ES2553412T3 - Antagonistas del receptor P2X3 para el tratamiento del dolor - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula estructural I:**Fórmula** o sales farmacéuticamente aceptables, y enantiómeros individuales y diastereómeros del mismo, en la que: X e Y representan, de manera independiente, N o CR1; A representa un heterociclilo de cinco miembros seleccionado del grupo que consiste en (CH2)noxazolilo, (CH2)nisoxazolilo y (CH2)ndihidro-10 isoxazolilo; R1 representa H, alquilo C1-6, halógeno, (CH2)nCF3, cicloalquilo C3-10, CN, (CH2)nOR2, (CH2)nheterociclilo C5-10, (CH2)narilo C6-10 o alcoxi C1-6; estando dichos alquilo, cicloalquilo, heterociclilo y arilo opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos de alquilo C1-6, halógeno, hidroxilo, (CH2)nCF3 o CN; R2 representa H, alquilo C1-6; R3 representa CR2R4R5; o R2 y R3 pueden combinarse con el nitrógeno al que están unidos para formar un heterociclilo C5-10 opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos de Ra; R4 y R5 representan, de manera independiente, H, (CH2)nOR2, CHF2, (CH2)nheterociclilo C5-10, (CH2)narilo C6-10, cicloalquilo C3-10, alcoxi C1-6 o alquilo C1-6; estando dichos alquilo, cicloalquilo, heterociclilo y arilo opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos de Ra; uno de R6 y R7 es hidrógeno y el otro es arilo C6-10 o heterociclilo C5-10 opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos de Ra; o R6 y R7 pueden combinarse con un átomo de carbono del anillo para formar un espirociclo de 4 a 6 miembros; Ra representa alquilo C1-6, halógeno, -OR2, hidroxilo, (CH2)nCF3, -O-, cicloalquilo C3-6, heterociclilo C5-10 o arilo C6- 10, estando dichos heterociclilo y arilo opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos de alquilo C1-6, halógeno, hidroxilo, (CH2)nCF3 o CN; y n representa 0 a 4.

Description

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o sales farmacéuticamente aceptables, y enantiómeros individuales y diastereómeros de los mismos.

Son ejemplos de dichos compuestos: 5 N-[(1R)-1-(5-fluoro-1-oxidopiridin-2-ilo)etil]-3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5S)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3il]benzamida; 3-(5-metilpiridin-2-il)-N-{(1R)-1-[1-oxido-6-(trifluorometil)piridin-3-il]etil}-5-[(5S)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3il]benzamida; 10 4’-metil-5-(5-oxa-6-azaspiro[3.4]oct-6-en-7-il)-N-[(1R)-1-(4H-1,2,4-triazol-3-ilo)etil]bifenil-3-carboxamida;

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arilalquilsulfinilo, arilsulfinilo, alquilsulfonilo C1-C8, arilalquilsulfonilo, arilsulfonilo, N-carbamoílo C0-C6, N,Ndialquilcarbamoílo C2-C15, cicloalquilo C3-C7, aroílo, ariloxi, arilalquiléter, arilo, arilo condensado a un cicloalquilo o heterociclo u otro anillo arilo, heterociclo C3-C7, o cualquiera de estos anillos condensados o espiro-condensados a un cicloalquilo, heterociclilo o arilo, en el que cada uno de los anteriores está además opcionalmente sustituido con uno más restos enumerados en (a) anterior.

"Halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.

El término "mamífero" o "mamíferos" incluye seres humanos, así como animales tales como perros, gatos, caballos, cerdos y ganado.

Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un cebador" incluye dos o más de dichos cebadores, la referencia a un "aminoácido" incluye más de uno de dichos aminoácidos, y similares.

Las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significan una concentración del modulador del complejo del receptor P2X suficiente para inhibir o potenciar el efecto del complejo del receptor P2X.

"Dolor" significa la sensación más o menos localizada de malestar, sufrimiento o agonía producto de la estimulación de terminaciones nerviosas especializadas. Hay muchos tipos de dolor, incluyendo, pero sin limitación, dolores súbitos, dolores fantasma, dolores fulgurantes, dolor agudo, dolor inflamatorio, dolor neuropático, dolor regional complejo, neuralgia, neuropatía, dolor por daño tisular y similares (“Dorland's Illustrated Medical Dictionary”, 28ª Edición, W. B. Saunders Company, Filadelfia, Pa.). El objetivo del tratamiento del dolor es reducir el grado o la gravedad del dolor percibido por un sujeto en tratamiento.

"Tratar" o "tratamiento" de un estado patológico incluye: 1) prevenir el estado patológico, es decir, hacer que los síntomas clínicos del estado patológico no se desarrollen en un sujeto que pueda estar expuesto o predispuesto al estado patológico, pero que todavía no experimenta ni presenta síntomas del estado patológico; 2) inhibir el estado patológico, es decir, detener el desarrollo del estado patológico o de sus síntomas clínicos; 3) o aliviar el estado patológico, es decir, provocar la regresión temporal o permanente del estado patológico o de sus síntomas clínicos.

Los compuestos descritos en el presente documento pueden contener uno o más dobles enlaces y pueden dar lugar a isómeros cis/trans, así como a otros isómeros conformacionales. La presente invención incluye todos los posibles isómeros, así como las mezclas de dichos isómeros, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros asimétricos y, por tanto, pueden darse como racematos, mezclas racémicas, enantiómeros sencillos, mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales.

Se entenderá que, como se usan en el presente documento, las referencias a los compuestos de fórmula estructural I también pretenden incluir las sales farmacéuticamente aceptables, así como las sales que no son farmacéuticamente aceptables cuando estas se usan como precursores para los compuestos libres o en otras manipulaciones sintéticas.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de bases o ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Cuando el compuesto de la presente invención es ácido, su sal correspondiente se puede preparar convenientemente a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas. Las sales obtenidas a partir de dichas bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre (ico y oso), férricas, ferrosas, litio, magnesio, manganeso (ico y oso), potasio, sodio, cinc y sales similares. Las sales obtenidas a partir de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, así como aminas cíclicas y aminas sustituidas tales como aminas de origen natural y sintetizadas sustituidas. Otras bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables, a partir de las que se pueden formar sales, incluyen resinas de intercambio iónico, tales como, por ejemplo, arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina y trometamina.

Cuando el compuesto de la presente invención es básico, su sal correspondiente se puede preparar convenientemente a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y orgánicos. Dichos ácidos incluyen, por ejemplo, ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, ptoluenosulfónico y similares.

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Se entiende que los grupos funcionales presentes en los compuestos descritos en los ejemplos que figuran más adelante se pueden manipular adicionalmente, cuando sea apropiado, usando las técnicas de transformación de grupos funcionales convencionales disponibles para los expertos en la materia, con el fin de proporcionar los compuestos deseados descritos en la presente invención.

5 También se entiende que los compuestos de la presente invención contienen uno o más estereocentros que se pueden preparar como enantiómeros o diastereómeros simples, o como mezclas que contengan dos o más enantiómeros o diastereómeros en cualquier proporción.

10 En los siguientes esquemas y ejemplos, se ilustran varios métodos de preparación de los compuestos de la presente invención. Los materiales de partida se preparan de acuerdo con procedimientos conocidos en la materia o como se ilustra en el presente documento.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar fácilmente de acuerdo con los siguientes esquemas y

15 ejemplos específicos, o modificaciones de los mismos, usando materiales de partida que se obtienen fácilmente, reactivos y procedimientos de síntesis convencionales. En estas reacciones, también es posible hacer uso de variantes que, en sí mismas, sean conocidas por los expertos habituales en la materia, pero que no se mencionan con mayor detalle. Los procedimientos generales de preparación de los compuestos reivindicados en la presente invención se pueden comprender y apreciar fácilmente por un experto en la materia tras la observación de los

20 siguientes esquemas.

ESQUEMAS DE REACCIÓN

La preparación de los compuestos finales puede realizarse a través de estrategias generales descritas a

25 continuación. Los siguientes ejemplos se ilustran normalmente por una estrategia. Sin embargo, el experto en la materia podría emplear otras estrategias.

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Los isoxazoles se pueden preparar de acuerdo con el Esquema 1. El bromuro 1 se oxida en aldehído 2, que se puede acoplar con una selección de ácidos arilborónicos bajo catálisis de metal de transición, dando el biarilo 3. La

30 condensación con hidroxilamina da la oxima de 4. A la cloración, le sigue la ciclación directa con varios alquinos para suministrar el isoxazol 5. La desprotección y el acoplamiento de amida finales en condiciones convencionales da el producto 6.

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ESQUEMA 3

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Como alternativa, las isoxazolinas se pueden preparar como se muestra en el Esquema 4, en el que se han reordenado las etapas sintéticas para permitir la producción de la isoxazolina como la última etapa.

ESQUEMA 4

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En otra modificación más, las isoxazolinas se pueden preparar como se representa en el Esquema 5, en el que se 10 han reordenado las etapas sintéticas para permitir la construcción del núcleo de biarilo como la última etapa.

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algunos casos, el orden en que se llevan a cabo los anteriores esquemas de reacción se puede variar para facilitar la reacción o para evitar productos de reacción no deseados.

PRODUCTOS INTERMEDIOS Y EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para poder comprender la invención de manera más completa. Estos ejemplos son solo ilustrativos y, bajo ningún concepto, se han de interpretar como limitantes de la invención.

PRODUCTO INTERMEDIO 1

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10

(1R)-1-(5-Fluoropiridin-2-il)etanamina

Etapa A: 5-Fluoropiridin-2-carboxilato de etilo

15 A una solución desgasificada de alcohol etílico (400 ml) en una bomba de acero Parr, se añadieron acetato de sodio (43,3 g, 528 mmol), 2-bromo-5-fluoropiridina (20 g, 114 mmol), 1,1’-bis(difenilfosfin)ferroceno (2,27 g, 4,09 mmol) y acetato de paladio (204 mg, 0,91 mmol). Se dispuso el recipiente bajo nitrógeno y se cerró herméticamente con una tapa Parr. Se desplazó la atmósfera con gas de monóxido de carbono y se ajustó la presión hasta 2.068,43 kPa

20 (300 psi). Se calentó mezcla hasta 90 ºC. Tras 3 h, la presión cayó hasta por debajo de 689,47 kPa (100 psi). Se enfrió el recipiente hasta la temperatura ambiente y se volvió a presurizar la reacción con monóxido de carbono hasta 2.068,43 kPa (300 psi). Se calentó el recipiente hasta 90 ºC durante 4 h más. Se enfrió el recipiente hasta la temperatura ambiente y se ventiló el resto del monóxido de carbono. Se concentró la mezcla hasta la mitad del volumen. Se añadieron acetato de etilo (500 ml) y agua (300 ml). Se aisló la capa orgánica y se extrajo la capa

25 acuosa con acetato de etilo (2 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. La purificación mediante cromatografía de gel de sílice (hexanos al 100 % → hexanos al 70 % / acetato de etilo) dio el compuesto del título (16 g). EM 170,0 (M+1).

Etapa B: 5-Fluoropiridin-2-carbaldehído

30 A una solución de 5-fluoropiridin-2-carboxilato de etilo (25 g, 148 mmol) en tetrahidrofurano (250 ml) a -78 ºC, se añadió gota a gota hidruro de diisobutilaluminio (1,0 M en hexanos; 296 ml, 296 mmol). Tras 1 h, se inactivó la reacción con alcohol etílico (10 ml). Se añadió solución acuosa saturada de tartrato de sodio tetrahidratado (1,3 l) y se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo (2 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con

35 salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. Se llevó la mezcla de solución (1,4 l) a la siguiente etapa sin concentración. EM 125,9 (M+1).

Etapa C: N-[(1E)-(5-Fluoropiridin-2-il)metilen]-2-metilpropano-2-sulfinamida

40 A una solución de 5-fluoropiridin-2-carbaldehído (18,49 g, 148 mmol) en acetato de etilo (850 ml), THF (250 ml) y hexanos (300 ml), se añadieron (R)-(+)-2-metil-2-propanosulfinamida (19,71 g, 163 mmol) y sulfato de cobre (II) anhidro (59,0 g, 370 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente. Tras 18 h, se filtró la mezcla a través de Celite. Se lavó la torta de masa filtrada con acetato de etilo y se concentró el filtrado. La purificación mediante cromatografía de gel de sílice (diclorometano al 100 % → diclorometano al 98 % / metanol) dio el compuesto del

45 título (33,7 g).

Etapa D: N-[(1E)-1-(5-Fluoropiridin-2-il)etil]-2-metilpropano-2-sulfinamida

A una solución de N-[(1E)-(5-fluoropiridin-2-il)metilen]-2-metilpropano-2-sulfinamida (52,12 g, 228 mmol) en

50 diclorometano (1.000 ml) a -78 ºC, se añadió bromuro de metilmagnesio (3,0 M en THF; 198 ml, 594 mmol). Se dejó calentar la mezcla hasta temperatura ambiente. Tras 30 min, se volvió a enfriar la mezcla hasta -78 ºC y se inactivó con solución acuosa saturada de cloruro de amonio (100 ml). Se dejó calentar la mezcla hasta la temperatura ambiente. Se separó la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con diclorometano (3 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. La

55 purificación mediante cromatografía de gel de sílice (100 % acetato de etilo) dio el compuesto del título (34,3 g). EM 245 (M+1).

Etapa E: (1R)-1-(5-Fluoropiridin-2-il)etanamina

60 A una solución de N-[(1R)-1-(5-fluoropiridin-2-il)etil]-2-metilpropano-2-sulfinamida (34,3 g, 140 mmol) en alcohol metílico (700 ml) a 0 ºC, se añadió cloruro de hidrógeno (4,0 M en dioxano; 105 ml, 421 mmol). Tras 30 min, se concentró la mezcla a sequedad. Se recristalizó el residuo usando alcohol etílico (15 ml) y éter (40 ml). Se filtró el

sólido blanco y se secó a presión reducida, dando la sal clorhidrato del compuesto del título (25,6 g). EM 141,1 (M+1).

PRODUCTO INTERMEDIO 2

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(1R)-1-[6-(Trifluorometil)piridin-3-il]etanamina

10 Etapa A: 2-metil-N-{(1E)-[6-(trifluorometil)-3-piridinil]metilen}-2-propanosulfinamida

A una solución de 6-(trifluorometil)nicotinaldehído (45,0 g, 257 mmol) en dicloroetano (640 ml), se añadieron (S)-(-)2-metil-2-propanosulfinamida (34,3 g, 283 mmol) y sulfato de cobre (II) anhidro (82 g, 514 mmol). Se agitó la mezcla a 50 ºC. Tras 48 h, se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente. Se filtró la mezcla de reacción a través de

15 Celite. Se lavó la torta de masa filtrada con diclorometano y se concentró el filtrado, dando el compuesto del título (76,8 g). EM 223,1 (M-terc-butilo +1)

Etapa B: 2-metil-N-{(1R)-1-[6-(trifluorometil)-3-piridinil]etil}-2-propanosulfinamida

20 A una solución de 2-metil-N-{(1E)-[6-(trifluorometil)-3-piridinil]metilen}-2-propanosulfinamida (76,8 g, 276 mmol) en diclorometano (920 ml) a -45 ºC, se añadió bromuro de metilmagnesio (3,0 M en THF; 184 ml, 552 mmol). Se agitó la mezcla a -45 ºC durante 4 h. Se calentó la mezcla de reacción hasta -20 ºC. Se añadió más bromuro de metilmagnesio (3,0 M en THF; 276 ml, 828 mmol) se añadió a -20 ºC. Se calentó la mezcla de reacción hasta 0 ºC y se inactivó con solución acuosa saturada de cloruro de amonio (300 ml). Se dejó calentar la mezcla hasta

25 temperatura ambiente. Se separó la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con diclorometano (3 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. Se recristalizó el concentrado usando alcohol etílico (500 ml). Luego se filtró el sólido blanco y se secó a presión reducida (41,6 g). EM 295,0 (M+1).

30 Etapa C: (1R)-1-[6-(trifluorometil)-3-piridin]etanamina

A una solución de 2-metil-N-{(1R)-1-[6-(trifluorometil)-3-piridinil]etil}-2-propanosulfinamida (41,6 g, 141 mmol) en alcohol metílico (470 ml) a 0 ºC, se añadió cloruro de hidrógeno (4,0 M en dioxano; 106 ml, 424 mmol). Tras 30 min, se concentró la mezcla a sequedad. Se recristalizó el residuo usando alcohol etílico (15 ml) y éter (40 ml). Se filtró el

35 sólido blanco y se secó a presión reducida, dando la sal clorhidrato del compuesto del título (26,3 g). EM 191,2 (M+1). RMN de 1H (500 MHz, CD3 OD): δ 8,83 (d, J = 2,2Hz, 1 H); 8,17 (d, J = 8,2 Hz, 1 H); 7,93 (d, J = 8,2Hz, 1 H); 4,69 (c,J = 6,9 Hz, 1 H);1,70 (d,J =6,9 Hz, 3 H).

PRODUCTO INTERMEDIO 3 40

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(1S)-1-(4H-1,2,4-Triazol-3-il)etanamina

45 Etapa A: [(1S)-2-Amino-1-metil-2-tioxoetil]carbamato de bencilo

A una solución de [(1S)-2-amino-1-metil-2-oxoetil]carbamato (15,0 g, 67,5 mmol) en diclorometano (337 ml), se añadió 2,4-disulfuro de 2,4-bis-(4-metoxifenil)-1,3-ditio-2,4-difosfetano (15,01 g, 37,1 mmol), y se calentó la mezcla hasta 55 ºC. Tras 1,5 h, se dejó enfriar la reacción hasta la temperatura ambiente y se concentró. La recristalización

50 en diclorometano dio el compuesto del título (13,4 g). EM 239,1 (M+1).

Etapa B: [(1S)-1-(4H-1,2,4-Triazol-3-il)etil]carbamato de bencilo

A una solución de [(1S)-2-amino-1-metil-2-tioxoetil]carbamato de bencilo (13,4 g, 56,2 mmol) en etanol (1,125 l), se

55 añadió hidrazida de ácido fórmico (20,26 g, 337 mmol) y cloruro de mercurio (II) (19,85 g, 73,1 mmol). Tras 1 h, se filtró la reacción y se concentró. Se añadieron solución acuosa saturada de carbonato de sodio y acetato de etilo. Se aisló la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo (2 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. Se calentó una

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Etapa C: N-[(1R)-1-(5-Fluoropiridin-2-il)etil]-3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5S)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3il]benzamida

A una solución de ácido 3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5S)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3-il]benzoico (11,7 g,

5 27,1 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml), se añadieron sal clorhidrato de (1R)-1-(5-fluoropiridin-2-il)etanamina (7,5 g, 35,2 mmol), EDC (7,78 g, 40,6 mmol), HOAT (1,84 g, 13,5 mmol) y trietilamina (26,4 ml, 189 mmol). La mezcla de reacción se calentó hasta 50 ºC. Tras 2 h, se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se añadió agua. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con agua (3 veces) y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. La purificación mediante

10 cromatografía de gel de sílice (diclorometano al 100 % → diclorometano al 40 %/acetona) dio el compuesto del título (10,67 g). HRMS 482,1999 (M+1). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3): δ 8,57 (ddd, J = 4,8; 1,8, 1,0 Hz, 1H); 8,49 (d, J= 2,1 Hz, 1H); 8,45-8,39 (m, 3H); 8,16 (t, J= 1,6 Hz, 1H); 7,71-7,66 (m, 2H); 7,59-7,52 (m, 3H); 7,37 (td, J= 8,3; 2,8 Hz, 1H); 7,30 (dd, J= 8,6; 4,4 Hz, 1H); 7,21 (ddd, J= 7,6; 4,9; 1,2 Hz, 1H); 5,87 (dd, J= 10,7; 7,1 Hz, 1H); 5,415,31 (m, 1H); 3,92-3,78 (m, 2H); 2,36 (s, 3H); 1,55 (d, J= 6,8 Hz; 3H).

15 EJEMPLO 1A

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20 N-[(1R)-(5-Fluoropiridin-2-il)etil]-3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5R)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3-il]benzamida

Etapa A: Ácido 3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5R)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3-il]benzoico

El presente compuesto se preparó usando los mismos procedimientos que se usaron para preparar N-[(1R)-1-(5

25 fluoropiridin-2-il)etil]-3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5S)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3-il]benzamida (etapa A y B, ejemplo 1).

Etapa B: N-[(1R)-1-(5-Fluoropiridin-2-il)etil]-3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5R)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3il]benzamida

30 A una solución de sal trifluoroacetato de ácido 3-(5-metilpiridin-2-il)-5-[(5R)-5-piridin-2-il-4,5-dihidroisoxazol-3il]benzoico (1,14 g, 1,94 mmol) en N,N-dimetilformamida (10 ml), se añadieron sal clorhidrato de (1R)-1-(5fluoropiridin-2-il)etanamina (0,62 g, 2,91 mmol), EDC (0,74 g, 3,88 mmol), HOAT (0,26 g, 1,94 mmol) y trietilamina (1,89 ml, 13,6 mmol). Se calentó la mezcla de reacción hasta 40 ºC. Tras 1,5 h, se añadieron más sal clorhidrato de

35 (1R)-1-(5-fluoropiridin-2-il)etanamina (0,29 g, 1,36 mmol), EDC (0,37 g, 1,94 mmol), HOAT (0,13 g, 0,97 mmol) y trietilamina (0,54 ml, 3,88 mmol). Tras 2 h, se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se añadió agua. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 veces). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con agua (3 veces) y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. La purificación mediante cromatografía de gel de sílice (diclorometano al 100 % → diclorometano al 95 %/metanol) dio el compuesto del título (820 mg). Se

40 disolvió el compuesto del título en diclorometano y se añadió HCl (2,0 M en éter). Se concentró la mezcla, dando la sal clorhidrato del compuesto del título. HRMS 482,2014 (M+1). RMN de 1H (400 MHz, CD3OD): δ 8,82 (d, J= 5,8 Hz, 1H); 8,75 (s, 1H); 8,68-8,49 (m, 6H); 8,42 (d, J= 8,4 Hz, 1H); 8,19 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 8,07-8,00 (m, 2H); 7,92 (dd, J= 8,9; 4,6 Hz, 1H); 6,28 (dd, J= 11,6; 6,8 Hz, 1H); 5,36 (c, J = 7,1 Hz, 1H); 4,30 (dd, J= 17,4; 11,7 Hz, 1H); 3,98 (dd, J = 17,4; 6,8 Hz, 1H); 2,61 (s, 3H); 1,70 (d, J = 7,1 Hz, 3H).

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ensayo (o, de lo contrario, según lo indicado). La jaula del animal se mantendrá con luz artificial (12 horas) entre las

7:00 y las 19:00 a una temperatura ambiente controlada de 21 ± 3 ºC, y con una humedad relativa mantenida al 4070 %. La información relativa a cualquier signo clínico y a la mortalidad se archivará con los materiales del estudio.

Tras la privación de comida durante la noche, se anestesian ligeramente (isoflurano) las ratas Sprague Dawley macho y se administra por inyección ácido acético al 1 % en el colon (1,5 ml), usando una cánula de 5 cm de longitud. Tras un período de recuperación de 75 minutos, se vuelven a anestesiar las ratas ligeramente (isoflurano) y se inserta un globo de látex de 1,5 cm de longitud fijado íntimamente a un catéter por el ano en el colon descendente y en el recto. Entonces, se retira la anestesia de inmediato. 15 minutos después, se administra la sustancia de ensayo por vía oral. 60 minutos después de la administración, se llena el globo con 1,2 ml de agua y se cuenta el número de contracciones abdominales producidas durante 10 minutos.

Se estudian 10 ratas por grupo. El ensayo se realiza con ocultación. La sustancia de ensayo se evaluará a 3 dosis y se comparará con el grupo tratado con vehículo. Las ratas se sacrificarán al final de los experimentos mediante exposición a una mezcla de O2/CO2 (20 %/80 %), seguida de CO2. Los datos se analizarán comparando los grupos tratados con el vehículo de control usando las pruebas U de Mann Whitney.

Modelo de ligadura del nervio espinal L5 in vivo

a. Cirugía y cuidados postoperatorios

Para el procedimiento de ligadura del nervio espinal (SNL), se anestesian las ratas Sprague Dawley macho (100200 g; Harlan) usando isoflurano (1-5 %; inhalación). Usando una técnica aséptica, se realiza una incisión en la línea media dorsal desde aproximadamente el nervio espinal L3 a S2. Se usa una combinación de disección aguda y roma para dejar al descubierto el proceso interarticular posterior L6/S1. Se visualiza el proceso transversal L6 y se retira, dejando al descubierto los nervios espinales L4 y L5 distalmente a su aparición desde el foramen intervertebral. A continuación, se liga bien el nervio L5 con una sutura de seda 6-0. Se cierra el músculo con una sutura 4-0 absorbible y se cierra la piel con grapas para heridas. Se realiza un seguimiento postoperatorio para garantizar la exposición de los animales a la menor cantidad de dolor posible. Se alojan los animales por parejas sobre lechos y se monitorizan diariamente (2 veces) durante tres días después de la operación por parte del personal de recursos animales del laboratorio, y después diariamente por parte del investigador para determinar cualquier signo de posible sufrimiento.

b. Pruebas de comportamiento

Antes de la cirugía, se analizan las ratas para determinar los umbrales de retirada mecánica de la pata trasera antes de la cirugía aplicando una serie de filamentos de von Frey calibrados (0,25-15 g) a la pata trasera izquierda y determinando la mediana del umbral de retirada usando el método "ascendente-descendente" de Dixon (Chaplan et al.. J Neurosci Meth 53:55, 1994). Se sitúan las ratas en cámaras de plástico individuales sobre una plataforma elevada de acero galvanizado de malla y se dejan aclimatar durante 60 minutos. Se determinan los umbrales de la retirada mecánica de la pata trasera antes de la cirugía y se excluyen del estudio las ratas que tienen un umbral < 15 g. Tras la determinación de los umbrales de retirada previos a la cirugía, se someten las ratas al procedimiento de SNL descrito anteriormente. Entre 28-35 días después del procedimiento quirúrgico, se ensayan las ratas para determinar los umbrales posteriores a la cirugía usando el procedimiento descrito anteriormente, y los animales que muestran un umbral de retirada de la pata trasera < 4,0 g se consideran alodínicos (es decir, hipersensibilidad mecánica). Los efectos de los compuestos de ensayo sobre la hipersensibilidad mecánica inducida por SNL se determinan administrando el compuesto junto con un grupo de vehículo de control y un grupo que recibe el comparador positivo pregabalina (20 mg/kg, vía oral). Se evalúa la eficacia del modelo de SNL determinando el % de inversión de la hipersensibilidad mecánica usando la fórmula:

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A final del estudio, se sacrifican todas las ratas usando CO2, y se extrae el plasma y el tejido cerebral para los análisis bioanalíticos de las exposiciones al fármaco.

Modelo de adyuvante completo de Freund (CFA) in vivo

Las ratas Sprague Dawley macho (300 -400 g; Charles River) reciben una inyección intradérmica de CFA (200 ul, 0,5 mg/ml) en la parte plantar de la pata trasera izquierda, y después se devuelven a sus jaulas donde se mantienen en lechos blandos. 72 horas después de la inyección de CFA, se ensayan las ratas para determinar los umbrales de retirada mecánica de la pata trasera posteriores al CFA, envolviendo a la rata en una toalla y colocando la pata

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Claims (1)

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