ES2525351T3 - Compuestos antiproliferativos, conjugados de los mismos, procedimientos para éstos y usos de los mismos - Google Patents

Compuestos antiproliferativos, conjugados de los mismos, procedimientos para éstos y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (II)**Fórmula** en la que n es 0, 1 o 2; R1, R2 y R3 son independientemente H, alquilo C1-C10 sin sustituir o sustituido, alquenilo C2-C10 sin sustituir o sustituido, alquinilo C2-C10 sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2O(alquilo C1-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2O(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2O(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2OC(>=O)(alquilo C1-C10), (CH2)1-2OC(>=O)(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2OC(>=O)(alquinilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, C(>=O)(alquilo C1-C10) sin sustituir o sustituido, C(>=O)(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, C(>=O)(alquinilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido; R4 es;**Fórmula** y R5 es H, alquilo C1-C5, alquenilo C2-C5, alquinilo C2-C5, CO(alquilo C1-C5), CO(alquenilo C2-C5) o CO(alquinilo C2-C5); o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo, una amida farmacéuticamente aceptable del mismo en el grupo carboxilo de R4 con el grupo α-amino de un α-aminoácido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Compuestos antiproliferativos, conjugados de los mismos, procedimientos para éstos y usos de los mismos
5 Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a compuestos estructuralmente relacionados con las tubulisinas, conjugados de los mismos con un ligando, procedimientos para fabricar y usar tales compuestos y conjugados y composiciones que comprenden tales compuestos y conjugados.
Las tubulisinas son citotoxinas originalmente aisladas de cultivos de las mixobacterias Archangium gephyra o Angiococcus disciformis, con cada organismo produciendo una mezcla de tubulisinas diferente. (Sasse y col. 2000; Reichenbach y col. 1998). Su estructura cristalina y su ruta biosintética se han elucidado (Steinmetz y col. 2004) y sus genes de biosintesis se han secuenciado (Hoefle y col. 2006b). La propia pretubulisina, un precursor biosintético de las
15 tubulisinas, también ha mostrado poseer actividad significativa (Ullrich y col. 2009). (Las citas integras de los documentos citados en el presente documento por el primer autor o inventor y el año se enumeran al final de la presente memoria descriptiva).
Las tubulisinas pertenecen a un grupo de polipéptidos y depsipéptidos antimitóticos naturales que incluyen las
20 fomopsinas , las dolastatinas y las criptoficinas (Hamel 2002). También existen agentes antimitóticos distintos de polipéptidos o depsipéptidos, por ejemplo paclitaxel, las maitansinas y las epotilonas. Durante la mitosis, los microtubulos de la célula se reorganizan para formar el uso mitótico, un procedimiento que requiere el rápido ensamblaje y desesamblaje de las proteínas constituyentes del microtúbulo a-y [3-tubulina. Los agentes antimitóticos bloquean el presente proceso y evitan que una célula sufra mitosis, aunque al nivel molecular el mecanismo de
25 bloqueo exacto puede diferir de un agente a otro. Las tubulisinas evitan el ensamblaje de las tubulinas en microtúbulos, causando que las células afectadas se acumulen en la fase G2fM y sufran apoptosis (Khalil y col. 2006). En cambio, el paclitaxel efectúa el mismo resultado final por unión a microtúbulos y evitar su desensamblaje.
Las tubulisinas tienen un armazón de tetrapeptidilo construido a partir de una subunidad aminoacídica proteinogénica
30 y tres subunidades aminoacídicas no proteinogénicas: ácido N-metilpipecolínico (Mep), isoleucina (lIe);. tubuvalina (Tuv) y bien tubufenilalanina (Tup, RA equivale a H en la fórmula (1) más adelante) o tubulirosina (Tut, R equivale a OH). Se conocen aproximadamente una docena de tubulisinas que se dan en la naturaleza (llamadas A, B, etc.), estando los sitios de variación estructural entre ellas en residuos RA, RO Y Re como se muestran en la Fórmula (1) y en la Tabla 1:
Mep 11. Tuv TupfTut
'7
Tabla 1 -Tubul isinas ue Se Dan en la Naturaleza Tubulisina I R I R I R
A OH OC( O)Me CH20C( O)i-Bu
B OH OC(=O)Me CH20C(=O)n-Pr
C OH OC(=O)Me CH20C(=O)Et
D H OC(=O)Me CH20C(=O)i-Bu
E H OC(=O)Me CH20C(=O)n-Pr
F H OC(=O)Me CH20C(=O)Et
G OH OC(=O)Me CH20C{=O)CH=CH2
H H OC(=O)Me CH20C(=O)Me
I OH OC(=O)Me CH20C(=O)Me
U H OC(=O)Me H
V H OH H
Z OH OH H Pretubulisina H H Me
Kaur y col. 2006 estudiaron las propiedades antiproliferativas de la tubulisina A y encontraron que era más potente que otros agentes antimitóticos tales como paclitaxel y vinblastina y era activa en ensayos de xenoinjertos contra diversas 40 lineas celulares cancerosas. Adicionalmente, la tubulisina A indujo apoptosis en células cancerosas pero no en células
normales y mostró propiedades antiangiogénicas significativas potenciales en ensayos in vitro. Las propiedades antimitóticas de otras tubulisinas se han evaluado también y generalmente se ha encontrado que se comparan favorablemente contra aquellas de agentes antimit6ticos no tubulisinas (véanse, por ejemplo, Balasubramanian y col. 2009; Steinmetz y col. 2004; Wipf Y col. 2004). Por las presentes razones, hay considerable interés en las tubulisinas como agentes anticancerigenos (véase, por ejemplo, Domling y col. 2005c; Hamel 2002).
Numerosas publicaciones describen esfuerzos dirigidos a la sintesis de tubulisinas, incluyendo: Balasubramanian y col. 2009; Domling y col. 2006; Hoefle y col. 2003; Neri y col. 2006; Peltier y col. 2006; Sani y col. 2007; Sasse y col. 2007; Shankar y col. 2009; Shibue y col. 2009; y Wipf y col. 2004. Otras publicaciones describen estudios de relación estructura-actividad (SAR), por medio de la preparación y evaluación de análogos o derivados de tubulisina: Balasubramanian y col. 2008 y 2009; Domling 2006; Domling y col. 2005a; Ellman y col. 2009; Hoefle y col. 2001 & 2006a; Pallerson y col. 2007 & 2008; Richter 2008; Vlahov y col. 2009; Wang y col. 2007; yWipf y col. 2007 ~ 2010. Los estudios de SAR exploraron principalmente variaciones estructurales en el anillo de Mep, en los residuos R y Re de la subunidad Tuv, yen el anillo aromático o en la cadena de carbonos alifática de la subunidad TupfTut.
Domling y col. 2005 revela conjugados de tubulisinas con una molécula compañera descrita genéricamente como un polimeroo una biomolécula, pero con ejemplos reales limitados a polietilenoglicol (PEG) como la molécula compañera. Otros documentos que describen los conjugados de tubulisinas son Boyd y col. 2008 y 2010; Vlahov y col. 2008a, 2008b y 2010; Leamon y col. 2008 Y2009; Reddy y col. 2009; y Low y col. 2009. Leung y col. 2002 revela polipéptidos poliani6nicos que pueden conjugarse a fármacos (incluyendo tubulisinas) para incrementar su bioactividad y solubilidad en agua.
Davis y col. 2008 y Schluep y col. 2009 revela formulaciones basadas en ciclodextrina en las que las tubulisinas están covalentemente unidas a una ciclodextrina por medio de un resto de engarce hidracida-disulfuro unido al grupo carboxi lo TupfTut.
Breve sumario de la invención
La presente invención revela compuestos antiproliferativos novedosos que están relacionados estructuralmente relacionados con las tubulisinas, son citotóxicos o citostáticos contra muchas células cancerosas y se cree que actúan por un mecanismo antimitótico. Los presentes compuestos se pueden conjugar con ligandos tales como anticuerpos para administración dirigida contra células cancerosas.
En una realización, la presente invención proporciona un compuesto que tiene una estructura representada por fórmula (11)
en la que
nesO 102; Rl, R2 Y R3 son independientemente H, alquilo G,-Glo sin sustituir o sustituido, alquenilo Cz-Glo sin sustituir o sustituido, alquinilo Cr Clo sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2h.20(alquilo Gl-ClO) sin sustituir o sustituido, (GH2)1_Z0(alquenil0 Gr GlO) sin sustituir o sustituido, (CH2h_zO(alquinilo G2-GlO) sin sustituir o sustituido, (GH2)'_ZOC(=O)(alquilo G,-ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2),_ZOC(=O)(alquenilo G2-ClO) sin sustituir o sustituido, (GHZ)'.20G(=O)(alquinilo CZ-ClO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquilo Cl-GlO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquen ilo G2-ClO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquinilo C2-Gl0) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido. arilalquilo sin sustituir o sustituido, o alquila rilo sin sustituir o sustituido;
R4
es NH2 NH2
~I
~
\ \
NH
Ú , (CH')'~3CH3 ; y
\:J~~~
CO,H 0CO,H
R~ es H, alquilo C,-C~, alquenilo C2-C5, alquinilo C2-C~, CO(alquilo C,-C5), CO(alquenilo C2""C~), o CO(alquinilo C2-C5);
o un éster farmacéutica mente aceptable del mismo, una amida farmacéuticamente aceptable del mismo en el grupo carboxi lo de R4 con el grupo o-amino de un a-aminoácido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Un R4 preferido es NH,
\:
C02H
con la estereoquimica en el grupo metilo alfa con respecto al carboxilo siendo más preferente que la que corresponde a las tubulisinas naturales, es decir:
NH,
\:
La presente invención proporciona también intermedios novedosos útiles para sintetizar compuestos de acuerdo con la fórmula (11).
En otra realización, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención conjugado por medio de
20 un resto de engarce a un ligando (preferentemente un anticuerpo, más preferentemente un anticuerpo monoclonal, y lo más preferentemente un anticuerpo monoclonal humano) para su administración selectiva a una célula diana tal como una célula cancerosa.
En otra realización, se proporciona una composición de materia que comprende un compuesto de la presente 25 invención y un resto de engarce, adecuado para conjugación a un ligando.
En otra realización, la presente invención proporciona compuestos para su uso en un procedimiento para inhibir la proliferación de células cancerosas en un sujeto que sufre de cáncer, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéutica mente efectiva de un compuesto de la presente invención o un conjugado del mismo con un 30 ligando (particularmente un anticuerpo). En otra realización, se proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento para inhibir la proliferación de células cancerigenas, comprendiendo poner en contacto tales células con un compuesto de la presente invención o un conjugado del mismo con un ligando (partiCUlarmente un anticuerpo), en condiciones suficientes para inhibir el crecimiento de ta les células cancerosas . Las células cancerosas pueden ser células de cáncer colorrectal, cáncer de higado, cáncer de próstata, cáncer de mama, melanoma, glioblastoma, cáncer
35 de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de ovarios, mieloma múltiple, cáncer renal, leucemia, o linfoma. Donde el ligando es un anticuerpo se prefiere que el anticuerpo se una a un anligeno expresado por las células cancerosas.
En otra realización , se proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento de tratar un cáncer en un sujeto que sufre de tal cáncer, comprendiendo administrar al sujeto una cantidad terapéutica mente efectiva de un compuesto
40 de esta invención o un conjugado de la misma con un ligando (en particular un anticuerpo). En otra realización, se proporciona el uso de un compuesto de esta invención (o un conjugado del mismo con un ligando (partiCUlarmente un anticuerpo)) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En estas realizaciones, el cáncer puede ser cáncer colorrectal, cáncer de higado, cáncer de próstata, cáncer de mama, melanoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de ovarios, mieloma múltiple, cáncer renal, leucemia, o linfoma.
En otra realización, se proporciona el uso de un compuesto de esta invención o un conjugado del mismo con un
E1 0739817
ligando (preferentemente un anticuerpo) para la preparación de un medicamento para tratar un cáncer en un sujeto que sufre de tal cáncer.
Breve descripción del/de los dibujo(s)
Figs. 1a y 1 b representan, en combinación, un Esquema 1 para fabricar compuestos de la presente invención. Figs. 2 y 3 representan Esquemas 2 y 3, respectivamente, también usables para fabricar compuestos de la presente invención. Fig. 4 representa un Esquema 4 adecuado para unir un engarce peptid ilo y un grupo reactivo de maleimida a compuestos de la presente invención. Figs. 5, 6, Y 7 representan Esquemas 5, 6, Y7, respectivamente, usables para fabricar compuestos de la presente invención. Figs. 8a, 8b, y 8c muestran Esquemas 8, 9 Y 10, respectivamente, para fabricar intermedios útiles para preparar compuestos de la presente invención. Figs. 9 y 10 muestran Esquemas 11 y 12, respectivamente, ilustrando como intermedios tales como aquellos mostrados en Figs. 8a-8c se pueden elaborar en compuestos de la presente invención. Figs. 11a y 11b muestran los trazados para ensayos de proliferación de 3H-timidina para un primer grupo de compuestos de la presente invención, contra dos tipos diferentes de células cancerosas. Figs. 12a y 12b muestran los trazados para ensayos de proliferación de luminiscencia de ATP para un segundo grupo de compuestos de la presente invención, contra dos tipos de células cancerosas. Figs. 12c y 12d muestran los trazados para ensayos de proliferación de 3H·timidina para el mismo segundo grupo de compuestos y contra los mismos dos tipos de células cancerosas. Fig. 13 muestra la actividad contra células cancerosas renales de conjugados de compuestos de la presente invención en ensayos de proliferación de 3H·timidina. Fig. 14 muestra la actividad contra células cancerosas renales de conjugados de compuestos de la presente invención en estudios de xenotransplante. Fig. 15 muestra un Esquema 13 para fabricar intermedios útiles para fabricar compuestos de esta invención. Fig. 16 muestra un Esquema 14 para fabricar compuestos de esta invención a partir de intermedios de elaborados por el esquema 13. Figuras 17 y 18 muestran Esquemas 15 y 16, respectivamente, para fabricar compuestos listos para la
conjugación de esta invención. Figura 19 muestra el Esquema 17 para fabricar un intermedio útil para fabricar compuestos de esta invención. Figuras 20a y 20b muestran el Esquema 18 para la preparación de compuestos de esta invención a partir del intermedio del Esquema 17. Fig. 21 muestra el Esquema 19 para fabricar un intermedio usado en el Esquema 18. Fig. 22 muestra el Esquema 20 para la sintesis de un intermedio usado en fabricar compuestos de esta invención. Fig. 23 muestra el Esquema 21 para fabricar compuestos de esta invención a partir del intermedio del Esquema 20. Fig. 24 muestra el Esquema 22 para fabricar aún otro intermedio útil para fabricar compuestos de esta invención. Fig. 25 muestra el Esquema 23 para fabricar compuestos de esta invención a partir del intermedio del Esquema 22.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
"Anticuerpo" quiere decir anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antrgeno (es decir, "parte de unión a antígeno") o cadenas individuales del mismo. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (l ) interconectadas por puentes disulfuro. Cada cadena pesada comprende una regíón variable de la cadena pesada (VH) y una regíón constante de la cadena pesada que comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (VL o Vk) y una región constante de la cadena ligera que comprende un dominio individual, Cl. Las regiones VH y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (COR), interdispersas con regiones marco más conservadas (FR). Cada VH y Vl comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo aminoterminal al extremo carboxiterminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, Y FR4. Las regiones variables contienen un dominio de unión que interacciona con un antigeno. las regiones constantes pueden mediar la unión del anticuerpo a tejidos o factores del huésped, induyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Se dice ~ue un anticuerpo se "une específicamente" a un antígeno X si el anticuerpo se une a antígeno X con un Ko de 5 x 10 M o menos, más preferentemente 1 x 10. 8 M o menos, más preferentemente 6 x 10. M O menos, más preferentemente 3 x 10-9 M o menos, incluso más preferentemente 2 x 10-9 M o menos. El anticuerpo puede ser quimérico, humanizado, o, preferentemente, humano. La región constante de la cadena pesada puede manipularse para afectar al tipo o extensión de la glicosilación, para prolongar la semivida del anticuerpo, para mejorar
o reducir interacciones con células efectoras o el sistema del complemento, o para modula r alguna otra propiedad. La manipulación se puede llevar a cabo por reemplazo. adición, o deleción de uno o más aminoácidos o por reemplazamiento de un dominio con un dominio de otro tipo de inmunoglobulina, o una combinación de lo precedente.
"Fragmento de anticuerpo" y "parte de unión al anticuerpo" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo")
quiere decir uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unir especifica mente a un anUgeno. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud total, tal como (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios Vl, VH, Cl y CH,: (ii) un fragmento F(ab')l' un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un
enlace disulfuro en la región bisagra: (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, por ejemplo, Abbas y col ., Cel/ular and Molecular Immuno/ogy, 6a edición, Saunders Elsevier 2007):
(iv) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH'; (v) un fragmento Fv constituido por los dominios Vl y VHde un brazo ind ividual de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341: 544-546), que consta de un dominio VH: (vii) una región de determinación de complementariedad aislada (CDR): y (viii) un nanocuerpo, una región va riable de cadena pesada que contiene un dominio variable individual y dos dominios constantes. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl Y VH , están codificados por genes separados, se pueden unir, usando procedimientos recombinantes, por un engarce sintético que les permite hacerlo como una cadena de proteína individual en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalenles (conocidas como Fv de cadena simple, o scFv); véase, por ejemplo, Sird Y col. (1988) Science 242: 423-426: y Huston y col. (1988) Proc. Nat!. Acad. Sci. USA ~: 5879-5883). Tales anticuerpos de cadena individual están también comprendidos dentro del término "parte de unión a antrgeno" de un anticuerpo.
Un "anticuerpo aislado" quiere decir un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a antígeno X está sustancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente antrgenos distintos de antigeno X). Un anticuerpo aislado que específicamente une antigeno X puede, sin embargo, tener reactividad cruzada a otros antígenos, tal como moléculas de antigeno X de otras especies. En ciertas realizaciones, un anticuerpo aislado une especifica mente a antígeno X humano y no reacciona de forma cruzada con otros antígenos X de antígeno (no humanos). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
"Anticuerpo mononoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales" quiere decir una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular individual, que presenta una especificidad y afinidad de unión individual para un epitopo particular.
"Anticuerpo humano" quiere decir un anticuerpo que tiene regiones variables en las que tanto las regiones marco como las regiones CDR (y la región constante, si está presente) se derivan de las secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir modificaciones posteriores, incluyendo modificaciones naturales o sintéticas. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o especifica de sitio in vitro o por mutación somatica in vivo). Sin embargo, "anticuerpos humanos" no incluyen anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la linea germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ratón, se han injertado en las secuencias marco humanas.
"Anticuerpo monoclonal humano" quiere decir un anticuerpo que presenta una especificidad de unión individual, que tiene reg iones variables en las que tanto las regiones marco como las reg iones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la linea germinal humana. En una realización, se producen anticuerpos monoclonales humanos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partirde un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana condensados a una célula inmortalizada.
"Alifático" quiere decir una cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada, sin restos de hidrocarburos aromáticos que tiene el número de átomos de carbono especificado (por ejemplo, como en "alifático C3: "alifático C,-C5", o "alifático C, a C5", siendo las últimas dos frases sinónimas para un resto alifático que tiene de 1 a 5 átomos de carbono) o, donde el número de átomos de carbono no se especifica explícitamente, desde 1 hasta 4 átomos de carbono (2 a 4 carbonos en el caso de restos alifáticos insaturados).
"Alquilo" quiere decir un resto alifático saturado, con la misma convención para designar el número de átomos de carbono siendo aplicable. A modo de ejemplo, restos de alquilo C,-C4 incluyen, pero no se militan a metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobulilo, t-butilo, 1-butilo, 2-butilo y similares.
"Alquenilo" quiere decir un resto alifálico que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, con la misma convención para designar el número de átomos de carbono siendo aplicable. A modo de ejemplo, restos de alquenilo C2-C4 incluyen, pero no se limitan a, etenilo (vinilo), 2-propenilo (aliloo prop-2-enilo), cis-1-propenilo, trans-1-propenilo, E-(o Z.) 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-butadienilo (but-l ,3-dienilo) y similares.
"Alquinilo" quiere decir un resto alifático que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono, con la misma convención para designar el número de átomos de carbono siendo aplicable. A modo de ejemplo, grupos alquinilo C2-C4 incluyen etinilo (acetilenilo), propargilo (prop-2-inilo), 1-propinilo, but-2-inilo y similares.
"Cicloalifático" quiere decir un resto hidrocarburo saturado o no saturado, no aromático que tiene de 1 a 3 anillos, teniendo cada anillo desde 3 hasta 8 (preferentemente desde 3 hasta 6) átomos de carbono. ·Cicloalquilo· quiere decir
un resto cicloalifático en el que cada anillo está saturado. "Cicloalquenilo" quiere decir un resto cicloalifático en el que al menos un anillo tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. "Cicloalquinilo" quiere decir un resto cicloalifático en el que al menos un anillo tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. A modo de ejemplo, los restos cicloalifáticos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciciopentilo, cidopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo y adamantilo. Los restos cicloalifáticos preferidos son cicloalquilos, especialmente ciclopropilo, ciciobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
"Heterocicloalifático" quiere decir un resto cicloalifático en el que, en al menos un anillo del mismo, hasta tres (preferentemente 1 to 2) carbonos se han reemplazado con un heteroátomo independ ientemente seleccionado de N, O, o S, donde el N y el S opcionalmente pueden oxidarse y el N opcionalmente puede cuaternizarse. De forma similar, "heterocicloalquinilo", "heterocicloalquenilo" y "heterocicloalquinilo" quiere decir un resto cicloalquilo, cicloalquenilo, o cicloalquinilo, respectivamente, en el que al menos un anillo del mismo se ha modificado así. Los restos heterocicloalifaticos ejemplares incluyen aziridinilo, azetidinilo, 1,3-dioxanilo, oxetanilo, tetrahidrofurilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidrotiopiranilsulfona, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiomorfolinilo sulfóxido, tiomorfolinilsulfona, 1,3-dioxolan ilo, tetrahidro-1, 1-dioxotienilo, 1,4-dioxanilo, tietanilo y similares.
"Alcoxi", "ariloxi", "alqu iltio", y "ariltio" quiere decir -O(alquilo), -O(arilo), -S(alquilo) y -S(arilo), respectivamente. Ejemplos son metoxi, fenoxi, metillio y fenillio, respectivamente.
"Halógeno" o "halo" quiere decir flúor, cloro, bromo o yodo.
"Arilo" quiere decir un resto de hidrocarburo que tiene un sistema de anillos mono-, bi-, o triciclicos en los que cada anillo tiene de 3 a 7 átomos de carbono y al menos un anillo es aromático. Los anillos en el sistema de anillos pueden estar condensados unos a otros (como en naftilo) o enlazados unos a otros (como en bifen ilo) y pueden estar condensados o enlazados a anillos no aromáticos (como en indanilo o ciclohexilfenilo). A modo de ejemplo adicional, los restos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antracenilo y acenaftilo.
"Heteroarilo" quiere decir un resto que tiene un sistema de anillo mono-, bi-, o triciclilo en el que cada anillo tiene desde 3 hasta 7 átomos de carbono y al menos un anillo es un anillo aromático que contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, o S, donde N y S pueden estar opcionalmente oxidados y N puede estar opcionalmente cuaternizado. Un anillo aromático tal que contenga al menos un heteroátomo puede estar condensado a otros tipos de anillos (como en benzofuranilo o tetrahidroisoquinolilo) o puede estar directamente enlazado a otros tipos de anillos (como en fenilpiridilo o en 2-ciclopentilpiridilo). A modo de ejemplo adicional, los restos heteroarilo incluyen pirrolilo, furanilo, tiofenilo (tienilo), imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridilo, N-oxopiridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, cinolinilo, quinozalinilo, nafti ridinilo, benzofuranilo, indolilo, benzotiofenilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, fenotiazolilo, benzimidazolilo, benzotriazolilo, dibenzofuranilo, carbazolilo, dibenzotiofen ilo, acridinilo y similares.
Donde se indica que un resto puede estar sustituido, tal como por uso de expresión "sustituido o sin sustituir" u "opcionalmente sustituido" como en "alquilo Cl-C~ sustituido o sin sustituir" o "heteroarilo opcionalmente sustituido", tal resto puede tener uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados, preferentemente uno a cinco en número, más preferentemente uno o dos en número. Los sustituyentes y los patrones de sustitución se pueden seleccionar por alguien de habilidad ordinaria en la técnica, teniendo en cuenta el resto por el que está unido el sustituyente, para proporcionar compuestos que sean quimicamente estables y que se puedan sintetizar por técnicas conocidas en la técnica asi como los por los proced imientos expuestos en el presente documento.
"Arilalquilo", (heterocicloalifatico)alquilo", "arilalquenilo", "arilalquinilo", "biarilalquilo" y similares quieren decir un alquilo, alquenilo o alquinilo, como puede ser el caso, sustituidos con un resto arilo, heterocicloalifático, biarilo, etc., como puede ser el caso, con la valencia abierta (insatisfecha) en el resto alquilo, alquenilo, o alquinilo, por ejemplo como en bencilo, fenetilo, N-imidazoliletilo, N-morfolinoetilo y similares. En cambio, "alquila rilo", "alquenilcicloalquilo" y similares qUieren decir un resto arilo, cicloalquilo, etc., como puede ser el caso, sustituidos con un resto alquilo, alquenilo, etc., como puede ser el caso, por ejemplo como en metilfenilo (tolilo) o alilciclohexilo. "Hidroxialquilo",
"haloalquilo", "alquila rilo", "cianoarilo", y similares quieren decir un resto alqu ilo, arilo, etc., como puede ser el caso, sustituido con uno o más de los sustituyentes identificados (hidroxilo, halo, etc., como puede ser el caso).
A modo de ejemplo, los sustituyentes permisibles induyen, pero no se limitan a, alquilo (especialmente metilo o etilo), alquenilo (especialmente alilo), alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalifático, heterocicloalifético, halo (especialmente fluoro), haloalquilo (especialmente trifluorometilo), hidroxilo, hidroxialquilo (especialmente hidroxietilo), ciano, nitro, alcoxi -O(hidroxialquilo), -O(haloalquilo) (especialmente -OCF3), -O(cicioalquilo), -O(heterocicloalquilo), -O(arilo), alquiltio, arillio, =0, =NH, =N(alquilo), =NOH, =NO(alquilo), -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -C02H, -C(=O)NHOH., -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)2, -OC(=O)(alquilo), -OC( =0)(hid roxialqu ilo), -OC( =0)O(alquilo), -OC(=0)O(h id roxialquilo), -OC( =O)N Hz, -OC( =O)N H(alqu ilo), -OC(=O)N(alquilon, azido, -NH2, -NH(alquilo),-N(alquilol2, -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquiloh, -NHC(=NH)NH2, -OS02(alquilo), -SH,
-
S{alquilo), -S{arilo), -S{cicloalquilo), -S{=O)alquilo, -S02{alquilo), -S02NH2, -S02NH{alquilo), -S02N{alquilo)z, y similares.
Donde el resto que está sustituido es un resto alifático, los sustituyentes preferidos son arilo, heteroa rilo, cicloalifático, heterocicloalifático, halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi, -O{hidroxialquilo), -O(haloalquilo), -O{cicloalquilo), -O{heterocicloalquilo), -O{arilo), alquillio, arillio, =0, =NH, =N{alquilo), =NOH, =NO{alquilo), -C02H, -C{=O)NHOH, -C{=O)O{alquilo), -C{=O)O{hidroxialquilo), -C{=O)NHz, -C{=O)NH{alquilo), -C{=O)N{alquiloh, -OC{=O){alquilo), -OC( =0)(hid roxialqu ilo). -OC{=0)O(alquilo l, -OC{=0)O(h id roxialquilo). -OC( =O)N Hz. -OC{ =O)N H{alqu ilo), -OC{=O)N{alquilo12, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N{alquiloh. -NH{arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC{=O){alquilo), -NHC{=O)H, -NHC{=O)NHz, -NHC{=O)NH{alquilo), -NHC{=O)N{alquilo)z, -NHC{=NH)NH2, -OSOz{alquilo), -SH, -S{alquilo), -S(arilo), -S(=O)alquilo, -S(cicloalquilo), -S(h(alquilo), -SOzNH2, -S02NH{alquilo) y -S02N(alquilo)2. Son sustituyentes más preferidos halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi, -O(arilo), =0, =NOH, =NO(alquilo), -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)O{alquilo), -OC{=O)NHz, -OC{=O)NH{alqu ilo), -OC{=O)N(alquilo)z, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquiloh, -NH(arilo), NHC{=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC{=0)NH2. -NHC{=O)NH(alquilo), -NHC{=0)N{alquilo)2 y -NHC(=NH)NH2.
Donde el resto que está sustituido es un resto cicloalifático, heterocicloalifático, arilo, o heteroarilo, los sustituyentes preferidos son alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquil0, ciano, nitro, alcoxi, -O{hidroxialquilo), -O(haloalquilo), -O(arilo), -O{cicloalquilo), -O{heterocicloalquilo), alquiltio, arillio, -C{=O){alquilo), -C{=O)H. -C02H, -C(=O)NHOH. -C{=O)O(alquilo), -C{=O)O(hidroxialquilo). -C{=0)NH2. -C{=O)NH{alquilo), -C{=O)N(alquiloh. -OC{=O){alquilo), -OC{=O){hidroxialquilo), -OC(=O)O{alquilo), -OC{=O)O(hidroxialquilo), -OC{=O)NHz, -OC{=O)NH(alquilo), -OC(=0)N(alquilo)2, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC{=O)H, -NHC{=0)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquiloh, -NHC{=NH)NH2. -OS02(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S{cicloalquilo), -S(=O)alquilo, -S02(alquilo), -S02NH2, -SOzNH(alquilo) y -S02N(alquilo)2. Son sustituyentes más preferidos alqu ilo, alquenilo, halo, haloalquilo. hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi, -O(hidroxialquilo), -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -C02H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C{=O)O(hidroxialquilo). -C{=0)NH2, -C{=O)NH(alquilo), -C{=O)N(alquilo)z, -OC{=O){alquilo), -OC{=O)(hidroxialquilo), -OC{=O)O(alquilo), -OC{=O)O(hidroxialquilo), -0C{=O)NH2, -OC{=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)z, -NH2, -NH(alquilo), -N{alquiloh. -NH{arilo), -NHC{=O)(alquilo), -NHC{=O)H, -NHC{=O)NHz. -NHC{=O)NH{alquilo), -NHC(=O)N(alquilok y -NHC(=NH)NH2.
Donde está establecido un intervalo, como en "alquilo Cl-CS" de "5 al 10 %", tal intervalo incluye los puntos finales del intervalo, como en Cl y Cs en el primer ejemplo y 5 % y 10 % en el segundo ejemplo.
A menos que los esteroisómeros particulares estén especialmente indicados (por ejemplo, por un enlace marcado o discontinuo en un centro estérico relevante en una fórmula estructural, por representación de un doble enlace como teniendo configuración E o Z en una fórmula estructural, o usando nomenclatura designada para estereoquimica), todos los estereoisómeros están incluidos dentro del alcance de la invención, como compuestos puros asi como en forma de mezclas de los mismos. A menos que se indique otra cosa, los enantiómeros individuales, diastereómeros individuales, isómeros geométricos individuales y combinaciones y mezclas de los mismos están abarcados por la presente invención.
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los compuestos pueden tener formas tautómeras (por ejemplo, formas ceto y enol), formas de resonancia y formas hibridas que son equivalentes a aquellas representadas en las fórmulas estructurales usadas en el presente documento y que las fórmulas estructurales abarcan formas tautoméricas, de resonancia, o híbridas.
"t:ster farmacéuticamente aceptable" quiere decir un éster que se hidroliza in vivo (por ejemplo en el cuerpo humano) para producir el compuesto parental o una sal de los mismos o que tiene por sí mismo actividad similar a aquella del compuesto parental. Los ésteres adecuados incluyen ésteres alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS o alquinilo C2-CS, especialmente metilo, etilo o n-propilo.
"Sal farmacéutica mente aceptable" quiere decir una sal de un compuesto adecuado para formulación farmacéutica. Donde un compuesto tiene uno o más grupos básicos, la sal puede ser una sal de adición ácida, tal como un sulfato, hidrobrornuro, tartrato, rnesilato, rnaleato, citrato, fosfato, acetato, parnoato (ernbonato), hidroyoduro, nitrato, clorhidrato, lactato, metilsulfato, fumarato, benzoato, succinato, mesilato, lactobionato, suberato, tosilato y similares. Donde un compuesto tiene uno o más grupos ácidos, la sal puede ser una sal tal como una sal de calcio, sal de potasio, sal de magnesio, sal de meglumina, sal de amonio, sal de cinc, sal de piperazina, sal de trometamina, sal de litio, sal de colina, sal de dietilamina, sal de 4-fenilciclohexilamina, sal de benzatina, sal de SOdio, sal de tetrametilamonio y similares. formas y solvatos cristalinos polimórficos estén también comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
Compuestos
Una realización preferida de compuestos de fórmula (11) está representada por la fórmula (II-a)
(i¡)n Y 'l'
O O
(l1-a)
.... ~,.'y~,.!-~--Á'/'l' )lN,R"
I O R1 ~2 SJ H
en la que n, R1, R2 Y R3 son como se han definido anterionnente con respecto a la fónnula (II) y R4a es
n NH
,o (CH'),_3CH3
/c~1 ,
\ CO,H 0CO,H
En los compuestos de fórmula (II-a), la subunidad que corresponde a TupfTut en las tubulisinas que se dan en la naturaleza se ha reducido en tamaño y lipofilidad en al menos dos carbonos, por medio de deleción de los dos átomos de carbono alifáticos que siguen inmediatamente al grupo de ácido carboxilico -es decir, el grupo amino esta ahora Qcon respecto al grupo ácido carboxílico, en lugar de estar y-con respecto a él. En el caso en el que R4 sea 4-aminofenilalanina, el grupo amina constituye un resto polar que reduce adicionalmente la lipofilidad. Los estudios de $AR muestran que la lipofilidad es un factor importante en la actividad biológica de las tubulisinas y sus análogos o derivados. Steinmetz y col. 2004 y Neri y col. 2006 describen ambos que las tubulisinas que se dan en la naturaleza más lipófilas --es decir, aquellas que tienen una subunidad Tup (RA equ ivale a H en fónnula 1) en vez de una subunidad Tut (RA equivale a OH en fórmula 1)-poseen mayor actividad biológica. Adicionalmente, las diferencias en actividades se retuvieron independientemente del tamaño y la lipofilidad del residuo 11-aciloxi (grupo RC en fórmula (1 » en la subunidad Tuv (Steinmetz y col. 2004). Los presentes resultados indican que una subunidad TupfTutlip6fila es un elemento de SAR particularmente importante.
Las observaciones anteriores están parcialmente corroboradas en dos estudios por Balasubramanian y col. En el primero (Balasubramanian y col. 2008), se compararon análogos dimetilados en el carbono alfa para el grupo carboxilo en la subunidad Tup frente a análogos idénticos diferentes desmetilados en la misma posición. Los análogos dimetilados tienen actividad antiproliferativa mayor -aunque las Clso de inhibición de tubulina in vitro fueron comparables-que la que podría esperarse basándose en sus lipofidades relativas. Sin embargo, la presente tendencia no se siguió en el segundo estudio (Balasubramanian y col. 2009), en el que se compararon tres análogos (un carbono a desmetilado, uno monometilado, y uno dimetilado). Allí, el análogo más activo fue el desmetilado mientras que el monometilado--es decir, con la subunidad Tup natural-fue con mucho el menos activo. Sin embargo, el último análogo tenia modificaciones adicionales en otra parte en la molécula volviéndola esencialmente inactiva, haciendo que no esté claro que tales inferencias, si hay alguna, se pueden representar gráficamente.
Patterson y col. 2007 y Eliman y col. 2009 compararon las citotoxicidades de tubulisina O y análogos en los que bien solo el fenetiloo bien el grupo y-carboxi se retuvo en la subunidad Tup. El análogo retenido en fenetilo fue de 3,6 a 13,6 veces menos activo que la tubulisina O frente a tres lineas celulares cancerigenas pero cuando el grupo V-carboxilo menos lipófilo se retuvo hubo una pérdida de actividad incluso mayor, de 25,7 a 62,5 veces menos activo. Es decir, el orden de actividad fue:
> >
C02H
Tubulisina D
En documentos anteriores se sugiere individualmente y en combinación, que la lipofilidad en el locus de Tuf es especialmente importante para la actividad biológica de las tubulisinas. Por lo tanto, la técnica anterior sugiere que el reemplazo de la subunidad Tup con fenilalanina (Phe), 4-aminofenilalanina (4-NH2Phe), norvalina u otra subunidad R4 de acuerdo con la fórmula (II-a) es indeseable, ya que cada una conduciría a la pérdida de al menos dos carbonos alifáticos y a una reducción consiguiente en lipofilidad en el locus de TupfTul.
'" ", 1 NH2
'"
¡ ' N ¡'N!?e: H ¡'N Beo H ¡'N~OH
H 2 H 2 H 2
H C02H
Tup Phe 4-NH2Phe Norvalina
Otra realización preferida de compuestos de fórmula (11 ) está representada por fórmula (II-b):
~ NH2
", 1
(JI-b)
eo,H
5 en la que n, R\ R2, Y R3 son según se definen anteriormente con respecto a la fórmula (11). Aunque la fórmula quimica se puede encontrar en la bibliografía abarcando un grupo -NH2 en la posición 4 del anillo aromático de Tup (Domling 2005a y 2005b), no ha habido revelación sobre como un compuesto que tiene una característica tal podría fabricarse.
I En las fórmulas (11), (II-a) y (II-b), R' preferentemente es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS, o alquenilo Cr C5 y es más 10 preferentemente un residuo de isoleucilo, es decir:
En las fórmulas (11), (ti-a) y (II-b), R2 preferentemente es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cr Cs, CH20(alquilo Cl-CS) , CH20 (alquenilo C2-C5), CH20(C=0)(alquilo C,-C5), o CH20C(=0)(alquenilo Cr Cs); y más preferentemente es H, Me, 15 Et, n-Pr, CH20Me, CH20Et, CH20C(=O)i-Bu, CH20C(=O)n-Pr, CH20C(=O)CH=CH2, o CH20C(=O)Me, con Me, n-Pr, CH20Me, CH20C(=0)i-Bu y CH20(n-Pr) siendo especialmente preferidos.
En las fórmulas (11), (II-a) y (II-b), R3 preferentemente es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cr Cs, C(=O)alquilo Cl -CS, o C(=O)alquenilo C2-CS; y más preferentemente es H, Me, Et, o C(=O)Me.
Preferentemente , en las fórmulas (11) y (II-a), R4 y R4a son:
n NH2
o
\:J~~
CO,H
25 En las fórmulas (11), (II-a) y (II-b), n es preferentemente 1 y, en el caso de fórmula (11), RSpreferentemente es metilo; es decir, el anillo en la subunidad Mep preferentemente es una N-metilpiperidinilona.
Una realización preferida de compuestos de acuerdo con fórmula (II-a) se representa por fórmula (II-a')
(] O ' O
Y tR
'~"'y~"'r'i~'/'l,)lN'R" (l 1-a') I O ""1~2 sJ
H
30 donde R4a es según se define anteriormente con respecto a la fórmula (II-a), R2 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS, CH20(alquilo Cl-CS) , CH20(alquenilo C2-CS) , CH20(C=O)(alquilo C,-Cs), o CH20C(=O)(alquenilo Cr Cs); y RJ es H, alqu ilo C,-Cs, alquen ilo C2-CS, C(=O)alquilo Cl-CS, o C(=O)alquenilo Cr Cs. preferentemente, R es H, Me, Et, CH20Me, CH20Et, CH20C(=O)i-Bu, CH20C(=O)n-Pr, CH20C(=O)CH=CH2, o CH20C(=O)Me; más preferentemente Me, n-Pr, CH20Me, CH20C(=O)i-Bu o CH20(n-Pr). Preferentemente, R3 es H, Me, Et, o C(=O)Me.
Una realización preferida de compuestos de acuerdo con fórmula (II-b) se representa por fórmula (II-b')
NH,
(l o·Y R3
<¡,_O
"t;" ''¡(~.'~,:,~N,)lN (U-b') I O "~"~o ~2 s1 H
C02H
donde R2 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cr Cs, CH20(alquilo Cl-CS), CH20(alquenilo C2-CS), CH20(C=O)(alquilo Cl-CS) , o CH20C(=O)(alquenilo C2-CS); y R3 es H, alquilo C l-CS, alquenilo C2-CS, C(=O)alquilo Cl-CS, o C(=O)alquenilo 5 C2-CS. preferentemente, R2es H, Me, Et, CH20Me, CH20Et, CH20C(=O)i-Bu, CH20C(=O)n-Pr, CH20C(=O)CH=CH2,
o CH20C(=O)Me y R3 es H, Me, Et, o C(=O)Me.
Donde un grupo carboxilo en R4 está eSlerificado, preferentemente el éster es un éster de alquilo Cl-CS, tal como un
éster de Me, Et, o Pr. Alternativamente, el grupo carboxilo se puede amidar con amoniaco o con una alquilamina.
10 En otra realización, esta invención proporciona un compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (II-c)
(l ~ ~Oy Cjl_R':,Jl (IJ-e) "(),,:: NRi~..J! ~
C02R15
donde R13 es Me, n-Pr, CH20Me, o CH20C(=O)CH2CH(Mel2: R14 es Me o C(=O)Me; y R15 es H o alquilo Cl-CS 15 (preferentemente H, Me o Et).
En las fórmulas (II-b), (II-b') Y (II-c) la estereoqu¡mica en el metilo en la posición alfa con respecto al carboxilo preferentemente es aquella correspondiente a las tubulisinas que se dan en la naturaleza, es decir:
En una realización preferida, un compuesto de esta invención está en la forma de una amida del grupo carboxilo en R4 (o R43 , como puede ser el caso) con el grupo a-amina de un a-aminoácido. El a-aminoácido se puede seleccionar del grupo constituido por un aminoácido proteinogénico, 4-aminofenilalanina, norvalina, norleucina y citrulina. 25 Preferentemente, el a-aminoácido está seleccionado del grupo constituido por alanina, norvalina, glicina, lisina, arginina, citrulina, norleucina, 4-aminofenilalanina y fenilalanina. También preferentemente, la configuración absoluta del a-aminoácido es la proteinogénica, es decir, L. En la presente realización preferida, R4 (o R43 ) preferentemente es:
o
\EC:H
30 Ejemplos específicos de compuestos de la presente invención de acuerdo con la fórmula (11) incluyen compuestos (III-a) hasta (III-y). Algunos de los compuestos se representan como un éster farmacéuticamente aceptable o una amida farmacéulicamente aceptable del grupo carboxilo R4 con el grupo a-amina de un a-aminoácido o éster metilico de los mismos.
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5 La presente invención proporciona también intermedios novedosos que pueden utilizarse para la s¡ntesis de compuestos de la presente invención. Se pueden usar compuestos de acuerdo con la fórmula (VIII-a) para la fabricadón de compuestos de acuerdo con la fórmula (11) o (II-b), como se enseña en las figuras y ejemplos en el presente documento:
(VIII-.)
En fórmula (VIII-a), R7 es H o un grupo protector de amina y R8 es H, alquilo C,-C~O, alquenilo C2-Cl0, alquinilo C2-ClO, arilo, cicloalifático, alquilcicloalifático, arilalquilo, o alqu ilarilo. Preferentemente, R es H, Boc (t-butoxicarbonilo), Troc (2,2,2-tticloroetoxicarboniI0), Bpoc (1-metil-1-(4-bifenil)etoxicarbonilo» , Cbz (benciloxicarbonilo), Aloc
RB
(aliloxicarbonilo), metilamina, o Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo). Preferentemente, es H o alquilo C1-C5 15 (especialmente Me).
Otro intermedio novedoso útil para s¡ntesis de compuestos de la presente invención tiene una estructura de acuerdo con fórmula (VIlI-b). El uso de compuestos de fórmula (VIlI-b) para fabricar compuestos de la presente invención se enseña en las figuras y ejemplos en el presente documento.
NHR9
""1 ""
(VIII-b)
En fórmula (VIlI-b), R9 y R'O son independientemente H o un grupo protector de amina y Rll es H, alquilo Cl-ClO, al~uenilo C2-C,O, alquinilo C2-C,O, arilo, cicloalifático, alquilcicloalifático, arilalquilo, o alquilarilo. Preferentemente, R9 y
R1
están independientemente seleccionados de H, Boc, Troc, Bpoc, Cbz, Aloc, metilamina, y Fmoc. Preferentemente,
R11 y RlO
25 es H o alquilo C,-C5 (especialmente Me). Preferentemente, donde R9 son cada uno un grupo protector de
ami na, hay diferentes grupos protectores de ami na.
Se describen grupos protectores de amina adecuados adicionales para los compuestos de fórmula (VIII-a) y (VIlI-b) en Greene y Wuts, Protectíve Groups in Organic $ynthesis, 3aedición, páginas 464-653 (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999).
CONJUGADOS
En otro aspecto, se proporciona un conjugado que comprende compuesto citotóxico de acuerdo con la presente invención y un ligando, representado por fórmula (IV)
(IV)
donde Z es ligando; D es un compuesto citotóxico de acuerdo con la presente invención; y -(Xo)aC(xz}b-se refieren colectivamente como un "resto de engarce" o "engarce" debido a que unen l y D. Dentro del engarce, C es un grupo escindible diseñado para escindirse en el sitio de acción biológica deseada de compuesto O; XO y XZ se refieren como restos espaciadores (o "espaciadores") debido a que ellos espacian aparte D 1 C y C y l, respectivamente; los subíndices a y b son independientemente O o 1 (es decir, la Rresencia de XO yfo X es opcional); y el subíndice m es 1, 2,3,4,5,6,7,8,9, o 10 (preferentemente 1, 2, 3, o 4). D, x c, C, XZ y l se defi nen más plenamente más adelante.
Ligando l -por ejemplo un anticuerpo -sirve para una función de marcar como diana. Un iéndose a un tej ido o célula diana donde está localizado su antígeno o receptor, el ligando l dirige el conjugado allí. Preferentemente, el tejido diana o la célula diana es un tejido canceroso o una célula cancerosa y el antígeno o receptor es un antigeno asociado a tumor, es decir, un antígeno que se expresa únicamente por células cancerosas o que se sobreexpresa por células de cáncer, comparadas con células no cancerosas. La escisión del grupo C en el tejido o célula diana libera compuesto D para ejercer localmente su efecto citotóxico. En algunos casos, el conjugado se internaliza dentro de una célula diana por endocitosis y la escisión tiene lugar dentro de la célula diana. De esta manera, la administración precisa del compuesto O se logra en el sitio de acción deseado, reduciendo la dosificación necesitada. Además, el compuesto O está normalmente biológicamente inactivo (o es significativamente menos activo) en su estado conjugado, reduciendo de este modo la toxicidad indeseada contra tejidos o células que no son dianas. Como los fármacos anticancerígenos son a menudo altamente tóxicos para las células en general. ésta es una importante consideración.
Como se refleja por el subíndice m, cada molécula de ligando l puede conjugarse con un compuesto D, dependiendo del número de sitios D que tenga disponibles para conjugación y de las condiciones experimentales empleadas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que, mientras que cada molécula individual de ligando l está conjugada a un número entero de compuestos D, una preparación del conjugado puede analizarse para una proporción no entera de compuestos D frente a ligando l, reflejando un promedio estadístico.
Ligando Z y Conjugación del Mismo
Preferentemente, el ligando Z es un anticuerpo. Por conveniencia y brevedad y no por limitación, la discusión subsiguiente en el presente documento sobre la conjugac ión del ligando l está escrita en el contexto de que el ligando es un anticuerpo. Por la misma razón, la discusión detallada más adelante se escribe sobre todo en términos de proporción 1:1 de anticuerpo Z a compuesto D.
Preferentemente, el ligando l es un anticuerpo contra un antígeno asociado a tumor, permitiendo un conjugado que comprende a un ligando l tal marcar selectivamente células cancerosas. Ejemplos de tales antígenos incluyen: mesotelina, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), CD19, C022, C030, C070, B7H4 (también conocido como 08E), proteína tirosina quinasa 7 (PTK7), RG1, CTLA-4 YCD44. El anticuerpo puede ser animal (por ejemplo, murino), quimérico, humanizado, o, preferentemente, humano. El anticuerpo preferentemente es monoclonal, especialmente un anticuerpo monoclonal humano. La preparaCión de anticuerpos monoclonales humanos contra algunos de los antígenos anteriormente mencionados se revela en Korman y col., US 2009/0074660 A1 (B7H4); Rao-Na ik y coL , US 2009f01423490 A1 A2 (CD19); King y coL, WO 2008f070569 A2 (CD22); Keler y coL , US
7.387.776 B2 (2008) (CD30); Terretl y col., US 2009/0028872 A1 (CD70); Korman y col., US 6.984.720 B1 (2006) (CTLA-4); Korman y coL, US 2009/0217401 A1 (PD-1); Huang y col., US 2008f0279868 A1 (PSMA); Lu YcoL, US 2010/0034826 A1 (PTK7); Harkins y col., US 7.335.748 82(2008) (RG1); Terrett y col., WO 2009/045957 A1 (mesotelina); y Xu y col., US 2010f0092484 A1 (CD44).
El ligando Z puede ser también un fragmento de anticuerpo o un mimetizador de anticuerpos, tal como un affibooy, un anticuerpo de dominio (dAb), un nanocuerpo, un un ibody, a DARPin, una anticalina, un versabody, una duocalina, una lipocalina, o un avímero.
Pueden usarse grupos sulfhid rilo en el ligando Z como un sitio de conjugación, incluyendo grupos t-amino en residuos de lisina, restos de carbohidratos pendientes, grupos de ácidos carboxílicos, grupos disulfuro, y grupos tiol. Cada tipo de grupo reactivo representa una solución de compromiso, teniendo algunas ventajas y algunas desventajas. Para revisiones en grupos reactivos de anticuerpos adecuados para conjugación, véase, por ejemplo Garnett, Adv. Drug
Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 Y Dubowchik y Walker, Pharmaeology & Therapeuties 83 (1999), 67-123.
En aún otra realización, el anticuerpo Z puede estar conjugado por medio de un grupo disulfuro que forma un puente con un resto de cisteína en el anticuerpo Z y un azufre en la otra parte del conjugado. Algunos anticuerpos carecen de tiollibre (sulfhidrilo) pero tienen grupos disulfuro, por ejemplo en la región de bisagra. En tal caso, se pueden generar grupos tiol libres por reducción de grupos disulfuro nativos. Los grupos tiol asi generados pueden usarse después para conjugación. Véanse, por ejemplo, Packard y col., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King y col., Gancer Res. 54, 6176-6185 (1994); Y Doronina y col., Nature Bioteehnol. 21(7), 778-784 (2003). De nuevo, hay asuntos respecto a la localización de sitio de conjugación y estequiometria y el posible rompimiento de la conformación nativa del anticuerpo.
Se conoce un número de procedimientos para introducir grupos de tiol libres en anticuerpos sin romper enlaces disulfuro nativos, procedimientos que se pueden practicar con un ligando Z de la presente invención. Dependiendo del procedimiento empleado, puede ser posible introducir un número predecible de sulfhid rilos libres en localizaciones predeterminadas. En una aproximación, se prepararon anticuerpos mutados en los que una cisteina está sustituida por otro aminoácido. Véanse, por ejemplo, Eigenbrot y col., US 2007/0092940 A1 ; Chilkoti y col., Bioconjugate Ghem. 1994,5,504-507; Umovitz y col., US 4.698.420 (1987); Stimmel y col., J. Biol. Ghem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam y col., US 7.311.902 B2 (2007); Kuan y col., J. Biol. Ghem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon y col., J. Biol. Chem. , 270 (15), 8571-8577 (1995). En otra aproximación, se añadió una cisteína extra al extremo C-terminal. Véase, por ejemplo Cumber y col., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King y col., Caneer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li Y col., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang y col., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); Y Olafson y col., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004). Un procedimiento preferido para introducir cisteínas libres se enseña por Liu y col., WO 2009/026274 A1, en el que una secuencia de aminoácidos que lleva cisteína se añade al extremo C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo. El presente procedimiento introduce un número conocido de residuos de cisteina (uno por cadena pesada) en una localización conocida alejada del sitio de unión a antigenos.
En aún otra realización, los grupos E-amino se pueden modificar con reactivos heterobifuncionales tales como 2-iminotiolano o N-succinimidil-3-(2-pi ridilditio)propionato (SPDP), convirtiendo un grupo E-amino en un grupo tiol o disulfuro -creando un sustituto de cisteina, por asi decirto. Sin embargo, el presente procedimiento sufre de la misma localización de conjugación y limitaciones de estequiometria asociadas con grupos E-amino apropiados.
En aún otra realización preferida, el ligando Z está conjugado por medio del producto de adición nudeófila de un grupo tiol a un resto aceptar. Un resto aceptor preferido es un grupo maleimida, cuya reacción con un grupo tiol de un anticuerpo está genéricamente ilustrada más abajo. El grupo tiol puede ser un nativo, o uno introducido como se
describe anteriormente.
~~,------HS-Z D(XD).C(XZ~-N~ O
D(XO),C(XZlb ~~S'Z Ny O
Como se destaca anteriormente, la parte de engarce de un conjugado de la presente invención comprende hasta tres elementos: un grupo C escindible y espaciadores opcionales X y Xc.
El grupo escindible C es un grupo escindible en condiciones fisiológicas, preferentemente está seleccionado de tal forma que sea relativamente estable mientras que el conjugado está en la circulación general en el plasma sanguineo, pero se escinde fácilmente una vez que el conjugado alcanza su sitio de acción deseado, es decir, cerca, en, o dentro de la célula diana. Preferentemente, el conjugado se intemaliza por endocitosis por una célula diana tras la unión del anticuerpo Z a un antígeno presentado en la superficie de la célula. Subsiguientemente, la escisión del grupo C tiene lugar en un cuerpo vesicular de la célula diana (un endosoma temprano, un endosoma tardío, o, especialmente, un lisosoma).
En una realización, el grupo C es un grupo sensible a pH. El pH en plasma sanguíneo está ligeramente por encima del neutral, mientras que el pH dentro de un liS050ma es ácido, de alrededor de 5. Así, un grupo G cuya escisión está catalizada por ácido se escindirá a una velocidad varios órdenes de magnitud más rápido dentro de un li50soma que a la velocidad en plasma sanguineo. Ejemplos de grupos sensibles a ácidos adecuados incluyen cis-aconitil-amidas e hidrazonas, como se describe en Shen y col., US 4.631.190 (1986); Shen y col., US 5.144.011 (1992); Shen y col., Biochem. Biophys. Res. Gommun. 102, 1048-1054 (1981) Y Yang Y col., Proc. Natl Aead. Sci (USA) , 85 , 1189-1193
(1988).
En otra realización, el grupo C es un disulfuro. Los disulfuros se pueden escindir por un mecanismo de intercambio, a una velocidad dependiente de la concentración de tiol en el ambiente. Como la concentración intracelular de glutation y otros tioles es más alta que sus concentraciones de suero, la velocidad de escisión de un disulfuro será más alta intracelularmente. Adicionalmente, la velocidad de intercambio de tiol-disulfuro puede modularse por ajuste de las características estéricas y electrónicas del disulfuro (por ejemplo, un disulfuro aril-aquilo frente a un disulfuro
alquil-alquilo; sustitución del anillo arilo, etc.) permitiendo el diseño de vinculos disulfuro que han potenciado la estabilidad sérica de una velocidad de escisión particular. Para revelaciones adicionales relativas a grupos escindibles disulfuro en conjugados, véanse, por ejemplo, Thorpe y col., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi y col., US 2005/0287155 A1; Ng Y col., US 6.989.452 82 (2006); Ng Y col., WO 2002f096910A1; 80yd Y col., US 7.691.962 82; Y Sufi y col. , WO 2008/083312 A2 .
Un grupo C preferido comprende un enlace peptidico que se escinde, de preferencia por una proteasa, en el sitio deseado de acción, como opuesto a por una proteasa en el suero. Normalmente, el grupo e comprende desde 1 hasta 20 aminoácidos, preferentemente desde 1 hasta 6 aminoácidos, más preferentemente desde 1 hasta 3 aminoácidos. Elllos aminoácido(s) pueden ser a-aminoácidos naturales y/o no naturales. Los aminoácidos naturales con aquellos codificados por el código genético, asr como aminoácidos derivados de ahi, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, citrulina y O-fosfoserina. El término aminoácido también incluye análogos de aminoácidos y mimetizadores de aminoácidos. Los análogos son compuestos que tienen la misma estructura de H2N(R)CHC02H general de un aminoácido natural, salvo porque el grupo R no es uno encontrado entre los aminoácidos naturales. Los ejemplos de análogos incluyen homoserina, norleucina, metionina-sulfóxido, y metilsulfonio de metionina. Un imitador de aminoácidos es un compuesto que tiene una estructura diferente de la estructura qurmica general de un a-aminoácido pero que funciona en una manera similar a uno. El término "aminoácido no naturar se desea para representar la forma estereoquímica "O", siendo los aminoácidos naturales de la forma "L".
Preferentemente, el grupo C contiene una secuencia aminoacidica que es una secuencia de reconocimiento de escisión para una proteasa. Se conocen en la técnica muchas secuencias de reconocimiento de escisión. Véanse, por ejemplo, Matayoshi y col. Science 247: 954 (1990); ounn y col. Meth. Enzymol. 241 : 254 (1994); Seidah y col. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber y col. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith y col. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); Y Bouvier y col. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995).
Para conjugados que no se desee que sean internalizados por una célula, se puede elegir un grupo C tal que se escinda por una proteasa presente en la matriz extracelular en la vecindad de un tejido diana, por ejemplo, una proteasa liberada por células cercanas a la muerte o una proteasa asociada a tumor. Las proteasas asociadas a tumores extracelulares ejemplares son metaloproteasas de matriz (MMP), oligopeptidasa thimet (TOP) y C0 10.
Para conjugados que están disenados para intema1izarse por una célula, el grupo C preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada para escisión por una proteasa endosomal o lisosomal, especialmente la última. Ejemplos no limitantes de tales proteasas incluyen catepsinas B, C, O, H, L Y S, especialmente catepsina B. La catepsina 8 de preferencia escinde péptidos en una secuencia _AA2_AA'_ donde AA' es un aminoácido básico o fuertemente formador de puentes de hidrógeno (tales como lisina, arginina, o citrulina) y AA2 es un aminoácido hidrófobo (tal como fenilalanina, valina, alanina, leucina, o isoleucina), por ejemplo Val-Cit (donde Cit designa citrulina)
o Val-L~s. (En el presente documento, las secuencias de aminoácidos se escriben en la dirección N-a-C, como en H2N-AA2_AA1_C02H, a menos que el contexto claramente indique otra cosa). Para información adicional con respeclo a grupos escindibles por catepsina, véanse oubowchik y col., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik y col., 8ioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998); Y oubowchik y col., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002). Otra enzima que se pueden utilizar para escindir engarces peptidicos es la legumaina, una proteasa de cisterna lisosomal que se escinde de preferencia en Ala-Ala-Asn.
En una realización, el Grupo C es un péptido que comprende la secuencia de dos aminoácidos _AA2_AA'_ en la que AA' es lisina, arginina, o citrulina y AA2 es fenilalanina, valina, alanina, leucina o isoleucina. En otra realización, C consta de una secuencia de uno a cinco aminoácidos, seleccionados del grupo constituido por Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cil-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser y Glu.
La preparación y el diseno de grupos C escindibles constituidos por un aminoácido individual se describe en Chen y
col.,US201010113476A1 .
El Grupo C puede ser también un grupo fotoescindible, por ejemplo un éter nitrobencílico que se escinde tras exposición a la luz.
El Grupo C puede estar unido directamente a anticuerpo Z o a compuesto O; es decir, los espaciadores XZ y Xc, corno puede ser el caso, están ausentes. Por ejemplo, si el grupo C es un disulfuro, uno de los dos azufres puede ser un residuo de cisteína o su sustituto en anticuerpo Z. O, el grupo C puede ser una hidrazona unida a un aldehído en una cadena lateral de carbohidratos del anticuerpo. En una realización preferida, el compuesto O está unido directamente al grupo e por medio de un enlace peptidilo a un grupo carboxilico O a un grupo amina en el compuesto o.
Cuando está presente, el espaciador XZ proporciona separación espacial entre grupo C y anticuerpo Z, para que el primero no interfiera estéricamente con la unión a antigeno por el segundo o para que el segundo no interfiera estéricamente con la escisión del primero. Adicionalmente, el espaciador XZ se puede usar para conferir solubilidad incrementada o propiedades de agregación disminuidas a los conjugados. Un espaciador XZ puede comprender uno o más segmentos modulares, que se pueden ensamblar en cualquier número de combinaciones. Ejemplos de segmentos adecuados para un espaciador XZ son:
o
!-(CH'),.6-~-! !-(CH,),..-N-H !
y
en la que el subindice r es 1 a 24, preferentemente 2 a 4. l os presentes segmentos se pueden combinar para fabricar espaciadores XZ tales como:
O O
11 H 11 H H
~-(CH2b-C-N-(CH2CH20)4-CH2CH2-C-N-(CH2lz-N-~,
<;? H H !-(CH,h-C-N-(CH,),-N-!
~ H 'il H~
o ~-(CHzl2-6-N-C-(CH2lz-6-N-~
El espaciador XD, si está presente, proporciona separación espacial entre grupo e y compuesto O, para que el último no interfiera estéricamente o electrónicamente con la escisión del primero. El espaciador XD también puede servir para introducir masa molecular adicional y funcionalidad qu¡mica en un conjugado. Generalmente, la masa y la funcionalidad adicionales afectarán a la semivida sérica y a otras propiedades del conjugado. Asi, por selección juiciosa de grupos espaciadores, la semivida sérica de un conjugado se puede modular. El espaciador XD también puede ensamblarse a partir de segmentos modulares, como se describe anteriormente en el contexto del espaciador Xz.
Bien el espaciador XZo bien el Xc, o bien ambos, pueden comprender un resto autoinmolador. Un resto autoinmolador es un resto que (1) está unido al grupo C y bien al anticuerpo Z o bien a la citotoxina D y (2) tiene una estructura tal que la escisión a partir del grupo e inicia una secuencia de reacciones que da como resultado que el resto autoinmolador rompa los enlaces de si mismo a partir del anticuerpo Z o a partir de la citotoxina D, como puede ser el caso. En otras palabras, una reacción en un sitio distal de anticuerpoZ o de citotoxina D (escindible de grupo C) causa que se rompan igual el enlace XZ_Zo el enlace XO_O. la presencia de un resto autoinmolador es deseable en el caso del espaciador XO porque, si, después de escisión del conjugado, el espaciador xD o una parte del mismo estuvieron permaneciendo unidos a la citotoxina D, la actividad biológica del último puede estar dañada. El uso de un resto autoinmolador es especialmente deseable donde el grupo escindible e es un polipéptido.
Restos autoinmoladores ejemplares (i}-(v) unidos a un grupo hidroxilo o amino en una molécula O compañera se
muestran a continuación :
(i)
a b (ii) a b
;0 , O. )l. : N: 0~1~ :0H , '11: ¿..r-., , N. ~ : H:
,,, O-oro' '" :0'1 ' : ¿.~,• N. ~ : H:
(iv) a (v) a b
b 'JcF,CN ,
, ,O: Me Me ..
,~ : ° r)).. lJl..
O'°irN'(CH,l2'.~·Y¡ O Y S N,
:11 H'
:0 :
:0 .... ° ,
, ,
,
El resto auitoinmolador es la estructura entre lineas discontinuas a y b, con caracteristicas estructurales adyacentes mostradas para proporcionar contexto. los restos autoinmoladores (i) y (v) están unidos a un compuesto D-NH2 (es decir, el compuesto O está conjugado por medio de un grupo amino), mientras que los restos autoinmoladores (ii), (iii), Y (iv) están unidos a un compuesto O-OH (es decir, el compuesto O está conjugado por medio de un grupo hidroxilo o carboxilo). la escisión del enlace amida en la linea discontinua b libera el nitrógeno de amida como un nitrógeno de ami na , iniciando una secuencia de reacciones que da como resultado la escisión del enlace en la línea discontinua a y la liberación consecuente de D-OH o D-NH2, como puede ser el caso. Para discusiones adicionales con respecto a restos autoinmoladores, véanse Carl y col. , J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl y col., WO 81/01145 (1981); Dubowchik y col., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone y col., US 6.214.345 B1 (2001); Toki y col., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina y col., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd y col., US 7.691 .962 B2; Boyd y col., US 200810279868 A1; Sufi y col., WO 2008/083312 A2; Feng, US
5 7.375.07882; YSenter y col. , US 2003f0096743 A1 ;
Compuesto O -Composiciones de Engarce
Los conjugados de la presente invención se preparan preferentemente uniendo primero un compuesto O y engarce 10 (Xo)aC(Xz)b para formar una composición de engarce a fármacos representada por fórmula (V-a):
donde R 31 es un grupo funcional adecuado para hacerlo reaccionar con un grupo funcional en anticuerpo Z para formar 15 el conjugado. Ejemplos de grupos adecuados R31 incluyen:
!-N>
O
!-N=C=O
y
O
¡-C-H
!-N=C=S
R32 R33
20 donde es CI, Br, F, mesilato, o tosilato y es CI, Br, 1, F, OH, -O-N-succinimidilo, -O-(4-nitrofenilo), -O-pentafluorofenilo o -O-tetrafluorofenilo. La química generalmente usable
para la preparación de restos adecuados D_(XD)aC(xz}b_Rse revela en Ng y col., US 7.087.600 82 (2006); Ng Y col. , US 6.989.452 B2 (2006); Ng Ycol., US 7.129.261 B2 (2006); Ng Ycol., WO 02/096910 A1; Boyd y col., US 7.691.962 B2; Chen y col., US 200610004081 A1; Gangwar y col., US 200610247295 A1; Boyd y col., US 2008/0279868 A1 ;
25 Gangwar y col., US 2008/0281102 A1; Gangwar y col., US 2008/0293800 A1; Sufi y col., WO 2008f083312 A2; y Chen Ycol. , US 2010/0113476 A1.
En una realización preferida, R 31 es un grupo maleimida y la molécula de compuesto-engarce citotóxica puede estar representada por fórmula (V-b):
(Y.b)
en los que
35 nesO, 1 02;
R, RY R~ son independientemente H, alquilo C1-C10 sin sustituir o sustituido, alquenilo Cz-C1o sin sustituir o sustituido, alquinilo Cr Clo sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2h·20(alquilo C1-ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2)1_20(alquenilo Gr Gl0) sin sustituir o sustituido, (CH2h_20(alquinilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1_20C(=O)(alquilo C1-ClO) sin sustituir o sustituido,
40 (CH2h.lOC(=O)(alquenilo Cl -ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2)1.l0C{=O)(alquinilo Cr ClO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquilo Cl-GlO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquenilo G2-ClO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquinilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido;
45 R4, es
H
N-¡
CO,R12
NH,
\:
CO-¡ ~-¡"'"1
\: C:R12
NH,
"'"
~
\:
COi
"'"1
~
~~
\:
COZR'2
E,NH'
~I
\: CO,-¡
(CH2)o-3C H3
+c01
H
N-¡
"'"
~
\:
C02 R'2
~NH'
~I
\:
co-!
o
\:Ec:-¡
en la que R12 es H, alquilo e j-CS, alquenilo e 2-CS, o alquinilo C2-CS; y
Res H, alquilo e,-cs, alquenilo e2-CS, alquinilo C2-CS, CO(alquilo e ,-es), CO(alquenilo Cz-Cs). o CO(alquinilo C2-CS)'
10 XO y Xl: son grupos espaciadores; e es un grupo escindible; y a y b son independientemente O o 1;
en la que el grupo R4' está unido por medio de un grupo carbonilo o amina en lo mencionado bien a grupo XO en el caso 15 de que a sea 1 o bien al grupo e en el caso de que a sea Q.
Preferentemente. el enlace entre el grupo carboxilo o amina en R4' y el grupo XD o C. como puede ser el caso, es por medio de un enlace amida.
20 En las estructuras
H NH,
N-¡
\: y \: co-¡
la estereoquímica en el grupo metilo en posición alfa con respecto al grupo carboxilo preferentemente corresponde a aquella de las tubulisinas que se dan en la naturaleza, es decir:
o 'xCO-¡
Preferentemente, en fórmula (V-b) n es 1, R1 es un residuo de isoleucilo, a es O, b es 1, Y e comprende uno a cinco aminoácidos (preferentemente uno a dos), y R4' está unido a e por un enlace peptidilo que es escindible enzimáticamente, y R5 es Me. La presente realización preferida está representada por fórmula (V-c):
Yn °M,R3
O
(V-c)
. ~ ~ N,)l R"-(AA) -X'-N I
N" '" N '/J N~ 1-!I
09I O ,••., ~2 S /¡ H O
donde R2, R3, Y R4' son según se definen con respecto a fórmula (V-b), cada AA es independientemente un aminoácido natural, y XZ es CH2CH2NHC(=O)(CH2):2_5 o C(=O)(CH2h_s. Los aminoácidos AA preferidos son lisina, citrulina, alanina, 5 valina, glicina y fenilalanina.
En la fórmula (V-b), R' preferentemente es H, alquilo C,-C5, alquenilo C2-C5, o alquenilo Cz-C5 y es más preferentemente un residuo de isoleucilo, es decir:
".~
En las fórmulas (V-b) y (V-c), R2 preferentemente es H, alquilo C,-Cs, alquenilo Cr Cs, CH20{alqu¡Io C,-Cs), CH20{alquenilo C2-CS), CH20(C=O)(alquilo C,-Cs), o CH20C(=O)(alquenilo Cz-Cs); y más preferentemente es H, Me, Et, CH20Me, CH20Et, CH20C(=O)i-Bu, CH20C(=O)n-Pr, CH20C(=O)CH=CH2, o CH20C(=O)Me.
15 En las fórmulas (V-b) y (V-e), R3 preferentemente es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cz-Cs, C(=O}alquilo C,-Cs, o C(=O)alquenilo C2-C5; y más preferentemente es H, Me, Et, o C(=O)Me.
,
En las fórmulas (V-b) y (V-e), R preferentemente es
H
N-¡
'\
, O
0co,-¡ v-Co,-¡
con R4, equivaliendo a
H
N-¡
COzR~2
l2
25 Y Requivaliendo a H, prefiriéndose especialmente Me o El.
S
En la fórmula (V-b), n preferentemente es 1 y Rpreferentemente es metilo; es decir, el anillo en la subunidad Mep es preferentemente una N-metilpiperidinilona.
30 En otra realización, esta invención proporciona un compuesto que tiene una estructura representada por fórmula (V-d)
(1 o y ~_R" o "~,. 'J(~,~~/..,/,,,( , )lN
(V-d)
I O" R" s.J1 H
"O
donde R13 es Me, n-Pr, CHzOMe, o CH20CMe. o CH20C{=O)CH2CH(Me)2: R14 es Me o C(=O)Me: y R15 es H o alquilo el-eS (preferentemente H, Me o El); R's es un grupo de cadena lateral de lisina {(CH2)4NH2) o citrulina 5 «CH2l3NHC(=O)NH2); R17 es un grupo de cadena lateral de valina (C(Meh l o alanina (Me); y p es Oo 1.
Ejemplos de construcciones compuesto-engarce citolóxicas específicas se muestran en fórmulas de la (VI-a) a la (VI-t). El compuesto-engarce (VI-n) se prefiere especialmente. Ellos tienen un grupo maleimida y están listos para conjugación a un anticuerpo por medio de un grupo sulfhidrilo en ellos, por un procedimiento lal como aquel descrito a
10 continuación. (VJ-a)
(1 O Y ~Jl O
,,~,. 'J(~"~~~N,)lN
JO.. H
I SJ
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(VJ-b)
(1 O Y ~Jl
O
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I O ..' I SJ H
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"
(VJ-e) H (~H2)4NH2
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(1 oy~/ O '" O OA(CH,),-N¡J '-~" ''J(~,.(t:'~N,)lN O
I O.' I SJ H
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CO,H
(VI-e)
(VI-f) H (C;H, ).NH, . O PiN¡('NH O
(] H O Y <¡>.Jl.. O "" O OA(CH,),-N~
'-~"''lrN'..~,:,~N~)lN Co,H r
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(VJ-i) H,N O
,
H O O O H O H HN O
(Vl-j) H,N O
,
H O O O H O H HN O
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(VI-p)
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y
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(VI-r)
O
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1 O~,:~~ S~ H
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OH O , 1 O
(VI-s)
NH,
o
y
(VI-t)
Preparación de Conjugados
Lo siguiente es un procedimiento ilustrativo, basado en la introducción de grupos lioles libres en un anticuerpo mediante una reacción de grupos r-amino con 2-iminotiolano, seguida por reacción con un resto de engarce a fármacos que contiene maleimida tal como se describe anteriormente. Inicialmente el anticuerpo sufre intercambio de tampón en tampón fosfato 0,1 M (pH 8,0) que contiene NaCI 50 mM y ácido dietileno triamina pentaacético 2 mM (DTPA) y se concentra a 5-10 mglml. Se logra tiolación por adición de 2-iminotiolano al anticuerpo. La cantidad de 2-iminotiolano a añadirse puede determinarse por un experimento preliminar y varía de anticuerpo a anticuerpo. En el experimento preliminar, se añade una valoración de cantidades incrementantes de 2-imidotiolano al anticuerpo, y tras incubación con el anticuerpo durante 1 hora a TA (temperatura ambiente, alrededor de 25 OC), el anticuerpo sufre desalación en tampón HEPES de pH 6,0 50 mM usando una columna SEPHADEXTN G-25 y el número de grupos de tiol introducidos se determinó rápidamente por reacción con ditiopiridina (DTDP). La reacción de los grupos de tiales con DTDP da como resultado liberación de tiopiridina, que puede monitorizarse espectrofotométricamente a 324 nm. Se usan normalmente las muestras a una concentración de proteinas de 0,5-1 ,0 mgfml. La absorbancia a 280 nm se puede usar para determinar con seguridad la concentración de proteínas en las muestras, y después se incuba una alícuota de cada muestra (0,9 mi) con 0,1 mi de DTDP (solución de reserva a 5 mM en etanol) durante 10 minutos a TA. Las muestras de blanco de sólo tampón más DTDP se incuban también aliado. Después de 10 minutos, se mide la absorbancia a 324 nm y el número de grupos de tial se cuantifica usando un coeficiente de extinción para tiopiridina de 19.800 M"1.
Normalmente es deseable un nivel de tiolación de aproximadamente tres grupos tiol por anticuerpo. Por ejemplo, con algunos anticuerpos esto puede lograrse añadiendo un exceso molar de 15 veces de 2-iminotiolano seguido por incubación a TA durante 1 hora. El anticuerpo se incuba después con 2-iminotiolano a la proporción molar deseada y después sufre desalación en tampón de conjugación (tampón HEPES de pH 6,0 50 mM que contiene glicina 5 mM y DTPA 2 mM). El material tialado se mantiene sobre hielo mientras que el número de tioles introducido se cuantifica como se describe anteriormente.
Después de verificación del número de tioles introducidos, se añade el resto de engarce a fármacos a un exceso molar de 3 veces por tiol. La reacción de conjugación se deja avanzar en tampón de conjugación que contiene también una concentración final de dimetilsulfóxido (DMSO) al 5 %, o disolvente altemativo similar. Comúnmente, la solución de reserva de engarce a fármaco se disuelve en DMSO al 100 %. La solución de reacción se añade directamente al anticuerpo tiolado, que tiene suficiente DMSA añadido para llevar la concentración final al 10 %, o se pre-diluye en tampón de conjugación que contiene una concentración final de DMSO al 10 %, seguida por adición a un volumen igual de anticuerpo tiolado.
La mezcla de reacción de conjugación se incuba a TA durante 2 h con agitación. Tras la incubación, la mezcla de reacción de conjugación se centrifugó y se filtró a través de un filtro de 0,2 IJm. La purificación del conjugado se puede logar por cromatografia usando un número de procedimientos. En un procedimiento, el conjugado se purifica usando cromatografia de exclusión de tamaño en una columna de SEPHACRYL ™ S200 pre-equilibrada con tampón de 5 HEPES a pH 7,2 50 mM que contiene glicina 5 mM y NaCI50 mM. La cromatografia se lleva a cabo a una velocidad de flujo lineal de 28 cm/h. Las fracciones que tienen conjugados se recogen, se almacenan y se concentran. En un procedimiento altemativo, la purificación se puede llevar a cabo por cromatografía de intercambio iónico. Las condiciones varian de anticuerpo a anticuerpo y se deberían optimizar en cada caso. Por ejemplo, se aplica mezcla de reacción de conjugado anticuerpo-fánnaoo a una columna de SP-SEFAROSA 1M pre-equilibrada en HEPES de pH 5,5
10 50 mM que contiene glicina 5 mM. El conjugado de anticuerpo se eluye usando un gradiente de NaCI 0-1 M en tampón de equilibración a pH 5,5. Las fracciones relevantes que contienen el conjugado se almacenan y dializan frente a tampón de fonnulación (tampón de HEPES a pH 7,2 50 mM conteniendo glicina 5 mM y NaCI100 mM).
Aquellos expertos en la técnica entenderán que las condiciones y la metodologia anterionnente descritas son 15 ejemplares y no limitantes y que otras aproximaciones para conjugación se conocen en la técnica y son usa bies en la presente invención.
Usando las técnicas anteriores, se conjugaron los compuestos de esta invención usando anticuerpos 2A10, un anticuerpo anti-PSMA (Huang y col. , documento US 2009/0297438); 2H5, una anticuerpo anli-CD70 (Coceia y col. , 20 WO 2008f074004 A2); o 6A4, un anticuerpo antimesotelina (Terretl y col., WO 2009f04957). Los conjugados resultantes se pueden representar por las siguientes fónnulas, donde Ab representa un anticuerpo. Aquellos expertos en la técnica entenderán que en estas fónnulas la proporción del compuesto citotoxina-anticuerpo se muestra como
1:1 por simpl icidad, pero esa en la actua lidad es usualmente más grande, lal como entre 2 a 3.
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~., 1 CO, H
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
En otro aspecto, la presente revelación proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente revelación formulado conjuntamente con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Puede contener opcionalmente uno o más ingredientes farmacéuticamente activos adicionales, tales como un anticuerpo u otro fármaco. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una terapia de combinación con otro agente terapéutico, especialmente otro agente anticancerigeno.
La composición farmacéutica puede comprender uno o más excipientes. Los excipientes que se pueden usar incluyen vehiculos, agentes activos de superficie, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, coadyuvantes de disperSión o solución, solubilizadores, colorantes, agentes aromatizantes, revestimientos, agentes disgregantes, lubricantes, edulcorantes, conservantes. agentes isotónicos y combinaciones de los mismos. La selección y uso de excipientes adecuados se enseña en Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Phannacy, 208 edición (Lippincott Williams & Wilkins 2003).
Preferentemente, una composición farmacéutica es adecuada para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, espinal o epidérmica (por ejemplo, por injección o infusión). Dependiendo de la via de administración, el compuesto activo puede estar revestido de un material para protegerlo de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivarlo. La frase "administración parenteral" quiere decir modos de administración distintos de la administración enteral o tópica, usualmente por injección, e incluye, sin limitación. inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Altemativamente, la composición farmacéutica puede administrarse por medio de una v¡a no parenteral, tal como via de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo intranasalmente, oralmente, vaginal mente, rectalmente, sublingualmente o tópicamente.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles. Se pueden formular también en una microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para lograr concentración de fármaco elevada.
La cantidad del ingrediente activo que se puede combinar con un material veh¡culo para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo de administración particular y será generalmente aquella cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. Generalmente, fuera de un cien por ciento, la presente cantidad variará desde aproximadamente el 0,01 por ciento hasta aproximadamente el noventainueve por ciento de ingrediente activo, preferentemente desde aproximadamente el 0,1 por ciento hasta aproximadamente el 70 por ciento, más preferentemente desde aproximadamente el 1 por ciento hasta aproximadamente el 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un veh¡cul0 farmacéutica mente aceptable.
Los reg¡menes de dosificación están ajustados para proporcionar una respuesta terapéutica. Por ejemplo, se puede administrar una inyección intravenosa rápida individual, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo. o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como se indique por las exigencias de la situación. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. "Forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades fisicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir la respuesta terapéutica deseada, en asociación con el veh¡cul0 farmacéutico requerido.
La dosificación varia desde aproximadamente 0,0001 hasta 100 mg/kg, y más usualmente 0,01 a 5 mglkg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mgfkg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mgfkg de peso corporal o 10 mgfkg de peso corporal o pueden estar dentro del intervalo de 1-10 mg/kg . Los regimenes de tratamiento ejemplares son de administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3
meses, o una vez cada tres a 6 meses. Los regimenes de dosificación preferidos incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mgfkg de peso corporal por medio de administración intravenosa, usando uno de los siguientes programas de administración de dosis: (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mgfkg de peso corporal una vez seguidos por 1 mgfkg de peso corporal cada tres semanas. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 ¡.Jgfml y en algunos procedimientos de aproximadamente 25-300 ¡.Jgfml.
Una "cantidad terapéulicamente efectiva" de un compuesto de la invención da como resultado preferentemente un decrecimiento en gravedad de los sintomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duración de periodos libres de los síntomas de la enfermedad, o una prevención de alteración o discapacidad debida a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de sujetos portadores de tumores, una "cantidad terapéutica mente efectiva" inhibe preferentemente crecimiento tumoral en al menos aproximadamente el 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente el 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente el 60 %, y hasta más preferentemente en al menos aproximadamente el 80 % en relación a sujetos no tratados. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar de otra forma síntomas en un sujeto, que es normalmente un ser humano pero puede ser otro mamífero.
La composición farmacéutica puede ser una formulación controlada o mantenida, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polimeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de vinilo etileno, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Véase, por ejemplo, Sus/ained and Gontrolled Release Drug Delivery Systems, J .R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar por medio de dispositivos médicos tales como (1) dispositivos de inyección hipodérmica sin agujas (por ejemplo, documentos US 5.399.163; 5.383.851 ; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; Y 4.596.556); (2) bombas de microinfusión (documento US 4.487.603); (3) dispositivos transdérmicos (documento US 4.486.194); (4) aparatos de infusión (documentos US 4.447.233 y 4.447.224); Y (5) dispositivos osmóticos (documentos US 4.439.196 y 4.475.196).
En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular para asegurar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención cruzan la barrera hematoencefálica, se pueden formular en liposomas, que pueden comprender adicionalmente restos marcados como objetivo para potenciar transporte selectivo a células u órganos especificos. Véanse, por ejemplo, los documentos US 4.522.811 ; 5.374.548; 5.416.016; Y 5.399.331; VV Ranade (1989) J. Glin. Pharmacof. 29: 685; Umezawa y col., (1988) Biochem. Biophys. Res. Gommun. 153: 1038; Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais y col. (1995) Antimicrob. Agents Ghemother. 39: 180; Briscoe y col. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134; Schreier y col. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen y Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; y Killion y Fidler (1994) Immunomethods.4: 273.
USOS
Los compuestos de la presente invención o sus conjugados se pueden usa r para tratar enfermedades tales como, pero no limitadas a. enfermedades hiperproliferativas, incluyendo: cánceres de la cabeza y el cuello que incluyen tumores de la cabeza, el cuello, la cavidad nasal, los senos paranasales, la nasofaringe, la cavidad oral, la orofaringe, la laringe, la hipofa ringe, las glándulas salivares, y los paragangliomas; cánceres del higado y del árbol biliar, particularmente carcinoma hepatocelular; cánceres intestinales, particularmente cáncer colorrectal; cáncer ovárico; cáncer de pulmón de células pequeñas y no de células pequeñas (SCLC y NSCLC); sarcomas de cáncer de mama, tales como fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, rabdomiosarcoma embrionario, leiomiosarcoma, neurofibrosarcoma, osteosarcoma, sarcoma sinovial, liposarcoma y sarcoma de parte blanda alveolar; leucemias tales como leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mielógena crónica (CML); neoplasmas de los sistemas nerviosos centrales, particularmente cáncer cerebral; mieloma múltiple (MM), linfomas tales como linfoma de Hodgkin, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma folicular, linfoma de tejidos linfoides asociados a mucosas, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes del linaje B, linfoma de Burkitt y linfoma de células grandes anaplásicas de células T. Clinicamente, la práctica de los procedimientos y el uso de las composiciones descritas en el presente documento darán como resultado una reducción en tamaf'io o número del crecimiento canceroso y/o una reducción en sintomas asociados (donde sea aplicable). Patológicamente, la práctica del procedimiento y el uso de las composiciones descritas en el presente documento producirán una respuesta patológicamente relevante, tal como: inhibición de proliferación de células cancerosas, reducción en el tamaf'io del cáncer o del tumor, prevención de metástasis adicionales e inhibición de angiogénesis tumorales. El procedimiento de tratar tales enfermedades comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de la invención a un sujeto. El procedimiento se puede repetir tantas veces como sea necesario. Especialmente, el cáncer puede ser cáncer colorreclal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de mama, melanoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer ovárico, mieloma múltiple, cáncer renal, leucemia (especialmente ALL, APL, o AML), o linfoma.
Los compuestos de la presente invención o sus conjugados se pueden administrar en combinación con otros agentes anticancerígenos o citotóxicos, incluyendo anticuerpos, agentes alquilantes, inhibidores de angiogénesis;
antimetabolitos, escindidores de ADN, reticuladores de ADN, intercalantes de ADN, ligandos del surco menor del ADN, enediinas, inhibidores de la proteína de choque término 90, inhibidores de la deacetilasa de histonas, inmunomoduladores, estabilizadores de microtúbulos, análogos de nucleósidos (de purinas o de pirimidinas), inhibidores de exportación nuclear, inhibidores de proteosomas, inhibidores de topoisomerasa (1 o 11), inhibidores de tirosina quinasas e inhibidores de serinaltreonina quinasas. Los agentes anticancerigenos o citotóxicos especificos incluyen p-Iapachona, ansamitocina P3, au ristatina, bicalutamida, bleomicina, bortezomib, busulfán, calistatina A, camptotecina, capecitabina, CC-1065, cisplatina, criptoficinas, daunorrubicina, disorazol, docetaxel, doxorrubicina, duocarmicina, dinemicina A, epotilonas, etopósido, floxuridina, floxuridina, fludarabina, fluoruracilo, gefitinib, geldanamicina, 17 -alilamino-17 -demetoxigeldanamicina (17 -AAG), 17 -(2-d imetilaminoetil)amin017 -demetoxigeldanamicina (17 -DMAG), gemcitabina, hidroxiurea, imatinib, interferones, interleucinas, irinotecán, maitansina, metotrexato, mitomicina C, oxaliplatina, paclitaxel, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), tiotepa, topotecán, tricostatina A, vinblastina, vincristina, vindesina, lenalidomida (REVUMIDd®), bevacizumab (AVASTINA®), trastuzumab (HERCEPTINA®) y cetuximab (ERBITUX®).
Ejemplos
La práctica de la presente invención puede entenderse por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ejemplo y no de limitación.
Ejemplo 1 -Esquema 1
Esquema 1 (Figs. 1a y 1 b) representan un procedimiento para fabricar compuestos de la presente invención.
Tioamida 2. Se mezcló 2,2-dietoxiacetonitrilo 1 (25 g, 193 mmol) con (NH4)2S (40 mi, 265 mmol, solución al 45 % en agua) en 300 mi de metanol (MeOH) a temperatura ambiente (TA). Después de guardar la mezcla de reacción durante toda una noche, se concentró a vacío y el residuo se llevó en acetato de etilo (EtOAc). La solución de EtOAc se lavó después con solución de NaHC03 saturada, salmuera y se secó sobre Na2S04 anhidro. El EtOAc se evaporó dando tioamida 2 (26 g, 159 mmol, 82 %) como un sólido blanco. RMN-'H (400 MHz, CDCI3) ti 5,01 (s, 1 H), 3,67 (m, 4H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 6H).
2-(dietoximetil)tiazo/-4-carboxilato de metilo 3. Se añadieron 100 9 de tamices moleculares (3A) a una mezcla de reacción de tioamida 2 (25 g, 153 mmol) y bromopiruvato de metilo (20 mi, 163 mmol) en 300 mi de MeOH. Después de que la mezcla se sometiera a reflujo durante 1,5 h, se enfrió y se filtró a través de CEUTET~. El filtrado se concentró y se hizo pasar a través de una columna {didorometano (DCM):EtOAc, 8:1) dando carboxilato de tiazol 3 (34,5 g, 140 mmol, 91 %) como un sólido, que se usó para la etapa siguiente sin purificación adicional.
2-formiJtiazol-4-carboxilato de metilo 4. Se disolvió tiazol-4-carboxilato 3 (30 g, 122 mmol) en 300 mi de acetona, a la que se añadió HCI acuoso (21 mi, 2 M). Después de guardar la mezcla de reacción a TA durante toda una noche, la mezcla de reacción se calentó y se mantuvo a 60'C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y evaporó después dando un residuo que se llevó en 200 mi de DCM. La solución de DCM se lavó después con solución de NaHC0 3 saturada, y después salmuera y se secó sobre Na2S04 anhidro. La solución de DCM se filtró y se concentró a vacío dando la solución concentrada que se trituró con éter dando 2-formiltiazol-4-carboxilato de metilo 4 (14 g, 82 mmol, 54 % para las dos etapas) como un sólido blanco. RMN-'H (400 MHz, CDCI3) ti 133-8-p110,16 (d, J = 1,3 Hz, 1 H), 8,53 (d, J = 1,3 Hz, 1 H), 4,01 (s, 3H).
Sulfinimina 7. Se disolvió (S)-2-metilpropano-2-sulfinamida 5 (7,3 mi, 68 mmol) en 100 mi de tetrahidrofurano (THF), a lo que se añadió Ti(OEt).¡ (27 mi, 130 mmol) y 3-metil-2-butanona 6 (8 g, 41 mmol) a TA. La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante toda una noche y después se enfrió y se añadió a una solución de salmuera. La mezcla resultante se filtró, y la torta se lavó con EtOAc. La fase orgánica se concentró dando un residuo que se sometió a cromatografia en columna de gel de sUice (DCM:EtOAc, 4:1) dando sulfinimina 7 (9,5 g, 37 mmol, 75 %) como un aceite. RMN_1 H (400 MHz, CDCb) ti 2,53 (m, 1 H), 2,29 (s, 3H), 1,22 (s, 9H), 1,12 (d, J = 4,2 Hz, 3H), 1,10 (d, J = 4,2 Hz, 3H). EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 190,12, hallada, 190.
Compuesto 8. Se anadió diisopropilamida de litio (LOA", 60 mi, 108 mmol, 1,8 M) a 200 mi de éter a -78 'C seguidos por la adición de sulfinimina 7 (18,9 g, 100 mmol) en 200 mi de éter y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 40 mino Se anadió CITi(OiPr):¡ (203 mmol, 48,4 mi) a la mezda de reacción y la solución se agitó durante 60 mino Una solución de 2-formiltiazol-4-carboxilato de metilo 4 (12,5 g, 72,6 mmol) en 180 mi de THF se añadió lentamente a la mezcla de reacción. Después de otras 2 horas a -78 'C, se anadió una mezcla de ácido acético y THF (1/5 vlv, 4,9 mi). La mezcla se calentó a 5 'C durante 1 hora ydespué s se vertió en una solución de salmuera. El producto deseado se extrajo después a partir de la solución de salmuera con éter y solución de EtOAc. La fase orgánica se secó después sobre MgS04 anhidro, se filtró y se evaporó. El residuo se hizo pasar a través de 2 columnas (DCM:EtOAc y Hexano:EtOAc) dando compuesto 8 (19,6 g, 54 mmol, 75 %) como un aceite. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 361,12, hallada, 361.
Compuesto 9. Una solución de compuesto 8 (19 g, 52,7 mmol) en 200 mi de THF se enfrió a -78 'C, después de lo cual se anadió lentamente Ti(OEt).¡ (21,7 mi, 105 mmol). Después de 60 minutos, cuando la solución llega a ser
transparente, se añadió NaBH4 (31 mmol, 1,17 g), después de 2 h (tiempo de reacción más largo causó reducción del éster) se añadieron 10 mi de MeOH. La mezcla se calentó después a O 'C, se vertió en 1 mi de HOAc en un lote de hielo. La mezcla se filtró y la torta se lavó con EtOAc. Después de la separación, la fase orgánica se secó con Na2S04 y se evaporó. El residuo final se hizo pasar a través de una columna (DCM:EtOAc, 1:4) dando compuesto 9 (19 g, 52 mmol, 99 %) como un aceite. RMN-'H (400 MHz, CDCI3) ti 8,1 (s, 1H), 5,54 (d, J = 6,7 Hz, 1 H), 5,16 (m, 1 H), 3,92 (s, 3H), 3,42 (m, 1~), 3,32 (d , J = 8,4 Hf3 1H), 2,25 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,68 (m, 1H), 1,26 (s, 9H), 0,91 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,87 (d, J -6,7 Hz, 3H). RMN-C (100 MHz, CDCI3) ti 177,9, 162,1 , 146,6, 127,7, 67,9, 58,6, 56,4, 52,5, 40,8, 33,9,23,1,19,8,17,4. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 363,13, hallada, 363.
Compuesto dimetilado 10. Se añadió hidruro de sodio (9,69 mmol, 60 %, 387 mg) a una solución de compuesto 9 en 6 mi de N,N-dimetilformamida (DMF) a 5 'C seguido por yoduro de metilo (607 ul, 9,7 mmol) después de 60 minutos. Después de agitar la mezcla de reacción durante 3 h, la mezcla se vertió en solución de NH4CI saturada enfriada en hielo. Se añadió éter etrlico y la fase organica se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró dando un residuo. El residuo se hizo pasar a través de una columna (hexano:EtOAc 1:4) dando el compuesto dimetilado 10 (314 mg, 0,805 mmol, 33 %) como un liquido. RMN-'H (400 MHz, CDCb) ti 8,17 (s, 1H), 4,87 (dd, J = 11,0 Hz, J = 2,5 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,50 (s, 3H), 3,40 (m, 1 H), 2,58 (s, 3H), 1,99 (m, 1 H), 1,83 (m, 2H), 1,25 (s, 9H), 0,98 (d , J = 6,8 Hz, 3H), 0,95(d, J = 6,7 Hz, 3H). EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 391,16, hallada, 391.
Monometilamina 11. Se añadió HCI acuoso (4 N, en dioxano, 0,5 mi) a una solución de un compuesto dimetilado 10 (370 mg, 0,95 mmol) en 5 mi de MeOH. DespuéS de agitar la mezcla de reacción durante 60 minutos, se evaporó en agitación dando monometilamina 11 (362 mg) como su sal de HCI, que se puede usar para la etapa siguiente sin purificación adicional. EM (ES+) mIz, calculada: m+1 , 287,14, hallada, 287.
Amida 12. Se mezclaron monometilamina 11 (362 mg, 1,12 mmol), compuesto de Fmoc 22 (preparado por Wipf y col., 2007; 1,2 g, 3,38 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (OlEA, 976 ul, 5,6 mmol) en 5 mi de DMF a TA. Después de agitar durante 24 horas, la mezcla se concentró y el residuo se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaHC03, salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró dando un residuo. El residuo se hizo pasar a través de una columna (hexano:EtOAt:MeOH 7:3:0,6) dando amida 12 (466 mg, 0,75 mmol, 67 %) como un aceite. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 622,2, hallada, 622.
Compuesto 13. Se disolvió amida 12 (466 mg, 0,75 mmol) en 8 mi de DCM que contienen piperidina al 5 °/0 aTA. Después de 1 hora, la mezcla se evaporó a vac¡o y el residuo se hizo pasar a través de una columna dando un aceite (150 mg) que se mezcló después con ácido (D)-N-metilpipecollnico 23 ("D-Mep," preparado por Peltier y col., 2006; 50 mg, 0,35 mmol), hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-0-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio ("HATU," 126 mg, 0,33 mmol), DIEA (152 ul, 0,84 mmol) en 2 mi de DCM. Después de agitar a 2,5 h, el disolvente se evaporó dando un residuo que se disolvió en EtOAc. La fase organica se lavó después con NaHC03 saturado, salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró dando un residuo. El residuo se hizo pasar a través de una columna (DCM al 0-10 %:MeOH) dando compuesto 13 (99 mg, 0,188 mmol, 25 %) como un aceite. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 525,3, hallada, 525.
Acido 14. El compuesto 13 (99 mg, 0,18 mmol) se disolvió en una mezcla de 3 mi de MeOH yagua (3:1 v:v), a la que se añadió NaOH (370 ul, 0,37 mmol, 1 M). Después de agitar durante dos horas, la mezcla de reacción se neutralizó y se concentró dando un residuo. El residuo se hizo pasar a través de una columna C-18 (agua (ácido trifluoroacético al1 % ("TFA"»:acetonitrilo (ACN) (TFA al1 %), 0-100 %) dando ácido 14 (78 mg, 0,125 mmol, 69 %) como una sal de TFA. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 511,29, hallada, 511.
Compuesto 15. OlEA (24 ul, 137 umol) se añadió a una solución de ácido 14 (9 mg, 14,4 umol, sal de TFA) y HATU (6 mg, 15 umol) en DMF (0,5 mi) a TA. Después de que se activó todo el aeido 14 (monitorizado por HPLC), se añadió tubufenilalanina (preparada por Peltier y col. 2006; 6,5 mg, 27 umol, sal de HCI). Después de agitar durante 20 minutos, la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna e -18 (agua (TFA al1 %):ACN (TFA al 1 %), 0-100 %) dando compuesto 15 (2,5 mg, 3 umol, 21 %) como una sal blanca de TFA. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 700,4, hallada, 700.
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Compuesto 16. Se añadió Ol EA (20 ul, 0,11 mmol) a una solución de acido 14 (12 mg, 0,0 19 mmol, sal de TFA), éster met¡lico de fenilalanina (5,3 mg, 0,024 mmol, como sal de HCI) y HATU (11 ,4 mg, 0,03 mmol) en 0,5 mi de DMF. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna C-18 (agua (TFA al 1 %):ACN (TFA al 1 %),0-100 %)dando compuesto 16 (4,2 mg, 0,005 umol, 26 %) como una sal blanca de TFA. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 672,89, hallada, 672,5. El compuesto 16 se refiere también como compuesto (III-c) anteriormente en el presente documento.
Compuesto 17. Se añadió OlEA (7 ul, 0,04 mmol) a una solución de ácido 14 (5 mg, 0,008 mmOI), éster de
5 metilnorvalina ("NVaM,N 2 mg, 0,012 mmol) y HATU (4,5 mg, 0,012 mmol) en OMF. Después de agitar la mezcla de reacción durante 30 minutos la mezcla en bruto se hizo pasar a través de una columna e-18 (agua (TFA al 1 %):ACN (TFA al 1 %),0-100 %) dando compuesto 17 (1 ,3 mg, 0,0017 mmol, 21 %) como una sal blanca de TFA. EM (ES+) mIz, calculada: m+1 , 624,85, hallada, 624,5. El compuesto 17 se refiere también como compuesto (I II-e) anteriormente en el presente documento.
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ACido 18. Se añadió NaOH acuoso (75 ul, 0,75 mmol, 10 M) a una solución de compuesto 16 (168 mg, 0,25 mmol) en una mezcla de MeOH y THF. Después de agitar durante toda una noche, la mezcla se neutralizó y se liofilizó a sequedad. El sólido se usó para la etapa siguiente sin purificación adicional. EM (ES+) miz, calculada: m+1, 658,36,
15 hallada, 658,4. El compuesto 18 se refiere también como compuesto (111-0) anteriormente en el presente documento.
NorvaliJamida 19. Se añadió OlEA (5 ul, 0,04 mmol) a una solución de ácido 18 (5 mg, 0,006 mmOI), HATU (3,5 mg, 0,009 mmol) y NVaM (4,5 mg, 0,009 mmol) en DMF. Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se hizo pasara través de una columna C-18 (agua (TFA all %):ACN (TFA al 1 %), 0-100 %) dando norvalilamida 19 (2 ,5
20 mg, 0,0025 umol, 40 %) como una sal blanca de TFA. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 772,02, hallada, 771,5. El compuesto 19 se refiere también como compuesto (1I1-f) anteriormente en el presente documento.
Compuestos 24, 25 Y 26. Estos tres compuestos se sintetizaron a partir de ácido 14 o 18 usando procedimientos análogos a aquellos descritos anterionnente. Los productos se pUrificaron todos por una columna C-18 (agua (TFA al
25 1 %): ACN (TFA al 1 %) 0-100 %). Los rendimientos variaron desde 25-50 %. Compuesto 24: EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 743,4, hallada, 743. Compuesto 25: EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 686,39, hallada, 686,5. Compuesto 26: EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 700,40, hallada, 700,5 .
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35 El compuesto 24 se refiere también como compuesto (1I1-g) anteriormente en el presente documento.
Compuesto 26a. El compuesto 14 se acopló con Ala-Phe OMe siguiendo el mismo procedimiento como se describe
para el compuesto 16. El producto se purificó por una columna C-18 {agua (TFA al1 %): ACN (TFA al1 %) 0-100 %). EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 743, hallada 743,4. El compuesto 26a se refiere también como compuesto (1I1-1) anterionnente en el presente documento.
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Ejemplo 2 -Esquema 2
10 El presente ejemplo describe la sintesis de compuestos mostrada en el Esquema 2 (Fig. 2).
Compuesto 28. Se añadieron éster metílico de fenilalanina (10 mg, 46,5 ¡Jmol) y HATU (14,7 mg, 38,6 umol) a una solución de compuesto 27 (preparado por Peltier y coL, 2006; 10 mg, 15,5 ¡JmOI, sal de formiato) en 0,5 mi de DMF seguido por DIEA a TA. Después de agitar durante 30 minutos, se añadió DMSO (2 mi) y la mezcla de reacción se
15 sometió directamente a una columna C-18 {agua (formiato de amonio 5 mM, pH 7,2):ACN 0-100 %), dando compuesto 28 (3,2 mg, 25 %) como un sólido blanco (sal de formiato). EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 758,41, hallada, 758,4. El compuesto 28 se refiere también como compuesto (III-h) anteriormente en el presente documento.
Compuesto 29. Se añadió anhidrido acético (30 ¡JI, 290 ¡Jmol) a una solución de compuesto 28 (3,2 mg, 3 ¡JmOI, sal de
20 formiato) en 0,5 mi de piridina a O'C. Después de agitar durante 24 h, se evaporó el disolvente a partir de la mezcla de reacción y el residuo se hizo pasar a través de una columna de silice regular (DCM al 0-10 %:MeOH) dando compuesto 29 (2,0 mg, 83 %) como un aceite. EM (ES+) mIz, calculada: m+1 , 800,42, hallada, 800,4. El compuesto 29 se refiere también como compuesto (l1I-i) anteriormente en el presente documento.
25 O-acetifo, N,O-acetaI29a. Se disolvió compuesto 29 (2 mg, 2,4 IJmol} en 0,5 mi de MeOH, a lo que se añadió una gota de HCI 4N en dioxano. Después de agitar la mezcla de reacción durante toda una noche a TA, la mezcla se concentró y el residuo se disolvió en DMSO, que se hizo pasar a través de una columna C-18 {agua (formiato de amonio 20 mM, pH 6,1): ACN (0-100 %) dando O-acetilo, N,O-acetal 29a (1 ,38 mg, 75 %) como un sólido blanco (sal de formiato) después de liofilización. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 730, hallada, 730,4. O-Acetilo, N,O-acetal 29a se refiere
30 también como un compuesto (III-m) anteriormente en el presente documento.
N,O-Aceta/ 29b. El compuesto 28 (S mg, 6 umol) se disolvió en MeOH, a lo que se añadió 1 gota de HCI4N en dioxano. Después de agitar la mezcla de reacción durante 24 horas, la solución se concentró y se usó para la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. EM (ES+) mIz, calculada: m+1 , 687, hallada, 688,4. N,O-Acetal 29b se refiere
35 también como compuesto (III -n) anteriormente en el presente documento.
O-melito, N,O-aeeta/ 2ge. Se disolvió N,O-acetal 29b (aproximadamente 5 mg, 7,2 umol) en DMF, a lo que se añadió dimetilsulfalo (3 ¡JI, 37 ¡Jmol) y NaH (2 mg, 50 ¡Jmol, al 60 % en aceite mineral) a O 'C. Después de 1 h, la mezcla se llevó en DMSO y se hizo pasar a través de una columna C-18 (agua (formiato de amonio 20 mM, pH 6,1): ACN
40 (0-100 %) dando O-metilo, N,O-acetaI 29c como un semisólido (0,31 mg, 5 %; mezcla que contiene un compuesto no identificado del mismo peso molecular). EM (ES+) mIz, calculada: m+1 , 702, hallada, 702,4. O-metilo, N,O-acetaI 29c se refiere también como un compuesto (III-k) anteriormente en el presente documento.
Ejemplo 3 -Esquema 3 45
Esquema 3 (Fig. 3) muestra un procedimiento para fabricar compuestos de acuerdo con la fórmula (II-b).
Aleoho/ 30. Se añadió TFA (171 mi) a una solución de {S)-terc-butil-1 -hidroxi-3-(4-nitrofenil)propan-2-ilcarbamato 20 (Erlanson y col., US 7.214.48782: 13,9 g, 46,9 mmol) en DCM (272 mi) a O 'C. La mezcla de reacción se ca lentó aTA, 50 Y la reacción se dejó avanzar durante 25 minutos. La solución se concentró proporcionando 9,2 g de {S)-2-amino-3-{4-nitrofenil)propan-1-oI en bruto como un sólido blanco. A una solución de este producto en bruto y carbonato de sodio (12,4 g, 117,3 mmol) en THF (87 mi) yagua (87 mi) se añadió N-carbetoxiftalimida ("CEPT," 12,3 g, 56,3 mmol). Después la mezcla de reacción se agitó a TAdurante 4 horas, se añadió EtOAc (150 mi). La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04anhidro, se
55 filtraron y se concentraron a vacio dando un residuo en bruto que se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de EtOAc al 0-100 % en hexanos dando 12,3 g de alcohol 30. EM: (+) mIz 327,0 (M+1).
Triflato 31. Se añadió piridina a una solución de alcohol 30 (1 g, 3,06 mmol) en DCM anhidro (18 mi) (0,274 mi, 3,36 60 mmol) a -78 'C. Después de que la mezcla de reacció n se agitó a -78'C durante 5 min, se añadió anhidr ido
trifluorometanosulfónico (0,568 mi, 3,36 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -78 'C durante 45 min , y después a TA durante 45 mino Después de que se filtró el precipitado, el filtrado se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo a partir de gel de silice con DCM produciendo 0,84 g de triflato 31. RMN-1H (400 MHz, CoCh) O 8,10 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,81 (2H, m), 7,74 (2H, m), 7,36 (2H, J = 8,8 Hz), 5,13 (1H, t, J = 10,0 Hz), 4,99 (1 H, m), 4,80 (1H, dd, J = 4,8,5,6 Hz), 3,52 (1 H, dd, J = 3,2, 11,2 Hz), y 3,27 (1 H, dd, J = 5,6, 8,8 Hz).
Diéster 32. Se añadió metilmalonato de dietilo (0,71 mi, 4,12 mmol) gota a gota a una suspensión de hidruro de sodio (0,161 g, 60 % de dispersión en aceite mineral, 4,03 mmol) en THF anhidro (4,7 mi) a O 'C. La mezcla d e reacción se agitó a O'C durante 10 min, y después a TA durante 10 mino La solución resultante se añadió lentamente a una solución de triflato 31 (0,84 g, 1,83 mmol), en THF anhidro (9,4 mi) a O oC. Después la mezcla de reacción se agitó a O 'C durante toda una noche, se añadió solución de NH4 CI acuosa saturada (20 mi). La solución acuosa se extrajo con EIOAc y las fases combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentraron a vacio dando un residuo. El producto en bruto se purificó porcromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de EtOAc al O-50 % en hexanos proporcionando 0,57 g de diéster 32. EM: (+) mIz 483,3 (M+1).
Monoéster 33. Una solución de diéster 32 en HCI6 N (10 mi) y ácido acético (10 mi) se calentó a 145 'C durante 2 dias. La solución orgánica se concentró proporcionando 0,41 g de la sal clorhidrato del ácido {R)-4-amino-2-metil-5-{4-nitrofenil)pentanoico en bruto como un sólido blanco.
Se añadió 2,2-dimetoxipropano (4 mi, 32,6 mmol) a una solución de la sal clorhidrato del producto en bruto y HCI concentrado (1 mi) en MeOH anhidro (20 mi). La mezcla de reacción se calentó a 60 'C durante toda una noche. La
solución
orgánica se concentró proporcionando 0,43 g de la sal clorhidrato del
4-amino-2-metil-5-{4-nitrofenil)pentanoato d
e {R)-metilo como u n sólido blanco.
Se
añadió trietilamina (0,44 mi, 3,1 mmol) a una solución de la sal clorhidrato del
{R)-metil-4-amino-2-metil-5-{4-nitrofenil)pentanoato de {R)-metilo y de dicarbonato de di-terc-butilo (0,369 g, 1,69 mmol) en ACN (10 mi) a TA. Después de que la mezcla de reacción se agitó a TA durante 4 horas, el disolvente se evaporó. Se añadió agua (20 mi), y la solución acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se concentraron. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de EtOAc del 0-30 % EtOAc en hexanos proporcionando 0,31 9 de monoéster 33 como un sólido incoloro. EM: (+) miz 267,3 (M-99).
Acido carboxílico 34. Una solución de monoéster 33 (0,31 g, 0,846 mmol) en HCI 6 N se calentó a 130 oC durante 1,5
h. La solución orgánica se concentró proporcionando 0,244 g de ácido carboxilico 34 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 253,1 (M+1).
Acido de nitro 35. El compuesto 34a (80,4 mg, 0,149 mmol, preparado por Palterson y col. 2008) se añadió a una solución 0,2 M de pentafluorofenol (41 ,1 mg, 0,224 mm 01) y N, N-diisopropilcarbodiimida ("DIC", 0,0255 mi, 0,164 mmol) en oCM (0,76 mi) a O 'C. La mezcla de reacció n se calentó a TA y se agitó a TA durante toda una noche. El disolvente se evaporó. Se añadió EtOAc (18 mi) y se filtró el producto en bruto, con enjuague del recipiente de reacción con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida y la materia prima se usó sin purificación adicional. Se añadió oMF (0.6 mi) al producto en bruto. seguido por ácido carboxilico 34 (0.129 g, 0,448 mmol) y OlEA, (0.13 mi, 0,745 mmol). La mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche y el disolvente se eliminó por evaporación. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de MeOH al 10-20% en OCM conteniendo NH40H al1 % proporcionando 0,11 g de ácido nítrico 35 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 773,4 (M+1).
Aminoácido 36. Una solución de ácido de nitro 35 (0,11 g, 0,142 mmol) y paladio en carbono (10 %, 15 mg) en MeOH (5 mi) se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 4 h. El catalizador se eliminó por filtración, y el filtrado se concentró proporcionando 91 mg de aminoácido 36 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 743,5 (M+1). El aminoácido 36 se refiere también como compuesto (1I1-b) anteriormente en el presente documento.
~ster metílico 36a. Se añadió HCI (1 gota, 37 %) a una solución de aminoácido 36 (1,9 mg, 2,5 mmol) y 2,2-dimetoxipropano rOMp·, 0,05 mi, 0,41 mol) en MeOH (0,5 mi). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 2 horas y después se concentró. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 1,7 mg de éster meUlico 36a como un sólido blanco. EM: (+) mIz 757.5 (M+1). El éster 36a se representa también en esta memoria descriptiva por fórmula (1I1-t).
Ejemplo 4 -Esquema 4
El Esquema 4 (Fig. 4) muestra un procedimiento para unir engarces de peptidilo y grupos funcionales reactivos a compuestos de la presente invención, lista para conjugación.
Compuesto 37. Una solución de OlEA, Fmoc-Lys(Boc}-OH (17,3 mg, 0,037 mmol), y HATU (12,8 mg, 0,0336 mmol) en oMF (0,3 mi) se agitó a TA durante 5 mino El pH de la solución se mantuvo entre 8 y 9. Después se añadió una solución de aminoácido 36 (25 mg, 0,0336 mmol) en DMF (2 mi) y se añadió OlEA a la mezcla de reacción, manteniendo el pH
entre 8 Y 9. Después de agitar a TA durante 15 min, se añadió solución de NH4CI saturada (5 mi) desactivando la reacción . La solución acuosa se extrajo con EtOAc, y las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sil ice con un gradiente de MeOH al 0-20 % en DCM proporcionando 36,1 mg de compuesto 37. EM: (+) mIz 1193,6 (M+1 ).
Compuesto 38. Se añadió piperidina a una solución de compuesto 37 (36,1 mg, 0,0302 mmol) en oMF (2 mi), manteniendo el pH entre 9 y 10. Después de agitar a TA durante 20 min, la solución orgánica se concentró proporcionando 29,3 mg del compuesto a-amino libre en bruto.
Se añadió OlEA a una solución de ácido 6-maleimidohexanoico (7,0 mg, 0,0332 mmol) y HATU (11,5 mg, 0,0302 mmol) en o MF (0,3 mi) manteniendo el pH entre 8 y 9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron OlEA y el compuesto amino libre en bruto en oMF (2 m), manteniendo el pH entre 8 y 9. Después la mezcla de reacción se agitó aTA durante 15 min, el producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionado 9,1 mg de compuesto 38 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 1164,6 (M+1 ).
Compuesto 39. Se añadió TFA (1,5 mi) a una solución de compuesto 38 (9,1 mg, 0,0078 mmol) en DCM (1,5 mi). Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 15 min, el producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 5,0 mg de la sal TFA del compuesto deseado 39 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 1064,8 (M+1). La estructura de base libre de compuesto 39 se muestra también anteriormente en el presente documento, como compuesto (VI-b). Alguna amida del compuesto 39 se aisló después como un subproducto en su preparación. EM (+) mIz 1036,6 (M+1 ). La amida se representa también en esta memoria descriptiva por fórmula (VI-q).
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Amida del compuesto 39
Ejemplo 5 -Esquema 5
Esquema 5 (Fig. 5) muestra un procedimiento para fabricar compuestos de acuerdo con la fórmula (II-b).
Aminoéster 42. Se añadió HC14,0 N en 1 ,4-dioxano (S,7 mi) a una solución de compuesto 41 (preparada por Pallerson y col. 2008; 1 g, 2,66 mmol) en etanol (17 mi). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 2 horas, y después se concentró proporcionando 0,82 g de aminaester 42 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 273,3 (M+1).
~ster azido 43. Se añadieron cloruro de oxalilo (1 ,71 mi, 19,95 mmol) y DMF (0,33 mi, 4,26 mmol) a una solución de azido isoleucina (Lundquist y col., Org. Lett. 2001, 3, 781; 0,669 g, 4,26 mmol) en hexanos (176 mi). La mezcla de reacció n se agitó a TA durante 1 h, se filtró y se concentró proporcionando el cloruro de ácido. El cloruro de ácido y OlEA (2,32 mi, 13,3 mmol) reañadieron a una solución de aminoéster 42 (0,82 g, 2,66 mmol) en o CM (26,7 mi) a °'C. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta TA y se agitó a TA durante toda una noche. Se añadió salmuera desactivando la reacción, y la solución acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron a vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografia ullrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de EtOH al O-50 % en hexanos proporcionando 0,86 g de éster azido 43 como un sólido blanco. EM: (+) m/z412,3 (M+1 ).
Compuesto de trietilsililo 44. Se añadieron 2,6-lutidina (1 ,22 mi, 10,45 mmol) y trifluorometilsulfonato de trietilsililo (1 ,14 mi, 5,02 mmol) a una solución de éster azido 43 (0,86 g, 2,09 mmol) en DCM (11 mi) a O 'C. La mezc la de reacción se dejó calentar a TA durante 1 h, Y después se agitó a TA durante una hora adicional. Se añadió salmuera desactivando la reacción, y la solución acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc al 0-30 % en hexanos proporcionando 1,1 g de compuesto de trietilsililo 44. EM: (+) mIz 526,4 (M+1).
Compuesto de N-metilo 45. Una solución de compuesto de trietilsililo 44 (1 ,04 g, 1,98 mmol) en THF (6,5 mi) se enfrió a -45 'C, Y se añadió hexametildisilazida de potasi o (0,5 M en tolueno, 4,75 mi, 2,37 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 20 minutos a -45 'C . Se añadió yoduro de metilo (0,37 mi, 5,94 mmol), y la mezcla de reacción se dejó
calentar a TA durante 4 horas tiempo al cual la reacción se desactivó con etanol (10 mi). El producto en bruto se diluyó con EtOAc y se lavó con salmuera, y la fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre NazS04 anhidro, se filtraron y se concentraron a vacio. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de silice con un gradiente de EtOAc al 0-30 % en hexanos proporcionando 0,91 g de compuesto de N-metilo 45. EM: (+) mIz 540,4 (M+1 ).
Compuesto 46. Una solución de compuesto de N-metilo 45 (1,0 g, 1,85 mmol) en AcOH deoxigenadolH20fTHF (65 mi,
3:1 :1, v/vfv) se agitó a TA durante 36 h. Se añadió tolueno (250 mi) y la solución se concentró. El producto en bruto se pUrificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sllice con un gradiente de EtOAc al 0-100 % en hexanos proporcionando 0,46 g de compuesto 46 como aceite. EM: (+) miz 426,3 (M+1).
Éster metílico 47. Se añadió hexamelildisilazida de potasio ("KHMDS," 0,5 M en tolueno, 2,54 mi, 1,27 mmol) a una solución de compuesto 46 (0,45 g, 1,06 mmol) en THF (5 mi) a -78 'C. La mezc la de reacción se agitó durante 20 min a -78 'C. Se añadió yoduro de metilo (0,2 mi, 3,18 m mol), y la mezcla de reacción se dejó calentar a -20 'C durante 2 horas tiempo al cual la reacción se desactivó con solución de NH4CI saturada. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron a vacío. El producto en bruto se pUrificó por cromatografia en columna eluyendo a partir de gel de sUice con un gradiente de EtOAc ala-50 % en hexanos proporcionando 0,41 g de compuesto 47 como un aceite incoloro. EM: (+) mIz 440,3 (M+l).
Compuesto 48. A una solución de D-Mep (0,45 g, 3,14 mmol) en EtOAc (10 m) se añadieron pentafluorofenol (0,64 g, 3,47 mmol) y N,N'-diciclohexilcarbod iimida ("OCC", 0,72 g, 3,47 mmol). Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche, el precipitado se filtró, y se lavó con EtOAc. Al filtrado resultante se añadió compuesto 47 (0,46 g, 1,05 mmol) y paladio en carbono (10 %,0,36 gl. La mezcla de reacción se ag itó en una atmósfera de hidrógeno durante toda una noche. El catalizador se filtró aparte, y después el filtrado se concentró a vacio. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de silice con un gradiente de MeOH al 0-5 % en EtOAc proporcionando 0,43 g de compuesto 48 como un aceite incoloro. EM: (+) mIz 539,4 (M+1 l.
ACido carboxílico 49. A una solución de compuesto 48 (0,43 g, 0,80 mmol) en 1,4-dioxano deoxigenado (8 mi) se añadió solución acuosa de hidróxido de litio deoxigenada (0,6 M, 4 mil a TA. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 2 horas, y después se concentró a vacio. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de MeOH al 10-30 % en DCM conteniendo NH,OH al 1 % proporcionando 0,3 g de ácido carboxilico 49 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 511,4 (M+1).
Acido de nitro 50. Se añadió ácido carboxilico49 (80 mg, 0,157 mmol) a una solución 0,2 M de pentafluorofenol (43,3 mg, 0,235 mmol) y ole (0,0269 mi, 0,173 mmol) en DCM (0,8 mi) a O 'C. La mezcla de reacción se calentó a TA, y se agitó a tal temperatura durante toda una noche. El disolvente se evaporó. Se añadió acetato de etilo (18 mi), y el producto en bruto se filtró, con enjuague de EtOAc del recipiente de reacción. El filtrado se concentró a presión reducida, y la materia prima se usó sin purificación adicional. Se añadió DMF (0,6 mil al producto en bruto, seguido por ácido carboxilico 34 (0,136 g, 0,47 mmol) y OlEA (0,137 mi, 0,785 mmoll. La mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche, y el disolvente se evaporó después a vacio. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida, eluyendo a partir de gel de sllice con un gradiente de MeOH 10-20 % en OCM conteniendo NH,OH al1 % proporcionando 0,1 9 de ácido de nitro 50 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 745,4 (M+l).
Aminoacido 51. Una mezcla de ácido de nitro 50 (0,1 g, 0,134 mmol) y paladio en carbono (10 %, 14 mg) en MeOH (5 mi) se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante 4 horas. El catalizador se filtró aparte, y el filtrado se concentró a vacio proporcionando 87,3 mg de aminoácido 51 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 715,5 (M+1 l. El aminoácido 51 se refiere también como compuesto (l1I-j) anteriormente en el presente documento.
Ejemplo 6 -Esquema 6
El Esquema 6 (Fig. 6) muestra un procedimiento para fabricar compuestos de acuerdo con la fórmula (II-b).
Compuesto de nitro hidroxi 52. El compuesto 27 (Esquema 2) (16,4 mg, 0,0275 mmol), se añadió a una solución 0,2 M de pentafluorofenol (7,6 mg, 0,0413 mmol) y DIC (0,0094 mi, 0,0606 mmol) en DCM (0,2 mi) a O'C. La mezcla de reacción se calentó a TA, y se agitó a TA durante tooa una noche. El disolvente se evaporó. Se añadió EtOAc (3 mi) y el producto en bruto se filtró, con aclarado del recipiente de reacción con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida, y el producto en bruto se usó sin purificación adicional. Se añadió DMF (0,1 mi) al producto en bruto, seguido por ácido carboxilico 34 (Esquema 3l (20,8 mg, 0,083 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,024 mi, 0,138 mmoll. La mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche, y el disolvente se evaporó después. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de silice con un gradiente de MeOH al 0-10 % en DCM proporcionando 14,9 mg de compuesto de nitro hidroxi 52 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 831 ,5 (M+1 l.
Compuesto de nitro acetilo 53. Una solución 0,1 M de compuesto de nitro hidroxi 52 (14,9 mg, 0,018 mmol) en piridina (0,23 mi) se enfrió a O 'C Y se añadió anhidrido acético (0,054 mi, 0,57 mmol). La mezcla de reacción se dejó calendar a TA durante 2 h Y se agitó a TA durante 24 h. La mezcla de reacción se enfrió a O 'C y se añadió la mez cla 1:1 de 1,4-dioxano yagua . La mezcla de reacción se dejó calentarse a TA, segu ido por agitación a esta temperatura durante
12 horas. El disolvente se evaporó, y el residuo se pUrificó por HPLC preparativa proporcionando 2,2 mg de compuesto de nitro acetilo 53 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 873,2 (M+1).
Compuesto de acetilamino 54. Una mezcla de compuesto de nitro acetilo 53 (2,2 mg, 0,0025 mmol) y paladio en carbono (10 %, 1 mg) en metanol (0,2 mi) se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante 4 h. El catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró. El producto en bruto se pUrificó por HPLC preparativa proporcionando 0,1 mg de compuesto nitro acetilo 54 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 843,2 (M+1 ). El compuesto acetilamino 54 se refiere también como compuesto (III-a) anteriormente en el presente documento.
Ejemplo 7 -Esquema 7
El Esquema 7 (Fig. 7) muestra aún otro procedimiento para fabricar compuestos de la presente invención.
Compuesto 55. El compuesto 34a (Esquema 3) (70 mg, O, 13 mmol) se añadió a una solución 0,2 M de pentafluorofenol (35,9 mg, 0,195 mmol) y DIC (0,0223 mi, 0,143 mmol) en OCM (0,66 mi) a O'C. La mezcla de reacción se calentó a TA y se agitó a TA durante toda una noche. El disolvente se evaporó. Se añadió EtOAc (16 mi) y el producto en bruto se filtró, con enjuague del recipiente de reacción con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida, y la materia prima se usó sin purificación adicional. Se añadió DMF (0,5 mi) al producto en bruto, seguido por p-nitrofenilalanina (82,0 mg.
0.,9 mmol) y OlEA (0,114 mi, 0,65 mmol). La mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche, y el disolvente se evaporó después. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo de gel de sllice con un gradiente de MeOH al1 0-20 % en DCM conteniendo NH4 0H al1 % proporcionando 65,2 mg de compuesto 55 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 731 ,0 (M+1).
Compuesto 56. Una mezcla de compuesto 55 (65,2 mg, 0,089 mmol) y paladio en carbono (10 %, 9,4 mg) en MeOH (3 mi) se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante 4 h. El catalizador se filtró aparte y el filtrado se concentró proporcionando 33,8 mg de compuesto 56 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 701 ,2 (M+1). El compuesto 56 se refiere también como compuesto (III-d) anteriormente en el presente documento.
Ejemplo 8 -Esquema 8
El Esquema 8 (Fig. 8a) muestra un procedimiento para fabricar un compuesto de acuerdo con la fórmula (VIlI-b), útil como un intermedio para fabricar compuestos de la presente invención.
Éster de Boc 58. A una solución de éster de amino 57 (Chem-Impex, 5 g, 19,18 mmol) y dicarbonato de di-terc-butilo ("(BOC)20," Aldrich, 4,6 g, 21,10 mmol) en DMF (Acros, anhidro, 50 mi), se añadió trietilamina ("TEA." Aldrich, 8,36 mi, 60 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 0,5 h. El análisis de HPLC mostró que la reacción se completó. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (500 mi) y la fase orgánica se lavó con agua (200 mi) y después salmuera (200 mi), se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró. El producto en bruto se pUrificó en columna Combiflash de 120 9 con MeOH al 0-5 % en OCM proporcionando éster de Soc de sólido blanco 58 (5,6 g, 81 %). RMN _lH (DMSO) ti 8,18 (d, 2 H), 7,47 (d, 2 H), 7,38 (d, 1H), 4,23 (m, 1 H), 3,60 (s, 3 H), 3,15 (m, 1 H), 2,95 (m, 1 H), 1,23 (s, 9 H).
Alqueno 59. Una solución de éster de Boc 58 (230 mg, 0,68 mmol) en DCM (Acros, anhidro, 2 mi) se enfrió a -78 'C en hielo seco-acetona, se añadió DIBAL (Aldrich, 1 M en DCM, 1 mi) lentamente. La mezcla de reacción se agitó y se calentó hasta -20 OC durante 3 h. Se añadió (1-etoxi carbonilethiliden)-trifenilfosforano (Aldrich, 492 mg, 1,36 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -20'C durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 mi) y los productos orgánicos resultantes se lavaron con agua (50 mi) y después con salmuera (50 mi), se secaron sobre MgS04 anhidro y se concentraron. El producto en bruto se pUrificó en columna de COMBIFLASH"" de 10 9 con EtOAc al O-SO '''lo en hexano proporcionando alqueno sólido blanco 59 (151 mg, 59 %). RMN_1H (OMSO) ti 8,18 (d, 2 H), 7,47 (d, 2 H), 7,22 (d, 1 H), 6,51 (d, 1 H), 4,48 (m, 1 H), 4,11 (c, 2 H), 2,80-2,94 (m, 2 H), 1,62 (s, 3 H), 1,23 (s, 9 H), 1,16 (t, 3 H).
Arilamina 60. Una solución de alqueno 59 (148 mg, 0,39 mmol) en EtOH (Acros, anhidros, 3 mi) y Pd en carbón activo (Aldrich, al 10 %, 50 mg) se agitó en H2 durante toda una noche. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (10 mi) y se filtró a través de CEUTE"". El filtrado se concentró y el producto en bruto se purifiCÓ en columna COMBIFLASH TM de 4 9 con MeOH al 0-20 % en DCM proporcionando arilamina 60 como un sólido blanco (102 mg, 75 %). RMN_1H (DMSO) ti 7,18 (d, 2 H), 7,11 (s, 2 H), 6,71 (d, 1 H), 3,98 (e, 2 H), 3,51 (m, 1 H), 2,57 (m, 2 H), 2,41 (m, 1 H), 1,63 (m, 1 H), 1,37 (m, 1 H), 1,29 (s, 9 H), 1,09 (t, 3 H), 0,99 (d, 3 H), EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 351,2, hallada 351,2.
Ejemplo 9 -Esquema 9
El Esquema 9 (Fig. 8b) muestra otro procedimiento para fabricar un compuesto de acuerdo con fórmula (VIlI-b), útil como un intermedio para fabricar compuestos de la presente invención.
Aminoacido 61. Una mezcla de ácido carboxllico 24 (Esquema 3, Fig. 3) (4,4 mg, 0,0025 mmol) y paladio en carbono (10 %, 1 mg) en MeOH (0,5 mi) se agitó a una atmósfera de hidrógeno durante toda una noche. El catalizador se eliminó por filtración, y el filtrado se concentró proporcionando 3,5 mg de aminoácido 61 como un sólido blanco. EM:
(+) mIz 223,3 (M+1).
Ejemplo 10 -Esquemas 10, 11 , Y 12
El Esquema 10 (Fig. 8c) muestra otro procedimiento para fabricar un compuesto de acuerdo con la fórmula (VIII-b), útil como un intermedio para fabricar compuestos de la presente invención.
Compuesto 62. Una mezcla de monoéster 33 (Esquema 3, Fig. 3) (0,34 g, 0,93 mmol) y paladio en carbono (al 10 %, 50 mg) en metanol (20 mi) se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante toda una noche. El catalizador se filtró, y el filtrado se concentró proporcionando 0,29 g de compuesto 62 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 237,3 (sin Boc).
El Esquema 11 (Fig. 9) ilustra como los compuestos de acuerdo con la fórmula (VIII-b) se pueden usar para fabricar compuestos de la presente invención. El éster de Boc 62 se convierte a éster de Bpoc 62a protegiendo primero el grupo amina aromático con un grupo Fmoc, tratamiento con TFA eliminando el grupo Boc del grupo de amina alifática, tratamiento con éster a,a-dimetil-p-fenilbencil-fenílico del ácido carbónico (8CI) instalando un grupo de Bpoc allí, y para eliminación del grupo Fmoc con piperidina. El éster de Bpoc 62a está acoplado con ácido carboxilico 63 con HATU proporcionando un éster intermedio que se hidroliza después con LiOH produciendo compuesto 64. La hidrogenación eliminando el grupo protector Cbz del compuesto 64, seguido por acoplamiento mediado por HATU con ácido 6-maleimidohexanoico y eliminación del grupo Bpoc con ácido acético produce aminoácido 65. Otro acoplamiento mediado por HATU con compuesto 34a (Esquema 3, Fig. 3) proporciona compuesto 66. La eliminación del grupo protector de Boc con TFA proporciona compuesto 67, listo para conjugación.
Aún se muestra otro modo de utilizar compuestos de fórmula (VIlI-b) en Esquema 12 (Fig. 10). Partiendo del compuesto 34a, el acoplamiento mediado por HATU con compuesto 68 proporciona éster de Boc 69. La eliminación del grupo Boc con TFA y la hidrólisis del éster con LiOH proporcionan aminoácido 36, que puede elaborarse como se muestra en el Esquema 4 (Fig. 4) preparando una composición adecuada para conjugación.
Ejemplo 11 -Compuesto 70
Compuesto 70. Tubulisina O (fabricada por Peltier y col. 2006; 2 mg, 2,4 umol) se disolvió en MeOH a O oC. A esta solución se añadió una gota de Hel (0,1 M). Después de agitar la mezcla de reacción durante tocla una noche a TA la solución se evaporó en el vacio dando un residuo que se hizo pasar a través de una columna corta (DCM:MeOH al 0-10 %) dando compuesto 70 (1 ,3 mg, 1,6 umol, 67 %) como un aceite. EM (ES+) mIz, calculada: m+1, 772,42,
hallada, 772.
o
~
~ O~O N' ~"~N 'YN lO, l S" H ", O I
~ C02H 70
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la metodologia general de los Esquemas se puede adaptar para fabricar compuestos de la presente invención distintos de aquellos espeCifica mente descritos anteriormente. Por ejemplo, el compuesto 14 (el mismo que el compuesto 49) se puede usar para hacer numerosos otros compuestos de la presente invención acoplándolo con otros reemplazos para la subunidad Tup. Como otro ejemplo, cambiando los reactivos usados con el compuesto 9 (Esquema 1), compuestos 44 y 46 (Esquema 5), se pueden sintetizar va riaciones en grupos R2y R3 en fónnula (II) más allá de aquellos especificamente ejemplificados.
Ejemplo 12 -Preparación de un Conjugado
El presente ejemplo describe la preparación de un conjugado de construcción de citotoxina-engarce (VI-b) y anticuerpo monoclonal anti-CD70 2H5 (Terrett y col., US 2009/0028872 A1 ; Coccia y col., WQ 20081074004 A2). Es representativo del proced imiento usado en la prepa ración de otros conjugados.
El anticuerpo anti-CD70 2H5 a -5 mglml en fosfato de sodio 20 mM, NaCI 50 mM, OTPA 1 00 ~M, pH 7,5, se tioló con un exceso molar de 13 veces de 2-iminotiolano. La reacción de tiolación se dejó avanzar durante 1 hora a TA con mezclado continuo.
Tras tiolación, se intercambió el tampón del anticuerpo en tampón de conjugación (HEPES 50 mM, glicina 5 mM, DTPA 2 mM, pH 6,0) por medio de una columna PD10 (Sephadex G-25). La concentración del anticuerpo tiolado se detenninó a 280 nm. La concentración de tiol se midió usando un ensayo de ditiodipiridina.
Una reserva de construcción 5 mM (VI-b) en DMSO se añadió a un exceso molar de 3 veces por tiol de anticuerpo y se mezcló durante 90 minutos a TA. Tras la conjugación, N-etilmaleimida 100 mM en DMSO se añadió a un exceso molar de tiol de 10 veces por anticuerpo desactivando cualesquiera glllpos tiol. Esta reacción de desactivación se hizo durante una hora a TA con mezclado continuo.
El conjugado del fármaco con anticuerpo anti-CD70 se filtró a través de un tamiz de 0,2 11m antes de purificación cromatográfica de intercambio de cationes. La columna de intercambio de Cationes de Alta Resolución (CEX) de SP SEFAROSATM se regeneró con 5 volúmenes de columna (CV) de HEPES 50 mM, glicina 5 mM, NaCI1 M, pH 6,0. Tras regeneración, la columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de tampón de equilibración (HEPES 50 mM, glicina 5 mM, pH 6,0). El conjugado se cargó y la columna y se lavó una vez con el tampón de equilibración. El conjugado se eluyó con HEPES 50 mM, glicina 5 mM, NaCI 200 mM, pH 6,0. El eluato se recogió en fracciones. La columna se regeneró después con HEPES 50 mM, glicina 5 mM, NaCI1M, pH 6,0 retirando agregados de proteina y cualquier constlllcción no reaccionada (VI-b).
Las fracciones que contienen conjugado monomérico de anticuerpo se almacenaron. La concentración de conjugado de anticuerpo y las proporciones de sustitución se determinaron midiendo absorbancia a 280 y 252 nm.
La reserva de eluato purificado se intercambió en sacarosa 30 mg/ml , glicina 10 mg/ml , pH 6,0 por diálisis. El dextrano 40 se añadió a la muestra a 10 mg/ml tras diálisis. La concentración de conjugado de anticuerpo y la proporción de sustitución (SR) se determinaron midiendo absorbancia a 280 y 252 nm. La SR fue 2,2 moles de citotoxina por mol de anticuerpo.
Ejemplo 13 -Ensayos de Proliferación
El presente ejemplo generalmente describe los procedimientos usados para ensayar la actividad antiproliferativa de compuestos de la presente invención en sus conjugados. Las lineas celulares tumorales humanas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, EE.UU. Yse cultivaron de acuerdo con la instlllcción de la ATCC. Las células se sembraron a 1,0 x 103o 1,0 x 10· célulasfpocillo en placas de 96 pocillos durante 3 horas para ensayos de ATP o ensayos de 3H-timidina, respectivamente. Se añadieron a los pocillos diluciones seriadas 1:3 de compuestos libres (no conjugados) o sus conjugados. Las placas se dejaron incubar de 24 a 72 horas. Las placas de 3H-timidina se sometieron a pulsos con 1.0 I1Ci de 3H-timidina por pocillo durante las últimas 24 horas del periodo de incubación total, se cosecharon, y se leyeron en un Contador de Centelleo Top Count (Packard Instlllments, Meriden, CT). Los niveles de ATP en placas de ATP se midieron usando el kit de Viabilidad Celular Luminiscente CELL TITER-GLO~ siguiendo el manual del fabricante y se leyeron en un luminómetro GLOMA~20f20 (ambos de Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los valores CEso -la concentración a la que el agente inhibe o reduce la proliferación celular en un 50 %-se determinaron usando software PRISM TM, versión 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.).
Ejemplo 14 -Actividad In Vitro de Citotoxina
Usando la 3H-timidina o el ensayo de luminiscencia de ATP, o ambos, las actividades de los compuestos de la presente invención se ensayaron contra las siguientes lineas celulares de cáncer: HCT-15 (cáncer colorrectal, multirresistente a fármacos (MDR»; Hep3B (cáncer de hígado); LNCaP (cáncer de próstata, positivo en receptor de andrógenos (AR*»; MDA-MB-231 (cáncer de mama, negativo en receptor de estrógeno, receptor de progesterona y Her2 (triple negativo»; A2058 (mela noma); U-87 MG (glioblastoma); NCI-H460 (NSCLC); A549 (NSCLC); HPAC (cáncer pancreático, primario); PC3 (cáncer de próstata, AR); BT474 (cáncer de mama, altamente positivo a Her2 (Her2hi)); SKOV3 (cáncer ovárico, Her2hi); 786-0 (cáncer renal); UO-31 (cáncer renal, MDR); NCI-H740 (SCLC); DMS53 (SCLC); SK-BR3 (cáncer de mama, Her2hi); ZR-75 (cáncer de mama, positivo en receptor de estrógenos); OVCAR3 (cáncer ovárico); HL-60 (APL); OVCAR8/Adr (cáncer ovárico, MOR); CEM-C1 (ALL); Nomo-1 (AML); RPMI-8226 (MM»; Raji (linfoma); SW-480 (cáncer colorrectal, metastásico); SW-620 (cáncer colorrectal); y H226 (cáncer de pulmón). (No todos los compuestos se ensayaron contra todas las lineas celulares).
Los siguientes compuestos se usaron como referencia o citotoxinas de comparación: doxorrubicina (Dox), Citotoxina CBI (un agente alquilante de surco menor de ADN de la clase ciclopropa[c)benz[o]indol-4-ona), tubulisina D (Tub D, Tabla 1) Yel éster metilico de MMAF ("MMAF", un compuesto relacionado con auristatina; véase Sutherland y col., J. Biol. Chem. 2006, 281 (15),10540-10547).
CI,
I '
""""-'.:::.: . -7 NH2
I H I
N~N (Y
HO á r--\JJ ~
O ~ 4 O Citotoxina CBI
Figs. 11a y 11b muestran planes ilustrativos para ensayos de proliferación de 3H-timidina para compuestos de la presente invención, contra células HL-60 y 786-0, respectivamente, con Citotoxina CBI y tubulisina O como compuestos comparativos, con un periodo de incubación de 48 horas.
Figs. 12a y 12b muestran planes ilustrativos para ensayos de proliferación de luminiscencia de ATP para un segundo grupo de compuestos de la presente invención, contra células HL-60 y 786-0, respectivamente, con un periodo de incubación de 72 horas. Figs. 12c y 12d muestran los trazados para ensayos de proliferación con 3H-timidina para el mismo grupo de compuestos, de nuevo contra células HL-60 y 786-0, respectivamente, con un periodo de incubación de 72 horas. En cada caso, se usó doxorrubicina como un compuesto comparativo.
La tabla 2 proporciona los datos para ensayos de proliferación usando el procedimiento de la 3H-limidina, con un periodo de incubación de 72 horas.
Tabla 2 Parte 1) · Ensayos de Proliferación con H-Timidina Línea Celular y CEso (nM
Compuesto
HCT-15 He 38 LNCaP MDA-MB-231 A2058 U-87 MG NCI-H460
Do, 149 44 130 133 -106 101
CB' 0,040 0,020 0,051 0,019 -0,14 0,042 Tub O 0,062 0,022 0,36 0,091 -0,014 0,032 MMAF 1,3 0,11 1,7 0,29 -0,12 0 ,37 15 67 1,6 27 1,3 1,6 0,42 2,0 16 284 >100 >100 >100 >100 >100 >100 17 392 >100 >100 84 >100 12 >100 19 1067 52 >100 -0,13 >100 >100 24 704 32 76 33 0,12 18 >100 25 280 305 930 236 409 271 306 26 31 18 >3000 15 25 5,2 18 51 101 4,2 41 8,7 0,40 0,75 7,2 26, > 100 36 80 >100 >100 71 >100 28 223 24 64 >100 0,96 >100 >100 29 0,18 0,04 1 0,54 0,13 0,40 0,064 0 ,21 29c 2,4 3.0 5,2 4,8 5,6 0,51 15 36 64 39 342 >100 60 15 52 51 101 4,2 41 8,7 0,40 0,75 7,2 54 0,44 0.30 16 1,6 0,64 0,11 0,31 56 2477 >100 >100 >100 >100 >100 >100
Tabla 2 Parte 2)· Ensayos de Proliferación con H-Timidina Línea Celular CEso nM
Compuesto
A549 HPAC PC3 8T474 SKOV3 786-0 UO-31 Do' 128 126 276 424 163 168 267 CB' 0,072 0,063 0,049 1,2 0,047 0,035 0,035
Tub O 0,014 0,015 0,038 0,51 0,039 0,15 0,10 MMAF 0,21 0,29 0,38 1,7 0,24 1,4 7,3
<"'-q) ---
15 2,1 3,0 1,7 7,1 2,6 -15 16 >100 >100 >100 >100 44 19 >100 17 >100 >100 82 >100 91 32 >100 19 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 24 38 >100 63 >100 68 >100 >100 25 270 206 319 804 180 1862 435 26 18 11 16 11 4,6 26 50 26, >100 >100 >100 7 47 > 100 > 100 28 > 100 34 > 100 >100 9,9 61 > 100 29 0,44 0,069 0,21 0,57 0,029 1,2 0 ,13 29c 6,5 32 11 12 1,9 3,9 1,0 36 44 83 66 >100 32 >100 >100 51 7,8 6,4 5,6 30 4,4 10 35 54 0,24 0,83 0,82 8,8 0,34 6,9 1,3 56 >100 >100 >100 >100 >100 29 >100
Tabla 2 Parte 3)·
Ensayos de Proliferación con H-Timidina
Compuesto
1 NCI-H740 DMS53 Linea Celular 'i CE~(nM SK-BR3 ZR-75 OVCAR3 HL-60 OVCAR8
Do,
255 979 794 258 56 2044
CS'
0,098 1,5 - 1,5 0,071 0,027 0,16
Tub O
2,2 0,21 - 1,7 0,051 0,032 0,17
MMAF
13 10 - 42 0,16 0,25 25
I"'-q)
- - 15,05
15
2.3 37 17 - >100 0,60 423
16
>100 >100 >100 >100 >100 8,9 1869
17
32 >100 >100 >100 >100 17 2970
19
3,8 >100 >100 34 53 37 69
24
51 >100 >100 3,6 90 6,9 >100
25
347 515 1714 >3000 379 308 946
26
3,0 99 32 >300 3,2 0,45 201
26a
3,2 >100 158 56 21 10 100
28
5,8 >100 >100 4,3 3,1 7,7 27
29
0,41 0,28 1,1 3,8 0,02 0,0099 0,70
29,
5,3 76 72 44 3,6 1,8 1,4
36
>100 >100 >100 >100 >100 107 >100
51
37 24 >100 1,3 2,5 4,2 20
54
10 2,0 1,1 2,2 3,9 0,53 2,1
56
>100 >100 >100 >100 >100 >100 >3000
Tabla 2
Parte 4) Ensayos de Proliferación con H-Timidina
Compuesto
I CEM-C1 Nomo-1 LInea Celular CE RPMI-8226 I Ra"i oM
Do,
144 105 68 61
CS'
0 ,11 0,016 0,12 0,0 13
Tub O
0 ,018 0,042 0,037 0,013
MMAF
0,17 0,27 0,24 0,12
15
0,93 2,3 3,3 0,47
16
11 1,8 22 28
17
43 6,8 47 53
19
22 1,3 23 32
24
13 1,1 17 11
25
225 116 396 231
26
22 0.36 7,7 7,0
26a
10 2,0 22 20
28
10 0,20 8,7 13
29
0,019 0,0075 0,034 0,024
29,
45 0,43 16 8,5
36
44 124 48 15
51
2,0 3,5 2,2 1,5
54
0 ,38 0,77 0,36 0,20
56
>100 >100 >100 >100
La Tabla 3 proporciona los datos para los ensayos de proliferación de luminiscencia de ATP, con un periodo de incubadón de 48 , 72 , o 96 h, como se destaca.
Tabla 3 Parle 1 Ensa os de Proliferación de Luminiscencia de ATP Periodo de Incubación como se Destaca
Linea Celular y CEso (nM
Compuesto
HCT-15 (48 h) 1 Hep3B (48 1 MDA-MB-231 h) (48h) 1 A20~~ (48 1 h NCI-H:)60(48h 1 A549 (48h) 1 PC3 (48 h)
Do, CS' Tub O MMAF 15 16 17 19 24 28 29
---40 157 443 ---- 443 2,6 0,0012 0,053 6,3 26 >100 18 10 17 1,6 ---5,6 28 65 ---- ---3,5 30 30 ---- ---6,7 69 69 ---- 149 3,0 0,020 0,33 ------3,9 1082 12 0,039 0 ,43 > 100 >100 >100 -33 13 5,8 3,4
25 -246 ---111 155 26 113 100 120 93 -->3000
26. ------28 -17 ----5,8 29 -1,6 ---3 ,9 3,4
2ge 200 75 52 32 --66 36 -86 ---1 ,9 78 51 -3,8 ----16 54 -1 ,5 ---3,0 3,1 56 >3000 >100 >100 >100 >100 ->100
Tabla 3 Parte 2
Ensa os de Proliferación de Luminiscencia de ATP Periodo de Incubación como se Destaca linea Celular CEro nM Compuesto
BT474 (48 h) I ~rQV3 (48 786-0 (48 h) I UQ-31 (48 h) I ~)MS53 (48 I ~r-BR3 (48 I ZR-75 (48 h)
Do' 674 360 908 CSI -3,0 1,6 4,2 ---Tub D -0,029 0,022 0,099 --MMAF -0,19 0,71 2,6 --
15 3,5 4,2 --32 3,9 13
16 19 18 --50 6,6 11
17 23 58 ->100 -80 24 24
19 8,8 -->100 -3,9 20
24 4,6 --13 -8,9 8,4
28 12 --5,8 -7,8 16
29 1,5 --2,7 5,3 3,6 15
25 166 --759 366 >3000 1003 26 19 --240 -253 208
26, ------
28 12 --5,8 -7,8 16 29 1,5 --2,7 5,3 3,6 15 2ge 492 --26 -278 136
36 -120 --8,8 -300 >300 >300 51 11 -->100 -13 19
54 4,8 ---7,9 6,2 9,6
56 >100 >100 -->100 >100 >100
84, --6, 12 ---84b --4,10 ---
109 --1,03 --- Tabla 3 Parte 3 Ensa os de Proliferación de Luminiscencia de ATP Periodo de Incubación como se Destaca linea Celular CE oM Compuesto
~E~iC1 I Nomo-1 (48 h) I :~~-82261 ~)CT-15 (72 I lNCaP (72 h)
~V~~R31 ~L~~
48h 48h
48 h
Do' 632 600 592 CSI 4,1 ----3,4 3,3 Tub D 0,085 ----0,014 0,093
MMAF 0,17 ----0,075 0,98
15 >100 -----
16 >100 -----
17 >100 -----
19 25 ----245
24 29 ----188
25 >3000 224 -83 -366
26 --61 3,9 45 -412
26, ------
28 14 ----132
29 >100 0,59 -0,24 -4,5
290 --20 2,9 70 -255
36 >300 114 -34 -96 >300
36, 0,048 ----51 5,5 ----93 54 >100 2,5 -3,1 -2,6 11 56 >100 -----84, 8,19 10-28 ---138 84b 4,91 16-27 ---22,8 109 0,019 ----112 0,05-,09 ----
Tabla 3 (Parte 4) Ensayos de Proliferación de luminiscencia de ATP (Periodo de Incubación como se Destaca)) línea Celular V CE50 nM) Compuesto
MOA-MB-231 I ~058 I ~-87 MG I NCI-H460 I A549 I HPAC I BT474
(72 h) 72 h) 72 h) I (72 h) (72 h) (72 h) (72 h) Dox 518 101 324 92 215 388 es, 3,1 0,20 3,3 0,64 -6,0 5,5 Tub o 0,047 0,0064 0,0054 0,0076 --0,021 MMAF 0,33 0,039 0,052 0, 13 -0,067 0,024 15 --8,6 ---16 -->100 ---17 --22 ---
19 32 26 >100 43 -0,33 24 13 14 18 23 -1,1 25 202 212 357 177 -97 26 --94 90 -279 26a ------28 16 20 18 35 -5,9 29 5,1 2,9 4,9 3,0 -4,9 2ge --136 6,0 -4,6 36 9,6 43 37 16 -2,9 51 -5,5 7,6 14 -4,5 54 5,6 1 ,4 1,6 1 ,6 -0,96 56 -->100 ---Tabla 3 (Parte 5) Ensayos de Proliferación de Luminiscencia de ATP (Periodo de Incubación como se Desta~))
Línea Celular CEso, nM) Compuesto
$KOV3 (72 786-0 I NCI-H740 I DM$53 I $K-BR3 I ZR-75 IOVCAR3
h) I 172 h) 172 h) 1172 h) (72 h) 172 h) (72 h) Dox 755 441 236 es' --2,2 3,8 3,1 2,2 - Tub o --0,022 0,069 0,025 0,034 MMAF ---4,5 0,16 0,25 (II'-q) -103 ----15 -9,4 ----
16 -36 ----
17 -73 ----
19 15 40 -87 --24 13 36 ->100 --25 109 306 ----26 38 126 -193 --49 26a ------28 2,9 11 0,82 10 15 36 21 29 -0,85 -1,0 2,1 2,7 1,5 2ge 8,6 ---36 41 8,4 36 -40 -62 24 81 45 51 -4,8 7,4 5,2 5,0 13 6,4 54 -1 ,2 -1 ,6 1,2 1,6 1,1 56 >100 >100 >100 5,7 24 >100 28 28 2,9 11 0,82 10 15 36 21 29 -0,85 -1,0 2,1 2,7 1,5 2ge 8,6 ---36 41 8,4 36 -40 -62 24 81 45 51 -4,8 7,4 5,2 5,0 13 6,4 54 1 ,2 1 ,6 1,2 1,6 11
Tabla 3 Parte
6 Ensa s de Proliferació n de Luminisc encia de ATP Periodo de Incu bación como se Destaca
Compuesto
Línea Celular CE5C nM HL-60 (72 h) I~~~iC1 I~~n;,~1 I~~~-8226 I ~~ihl I:'~~O I:,~,20
Do, eBI Tub D MMAF (III-q) 15 16 56 17 19 24 2S 26 2& 28 29 29< 36 51 54 56
'" '"0,76 0,55 0,0096 0,0030 0,12 0,11 14,27 -2,7 2,6 2,8 2,5 "oo "oo 7,4 26 7,7 " 6,4 8,7 -176 27 ---2,9 "-0,85 8,6 --40 -4,8 -1,2 " oo "OO 338 0,37 0,013 0,14 -2,7 3,1 "oo 3,9 5,2 4,0 ---0,82 ---7,4 -"oo 345 301 4,1 2,1 0.0051 0,0048 0,068 0,Q84 --2,6 2,5 15 3,0 5,7 24 15 27 9,6 9,2 8,4 7,9 235 209 -46 --10 15 1,0 2,1 -36 62 24 5,2 5,0 1,6 1,2 5,7 24 215 0,92 0,Q20 0,17 -5,6 48 "OO 92 52 42 261 67 -36 2,7 41 81 13 1,6 "OO 145 0,33 0,0058 0,057 -3,7 29 28 65 14 10 193 48 -21 1,5 8,4 45 6,4 1,1 28
Adicionalmente, los siguientes valores de CEso se midieron para los siguientes compuestos contra la linea celular H226, usando el ensayo de ATP y un periodo de incubación de 72 horas: compuesto 36a (0,307 nM); compuesto 109
5 (1,609 nM); y compuesto 112 (0,67-1,16 nm). Los siguientes valores de CEso se midieron para los siguientes compuestos contra la linea celular OVACAR8/Adr, usando el ensayo de ATP y periodo de incubación de 48 horas: compuesto 36a (17,05 nM), compuesto 84a (>300 nM); compuesto 84b (47,2 nM); compuesto 109 (24,9 nM); y compuesto 112 (12 nM).
10 Ejemplo 15 -Actividad In Vitro de Conjugados
Fig. 13 muestra la actividad de conjugados de la presente invención en ensayos de proliferación que usan 3H-timidina, medidos contra células 786-0 de cáncer renal, que son positivas en C070. El periodo de incubación fue de 72 horas. Los valores de CEso extra idos de las curvas de la Fig. 13 se dan en la Tabla 4, junto con datos de otros experimentos. 15 La linea celular LNCap es una linea celular de cáncer de próstata que expresa anUgeno de membrana especifico de próstata con (PSMA); H226 es una linea celular de cáncer de pulmón que expresa mesotelina. Los anticuerpos usados para conjugación fueron 23 10, un anticuerpo anti-PSMA (Huang y col., US 200910297438); 2H5, un anticuerpo anti-CD70 (Terrett y col., US 2009f028872); IF4, un anticuerpo anti-CD70 (Coccia y col., WO 20081074004); y 63 4, un anticuerpo antimesotelina (Terret y col., WO 2009f045957). Como controles , el Compuesto J de Sufi y col., WO
20 2008/083312 ("Cpd. J", un agente de unión/alquilante de surco menor de ADN) se usó como un compañero de conjugación y la toxina diftérica ("OTX") se usó como un control no específico no conjugado.
Tabla 4
Actividad In Vitro de Con·u ados
Conjugado o Compuesto de Prueba
CE.
Linea Celular
(nM)
Desi
nación Descri ión
2A10-CBI
Conjugado de 2A 10 Y Compuesto J 786-0 116,7
DTX
Control no específico no conjugado 786-0 104,4
2H5-CBI
Conjugado de 2H5 y Compuesto J 786-0 0,08592
lF4-CBI
Conjugado 1 F4 Y Compuesto J 786-0 0,09951
2H5-(VI-a)
Conjugado 2H5 y Compuesto (VI-a) 786-0 0,1151 a
0,0749
2A1O-(VI-a)
Conjugado de 2A210 y Compuesto (VI-a) 786-0 » 100
2H5-(VI-b)
Conjugado de 2H5 y Compuesto (VI-b) 786-0 0,06554
2Al0-(VI-b)
Conjugado de 2A10 Y Compuesto (VI-b) 786-0 » 100
2H5-(VI-n)
Conjugado de anticuerpo anti-2H5 y Compuesto 786-0 0,4384
(VI-n)
2H5-(VI-m)
Conjugado de 2H5 y Compuesto (VI-m) 786-0 0,5899
2H5-(VI-q)
Conjugado de 2H5 y Compuesto (VI-q) 786-0 inactivo
2H5-(VI-p)
Conjugado de 2H5 y Compuesto (VI-p) 786-0 inactivo
2H5-(VI-t)
Conjugado de 2H5 y Compuesto (VI-t) 786-0 0,310
6A4-(VI-!)
Conjugado de 6A4 y Compuesto ~~~-t~1) H226 0,360
2Alo'-(VI-t
Coniugado de 2A 10 Y Compuesto VI-! LNCap 0,570
Los datos muestran que un anticuerpo específico de C070 se necesita por un conjugado pa ra ser capaz de administrar de forma efectiva una citotoxina a células 786-0 C070-positivas: conjugados de anticuerpo 2A10, que es especifico para un antígeno diferente (PSMA), tienen actividad baja o no tienen ninguna actividad. En cambio, todos los conjugados de un anticuerpo anti-C070 fueron activos. Los conjugados de los Compuestos (VI-a) y (VI-b) fueron comparables en actividad a los conjugados del Compuesto J, un compañero de conjugación bien conocido y uno de cuyos conjugados está sufriendo ensayos clínicos. Es digno de mención que los conjugados de los Compuestos (VI-a) y (VI-b) muestren por separado toxicidad no específica muy pequeña: comparar las actividades de 2A10-(VI-a) y 2A10-(VI-b) frente a aquella de 2A 10-CBI.
Ejemplo 16 -Actividad In Vi/ro de Conjugados
Las células 786-0 de cáncer renal humano C070-positivas (Cal. CRL-1932 originalmente adqui ridas de ATCC) se cultivaron in vitro por instrucciones de ATCC Las células se recogieron, y se implantaron 2,5 millones de células por 200 ¡JI de OPBSIMatrigel™ (1 :1) subcutáneamente en la región de los flancos de ratones CB17.SCI0. Se midieron los tumores semanalmente en 3 dimensiones con un Calibrador Digital Electrónico de Fowler (Modelo 62379-531; Fred V. Fowler Ca., Newton, MA, EE.UU.) Y se registraron electrónicamente datos usando software StudyOirector de Studylog Inc. (San Francisco Sur, CA, EE.UU.). Los animales se sometieron a control diariamente con respecto a cambios posturales, de acidamiento y respiratorios, así como de letargo. Los animales también se pesaron semanalmente y se sometieron a eutanasia si la pérdida de peso fue <!: 20 %. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 194 mm:!, se trataron grupos de 6 ratones cada uno con una dosis intraperitoneal (IP) individual de un conjugado de prueba (por ejemplo, 2H5-(VI-b» y un control isotípico (2A 10-(VI-b)) a un peso corporal de 0,3 ¡Jmollkg. Los volúmenes de tumores (LAN2) y los pesos de los ratones se registraron a lo largo del curso de cada estudio, que se dejaron avanzar durante aproximadamente 2 meses tras la administración de dosis inicial. Se usó una macro de hoja de cálculo de Excel calculando los valores de media, desviación estándar y mediana de los tamaños de los tumores. Los datos se dibujaron en una curva usando el programa Prism versión 4.0.
El estudio de xenoinjerto resultó como se muestra en la Fig. 14, donde las etiquetas de las leyendas tienen el mismo significado que en el ejemplo anterior y que en la Fig. 13. Los datos demuestran la actividad in vivo de conjugados de compuestos de la presente invención frente a células 786-0 C070'. Tanto conjugados de compuestos (VI-a) como conjugados de compuestos (VI-b) con el anticuerpo 2H5 anti-C070 causaron una reducción en tamaño de tumor promedio a menos de la mitad durante el curso del estudio, mientras que, cuando se administró el control de vehículo
o un conjugado con el anticuerpo 2A 10 anti-PSMA, el volumen promedio de tumor subió a más del doble.
Ejemplo 17 -Esquema 13
El Esquema 13 (Fig. 15) muestra un procedimiento para fabricar 4-nitrotubufenilalaninas enantioméricamente puras (4-NÜ:2Tup) 82a y 82b, que son útiles para fabricar compuestos de esta invención.
Compuesto 80. Se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (90,5 mg, 0,42 mmol) a una mezcla de compuesto 34 de Esquema 3 (0,1 g, 0,35 mmol) en NaOH acuoso 0,7 M (1 mi). La mezda de reacción se agitó a TA durante 3 horas, y después se acidificó a pH 3 con HCI 5 N. Después de que la solución acuosa se extrajera con EtOAc tres veces , las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de metanol al 0-20 % en OCM proporcionando 0,117 g de compuesto 80 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 253,1 (M+1 sin 8oc).
Ésteres de (-)-mentoI 81a y 81b. Se añadió OCC (87,8 mg, 0,43 mmol) a una solución de compuesto 80, (-)-mentol (66,6 mg, 0,43 mmol) y 4-(dimetilamino)piridina ("OMAP: 10,4 mg, 0,085 mmol) en OCM (1,5 mi) a TA. Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 3 h, el precipitado se eliminó por filtración. El filtrado se concentró después. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente del 0-20 % en hexanos proporcionando 55,7 mg de éster 81a como un sólido blanco, y 55,7 mg de éster 81b como un sólido blanco. EM para éster 81a : (+) mIz 391,2 (M+1 sin Boc); EM para éster 81b: (+) miz 391,2 (M+1 sin Boc).
4-NOzTup 82a y 8lb. Se calentó una solución de éster 81 a en HCI6 N (40 mg, 0,082 mmol) a 130 'C durante 1, 5 h. La mezcla de reacción se concentró proporcionando 23,S mg de 4-NOzTup 82a como un sólido blanco. RMN lH (OzO, 400 MHz): ~ 8,04 (d, 2H, J ¡;; 8,4 Hz), 7,33 (d, 2H, J;o; 8,4 Hz), 3,50 (m, 1H), 3,03 (dd, 1H, J;o; 6,8, 14,4 Hz), 2,89 (dd, 1 H, J ;o; 7,6 Hz, 14,4 Hz), 2,45-2,39 (m,1H), 1,92-1,84 (m, 1H), 1,62-1,55 (m,1H), and 0,98 (d, 3H, J;o; 7,2 Hz); EM: (+) miz 253,1 (M+1). 4-NOzTup 82b se obtuvo por el mismo procedimiento en la misma escala como un sólido blanco (23,5 mg). RMN lH (OzO, 400 MHz) : ~ 8,03 (d, 2H, J;o; 8,4 Hz), 7,33 (d, 2H, J;o; 8,4 Hz), 3,50 (m , 1 H), 2,93 (dd, 2H, J;o; 2,0, 7,6 Hz), 2,54-2,48 (m, 1 Hl, 1,86-1,78 (m, 1 H), 1,60-1,53 (m, 1 H) Y 0,98 (d, 3H, J;o; 6,8 Hz); EM: (+l mIz 253,1 (M+1 l .
Ejemplo 18 -Esquema 14
El Esquema 14 (Fig. 16) representa la conversión de 4-NOzTup 82a y 82b en compuestos de la invención.
Ácido de nitro 83a. Se añadió Compuesto 34a de Esquema 3 (10 mg, 0,019 mmol)a una solución 0,2 M de pentafluorofenol (5,1 mg, 0,028 mmol) y N,N-diisopropilcarbod iimida ("OIC," 0,0032 mi, 0,021 mmol) en OCM (0,2 mi)
a O oC. La mezcla de reacción se calentó a TA y se agitó a tal temperatura durante toda una noche. El disolvente se evaporó. Se añadió EtOAc (1 ,8 mi), t se filtró el producto en bruto, con aclarado del recipiente de reacción con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida, y el pentafluorofenilo en bruto se usó sin purificación adicional. Se añadió DMF (O,2 mi) al éster en bruto, seguido por 4-NOzTup 82a (10,7 mg, 0,037 mmOI), y OlEA (0,013 mi, 0,074 mmol). La mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche, y el disolvente se eliminó por evaporación después. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de MeOH al 0-20 % conteniendo NH40H al1 % en DCM proporcionando 12,9 mg de ácido de nitro 83a como un sólido blanco. EM: (+) mIz 773,4 (M+1).
Acido de nitro 83a de vía alternativa: se añadió OlEA a una solución de compuesto 34a (10 mg, 0,019 mmol) y HATU (7,8 mg, 0,020 mmol) en DMF (0,3 mi), manteniendo el pH a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron OlEA y amina de nitro 82a (5,4 mg, 0,019 mmol) en OMF (1 mi), manteniendo el pH a 8-9. Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 minutos, el producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 13,4 mg de ácido de nitro 83a como un sólido blanco.
Se preparó ácido de nitro 83b por la misma vía alternativa, en la misma escala y se obtuvo como un sólido blanco (13,4 mg). EM: (+) mIz 773,4 (M+1).
Amina 84a. Una mezcla de ácido de nitro 83a (7,5 mg, 0,0097 mmol) y paladio en carbono (10 %, 1,1 mg) en MeOH (0,37 mi) se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 4 horas. El catalizador se eliminó por filtración, y el filtrado se concentró. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 6,2 mg de amina 84a como un sólido blanco. RMN 'H (C0300, 400 MHz): i5 8,06 (s, 1H), 7,36 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,17 (d , 2H, J = 8,4 Hz), 5,70 (dd, 1 H, J = 2,8, 10,8 Hz), 4,71 (d, 1 H, J = 7,2 Hz), 4,44-4,35 (m, 2H), 3,74{ d, 1 H, J = 9,6 Hz), 3,49-3,45 (m, 1 H), 3,36-3,35 (m, 1 H), 3,30-3,25 (m, 1 H), 3,13 (s, 3H), 3,14-3,04 (m, 1 H), 2,93 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 2,74 (s, 3H), 2,48-2,28 (m, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,19-2,03 (m, 2H), 1,95-1,86 (m, 4H), 1,80-1,71 (m, 2H), 1,71-1,57 (m, 3H), 1,24-1,13 (m, 1H), 1,16 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,04 (d , 3H, J = 6,4 Hz), 1,02 (d , 3H, J = 6,8 Hz), 0,94 (t, 3H, J = 7,2 Hz) y 0,84 (d, 3H, J = 6,8 Hz); EM: (+) mIz 743,4 (M+1).
El ácido de nitro 83b se hidrogenó a amina 84b usando el mismo procedimiento, en una escala de 8 g. Se obtuvo amina 84b como un sólido blanco (6,7 mg). RMN 'H (COJOD, 400 MHz): O 8,06 (s, 1H), 7,35 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,16 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 5,70 (dd, 1H, J = 2,8, 11 ,2 Hz), 4,72 (d, 1 H, J = 7,2 Hz), 4,49-4,32 (m, 2H), 3,75 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 3,49-3,45 (m, 1H), 3,36-3,35 (m, 1H), 3,33-3,31 (m, 1H), 3,12 (s, 3H), 3,12-3,04 (m, 1H), 2,91 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 2,74 (s, 3H), 2,57-2,52 (m, 1H), 2,45-2,37 (m, 1H), 2,33-2,28 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 2,19-2,13 (m, 1H), 2,03-1,88 (m, 5H), 1,81-1,57 (m, 5H), 1,24-1,13 (m, 1 H), 1,17 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,04 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 1,02 (d , 3H, J = 7,2 Hz), 0,94 (t , 3H , J = 7,2 Hz), y 0,84 (d, 3H, J =6,4 Hz); EM: (+) mIz 743,4 (M+1 ).
Los compuestos 84a y 84b se describen también en esta memoria descriptiva por fórmulas (III-r) y (III-s), respectivamente.
Ejemplo 19 -Esquema 15
El Esquema 15 (Fig. 17) representa la síntesis de compuestos listos para la conjugación de esta invención que tiene un engarce aminoacidico de esta invención (citrulina).
Compuesto 85. Una mezcla de compuesto 62 de Esquema 10 (0,22 g, 0,654 mmol), citrolina protegida por fmoc (0,39 g, 0,981 mmol), y clorhidrato de N-{3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida rEDCI," 0,188 g, 0,981 mmol) en DMF (4 mi) se agitó a TAdurante toda una noche. La reacción se desactivó por adición de NH4CI saturado y la solución acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se pUrificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sil ice con un gradiente de MeOH al 0-20 % en DCM proporcionando 0,42 g de compuesto 85 como un sólido blanco. EM : (+) mIz 716,4 (M+1 ).
Compuesto 86. Se añadió piperidina a una solución de compuesto 85 (0,248 g, 0,346 mmol) en OMF, manteniendo el pH a 9-10. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 20 minutos y después se concentró proporcionando 0,17 g de compuesto 86. EM: (+) mIz 494,4 (M+1 ).
Compuesto 87. Se añadió LiOH (26,6 mg, 1,11 mmol) en agua (3 mi) a una solución de compuesto 86 (0,17 g, 0,346 mmol) en THF (2 mi). Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 2 h, el disolvente se eliminó parcialmente. La solución acuosa se acidificó a pH 2-3 con Hel y se concentro. El residuo se redisolvió en DMF (2 mi) y se añadieron 6-maleimidohexanoato de N-succinimidil0 (0,16 g, 0,519 mmol) y OlEA (0,091 mi, 0,519 mmol). Después la mezcla de reacci6 n se agitó a TA durante 10 minutos, el producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 0,198 g de compuesto 87 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 673,4 (M+1 ).
Compuesto 88. Se añadió TFA (0,5 mi) a una solución de compuesto 87 (12,5 mg, 0,019 mmol) en OCM (0,5 mi) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 minutos y después se concentro proporcionando 12,8 mg de compuesto 88 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 573,4 (M+1).
Compuesto 89. Se añadió OlEA a una solución de compuesto 34a de Esquema 3 (5 mg, 0,0093 mmol) y HATU (3,9 mg, 0,010 mmol) en DMF (0,3 mi), manteniendo el pH a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron OlEA y compuesto 88 (12,8 mg, 0,019 mmol) en DMF (1 mi), manteniendo el pH a 8-9. Después la mezda de reacción se agitó a TA durante 15 minutos, el producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 8,6 9 de compuesto 89 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 1093,8 (M+1). Se representa también el Compuesto 89 en esta memoria descriptiva por fórmula (VI-m).
Compuesto 90. Se añadió OlEA a una solución de compuesto 49 de Esquema 5 (5 mg, 0,0098 mmol) y HATU (4,1 mg, 0,011 mmol) en DMF (0 ,3 mi), manteniendo el pH a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron OlEA y el compuesto 88 (13,5 mg, 0,0196 mmol) en DMF (1 mi), manteniendo el pH 8-9. Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 15 minutos, el producto en bruto se pUrificó por HPLC preparativa proporcionando 8,9 mg de compuesto 90 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 1065,6 (M+1). Se representa también el compuesto 90 en esta memoria descriptiva por fórmula (VI-p).
Ejemplo20 -Esquema 16
El Esquema 16 (Fig. 18) representa la preparación de compuestos listos para conjugación de esta invención, que tienen un engarce dipeplídico (citrulina-valina).
Compuesto 91 . Se añadió OlEA a una solución de valina protegida con Fmoc (62,3 mg, 0,184 mmol) y HATU (63,6 mg, 0,167 mmol) en DMF (0 ,5 mi), manteniendo el pH a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron OlEA y el compuesto 86 de Esquema 15 (82,5 mg, 0,167 mmol) en DMF (1 mi), manteniendo el pH a 8-9. Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 15 minutos, la reacción se desactivó por adición de TFA acuoso al 0,05 %. Después de que la solución acuosa se extrajera con EtOAcef tres veces , las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de silice con un gradiente de MeOH al 0-20 % en DCM proporcionando 0,13 g de compuesto 91 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 815,5 (M+l).
Compuesto 92. Se añadió piperidina a una solución de compuesto 91 (0,144 g, 0,177 mmol) en DMF, manteniendo el pH a 9-10. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 20 mino y después se concentró. El residuo se disolvió en THF (2,5 mi ) y se añadió LiOH (16,3 mg, 0,681 mmol) en agua (1 ,3 mi). Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 2 h, el disolvente se eliminó parcialmente. La solución acuosa se acidificó a pH 2-3 con HCI y después se concentró. El residuo se redisolvió en DMF (2,5 mi) y se añadieron 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (0,105 g, 0,341 mmol) y OlEA (0,060 mi, 0,341 mmol). Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 10 minutos, el produclo en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 0,116 9 de compuesto 92 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 772,5 (M+1).
Compuesto 93. Se añadió TFA (0,6 mi) a una solución de compuesto 92 (14,4 mg, 0,019 mmol) en DCM (1 mi) a TA. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 minutos y después se concentró proporcionando 14,7 mg de compuesto 93 como un sólido blanco. RMN l H (CD30D, 400 MHz): O 7,58 (dd, 2H, J = 1,6,8,4 Hz), 7,21 (dd, 2H, J= 2,8, 8,8 Hz), 6,79 (s, 2H), 4,48 (m, lH), 4,13 (d, lH, J= 7,6 Hz), 3,57-3,46 (m, 3H), 3,33-3,32 (m, 1H), 3,22-3,09 (m, 2H), 2,91-2,80 (m, 1 H), 2.27 (t, 2H, J = 7.2 Hz). 2,09-1,85 (m, 3H), 1.81-1,54 (m, 8H), 1.35-1,29 (m. 3H), 1.19 (d. 1,5 H, J = 6.8 Hz), 1.18 ( d, 1,5 H, J = 7,2 Hz), 0,98 (d, 3H, J = 2,4 Hz), 0,96 (d, 3H, J = 2,8 Hz); EM: (+) mIz 672,4 (M+1).
Compuesto 94. Se añadió OlEA a una solución de compuesto 34a de Esquema 3 (11 mg, 0,0204 mmol) y HATU (3,9 mg, 0,0204 mmol) en DMF (0,3 mi), manteniendo el pH a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron OlEA y compuesto 93 (14,7 mg, 0,019 mmol) en DMF (1 mi), manteniendo el pH a 8-9. Después la mezda de reacción se agitó a TA durante 15 minutos, el producto en bruto se purificó por HPLC preparativa proporcionando 18,9 g de compuesto 94 como un sólido blanco. EM : (+) miz 1192,6 (M+l). Se representa también que el compuesto 94 se representa también en esta memoria descriptiva por fórmula (VI-n).
Acetato de compuesto 2 7. Se añadió anhidrido acético (0 ,248 mi) a una solución de compuesto 27 de Esquema 2 (Peltier y col., 2006; 0,13 g, 0,218 mmol) en piridina (2,6 mi) a O oC. La mezcla de reacción se agitó después a TA durante toda una noche. Después la mezcla de reacción se enfrió a °'C, una solución de agua y se añad ió 1 ,4-dioxano (12 mi , ....Iv 1 :1). La mezcla de reacción se agitó a TA durante toda una noche y después se concentró. El produclo en bruto se purificó por cromatografia ultrarrápida eluyendo a partir de gel de sílice con un gradiente de MeOH al 10-20 % en DCM proporcionando 0,114 g de compuesto 27 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 639,4 (M+1 ).
Acetato del compuesto 27
Compuesto 95. Se añadió DIEA a una solución de acetato de compuesto 27 (3,8 mg, 0,0059 mmol) y HATU (2,5 mg, 0,0065 mmol) en DMF (0,3 mi), manteniendo el pH a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 mino Después se añadieron DIEA y compuesto 93 (5,6 mg, 0,0071 mmol) en DMF (1 mi), manteniendo el pH a 8-9. Después la mezcla de reacción se agitó a TA durante 15 minutos, el producto en bruto se pUrificó por HPLC preparativa proporcionando 6,5 9 de compuesto 95 como un sólido blanco. EM: (+) mIz 1292,7 (M+1 ). El compuesto 95 se representa también en esta memoria descriptiva por fónnula (VI-o).
Ejemplo 21 -Esquema 17
Este ejemplo describe la sintesis de ácido 108, un intennedio útil para la preparación de compuestos de esta invención, con referencia a Esquema 17 (Fig. 19).
~stermetílico 100. Se al"iadió HCI en dioxano (8,3 mi, 4M, 33,2 mmol) a una solución de compuesto 9 de Esquema 1 (8 g, 22,1 mmol) en MeOH (10 mi). La mezcla de reacción se agitó después a TA. Después de 20 minutos, la solución se evaporó a vacio dando éster metilico 100 como un aceite (6,5 g), que se usó para la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional.
Propilamina 101. Se al"iadieron propanal (700 j.Jl, 7,36 mmol) y NaSH(OAc)3 (2,8 g, 13,2 mmol) a una solución de éster metílico 100 (1 ,96 g, 6,6 mmol) en DCM (10 mi). La mezcla de reacción se agitó después a 5 'C. Después de 1 hora la mezcla se llevó en EtOAc y se lavó con solución de K2COJ al 7 % dos veces y después con salmuera . la fase de EtOAc se secó sobre Na2S04 anh idro y después se evaporó a vacio proporcionando un residuo que se hizo p'asar a través de una columna (MeOH al 0-10 %:DCM) dando propilamina 101 (1,12 g, 60 %) como un aceite. RMN H (400 MHz, CDCIJ) ti 8,17 (s, 1H), 5,43 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,07-2,87 (m, 2H), 2,82-2,70 (m, 1 H), 2,54 (s, 1 H), 2,45-2,26 (m, 2H), 2,16-2,02 (m, 1 H), 1,73 (m, 2H), 1,05-0,94 (m, 9H). EM miz C14H2SN20 3S (M+1 ¡> calculada 301 ,2, hallada 301.
Compuesto 102. Se al"iadieron hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio ("PySop," 1,28 g, 2,47 mmol), HOSt (0,33 g, 2,47 mmol), isoleucina protegida con Boc (430 j.Jl, 2,47 mmol) a una solución de propilamina 101 (570 mg, 1,9 mmol) en DCM (5 mi). La mezcla de reacción se agitó después a TA. Después de 20 minutos se añadió EtOAc (200 mi) y la fase orgánica se lavó con ácido citrico al10 % (dos veces), NaHC03 saturado, y salmuera. La fase de EtOAc se secó sobre Na2S04 anh idro y después se evaporó a vacio proporcionando un residuo que se hizo pasar a través de una columna dando compuesto 102 (0,55 g) como un aceite. EM mlzC2sH44N30eS (M+1)+ calculada 514,3, hallada 514 ,3.
~sterde azido 104. Se al"iadió cloruro ácido 103 (2 mmol., Lundquist y col. 2001 ; véase también anteriormente en la preparación de éster de azido 43 de Esquema 5) en DCM (3 mi) a una solución de compuesto 102 (0,55 g, 1,1 mmol) en DCM (10 ml)y DIEA (871 j.Jl, 5 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 5 'C. Después de agitar durante 10 minutos la mezcla se evaporó a vacio dando un residuo que se hizo pasar a través de una columna dando éster de azido 104 (300 mg) como un aceite. EM miz CJ1Hs3Ne07S (M+1 f calculada 653,4, hallada 653.
Compuesto 106. Se añadió una solución de éster de pentafluoroetilo 105 (2,1 mmol, Peltier y col. 2006) en 1 mi de EtOAc a una solución de éster de azido 104 (300 mg, 0,46 mmol) y Pd/C (10 %, 50 mg) en EtOAc (5 mi). El matraz de reacción se cargó con H2 usando un balón y se agitó durante toda una noche a TA. Después de agitar durante toda una noche la mezcla de reacción de filtró, se concentró a vacio y después se hizo pasar a través de una columna (MeOH:DCM, 0-10 %) dando compuesto 106 (170 mg) como un aceite. EM miz C38HooNsOeS (M+1)+ calculado 752,5, hallado 752 ,5.
Compuesto 107. Se añadió NaOH (120 ul, 1,2 mmol, 10 M) a una solución de compuesto 106 (170 mg, 0,22 mmol) en MeOH (10 mi) a TA. Después de agitar durante 2 horas la mezcla de reacción se acidificó a pH 2 con HCI concentrado. La mezcla de reacción se evaporó después a vacío y se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:H20, 0-100 % con TFA al 0,1 %). Después de liofilización, el compuesto 107 (63 mg) se obtuvo como un polvo blanco. El perfil de HPLC ind icó que era una mezcla de rotámeros . EM miz C26H4SN40 SS (M+1 f calculada 525,3, hallada 525.
Acido 108. Se añadió anhídrido acético (60 ul, 0,64 mmol) a una solución de compuesto 107 (63 mg, 0,12 mmol) en piridina (1 mi) a 5 'C. La temperatura se elevó a T A gradualmente. Después de permitir a la reacción avanzar durante toda una noche, se añadió agua (100 ul). Después de otras 5 horas, los productos orgánicos volátiles se eliminaron dando un residuo que se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:H20 , 0-100 % con TFA al 0,1 %) dando ácido 108 (42 mg) como un aceite. RMN 'H (400 MHz, CD30D) 6 8,35 (s, 1H), 5,71 (dd, J = 11,4, 1.4 Hz, 1 H), 4,63 (d , J = 9,1 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 16,4 Hz, 1 H), 3,65-3,42 (m, 2H), 3,21-3,05 (m, 2H), 2,87 (s, 3H), 2,34-2,14 (m, 4H), 2,13 (s, 3H), 2,03-1,46 (m, 10H), 1,29-1,06 (m, 1 H), 1,04-0,85 (m, 15H). EM miz C28H47N40 SS (M+1 f calculado 567,3, hallado 567.
Ejemplo 22 -Esquemas 18 y 19
El Esquema 18 (Figs. 20a y 20b) muestra la síntesis de compuestos de esta invención usando como ácido 108, preparado en el ejemplo precedente.
Procedimiento general para acoplamiento mediado por HATU. Se añadieron HATU (en exceso 1,2 x) y OlEA (en exceso 4 x) en una solución de ácido 108 en DMF a 5 'C. Después de agitar la mezcla de reac ción durante 10 minutos, se añadió la amina correspondiente. La mezcla de reacción se agitó durante otros 10 minutos antes de diluirla con OMSO y solución de TFA al 0,1 %. La mezcla resultante se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:H20, 0-100 % con TFA al 0,1 %). Se analizaron las fracciones recogidas y se liofilizaron las fracciones deseadas dando el producto correspondiente.
Compuesto 109. Obtenido del acoplamiento de ácido 108 y éster meUlico de fenilalanina. EM miz C38H58NS0 7S (M+1 )+ calculada 728.4, hallada 728,4. El compuesto 109 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (III-x).
Compuesto 111. Obtenido del acoplamiento de ácido 108 y compuesto 110 (preparación descrita más adelante). EM miz C42H63N6Ú9S (M+1f calculado 827,4, encontrado 827,5.
Compuesto 112. A una solución de compuesto 111 (5 mg, 6 IJmol) en 2 mi de MeOH se añadió PdlC (10 %,10 mg). El matraz de reacción se cargó con Hz usando un balón y se agitó durante 2 horas a TA. La mezcla de reacción después se filtró, se concentro a vacío y se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:H20, 0-100 % con TFA al 0,1 %) dando compuesto 112 (2,1 mg) como un polvo blanco. EM miz C4 2H67N607S (M+1)+ calculada 799,5, hallada 799,5. El compuesto 112 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (1I1-y).
Compuesto 114. Obtenido del acoplamiento de ácido 108 y compuesto 113 (preparación descrita más adelante). EM miz C41H64N50 7S (M+1f calculada 770,4, hallada 770.
Compuesto 116. Obtenido del acoplamiento de ácido 108 y compuesto 115 (preparación descrita más adelante). EM mlZG61H95N'1013S (M+2)+ calculada 610,9, hallada 611. El compuesto 116 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (VI-t).
Compuesto 117. Obtenido del acoplamiento de ácido 108 y del éster meUlico de alfa-N-acetillisina. EM miz C37H6;lNsOeS (M+1 f calculado 751,4, hallado 751,5.
Compuesto 110. Se disolvió alqueno 59 de Esquema 8 (como éster etílico en vez de éster metílico, 1 g, 2,6 mmol) en DCM (10 mi) conteniendo TFA al 5 % Y la mezcla de reacción se agitó a 5 'C. Después de 40 minutos la me zcla se secó a vacío dando compuesto 110 (0,3 g, 100 %) como un semisólido. RMN l H (400 MHz, C0300) i5 8,22-8,17 (m, 2H), 7,50 (dd, J = 9,0, 2 ,2 Hz, 2H), 6,58 (d , J = 10,0 Hz, 1H), 4,45 (td, J = 9,8, 5,3 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,35-3,28 (m, 1 H), 3,06 (dd, J = 13,2, 9,6 Hz, 1 H), 1,55 (d, J = 0,9 Hz, 3H) , 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
Compuesto 113. Se añadió HCI (2.5 mi, 10 mmol, 4 M) a una solución de compuesto 118 (2 g, 5,5 mmol, Peltier y col. 2006) en MeOH (10 mi) y la mezcla de reacción se agitó a TA. Después de 20 minutos la mezcla se secó a vacío dando compuesto 113 (2 g, 100 %) como un semisólido. Se usó producto en bruto para la reacción de la siguiente etapa sin pUrificación adicional. EM miz C13H19NOZ (M+1 f calculada 222,1, hallada 222.
""1
HCI •
HCI -H, N
118 113
El Esquema 19 (Fig. 21) muestra la síntesis de compuesto 115, usado en la sintesis de compuesto 116, anterior. 15
Compuesto 120. Se añadieron DIEA (697 ¡JI, 12 mmol) y éster t-butílico de valina 543 (627 mg, 3 mmol) en una solución en 10 mi de DCM de ácido 6-maleimidohexanoico ("6-MHA." 622 mg, 3 mmol) y HATU (1 ,14 g, 3 mmol). Después de 20 minutos se añadió EtOAc (200 mi). La fase orgánica se lavó con ácido citrico al10 %, solución de NaHC03 saturada y salmuera. Se secó con Na2S04 anhidro y el disolvente se eliminó por evaporación. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (Hexano:EtOAc, 0-80 %) dando compuesto 120 (900 mg) como un aceite. RMN 'H (400 MHz, CDCh) ti 6,66 (s, 2H), 5,94 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) , 4,44 (dd , J = 8,7, 4,5 Hz, 1 H), 3,49 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,31-2,06 (m, 3H), 1,73-1,54 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,37-1,25 (m, 2H). EM miz C,9H3,N20 S (M+1)+ calculada 367,2, hallada 367.
Compuesto 121. El compuesto 120 (1 g, 2,73 mmol) se disolvió en 20 mi de DCM con 3 mi de TFA a TA. Después de 1 hora la mezcla se secó por evaporación dando compuesto 121 () como un aceite, que se usó sin purificación adicional. EM miz Cl sH23N20 S (M+1)+ calculado 311 ,2, hallado 311 .
Compuesto 123. Se añadieron DIEA (920 ¡JI, 5,28 mmol) y compuesto 122 (500 mg, 1,32 mmol; véase Esquema 22 y Ejemplo 25 en el presente documento) a solución en 10 mi de DMF de citrulina protegida por Fmoc (524 mg , 1,32 mmol) y HATU (601 mg, 1,58 mmol). Después de 20 minutos, se añadieron 200 mi de EtOAc. La fase orgánica se lavó con ácido citrico al 10 %, solución saturada de NaHC03 y salmuera. Se secó después con Na2S04 anhidro y se evaporó el EtOAc. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (MeOH:DCM; 0-10 %) dando un sól ido. Este sólido se disolvió en DMF (5 mi) con piperidina al 5 %. Después de 1 hora la solución se evaporó y el residuo se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:H20; 0-100 % con TFA al 0,1 %) dando compuesto 123 (212 mg). EM miz C27H4sNsOs (M+1f calculada 536,3, hallada 536,4.
Compuesto 124. Se añadieron DIEA (404 ¡JI, 2,4 mmol) y compuesto 123 (321 mg, 0,6 mmol) en una solución en DMF de 5 mi de compuesto 121 (180 mg, 0,58 mmol) y HATU (220 mg, 0,58 mmol). Después de 20 minutos se añadieron 200 mi de EtOAc. La fase orgánica se lavó con ácido cítrico al10 %, solución de NaHC03 saturada y salmuera. Se secó después con Na2S04 anhidro y se evaporó el EtOAc. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (MeOH:DCM; 0-20 %) dando compuesto 124 (240 mg) como un aceite. EM miz C42HssN70 10 (M+1 )+ calculada 828 ,5, hallada 828 ,5.
Compuesto 115. El compuesto 124 (240 mg, 0,29 mmol) se disolvió en una solución de 5 mi de TFA y DCM (1 :1). Después de 3 horas la mezcla se secó por evaporación y el compuesto 115 resultante se usó sin purificación adicional. A partir de RMN, se obtuvo una mezcla de dos (5:1) isómero. Se comunica el isómero principal: RMN lH (400 MHz, CD30D) O 8,27 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,58 (dd, J = 8,5, 1,9 Hz, 2H), 7,21 (d. J = 8,5 Hz, 2H), 6,79 (s, 2H), 4,48 (dd, J = 13,3,8,1 Hz, 1H), 4,14 (dd, J= 7,5, 4,9 Hz, 1H), 3,62-3,38 (m, 3H), 3,25-2,97 (m, 3H), 2,96-2,78 (m, 2H), 2,70-2,40 (m, 1 H), 2,32-2,21 (m, 2H), 2,11-1,92 (m, 2H), 1,94-1,83 (m, 1 H), 1,82-1,70 (m, 1H), 1,70-1,49 (m, 7H), 1,19 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,97 (dd, J = 6,8, 2,8 Hz, 6H). EM miz C33HsoN70a (M+1 f calculada 672,4, hallada 672.
Ejemplo 23 -Esquema 20
El Esquema 20 (Fíg. 22) muestra la síntesis de compuesto 131, un intermedio usado para fabricar compuestos de esta invención.
Compuesto 125. El compuesto 9 de Esquema 1 (3 g, 8,29 mmol) se disolvió en THF (20 mi) y dimetilsulfato (1 ,2 mi, 12,4 mmol). A esta solución se añadió NaH (552 mg, 13,8 mmol) a 5 'C en partes durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se vertió después en solución de NH4CI saturada. Se añadió EtOAc a la mezcla de reacción y la fase orgánica se lavó con salmuera y se secó y se evaporó a vacío dando un residuo. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (Hexano:EtOAc, 0-100 %) dando compuesto 125 (1,2 mg) como un aceite. RMN lH (400 MHz, CDCI3)O 8,12 (s, 1H), 4,95 (dd, J = 10,0,3,3 Hz, 1 H), 3,89 (s, 3H), 3,50 (s, 3H), 3,45-3,40 (m, 2H), 1,93-1,79 (m, 2H), 1,74-1,65 (m, 1 H), 1,20 (s, 9H), 0,84 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,80 (d, J = 6,8 Hz, 3H). EM mIz C1sH29N204S2(M+1)+ calculada 377,1, hallada 377,2.
Compuesto 126. Se añadió HCI en dioxano (1 mi, 4 mmol) a una solución de compuesto 125 (0,7 g, 1,86 mmol) en MeOH (10 mi). La mezcla de reacción se agitó después a TA. Después de 20 minutos, los productos volátiles se evaporaron a vacio dando compuesto 126 (0,8 g) como un aceite que se usa para la siguiente etapa de reacción sin purificaCión adicional. EM miz C12HZ1N203S (M+1f calculada 273,1, hallada 273.
Compuesto 127. A una solución de compuesto 126 (616 mg, 2 mmol) en DCM (10 mi) y DIEA (1,8 mi, 10 mmol) a 5 oC, se añadió compuesto 103 (Esquema 17, 6 mmol) en 5 mi de DCM. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a TA. Después de 3 horas la mezcla de reacción se vertió en solución NaHC03 saturada y EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se evaporó. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (Hexano:EtOAc, O-50 %)dando compuesto 127 (594 mg, 72 %) como un semiaceite. RMN lH (400 MHz, CDCI3) O 8,18 (s, 1H), 6,47 (d, J = 9,9 Hz, 1 H), 4,60-4,52 (m, 1 H), 4,23-4,13 (m, 1 H), 3,96-3,95 (m, 1 H), 3,94 (s, 3H), 3,44 (s, 3H), 2,21-2,08 (m, 1 H), 1,94-h84 (m, 2H), 1,84-1,71 (m, 1H), 1,52-1,38 (m, 1H), 1,35-1,20 (m, 1H), 1,07 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,95-0,85 (m, 9H). RMN C (101 MHz, CDCI3) ti 176,00, 168,63, 161,92, 146,90, 128,24,78,81,70,34,58,97, 52,72,50,76,40,48,38,62, 32,24,24,32,19,13,18,13,16,25,11,82. EM mlzC1aH3QNs0 4S (M+1f calculada 412,2, hallada 412,3.
Compuesto 129. Se añadió hexametildisilazida de potasio ("KHMDS: 0,19 mmol, 0,375 mi de solución de tolueno) en una solución en THF (0,5 mi) de compuesto 127 (50 mg, 0,12 mmol) a -43 'C. Después de 20 minutos se añadió compuesto 128 (0,36 mmol, 137 ul, Abe y col. 1997). Después de 2 horas, se añadieron 100 ¡JI de MeOH y la mezcla de reacción se vertió en solución de NH4Ci saturada. Se añadió después EtOAc. Después de separación de las fases, la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con NaZS04 anhidro y el disolvente se retiró por evaporación. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (Hexano:EtOAc, O-50 %) dando compuesto 129 (51 mg) como un
semisÓlido. RMN lH (400 MHz, CDCI3) 6 8,16 (s, 1 H), 5,70 (s, 1H), 5,43 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,32 (d, J = 12,3 Hz, 1 H), 4,39 (d, J = 10,6 Hz, 1 H), 3,92 (d, J = 11,7 Hz, 3H), 3,53-3,44 (m, 1H), 3,37 (d, J = 10,5 Hz, 3H), 2,41 (d, J= 7,2 Hz, 2H), 2,37-2,11 (m, 4H), 1,92 -1,68 (m, 2H), 1,37-1,21 (m, 1H), 1,12 -0,85 (m, 18H). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) O 175,24, 172,79, 171,21 , 161,90,147,09,128,25,78,44,68,69, 63,35, 58,71, 52,48, 43,23, 38,63, 34,91, 31,01, 25,73, 25,25, 22,58,22,56,22,48,20,45, 19,62,16,14,10,65. EM mIz C24 H4oNsOsS (M+1)+ calculada 526,3, hallada 424,3 (rotura del N,O acetal).
Compuesto 130. Se mezclaron compuestos 129 (200 mg, 0,38 mmol) y 105 (Peltier y col. 2006; 4 mmol) en 5 mi de EtOAc con PdlC (150 mg, 10 %) a ta. El matraz de reacción se evacuó y recargó con H2usando un balón. Después de agitar durante toda una noche a TA, la mezcla se filtró y el disolvente se evaporó. Después de cromatografía en columna (Si02, MeOH:DCM, 0-10 %), se obtuvo el compuesto 130 (97 mg) como un sólido. EM miz C31Hs3N40 7S (M+1f calculada 625 ,4, hallada 625 ,5.
Compuesto 131. Se añadió hidróxido de tributilestaño (181 mg, 0,59 mmol) a una solución de compuesto 130 (97 mg, 0,16 mmol) en 1 ,2-dicloroetano de 10 mi. Después de 22 horas a 67 'C, la mezcla se evaporó y se hizo p asar a través de una columna en fase reversa (ACN:(tampón NH4(HC03) 20 mM, pH 7), 5-100 %) dando compuesto 131 (34 mg) como un sólido. EM miz ClOHs1N,07S (M+1f calculada 611,3, hallada 424,3 (rotura del N,O acetal).
Ejemplo 24 -Esquema 21
El Esquema 21 (Fig. 23) muestra la síntesis de compuestos de esta invención usando compuesto 131 como un precursor.
Compuesto 132. Se disolvió compuesto 60 (Esquema 8, 200 mg, 0,57 mmol) en 2 mi de DCM con TFA al 20 % ata. Después de 1 hora los productos volátiles se evaporaron dando compuesto 132 (200 mg) como un sólido amarillo, que se usó sin purificación adicional.
Compuesto 133. Se añadió DIEA (43 ¡JI, 0,2 mmol) a una solución DMF (1 mi) de compuesto 131 (30 mg, 0,049 mmol) y HATU (22,3 mg, 0,059 mmol) a -43 'C . Después de 1 °min se añadió compuesto 132 (15 mg, 0,06 mmol). La mezcla se elevó a TA. La mezcla final se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:(tampón 20 mM NH4(HC03) 20 mM, pH 7), 5-100 %) dando compuesto 133 (20 mg) como un polvo blanco. EM miz C44Hn NsOaS (M+1f calculada 843,5, hallada 843,5. El Compuesto 133 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (III-u).
Compuesto 134. Se disolvió el compuesto 133 (2 mg, 2,4 ¡Jmol) en 0,5 mi de metanol y el pH de la solución se ajustó a 1 con HCI 1 M. Después de agitar durante toda una noche, los productos volátiles se evaporaron yel residuo se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:(tampón NH4(HC03) 20 mM, pH 7), 5-100 %) dando compuesto 134 (0,7 mg) como un polvo blanco. EM mlzC4oH6sNe0 7S (M+1 f calculada 773,5, hallada 773,5. El Compuesto 134 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (1I1-v).
Compuesto 135. Se disolvió el compuesto 133 (2 mg, 2,4 ¡Jmol) en 0,5 mi de n-propanol y el pH de la solución se ajustó a 1 con HCI1 M. Después de agitar durante toda una noche, los productos volátiles se evaporaron y el residuo se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN :(tampón NH4(HC03) 20 mM, pH 7), 5-100 %) dando compuesto 135 (0,4 mg) como un polvo blanco. EM miz C4zH69Ne0 7S (M+1)' calculada 802,5, hallada 801 ,5. El compuesto 135 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (1I1-w).
Ejemplo 25 -Esquema 22
El Esquema 22 (Fig. 24) muestra un procedimiento para fabricar compuesto 142, útiles como un intermedio para fabricar compuestos de esta invención.
Compuesto 136. Se añadió NaOH (800 ul, 10 M, 8 mmol) a una solución de 20 mi de THF y MeOH (1:1) con compuesto 59 de Esquema 8 (1 ,65 g, 4,37 mmol). Después de agitar durante toda una noche el pH de la solución se ajustó a 1 con HCI3 N a 5 'C . Después de evaporaci ón de los disolventes, se añadieron 200 mi de EtOAc. Después de separación, la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2S04 anhidro y se evaporó el EtOAc. El residuo se
hizo pasar a través de una columna (MeOH:DCM; 0-20 %) dando compuesto 136 (1,2 mg) como un aceite. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) O 8,21-8,12 (m, 2H), 7,41-7,32 (m, 2H), 6,62 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,82-4,57 (m, 2H), 3,15-3,02 (m, 1H),2,90(dd,J= 13,3, 7,2 Hz, 1H), 1,71 (d,J= 1,2 Hz, 3H), 1,41 (s,9H).
Compuesto 137. Se añadió DMF-di-t-butilacetal (1 mi, 4 mmol) a una solución en 6 mi de tolueno de compuesto 136 (128 mg, 0,36 mmol) a 133 'C . Después de 10 minutos las mezcla de reacción se enfrió y el disolvente se evaporó. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (Hexano:EtOAc, 0-30 %) dando compuesto 137 (133 mg) como un aceite. RMN 'H (400 MHz, CDCI3) O 8,19-8,10 (m, 2H), 7,39-7,30 (m, 2H), 6,39 (dd, J = 9,1, 1,5 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 39,1 Hz, 2H), 3,03 (dd, J= 13,2, 6,2 Hz, 1 H), 2,90 (dd, J = 13,3, 7,0 Hz, 1 H), 1,67 (d, J = 1,5 Hz, 3H), 1,47 (s, 9H), 1,39 (s, 9H).
Compuesto 122. Se añadieron compuesto 137 (540 mg, 1,22 mmol), Pd/C (136 mg, 10 %) YHCI 3 N (0,3 mi) a una mezcla de DCM y MeOH (30 ml:5 mi). El matraz se cargó con H2 usando un balón. Después de agitar durante toda una noche a TA, la mezcla se filtró y se concentró dando compuesto 122 (550 mg) como un semisÓlido. EM mIz C2,H3SNZ04 (M+1f calculada 379,3, hallada 223.
Compuesto 138. Se mezclaron compuesto 136 (100 mg, 0,28 mmol) y PdfC (20 mg, 10 %) en mezcla de 5 mi de MeOH y DCM (v:v 1:1) en un balón de hidrógeno a TA. Después de agitar durante toda una noche la mezcla se filtró y los disolventes se evaporaron a vacio dando compuesto 136 (95 mg) como aceite, que se usó para la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. EM mIz C17HuN204 (M+1 f calculada 323,2, hallada 223.
Compuesto 139. Se mezclaron compuesto 136 (10 mg, 0,03 mmOI), cloruro de terc-bulildimetilsililo rTBDMSCI ,R 4,5 mg, 0,03 mmol) e imidazol (4 mg, 0,06 mmol) en 1 mi de DMF a TA. Se mezclaron citrulina protegida con Fmoc (24 mg,
0.06 mmol), oxalato de N,N'-disuccinimidilo ("DSO," 8 mg, 0,06 mmol) y DIEA (20 ul, 0,12 mmol) en otro 1 mi de DMF a TA. Después de 1 hora se mezclaron las dos soluciones y la mezcla se mantuvo a TA. Después de agitar durante toda una noche, se añadió EtOAc y la solución se lavó con ácido cítrico acuoso al10 % y salmuera. La fase orgánica se secó después con Na2S04 anhidro y se evaporó a vacío. El residuo resultante se hizo pasar a través de una columna (MeOH :DCM; 0-10 %) dando compuesto 139 (7 mg) como un aceite. EM miz C36H4sN50 s (M+1 )' calculada 702, hallada 702.
Compuesto 141. El compuesto 139 (10 mg, 0,014 mmol) se disolvió en 1 mide DMF con piperidina al 5 %. Después de 20 minutos el disolvente se evaporó a vacio y el residuo se mezcló con N-succinimidil-4-maleimidobutirato 140 (5,6 mg, 0,028 mmol) y DIEA (5 ul, 0,028 mmol) en 1 mi de DMF. Después de 10 minutos los disolventes se eliminaron de la mezcla de reacción a vacío y se hicieron pasar a través de una columna (MeOH:DCM, 0-20 "lo) dando compuesto 141 (6 mg) como un sólido. EM miz C3,H45N6Ü9 (M+1f calculada 645, hallada 645.
Compuesto 142. El compuesto 141 (6 mg, 0,01 mmol) se disolvió en 1 mi de DCM con TFA al10 %. Después de 10 min el disolvente se evaporó a vacio dando compuesto 142 (6 mg), usado para la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional.
Ejemplo 26 -Esquema 23
El Esquema 23 (Fig. 25) muestra la elaboración de compuesto 142, hecha por Esquema 22, en un compuesto de esta invención.
Compuesto 145. Se añadió HCI (30 IJmmol) en 150 IJI de MeOH a una solución de compuesto 27 de Esquema 2 (5 mg, 8,3 IJmmol) en 0,7 mi de MeOH a 5 'C. La temperatura se dejó aumentar a TA gradualmente. Después de agitar durante toda una noche la mezcla se evaporó y disolvió en 0,7 de piridina. A esta solución se añadió AC20 (28 IJI, 296 IJmmol) a 5 'C. La temperatura se dejó elevar a TA gradualmente y después de ag itar durante toda una noche se añadieron 50 IJI de H20 . Después de 3 horas los productos volátiles se evaporaron y el residuo resultante se evaporó dando compuesto 145 (4,7 mg) como un semisólido. EM miz CUH45N40 7S (M+1f calculada 569,3, hallada 569.
Compuesto 146. Se añad ieron OlEA (6 1..11, 34 IJmol ) y compuesto 142 (5,5 mg, 8,3IJmol) a solución en 0,5 mi de DMF de compuesto 530 (4,7 mg, 8,3IJmmol) y HATU (3,2 mg, 8,4 lJmol) a 5 ~C. Después de 20 minutos, la mezcla final se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:(tampón NH4(HC03) 20 mM, pH 7), 5-100 %) dando compuesto 146 (20 mg) como un polvo blanco. EM miz CS3H79N'00 13S (M+1)+ calculada 1095,5, hallada 1095,5. El compuesto 146 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (VI-r).
Compuesto 147. OlEA (1 ,4 ul, 8 IJmol) y una gola de solución de NH4CI saturada en una solución en 0,5 mi de DMF de compuesto 146 (2 mg, 1,8 IJmol) y HATU (1 ,6 mg, 4,6 IJmol). Después de 10 minutos, la mezcla se hizo pasar a través de una columna en fase reversa (ACN:(tampón NH4(HC03) 20 mM, pH 7), 5-100 %) dando compuesto 147 (20 mg) como un semisÓlido. EM miz CS3H80N"O lZS (M+l)+ calculada 1094,6, hallada 1094. El Compuesto 147 se representa también anteriormente en el presente documento como estructura (VI-s).
Ejemplo 27 -Diastereómeros de 4-aminotubufenilalanina
El compuesto 122 (Ejemplo 25 anterior) se determinó que es una mezcla de diastereómeros 148a y 148b 3:1 como sigue.
NH, NH,
:? :?
'" '"
BocHN BocHN
",.,
COzt-Bu COzt-Bu
(mezcla 3: 1)
148. 148b
El compuesto 122 (10 mg, 0,026 mmol) se disolvió en una mezcla de 2 mi de TFA y DCM (1:1) a TA. Después de 3 horas los disolventes se evaporaron y el residuo se hizo pasar a través de una columna de fase reversa (ACN:H20; 0-100 % con TFAal 0,1 %) dando una mezcla 3:1 de los compuestos 149a y 149b. El principal isómero en esta mezcla fue la estructura designada 149a comparando el espectro de RMN con la RMN de una muestra auténtica de compuesto 149a hecho de compuesto 150.
(mezcla 3:1) 14gb
NO,
H"
Pd/C
..
HCI"H,N HCI"H,N
151 150 10
Se añadió HNOl concentrado (10 ~I) a una solución en 200 ~I de H2S04 concentrado de tubufenilalanina 150 (Peltier y col. 2006; 6 mg, 0,025 mmol) a 5 'C. Después de 20 minutos la solución se vertió en 2 mi de solución de K2COl al 7 % enfriada. Se añadieron después 10 mi de EtOAc. Después de la separación, se secó la fase orgánica por evaporación y se hizo pasar el residuo a través de una columna de fase reversa (ACN:H20; 0-100 % con TFA al 0,1 %) dando
15 compuesto de nitro 151 (5 mg). RMN l H (400 MHz, C0300) O 8,27-8,21 (m, 2H), 7,56-7,49 (m, 2H), 3,69-3,58 (m, 1 H), 3,07 (d , J= 7,2 Hz, 2H), 2,73-2,61 (m, lH), 2,04-1,91 (m, lH), 1,64 (ddd, J = 14,7, 8,2, 4,9 Hz, l H), 1,20 (d, J= 7,1 Hz, 3H). EM mIz C12H17N204 (M+l)* calculada 253,1, hallada 253.
El compuesto de nitro 151 se convirtió después a compuesto 149a como sigue: se mezcló compuesto de nitro 151 (5
20 mg, 0,01 mmol) con PdfC (10 mg, 10 %) en 5 mi de MeOH a TA. El matraz se cargó con H2 usando un balón. Después de 1 hora la mezcla se filtró y evaporó dando compuesto 149a (4,5 mg), RMN l H (400 MHz, COlOO) O 7,08-7,03 (m, 2H), 6,83-6,79 (m, 2H), 3,51-3,41 (m, lH), 2,84-2,78 (m, 2H), 2,68-2,58 (m, lH), 2,04-1,92 (m, lH), 1,60 (d, J= 7,8 Hz, 1 H), 1,18 (d, J = 7,0, Hz, 3H). EM mIz C12H19N202 (M+l)~ calculada 223,1, hallada 223. Este espectro de RMN fue la base para asignar las estructuras del componente principal de las mezclas 148a/148b y 149a/149b.
25 Se hizo pasar una muestra de compuesto 122 a través de una columna en fase reversa (ACN:H20; 0-100 % con TFA al 0,1 %) y las reacciones con el isómero menor se recogieron y liofilizaron. El producto resultante se trató después con TFA y OC M eliminando el grupo Boc. Después de 1 hora los disolventes se evaporaron dando un producto, que se
designó para ser el 149b, después de comparar su espectro de RMNcon aquel del compuesto 149a. Compuesto 149b:
30 RMN l H (400 MHz, CD30D) 7,36-7,23 (m, 2H), 7,22-7,09 (m, 2H), 3,59-3,40 (m, lH), 3,04-2,84 (m, 2H), 2,61-2,45 (m, 1 H) 2,07-1 ,87 (m, 1 H), 1,73-1,58 (m, lH), 1,21-1,09 (d, J = 7,2 Hz, 3H).
Los compuestos 148a, 148b, 149a, y 149b pueden usarse para preparar compuestos de esta invención que tengan una subunidad 4-aminotubufenilalanina, donde se define la estereoquímica del grupo alfa-metilo, utilizando las aproximaciones sintéticas ejemplificadas anteriormente, cambiando lo que haya que cambiar. Pueden ponerse para uso similar los compuestos 82a y 82b (Ejemplo 17).
Adicionalmente, mientras la presente invención se ha descrito particularmente en términos de ciertas realizaciones preferidas, la invención no está limitada a tales realizaciones preferidas. Por el contrario, el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
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Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (11)
    (11)
    en la que
    nesO 102;
    10 R\ R2 Y R3 son independientemente H, alquilo C,-C, o sin sustituir o sustituido, alquenilo C2-C,O sin sustituir o sustituido, alquinilo Cz-C,o sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2h.20(alquilo Cl-ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2)1_20{alquenilo C2-C,O) sin sustituir o sustituido, (CH2h_zO{alquenilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, (CHz)'.20C{=O){alquilo C,-C,o). (CH2h_zOC(=O)(alquenilo C2-C,O) sin sustituir °sustituido, (CH2)1_20C(=O){alquinilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, C(=O)(alquilo C,-Cl0) sin
    15 sustituir o sustituido, C(=O)(alquenilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, C{=O){alquinilo CZ-ClO) sin sustituir o sustituido, cicloalifátioo sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido;
    R4
    es NH, NH,
    NH'
    ",1
    \: \: \:
    ~
    CO, H 20
    NH
    Ú , (CH2)1 _3CH3 ; y
    J~~I
    \: CO,H 0CO,H
    R5
    es H, alquilo Cl -CS, alquenilo C2-CS, alquinilo Cz-Cs. CO(alquilo C,-Cs), CO(alquenilo Cz-Cs) o CO(alquinilo C2-C5);
    o un éster farmacéutica mente aceptable del mismo, una amida farmacéuticamente aceptable del mismo en el grupo carboxi lo de R4 con el grupo a-amino de un a-aminoácido o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo.
  2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-a) 30
    (U-a)
    en la que R4a es NH
    Ú , , o (CH2lt-3C H3
    \:J~~
    CO,H 0 CO,H 35
  3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-a'):
    (JI-a')
    en la que
    R2
    es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS, CH20 (alquilo Cl-CS), CH20(alquenilo C2-CS), CH¡O(C=O)(alquilo Cl-CS) o CH20C{=O){alquenilo C2-CS): y
    R3 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cl -CS, C{=O)alquilo Cl -Cs o C{=O)alquenilo Cl -CS.
    10 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-b): NH,
    (II-b)
    Co,H
  4. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-b'): NH,
    (I1-b')
    CO,H
    15 enlaque R2
    es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cl -CS, CHlO{alquilo Cl-CS), CH20(alquenilo C2-CS) , CHlO(C=O)(alquilo Cl-Cs) o CH20C(=O)(alquenilo C2-CS); y
    R3 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cr Cs, C{=O)alquilo Cl-CS o C{=O)alquenilo C2-CS.
  5. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen una estructura de acuerdo con las fórmulas (IU-a), III-b), (III-c), (III-d), (III-e), (III-f), (III-g), (III-h), (III-i), (III-j), (III-k), (111-1), (l1I-m), (l1I-n), (III-o), (III-p), (III-q), (III-r), (III-s), (l1I-t), (l1I-u), (III-v), (IIJ-w) o (III-y).
    25 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-c) NH,
    (II-e)
    l3 l4 IS
    en la que Res Me, n-Pr, CH20Me o CHzOC(=O)CHzCH(Me)2; Res Me o C(=O)Me; y Res H o alquilo Cl-C~.
  6. 8. Una molécula enlazadora de compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (V-b)
    ft¡ln O Y c:¡,R3 O ~~
    (V-b)
    't;l:"'y~".~~~N,AN'R"'-(X"JaC(XZ)b-Ny-L
    J
    R' O R' R' 5 H O
    5 en la que
    n es O, 1 02: R', R2 YR3 son independientemente H, alquilo C,-ClO sin sustituir o sustituido, alquenilo Cr C,o sin sustituir o sustituido, alquinilo C2-C,O sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o
    10 sustituido, (CH2h·20(alquilo C,-C,o) sin sustituir o sustituido, (CH2)'_20 (alquenilo Cr ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2),_20 {alquinilo Cr Clo) sin sustituir o sustituido, (CH2h.20C{=O){alquilo Cl-C,O), (CH2h_20C{=O){alquenilo C2-C,O) sin sustituir o sustituido, (CH2)'_20C(=O)(alquinilo C2-C,O) sin sustituir o sustituido, C{=O){alquilo C,-Clo) sin sustituir o sustituido, C{=O){alquenilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, C{=O){alquinilo Cr ClO) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o
    15 sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido: R4, es
    H H
    NH,
    N-¡ N-¡
    \
    C02R'2 CO-!
    NH,
    ~-¡ NH'
    c7'1 ", 1
    \ ~.
    '"
    \
    \ ~
    CO-! Co,R" CO-!
    NH
    Ú , , O
    J~~I,
    \ CO,-¡
    (CH2)1_3CH3
    0co,-¡
    en las que R,2 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS o alquinilo C2-CS: y RS es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS, alquinilo C2-CS, CO(alquilo C,-Cs), CO(alquinilo C2-CS) o CO(alquinilo
    C2-eS);;
    XO y XZ son grupos espaciadores; 25 C es un grupo escindible; y a y b son independientemente Oo 1;
    en donde el grupo R~' está unido mediante un grupo carboxilo o un grupo amina de los mismo al grupo x D en el caso de que a sea 1 o al grupo e en el caso de que a sea O.
  7. 9. La molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 que tiene una estructura representada por 5 la fónnula (V-e):
    (V-e)
    en la que R2, R3Y R4, son como se han definido en la reivindicación 8, 10 cada AA es independientemente un aminoácido natural y XZ es CH2CH2NHC(=O)(CH2)2-5 o C(=O)(CH2n.5
  8. 10. La molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con la reivindicación 9 que tiene una estructura representada por la fónnula (V-d):
    Íl O Y ~_"R" O
    (V-d)
    '-.~"1r~"~~~"" lrN
    I O ", R" sJl H "
    en la que R13 es Me, n-Pr, CH20Me o CH20C(=O)CH2CH{Me)2; R'4 es Me o C(=O)Me; Res H o alquilo C,-Cs; R'6 es {CH2).¡NH2 o (CH2)3NHC(=O)NH2; R17 es C(Meh o Me; y p es Oo 1. 20
  9. 11. La molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 que tiene una estructura representada por una de las fónnulas (VI-a) a (VI-t)
    (VI-a)
    (] H O Y Ij>Jl O
    '-fyN,.,(l~~N~)lN
    J
    O ""''1 I 5 H
    (VI-b) H (~H,).NH, N ' O r('NH O
    O A ,~
    (] H Y Ij>~ O
    O O (CH2J.-N,y-h
    '-r'yN",(l~~NJN O '
    O H
    ",0'1 I 5J O,H
    (VI-c)
    (] H O Y r:¡/ O
    '-fyN".(l~~N~)lN
    O J 5 H
    ""''1 J co.H
    (VI-d) H (~H,J.NH2 N '
    <Y I r('NH O
    HO O/ O"" OA
    I Nl. " I N Co,H
    O ~,.,. S IJ H O •
    O
    I '
    (VI-e)
    \10
    H O"" O Phe 0
    O
    N'" N, N H O O Y
    (V1-f) H <<:H,),NH,
    N .
    O [f'NH O
    í) ~,_ O Y ~~ O ;C~ OOA<CH'I._N>
    'y'y .(N~N¡'-)(N •
    CO,H O
    I O ,,-_ I 5J H
    (VI·i) H, N O
    /'
    H O O O H O H HN O 'O .. , st HO-HO A
    ~ ~~ O
    62
    (VI-k)
    H o o N o~~.......CO,H o
  10. 0. N"(NM ".NrJl.~ O'o/'(CH,),-N.IIr
    "y'[r 'I SJ O ~ ~ O I -r,
    I O "~,o VN~NH O
    ,
    H (CH,).NH,
    (VI-m)
    CO,H
    (VI-o)
    Co,H (VI-p)
    N'" N' •.~ O O
    QyH °M:r
    IN '
    O.,. I ", N
    \' ,SIJ H
    C02H
    (V1·q)
    CONH2 (VI-;') H
    H2N N
    r'l .
    ,v ~~Jl ~
    '" I 1('~ (CH2h-Nn-3
    O
    OH
    5 O
    (VI-s)
    NH~
    o
    y
    (VI-t)
    í) ~~OMAC o
    "y ''y'' y
    I N · :.-'
    ° ,,,O ~ S!. ~ 5
    12 La molée I acuerdo a relvlndlcaclon 8 presentada •
    u a enlazad con I
    por la fórmula (VI-o) ora de compuesto de
    (VI-o) qoe I,eoeooa e,'rue'"a ,e
    YuH °MJl
    N"I N..~N N O
    O ".,. l. ;y~
    CO,H
    O~
  11. 13. La molécula enlaza e acuerdo I que llene una es! ructura representada
    -
    t) 000 a ,ei,iodicaeióo 8 . .
    por la fórmula (VI-t) dora de compuesto d (VI O "" ~ ¡CH2hNH-1:-NH, . ¡('NH °
    O 0X1r(CH2).-N?
    O
    Co,H
  12. 14.
    Un conjugado que comprende la molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 conjugada a un ligando mediante el producto de adición nucleófila de un grupo sulfhidrilo del ligando y el grupo maleimida de la molécula enlazadora de compuesto, en donde el ligando se selecciona entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y miméticos de anticuerpo.
  13. 15.
    El conjugado de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la molécula enlazadora de compuesto tiene una
    estructura representada por la siguiente fórmula: O
    "
    (CH,hNH-C-NH,
    H -O Ny-'NH
    (Í H Oy<¡>Ac O
    '-'f'yN"r~~N,)C~ 1 O "" '1 ~ sJl Co,H Ab
    10 en la que Ab representa el anticuerpo anti-mesotelina monoclonal humano 6A4 que tiene la secuencia de la región variable de cadena pesada:
    QVHL VESGGGVVQPGRSLRLSCV ASGITFRIYGMHWVRQAPGKGLEWV A VL WY
    DGSHEYYADSVKGRFrISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAIYY CARDGDYYDSGS
    PLDYWGQGTL VTVSS
    15 Y la secuencia de la región variable de cadena ligera:
    EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT
    GIPARFSC;SGSGTDFTL TISSLEPEDF A VYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK,
  14. 16. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un conjugado de acuerdo con la 20 reivindicación 14 o la reivindicación 15, para su uso en el tratamiento de un cáncer.
  15. 17. Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula (VIII-a)
    NO,
    (VIn-a)
    R'HN
    CO,R'
    25 en la que R1 es H o un grupo protector de amina y R8 es H, alquilo Cl-CID, alquenilo Cr Clo, alquinilo C2-C lO, arito, cicloalifático, alquilcicloalifático, arilalquilo o alquilarilo.
  16. 18. Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula (VIlI-b)
    NHR'
    (VIII-b)
    C02R"
    30 en la que R9 y R10 son independientemente H o un grupo protector de am ina y R11 es H, alquilo Cl-C1D, alquenilo C2-C lO, alquinilo Cr ClO, arilo, cicloalifático, alquilcicloalifático, arilalquilo o alquilarilo.
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