MXPA06000798A - Anticuerpos de rg1 y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos de rg1 y usos de los mismos.

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Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos, y fragmentos de anticuerpo de union a antigeno, dirigidos contra un polipeptido de RGI. La invencion se refiere adicionalmente a metodos para utilizar los anticuerpos, y fragmentos de anticuerpo, para aplicaciones de diagnostico y terapeuticos.

Description

ANTICUERPOS DE RG1 Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención Esta invención se refiere a nuevos anticuerpos dirigidos contra un polipéptido, el RG1, que se expresa de manera preferencial en próstata y otras células de tumor. En particular, la invención se refiere al uso de estos anticuerpos para el tratamiento y detección de cáncer y metástasis de cáncer.
Antecedentes de la Invención El cáncer de próstata es una enfermedad de recurrencia frecuente en el hombre, ya que se encuentra en aproximadamente un tercio- de los hombres de más de 45 años de edad. Existe evidencia tanto para causas genéticas como ambientales, con la mayoría de los casos que son probablemente el resultado de una combinación de factores. Los estudios de cáncer familiar han sugerido que la predisposición genética juega un papel de aproximadamente 5-10% de todos los canceres de próstata, y en aproximadamente 45% de los casos en hombres más jóvenes de 55. Existe evidencia que el cáncer de próstata se desarrolla como una enfermedad de varios pasos, con una de las lesiones precursoras que es la neoplasia intraepitelial prostática (PIN, por sus siglas en inglés) . Las etapas tempranas de la enfermedad son dependientes de andrógeno, en tanto que las etapas tardías son independientes de las hormonas. Un trastorno proliferativo de la próstata conocido como hiperplasia prostética benigna frecuentemente se detecta de forma clínica pero probablemente no es una etapa en el desarrollo del cáncer. Sin embargo, se asocia frecuentemente con cáncer de próstata. Los canceres en la próstata frecuentemente son multifocales , en general que crecen lentamente y son heterogéneos. Los canceres de etapas tardías se mestatizan frecuentemente a los nodulos linfáticos y al hueso. Usualmente se diagnostica cáncer de próstata por examen físico y por niveles séricos de antígeno específico de próstata (PSA, por sus siglas en inglés) . La prostatectomía radical es el tratamiento de elección para la enfermedad localizada. Actualmente se trata la enfermedad metastática avanzada por ablación con andrógenos inducida por orquiectomía o tratamiento con GnRH (hormona de liberación de gonadotropina) , y por terapia anti-andrógena . Sin embargo, la enfermedad avanzada casi llega a ser invariablemente resistente a hormonas y no hay cura para la enfermedad progresiva. Además, hay serios efectos secundarios asociados tanto con la prostatectomía radical como con la terapia de ablación por andrógenos. Estos incluyen un alto riesgo de incontinencia e impotencia asociada con la prostatectomía radical y fracturas de huesos y osteoporosis asociadas con terapia de ablación con andrógenos . Por lo tanto, existe una necesidad considerable de nuevos planteamientos terapéuticos tanto para el cáncer de próstata de etapa temprana como de etapa tardía. También existe una necesidad significativa de nuevos agentes de diagnostico, puesto que esta influencia de forma significativa las opciones de tratamiento. Por ejemplo, si la enfermedad ha progresado más allá de la próstata y se ha metastitizado a los nodulos linfáticos, la prostatectomía radical no se emprende puesto que no tiene efecto en el progreso, pero puede tener efectos secundarios indeseados, significativos. Un agente que puede detectar la metástasis, in vivo, tendrá valor considerable. Se han demostrado cambios en la expresión de proteínas especificas en cáncer de próstata que incluyen expresión anormal de p53 en el cáncer de próstata de etapa tardía, niveles reducidos de receptores de TGF-ß, niveles reducidos de E-cadherina, C-Cam (una molécula de adhesión celular) y varias integrinas . La expresión de el encogen bcl-2 se eleva sorprendentemente en tumores independientes de andrógeno de etapa tardía, y es relativamente pobre la prognosis para pacientes con expresión de bcl-2 a niveles elevados. En tanto que los cambios mencionados anteriormente en la expresión génica están bien documentados, no se han identificado cambios en la expresión que se ha demostrado que sean causantes de la enfermedad. Por lo tanto, seria útil identificar nuevas proteínas cuya expresión este enlazada a la presencia o desarrollo de tumores de próstata que puedan servir como objetivos moleculares para composiciones dirigidas a diagnosis y terapia de cáncer de próstata. El polipéptido RG1 (ver Patente de los Estados Unidos No. 5,871,969) es un homologo de la familia de Mindinas/F-espondinas , que son proteínas de matriz extracelular . Se demostró que el polipéptido RG1 se expresa altamente en tejido de próstata (ver W098/45442), y debe ser un objetivo útil para diagnosis y terapia de cáncer de próstata, así como en otros canceres donde se expresan.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que son altamente efectivos para polipéptidos RG1, y que se pueden emplear métodos para detección de la expresión de RG1, que se asocia con estados de enfermedad tal como cáncer de la próstata, riñon, colon u ovarios, y en el tratamiento de estos estados de enfermedad.
Para estos fines, es un objeto de la invención proporciona anticuerpos aislados, o fragmentos de anticuerpo de unión a antigeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen de manera específica a un epítope presente en un polipéptido RG1 (SEQ. ID. No.: 2). Particularmente preferidos son los anticuerpos humanos que se unen al epítope del polipéptido RG1 con una constante disociación (KD) que es menor que o igual a 1 µ?, de manera más preferente menor que o igual a 100 nM, y de manera más preferente menor que o igual a 10 nM. De acuerdo con modalidades preferidas adicionales de la invención, se proporcionan anticuerpos aislados y fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No. : 26 o SEQ. ID. No. : 29. También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ. ID. No.: 27, SEQ. ID. No.: 28, SEQ . ID. No.: 30 o SEQ. ID. No.: 30. Una modalidad particularmente preferida es un anticuerpo humano, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. : 26 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 27 o SEQ. ID. No.: 28. Una segunda modalidad particularmente preferida es un anticuerpo humano, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 29 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.:' 30 o SEQ. ID. No.: 31. En un aspecto adicional de la invención, también se contemplan regiones variables de cadena ligera y regiones variables de cadena pesada con secuencias de aminoácidos que tienen 80% de identidad de secuencia a las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente. También se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos descritos anteriormente. Se prefiere un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ. ID. No.: 20 o SEQ. ID. No.: 23. También se prefiere un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ. ID. No.: 21, SEQ. ID. No.: 22, SEQ. ID. No.: 24 o SEQ. ID. No.: 25. De acuerdo con ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, los anticuerpos se conjugan a un marcador detectable, para el uso como un agente de diagnostico para la administración a células in vitro, a células ex vivo y a células in vivo, o a un organismo multicelular. Particularmente preferidos serán un anticuerpo conjugado a una radiomarca, una enzima, un cromóforo o un fluorescedor . Los métodos particularmente preferidos de detección son inmunoescintigrafia y tomografía de emisión de positrones, en los cuales el anticuerpo se conjugará a un radioisótopo tal como ?11?? o S9mTc, para inmunoescintigrafía, o a 43Sc, 4Sc, 52Fe, 55Co, 68Ga, 6 Cu, 86Y o 9 mTc, para tomografía de posición de positrones. En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan anticuerpos que se conjugan a un agente terapéutico, por ejemplo, resina o un radioisótopo, para, administración a células in vi tro, a células ex vivo y a células in vivo, y a un organismo multicelular. Preferidos a este respecto son agentes terapéuticos que son citotóxicos. Particularmente preferido para un agente terapéutico serán anticuerpos conjugados a un radioisótopo, tal como 90Y y 177Lu. En ciertas modalidades preferidas a este respecto es la administración de estos anticuerpos conjugados a un paciente humano para tratamiento de un estado de enfermedad caracterizado por expresión de RG1, tal como cáncer de próstata, y en particular, cáncer de próstata, metastático avanzado. En un aspecto adicional de la invención, la conjugación de un anticuerpo RG1, o un fragmento de unión a antigeno del mismo, a un marcador detectable o agente citotóxico se logra a través del uso de un guelador seleccionado del grupo que consiste de p-SCN-Bencil-DTPA y derivados del mismo, ácido 1 , 4 , 7 , 10-tetraazaciclododecano-?,?' ,?' ' ,?' ' ' -tetracético, (DOTA) y derivados del mismo, y ácido 1,4, 7-triazaciclononano-N,N' ,?' ' -triacético (NOTA) y derivados del mismo. En un aspecto adicional de la invención, es un método para tratamiento de un estado de enfermedad asociado con la expresión de un polipéptido RG1, tal como próstata, qué usa los inmunoconjugados de la presente invención. En un aspecto adicional de la invención, es un método para detección de un estado de enfermedad asociado con la expresión de un polipéptido RG1, tal como cáncer de próstata, que usa los inmunoconjugados de la presente invención . En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan péptidos y anticuerpos anti-idiotípicos que se pueden usar para estimular una respuesta inmunitaria. Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción. Sin embargo, se debe entender que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, en tanto que indican modalidades preferidas de la invención, se dan a manera de ilustración únicamente. Llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la lectura de la siguiente descripción y de la lectura de otras partes de la presente invención los varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención descrita.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Biodistribución de anticuerpos RG1 marcadas con a?1??. Tres anticuerpos RG1 (A, B y C) , un anticuerpo de control hlgGi no específico, y ProstascintMR se radiomarcaron con 111In. Se administraron anticuerpos radiomarcados (actividad específica: 0.3 mCI/mg) I.v. en ratones desnudos que tienen tumor (LNCaP) . Doce animales por grupo (3 animales por punto de tiempo) se sacrificaron a las 6, 24, 120 y 150 hr p.i. y se monitorizó la acumulación en el tumor, sangre e hígado (ver Ejemplo 11) · Figura 2: Efecto anti-tumor de anticuerpos RG1 marcados con 90Y : Se inyectaron animales que tienen tumor LNCaP con anticuerpos marcados con 90Y (anticuerpos B y C anti-RGl o IgGi no especifica, actividad específica, 0.5 mCI/mg) . Se administró una dosis individual de anticuerpo RG1 marcado con 90Y de 125 //Ci (B, C) i.p. Los ratones se sacrificaron en el día 32 y los tumores se escindieron y pesaron. (Ver Ejemplo 12) . Figura 3 : Secuencia de aminoácidos de las regiones de cadena variable del anticuerpo B monoclonal humano, que incluye una región de cadena pesada, variable, mutada VL (SEQ. ID. No.: 26), VH (SEQ. ID. No.: 27), VH_2m (SEQ. ID. No . : 28) . Figura 4 : Secuencia de aminoácidos de las regiones de cadena variable de anticuerpo monoclonal humano C, que incluyen región de cadena pesada, variable, mutada. VL (SEQ . ID. No.: 29), VH (SEQ. ID. No.: 30), VH_3m (SEQ . ID. No. : 31) .
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Como se usa en la especificación, ejemplos y reivindicaciones anexas, a menos que se especifique lo contrario, los siguientes términos tienen el significado indicado . "rgl" se refiere al polinucleótido que tiene la secuencia expuesta en SEQ. ID. No. : 1 y polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de RG1 expuesta en SEQ. ID. No.: 2, y a polinucleótidos que codifican para variantes, derivados y fragmentos de RG1, y fragmentos de las variantes y derivados. gl también se refiere a estos polinucleótidos compuestos de ARN así como a polinucleótidos que son el complemento de polinucleótidos que codifican para la secuencia de polipéptidos expuestos en SEQ. ID. No.: 2. "RG1" se refiere al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ. ID. No.: 2, variantes y derivados del mismo, y fragmentos de SEQ. ID. No.: 2, variantes y derivados de los mismos. Los términos "variantes", "fragmento" y "derivado", cuando se refieren a polipéptido de SEQ. ID. No.: 2 significan un polipéptido que retiene esencialmente la misma actividad biológica y/o inmunológica como el polipéptido de SEQ. ID. No.: 2. "Actividad biológica" se refiere a las funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas del polipéptido RG1 que se presenta de forma natural . "Actividad inmunológica" se refiere a (1) la capacidad de RG1 natural, recombinante o sintético, o cualquier fragmento del mismo, para inducir una respuesta inmunitaria específica en animales o en células apropiadas y para unirse con anticuerpos específicos, o (2) la capacidad de los anticuerpos de RG1 para unirse a RG1 in vivo y para activar una respuesta inmunitaria, celular, mejorada a tej ido o tumor que expresa RG1. "RG1 que se presenta de forma natural" se refiere a RGl producido por células humanas que no se han manejado genéticamente y contemplan en forma especifica varias formas de RGl que surgen de las modificaciones pos-transduccionales del polipéptido que incluyen de manera enunciativa y sin limitación acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, acilación y escisión. "RGl nativo" , o "nRGl" se refiere a RGl que está en su conformación nativa . "Polinucleótidos (s) " se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido , que pueden ser AR o ADN o modificado o ARN o ADN modificado. De esta manera, por ejemplo, los polinucleótidos como se usah en la presente se refiere a, entre otros, ADN de hebra individual y doble, ADN que es una mezcla de regiones libre individual y doble, ARN de hebra individual y doble, y ARN que es mezcla de regiones de hebra individual y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra individual o de manera más típica de doble hebra o una mezcla de regiones de hebra individual y doble. Además, el polinucleótido como se usa en la presente se refiere a regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las hebras en estas regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente comprenden solo una región "de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región triple-helicoidal frecuentemente es un oligonucleótido . Como se usa en la presente, el término ' "polinucleótido" se refiere a ADN o ARN como se escribe anteriormente que contiene una o más bases modificadas. De esta manera, ADN o ARN con estructuras modificadas para estabilidad o por otras razones son "polinucleotidos" como se propone en la presente este término. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tal como inosina, o bases modificadas, tal como bases marcadas con tritio, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleotidos como se usa en la presente el término. Se apreciará que se ha hecho una gran variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por aquellos expertos en la técnica.. El término "polinucleótido" como se emplea en la presente abarca estas formas química, enzimática o metabolitamenté modificadas de los polinucleotidos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas, ínter alia . "oligonucleótido (s) " se refiere a polinucleotidos relativamente cortos. Frecuentemente el término se refiere a desoxirribonucleótidos de hebra individual, pero puede referirse también a ribonucleótidos de hebra individual o doble, híbrido de ARNrADN y ADN de doble hebra, entre otros. Los oligonucleótidos, tal como oligonucleótidos de sonda de ADN de hebra individual, frecuentemente se sintetizan por métodos químicos, tal como aquellos implementados en sintetizadores automatizados de oligonucleótidos. Sin embargo, se pueden elaborar oligonucleótidos por una variedad de otros métodos, incluyendo técnicas in vi tro mediadas por ADN recombinante y por la expresión de ADN en células y organismos. "Oligonucleótidos" u "oligómeros" o "fragmento" , "porción" o "segmento" de polinucleótidos se refiere a una secuencia de polinucleótido de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y tanto como aproximadamente 60 nucleótidos, de manera preferente de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, y de manera más preferente de aproximadamente 20-25 nucleótidos. "Polipéptidos" , como se usa en la presente, incluye todos los polipéptidos como se describe más adelante. La estructura básica de los polipéptidos es bien conocida y se ha descrito en innumerables libros de texto y otras publicaciones en la técnica. En este contexto, el término se usa en la presente para referirse a cualquier polipéptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí en una cadena lineal en enlaces peptídicos. Como se usa en la presente, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se refieren comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptido y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas largas, que en general se refieren en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos . Se apreciará que los polipéptidos contienen frecuentemente aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos referidos comúnmente como los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural, y que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, se pueden modificar en un polipéptido dado, ya sea por procesos naturales tal como glicosilación y otras modificaciones pos-transduccionales, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Las modificaciones comunes incluyen glicosilación, unión lipídica, sulfación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, y estos y otros se describen en muchos textos básicos, tal como por ejemplo, I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York, 1993. Muchas revisiones detalladas están disponibles a este tema, por ejemplo, éstas se proporcionan por Wold, F., en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C., Johnson, Ed. , Academia Press, New Yor, p . 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol . 1982: 626-646, 1990 y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann N.Y. Acad. Sci . 663 : 48-62, 1992. Se apreciará, como es bien conocido, y como se señala anteriormente, que los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, en general como resultado de eventos pos-transducción, incluyendo eventos de procesamiento natural y eventos ocasionados por manipulación humana que no se presentan de forma natural. Los polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados se pueden sintetizar por procesos naturales no transduccionales y también por métodos completamente sintéticos. Las modificaciones pueden presentarse donde quiera en un polipéptido, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los términos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente, es común en polipéptidos sintéticos y que se presentan de forma natural y estas modificaciones pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención también. Por ejemplo, el residuo amino término y los polipéptidos elaborados en E. coli, antes del procesamiento proteo lítico, casi invariablemente será N-formilmetionin . Las modificaciones que se presentan en un polipéptido frecuentemente se dan en una función de cómo se hace. Para polipéptidos hechos al expresar un gen clonado en un hospedador, por ejemplo, la naturaleza y grado de la modificación en gran parte se determinará por la capacidad de modificación pos-transduccional de la célula hospedadora y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como es bien conocido, la glicosilacion frecuentemente no se presenta en hospedadores bacterianos tal como E. coli . Por consiguiente, cuando se desea glicosilacion, se debe expresar un polipéptido en un hospedador de glicosilacion, en general una célula eucariótica. Las células de insecto f ecuentemente llevan a cabo las mismas glicosilaciones pos-transduccionales como células de mamífero y por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para expresar de forma eficiente proteínas de mamífero que tienen patrones nativos de glicosilacion, ínter alia. Consideraciones similares aplican a otras modificaciones . En general, como se usa en la presente, el término polipéptido abarca todas estas modificaciones, particularmente aquellas que están presentes en polipéptidos sintetizados al expresar un polinucleótido en una célula hospedadora. "Derivados" se refiere a polinucleotidos o polipéptidos derivados de rgl, RG1 que se presentan de forma natural o de anticuerpos que se unen a RG1 , respectivamente, por modificaciones químicas tal como ubiquitinación, marcación (por ejemplo, radionúclidos , varias modificaciones enzimáticas, pegilación (derivatización con polietilenglicol ) o por inserción o substitución de aminoácidos tal como ornitina (o substitución de los nucleótidos que codifican para este aminoácido) , que no se presentan normalmente en proteínas humanas . "Polinucleótido que codifica para un polipéptido" como se .usa en la presente abarca polinucleotidos que incluyen una secuencia que codifica para un polipéptido de la presente invención, particularmente el polipéptido RG1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ. ID. No.: 2. El término abarca polinucleotidos que incluyen una región continua individual o regiones discontinuas que codifican para el polipéptido (por ejemplo, interrumpido por intrones) junto con regiones adicionales. Un "fragmento", "porción" o "segmento" de polipéptido es un tramo de residuos de aminoácidos de al menos -aproximadamente 5 aminoácidos, frecuentemente menos de aproximadamente 7 aminoácidos, típicamente al menos aproximadamente 9 a 13 aminoácidos, y en varias modalidades, al menos aproximadamente 17 o más aminoácidos. "Fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma como parte, pero no toda, la secuencia de aminoácidos de los polipéptido RG1 mencionados anteriormente, o anticuerpos a RG1 , y variantes o derivados de los mismos. "Supresión" se define como un cambio en ya sea la secuencia de aminoácidos o de polinucleótido en la cual están ausentes uno o más polinucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente. "Inserción" o "adición" es aquel cambio en una secuencia de polinucleótido o aminoácidos que ha dado por resultado la adición de uno o más polinucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, en comparación a la secuencia de polinucleótidos o aminoácidos que se presentan de forma natural . "Sustitución" resulta del reemplazo de uno o más polinucleótidos o aminoácidos por diferentes polinucleótidos o aminoácidos, respectivamente. "Variante (s) " de polinucleótidos o polipéptidos , como el término se usa en la presente, se describen más adelante y en otros sitios de la presente descripción en mayor detalle. Una variante de un polinucleótido es un polinucleotido que difiere en la secuencia de polinucleótidos de otro polinucleotido de referencia. En general, las diferencias se limitan de modo que las secuencias de polinucleótidos de la referencia y la variante están cercanamente traslapadas de manera similar y en muchas regiones son idénticas. Pueden ser poco notorios los cambios en la secuencia de polinucleótidos de la variante. Es decir, no pueden alterar los aminoácidos codificados por el polinucleotido. Donde las alteraciones se limiten a cambios poco notorios de este tipo, una variante codificará para un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos como la referencia. También como se señala más adelante, los cambios en la secuencia de polinucleotido de la variante pueden alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleotido de la referencia. Estos cambios de polinucleotido pueden dar por resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza más adelante . Una variante de un polipéptido es un polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. En general, las diferencias' se limitan de modo que las secuencias de la referencia y la -variante están traslapadas cercanamente de manera similar y en muchas regiones son idénticas. Un polipéptido variante y de referencia puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamiento que pueden estar presentes en cualquier combinación. Las variantes recombinantes que codifican para estos mismos polipéptidos o polipéptidos similares se pueden sintetizar o seleccionar al hacer uso de la "redundancia" en el código genético. Varias sustituciones de codones, tal como los cambios poco notorios que producen varios sitios de restricción, se pueden introducir para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. También se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, para cambiar afinidades de unión a ligando, afinidades inter-cadena, o degradación del polipéptido o velocidad de producción. Como se analiza en la presente, variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos, anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan como que se abarcan por la presente invención, con la condición que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 80%, de manera más preferente al menos 85%, 90%, 95% y de manera más preferente 99% de la secuencia original. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que toma a lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato) ; (2) básicos (Usina, arginina, histidina) (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) ,-y (4) polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina) . . Las familias más preferidas son: serina y treonina que son familias alif ticas-hidroxi ; asparagina y glutamina que son una familia que contiene amida, alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptofano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto mayor en la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no comprende un aminoácido dentro de un sitio de estructura. Si un cambio de aminoácido da por resultado péptido funcional se puede tener fácilmente al comparar la actividad específica del derivado de polipéptido con el polipéptido no modificado. Para propósitos de esta solicitud, la invención abarca variantes de los anticuerpos reivindicados que mantienen una afinidad de unión (KD) menor a 1 µ? para un epítope de RGl . Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación" , "identidad de secuencia" , "porcentaje de identidad de secuencia", "identidad sustancial", "similitud", y "homólogos". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o ADNc de longitud completa dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia génica o ADNc completa. En general, una secuencia de referencia es de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y f ecuentemente al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción del polinucleótido completo o secuencia de aminoácidos) que sea similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender adicionalmente una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente al comparar secuencias de dos moléculas con respecto a una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" como se usa en la presente, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones contiguas de nucleótidos o 6 aminoácidos en donde una secuencia de polinucleótido o secuencias de aminoácidos se puede comparar o una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, supresiones, sustituciones, y similares (es decir, separaciones) de 20 por ciento o menos en comparación a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. app'l . Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol . 48:443 (1970) y la búsqueda por método de similitud de Pearson y Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci . (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y FASTA en Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, is.), o los paquetes de programa Geneworks , o MacVector, o por inspección, y se selecciona la mejor alineación (que resulta del más alto porcentaje de homología con respecto a la ventana de comparación) generada por los varios métodos . El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) con respecto a la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base idéntica de ácido nucleico (por ejemplo A, T, C, G, U o I) o residuos se presentan en ambas secuencias para producir el número de posiciones correspondidas, dividiendo el número de posiciones correspondidas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) , y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se usa en la presente denota una característica de una secuencia de polinucleót dos o aminoácidos, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de manera preferente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, de manera más usual al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación a una secuencia de referencia con respecto a una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos) , frecuentemente sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula al comparar la secuencia de referencia a la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones con el 20 por ciento total o menor de la secuencia de referencia con respecto a la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. El término "similitud", como se usa para describir un polipéptido, se determina al comparar la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido o la secuencia de un segundo polipéptido. El término "homologo" , cuando se usa para describir un polinucleótido, indica que dos polinucleótidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean de forma óptima y se comparan, son idénticos, con inserciones o supresiones apropiadas de nucleótidos, en al menos 70% de los nucleótidos, usualmente de aproximadamente 75% a 99%, y de manera más preferente al menos 98 a 99% de los nucleótidos. "Anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo, que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, se dice que se une de forma específica a un antígeno cuando la constante de disociación es menor que o igual a 1 µ?, de manera preferente menor que o igual la 100 n y de manera más preferente menor que o igual a 10 nM. La unión se puede medir por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, un ejemplo que es el uso de un instrumento BIAcoreMR. Los fragmentos de anticuerpo comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de manera preferente la región variable o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Los fragmentos de unión incluyen los fragmentos Fab, Fab' , F(ab' )2 y Fv; día-cuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena individual; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology) , Oxford Uníversity Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual) , Springer Verlag) . Un anticuerpo diferente de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" se entiende que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos . "Epítope" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos consisten usualmente de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Dos anticuerpos se dice que "se unen al mismo epítope" si un anticuerpo muestra que compite con el segundo anticuerpo en un ensayo en unión competitiva, por cualquiera de los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. "Recombinante" o "molécula de ADN recombinante" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que no se presentan de forma natural, o se constituye por la combinación artificial de dos segmentos separados de otro modo de la secuencia. Por "recombinantemente producido" se quiere decir combinación artificial frecuentemente lograda ya sea por un medio de síntesis química, o por la manipulación artificial de segmentos aislados de los polinucleótidos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética. Esta manipulación usualmente se hace para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica para el mismo aminoácido o aminoácido conservador, en tanto que introduce o remueve típicamente un sitio de reconocimiento de secuencia. De manera alternativa, se realiza para unir conjuntamente segmentos de polinucleótidos con funciones deseadas para generar una entidad genética individual que comprende una combinación deseada de funciones no encontradas en las formas naturales comunes. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, secuencias de regulación, secuencias de control, u otras características útiles se pueden incorporar por diseño. "Moléculas de ADN recombinante" incluyen vectores de expresión y clonación. "Recombinante" también puede referirse a un polinucleótido que codifica para un polipéptido y se prepara usando técnicas de ADN recombinante. "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural; es decir, que, si se presenta en la naturaleza, se ha cambiado o removido de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido que se presenta de forma natural o un polipéptido presente de forma natural en un animal vivo en su estado natural no está "aislado" , sino que el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales consistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea en la presente el término.
Por ejemplo, con respecto a los polinucleotidos, el término aislado significa que se separa del cromosoma y célula en la cual se presentan de forma natural. Los polinucleotidos y polipéptidos pueden presentarse en una composición, tal como formulaciones de medios, soluciones para introducción de polinucleotidos o polipéptidos, por ejemplo, de células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones que se presentan de forma natural, y permanecen en la misma polinucleotidos o polipéptidos aislados dentro del significado de ese término como se emplea en la presente . "Sustancialmente puro" y "sustancraímente homogéneo" se usan de forma indistinta y describe el polipéptido RG1 , o fragmentos del mismo, o un segmento de polinucleotido que codifica para el mismo, donde este polipéptido o polinucleótido se separa de los componentes que lo acompañan de forma natural. Un polipéptido RG1 o fragmento del mismo, o segmento de ADN que codifica para el mismo está sustancialmente libre de los componentes asociados de forma natural cuando se separa de los contaminantes nativos que los acompañan en su estado natural. De esta manera, un polipéptido que se puede sintetizar químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula en la cual se origina de forma natural estará sustancialmente libre de sus componentes naturalmente asociados. De manera similar, un polinucleótido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula en la cual se origina de forma natural estará sustancialmente libre de sus componentes asociados de forma natural . "Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento en donde las piezas específicas de ADN se amplifican como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195, emitida el 28 de julio de 1987. En general, la información de secuencias de los extremos del fragmento de polipéptido de interés o más allá necesita estar disponible, tal que se puedan diseñar los cebadores de oligonucleótidos ; estos cebadores apuntarán uno hacia el otro, y serán idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas de la plantilla que se va a amplificar. Los nucleótidos 5 ' -terminales de los dos cebadores coincidirán con los extremos del material amplificado. Se puede usar PCR para amplificar secuencias específicas de ADN del ADN genómico total, ADNc transcrito de ARN celular total, secuencias de plásmído, etc., (ver en general Mullís et al., Coló. Spring Harbor Symp. Quant. Biol . , 51:263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) . "Severidad" se presenta típicamente en un intervalo desde aproximadamente Tm (temperatura de fusión) -5°C (5o por debajo de la Tm de la sonda) ha aproximadamente 20°C hasta 25°C por debajo de Tm. Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, se puede usar hibridación severa para identificar o detectar secuencias idénticas de polinucleotidos o para identificar o detectar secuencias similares o relacionadas de polinucleotidos . Como se usa en' la presente, el término "condiciones severas" significa hibridación que se presentará solo si hay al menos 95% y de manera preferente al menos 97% de identidad entre las secuencias . "Hibridación" como se usa en la presente, debe incluir "cualquier proceso por el cual una hebra de polinucleótido se una con una hebra complementaria a través del apareamiento de bases" (Coombs, J. , Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y. , 1994) . "Dosis terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad de polipéptido o sus anticuerpos, antagonistas, o inhibidores, que incluyen moléculas antisentido y ribozimas, que mejoran los síntomas o condiciones de un estado de enfermedad. Una dosis se considera una dosis terapéuticamente efectiva en el tratamiento de cáncer o su metástasis cuando se retrasa o detiene el crecimiento de tumor o el crecimiento metastático, o el tumor o metástasis se encuentra que se encoge de tamaño, para conducir a una extensión en el intervalo de vida del sujeto. Una dosis también se considera terapéuticamente efectiva si conduce a una mejora en la calidad total de vida del paciente, es decir, alivio del dolor. La eficacia terapéutica y toxicidad de estos compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos normales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal a 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación ED50/LDso. "Que trata" o "tratamiento" como se usa en la presente cubre el tratamiento de un estado de enfermedad en un paciente humano, estado de enfermedad que incluye estados de enfermedad que se caracterizan por un nivel incrementado de RG1, tal como cáncer de próstata o cáncer de próstata metastático avanzado.
Descripción Detallada de la Invención Anticuerpos La presente invención se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, y variantes de los anticuerpos y fragmentos, que se unen de manera específica a un polipéptido de RG1, particularmente al polipéptido RG1 que tiene la sustancia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 2. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales . Más preferidos son los anticuerpos monoclonales. O más preferidos son los anticuerpos quiméricos o humanizados, y aún más preferidos son los anticuerpos humanos. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígenos, y variantes de los anticuerpos y fragmentos, contemplados en la presente invención se unirán a un epítope del polipéptido RG1 con una constante de disociación (KD) menor o igual a 1 µ?. Más preferidos son anticuerpos que se unen con una KD menor que o igual a 100 nM. Más preferidos son los anticuerpos que se unen con una KD menor que o igual a 10 nM. También se contemplan anticuerpos que reconocen y se unen al mismo epitope como el epitope unido por los anticuerpos descritos más adelante, y que se pueden determinar a través de estudios de unión competitiva, usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos . en la técnica. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, y variantes de los anticuerpos y fragmentos, de la invención están comprendidos de una región variable de cadena ligera y una región de cadena pesada. Entre las modalidades preferidas de la invención a este respecto están los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que comprenden una región variable de cadena ligera que tiene al menos 80%, de manera más preferente al menos 90%, de manera aún más preferente al menos 95%, y de manera aún más preferente 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 26 o SEQ . ID. No.: 29. También las modalidades preferidas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que tiene al menos 80%, de manera más preferente al menos 90%, de manera aún más preferente al menos 95%, y de manera aún más preferente 99% de identidad de secuencia a las secuencias de aminoácidos de SEQ. ID. No.: 27, SEQ. ID. No.: 28, SEQ. ID. No.: 30 o SEQ. ID. No.: 31 (ver Figuras 3 Y 4). Las modalidades particularmente preferidas de la invención son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos de los mismos, o variantes de los mismos, que comprenden una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 26 o SEO.
ID. No.: 29, que se codifican por las secuencias de nucleótidos SEQ. ID. No.:20 y 23, respectivamente. También particularmente preferidos son anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de SEO. ID. Nos.: 27, 28, 30 ó 31, que se codifican por las secuencias de nucleótidos SEQ. ID. Nos.: 21, 22, 24 y 25, respectivamente. Más particularmente preferidos a este respecto son un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o una variante del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 26 y que comprende además una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 27 o SEQ. ID. No.: 28 y un segundo anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 29 y que comprende además una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 30 o SEQ . ID. NO. : 31. Más preferidos son los anticuerpos humanos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, como sigue: (a) un anticuerpo comprendido de una región variable de cadena ligera que tiene la .secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. : 26 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 27, (b) un anticuerpo comprendido de una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 26 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 28, (c) un anticuerpo comprendido de una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ . ID. No. : 29 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 30, o (d) un anticuerpo comprendido de una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. : 29 y una región variable de cadena pesada que tiene ' la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No.: 31.
Producción de anticuerpos Los polipéptidos RGl, fragmentos o derivados, o células que nos expresan se pueden usar como un inmunógeno para producir anticuerpos a los mismos (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989) ) . Se pueden usar varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de estos anticuerpos y fragmentos (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering {Ereakthroughs in Molecular Biology) , Oxford University Press; R. Kontermann & s. Duebel, editores (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual) , Springer Verlag) . Se pueden obtener anticuerpos generados contra RGl por inyección directa de los polipéptidos en un animal o al administrar los polipéptidos a un animal, de manera preferente un no humano . El anticuerpo obtenido de esta manera entonces se une a los polipéptidos mismos. De esta manera, aún una secuencia que codifique solo para un fragmento de los polipéptidos se puede usar para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. Estos anticuerpos entonces se pueden usar para aislar ,el polipéptido del tejido que expresa ese polipéptido. Los métodos alternativos que no requieren el uso de protelna RGl purificada o péptidos RGl purificados para generar anticuerpos a RGl, incluyen "inmunización de ADN" en el cual se crea un vector de expresión o virus usando ADN que codifica para RGl y se usa para transfectar o infectar células de tejido hospedadoras para expresar el RGl en el animal usado para generar anticuerpos, o inmunización basada en células en las cuales se usan las líneas celulares que expresan RGl expresado ín vivo en el procedimiento de inmunización . Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Mílstein, JTature 256: 495-497, 1975), la técnica de hibridoma de células B humanas ( ozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983) y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., en Monoclonal Antibodies and Cáncer, Alan R. Li-ss, Inc., 77-96, 1985). Para inmunizaciones basadas en células que usan líneas celulares que expresan RG1, se puede usar inmunización sustractiva para inmunotolerizar los animales a la línea celular de origen (Sleister, H. M. y Rao, A. G. , J. Immunological Methods 261:213-220, 2002) . Además, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricas" , el empalme de genes de anticuerpo de ratón a genes de anticuerpo humanos para obtener una molécula con especificidad apropiada al antígeno y actividad biológica se pueden usar (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314:452-454, 1985) . De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena individual específicos a RG1. Adicionalmente , se pueden producir anticuerpos "humanos" usando los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,877,397 y 5,569,825, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad, o a través del uso de XenomouseMR, como se describe en Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997. Estos anticuerpos también se pueden generar usando tecnología de exhibición en fagos (Rader et al., Current Opinión in biotechnology 8:155-168, 1997; Auj ame et al., Human Antibodies 8:155-168, 1997). La generación de anticuerpos humanos es muy atractiva, ya que estos anticuerpos se espera que reduzcan al mínimo las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a anticuerpos monoclonales de ratón o derivados de ratón. La generación de anticuerpos humanos que reconocen epitopes del polipéptido RG1 (SEQ. ID. No. : 2) se describen en el Ejemplo 4. También se pueden producir anticuerpos al inducir producción in vivo en la población de linfocitos o al seleccionar bibliotecas de inmunoglobulinas recombinantes o paneles de reactivos de unión altamente específica como se describe en Orlandi et al., (Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:3833-3837, 1989) y Wínter y Mílstein (IVature 349:293-299, 1991) . Los fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específica para RG1 también se pueden generar. Frecuentemente hay ventajas para usar fragmentos de anticuerpo, en lugar de usar anticuerpos completos, puesto que el tamaño más pequeño de los fragmentos puede conducir a una depuración más rápida, y también puede proporcionar acceso mejorado a los tumores sólidos. Estos fragmentos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, fragmentos F(ab')2 que se pueden producir por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar al reducir los enlaces disulfuro de los fragmentos F(ab' )2- De manera alternativa, las bibliotecas de expresión de Fab se pueden construir para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse et al . , Science 256:1270-1281, 1989). Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar todos en y segregar a partir de E. coli, o una variedad del sistema de expresión de células eucarióticas , que permiten la producción de grandes cantidades de estos fragmentos . De manera alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar directamente para formar fragmentos F(ab' )2, (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) . Se conocen por aquellos expertos en la técnica otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos Fab de cadena individual (scFv) , día-cuerpos, minicuerpos y otros fragmentos de anticuerpo manejados también se contemplan (ver. Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,5761894 y 5,587,458; Hudson et al., Nature Medicine 9:129-133, 2003)). Los fragmentos Fv y sFv son ejemplos de especies con sitios intactos de combinación que están desprovistos de regiones constantes; de esta manera, probablemente van a mostrar unión no especifica reducida durante el uso in vivo, y son particularmente preferidos para el uso como agentes de formación de imágenes (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology) , Oxford University Press; R. ontermann & S. Duebel, editores (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual) , Springer Verlag) . El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,641,870, a manera de ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser mono-específicos o bi-específicos . También se contemplan variantes de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo descritos en la presente, y se pueden elaborar usando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras, por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 5,364,934. Las variaciones incluyen substitución, supresión o inserción de uno o más codones que codifican para el anticuerpo, que da por resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa de anticuerpo. La utilidad de estas variaciones contempladas incluirá aquellas que conducen a (1) una reducción en la susceptibilidad a la proteólisis o inactivación por oxidación, (2) una alteración en la afinidad de unión para formar complejos de proteína o afinidades de unión a antígenos, (3) una alteración en la depuración o biodistribución in vivo, (4) cambios en el isotipo o halotipo del anticuerpo, (5) cambios en las propiedades funcionales del anticuerpo, por ejemplo, unión al receptor Fe, (6) una alteración en las secuencias del epítope para disminuir o incrementar la homogenecidad, y (7) otros cambios en las propiedades fisicoquímicas o funcionales de estos análogos. La guía en la determinación de qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o suprimir sin que afecte de manera adversa la actividad deseada se puede encontrar al reducir al mínimo el número de cambios de la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de alta homología entre los anticuerpos RG1 y aquellos de las proteínas homologas. La variación permitida se puede determinar al hacer sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y al probar las variantes resultantes para la cantidad exhibida por la secuencia nativa. Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional comprende sustituir uno o más- residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo anticuerpo humano). En general, la(s) variante(s) resultante (s) seleccionada (s) para desarrollo adicional tendrá propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo de origen del cual se generó. Una manera conveniente para generar estas variantes de substitución comprende maduración por afinidad usando exhibición en fagos (Schier R . , J". Mol. Biol . , 263:551-67, 1996). Las variantes entonces se seleccionan por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente (ver, Ejemplo 4) . A fin de identificar los residuos de región hipervariable que serán buenos candidatos para modificación, se puede realizar mutagénesis de exploración de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen de manera significativa a la unión al antigeno. Los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes pueden someterse, a desarrollo adicional . Las secuencias de aminoácidos de RG1 (SEQ. ID. No. : 2) presentada en la presente se puede usar para seleccionar regiones específicas del polipéptido RG1 para generar anticuerpos. Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, las regiones o epítopes de un polipéptido RG1 al cual se dirige un anticuerpo puede variar con la aplicación propuesta. Por ejemplo, los anticuerpos propuestos para el uso en un inmunoensayo para la detección de RG1 unido a membrana en células de próstata se puede dirigir hacia epítopes accesibles en el polipéptido RG1. Las regiones del polipéptido RG1 que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, se pueden identificar fácilmente usando varios métodos diferentes conocidos en la técnica, tal como análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, o Jameson-Wolf . Los fragmentos que contienen estos residuos son particularmente adecuados en la generación de - anticuerpos anti-RGl. Los fragmentos útiles incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, las secuencias PLGGESICSAGAPAKYSI (SEQ. ID. No. : 8) ; HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ. ID. No.: 10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV . (SEQ. ID. No.: 11); y NEIVDSASVPET (SEQ. ID. No.: 12). La generación de anticuerpos policlónales a estas regiones se describe en el Ejemplo 4.
Usos de Anticuerpos que Reconocen Epítopes de RGl Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, y variantes de los mismos de la invención pueden ser particularmente útiles en los ensayos de diagnostico, metodologías de formación de imágenes, y métodos terapéuticos para el manejo de canceres en los cuales RGl está sobre-expresado, incluyendo canceres de la próstata, riñon, colon y ovarios. La invención proporciona varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de polipeptidos RGl y para la diagnosis de canceres, tal como cáncer de próstata. Estos ensayos comprenden en general uno o más anticuerpos RGl para reconocer y unirse a un polipéptido RGl . Los anticuerpos más preferidos se unirán de forma selectiva a RGl y no se unirán (o se unirán débilmente) a polipéptidos que no son RGl . Los ensayos incluyen varios formatos de ensayo inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación varios tipos de radioinmunoensayos , ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas, y similares. Además, los métodos de formación de imágenes inmunológicos capaces de detectar cáncer de próstata también se proporcionan por la invención, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación métodos de formación de imágenes radioescintigráficos que usan anticuerpo RGl marcados. Estos ensayos pueden ser clínicamente útiles en la detección, monitoreo y prognosis de canceres, tal como cáncer de próstata. Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para aislar o identificar clones que expresan el polipéptido para purificar el polipéptido de la presente invención por la unión del anticuerpo a un soporte sólido para aislamiento y/o purificación por cromatografía de afinidad. Adicionalmente , se pueden usar anticuerpos de RGl para aislar células positivas a RGl usando técnicas de clasificación y purificación celular. En particular, se pueden usar anticuerpos de RGl para aislar células de cáncer de próstata del tejido de tumor de xenoinjerto, de células en cultivo, etc., usando técnicas de purificación por afinidad o clasificación celular. Otros usos de los anticuerpos RGl de la invención incluye generar anticuerpos anti-idiotlpicos que imitan al polipéptido RGl. Se pueden usar anticuerpos RGl para detectar la presencia de cáncer de próstata o metástasis de tumor. La presencia de estas células que contienen RGl dentro de las varias muestras biológicas, incluyendo suero, próstata y otros especímenes de biopsia de tejido, se pueden detectar con anticuerpos RGl. Además, se pueden usar anticuerpos RGl en varias metodologías de formación de imágenes tal como inmunoescintografía con un anticuerpo conjugado a S9mTc (u otro isótopo) . Por ejemplo, un protocolo de formación de imagen es similar a uno recién descrito que usa anticuerpo anti-PSMA conjugado a 11:LIn se puede usar para detectar carcinomas de próstata metastáticos y recurrentes (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21:759-766, 1997). Otro método de detección que se puede usar es tomografia de emisión de positrones (ver Herzog et al., J. Nucí. Med. 34:2222-2226, 1993) . Los anticuerpos RGl de la invención se pueden marcar con un marcador detectable o conjugar a una segunda molécula, tal como un agente citotóxico, y se usa para seleccionar como objetivo la segunda molécula a una célula positiva RGl (Vitetta, E.S. et al., Immunotoxin Therapy, in deVita, Jr, V.T. et al., eds. Cáncer: Principies and Practice of Oncology, 4o ed. , J.B. Lippincott Co . , Filadelfia, 2624-2636, 1993) . Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, di idroxi-antracina-diona, actinomicina D, toxina de difteria, epotilones, exotocina A de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrin y glucocorticoide y otros agentes quimioterapéuticos , así como radioisótopos . Se pueden crear proteínas de fusión, seleccionadas como objetivo, citotóxico o antiproliferativas por fusión génica o química del anticuerpo a una citosina, quimiocina, interferón, o factor de crecimiento apropiado que tiene la actividad biológica anti-tumor deseada (Asgeirsdottir et al., Biochem. Pharmacol. 15:1729-1739, 2003). Los marca dores detectables adecuados incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente , compuesto quimioluminiscente quemador metálico o una enzima. Los radioisótopos adecuados para inmunoterapia o para uso como un marcador detectable incluyen los siguientes: antimonio-124 , antimonio-125 , arsénico-74, Bario-103, Bario-140, Berilio-7, Bismuto-j 206 , Bismuto-207, Cadmio-109, Cadmio-115m, Calcio-45, Cerio-139, Cerio-141, Cerio-144, Cesio-137, Cromo-51, Cobalto-56, Cobalto-57, Cobalto-58, Cobalto-60, Cobalto-64, Erbio-169, Europio-152; Gadolinio-153 , Oro-195, Oro-199, Hafnio-175, Hafnio-181, Indio-111, Yodo-123, Yodo-131, Iridio-192, Hierro-55, Hierro-59, Cripton-85, Plomo-210, Lutetio-177, Manganeso-54 , Mercurio-197 , Mercurio-203 , Molibdeno-99, Neodimio-147 , Neptunio-237, Niguel-63, Niobio-95, Osmio-185+191, Paladio-103, Platino-195m, Praseodimio-143 , Prometio-147 , Protactinio-233 , Radio-2226, Renio-186, Rubidio-86, Rutenio-103, Rutenio-106, Escandio-44, Escandio-46, Selenio-75, Plata-llOm, Plata-11, Sodio-22, Estroncio-85 , Estroncio-89, Estroncio- 90 , Azufre-35, Tantalo-182, Tecnetio- 99m, Telurio-125, Telurio-132, Talio-170, Talio-204, Torio-228, Torio-232, Estaño-113, Titanio-44, Tungsteno-185 , Vanadio-48, Vanadio-49, Ytterbio-169 , Itrio-88, Ytrio-90, Zinc-65 y Zirconio-95. La radiomarcación de anticuerpo se logra usando un agente quelante que se une covalentemente al anticuerpo, con el radionúclido insertado en el agente quelante. Los agentes quelantes preferidos se exponen en Srivagtava et al., Nucí. Med. Bio . 18:589-603, 1991 y McMurry et al., J. Med. Che . 41:3546-3549, 1998, o se deriva del llamado quelato NOTA publicado en H. Chong, K. et al., J. Med. Chem. 45:3458-3464, 2002, todos los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Particularmente preferidos para conjugación de radioisótopos a un anticuerpo RG1 son derivados del quemador bifuncional p-SCN-Bencil-DTPA (Brechbiel et al. Inorg. Chem. 25-2772-2781, 1986); por ejemplo, ciclohexil-DTPA (CHX-A' ' -DTPA, u et al., Bioorg. Med. Chem. 10:1925-1934, 1997) y MX-DTPA (1B4M-DTPA, McMurry et al., J. Med. Chem.., 41:3546-3549, 1998), así como ácido 1,4,7-triazaciclononano-?,?'?' ' -triacético (NOTA) (Chong et al., J. Med. Chem. 45:3458-3464, 2002). Se puede lograr la conjugación por el método de Nikula et al., Nucí. Med. Biol. 3:387-390, 1995. Particularmente preferido para el uso como un marcador detectable para inmunoescintigrafía son los radioisótopos mIn o 99mTc . Los marcadores detectables preferidos para tomografía de emisión de positrones son 43Sc, 4 Sc, 52Fe, 55Co, 68Ga, 64Cu, 86Y y 9 mTc . Para inmunoterapia, los radioisótopos beta-emisores 48Sc, 7Sc, 48Sc, 72Ga, 73Ga, 90Y, 67Cu, 109Pd, mAg, 149Pm, 153Sm, lssHo, 177Lu, 18SRe y 188Re y los radioisótopos alfa-emisores 211At, 211Bl, 212B1, 213B1 y 214Bl , se pueden usar. Se prefieren 90YM 177Lu, 72Ga, 153Sm, S7Cu y 12Bi y son particularmente preferidos 90Y y 177Lu.
Inmunoterapia para cáncer de próstata y otros canceres La invención proporciona varios métodos inmunoterapéuticos para tratar cáncer de próstata y otros cánceres, incluyendo terapia de anticuerpos, vacunas in vivo, y planteamientos de inmunoterapia ex vivo. Otros canceres incluyen cáncer del riñon, colon y ovarios. En un planteamiento, la invención proporciona anticuerpos RGl que se pueden usar de forma sistémica para tratar cáncer de próstata. Por ejemplo, se pueden introducir anticuerpos RGl no conjugados en un paciente tal que el anticuerpo se una a RGl sobre, en o asociado con células de cáncer de próstata y medir la destrucción de las células y el tumor, por mecanismos que pueden incluir histolisis mediada por cumplimiento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, alteración de la función fisiológica de RGl, y/o la inhibición de la unión a ligando o fruta de transducción de señales. Los anticuerpos RGl conjugados agentes tóxicos tal como ricino o radioisótopos, como se describe anteriormente, también se pueden usar de forma terapéutica para distribuir directamente el agente tóxico a las células de tumor de próstata que tienen RGl y destruir de este modo las células de tumor. La inmunoterapia de cáncer de próstata usando anticuerpos RGl pueden seguir las enseñanzas generadas a partir de varios planteamientos que se han empleado exitosamente con respecto a otros tipos de cáncer, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación cáncer de colon (Arlen et al., Crit. Rev. I munol . 18: 133-138, 1998), mieloma múltiple (Ozaki et al., Blood 90: 3179-3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90: 2437-2444, 1997), cáncer g strico (Kasprzyk, et al., Cáncer Res. 52:2771-2776, 1992), linfoma de células B (Funakoshi et al., Immunther, Emphasis Tumor Immunol . 19: 93-101, 1996), leucemia (Zhong et al., euk Res. 20:581-589, 1996) cáncer colorrectal (Moun et al., Cáncer Res. 54. 6160-6166, 1994; Velders et al., Cáncer Res. 55:4398-4403, 1995), y cáncer de mama (Shepard et al., J. Clin, Immunol. 11: 117-127, 1991) . La invención proporciona además vacunas formuladas para contener un polipéptido RGl o fragmento del mismo . El uso de un antígeno de tumor en un vacuna para generar inmunidad humoral o mediada por células para el uso en terapia anti-cáncer es bien conocida en la técnica y se ha empleado en cáncer de próstata usando . PS A humano e inmunógenos de PAP de roedor (Hodge et al., Int. J. Cáncer 63: 231-237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159 : 3113-3117 , 1997) . Estos métodos se pueden practicar fácilmente al emplear un polipéptido RGl, o fragmento del mismo, o una molécula de ácido nucleico que codifica para RGl y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar de forma apropiada el inmunógeno RGl. Por ejemplo, se pueden usar sistemas de distribución de genes virales para distribuir una molécula de ácido nucleico que codifica para RGl. Los varios sistemas de distribución de genes virales que se pueden usar en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, vaccinia, viruela aviar, viruela de canarios, adenovirus, influenza, poliovirus, virus adeno-asociados , lentivirus, y virus de sindbus (Restifo en Curr. Opin, Immunol. 8: 658-663, 1996). También se pueden emplear sistemas de distribución no virales al usar ADN desnudos que codifica para un polipéptido RG1 o fragmento del mismo introducido en el péptido (es decir, de forma intramuscular) para inducir una respuesta anti-tumor. En una modalidad, se puede emplear ADNc de RG1 de longitud completa. En otra modalidad, se pueden emplear fragmentos de ADNc de RG1 humanos. En otra modalidad, se pueden emplear moléculas de ácido nucleico de RG1 que codifican para epítopes específicos de linfocitos T (CTL) . Los epítopes de CTL se pueden determinar usando algoritmos específicos (por ejemplo Epimer, Brown University) para identificar péptidos dentro de un polipéptido RG1 que es capaz de unirse óptimamente a los alelos HLA especificados. También se pueden emplear varias estrategias ex vivo. Un planteamiento comprende el uso de células dendltricas para presentar un polipéptido RG1 como antígeno al sistema inmunitario de un paciente. Las células dendítricas expresan MHC clase I y II, co-estimulador B7, e IL-12, y de esta manera son células que presentan el antígeno, altamente especializadas. En células de cáncer, las células dendítricas antologas tratadas con impulsos de péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) se están usando en un ensayo clínico Fase I para estimular los sistemas inmunitaríos de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., Prostate 28: 65-69, 1996; Murphy et al., Prostate 29: 371-380, 1996). Se pueden usar células dendríticas para presentar polipéptidos RGl a células T en el contexto de moléculas de MHC clase I y II. En una modalidad, las células dendríticas antologas se tratan con impulsos de polipéptidos RGl capaces de la unión a moléculas de MHC. En otra modalidad, se tratan con impulso células dendríticas con el polipéptido RGl completo. Aún otra modalidad comprende el manejo de la sobre-exprésion del gen rgl en células dendríticas usando varios vectores de implementación conocidos en la técnica, tal como adenovirus (Arthur et al., Cáncer Gene Ther. 4: 17-25, 1997), retrovirus (Henderson et al., Cáncer Res. 56: 3763-3770, 1996) , lentivirus, virus adeno-asociado, transfección con ADN (Ribas et al., Cáncer Res. 57: 2865-2869, 1997), y transfección de AR derivado de tumor (Ahsley et al., J. Exp. Med. 186: 1177-1182, 1997) . También se pueden usar anticuerpos anti-RGl anti-idiotípicos en terapia anti-cáncer como una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria a células que expresan un polipéptido RGl. De manera específica, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica y se puede adaptar fácilmente para generar anticuerpos anti-RG1 anti-idiotipicos que imitan a un epítope en un polipéptido RGl (ver, por ejemplo, Wagner et al., Hybrido a 16: 33-40, 1997: Foon et al., J". Clin. Invest. 96: 334-342, 1995; Herlyn et al., Cáncer I munol Immunother 43: 65-76, 1996) . Esta molécula anti-idiotipica se puede usar en terapia anti-idiotípica como se practica actualmente con otros anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra antigenos de tumor. Se pueden emplear métodos de inmunización genética para generar respuestas inmunitarias humorales y celulares profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células de cáncer que expresan RGl. Usando las moléculas de ADN que codifican para RGl descritas ejemplo, las construcciones que comprenden /ADN que codifica para un polipéptido RGl/inmunógeno y secuencias reguladoras apropiadas se pueden inyectar directamente en el músculo o piel de un individuo, tal que las células del músculo o piel tomen la construcción y expresen el polipéptido RGl/inmunógeno codificado. El polipéptido RGl/inmunógeno se puede expresar como un polipéptido de superficie celular o se segrega. La expresión del polipéptido RGl/inmunógeno da por resultado la generación de actividad humoral o celular profiláctica o terapéutica contra ' cáncer de próstata. Se pueden usar varias técnicas de inmunización genética profilácticas y terapéuticas conocidas en la técnica (para una revisión, ver información de referencias publicadas en la dirección interna www.genweb.com) .
Ensayos para identificar agentes que se unen a G1 La presente invención también se refiere a ensayos y métodos que se pueden usar para identificar agentes (es decir, un anticuerpo, péptido, etc., que se une a RG1. De manera especifica, los agentes que se unen a RG1 se pueden identificar por la capacidad del ligando RG1 u otro agente o constituyente para unirse a RG1 y/o la capacidad para inhibir/estimular la actividad de RG1. Como se describe anteriormente, los anticuerpos se obtienen por inmunización de sujetos mamíferos adecuados con péptidos, que contienen como regiones antigénicas, aquellas porciones del polipéptido RG1 propuestas para ser seleccionadas como objetivo por los anticuerpos. Estos agentes se pueden usar en estudios de unión competitivo para identificar agentes inhibitorios de segunda generación así como para bloquear la actividad de RG1. Los agentes que se unen a un polipéptido de RG1, tal como un anticuerpo de RG1, se pueden usar para modular la actividad de RG1, para dirigir a agentes anti-cáncer a células apropiadas de mamífero, o para identificar agentes que bloqueen la interacción con RG1. Se pueden seleccionar como objetivo, o identificar células que expresan RG1 al usar un agente que se une a RG1. Como se usarán los agentes de unión a RG1 depende de la naturaleza del agente de unión a RG1. Por ejemplo, se puede usar un agente de unión a RG1 para: distribuir toxinas conjugadas, tal como toxina de difteria, toxina de cólera, ricina o exotosina de pseudomonas, a una célula que exprese RG1 ; para modular la actividad de RG1; para aniquilar directamente una célula que exprese RG1; o en detecciones para identificar agentes de unión competitiva. Por ejemplo, se puede usar un agente inhibitorio de RG1 para dividir directamente el crecimiento de células que expresen RG1 en tanto que se puede usar un agente de unión a RG1 como un agente de diagnostico.
Composiciones farmacéuticas y administración La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que pueden comprender polinucleótidos rgl , polipéptidos RG1, anticuerpos, agonistas, 'antagonistas, o inhibidores, solo o en combinación con al menos otro agente, tal como compuesto estabilizante, que se pueda administrar en un portador estéril, biocompatible, farmacéutico, que incluye, de manera enunciativa y sin limitación, solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa y agua. Se pueden administrar cualquiera de estas moléculas a un paciente solo, o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas, en composiciones farmacéuticas en donde se mezcla con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. En una modalidad de la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable es farmacéuticamente inerte . La presente invención también se refiere a la administración de composiciones farmacéuticas. Esta administración se logra de forma oral o parenteral . Los métodos de distribución parenteral incluyen administración tópica, intra-arterial (directamente al tumor) , intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal , o intranasal . Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar de forma farmacéutica. Los detalles adicionales de las técnicas para la formulación de administración se pueden encontrar en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co. Easton, Pa) . Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden formular usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica a las dosis adecuadas para la administración oral. Estos portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para la ingestión por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener a través de una combinación de compuestos activos con excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de los gránulos, después de adicionar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son agentes de relleno de carbohidratos o proteína tal como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metil, metil-celulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulsa sódica; y gomas incluyendo goma arábiga y de tragacanto; y proteínas tal como gelatina y colágenos. Si se desea, se pueden adicionar agentes desintegrantes o solubilizantes, tal como la polivinil-pirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Se proporcionan núcleos de grageas con revestimientos adecuados tal como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes . Se pueden adicionar materias colorantes o pigmentos a las tabletas o revestimientos de gragea para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosis. Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar de forma oral incluyen cápsulas ajustadas elaboradas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas elaboradas de gelatina y un revestimiento tal como glicerol o sorbitol . Las cápsulas ajustadas pueden contener ingredientes activos mezclados con un agente de relleno o aglutinantes tal como lactosa o almidones, lubricantes tal como talco o estereato de magnesio, y opcionalmente , estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o dispersar en líquidos adecuados, tal como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicol líquido cono sin estabilizadores. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de compuestos activos. Para inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, de manera preferente en amortiguadores SI fisiológicamente compatibles tal como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológicamente amortiguada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano . Adicionalmente, se pueden preparar soluciones de los compuestos activos como suspensiones apropiadas de inyección, aceitosas. Los solventes lipófilos adecuados, o vehículos, incluyen aceites grasos tal como aceite de ajonjolí, o esteres de ácidos grasos sintéticos, tal como oleato de etilo o triglicéridos , o liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Para administración tópica o nasal, se usan de la formulación penetrante apropiados a la barrera particular que se va a permear . En general se conocen en la técnica los penetrantes .
Equipos La invención se refiere adicionalmente a paquetes y equipos farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones mencionadas anteriormente de la invención.
Asociado con estos recipientes puede ser un aviso a la forma descrita por una agencia gubernamental que regula la elaboración, uso o venta de farmacéuticos o productos biológicos, que reflejen la aprobación por la agencia para la elaboración, uso o venta de producto para administración en humanos .
Elaboración y almacenamiento Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden elaborar de manera que se conoce en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsionamiento, encapsulación, atropamiento olefilización . La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal y se puede formar con muchos ácidos, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros protónicos que son las formas correspondientes de base libre. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, sacarosa al 0.1%-2%, mannitol al 2%-7% en un intervalo de pH de 4.5 a 5.5 que se combina con amortiguador antes del uso.
Después de que se han preparado las composiciones farmacéuticas' que comprenden un compuesto de la invención formulado en un portador aceptable, se pueden colocar en un recipiente apropiado y marcar para tratamiento de una condición indicada. Para administración de RGl, esta marcación incluirá la cantidad, frecuencia y método de administración.
Dosis terapéuticamente efectiva Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito o propósitos, es decir, tratamiento de un estado de enfermedad particular caracterizado por expresión de RGl. La determinación de una dosis efectiva está bien dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente ya sea en los ensayos de cultivo celular, por ejemplo, células neoplásticas, o en modelos de animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo de animal también se usa para lograr un intervalo deseable de concentración y ruta de administración. Esta información entonces se puede usar para determinar dosis útiles y rutas útiles para administración en humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad de proteina o sus anticuerpos, antagonistas o inhibidores que mejoran los' síntomas o condición. La eficacia terapéutica y toxicidad de estos compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos normales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y LD50 (la dosis letal a 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, ED50/LD50. Las composiciones farmacéuticas que exhiben grandes Indices terapéuticos con las preferidas. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudio en animales se usan en la formulación en un intervalo de dosis para uso humano. La dosis de estos compuestos está de manera preferente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada, sensibilidad del paciente, y la ruta de administración . La dosis exacta se elige por el facultativo individual en vista del paciente que se va a tratar. La dosis y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de la porción activa o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que se toman en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, por ejemplo, tamaño y ubicación del tumor; edad, peso y genero del paciente; dieta; tiempo y frecuencia de administración, combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta o terapia. Se pueden administrar composiciones farmacéuticas de acción prolongada cada 3 o 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y la velocidad de depuración de la formulación particular . Las cantidades normales de dosis pueden variar desde 0.1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración. La guía en cuanto a las dosis particulares y métodos de distribución se proporcionan en la literatura ver, Patente de los Estados Unidos No. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Aquellos expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para polinucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la distribución de polinucleótidos o polipéptidos será específica a células particulares, condiciones particulares, ubicaciones particulares, etc. Las actividades específicas preferidas para un anticuerpo radiomarcado puede variar de 0.1 a 10 mCi/mg de proteína (Riva et al., Clin. Cáncer Res. :3275s-3280s, 1999; Wong et al . , Clin. Cáncer Res. 6:3855-3863, 2000; Wagner et al., J. Nuclear Med. 43:267-272, 2002) . La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención por referencia a modalidades especificas. Estas ejemplificaciones, en tanto que ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no delinean las limitaciones o circunscriben el alcance de la invención descrita. Todos los ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas normales, que son bien conocidas y rutinarias por aquellos expertos en la técnica, excepto donde se describa de otro modo en detalle. Las técnicas de biología molecular de rutina de los siguientes ejemplos se puede llevar a cabo como se describe en los manuales normales de laboratorio, tal como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989.
Ejemplo 1: identificación de polinucleótido rgl humano Se identificó rgl como un gen expresado en la próstata por extracción de la base de datos Incyte's LifeSeq®. La secuencia de nucleótidos se identificó por una búsqueda de anotación de la base de datos, usando la herramienta de "función de proteina" proporcionada por Incyte para el propósito de buscar la base de datos . La secuencia de nucleótidos se encontró en la categoría de moléculas de adhesión celular en la base de datos anotada y se describió como un homologo de f-espondina. El análisis ¦ electrónico Northern de la distribución de las secuencias de polinucleótido rgl en el conjunto de biblioteca en la base de datos reveló que rgl se expresó a altos niveles en las bibliotecas de próstata y a bajos niveles en varias bibliotecas de otros tejidos, incluyendo aquellas de tejidos normales y de tumor. Después del montaje del conjunto de clones de rgl en la base de datos en una secuencia contigua de polinucleótidos , y de la edición de la secuencia contigua, se identificó una secuencia de codificación de longitud completa en el polinucleótido montado, previsto. Esta secuencia codificó para una proteína homologa a f-espondina y a Mindina-2. Los clones 1640796, 1712252 y 1880265 de Incyte se obtuvieron de Incyte para trabajo experimental y el clon 3360733 se identificó como que tiene la secuencia de más de 5 ' -nucleótido . Este clon se secuenció completamente con tubo la secuencia de codificación completa para la proteína G1 prevista. Esta secuencia se muestra en SEQ. ID. No.: 1.
Ejemplo 2: Expresión de .ARNm de rgl La expresión de ARNm de rgl en una variedad de muestras de . tejidos normales y de tumor y en líneas celulares, se determinó por PCR semi-cuantitativa usando un ensayo Tagman (Perkin-Elmer) . Se obtuvieron muestras de tejido normal, benigno, y de tumor de próstata, que se han graduado de acuerdo a un sistema de graduación modificado de Gleason a partir del Departamento de Urología de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford' (Urology Departament at Stanford University School of Medicine) . Se aisló ARN de estas por procedimientos normales . El ARN de otros tej idos normales y de tumor se compró de fuentes comerciales, incluyendo Clonetech, y Biochain. Se obtuvieron líneas de células de tumor de próstata (PC-3, LNCaP y DU145) , de American Type Culture Collection y se propagaron en cultivo por métodos normales usando medio que contiene suero. Se establecieron tumores de xeno injerto derivados de estas líneas de células en ratones desnudos y se recolectaron de los ratones aproximadamente a las 4-6 después del implante. Se aisló el ARN de los tumores por procedimientos normales . Se analizó análisis de PCR basados en Tagman usando los cebadores: CGC GCA TAG CTC CGA CTA C (SEQ ID NO: 3) y GCC GCG TCC GCA AAG (SEQ ID NO : 4) y la sonda de Tagman: 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG CTG-Tamra (SEQ ID NO : 5) . Estos cebadores y las sondas se designaron usando el programa Perkin Elmer's Primer Express y se sintetizaron por Synthetic Genetics. Se llevaron a cabo reacciones de PCR durante 30-40 ciclos y se cuantificaron usando ARN de próstata para generar una curva normal para comparación relativa. Este análisis demostró que se detectó ARNm de Rgl a la mayor abundancia de la próstata y a niveles significativamente menores en otros tejidos varios.
Ejemplo 3: Producción de RG1 en células BHK Clonación: Se obtuvo la región de codificación de RG1 del plásniido 3360733 de Incyte. La secuencia de codificación se amplificó por PCR con los cebadores SST115 (5 ' -TCGCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3 ' ) (SEQ ID NO: 6) y SST113 (5 ' -AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3 ' ) (SEQ ID NO: 7) en reacción de PCR normal (100 µ?) usando amortiguador de polimerasa lx Pfu Turbo (Stratagene, La Jolla, CA)/200uM dNTPs/0.2uM cebadores de oligonucleótido/2.5U de polimerasa Pfu Turbo (Stratagene). Las condiciones de amplificación por PCR fueron como sigue: 3 minutos a 95 °C, (15 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C, 2 minutos a 72°Cx35, 72 °C durante 7 minutos. El producto resultante amplificado por PCR se purificó usando una columna QlAquick PCR (Qiagen, Valencia, CA) y se digirió con las enzimas de restricción Xbal y Pml para dar por resultado un fragmento de 1010 pb que se purificó de un gel de agarosa al 1 % usando un equipo BIO 101 Gene Clean Kit (Vista, CA) . El fragmento purificado se ligó (usando el equipo Epicientre Fast Link Kit, (Epicenter, Madison, WI) al vector de expresión de Sindbis no-citopático pSINrep21 (Agapov et al, 1998, PNAS 95: 12989-12994) digerido con Xbal y Pmll, y se transformó en células competentes DH5-alfa (Life Technologies, Gaithersburg, CA) y se seleccionó en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 µg/ml) . Se cultivó una colonia resistente a ampicilina en el medio LB con ampicilina y mostró por análisis de secuencia que contiene la secuencia de codificación RG1 insertada. Este plásmido se llamó pPEG6. Expresión: Se usaron dos microgramos de pPEG6 para transfectar l-3xlOs células de riñon de hámster neonato (BHK) usando el reactivo Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después del a transfección, las células se incubaron en suero de sangre fetal DMEM plus durante 24-48 horas, tiempo en el cual las células se dividieron 1 a 10 y se inició la selección para las células que contienen el plásmido al adicionar puromicina (2.5ug/ml de concentración final) y suero que contiene DMEM. Después de que las células estuvieron confluentes (4-5 días después de la adición de puromicina) las células se lavaron con PBS, se dividieron -1 a 10, y el medio DMEM con suero y 5ug/ml de puromicina se adicionaron. Después de 2-3 días adicionales, el medio se reemplazó con DMEM y 5ug/ml de puromicina sin suero, se cultivó durante 2-3 días y la presencia de la proteína RG1 se detectó en el medio por análisis Western usando anticuerpos de RG1. Se detectó la proteína RG1 a un nivel de lug/ml . Purificación : Células de riñon de hámster neonato (BHK) , transfectadas para sobreexpresar de forma estable y segregar la proteína RG1 en el medio de crecimiento, se cultivaron el medio que contiene suero bovino fetal. Cuando estuvieron sub~confluentes, las células se cambiaron a medio libre de suero durante 24-48 horas. El medio se recolectó, se centrifugó para remover las células y se almacenó a menos 80 °C. El medio se descongeló inmediatamente antes de la purificación y se mantuvo en hielo. Se adicionaron inhibidores de proteasa, el suero se diluyó diez veces con amortiguador frió de acetato de sodio 20mM, pH 6.5 y se mantuvo a 4°C a todo lo largo de la purificación. La muestra diluida se cargó en columna de intercambio aniónico Q-Sefarosa a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min, entonces se lavó con el mismo amortiguador. Se realizó una ilusión usando un gradiente lineal de NaCl (0-80 % de NaCl 1M en amortiguador, 0.5 % por minuto) en tanto que se recolectan las fracciones. El RG1 eluyó a aproximadamente NaCl 75 mM, como se determina por SDS PAGE y transferencia Western. Se mezclaron las fracciones que contienen RG1 , se concentraron por ultrafiltración y se purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración de gel Superdex 75. Se usó BHK-RG1 purificado como inmunógeno en la generación de anticuerpos humanos que son específicos para la proteína RG1 nativa (nRGl) , y como antígeno en la detección y caracterización de estos anticuerpos.
Ejemplo 4: Generación de Anticuerpos Anticuerpos policlonales ·. Se formularon antisueros policlonales de conejo contra cinco secuencias sintéticas de polipéptidos derivadas de la secuencia de proteína RG1. Estas secuencias se seleccionaron debido a sus posiciones previstas en la superficie de la proteína, a fin de generar antisueros que van a reconocer más probablemente los epítopes superficiales. Los residuos de cisterna se reemplazaron con ácido aminobutírico (Abu) para ayudar a la síntesis. Las secuencias específicas de aminoácidos, las posiciones en la proteína de RG1 y las designaciones para los cinco péptidos se listan a continuación.
Designación Posición Secuencia de Aminoácidos 1C 28-46 PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO : 8) 2C 46-64 TFTGKWSQTAFPKQYPLFR (SEQ ID NO : 9) 3C 77-91 HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO : 10) 4C 188-210 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO: 11) 5C 263-274 NEIVDSASVPET (SEQ ID MO : 12) Se acoplaron covalentemente péptidos a hemocianina de lapa (KLH) vía una cisterna carboxi-terminal adicional, para el uso como un inmunógeno . De manera similar, se preparó un congujado de albúmina de suero bovino (BSA) para el análisis de los títulos de antisuero mediante ELISA. Se inmunizaron dos animales con cada péptido. Se realizaron inmunizaciones iniciales en el adyuvante completo de Freunds (0.5 mg/animal) , seguido por refuerzos en intervalos de tres semanas con 0.25 mg/animal en el adyuvante incompleto de Freunds aplicado intramusculármente . Se tomaron sangrados de prueba periódicos y se midieron los títulos de anticuerpo contra el conjugado específico de BSA-péptido por ELISA y se compararon por los sueros pre-inmunitarios . Los sueros contra los péptidos 1C y 3C se muestran que son activos. Los antisueros contra el péptido 2C no reconocieron el polipéptido RG1. Los antisueros contra los péptidos 4C y 5C no se probaron. Anticuerpos Monoclonales : Se generaron anticuerpos monoclonales contra RG1 al inmunizar ratones transgénicos contra péptidos RGl y una protelna de fusión de RGl marcada con 6-histidina expresada en E. coli. Los explenocitos de estos animales se fusionaron con células de mieloma para producir células de hibridoma . Los hibridomas resultantes se detectaron por ELISA para hibridomas que producen anticuerpos dirigidos contra los péptidos RGl y proteína. También se prepararon anticuerpos monoclonales humanos con especificidad para RGl nativo por inmunización de ratones transgénicos que contienen el sitio de la cadena ligera capa de ratón y pesada de ratón interrumpida (Patente de los Estados Unidos No. 5,877,397). Los ratones transgénicos de las ratas cruzadas C57BL/6J (Medarex) se inmunizaron con protelna RGl purificada producida en una línea de células BHK, transfectada, estable (ver Ejemplo 3) . El antígeno se mezcló con el adyuvante Completo de Freunds (Sigma, F5881) para la primera y segunda inmunización para el protocolo 1; - posteriormente los antígenos se mezclaron con el adyuvante incompleto de Freund (Sigma, F5506) . Para el segundo protocolo, se usó el adyuvante completo de Freunds para la primera inmunización y posteriormente se usó el adyuvante incompleto de Freunds . Cada ratón recibió 25 ug de RGl nativo (nRGl) en 100 µ? de PBS, mezclado 1:1 con el adyuvante usando una aguja de emulsionamiento . Los ratones se inyectaron con 0.2 mL de antígeno preparado en la cavidad peritoneal .
Preparación de Hibridoma .- La línea de células de mieloma P3 X63 ag8.653 (ATCC CRL 1580, lote F15183) se usó para las fusiones. El frasco de ATCC original se descongeló y expandió en cultivo. Se preparó una solución concentrada de los frascos congelados de esta expansión. Las células se mantuvieron en cultivo durante 3-6 meses, se pasaron dos veces por semana. El sobrenadante de las células S388D1 (ATCC, TIB-63 FL) se usó como medio condicionado para los hibridomas . De forma breve, se cultivaron las células y se expandieron a 200 mi. Se cultivaron cultivos estacionarios durante aproximadamente 7 días. El sobrenadante agotado se decantó y filtró a través de un filtro estéril de 0.2 µt?. Esta línea celular se pasa durante 3-6 meses y luego se descongela el nuevo frasco. Se usaron DMEM (Cellgro# 10013271, 10013270) que contiene 5 % de FBS (Hyclone, #AKE11828) y P/S (Cellgro, #30002029) para cultivar células de mieloma y P388D1. Se adicionaron complementos adicionales del medio al medio de crecimiento de hibridoma, que incluyó 5 % de factor de clonación de hibridoma, Origen - (IGEN, # 36684, 36908) , 5 % de medio condicionado P388D1 (11/15/00, 12/21/00 DH) , 10 % de FCS (Hyclone, #AKE11828) , ß-mercaptoetanol (Gibco #1076640) , Genetacina (Gibco #1079874) , Hepes (Cellgro-#25060041) y HAT (Sigma, H 0262; l.OxlO^4 M Hipoxantina, 4.0xl0"7 M Aminopterina, 1.6xl0~5 M Timidina) , o HT (Sigma, H0137; l.OxlCT4 M Hipoxantina, 1.6xl0~5 M Timidina) . Los esplenocitos se fusionaron con células de mieloma usando PEG y metodología normal . Los hibridomas resultantes se colocaron en 50 placas de 96 cavidades, y se sembraron a 200 µ?/cavidad para la primera fusión. La detección inicial de ELISA para anticuerpos IgG,k humanos se realizó 10-12 días después de la fusión. Entonces se detectaron cavidades positivas a IgG,k humana por un ELISA de captura de 6-His. Esta detección condujo al aislamiento de 8 anticuerpos humanos a partir de 3 fusiones; tres IgM, una IgG3, y cuatro anticuerpos de la sub-clase de la IgGl. Los hibridomas de las cavidades con anticuerpos de unión a antígeno se transfirieron primero a placas de 24 cavidades, y se re-detectaron nuevamente para la especificidad. Los hibridomas específicos para RG1 nativo se sub-clonaron al limitar la dilución para asegurar la monoclonalidad. Se conservaron hibridomas que producen anticuerpos que se unen a RG1 nativo (nRGl) en varias etapas en el proceso de desarrollo al congelar células en el medio de congelación y gen. Los medios de estas líneas se congelaron y usaron para purificación de anticuerpos como se describe más adelante . Se determinaron cuatro de ocho que tienen suficiente especificidad para garantizar estudio adicional . Purificación de anticuerpos: Cuatro de los anticuerpos monoclonales humanos a RG1 descritos anteriormente se purificaron a partir del medio acondicionado de células usando cromatografía de afinidad de proteína G Sepharose. Las células se removieron del medio por centrifugación y filtración, y el medio se hizo pasar sobre la columna de proteína G. La columna se lavó con PBS para remover el material no unido. Los anticuerpos unidos se eluyeron con glicina lOOmM, pH 2.5 y se neutralizaron inmediatamente al adicionar Tris 1M al 10 % v/v, pH 8 a las fracciones. Las fracciones que contienen el anticuerpo se mezclaron, se dializaron en PBS, se probaron para la pureza por SDS PAGE, y se analizaron para actividad de unión a antígeno por ELISA. Detección de Anticuerpos : La detección de anticuerpos se realizó usando varios procedimientos diferentes de ensayo: A. Detección de ELISA de hlgGyK: Se revistieron placas de microtítulo de noventa y seis cavidades (Falcon, #3912) durante la noche con lug/ml de IgGK anti-humano o IgGK anti-humano en PBS (50 ul/cavidad). Las placas se aspiraron y bloquearon con PBS, 0.05 % de Tween 20 que contiene 5 % de suero de pollo durante 1 hora a temperatura ambiente (100 µ?/cavidad) , luego se lavaron tres veces con PBS-tween. Los sobrenadantes de los hibridomas se diluyeron 1:2 en amortiguador de bloque y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (100 µ?/cavidad) para detección. Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces en amortiguador de bloqueo antes de adicionar 100 µ?/cavidad de anticuerpo secundario (IgGFc anti-humano de HRP (Jackson, #109-036-098 o IgGK anti-humano de HRP (Sigma, #A7164) . El anticuerpo secundario se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego las placas se lavaron 2X en amortiguador de bloqueo. Las placas se revelaron usando 10 mi de amortiguador de fosfato de citrato, pH 4.0 que contiene 80 ul de ABTS (Sigma, #A1888), 8 µ? de H202 por placa y se leyeron a: A415-490 nm. B. ELISA de unión a RGl: se revistieron placas de microtitulo de noventa y seis cavidades durante la noche con 0.5-1.0 ug/cavidad de proteina RGl nativa purificada en PBS, 50 ul/cavidad, 4 grados C. Las cavidades se aspiraron y entonces la reacción se bloqueo con la adición de 100 ul/cavidad de PBS-tween + 5 % de suero de pollo, seguido por incubación durante 1 hora a temperatura ambiente . Las placas entonces se lavaron tres veces en amortiguador de bloqueo . Entonces se adicionaron a cada cavidad muestras diluidas en serie (suero, sobrenadante de hibridoma, anticuerpos purificados, etc.), a 50 ul/cavidad. Se incuba a 1 hora a temperatura amiente y luego se lava 3 veces en amortiguador de bloqueo. Las cavidades entonces se incuban con anticuerpo secundario IgGFc anti-humano de HRP en amortiguador de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lava tres veces como antes. Las placas se revelan usando sustrato descrito anteriormente y medición del A405 nm usando un lector de placas de 96 cavidades. C. Método de ELISA de Captura: A fin de determinar anticuerpo mab que se una a proteína G1 en su conformación nativa, se usó el formato de ELISA de captura. La proteína RG1 , que contiene una marca de expresión de seis-histidinas (6HÍS-RG1) se expresó en células BH y se usó como el antígeno. El 6HÍS-RG1 se purificó del medio condicionado usando cromatografía de afinidad en agarosa NiNTA siguiendo metodología normal . Se capturó 6HisRGl purificada en placas de NiNTA de 96 cavidades (Qiagen NiNTA HisSorb) usando una concentración de 1.5 ug/ml en PBS más 0.2 % BSA (PBS/BSA) , 100 ul/cavidad) durante la noche a 4°C. Las cavidades se lavaron 3 veces con PBS que contiene Tween 20 al 0.05 % (PBST) . Las muestras (sobrenadante de hibridoma, sueros, anticuerpos purificados, etc.) se diluyeron en PBS/BSA y se incubaron en placas durante 1-2 horas a temperatura ambiente (50 ul/cavidad) y se lavaron 3 veces con PBST. El anticuerpo secundario (IgGFc anti-humano de cabra marcado con HRP) se diluyó 1:5000 en PBS/BSA, adicionado a la placa a 50 ul/cavidad y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las placas se lavaron 3 veces con PBST y se revelaron como en un ELISA. Se midió la absorbancia a 405 nm usando un lector de placas de ELISA. D. Ensayo de Resonancia de Plasmon Superficial BiAcore (SPR) : Se detectaron adicionalmente sobrenadantes de hibridoma de origen para clasificar cualitativamente los clones por avidez usando SPR. Se inmovilizó un IgGFc antihumano de ratón (Pierce, 31142) en un chip sensor (Biacore, BR-1000-12) usando acoplamiento normal de amina y 60 ug/ml de anticuerpo en acetato, pH 4.0 y una fase móvil de solución salina amortiguada con HEPES (HBS) . El medio de hibridoma -se paso sobre la superficie a 5 ul/m'in para capturar sobre la superficie y luego se lavó a la línea base con HBS. La proteína BHK-RG1 nativa, purificada (400 nM) entonces se pasó sobre la superficie y se midió en unión por SPR. Al final de la inyección, se pasó HBS sobre la superficie para medir la disociación del complejo anticuerpo :RG1. La pendiente de la medición de SPR durante el tiempo es indicativa de la velocidad de disociación, entre mayor sea la pendiente, más rápida es la velocidad y por lo tanto menor la avidez del anticuerpo.
Ejemplo 5: Análisis por transferencia Western de anticuerpos Se probaron antisueros para especificidad de RG1 vía transferencia Western. Se probaron antisueros específicos de RGl (aquellos formulados contra las secuencias 1C y 3C, anteriores) en RGl expresado de forma momentánea en células COS, RGl nativa segregada de células LNCaP y RGl producida de células de riñon de hámster neonato transfectadas' (BHK) . Los antisueros específicos de RGl se probaron adicionalmente en Usados preparados de: tumores de LNCaP, células de LNCaP, tumores PC3 , células PC3 y varias muestras clínicas de tumores humanos de próstata. Las células y tejidos se lisaron en amortiguador detergente. Después de ebullición durante 5 minutos, se cargaron 10 ul de cada lisado en un gel de SDS-poliacrilamida al 12 % para resolver las proteínas. Entonces se transfirieron las proteínas separadas a membranas de nitrocelulosa . Se verificó la especificidad de unión de los anticuerpos de RGl por unión en la presencia de péptidos homólogos y heterólogos . Los antisueros específicos de RGl pueden detectar la proteína en todas las muestras pero células PC-3 y tumores PC-3. El análisis por referencia Western de anticuerpos humanos específicos para RGl nativa demostró que estos anticuerpos reconocieron RGl en transferencias sólo bajo condiciones no reductoras . Estos sugieren que estos anticuerpos se unen a una forma más nativa de RGl .
Ejemplo 6: Purificación de Proteína RGl Nativa Segregada de Células LNCaP Células LNCaP cultivadas en cultivo se mostraron que segregan proteína RGl nativa por análisis de transferencia Western. A fin de purificar la proteína nativa, se cultivaron células durante 48 horas en medio que carece del suero. Este medio condicionado libre de suero se recolectó, se centrifugó para remover cualquier célula, y se concentró a aproximadamente 50 veces por ultrafiltración. El medio concentrado entonces se diluyó 10 veces con amortiguador de acetato de sodio 20 tnM, pH 6.5 y se cargó en una columna de intercambio aniónico Q-Sepharose. La elusión en columna consistió de un gradiente de cloruro de sodio (0.5 % por minuto) en tanto que se recolectan fracciones de 2.0 mi. La proteína RGl eluyó a aproximadamente NaCl 75 mM, como se determina por transferencia Western y transferencia SDS-PAGE. La proteína RGl nativa corre a un peso molecular ligeramente menor que la proteína de fusión 6-histidina-RGl expresada en bacterias, presuntamente debido a que carece del péptido de fusión.
Ejemplo 7: Tinción inmunohistoquímica de la expresión de RGl en Próstata y Metástasis de Cáncer de Próstata La expresión de la proteína RGl se determinó por LifeSpan Biosciences, Inc. en una variedad de tejidos humanos, incluyendo riñon, pulmón, páncreas, músculo, cerebro y próstata, así como nodulos linfáticos y metástasis ósea. Se obtuvieron tejidos adicionales de próstata del Departamento (de Urología de la Escuela de la Universidad de Stanford y se probaron en Berlex. Las secciones de tejido se despa afinaron usando procedimientos normales. El anticuerpo policlonal RG1-3C se usó como un anticuerpo primario y el sistema de detección consistió del uso del equipo Vector ABC-AP (AK5002) con un equipo de sustrato rojo Vector (Sk5002) . Como un control negativo, la tinción se llevó a cabo en la ausencia del anticuerpo primario. Se examinó la expresión de RG1 en tumor de próstata y tejido normal de próstata a partir de varios pacientes. En todos los casos, se vio fuerte tinción que representa expresión de RG1 en las muestras de tumor de próstata. La expresión de RG-1 varió en el tejido normal de próstata, de casi nada a tinción significativa. La expresión de RG1 también se detectó por inmunohistoquímica en nodulos linfáticos y muestras de hueso que se conoce que contienen metástasis de tumor de próstata. Los nodulos linfáticos normales o hueso no muestran tinción.
Ejemplo 8: Secuenciación de Anticuerpos RG1 Las secuencias de ácido nucleico de dos anticuerpos de RG1 humanos (C y B) generados y purificados como se describe anteriormente en el Ejemplo 4 se determinaron por métodos normales. La secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera B se designó SEQ ID NO: 20 y aquella de la región variable de cadena pesada B es SEQ ID NO: 21. La secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera C se designa SEQ ID NO: 23 y aquella de la región variable de cadena pesada C ,es SEQ ID NO: 24. Las secuencias de aminoácidos, correspondientes, previstas, de estas regiones de cadena variable se determinaron, y se designaron SEQ ID NO: 26 (cadena ligera B) ; SEQ ID NO: 27 (cadena pesada B) ; SEQ ID NO : 29 (cadena ligera C) ; SEQ ID NO: 30 (cadena pesada C) . Ver Figuras 3 y .
Ejemplo 9: Determinación de Constantes de Unión para Anticuerpo de RGl Se determinaron constantes cinéticas (KD, ka y kd) de anticuerpo que se une a proteína RGl nativa por BiAcore usando un formato de captura en el cual la proteína RGl nativa soluble se unió a anticuerpo inmovilizado en un chip sensor. IgGFc anti-humano de conejo de immunoPure (Pierce, 31142) se inmovilizó de manera covalente al Chip Sensor CM5 (Biacore, BR-1000-12) usando métodos normales de acoplamiento a amina. Se usaron a 5 ul/min 100 ug/ml de anticuerpo diluido en acetato 10 mm. Se usó HBS-EP (Biacore, BR-1001-88) como la fase móvil. Los sitios sin reaccionar se bloquearon con etanolamina. Se diluyeron los anticuerpos a 200 nM con HBS y se inyectaron 50 ul por ciclo a 10 ul/min. Se dieron diluciones en serie de BHK-RG1 (12.5 - 400 nM) al anticuerpo inmobilizado . Se midieron las cinéticas de disociación inmediatamente después de que se completó la inyección de antígeno a 20 ul/min durante 8 minutos. La superficie se regeneró después de cada ciclo usando 25 ul de glicina 10 mm, pH 1.8 y luego se lavó con HBS. Típicamente, se corrieron cinco concentraciones y un control de medio. Los datos se- ajustaron a un modelo Langmuir 1 : 1 usando el programa proporcionado por el fabricante del instrumento (BIAevaluation 3.0), y se calcularon las constantes cinéticas. Las constantes de equilibrio estuvieron en el intervalo nanomolar con velocidades de disociación favorables (10~4 s_1) . La Tabla 1 muestra las constantes cinéticas para cuatro de los anticuerpos humanos.
Tabla 1 Constantes Cinéticas de anticuerpos RG-1 humanos A, B, C y D. Las constantes cinéticas para estos anticuerpos se determinaron al ajustar un modelo de Langmuir 1:1 a los datos obtenidos del estudio de BiAcore . a: velocidad de asociación (1/s) : kd: velocidad de disociación (1/s) , kD: afinidad (M) M ab Ka (1/M s) ¾ (1/s) KD (M) A 2 .3 x 104 1.9 x 1CT4 £ 5-9 x 10'9 B 2 .9 x 104 2.3 x 1CT4 E S .4 x 10"9 C 2 .5 x 104 8-4 x 1CT4 . 3 .36 x 1CT8 D 3. 17 x 104 2.95 x 10~3 9 -27 X 1CT8 Ejemplo 10: Radiomarcado de Anticuerpos de RGl Conjugación de quelador de anticuerpos de RGl: El quelador bifuncional p-SCN-Bencil-DTPA (Macrocyclics , Inc.) se unió covalentemente a anticuerpos usando un método adaptado de Mikula et al, Nucí. Med. Biol . , Vol . 22, No. 3, pp. 387-390, 1995. Todos los reactivos y equipo utilizado durante este procedimiento se volvieron libres de metal antes del uso a fin de evitar la inactivación del quelador. Todas las soluciones se prepararon con reactivos de bajo contenido metálico, agua de alta pureza (MilliQ) y Chelex tratado para remover metales traza. Todo el equipo se enjuagó con EDTA 10 mM y luego se enjuagó extensivamente con agua MilliQ. Primero se trataron los anticuerpos purificados (aproximadamente 20 mg) con EDTA 1 mM durante 1 hora a temperatura ambiente para remover cualquier metal antes del intercambio con amortiguador en amortiguador de Carbonato 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8.5 usando columna de desalación Pharmacia 26/10 en un sistema de cromatografía de AKTA. Las fracciones que contienen el anticuerpo se mezclaron y concentraron a aproximadamente 2 mg/ml por ultrafiltración (Centricon 30) . Se preparó de forma reciente una solución concentrada de p-SCN-Bencil-DTPA a 100 mg/ml en DMSO anhidro. Se usó un exceso molar de 50-100 veces de DTPA en la reacción de conjugación, que permitió proseguir durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción entonces se intercambio con amortiguador en acetato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6.5 (Amortiguador de Radiomarcación) y se concentró a al menos 3 mg/ml por ultrafiltración . Los conjugados de anticuerpo fueron estables en este amortiguador durante semanas a 4°C. Se determinó la concentración de proteína por BCA y se verificó la actividad de unión a antigeno por ELISA. Radiomarcación de anticuerpos de RG1.· Se radiomarcaron anticuerpos conjugados a DTPA con 90Y o 111In, bajo condiciones libres de metal, para el uso en estudios in vivo en animales que tienen tumor. Típicamente, se mezclaron 10 mg del conjugado de anticuerpo con 10 mCi de [90Y] Cl3 o [li:Lln] Cl3 (PerkinElmer Life Sciences) durante 1 hora a temperatura ambiente con mezclado suave por atrás protección pesada. Se adicionó EDTA a 1 mM y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se corrió sobre una columna de Desalación Pharmacia 26/10, que se ha puesto en pre-equilibrio en PBS libre de metal, a fin de separar el anticuerpo radiomarcado de 90Y no unido y para intercambiar amortiguador. Se recolectaron fracciones de un mi que contienen el anticuerpo. Se determinó la concentración de proteína por BCA. Se determinó la radioactividad total en una muestra de 1 ul usando un contador de escintillación líquida para 90Y o un contador gamma para i:L1In. Se calculó la actividad específica como mCi por mg de proteina y varió típicamente de 0.25 a 1.0 mCi/mg. Se determinó la pureza radiológica por cromatografía de capa delgada instantánea (ITLC) de acuerdo a Nikula et al, Nucí, Med. Biol. 22:387-390, 1995. Típicamente, más del 98 % de la radioactividad se asoció con la proteína. Se determinó la actividad de un nuevo antígeno del readioconjugado por ELISA contra una norma de anticuerpo no conjugado (conjugado de 90Y) , o usando un ensayo de unión radioinmunológico de fase sólida en proteína RG1 inmovilizada (conjugados de li:LIn) . En todos los casos, la unión de antígeno de los radioconj ugados fue indistinguible de aquella del anticuerpo no conjugado.
Ejemplo 11: Acumulación Específica en Tumor de Anticuerpos de RG1 Marcados con In Se establecieron xenoinjertos de tumor inyección s.c. de IxlCT7 células LNCaP en matrigel en el flanco de ratones desnudos atímicos machos de 5-6 semanas de edad. Se realizaron estudios de biodistribución cuando los tumores alcanzaron un volumen de 150-400 mm3 (aproximadamente 4-6 semanas después de la inoculación de células de tumor) . Los anticuerpos de RGl humanos marcados con X11ln (C, B, A) y anticuerpo de control IgGx humano no específico (actividades específicas, 0.3mCi/mg) se administraron en forma intravenosa en cuatro grupos de 12 ratones que tienen xernoin ertos LNCaP. Se extrajo sangre de ratones por punción cardiaca antes de la disección. La sangre, el tumor y todos los órganos principales se removieron, se pesaron en una balanza analítica, y se contó la radioactividad en un contador gamma. Se determinó la depuración del cuerpo completo al sumar la radioac ividad medida en sangre, órganos individuales, y en el resto del animal muerto. Todos los datos se corrigieron para la descomposición del radioisótopo. Los resultados se expresaron como porcentajes de dosis inyectada por gramo de tejido. Los anticuerpos específicos de RGl muestran una alta acumulación específica del tumor (Ver Figura 1) .
Ejemplo 12: Inhibición de Crecimiento de Tumor con Anticuerpos de RGl marcados con 90Y Se establecieron xenoin ertos de tumor por inoculación S.C. de lxlO"7 células LNCaP en matrigel en el flanco de ratones atímicos machos de 5-6 semanas de edad. El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron un volumen de 50-350 mm3 (5 semanas después de la inoculación) de células de tumor. Los animales que tienen tumor se distribuyeron uniformemente en cuatro grupos de tratamiento (n = 13/grupo) . Se administró una inyección i.p. individual del anticuerpo radiomarcado B, B , e IgGi no específica (125 µ<_!?/animal) en ratones que tienen xenoinjertos de LNCaP. El cuarto grupo de tratamiento se debió a una inyección i.p. de solución salina. El efecto de los anticuerpos específicos de RG1 marcado con 90Y en el crecimiento de tumores derivados de LNCaP se monitorizó durante 32 días después de la inyección. En su momento, los animales se sacrificaron y los tumores se tomaron y pesaron. Se determinó el estado de salud al monitorizar el peso corporal. Una administración individual de anticuerpos de RG1 humanos específicos marcados con 90Y produjo una inhibición significativa del crecimiento de tumor en comparación a los resultados vistos en animales inyectados con anticuerpo no específico marcado con 90Y o el control con vehículo (Ver Figura 2) .
Ejemplo 13: Clonación y Expresión de Anticuerpos de RG1 en Células CHO utagénesis : Se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio del ADNc tipo silvestre que codifica para regiones variables del anticuerpo B y C anti-RGl para generar alotipos que se expresan más -frecuentemente en humanos . El método de Mutagénesis dirigido a múltiples sitios QuickChange® (Stratagene) se usó para llevar a cabo la mutagénesis con TOPO/BVH y TOPO/CHV (Medarex) como plantillas. Los cebadores (GGGGAGGCTTGGTACAACCTGGGGGGTCCCTGAG; SEO ID NO: 14) y (GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAG; SEQ ID NO: 15) se usaron para introducir las mutaciones puntuales H13Q, M90T y M92V en B ADNv (BW 3m) ; y H13Q, M90T en C ADNc (CVH_2m) . Las mutaciones se confirmaron por análisis de secuencia de ADN y dieron por resultado regiones variables de cadena pesada mutantes consecuencias de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 25, respectivamente. Las secuencias previstas de aminoácidos para estas dos regiones variables de cadena pesada se dieron por SEQ ID NO: 28 y 31, respectivamente. Construcción de vectores de expresión: El vector de expresión de pIE_SRylfa (Medarex) contiene ADNc que codifican para las regiones CH y CL de IgGl humana (haplotipo fa) y las cadenas kappa, respectivamente. Para permitir la floración en cuadro de las regiones variables de cadena ligera B y C en pIE SRylfa fue, el par de cebadores BVK_F (GGGAAGCTTGCCACCATGGAAACCCCAGCG; SEQ ID NO: 16) y BVK R (CAGTCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCC; SEQ ID NO: 17) se usó para introducir sitios HindIIl/Bsiw compatibles (subrayados) en los extremos 5' y 3', respectivamente, de los ADNc de BV1 y CVL. Los ADNc de VL generados por PCR, resultantes, se clonaron en el sitio Hindll/Bsiw de pIE_SRylfa para crear pIE/BVL y CVL. Se usó la misma estrategia para construir fusiones VH en cuadro (que incluyen BVH, BVH_3m, CVH y CVH_2m) en pIE/BVL y CVL. EN forma breve, el par de cebadores CVH_F (GTCAGGATGCGGCCGCCACCATGGAGTTTGTGCTGAGCT; SEQ ID NO: 18) y CVH_R (ACCGATGGGCCCTTGGTGGA; SEQ ID NO: 19) se usó para introducir sitios Notl/Apal en los extremos del ADNc de VH amplificado por PCR. Los productos de PCR se digirieron con Notl/Apal y se insertaron en la dirección 5 de la región CH de pIE/BL y pIE/CVL asegurando que las regiones VH estuvieran en cuadro con la región CH en los respectivos derivados de pIE. Las construcciones finales se nombraron pIE/B, pIE/B_3m, pIE/C y pIE/C_2m. Todos los insertos se insertos se han verificado por análisis de secuencia de ADN. Transfección y selección/amplificación de células DG44 y DXB11. Aproximadamente 4 x 10s DG 4 y DXB11 complementadas con medio F12 y FCS al 5 % se colocaron en cajas P100 un día antes de la transfección. Se llevaron a cabo transfecciones usando Lipfectamine 2000 (Invitrogen) y 24 ug de ADN de plásmido linealizado (pIE/B_3m o pIE/C_2m) /P100. El medio se cambio 4 horas después de la transfección. Se aplicaron condiciones selectivas aproximadamente 24 horas después de la transfección. Se llevó a cabo primero la selección con el medido MEM que contiene FBS dializado al 5 %, L-glutamina 2mM y G418 (400ug/ml) , pero que carece de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos . Alcanzando una confluencia de aproximadamente 90 %, las células se dividieron en discos P100 4x y se co-seleccionaron con G418 más metotrexato a varias concentraciones. Después de una semana, las células supervivientes se cebaron en placas de 96 cavidades a 100 células/placa en la presencia de medio de co-selecció . Los clones supervivientes se seleccionaron por ELISA para la expresión de anticuerpo recombinante . El número de copia génico de 10 clones que exhiben los niveles más altos de expresión se amplificó por sección consecutiva en la presencia de concentraciones crecientes de metotrexato y los clones elegidos se adaptaron al medio libre de suero para preparación de un banco principal de células. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se comparan de este modo por referencia. En tanto que la presente invención se ha descrito con referencia a modalidades específicas de la misma, se debe entender por aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varios cambios y equivalentes pueden ser sustituidos sin apartarse del espíritu y el alcance verdadero de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación particular, material particular, composición de materia, proceso, paso o pasos de proceso, al espíritu y alcance objetivo de la presente invención. Todas estas modificaciones se propone que estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas a la presente.

Claims (36)

  1. REIVINDICACIONES 1. Anticuerpo humano aislado, o fragmento de anticuerpo de unión antigeno del mismo, o una variante del mismo, que se une de manera específica a un epitope presente en un polipéptido RG1. 2. Anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión antígeno según la reivindicación 1, en donde el polipéptido RG1 al cuál se une tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO :
  2. 2.
  3. 3. Anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión antígeno, según la reivindicación 1, en donde la unión al polipéptido RG1 se presenta con una a KD igual a o menor que 1 uM.
  4. 4. Anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión antígeno, según la reivindicación 3, en donde en donde la unión al polipéptido RG1 se presenta con una a KD igual a o menor que 10 nM .
  5. 5. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de frecuencia con SED ID NO: 26 ó SEQ ID NO: 29.
  6. 6. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia ' de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO: 30, Ó SEQ ID NO: 31.
  7. 7. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 23.
  8. 8. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 24, ó SEQ ID NO: 25.
  9. 9. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27 ó SEQ ID NO: 28.
  10. 10. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 30 ó SEQ ID NO: 31.
  11. 11. Anticuerpo según la reivindicación 9, en donde la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27.
  12. 12. Anticuerpo según la reivindicación 9, en donde la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28.
  13. 13. Anticuerpo según la reivindicación 10, en donde la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30.
  14. 14. Anticuerpo según la reivindicación 10, en donde la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 31.
  15. 15. Anticuerpo que reconoce y se une al mismo epítope como el epitope unido por el anticuerpo de la reivindicación 9.
  16. 16. Anticuerpo que reconoce y se une al mismo epítope como el epítope unido por el anticuerpo de la reivindicación 10.
  17. 17. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el fragmento de anticuerpo se selepciona de un grupo de fragmentos que consiste de Fv, F(ab')2, scFv, fragmentos de minicuerpo y día-cuerpo.
  18. 18. Inmunocon ugado que comprende el anticuerpo monoclonal humano o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta conjugado a una molécula que es un agente terapéutico o un marcador detectable.
  19. 19. Inmunoconjugado según la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico es un agente citotoxico.
  20. 20. Inmunoconjugado según la reivindicación 19, en donde el agente citotoxico se selecciona del grupo que consiste de ricino, doxorrubicina, daunorrubicina, TaxolMR (paclitaxel) bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colguicina, dihidroxi- antracina-diona, actinomicina D, toxina de difteria, exotoxina de pseudomonas (PE) A, PE40, ricino abrin, 5 glucocorticoide y radioisótopos.
  21. 21. Inmunocon ugado según la reivindicación 20, en donde el agente citotóxico es un radioisótopo y se selecciona de un grupo que consiste de SSc, 47Sc, 48Sc, 72Ga, 73Ga, 90Y, 67Cu, 109Pd, 21Ag, 149Pm, 153Sm, 16SHo, 177Lu, 18S e, 211At, 211Bi, 212Bi, 213Bi, y 214Bi. 10
  22. 22. Inmunoconjugado según la reivindicación 18, en donde el marcador detectable es una radiomarca, de una enzima, un cromóforo, o un florecedor.
  23. 23. Inmunoconjugado según la reivindicación 22, en donde el marcador detectable es una radiomarca y se 15 selecciona del grupo que consiste 43Sc, 44Sc, 52Fe, S5Co, S8Ga, e4Cu, 8SY, 94mTc, mIn, y 99mTc .
  24. 24. Inmunoconjugado según la reivindicación 18, en donde la conjugación del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, con el agente terapéutico o marcador detectable o n utiliza un quelador seleccionado del grupo que consiste de p-SCN-Bencil-DPTA y derivado del mismo, ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-N, N', N' ' , N1 ' ' -tetracético (DOTA) y derivados del mismo, y ácido 1 , 4·, 7-triazaciclononano-N, 1, 1 ' -triacético (NOTA) y derivado del mismo. 5
  25. 25. Inmunoconjugado según la reivindicación 24, en donde el quelador usado es ciclohexil-DTPA (CHX-A ' ' -DTPA) o MX-DTPA (1B4M-DTPA) .
  26. 26. Método para destruir selectivamente . una célula que expresa un polipéptido RGl humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que comprende hacer reaccionar el inmunoconjugado de la reivindicación 20 con la célula tal que se destruya la célula.
  27. 27. Método para tratar un estado de enfermedad en un paciente humano, en donde el estado de enfermedad se asocia con la expresión de un polipéptido de RGl que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del inmunoconjugado de la reivindicación 19.
  28. 28. Método según la reivindicación 27, en donde el agente terapéutico del inmunoconj ugado es 90Y o 177Lu.
  29. 29. Método según la reivindicación 27, en donde el estado de enfermedad es cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer ovárico o cáncer colorrectal .
  30. 30. Método para detectar un estado de enfermedad en un sujeto, en donde el estado de enfermedad se asocia con la expresión de un polipéptido RGl que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y en donde el método comprende: (a) administrar al sujeto e inmunoconjugado de la reivindicación 22; (b) detectar la unión del inmunoconjugado dentro del sujeto; (c) determinar si el nivel de unión del inmunoconj ugado del sujeto se incrementa en comparación con el nivel de unión detectado en los sujetos de control libre de enfermedad.
  31. 31. Método según la reivindicación 30, en donde el método de detección es inmunoescintigrafía .
  32. 32. Método según la reivindicación 31, en donde el marcador detectable del inmunoconj ugado es ???1?? o 99mTc .
  33. 33. Método según la reivindicación 32, en donde el método de detección es tomografía de emisión de positrones.
  34. 34. Método según la reivindicación 33, en donde el marcador detectable del inmunoconj ugado se selecciona de un grupo que consiste de 3Sc, 4Sc, 52Fe, 55Co, S8Ga, S Cu, 8£Y o S4mTc _
  35. 35. Método según la reivindicación 34, en donde el estado dependerá es cáncer.
  36. 36. Método según la reivindicación 35, en donde el cáncer es cáncer de próstata.
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