TWI353992B - Rg1 antibodies and uses thereof - Google Patents

Rg1 antibodies and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
TWI353992B
TWI353992B TW93121655A TW93121655A TWI353992B TW I353992 B TWI353992 B TW I353992B TW 93121655 A TW93121655 A TW 93121655A TW 93121655 A TW93121655 A TW 93121655A TW I353992 B TWI353992 B TW I353992B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
TW93121655A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200510459A (en
Inventor
Richard Harkins
Deborah Parkes
Gordon Parry
Renate Parry
Douglas Schneider
Original Assignee
Schering Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34102813&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI353992(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Schering Ag filed Critical Schering Ag
Publication of TW200510459A publication Critical patent/TW200510459A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI353992B publication Critical patent/TWI353992B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

1353992 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於針對多肽RG1之新穎抗體，該RG1係優先表 現於前列腺腫瘤細胞及其他腫瘤細胞中。詳言之，本發明 係關於此等抗體用於治療及债測癌症及癌轉移之用途。 【先前技術】 前列腺癌是男性常發生的疾病，因為約有三分之一年齡 超過45歲的男性發現罹患前列腺癌。有證據顯示係遺傳及
環k兩種原因所造成，而大多數病例是兩個因素結合所造 成的結果。家族性癌症研究業已推論遺傳傾向性在約5_1〇% 所有前列腺癌上有作用，且在約45%55歲以下男性之前列 腺癌上有作用。
有證據證明，前列腺癌是以多階段疾病方式發展的，其 中前驅病變之一是前列腺上皮内瘤形成（pas· in=aepitheiial neopUsia ; PIN)。該疾病早期階段是男性荷 爾蒙依賴性的，而後期階段則不依賴荷爾蒙。已知為良性 前列腺增生的前列腺增生失調症在臨床上常常被偵測到， 但可能不是在癌症發展中的階段，然而，其通常係與前列 腺癌有關聯性。發生在前列腺的癌症通常為多病灶性的， -般而言成長緩慢，且為異質性。後期階段癌症常常會轉 移至淋巴結及骨路。 前列腺癌通常係藉由身體檢查及藉由血清中前列腺特異 抗原(PSA)含量加以診斷的。徹底前列腺切除術(radical prosmeetcmy)是治療局部化疾病的選項。末期轉移症目前 94497-990305.doc ===除術或GnRH(促性腺激素釋故激素)治療所 療。辦而，2荷爾蒙療法及藉由抗男性荷爾蒙療法來治 且幾乎總是會變成對荷爾蒙具有抗性， 切㈣丁性的疾病。除此之外，存在與徹底前列腺 作用勺括：荷爾蒙療法相關之嚴重副作用，此等副 陽二二f與徹底前列腺切除術相關之高風險失禁與 、抑制男性荷爾蒙療法相關之骨折與骨質疏鬆症。 ’極需針對早期及晚期前列腺癌二者的新 7亦明顯需要新診斷藥劑’因為其會明顯影響治療的選 ;。例如’若疾病已發展到前列腺之外且已轉移至淋巴結， 二不採用徹底前列腺切除術，因為該療法對惡化的疾病沒 效果’但卻具有顯著非吾人所樂見之副作用。可積測活 體内轉移的藥劑是具有重要價值。 特異蛋白質表現的變化業已在前列腺癌中得到證實，包 括後期前列腺癌之異常p53表現、TGF_P受體含量之降低， ^黏附蛋白（E-cadherin)、c_Cam(細胞黏附分子）及數種整 D素（lntegnn)含直之降低。致癌基因bcl_&表現在後期男 性荷爾蒙獨立型腫瘤中會劇烈上升，且表現高含量⑷患 者的預後相對較差。雖然前述基因表現之變化有良好文獻 記錄’但尚未證實基因表現的變化為引起疾病之原因。因 此’識別出其表現與前列腺腫瘤之存在或發展有關之新蛋 白質是有用的，其可作為針對前列腺癌診斷及治療之組合 物的分子目標。 夕肽RG1(參看美國專利第5,871，969號）是 94497-990305.doc 1353992 ?-50〇11£^11家族之同質物，其係胞外基質蛋白質。尺〇1多肽 經證明可高度表現在前列腺組織中（參看WO 98/45442)，且 應作為用以診斷及治療前列腺癌及其他表現RG1多肽之癌 症的有用標的物。 【發明内容】 本發明提供針對RG1多肽具有高度選擇性之抗體或其鍵 結-抗原之抗體片段、或其變體，該等可用於偵測與RG1表 現相關病狀（諸如前列腺癌、腎癌、結腸癌或卵巢癌）之偵測 方法及此等病狀之治療。 為此，本發明一目的為提供可特異性地結合至存在於 RG1多肽中之抗原決定部位（SEQ ID NO:2)的經分離抗體或 其鍵結-抗原之抗體片段或其變體。特佳者係以小於或等於 1 μΜ、更佳者小於或等於100 Nm，且最佳者小於或等於10 nM之解離常數（KD)而結合至RG1多肽之抗原決定部位的人 類抗體。 根據本發明進一步之較佳實施例係提供經分離抗體及其 鍵結-抗原之抗體片段，其包括含有SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:29胺基酸序列之輕鏈可變區。
本發明亦提供經分離抗體及其鍵結-抗原之抗體片段，其 包括含有 SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30 或 SEQ ID NO:31胺基酸序列之重鏈可變區。特佳實施例為人 類抗體，其包含具有SEQ ID NO:26胺基酸序列之輕鏈可變 區，及具有EQIDNO:27或SEQIDNO:2 8胺基酸序列之重鏈 可變區。另一特佳實施例為人類抗體，其包含具有SEQ ID 94497-990305.doc 1353992 N〇·29胺基酸序列之輕鏈可變區，及具有SEQ ID NO:30或 SEQ ID NO.31胺基酸序列之重鏈可變區。 在本發明進一步之態樣中，具有與前述胺基酸序列80% 致的胺基酸序列之輕鏈可變區及重鏈可變區亦涵蓋在 内。 本發明亦提供編竭前述抗體輕鏈及重鏈可變區之核苷酸 序列。較佳者為包括藉由包含SEQ ID ΝΟ:20或SEQ U N0.23核芽酸序列編碼之輕鏈可變區的抗體。同樣較佳者為
c 括藉由包含 SEQ ID N〇:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID 或SEQ IDNO:25核苷酸序列編碼之重鏈可變區的抗體。
根據本發明此態樣之特定較佳實施例，該等抗體係經共 輛至可制標記，以作為投藥至試管中細胞、活體外細胎 及活體内細胞或投藥至多細胞機體之診斷劑。特佳者係與 放射性標記、酵素、發色團、螢光劑共軛之抗體。特佳偵 測方法為免疫閃爍掃描法及正子放射斷層攝影術，其中免 疫閃爍掃描法所用之抗體係與放射性同位素（例如⑴匕或 Tc)共軛，或正子放射斷層攝影術所用之抗體係與43心、 44Sc、52Fe、55C〇, 68Ga、“Cu、，或 94mTc共軛。 在本發明另一態樣中係提供與例如M麻蛋白或放射性同 位素之治療劑共軛之抗體’其係用於投藥至試管内細胞、 活體外細胞及活體内細胞或投藥至多細胞有機體。有^於 此’較佳者為具有細胞毒性的治療劑。特佳治療劑為與放 射性同位素（例如9吟及177LU)共軛之抗體。在關於此2特定 較佳實施例係投與人類患者此等共軛抗體，以治療具有^ 94497-990305.doc ¥ 1353992 由RG1表現為特徵之病狀，例如前列腺癌及詳言之，為 末期轉移性前列腺癌。 本發明另一態樣係RG1抗體或其結合抗原片段與可偵測 標記或細胞毒素劑之共軛作用可藉由使用選自由下列各物 組成之群的螯合劑來完成二對_SCN•节基_DTpA及其衍生 物，1，4,7，1〇-四氮雜環十二烷_队：^，，;^"，;^,"_四乙酸（1)〇丁八） 及其衍生物，及1，4,7-三氮環壬炫_n,N，,N"-四乙酸（ΝΟΤΑ) 及其衍生物。 本發明另一態樣係治療與R G丨多肽表現相關病狀（例如前 列腺癌）之方法，其係使用本發明免疫共軛物。 本發明另一態樣係偵測與RG1多肽表現相關病狀（例如前 列腺癌）之方法，其係使用本發明免疫共扼物。 本發明另一態樣係提供肽及抗個體基因型抗體，其可用 以刺激免疫反應。 熟習此項技術者從下文所描述者可容易地瞭解本發明其 它目的 '特徵、優勢及態樣。但是應當瞭解，下文所描述 及特定實施例在指示本發明較佳實施例時僅以說明之方式 給出。热習此項技術者閱讀下文所描述及本發明其它部分 將可輕易地瞭解本發明精神及範疇内的各種變化及修改。 【實施方式】 / 定義 如同本專利說明書、實例及附加之申請專利範圍中所使 用’除非另有不同說法’否則下列術語具有經指示的含義。 Vg7"係指具有SEQ m N〇:1中所示序列之聚核苦酸及編 94497-990305.doc 1353992 碼具有SEQ ID N0:2中所示RG1胺基酸序列之多肽的聚核 苷酸；及係指編碼RG1變體、衍生物及片段及變體與衍生 物之片段的聚核苷酸。亦係指由RNA組成此類聚核苷 酸，以及係指編碼SEQ ID NO: 2中所示多肽序列的聚核苦酸 之補碼（complement)的聚核普酸。 "RG1"係指具有SEQ ID NO:2中所示胺基酸序列的多肽、 其變體及衍生物，以及SEQ ID NO:2之片段、其變體及衍生 物。當關連到SEQ ID NO:2多肽時之術語"變體"、··片段，'及 "衍生物"意指為本質上保有與SEq ID NO:2之多肽相同的 生物及/或免疫活性之多肽。 生物活性係指自然存在的RG 1多肽之結構性、調節性或 生化性功能。 "免疫活性”係指（1)自然、重組或合成RG丨或其任意片段 在適當動物或細胞中可引發特定免疫反應及與特定抗體結 合之能力，或（2)RG1抗體在活體内與尺⑴結合及引發尺⑴ 表現組織或腫瘤之增強細胞免疫反應的能力。 ”自然存在之RG1"係指未經基因工程設計之人體細胞所 產生之RG1，且特定地涵蓋各種起源於多肽之轉譯後改質 的RG1形式，其中改質包括（但不限於）乙醯化、羧化、糖基 化、填酸化、脂化、醯化及裂解。 "天然RG1或"nRGl”係指為其天然構型之RG1。 "聚核苷酸"通常係指任何聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核 苷酸，其可為未經改質之RNA或DNA，或經改質之rna或 DNA。因此，舉例而古，士垂μ 去化m J叩。，本專利說明書所用之聚核苷酸尤 94497-990305.doc 1353992 其係指單股及雙股DNA、單股及雙股區之混合DNA、單股 及雙股RNA，及單股及雙股區之混合RNA，包含單股、或 更通常為雙股、或單股與雙股區混合的DNA及RNA之雜交 分子。此外，本專利說明書所用之聚核苷酸係指包含RN A 或DNA或RNA及DNA兩者的三股區域。此等區域之股可源 " 自相同分子或不同分子。該等區域包括所有一或多種分 子，但更通常僅涉及一區域之若干分子。三螺旋區域其中 之一的分子通常為寡核苷酸。 # 如本專利說明書所用之術語'’聚核苷酸"包括前述DNA或 RN A，其包含一或多種改質驗基（modified base)。因此，具 有為穩定性或其它原因而經改質之主鏈的DNA或RNA係為 本專利說明書術語所指之”聚核苷酸”。此外，包含奇特鹼 基（例如肌苷）或改質鹼基（例如經氚標記之鹼基）之DNA或 RNA為本專利說明術語所指之聚核苷酸（僅舉出兩個實例）。 應瞭解，為了諸多熟習此項技術者所知之目的，對DNA 及RNA已作出各式各樣的改質。本專利說明書採用術語”聚 I 核苷酸”包含此等以化學性、酵素性或新陳代謝性方式改質 之聚核苷酸形式，以及具有病毒及細胞（包括簡單及複雜細 胞）中DNA及RNA特性之化學形式。 "寡核苷酸”係指相對較短之聚核苷酸，通常該術語係指 單股脫氧核糖核苷酸，但其尤其亦可指單股或雙股核糖核 苷酸、RNA:DNA雜交及雙股DNA。寡核苷酸（例如單股DNA 探針寡核苷酸）通常係藉由化學方法加以合成，例如在自動 化寡核苷酸合成儀上所進行之方法。但是，寡核苷酸可藉 94497-990305.doc 12 1353992 由各種其它方法來製得，包括試管内f組DNA介導之技 術，及藉由DNA在細胞及組織中之表現。"寡核苦酸"或 聚物"或聚核㈣"片段·，、，，部分"’或"片段"係指至少約1〇 個核㈣及至多60個核㈣之聚料酸序列，較佳為約Η 至30個核苷酸，且更佳為約2〇_25個核苷酸。 如本專利說明書所用之”多肽”包括下述所有的多肽。多 肽之基本結構在此項技術十為吾人所熟知且已描述於益數 教科書及其它出版物中。在本專利說明書，本文中該術語 係指任何包含兩或多個經.由肽鍵在直鏈中彼此接合之胺基 酸的肽或蛋白質。如本文所使用，該術語係指短鏈（在此項 技術中其通常亦稱為’例如，肽、寡聚肽及寡聚物）及較長 鏈（此項技術中其一般稱為蛋白質，具有多種類型）中之兩 者0 咸應瞭解，多肽常常含有常稱為2〇自然存在胺基酸之2〇 胺基酸以外的胺基酸，及在特定胺基酸中經改質之諸多胺 基酸（其係藉由例如糖基化及其它轉譯後改質之自然方法 或者藉由此項技術中熟知之化學改質技術來進行）。普通性 改質包括糖基化、脂附著、硫酸鹽化、縠胺酸殘基之丫_羧 化，羥基化及ADP-核糖基化，且此等及其它方法描述於大 多數基本教材中，例如，I E. Creight〇n，Pr〇teins Structure and Molecular Properties, ^ 2 > W.H. Freeman and Company,
New York，1993。許多關於此主題的詳細評論是公開可取得 的’例如1Wo\d,K 之 Posttranslational Covalent Modification B. C· Johnson編著，Academic Press，New York, 94497-990305.doc -13- 第 1-12頁，1983; Seifter等人，Meth. Enzymol. 182: 626-646, 及 專 k ’ pr〇tein Synthesis: Posttranslational
Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992中所提供者。 咸應瞭解，一如吾人所熟知且如前述，多肽並非總是完 全直鏈的。例如，多肽可因為泛素化作用（ubiquitinati〇n) 而具有支鏈，且其通常會因為轉譯後情況（包括自然發生情 況及因人為處理所引起的非自然發生情況）而成為具有或 不具有支鏈的環。環狀多肽、具支鏈多肽及具支鏈之環狀 多肽可藉由非轉譯自然方法及藉由完整性合成方法加以合 成。 改質可以發生在多肽中的任意位置，包括肽主鏈、胺基 酸側鍵及胺基或缓基終端。實際上，以共價方式改質而封 阻多肽中胺基或羧基或兩者在自然存在之多肽及合成多肽 中是常見的，且此等改質作用亦可存在於本發明多肽中。 例如，於五_ co/z·中蛋白水解過程之前所製得之多肽的胺基 終端殘基幾乎總是為N-甲醯曱硫胺酸。 出現於多肽中之改質作用通常具有的功能是視其如何製 得。對於（例如）藉由在宿主中表現選殖基因而製得之多肽而 言，改質之性質及程度大部分將取決於宿主細胞轉譯後改 貝旎力及存在於多肽胺基酸序列中之改質訊號。例如，如 吾人所熟知，糖基化作用常常不會出現在細菌宿主（例如[ ⑺⑺中。據此，當糖基化作用有需要時，多肽應在可進行 糖基化的宿主中表現’ it常是真核細胞。昆蟲細胞常會執 94497-990305.doc 14 1353992 行與哺乳動物細胞相同之轉譯後糖基化作用，且因此，業 已發展出昆蟲細胞表現系統.，以有效地表現出其中具有天 然樣式的糖基化哺乳動物蛋白質。類似的考量應用至其他 的改質作用。 一般而言，如本文所使用，多肽一詞涵蓋所有該等改質， 特別是這些存在於藉由在宿主細胞表現出聚核苷酸所合成 之多肽的改質。 "衍生物"係指分別衍生自自然存在之、RG1或源於結 合抗體之RG1的聚核苷酸或多肽’其係藉由化學方式改 質，例如泛素化、標記（例如，以放射性核、各種以酵素方 式的改質作用）、聚乙二醇化（pegylati〇n)(藉由聚乙二醇進 行之衍生作用）或藉由插入或取代’例如烏胺酸之胺基酸（或 取代編碼例如胺基酸的核苷酸）來實現，其通常不會發生於 人類蛋白質中。 如本文所使用之，|編碼多肽之聚核苷酸，，涵蓋包括編媽本 發明多肽序列的聚核苷酸，尤其是具有SEq ID n〇:2所示胺 基酸序列的RG1多肽。該術語涵蓋包括編碼多肽之單獨連 續區或非連續區（例如’被内含子中斷;)及額外之區的聚核苷 酸。 多肽"片段"、”部分"，或，，片段，|為一段至少約5個胺基酸 之胺基酸殘基’通常為至少約7個胺基酸，典型為至少約9 至13個胺基酸’且在各種實施例申為至少約丨7個或更多胺 基酸。”片段"係指具有與前述RG1多肽或RG1之抗體及其變 體或衍生物之胺基酸序列部分（但並非全部）完全相同之胺 94497-990305.doc 15 1353992 基酸序列的多肽。 將"缺失（deletion)疋義為聚核皆酸或胺基酸序列之任一 者中之變化’其中分別缺少一或多個聚核苷酸或胺基酸殘 基。 "插入（insertion)”或"加成（addition)，，係導致分別加成一 或多個聚核苷酸或胺基酸殘基的聚核苷酸或胺基酸序列與 自然存在之聚核皆酸或胺基酸序列相比較而言之變化。 "取代”導因於分別以不同的聚核苷酸或胺基酸置換一或 多個聚核苷酸或胺基酸所產生。 如本文所使用之術語聚核苷酸或多肽之"變體”如下文及 本揭示内容之其它地方詳盡描述。 聚核苷酸變體為其中聚核苷酸序列與參考聚核苷酸不同 之聚核苷酸。一般而§，差別是有限的，因此參考聚核苷 酸與變體聚核苦酸序列整體而言非常相似，且在許多區域 是相同的。 變體聚核苷酸序列的改變可能是靜止的。意即，其可能 不會改變由該聚核苷酸所編碼之胺基酸。當改變限於此類 靜止變化時，變體將會編碼與參考聚核苷酸相同的胺基酸 序列之多肽。亦如下所述，變體聚核苷酸序列中的變化可 能會改變由參考聚核苷酸所編碼之多肽的胺基酸序列此 等聚核Μ變化會導致參考序列所編碼之多肽中的胺基酸 產生下文討論之取代、加成、缺失、融合及切斷。 多肽變體為其中胺基酸序列不同於參考多肽之多肽。一 般而言，差別是有限的，因此參考多肽與變體多狀的序列 94497-990305.doc 1353992 在整體而言是非常相似，且在許多區域是相同的。變體多 肽及參考纽之胺基酸序列可能因—或多個取代加成、 缺失、融合及切斷（其可能以存在任 仔在任何組合）而不同。編碼此 等相同或相似多肽之重組變體係藉由使用遺傳密碼中之" 冗餘密碼"加以合成或選擇。可將各種密碼子取代作用（諸 如’可產生各式限制酵素作用位置之靜止變化)引入選殖至 最佳化質粒或病毒載體或特定原核或真核系統中之表現。 亦可引入突變以改質多肽之特性，以改變結合配位體之親 合性、鏈間親合性或多肽退化性或週轉率。 如本文中所討論’本發明所包括之多肽、抗體或免疫球 蛋白分子之胺基酸序列中的次要變化也涵蓋其中，其限制 條件為該胺基酸序列變化維持在原始序列至少8〇%，更加 為至少85%、90%、95%，且最佳為99%。詳言之保守胺 基酸序列之置換涵蓋在内。保守胺基酸置換發生在其側鏈 相聯之胺基酸家族内的置換。基因性編碼之胺基酸通常分 為下列家族：（1)酸性（天門冬胺酸、縠胺酸）；（2)鹼性（賴胺 酸、精胺酸、組胺酸）；（3)非極性（丙胺酸、纈胺酸、亮胺 酸、異亮胺酸'脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸、色胺酸”及 (4)不帶電荷極性（甘胺酸、天冬醯胺酸、縠醯胺、半胱胺酸、 絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸）。更佳之家族為：絲胺酸及蘇胺 酸為脂族經基族；天冬酿胺及縠醯胺為含胺基族；丙胺酸、 顯胺酸、亮胺酸及異亮胺酸為脂族；且苯丙胺酸、色胺酸 及路胺酸為芳香族。例如，合理地認為以異亮胺酸或織胺 酸隔離取代亮胺酸，以穀胺酸取代天門冬胺酸，以絲胺酸 94497-990305.doc 17 1353992 取代蘇胺酸’或以結構上相關聯之胺基酸進行相似胺基酸 取代而不會對所得分子之結合性或特性產生主要影響，特 別是如果該取代並未涉及結構位置内之胺基酸。藉由比較 多狀衍生物與未改質多肽之特異活性，可輕易地確定具有 功此的肽中胺基酸是否有變化。為本發明應用之目的，本 發明涵盍所主張之抗體的變體，其保持低於1 μΜ之對RG1 抗原決定部位之結合親合性（Kd)。 使用下列術語描述兩個或多個以上的聚核苷酸或胺基酸 序列之間的序列關係·"參考序列（referenCe sequence)"、 "比較窗口（comparion window)"、，，序列一致性（sequence identity)”、"序列一致性百分比"、”大體一致性（substantial identity)"、"相似性（simiiarity)"及"同質性（h〇m〇1〇g〇us)" 〇 "參考序列"是作為序列比較基礎之經界定序列；參考序列 可能是較大序列之子集（subset)(例如，一如全長eDNA或序 列列表中給定之基因序列之片段），或可能包含完整cDNA 或基因序列。一般而言’參考序列長度至少丨8個核苷酸或6 個胺基酸’常常長度為至少24個核苷酸或8個胺基酸，且長 度通常至少48個核苷酸或1 6個胺基酸。因為兩個聚核苷酸 或胺基酸序列可能各自（1)包含於兩分子之間相似的序列 (意即完整聚核普酸或胺基酸序列之部分），且（2)可進一步 包含於兩聚核苷酸或胺基酸序列之間分歧的序列，所以兩 (或更多）分子間的序列之比較通常係藉由在"比較窗口 '，上 比較兩分子之序列以識別及比較序列相似性之局部區域來 完成。如本文所使用之"比較窗口 "係指至少1 8個鄰近核苦 f - 94497-990305.doc 1353992 酸位置或6個胺基酸之概念上的片段，其甲聚核苷酸序列或 胺基酸序列可與至少1 8個鄰近核苷酸或6個胺基酸序列之 參考序列比較，且其中比較窗口中之聚核苷酸序列的部分 與參考序列（其不包含加成或缺失）相比可包含20%或更少 之加成、缺失、取代，及類似狀況（意即，中斷）以用於該等 兩個之最佳對準。用來對準比較窗口之最佳對準序列可藉 由Smith及Waterman之局部同源算法（i〇cai homology algorithm) ’ Adv.々?〆 ΜαΑ 2:482(1981)來進行，藉由 Needleman及Wunsch之局部相同算法，j.协/.价〇/. 48:443(1970)來進行’藉由Pears〇n及Lipnian之尋找相似性 方法，JcaiScz.· (U.S.A)85:2444(1988)來進行， 藉由此等算法之計算化執行（Wisconsin遺傳軟體包7.0版 (遺傳 s十算機組，575 Dr.，«，奶）.）中 GAP、 BESTFIT、FASTA及 TFASTA，Geneworks，或 MacVector軟 體包）來進行，或藉由檢測來進行，且選擇由各種方法產生 之最佳對準（意即，產生與比較窗口最高相同百分比）。 術語"序列一致性"意為兩個聚核苷酸或胺基酸序列在比 較窗口上係一致的（意即，以核苷酸-核苷酸或殘基_殘基為 基礎）。術語"序列一致性百分比"係藉由在比較窗口上比較 兩個最佳對準序列來計算，決定兩個序列中出現一致核酸 鹼基（例如A、T、C、G、U或I)或殘基之數目，以得到配對 位置的數目，配對位置數目除以比較窗口之總位置數目（意 即，窗口大小），並將結果乘以100來得到序列—致性百分 比。用於本文之術語”大體一致性"表示聚核苦酸或胺基酸 94497-990305.doc 19 1353992
序列之特徵，其中聚核苷酸或胺基酸包含具有至少85%序 列一致性之序列，較佳至少9〇至95%序列一致性，更通常 至少99%序列一致性，一致性係與參考序列在至少18個核 苷酸（6個胺基酸）位置之比較窗口上，常常係至少24·48個核 苷酸（8-16胺基酸）位置上之比較窗口上比較而得其中序列 一致性百分比藉由比較參考序列與可包括缺失或加成（總 計為比較窗口上參考序列之20%或更少）之序列來計算。該 參考序列可為較大序列之子集。當用於描述多肽時，術語,, 相似性"係藉由將一種多肽之胺基酸序列及保守胺基酸替 代物與第二種多肽序列進行比較來測定。當用於描述聚核 苷酸時，術語，，同質性"係指兩個聚核苷酸或其指定序列引 入適當核苷酸插入或核苷酸缺失時，當最佳對準及比較時 是為一致的，至少70%核苷酸’通常為約75%至99%，且更 佳者至少約98%至99%核苷酸是相同的。
"抗體"或"鍵結-抗原之抗體片段”係指完整抗體或其片 段，其可與元整抗體競带特異性結合。據稱，當解離常數 小於或等於1 μΜ、較佳小於或等於1 〇〇 ηΜ且最佳小於或等 於10 ηΜ時，抗體或鍵結·抗原之抗體片段可特異地與抗原 結合。可藉由熟習此項技術者已知之方法來量測結合力， 一實例為使用BIAcore™工具。抗體片段包含完整抗體之部 分，較佳為完整抗體之抗原結合或可變區。結合片段包括 Fab、Fab1、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單 鏈抗體分子；及自抗體片段形成之多特異性抗體Α. κ Borrebaeck, editor( 1995) Antibody •20- 94497-990305.doc ί 1353992
Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford
University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors(2001) Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)。吾人瞭解，除了 "雙特異性"或"雙功能性"抗體之 外的抗體各個結合位置具有一致性。 "抗原決定部位"包括任意能夠與免疫球蛋白或T細胞受 體特異性結合之蛋白質決定子。抗原決定部位決定子通常 係由具有化學活性之表面分子群（例如胺基酸或糖側鏈）組 成，且通常具有特異性三維結構特徵及荷質比 charge)特徵。若藉由熟習此項技術者熟知方法進行之競爭 結合檢定顯示出-種抗體會與第二種抗體競爭，則稱為兩 種抗體結合相同的抗原決定部位"。 "重組體"或"重組DNA分子"係指非自然存在或藉由將另 /兩個早獨序列片段以人工方式加以組合後所製得之聚核 苷酸序列。"以重组方戎士 、万式生成表不係以人工方式組合，苴 通常係藉由化學人忐古、七斗、p , 八 成方法或藉由人工處理（例如藉由遺傳 工私技術）聚核苷酸之分離 ^ Θ杈术疋成。通常進行此種人工 刼作處理係為以編碼相 換密碼子，料通讀錢之職密碼子來置 執行此處理二4::移除 起，以產生包4通=能的聚㈣酸片段接合在- 合的單—遺傳 *、"令未被發現之所需功能之组 事體。限制酶識別部位、 或其它有用待徵可ά & 5序列、控制序列 選殖選體及表現載# 重，，且DNA分子"包括 載體重组體”亦可指編碼多肽之聚核芽 94497-990305.d( 1353992 酸’並可利用重組DNA技術加以製備β
經分離"意為"藉由人的手"來改變其自然狀態；意即，若 f為自然存在狀況，則其已與其初始環境不同或從、初始 %境中移除’或者兩者。例如’自然存在之聚核苷酸或自 然存在於活動物内的自然狀態之多肽並未，，經分離”，但盥 其自然狀態共存物質分開之相同聚核芽酸為 經分離"的，如用於本文該術語。例如，以聚核㈣ 術語經分離意為該聚核普酸與其自然存在之染色體及細胞 是分開的。聚核㈣及多肽可存在於諸如培養基調配物、 用於將聚核#酸或多W丨人·(例如）細胞之溶液、用於化學反 應或酶反應之組合物或溶液#之例如其料自然存在之組 。物的組合物中，且其中保持屬於本文中所採用該術語之 含義内的分離之聚核苷酸或多肽。 夕，，大體上純淨”及"大體上同質"可交替使用，且係描述汉⑺ 户肽或其片段，或編碼多肽或其片段之聚核苷酸片段，其 中此多肽或聚核苷酸係與其自然伴隨之組份分開。細多 狀或其片段，或編碼多肽或其片段之職片段與其自然狀 態伴隨之天然污染物分開時，其大體上是不含有自然相關 的’且伤目此’以化學合成方式或在細胞系統中合成的多 肽疋不同於其在自然原來細胞所產生者， 不含其自然相關的組份。相似地，以化學方式合成或在細 胞糸統中合成的聚核苷酸是不同於其在自然原來細胞所產 生者’該聚核苷酸大體上是不含其自然相關的組份。 "聚合酶鏈反應"或"PCR"係指一過程，其中dna之特異性. 94497-990305.doc •22· 1353992 部分被擴增，如在頒於1987年7月28日之美國專利號 1^〇.4,683，195中描述。一般而言，需要用到相關或不相關之 多肽片段末端之序列信息，從而設計寡核苷酸引子；此等 引子指向彼此，且與待擴增模板之反向股的序列是一致性 的或相似的。兩引子之5,終端核苷酸與該經擴增物質之末端 是相符。PCR可用於擴增來自基因體DNA、總細胞RNA轉 錄之cDNA、質粒序列等之特異性DNA序列（通常參看Mullis 專尺，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 5V.26、\9们
Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) 〇 M嚴苛性（stringency)"通常發生在Tm(熔點）_5°C (低於探針 之Tm 5。）至低於丁^約2(TC至25°C之範圍内。熟習此項技術者 將瞭解，嚴苛雜交作用可用以識別或偵測相同聚核苷酸序 列’或用以識別或偵測相似或相關之聚核苷酸序列。如本 文所使用’術s吾"嚴苛條件”意指雜交作用僅發生在兩序列 之間同一性達到至少95%及較佳至少97%時。 如本文所使用之”雜交”’應包括"其中聚核苷酸股藉由鹼 基對而與互補股接合之任何程序”（c〇ombs, 乂，似π of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994) 〇 ”治療有效劑量"係指可改善病狀之症狀或病症的多肽或 其抗體、拮抗劑或抑制劑（包括反義分子（antisense m〇iecu⑷ 及核S# (ribozyme))之量。在癌症或其轉移之治療中，當一 劑量使腫瘤或轉移生長減緩或停止，或發現腫瘤或轉移之 尺寸縮小從而引起受檢者壽命延長時，即認為此劑量為治 療上有效劑量。若劑量導致患者總體生活品質之提高（意 94497-990305.doc -23- 1353992 即，緩解痛苦），則亦可認為其為治療上有效劑量。該等化 合物之治療效力及毒性可藉由標準醫藥程序於細胞培養或 實驗動物中測定，例如ED5〇(對50%動物總數具有治療效果 之劑量）及LD^(對50%動物總數之致命劑量）^治療效果及 ’性效果之間的劑量比係治療指數（therapeutic index)，且 其可以比率ED5Q/LD5Q來表現。 如本文所使用"治療"或"療法"涵蓋人類患者病狀之治 療，該病狀包括以RG1含量上升為特徵之病狀，例如前列 腺癌或晚期轉移前列腺癌。 本發明係關於抗體、其鍵結-抗原之抗體片段，及抗體及 片奴之變體，該等可專一性地與RG1多肽結合，尤其係與 具有胺基酸序列SEQIDNO:2之RG1多肽結合。該等抗體可 為（例如）多株抗體或單株抗體，更佳者為單株抗體，仍更佳 者為崁合性抗體或擬人化抗體，且仍更佳者為人類抗體。 本發明所涵蓋之該等抗體、鍵結-抗原之抗體片段及抗體 與片段之變體係以小於或等於1 μΜ之解離常數（尺〇)與11<31 多肽之抗原決定部位結合。更佳者係以小於或等於100 ηΜ 2KD而結合之抗體。最佳者係以小於或等於ι〇 ηΜ之Kd而 結合之抗體。本發明亦涵蓋可辨識且結合於與下述抗體所 結合之抗原決定部位相同之抗原決定部位的抗體，且該抗 體了經由使用熟習此項技術者熟知技術進行之競爭性結合 研究加以測定。 94497-990305.doc -24· 1353992 本發明該等抗體、鍵結-抗原之抗體片段，及抗體及片段 之變體係由輕鏈可變區及重鏈可變區構成。有關於此，本 發明較佳實施例為抗體、其鍵結-抗原之抗體片段或其變 體，包括具有與胺基酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:29 至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%，且仍更佳99% 之序列一致性之輕鏈可變區。同樣較佳實施例為抗體、其 鍵結-抗原之抗體片段或其變體，包括具有與胺基酸序列 SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30 或 SEQ ID NO:31至少80%，更佳至少90%，仍更佳至少95%，且仍更 佳99%之序列一致性之重鏈可變區（參看圖3及4)。 本發明特佳實施例為包含具有經核苷酸序列SEQ ID 1^〇:20及1^〇:23分別編碼之胺基酸序列3£(^1〇]^〇:26或8£(5 ID NO:29之輕鏈可變區的抗體或其鍵結-抗原之抗體片段 或其變體。 同樣特佳者為包含具有選自經核苷酸序列SEQ ID NO:2 1、22、24及25分別編碼之胺基酸序列SEQ ID NO:27、 28、30或31中之一胺基酸序列之重鏈可變區的抗體或其結 合抗原或其變體。 有關於此，特佳者為包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:26 之輕鏈可變區及進一步包含具有胺基酸序列SEQ ID NO :27 或SEQ ID NO:28之重鏈可變區的抗體、其鍵結-抗原之抗體 片段或其變體，及包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:29之輕 鏈可變區及進一步包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:30或 SEQ ID ΝΟ··31之重鏈可變區的第二抗體。 94497-990305.doc -25 - 最佳者為如下之人類抗體、或其鍵結-抗原之抗體片段或 其變體：（a)由具有胺基酸序列SEQIDNO:26之輕鏈可變區 及具有胺基酸序列SEQ ID NO:27之重鏈可變區所組成的抗 體，（b)由具有胺基酸序列SEQ ID NO:26之輕鏈可變區及具 有胺基酸序列或SEQ ID NO:28之重鏈可變區所組成的抗 體，（c)由具有胺基酸序列SEQIDNO:29之輕鏈可變區及具 有胺基酸序列SEQ ID NO:30之重鏈可變區所組成的抗體， 或（d)由具有胺基酸序列SEQ ID NO:29之輕鏈可變區及具 有胺基酸序列或SEQ ID NO:31之重鏈可變區所組成的抗 體。 抗體生成 RG1多肽、片段或衍生物，或表現該等之細胞可作為免 疫原之用，以產生針對其之抗體（Harlow, Cold
Spring Harbor Press, NY(1989))。此項技術中各種已知程序 可用來產生該等抗體及片段（C. A_ K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag) ° 藉由將多肽直接注射至動物或將多肽投與動物（較佳為 非人類）可獲得針對RG1所產生之抗體，如此所獲得之抗體 隨後可與多肽自身結合。以此方式，即使僅編碼該多肽一 片段之序列仍可用以產生與整個天然多肽結合之抗體。該 等抗體隨後可用以從表現該多肽之組織中分離出該多肽。 94497-990305.doc -26- 不需要使用經純化RG1蛋白質或RG1肽以產生RG1抗體的 另一方法係包括"DNA免疫作用”或以細胞為基礎之免疫作 用，其中"DNA免疫作用"係利用編碼RG1之DNA創造出表現 載體或病毒並使用該等表現載體或病毒轉染或感染可表現 RG1之用以產生抗體動物之宿主組織細胞；其中細胞為基 礎之免疫作用係將在試管内所創造可表現RG1的細胞株用 於免疫作用程序。 單株抗體係使用任何可提供以連續細胞株培養產生抗體 的技術來製備。實例包括融合瘤技術（Kohler及Milstein， iVaiwre 256:495-497, 1975)、人類 B細胞融合瘤技術（Kozbor 等人，/mmwno/ogy化心少4:72, 1983)及用以製備人類單株 抗體之EBV融合瘤技術（Cole等人，Mcmoc/owa/ and Alan R. Liss，Inc·, 77-96，1985)。對於使用可表 現RG1細胞株之以細胞為基礎的免疫作用而言，消減免疫 作用可用來使該動物變成對母細胞株具有免疫耐受性 (Sleister, Η. M.及 Rao，A. G.，J. Tmmwno/ogz.ca/ Mei/joA 261:213-220, 2002)。
另外，發展用於”崁合性抗體”之生成，將小鼠抗體基因 接合至人類基因以獲得具有適當抗原特異性及生物活性之 技術亦可使用（Morrison等人，iVoc. iVai/. 5W. USA 81:685 1-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda et al_, 314:452-454，1985)。或者，揭示 用於產生單鏈抗體的技術（美國專利案第4,946,778號）可適 用於產生RG1-特異性之單鏈抗體。 94497-990305.doc -27- 1353992 此外’利用美國專利案第5,877,397及5,569,825號（其以全 文引用方式併入本文）中所描述之方法，或藉由使用
XenomouseTM’如 Mendez等人在 WiMre 15:146-156, 1997中所描述者可用以產生"人類"抗體。此等抗體亦可使 用嗟函體顯示技術產生（Rader等人，Cwrrewi inion in Biotechnology 8:155-168, 1997; Aujame et al., Human 8:155- 168, 1997)。人類抗體的產生非常具有吸 引力’因為該等抗體預期可最小化小鼠或源於小鼠的單株 抗體固有的免疫性及過敏反應。產生可辨識多肽（SEQ ID NO:2)抗原決定部位之人類抗體在實例4中說明。 藉由誘發活體内淋巴球母群體的產生或篩檢出高特異性 結合试劑之重組免疫球蛋白庫或群組亦可產生抗體，如
Orlandi·# 人(TVoc. iVa". 5W. USA 86:3833-3837，1989) 及 Winter與Milstein 349:293-299, 1991)所揭示。 亦可生成含有針對RG1特異性結合位置之抗體片段。通 常’使用抗體片段而非整個抗體是有利的，因為更小尺寸 之片¥又可導致更快速的清除率’且亦可提供較良好進入至 固體腫瘤的方式。 此等片段包括（但不限於）：藉由胃液蛋白酶消化抗體分 子所生成之F(ab’）2片段；及藉由還原p(ab，）2片段之二硫橋鍵 後所生成之Fab片段。或者，建立Fab表現庫，以便快速及 容易識別出具有所要特異性的單株Fab片段（Huse等人， 256:1270-1281，1989)。所有的 Fab、Fv&ScFv 抗體 片《又可在五· 表現且自五.co/z·分泌出來，或者可在各種真 94497-990305.doc -28 ·
1353992 核細胞表現系統中表現，如此可以大量產生此等片段。另 一種方式是，直接從五.C0"回收Fab'-SH片段，並以化學方 式偶合以形成F(ab')2片段（Carter等人，少 10:163-167(1992))。其它用於產生抗體片段之技術為熟習 此項技術者所知。亦可設想出單鏈Fv片段（scFv)、雙功能抗 體、微型抗體及其它工程設計抗體片段（參看美國專利案第 5,5761,894 號及第 5,587,458 號；Hudson 等人， Medicine 9:129-133, 2003)。Fv及sFv片段為具有完整組合 位置（其缺乏恒定區）種類的實例；因此，其在活體内使用期 間，可能會顯示出降低的非特異性結合，且尤其較佳係用 作為顯像劑（C· A. K Borrebaeck，編者（1995)>4«ί/Ζ>ο办 Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001 )Antibody Engine ering(Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)。抗體片段亦可為"線性抗體"，例 如，如美國專利案第5,641，870號中所述。此線性抗體片段 可為單特異性或雙特異性。 本專利說明書亦涵蓋所描述之抗體或抗體片段之變體， 且該等可使用任何保守及非保守突變之技術及準則來製 得，例如美國專利第5,364,934號。變異包括取代、缺失或 插入一或多個編碼該抗體之密碼子，進而導致胺基酸序列 與天然抗體序列比較時發生變化。所涵蓋之此等變異的效 用將包括導致（1)降低對蛋白質水解作用易感性或可藉由氧 化失去活性，（2)形成蛋白質錯合物之結合親合性或對抗原 94497-990305.doc •29- 1353992 的結合親合性之改變，（3)活體内清除或體内分解之改變， (4)抗體同型或異型之變化，（5)抗體之功能特性（例如以受 體結合力）之變化，（6)抗原決定部位序列之改變，以降低或 增加免疫原性’及（7)此等類似物之物理化學或功能特性之 匕變化。最小化胺基酸序列變化數目（介於RG1抗體與同 質性蛋白質抗體間的高度同質性區域）是決定出可插入、取 代或缺失之胺基酸殘基而沒有負面影響所要活性的指引。 所允許之變異係在序列中以系統化方式進行插入、缺失或 取代胺基酸’並測試所得變體針對天然序列所具有之活性 來加以決定。 特佳類型之取代變體係與取代親本抗體（例如人類抗體） 中一個更高可變區中的殘基有關。一般而言，進一步篩選 出用以發展所得變體相對於親本抗體（變體是生成自該親 本抗體）而言是具有改良的生物特性。一種用以生成此等取 代變體之便利方法係涉及使用噬菌體顯示技術之親合性成 熟作用（Schier R·，/. Mo/.仏〇/·，263:551-67, 1996)。然後， 以本專利說明書所述（參看實例4)篩檢該變體生物活性（例 如結合親合性）。為識別可成為良好改質候選者的高可變區 殘基，進行丙胺酸掃描突變發生作用以識別出明顯可促成 抗原結合之高可變區殘基。經一或多個相關檢定中發現具 有優良特性之抗體可經受進一步的發展。 本專利說明書出現之RG1胺基酸序列（SEq ID N〇:2)可用 以篩選出用於產生抗體的R_G1多肽之特異性區域。如熟習 此項技術者將瞭解，抗體所指向的RG1多肽之區域或抗原 94497-990305.doc •30- 1353992 決定部位可隨所要之應用而變化。例如，意欲用於免疫檢 定中以偵測前列腺細胞上膜結合RG1之抗體應當指向RG1 多肽上可近性抗原決定部位。顯示免疫結構之RG1多肽之 區域及其它區域及領域可容易地使用此項技術中已知之各 種其它方法加以識別，例如Chou-Fasman、Garnier-Robson或 Jameson-Wolf分析。包含此等殘基之片段尤其適合於生成抗 RG1抗體。有效之片段包括（但不限於）序列 PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID N0:8); HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO:10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO:ll);及 NEIVDSASVPET(SEQ ID NO:12)。該等 區域多株抗體之生成描述於實例4中。 辨識RG1抗原決定部位之抗體的用途 本發明抗體、鍵結-抗原之抗體片段及其變體可尤其用於 管理癌症之診斷檢定、成像方法，及治療方法，其中該等 癌症之RG1會過度表現，包括前列腺癌、腎癌、結腸癌及 卵巢癌。 本發明提供用以偵測RG1多肽及診斷癌症（例如前列腺癌） 各種有效的免疫檢定。此等檢定一般包含一或多種RG1抗 體，該等抗體能夠識別且結合RG1多肽。最佳抗體係選擇 性與RG1結合，且不會與非RG1多肽結合（或弱結合）。該等 檢定包括此項技術中已知的各種免疫檢定形式，包括（但不 限於）各種類型之放射性免疫檢定、酵素連結免疫吸附法， 及類似檢定。另外，本發明亦提供能夠偵測前列腺癌之免 疫成像方法，包括（但不限於）使用經標記RG1抗體之放射性 -31- 94497-990305.doc Γ 1353992 閃燥掃描成像方法。此等檢定在臨床上用於癌症（例如前列 腺癌）之偵測、監測及預後。 該上述抗體可用以分離或識別出可表現本發明多肽的選 殖體’或用以純化本發明多肽，其係藉由將抗體附著於固 體載體以分離及/或經由親合性層析法進行純化。 另外，使用細胞分選術及純化技術，RG1抗體可用來分 離RG1陽性細胞。詳言之’例如使用以抗體為基礎之細胞 分選術或親合性純化技術’ RG1抗體可用以從異種移植腫 瘤組織、從培養細胞等來分離出前列腺癌細胞。本發明RG1 抗體其它用途包括生成抗個體基因型抗體，該抗個體基因 型抗體與RG 1多肽極為類似。 RG1抗體可用於偵測前列腺癌的存在或腫瘤轉移。此等 含RG1細胞在各種生物樣品（包括血清、前列腺及其它組織 活體切片樣品）中之存在可用RG1抗體來偵測。另外，rgi 抗體可用於各種成像方法中，例如用"mTc(或其它同位素） 共輕抗體的免疫閃爍掃描法。例如，可使用與最近描述的 使用In共輕抗_PSMA抗體之方案相似的成像方案來彳貞測 一再發生性及轉移性前列腺癌（Sodee等人C7i«. 21: 759-766，1997)。另一種可使用之偵測方法為正電子發 射斷層攝影.術（positron emitting tomography)(參看 Herzog 等人，·/ iVwc/· Med. 34:2222-2226，1993)。 本發明RG 1抗體可經可偵測標記加以標記或共輛至第二 分子上’諸如細胞毋素劑’並將第二分子目標定在RG 1陽 性細胞上（Vitetta，E.S. et al.，/mwwnoiojck TTierapy in 94497-990305.doc -32- 1353992
DeVita, Jr, V.T. et al., eds, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624_2636，1993)。細胞毒素劑之實例包括（但不限於）蓖麻 毒素、阿黴素、道諾黴素、紫杉酚、溴化乙键、絲裂黴素、 足葉乙甙、tenoposide、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、二 . 經基厌疽菌素二銅（dihydroxy anthracin dione)、放射菌素 -D、白喉毒素、埃博黴素（ep〇thil〇nes)、假單胞菌外毒素 (PE)A、PE40、相思豆毒素、及糖皮質激素及其它化學治療 劑，以及放射性同位素。可藉由遺傳方式或化學方式將該 春 抗體融合至適當細胞激素、化學激素、干擾素或生長因子 (該等具有所需抗腫瘤生物活性）來建造出細胞毒素或抗增 生標地性融合蛋白質（Asgeirsdottir等人， 15:1729-1739，2003)。適用之可偵測標記包括 (但不限於）放射性同位素螢光化合物、生物發光化合物、化 學冷光化合物、金屬螯合劑或酵素。用於免疫療法或用作 可债測標記之適用放射性同位素包括下列各物：銻_丨24、 錄-125、珅-74、鎖-103、鋇-140、鈹_7、M_j2〇6、秘_2〇7、參 4¾-109 ^-11 5m > 1^-45^-139. ^.141. ^-144 > Ιέ-137 ^ 絡-51、姑-56、姑-57 ' 鈷-58、鈷 _60、鈷_64、铒 _169、銪 -152、4L-153、金-195、金-199、給_175、給⑻、銦 _U1、 蛾-123、填-13 1、銀-192、鐵-55、鐵-59、氪-85、鉛-210、 镥-177、錳-54、汞-197、汞 _203、鉬 _99、鈦 _147、鎿_237、 錄-63、铌-95、娥-185 + 191 ' |£.1〇3、n95m、镨]43、 鉅-147、鎮-233、鐳-2226、銖-i86、铷 _86、釕 _1〇3、釕_1〇6、 94497-990305.doc •33· 1353992 銃-44、銃-46、硒-75、銀-110m、銀-11、鈉-22、锶-85、锶 -89、锶-90、硫-35、钽-182、鍀-99m、碲-125、碲-132、 鉈-170、鉈-204、钍-228、鉦-232、錫-113、鈦-44、鎢-185、 釩-48、釩-49、镱-169、釔-88、釔-90、鋅-65及锆-95。 將抗體放射性進行標記係使用螯合劑來完成的，該螯合 劑係以共價方式附著至抗體上，其中該放射性核係插入至 螯合劑中。較佳螯合劑闡明於：Srivagtava等人TVwc/· Med. Bio. 1 8:5 89-603, 1991 及 McMurry 等人，1/.^/^£^.0/26所· 41:3546-3549, 1998，或源自所謂ΝΟΤΑ螯合劑，發表於Η. Chong, K. ^ A > Med. Chem. 45:345 8-3464, 2002 > 其均 以全文引用的方式併入本文。雙功能螯合劑衍生物對-SCN-苄基-DTPA(Brechbiel 等人 Inorg· Chem. 25:2772-2781, 1986) 是特佳用於放射性同位素與RG1抗體之共軛作用；例如， 環己基-DTPA(CHX-An-DTPA，Wu等人，价oorg. Mei C；2em· 10:1925-1934, 1997)及 MX-DTPA (1B4M-DTPA，McMurry 等 人，J. Mei C/zem·, 41: 3546-3549, 1998)，以及 1，4,7-三氮 雜環壬烷-N，N，，N"-三乙酸（NOTA)(Chong 等人，·/. Med. C/zem. 45:3458-3464, 2002)。可藉由 Nikula等人，A^wc/. Med. 价〇/. 3:387-390，1995之方法來完成共軛作用。以免疫閃爍 掃描法而言，放射性同位素mIn或99mTc是特佳之偵測標 記。正電子發射斷層攝影術之較佳可偵測標記為43Sc、 44Sc、52Fe、55Co、68Ga、64Cu、86Y及94mTc。對於免疫療法 而言，可使用發射β放射性同位素46Sc、47Sc、48Sc、72Ga、 73Ga、90Y、67Cu、i〇9Pd、ulAg、丨49Pm、〗53Sm、166Ho、”7Lu、 94497-990305.doc •34· 1 8 6 , 188
Re及 Re及發射α同位素2"At、2丨丨Bi、2丨2則、2丨3出及 Bi。較佳為 90γ、i77Lu、72Ga、153sm、67(：11及212則，且特 佳者為90Y及丨77Lu。 立）列腺癌及其它痛症之免疫療法 本發明提供各種用於治療前列腺及其它癌症的免疫治療 方法，包括抗體療法、活體内疫苗，及活體外免疫治療方 法°其它癌症包括腎癌、結腸癌及卵巢癌。在一種方法中， 本發明係提供系統性使用RG1抗體以治療前列腺癌。例 如，未經共軛RG1抗體可引入至患者，如此該抗體會結合 至4列腺癌細胞上、癌細胞中或與癌細胞相關之RG1，且 藉由包括補體調節細胞溶解、抗體依賴性細胞毒性、改變 RG1之生理功能及/或抑制配位體結合或訊號轉換通道的機 制來調節細胞及腫瘤之破壞。如前述，與毒性劑（例如蓖麻 毒素或放射性同位素）共軛之RG1抗體亦可治療性用於將毒 性劑直接傳送至帶有RG1前列腺腫瘤之細胞，並藉以破壞 該腫瘤細胞。 使用RG1抗體之前列腺癌免疫療法係遵循已成功用於其 它類型癌症之各種方法所得的教示，該等其它類型癌症包 括（但不限於）結腸癌（Arlen等人，CWi. /mmimo/. 1 8: 133-138，1998)、多發性骨髓瘤（0zaki 等人，90: 3179-3186， 1997; Tsunenari等人，B/ood 90: 2437-2444, 1997)、胃癌（Kasprzyk等人，C⑽cer Λα. 52: 2771-2776, 1 992)、Β -細胞淋巴瘤（Funakoshi 等人，/mmwwi/zer. & rwwor 19: 93-101，1996)、白血病（Zhong等人，LewA:. 94497-990305.doc •35- 1353992 jRes. 20: 581-589，1996)、結腸直腸癌（Moun等人，Cancer 54:6160-6166，1994; Velders等人，及以.55:4398-4403，1995)及乳腺癌（Shepard 等人，Τ'. C/iw. /wwm«o/. 11:117-127， 1991)。 本發明進一步提供經調配以包含RG1多肽或其片段之疫 苗。疫苗中腫瘤抗原用以生成用於抗癌療法之體液及細胞 調節免疫之用途係此項技術中為吾人熟知且已用於使用 PSMA及齧齒類PAP免疫原之前列腺癌（Hodge等人，/从乂 63:23 1-237, 1995; Fong等人，/./^7^/20/.159:3113-3117，1997)。此等方法可藉由使用RG1多肽或其片段或 RG 1 -編碼核苷酸分子及可表現且適當地呈現rg 1免疫原之 重組載體而容易地加以實現。 例如，病毒基因傳遞系統可用於傳遞RG1_編碼核酸分 子。各種可用於實行本發明之此態樣的病毒基因傳遞系統 包括（但不限於）牛痘、鳥痘、金絲雀痘、腺病毒、流行性感 冒、脊髓灰質炎病毒、腺相關病毒 '慢病毒（lentivirus)及 sindbus病毒（Restifo, in Cwrr. 8:658-663, 1996)。非病毒傳遞系統亦可採用’該系統係藉由將編碼RG1 多肽或其片段之裸DNA引入至患者以誘發抗腫瘤反應。在 一個貫施例中’係採用全長人類cDNA。在另一實施例 中’係採用人類rg/ cDNA片段。在另一實施例中，係採用 編碼特異性T淋巴球（CTL)抗原決定部位之核酸分子。 CTL抗原決定部位可使用特異性演算法（例如Epimer， Brown University)加以測定，以識別RG1多肽内能夠最佳地 94497-990305.doc -36- 1353992 與指定HL A等位基因結合之肽。 亦可採用各種活體外策略。一種方法涉及使用樹突細胞 以便將RG1多肽作為抗原而呈遞至患者免疫系統。樹突細 胞會表現MHC第I及第II類、B7共刺激物及IL-12，且因此為 高度特異性之抗原呈遞細胞。在前列腺癌中，以前列腺特 異性膜抗原（PSMA)之肽脈衝的自體同源樹突細胞正用於 臨床試驗第I階段，以刺激前列腺癌患者之免疫系統（Tjoa et al., Prostate 28: 65-69, 1996; Murphy 等人，Prostate 29: 371-380,1996)。樹突細胞可用以將RG1多肽呈遞至MHC第I 及第II類分子之T細胞。在一個實施例中，自體同源樹突細 胞係經以能夠與MHC分子結合之RG1加以脈衝。在另一實 施例中，樹突細胞係以該完全RG1多肽加以脈衝。而另一 實施例涉及使用各種此項技術中已知之載體來設計樹突細 胞中以7基因之過度表現，該載體諸如腺病毒（Arthur等人， C⑽cer Gene TTzer. 4:17-25，1997)、逆轉錄酶病毒 (Henderson等人，Cancer 56:3763-3770, 1996)、短病 毒、腺相關病毒、DNA 轉染（Ribas et al., Cancer Res. 5 7:2865- 2869，1997)，及腫瘤起源 RNA轉染（Ashley 等人， «/·五xp. Mei 186:1177-1 182, 1997)。 抗個體基因型抗RG1抗體亦可作為疫苗用於抗癌療法， 以誘發針對可表現RG 1多肽之細胞的免疫反應。詳言之， 抗個體基因型抗體之生成在此項技術中為吾人所熟知的， 且可容易地適合產生抗個體基因型抗RG1抗體，該抗個體 基因型抗RG1與RG1多肽上之抗原決定部位極為類似（參看 94497-990305.doc -37- 1353992 例如，Wagner等人，16:33-40，1997:Foon等人， J- Clin. Invest. 96:334-342，1995; Herlyn 等人，Cawcer Immunol Immunother 43:65-76, 1996)° itb 一 抗個體基因型抗 體可用於抗個體基因型療法，其目前係與其它針對腫瘤抗 原之抗個體基因型抗體施行。 可採用基因免疫法，以便針對表現RG1癌細胞產生預防 性或治療性之體液免疫反應及細胞免疫反應》使用本文描 述之RG1編碼DNA分子’包含編碼RG1多肽/免疫原之DNA 及適當調控序列的構築體可直接注射至個體的肌肉或皮膚 内’如此該肌肉或皮膚細胞會吸收該構築體並表現出該經 編碼之RG1多肽/免疫原。該rg 1多肽/免疫原可以細胞表面 夕肽表現或被分泌出來。該RG1多肽/免疫原之表現會導致 產生對抗前列腺癌之預防性或治療性體液及細胞免疫。可 使用此項技術中各種已知的預防性及治療性基因免疫技術 (作為回顧’參看網際網路位址www.genweb.com公開之資訊 及文獻）。 識別結合至RG 1之試劑的檢定 本發明亦係關於可用於識別結合至RG1之試劑（意即，抗 體、肽等等）的檢定及方法。詳言之，結合至RG1之試劑可 藉由RG1配位體或其它試劑或組份與RG1結合之能力及/或 抑制/刺激RG1活性的能力加以識別。 如上所述’藉由以含有抗原區（意欲作為抗體之目標的 RG1夕狀之部分）之狀來免疫適當哺乳動物受檢者可獲得抗 體此等忒劑可用於競爭性結合研究，以識別出第二代抑 94497-990305.doc
•38· 1353992 制劑及阻斷RG1活性。 結合RG1多肽之試劑（例如RG1抗體）可用於調節RG丨活 性、用於將抗癌劑目標指定在適當的哺乳動物細胞上，或 用於識別可阻斷RG1相互作用之試劑。藉由使用與RG1結合 之試劑可將表現RG1之細胞指定為目標物或識別出來。 如何使用RG1結合之試劑取決於RG1結合之試劑的性 質。例如，RG1結合之試劑可用於：將共軛毒素（例如白喉 毒素、霍亂毒素、蓖麻毒素或假單胞菌毒素）傳遞至rgi表 現細胞；調節RG1活性；直接殺死表現RG1細胞；或用於篩 檢以識別競爭性結合劑。例如，RG1抑制劑可以直接用來 抑制尺〇1表現細胞之生長，而RG1結合之試劑可用作為診斷 劑0 _醫學組合物及jg· _ 本發明亦係關於醫藥組合物，其可單獨包含聚校 &L RG1多肽、抗體、激動劑、拮抗劑或抑制劑，或與 少一種其它試劑組合，例如穩定化合物，其可以任何無菌
生物相容醫藥載劑加以投藥，醫藥載劑包括（但不限於）含 溶液、經緩衝含鹽溶液、右旋糖及水。任何此等分子可 獨投與患者，或在其中其與賦形劑或醫藥學上可接受之 劑混合之醫藥組合物中與其它試劑、藥物或激素組合 樂。在本發日月—個實施例中，該醫藥學上可接 醫藥學上惰性的。 ^ 本發明亦係關於醫藥組合物之投藥，此投藥方式是以 口服或非經腸方式完成的。非經腸傳遞之方法包括：： 94497-990305.doc -39- 1353992 動脈内（直接至腫瘤）、肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、 靜脈内、腹膜内或鼻内投藥。除活性成分之外，此等醫藥 組合物可含有適當醫藥學上可接受之載劑，包含賦形劑及 助劑，其有助於將活性化合物加工成醫藥學上可使用之製 劑。關於調配及投藥之技術的進一步細節可見最新版
Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed. Maack Publishing Co，Easton，Pa.)。
用於口服投藥之醫藥組合物可使用此項技術中所熟知的 醫藥學上可接受之載劑以適於口服之劑量來調配。該等載 劑使得醫藥組合物調配為錠劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液 劑、凝膠劑、糖漿、漿劑、懸浮液劑及類似物，以便患者 攝取。 用於口服使用之醫藥製劑可經由將活性化合物與固體賦 形劑組合來獲得，視情況研磨所得混合物，若有必要則在 添加適當助劑後處理顆粒混合物，以獲得㈣或糖錠劑 核。適备賦形劑為碳水化合物或蛋白質填充劑，例如糖， 包括乳糖、嚴糖、甘露醇或山梨醇；源自玉米、小麥、大 米、馬鈐薯或其它植物的㈣；纖維素例如甲基纖維素、 經:基甲基纖維素或叛甲基纖維素鈉；及包括阿拉伯樹膠 及黃青膝之樹膠；及諸如明膠及膠原質之蛋白質。若需要二 可添加朋解劑或増溶劑，例如交聯聚乙稀対院酮匕、 藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。 曰 促饮丹有適當糖衣 挪仏馮例如濃縮3
液、、亦可含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙燦料烷I 94497-990305.doc 1353992 聚幾乙烯凝膠、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆溶液，及適當 有機溶液或溶劑混合物。可將染料或色素添加至錠劑或糖 鍵劑塗層作產品識別或特徵化活性化合物之量，意即劑量。 可口服使用之醫藥製劑包括由明膠製成之推入配合式 (Push-Ht)膠囊，以及由明膠及塗層（例如甘油或山梨醇）製成 之柔軟、密纣膠囊。推入配合式膠囊可含有與填充劑或黏 合劑（例如乳糖或澱粉）、潤滑劑（例如滑石粉或硬脂酸鎂） 及視情況之穩定劑混合的活性成分。在柔性膠囊中，活性 化合物可溶於或懸浮於適當液體中，例如脂肪油、液體石 壤’或含/不含穩定劑之液態聚乙二醇。 用於非經腸投藥之醫藥調配物包括活性化合物之水溶 液。為用於注射，本發明醫藥組合物可在水溶液中調配， 較佳在生理上相容緩衝劑中，例如Hank溶液、溶液， 或生理學上緩衝鹽。含水注射懸浮液可含有增加懸浮液黏 性之物質，例如羧曱基纖維素鈉、山梨醇或右旋糖酐。另 外，活性化合物之懸浮液可製備為適當油性注射懸浮液。 適當親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油（例如麻油）或合成脂肪 酸酿（例如油酸乙醋或甘油三酸醋或脂f體）。視冑況懸浮液 亦可含有適當穩定劑或增加化合物溶解度之試劑以使製備 高濃縮溶液。 以局部或經鼻投藥而言，在調配物中使用適於待穿透特 定障壁之滲透劑，該等渗透劑—般在此項技術中是已知的。 套組 本發明進一步關於醫藥包裝及套組，其包含一或多個填 94497-990305.doc 1353992 充有一或多種前述本發明組合物成分之容器。與該（等）容器 相關者為調即醫藥產品或生物產品之製造、使用或銷售之 政府機關規定形式的標示’該標示顯示出用於人類投藥之 產品的製造、❹或銷售機關之核准。 製造及儲存
本發明醫藥經合物可以此項技術中已知方式來製造例 如，藉由習知混合、溶解、粒化 '弟,J糖鍵劑、磨細 (levigating)、乳化、封入膠囊 '截留或凍乾方法。 該醫藥組合物可以鹽形式提供’且可用許多酸來形成 孤°亥等馱包括（但不限於）鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石 酸、蘋果酸、丁二酸等等。在相應的游離鹼形式之水性或 其它質子溶劑t，鹽趨向於更可溶。在其它狀況下，較佳 製劑可為PH值範圍4.5_5.5之i mM_50 mM組胺酸、〇m 蔗糖、2%·7%甘露醇中之經;東乾粉末，其在使用前與緩衝 劑組合。
在包含可接受載劑中調配之本發明化合物的醫藥組合物 製備之後，可將其置放於適當容器中且標示用於所指示之 症狀的治療。為便RG1投藥，此標示應當包括投藥之量、 頻率及方法。 治療有效劑量 適用於本發明醫藥組合物包括其中含有有效量之活性成 分以達成所要之目的（意即，治療以RG1表現為特徵之特定 病狀）之組合物。有效劑量之測定係在熟習此項技術者能力 所及範圍内。 94497-990305.doc -42- 1353992 對於任意化合物，治療有效劑量最初可在細胞培養檢定 (例如腫瘤細胞）或動物模型（通常為小鼠、兔子、狗或豬） 中之任一者中來估計。動物模型亦用來達成所要之濃度範 圍及投藥途徑。此資訊可隨後用來測定人類投藥之有效劑 量及途徑。 治療有效劑量係指可缓解症狀或病症之蛋白質或其抗 體、结抗劑或抑制劑之量。此等化合物之治療效應及毒性 可在細胞培養或試驗動物中藉由標準醫藥程序來測定，例
如ED5〇(對5〇%總體之有效治㈣量）及LD5。（對5〇%總體之 致命劑幻。治療效應及毒性效應之間的劑量比為治療指 數’且其係以比率ED5Q/LD5G表現。具有較大治療指數之醫 樂組合物較佳。使用獲自細胞培養檢定及動物研究之資料 來調配供人類使用之劑量範圍。此等化合物劑量較佳在循 環濃度以内之範圍，其包括ED5。而具有报小或無毒性。劑 置視採用之劑型、患者敏感度及投藥途徑而定在 變化。 個別醫師#於待治叙患者來選擇具體劑量。調整劑量 :樂以提供足夠含量之活性部分或保持所要之效應。可 :慮：：外因素包括病狀之嚴重性，例如腫瘤大小及位 :旦:：體重及性別；飲食、投藥時間及頻率、藥 物.，且a物、反應靈敏度， 調配物半衰期及清除率P 1耐受性/反應。視特定 5 4卜 ’、疋長期作用醫藥组合物可每3 至天、母週，或每兩週投藥1次。 視投樂途徑而定，正常劑量自01至100,咖微克變化，直 94497-990305.doc •43- 1353992 至〜、d里為約lg。文獻中有提供特殊劑量及傳遞方法的指 導。參看美國專利案第4 657 760號；第5 206 344號；或第 5’225’212號。熟習此項技術者可針對聚核苷酸採用與對蛋 白貝或其抑制劑所採用之不同的調配物。相似地，聚核苷 酸或夕肽之傳遞對特定細胞、症狀、位置等具有特定性。 放射性標記抗體之較佳特異活性係在〇丨至1〇 mCi/mg之蛋 白質範圍内變化（Riva等人，匸心以加以…$ 5; 3275s-3280s，1999; Wong 等人，C7i„. 細· 6.3855-3863， 2000; Wagner 等人，j 43:267-272, 2002) 〇 本發明進一步藉由下列實例來描述。提供該等實例僅用 於參考特定實施例來說明本發明。此等例證在說明本發明 之某些特定態樣時，並未描繪所揭示發明之侷限性或限制 所揭示發明之範疇。 除非另外詳情描述，否則均使用熟習此項技術者所熟知 且常用之標準技術來執行所有實例。下列實例之常用分子 生物學技術可如標準實驗室手冊中所述來執行，例如 ambrook專人 ’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual， 第 2版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y·，1989。 實例1 :人類聚核苷酸之確認 藉由搜尋Incyte's LifeSeq®資料庫，經確認係為前列 腺中所表現之基因。藉由使用ineytem提供用於搜索資料庫 之’’蛋白質功能"工具注解搜索資料庫，從而確認核苷酸 94497-990305.d〇. •44· 1353992 序列，在注解資料庫十之細胞黏附分子類別中發現該核苷 酸序列且被描述為f_spondin的同系物。對聚核苷酸序列 在資料庫中庫的集合中之分佈的Electr〇nic Northern分析揭 示· 在別列腺庫中係以局含量表現，而在一些其他組織 庫則以低含量表現’包括源自正常及腫瘤組織者。 將資料庫中選殖體中聚核苷酸序列段組成鄰近連續 聚核苷酸序列’及編輯該鄰近連續序列之後，在所預定組 成之聚核苷酸中鑑別出全長編碼序列。此序列編碼與 f-spondin及Mindin-2具有同一性質的蛋白質。
Incyte選殖體 1640796、1712252及 1880265係獲自 lncyte， 以用於試驗工作，而選殖體3360733則經識別是含有最5,核 苷酸序列。此選殖體經完全定序，並含有該預期RG1蛋白 質之完全編碼序列。此序列示於SEQ ID NO : 1。 實例2 : rgi mRNA表現 藉由使用Taqman檢定之半定量PCR(Perkin-Elmer)來測定 巧7 mRNA在各種正常及腫瘤組織及細胞株樣品中的表 現。業已根據獲自Stanford University醫學院泌尿學系之經 改良Gleason分級系統，將前列腺正常、良性及腫瘤組織樣 品分級。用標準程序從該組織樣品分離出RNA，源自其它 腫瘤及正常組織之RNA則可購自商業資源，包括ci〇netech 及Biochain。前列腺腫瘤細胞株，（PC-3, LNCaP及DU145)， 係獲自American Type Culture Collection，並以標準方法使 用含血清培養基在培養液中繁殖。在裸鼠中建立源自該等 細胞株之異種移植物腫瘤，且在植入後大約4-6週從小鼠獲 94497-990305.doc -45- 1353992 取該異種移植物腫瘤。藉由標準程序從該腫瘤分離出RNA。 以Taqman為基礎之PCR分析係使用引子：CGC GCA TAG CTC CGA CTA C(SEQ ID N0:3)及 GCC GCG TCC GCA AAG(SEQIDNO:4)及 Taqman 探針：6-FAM-AGGAAGAAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra(SEQ ID NO:5) 來進行的。 此等引子及探針係使用Perkin Elmer的Primer Express軟 體來設計，且藉由Synthetic Genetics來合成的。PCR反應進 行30-40次循環，且使用前列腺RNA來量化，以產生用於相 對比較之標準曲線。該分析證明：前列腺中可偵測到最高 量之mRNA，而在數種其它組織中rgi mRNA含量明顯 地降低。 實例3 : BHK細胞中RG1之生成
選殖=自Incyte質粒3360733獲得RG1編碼區域。編碼序 列於使用lxPfu Turbo聚合酶緩衝劑（Stratagene，La Jolla， CA)/200 μΜ dNTPs/0.2 μΜ寡核苷酸引子/2.5U Pfu Turbo聚 合酶（Stratagene)之標準PCR反應（100ul)中，以下列引子進 行 PCR 擴 增 ： SST115(5'_TCCCTCTAGAGCCACC ATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3丨)(SEQ ID NO:6)及SST113 (5·-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3')(SEQ ID NO:7)。PCR擴增條件如下：95°C3分鐘，（95°C 15秒， 60°C30秒，72°C2分鐘）χ35，72°C7分鐘。所得經PCR擴增產 物使用 QIAquick PCR管柱（Qiagen，Valencia，CA)純化，並 以Xbal及Pmll限制酶消化，以產生1010 bp片段，使用BIO 94497-990305.doc -46- 1353992 101 GeneClean Kit(Vista’ CA)從1%瓊脂糖凝膠純化該片 段。將經純化片段接合（使用Epicientre Fast Link Kit)(Epicenter，Madison，WI)至非細胞病變 Sindbis表現載 體 pSINrep21(Agapov等人，1998, PAMS 95: 12989-12994)， 用Xbal及Pmll消化，並轉型至DH5a感受性細胞（Life Technologies, Gaithersburg, CA)中，且在含有胺必西林 (ampicillin)(100 ug/ml)之LB瓊脂平板上進行篩選。篩選出 一個會在含有胺必西林之LB培養基上生長之菌落，並藉由 序列分析來確認其含有所插入之RG1編碼序列。此質粒被 稱為pPEG6。 表現:根據製造商說明書使用Lipofectamine Plus試劑 (Life Technologies，Gaithersburg，MD)，使用 2微克 pPEG6 轉染1-3 xlO5幼倉鼠腎細胞（BHK)。轉染之後，將細胞在外 加胎兒血清之DMEM中培育24-48小時，此段時間，該細胞 會分成1至10，並藉由添加嘌呤黴素（2·5 ug/ml最終濃度）及 含有血清之DMEM開始篩選含有質粒之細胞。在細胞長滿 之後（嘌呤黴素添加4-5天後），以PBS清洗細胞，分成1至 10，且添加含有血清及5 ug/m卜票吟黴素之DMEM培養基。 在額外2-3天後，以不含血·清之DMEM及5 ug/ml嗓吟徽素替 換該培養基，生長2-3天，且藉由Western分析法，使用RG1 抗體在培養基中偵測到RG1蛋白質之存在。偵測到RG1蛋白 質含量為1 Mg/ml。 純化:將經轉染為穩定過表現且分泌RG1蛋白質至生長 培養基中的幼倉鼠腎細胞（BHK)培養在含有胎兒牛血清之 94497-990305.doc -47- 1353992 培養基中。當長到快要滿時（subconfluent)，將細胞轉換至 不含血清培養基中24-48小時。收集培養基，將其離心以移 除細胞並儲存在攝氏-80度。進行純化之前，將培養基前立 即解凍並置於冰上。添加蛋白酶抑制劑，以冰冷20 mM乙 酸鈉緩衝液（pH值為6.5)將培養基稀釋10倍，且在純化整個 過程中保持在攝氏4度下。將經稀釋樣品以0.5 ml/分鐘之流 速裝載至Q-瓊脂糖陰離子交換管柱上並用相同缓衝液洗 滌。使用線性NaCl梯度（於緩衝液中之0-80%之1M NaCl， 0.5%每分鐘）進行沖提，同時收集溶離份。RG1會在大約75 mM NaCl下沖提出來，藉由SDS PAGE及西方墨點法測定。 併集含有RG1之溶離份，藉由超過濾濃縮，並進一步以 Superdex75凝膠過濾管柱加以純化。經純化BHK-RG1係作 為產生人類mab(其對天然RGl(nRGl)蛋白質有特異性）之 免疫原，且可作為篩檢及特徵化該等抗體之抗原之用。 實例4 :抗體生成 多株抗體:製備對抗衍生自RG1蛋白質序列之5種合成性 多肽序列之兔子多株抗血清。選擇該等序列的原因是因為 其預期位置係位於蛋白質表面，以便生成更可能辨識表面 抗原決定部位之抗血清。用胺丁酸（Abu)置換掉半胱胺酸殘 基，以幫助合成。針對該5種肽之特定胺基酸序列、RG1蛋 白質位置及名稱如下所示。 名稱 位置 胺基酸序列 1C 28-46 PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO:8) 2C 46-64 TFTGKWSQTAFPKQYPLFR(SEQ ID NO:9) 94497-990305.doc * 48 *
1353992 3C 77-91 HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO: 10) 4C 188-210 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO:ll) 5C 263-274 NEIVDSASVPET(SEQ ID NO: 12) 藉由額外羧基末端半胱胺酸將肽以共價方式偶合至鑰孔 嘁血藍蛋白（KLH)，以作為免疫原之用。相似地，製備牛血 清白蛋白（BSA)共軛物，以便經由ELIS A抗血清滴定量分 析。 2種動物各以肽進行免疫。初次免疫作用係以Freund完全 佐劑（0.5 mg/動物）進行，隨後在3週間隔期以肌肉内方式以 Freund不完全佐劑（0.25 mg/動物）追加。週期性抽取試驗血 液，並藉由ELISA來量測抵抗特異性BSA-肽共軛物之抗體 效價，且與免疫前的血清做比較。對抗肽1C及3C之抗血清 經顯示具有活性。對抗肽2C之抗血清則不會辨識RG1多 肽。對抗肽4C及5C之抗血清沒有測試。 單株抗體:藉由將轉殖基因小鼠進行免疫產生對抗RG1 之單株抗體，其係對抗在五.co"細胞中所表現RG1多肽及6-組胺酸-標記之RG1融合蛋白質。這些動物的脾細胞與骨髓 瘤細胞融合，以生成融合瘤細胞。以ELISA篩檢所得融合 瘤細胞，以得到可產生對抗RG1肽及蛋白質之抗體的融合 瘤。 對天然RG1具有特異性的人類單株抗體亦係藉由將轉殖 基因小鼠進行免疫後加以製備的，該等小鼠含有經破壞小 鼠重鏈及小鼠κ輕鏈基因座。（美國專利第5,877,397號）。源 自C57BL/6J近親交配系（Medarex)之轉殖基因小鼠係以經 94497-990305.doc -49- 1353992 純化RG1蛋白質進行免疫，該RG1蛋白質係在穩定轉染ΒΗΚ 細胞株中生成的（參看實例3)。 將抗原與完全Freund(Sigma，F5881)佐劑混合用於方案1 之第一及第二免疫化；其後，將抗原與不完全Freund (Sigma，F5506)混合。對於第二方案，完全Freund用於第一 免疫化且其後使用不完全Freund。各個小鼠接受使用乳化 針而與佐劑1 : 1混合的100 μΐ^ PBS中之25叫天然RG1 (nRGl)。以0.2 mL製備之抗原注射入小鼠腹膜腔。 融合瘤製備：將P3x63 ag8.653骨髓瘤細胞系（ATCC CRL 1580, lot F-1 5 183)用於融合。將原始ATCC小瓶解凍並在培 養液中培養增生，自此所增生的細胞製備種子儲備細胞的 冷凍小瓶。將細胞保持在培養液中3-6個月，一週繼代兩 次。源自P388D1(ATCC，TIB-63FL)細胞之上清液用作融合 瘤之調理培養基。簡而言之，細胞生長並增生至200 ml， 固定培養生長〜7天。將經抽出的上清液進行離心並經由0.2 μιη無菌過濾器過濾。該細胞株繼代3-6月，並然後再解凍新 的小瓶。 含有 5% FBS(Hyclone，#AKE 11828)及 P/S(Cellgro， #30002029)之 DMEM(Cellgro#10013271，10013270)用於培 養骨髓瘤及P3 88D1細胞。將額外培養基補劑添加至融合瘤 生長培養基，其包括5%之Origen-融合瘤選殖因子（IGEN， #36684，36908)，5% 之 P388D1 調理性培養基（11/15/00， 12/21/00 DH)，10% FCS(Hyclone，#ΑΚΕ11828)，β-巯基乙 醇（Gibco#1076640)，Genetacin(Gibco #1079874)，Hepes 94497-990305.doc -50- 1353992 (Cellgr〇-#25060041)及 HAT(Sigma，Η 0262; 1.〇χ1〇·4Μ 次黃 嘌呤，4.0χ10·7 M 胺基蝶呤，1.6xl〇-5M 胸苷）或 HT^Sigma， H0137; 1.〇χ1〇·4Μ 次黃嘌呤，1.6χ1〇·5Μ 胸苦）。 使用PEG及標準方法將脾細胞與骨髓瘤細胞融合。所得 融合瘤細胞接種至50個96槽培養盤中，第一次融合時係接 種200 μΐ/槽。融合後10_12天進行人類IgG，K抗體之初始 ELISA篩檢。隨後藉由6_組胺酸捕捉式eLISA來篩檢人類 IgG，K陽性反應的細胞槽。此篩檢得到源自3個融合物之8個 人類抗體之分離物：3個IgM，1個Ig〇3，及4個IgG 1亞型抗 體。 將具有鍵結-抗原之抗體之細胞槽中的融合瘤細胞第一 次轉移至24槽培養盤中，並再次針對特異性重新篩檢。可 藉由極限稀釋次選殖出天然RG1特異性融合瘤，以確保細 胞的單株特性。在發展過程中的數個階段，將產生與天然 RG1 (nRG 1)結合之抗體的融合瘤細胞冷凍在丨GEN冷凍培養 基中，以保存該等細胞。將該等細胞株的培養基冰凍，並 以如下所述用於純化出抗體。8個分離物中的4個被測定為 具有足夠特異性，可藉此進一步研究。 选胃t.純4 : 4個上述人類單株RG丨抗體使用蛋白質〇瓊 脂糖親合色譜法從細胞調理性培養基純化。藉由離心及過 濾將細胞自培養基移除’使培養基經過蛋白質G管柱。隨後 將s亥官柱在PBS中洗滌以移除未經結合的物質。以丨〇〇 mM 甘胺酸（pH值為2.5)沖提出經結合的抗體，且立即藉由添加 10°/。v/v 1M Tris(pH值為8)來中和該溶離份。併聚含有抗體 94497-990305.doc -51 - 1353992 之溶離份，以PBS透析，藉由SDS PAGE來測試純度，並藉 由ELISA檢定抗原結合活性。 抗體之篩檢:抗體之篩檢係使用幾種不同檢定程序來進 行： 八上1经0以£1^18八篩檢：96槽微量盤（？31(：〇11，#3912)經以1 ug/ml抗人類IgGK或溶於PBS中之抗人類IgGK(50 ul/槽）塗 覆整夜。將培養盤中培養基吸出，並用含有5%雞血清之PBS 0.05% Tween 20在室溫下阻斷1小時（100 μΐ/槽），隨後以 PBS-tween洗務3次。將融合瘤上清液在阻斷缓衝液中稀釋 1 : 2，且在室溫下培育1小時（100 μΐ/槽）用於篩檢。培育之 後，在添加二級抗體HRP抗人類IgGFc(Jackson, #109-036-098)或 HRP抗人類 IgGK(Sigma, #A-7 164)之前（100 μΐ/槽），將培養盤以阻斷缓衝液洗滌3次。將二級抗體在室 溫下培育1小時並接著將培養盤以阻斷緩衝液洗滌2次。使 用含有 80 ul ABTS(Sigma，# Α1 888)，8 μΐ Η2〇2之 10 ml檸 檬酸鹽缓衝液（pH值為4.0)使各培養盤呈色，且在A415_49〇nm 下讀取。 B. RG1結合ELISA :攝氏4度下，將96槽微量盤以PBS中 之0.5- 1.0 ug/槽的純化天然RG1蛋白質（50 ul/槽）塗覆整 夜。吸出細胞槽培養基並接著添加1 00 ul/槽之PBS-tween + 5%雞血清來阻斷反應，隨後在室溫下培育1小時。隨後將 培養盤以阻斷緩衝液洗滌3次。接著將經連續稀釋之樣品 (血清、融合瘤supe、純化mab等）以50 ul/槽添加至各個細胞 槽中。在室溫下培育1小時隨後以阻斷緩衝液洗滌3次。隨 94497-990305.doc -52- 後以HRP抗人類IgGFc二級抗體在阻斷缓衝液中於室溫下 培育該等細胞槽1小時並接著如前述洗滌3次。使用前述受 質將該培養盤呈色並使用96槽培養盤讀取器量測A4〇5 nm的 讀值。 C. 捕捉式ELISA方法：為了測定與天然構型之RG1蛋白質 結合之mab，使用捕捉式ELISA形式。將含有6組胺酸表現 標記之RG1蛋白質（6His-RGl)在BHK細胞中表現並用作抗 原。根據標準方法，使用NiNTA瓊脂糖親合色譜法從調理 性培養基中純化出6His-RGl。 在96槽NiNTA培養盤（Qiagen NiNTA HisSorb)上使用濃度 1.5 ug/ml PBS加 0.2% BSA(PBS/BSA，100 ul/槽）在 4攝氏度 下隔夜捕捉經純化6His RG卜以含有0·05% Tween 20 (PBST) 之PBS將細胞槽洗滌3次。將樣品（融合瘤上清液，血清，純 化mab等）在PBS/BS A中稀釋並在培養盤上於室溫下培育 1-2小時（50 ul/槽）並接著以PBST洗滌3次。二級抗體（HRP-標記山羊抗人類IgGFc)在PBS/BSA中稀釋至1 : 5000，以50 ul/槽添加至培養盤並在室溫下培育1小時。 以PBST將培養盤洗滌3次，並如在ELISA中進行呈色反 應。使用ELISA培養盤讀取器量測405 nm下之吸光度。 D. BIAcore表面電漿共振（SPR)檢定··使用SPR，將親本 融合瘤上清液進一步篩檢，以藉由親合力將選殖體以質量 方式分級。使用標準胺偶合及pH 4.0之乙酸鹽及MEPES緩 衝鹽（HBS)之流動相中的60 ug/ml抗體將兔子抗人類 IgGFc(Pierce’ 31142)固定至感應晶片（Biacore，BR-1000-12) 94497-990305.doc -53- 1353992 上。融合瘤培養基以5 ul/分鐘通過該表面，以捕捉至該表 面並接著以HBS洗滌至基礎線。接著將純化、天然、 BHK-RG1蛋白質（400 nM)通過該表面並以SPR來量測結合 力。在注射最後，將HBS通過該表面以量測抗體：RG1錯合 體的解離。SPR量測值隨時間之斜率是解離率的指標，斜率 越大，表示解離越快，且因此該抗體之親合力越低。 實例5 :抗體之西方墨點分析 抗血清係藉由西方墨點法測試針對RG1之特異性。以COS 細胞中瞬間表現之RG1、自LNCaP細胞分泌之天然RG1及自 轉染幼倉鼠腎細胞（BHK)生成之RG1上測試RG1特異性抗 血清（該等係對抗前述序列1C及3C)。RG1特異性抗血清進 一步從下列各物製備之溶解物上測試：LNCaP腫瘤、LNCaP 細胞、PC3腫瘤、PC3細胞及數種人類前列腺腫瘤之臨床樣 品。細胞及組織溶解於清潔緩衝劑中，煮沸5分鐘後，將1 0 ul之各種溶解物裝載至12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，以解 析蛋白質。經分離蛋白質隨後轉潰至硝化纖維膜上，藉由 同質性肽及異質性肽存在下的結合來確認RG 1抗體之結合 特異性。RG1特異性抗血清可在所有的樣品中偵測到蛋白 質，但PC-3細胞及PC-3腫瘤除外。 對天然RG1具有特異性之人類mab之西方墨點分析證 實：此等抗體僅在非還原條件下於墨點上辨識RG1，此推 論該等mab係與更為天然形式之RG1結合。 實例6 :分泌自LNCaP細胞的天然RG1蛋白質之純化 藉由西方墨點分析顯示組織培養生長之LNCaP細胞可分 94497-990305.doc -54-
"J 1353992 泌出天然RG1蛋白質。為了純化該天然蛋白質，將細胞置 於無血清培養基中生長48小時。收集該無血清經調理的培 養基、離心去除所有細胞，並藉由超過濾濃縮大約5〇倍。 經濃縮培養基隨後以20 mM乙酸鈉緩衝液（pH值為6.5)稀釋 Μ倍，並裝載至Q-瓊脂糖陰離子交換管柱上。管柱沖提液 係由氯化鈉梯度（0.5%每分鐘）構成，同時收集2 〇 ml溶離 份。該RG1蛋白質在大約75 mMNaC丨（藉由西方墨點及SDS PAGE測定）下沖提出來。該天然RG1蛋白質與在細菌中所表 現之6-組胺酸-RG1融合蛋白質相比，呈現以略微較低之分 子量，大概是因為它缺少融合肽。 實例7 :前列腺及前列腺癌轉移中之RG丨表現的 免疫組織化學著色 藉由LifeSpan Biosciences，Inc.測定人類各種組織（包括 腎臟、肺臟、胰臟、肌肉、腦及前列腺，及淋巴結與骨轉 移）中RG1蛋白質之表現。額外之前列腺組織獲自史丹佛大 學史丹佛學院泌尿學系並於Berlex測試。該組織切片使用標 準程序進行脫石蠘。多株抗體RG1 -3 C係作為初級抗體，而 該 <貞測系統由使用具有Vector紅色基質套組（sk5 002)的 Vector ABC-ΑΡ套組（AK5002)構成。在不含初級抗體下進行 著色係為陰性控制組。 檢查數位患者的前列腺腫瘤及正常前列腺組織中RG1之 表現。在所有狀況下’前列腺腫瘤樣品均發現呈現強烈著 色（表示有RG-1表現）° RG-1表現在正常前列腺組織各有不 同，從幾無著色至顯著著色。 94497-990305.doc •55- 1353992 藉由免疫組織化學在已知含有前列腺腫瘤轉移之淋巴結 及骨骼樣品亦可偵測到RG1表現。正常淋巴結或骨骼不會 顯示出著色。 實例8 : RG1抗體之定序
藉由標準方法測定如上述實例4中所產生及純化的兩種 人類RG1抗體（C及B)之核酸序列。B輕鏈可變區之核苷酸序 列指定為SEQ ID NO:20，而B重鏈可變區之核苷酸序列指 定為SEQ ID NO:21。C輕鏈可變區之核苷酸序列指定為SEQ ID NO:23，而C重鏈可變區之核苷酸序列指定為SEQ ID NO:24。 測定此等可變鏈區之相應預測胺基酸序列，並指定為 SEQ ID NO:26(B 輕鏈）；SEQ ID NO:27(B 重鏈）；SEQ ID NO:29(C輕鏈）；SEQ ID NO:3 0(C重鏈）。參看圖 3及4。 實例9 : RG1抗體之結合常數的測定
與天然RG1蛋白質結合之mab的動力學常數（KD、ka及kd) 係藉由BIAcore使用捕捉形式來測定，其中可溶解、天然 RG1蛋白質係結合至位於感應晶片上之固定化mab。免疫純 兔子抗人類1§〇?〇(?丨6〇^，31142)使用標準胺偶合方法共價 固定於感應晶片CM5(Biacore，BR-1000-12)上。使用稀釋 於10 mm乙酸鹽中之100 ug/ml抗體，pH值為4.0，以5 ul/分 鐘來使用。HBS-EP(Biacore, BR-1001-88)係作為流動相之 用，未反應部位以乙醇胺來阻斷。以HBS將mab稀釋至200 nM，且以每循環10 ul/分鐘速率注射50 ul。BHK-RG1之連 續稀釋液（12.5-400 nM)與固定mab結合，以20 ul/分鐘進行8 94497-990305.doc -56- 1353992 分鐘抗原注射完成後’立即量測解離動力學。在每個循環 之後，使肖25以10 mm甘胺酸（pH值為！ 8)再生該表面並 接著以HB S洗務該表面。 通常’運行五次濃度及-次培養基對照。使用儀器製造 商提供值軟體（BIAevaluation 3.0)將資料配合入1 : i Langmuir模型中，並計算動力學常數。平衡常數係為具有 有利解離速率（10·4，）之奈莫耳濃度範圍。表丨顯示4種人類 抗體之動力學常數。 表1 .人類RG-1抗體A、B、C及D之動力學常數。此等抗 體之動力學常數係藉由使i : 1的1^%〇1114模型配合獲自 BIAcore研究的數據來測定。Ka:結合率（1/s); Kd:解^率 (1/s) ; KD :親合力（M)
貫例10 · RG1抗體之放射性標記 聱舍劑與之共麵:利用修改自Nikula等人 ；Vwc/· Med. 5ζο/., ν〇ΐ· 22，Νο.3，ρρ·387-390，1995之方法， 將雙功能螯合劑對-SCN_节基_DTpA(Macr〇cyclics，he )以 共價方式連接至抗體上。在此程序期間所使用之所有試劑 及设備於使用必須是不含金屬，以避免螯合劑失去活性。 94497-990305.doc •57· 1353992 所有溶液以低金屬試劑、高純度（MilliQ)水及經處理以移除 微量金屬之Chelex來製備。以10 mM EDTA漂洗所有設備並 接著用MilliQ水充分漂洗。 在緩衝交換成50 mM碳酸鈉緩衝液、15 0 mM NaCl(pH值 為8.5)之前，利用在AKTA層析法系統使用Pharmacia 26/1 0 脫鹽管柱，先以1 mM EDTA在室溫下處理經純化mab(〜20 mg)l小時，以移除所有金屬。併聚含有抗體之溶離份，並 藉由超過遽法（Centricon 30)將其濃縮至大約2 mg/ml。1 00 mg/ml對-SCN-苄基-DTPA儲存溶液在無水DMSO中新鮮製 備。共軛反應係使用50-100倍莫耳過量之DTPA，使其在室 溫下隔夜進行。反應混合物隨後緩衝交換成50 mM乙酸 鈉、150 mM NaCl，pH值為6.5(放射性標記緩衝液），並藉 由超過濾濃縮至至少3 mg/ml。抗體共軛物於攝氏4度下穩 定於該缓衝液中達數週。藉由BCA測定蛋白質濃度，並藉 由ELISA確認抗原結合的活性。 RG1抗體之放射性標記:在無金屬的條件下，將DTPA共 扼抗體以9QY或nlIn進行放射性標記，以作為帶有腫瘤動物 活體内研究之用。通常，係將10 mg抗體共軛物與10 mCi 之[9()Y]C13或[inIn]Cl3(PerkinElmer生命科學）在室溫下於厚 重護罩之後，以輕度方式混合1小時。添加EDTA至1 mM並 在室溫下反應10分鐘。反應混合物通過26/10脫鹽管柱（已在 無金屬PBS中預平衡）運行，以便從未結合9GY分離出經放射 性標記抗體，並交換缓衝液。收集1 ml溶離份並彙聚含有 抗體之溶離份。藉由BCA測定蛋白質濃度。使用針對9QY之 94497-990305.doc -58· 1353992 液體閃爍計數器或針對1πΙη之γ計數器來測定1…樣品之總 放射性。以mCi/mg蛋白質來計算特異活性，且通常範圍介 於0.25至1.0 mCi/mg之間。藉由根據Nikula等人胸
Ao/. 22:387-390，1995之瞬間薄層層析儀（ITLC)來測定放 射性純度。通常’大於98%之放射性與蛋白質有關。放射 共輛物之抗體結合活性係藉由針對非共輛抗體標準（9〇γ共 軛物）之ELISA方法或使用經固定化RG1蛋白質（mIn共軛物） 之固相放射性免疫結合檢定法加以測定。在所有狀況下， 放射性共軛物之抗原結合與未共軛抗體之抗原結合無法區 別。 實例11 :經川111標記之RG1抗體的腫瘤特異性聚積 將置於母膠中之lxio7 LNCaP細胞以皮下注射（s c )方式 共同接種至5-6週大雄性無胸腺裸鼠脅腹，以建立腫瘤異種 移植物。當腫瘤達到體積150_400 mm3時（腫瘤細胞接種後 大約4-6週）進行生物分布研究。將經niln標記之人類R(H抗 體（C、B、A)及非特異性人類“仏對照抗體（特異活性，〇 3 mCi/mg)以靜脈内投藥方式投與4組丨2隻帶有LNCap異種移 植物的小鼠t。小鼠在解剖前先以心臟穿刺法抽血。取出 企液、腫瘤及所有主要器官，在分析天平上稱重，及以丫計 數器中計算放射性。血液、個別器官及殘餘屍體中所測之 放射性總和來測定全身清除率。所有數據係進行放射性同 位素衰減校正。結果以每公克組織注射劑量的百分比表 不。RG1特異性抗體顯示出具有高腫瘤特異性聚積（參看圖 94497-990305.doc •59- 1353992 實例12 :以經9GY-標記RG1抗體之腫瘤生長抑制作用 將置於母膠中之lxl07LNCaP細胞以皮下注射（S.C.)方式 共同接種至5-6週大雄性無胸腺裸鼠脅腹，以建立腫瘤異種 移植物。當腫瘤達到體積50-350 mm3時（腫瘤細胞接種後5 週）開始治療。將帶有腫瘤的動物平均分配至4個治療組（η =13/組）。以腹腔注射方式（i.p.)，將單劑經放射標記抗體 B、C及非特異性IgGi(125 μ(：ί/動物）投用至帶有LNCaP移植 物的小鼠，第4治療組係以i.p.注射方式給予食鹽溶液。注 射後，監測經9()Y標記RG1特異性抗體對衍生自LNCaP的腫 瘤生長的影響達32天《彼時，殺死動物並將腫瘤取出及稱 重。藉由監測體重來決定健康狀況。與注射經9GY標記之非 特異性抗體或媒劑對照物之動物所得結果相比，經9GY標記 之特異性人類RG1抗體之單劑投藥對腫瘤生長會產生顯著 的抑制作用。（參看圖2)。
實例13 : RG1抗體在CHO細胞中的選殖及表現 突變發生=將編碼抗RG1抗體B及C可變區之野生型cDNA 的進行定點突變發生，以便產生可更常在人類中表現之同 種異型抗原免疫球蛋白。使用QuickChange®多定點突變發 生方法（Stratagene)來進行突變發生，其中係以TOPO/B VH 及 TOPO/CVH(Medarex)作為模板。將 H13Q、M90T 及 M92V 點突變（point mutation)引入至 B cDNA(BVH_3m)及將 H13Q、M90T弓|入至C cDNA(CVH_2m)係使用弓|子 (GGGGAGGCTTGGTACAACCTGGGGGGTCCCTGAG; SEQ ID NO:14) 及 (GAACAGC 94497-990305.doc -60· CTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAG; SEQ ID N0:15)。藉由DNA序列分析確認突變作用，及導致 產生分別具有SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:25突變重鏈可變 區。該等兩個重鏈可變區之預測胺基酸序列分別示於SEQ ID NOS:28及 31。 表現鈸體之構築：pIE_SRylfa(Medarex)之表現載體含有 分別編碼人類IgGl(fa單倍體）之CH及CL區域及kappa鏈之 cDNA。為了使B及C輕鏈可變區以讀框方式選殖入 pIE_SRylfa ， 使 用 引 子 對
BYK FfGGGAAGCTTGCCACCATGGAAACCCCAGCG; SEQ ID NO: 16) 及 BYK RfCAGTCGTACGTTT
GATCTCCACCTTGGTCC; SEQ ID NO: 1 7)分別在 BVL 及 CVL cDNA之5'及3'末端引入相容Hindlll/Bsiw部位（下劃 線）。藉由PCR產生之所得VL cDNA選殖至pIE_SRylfa之 Hindlll/Bsiw部位，以製造pIE/BVL及CVL。使用相同策略 以讀框方式將VH融合物（包括BVH、BVH_3m、CVH及 CVH_2m) 構築至 pIE/BVL及CVL 。 簡言之， CVH F(GTCAGGATGCGGCCGCCAC
CATGGAGTTTGTGCTGAGCT: SEQ ID NO: 18)及 CVH_R (ACCGATGGGCCCTTGGTGGA; SEQ ID NO: 19)係用以將 Notl/Apal部位引入於以PCR方式擴增之VH cDNA之末端。 PCR產物經以Notl/Apal消化，並插入pIE/BVL及pIE/CVL之 CH區域的上游，確保在對應pIE衍生物中的VH區域係與CH 區域在讀框内。最終構築體命名為pIE/B、pIE/B_3m、pIE/C 94497-990305.doc -61 - 1353992 及pIE/C_2m。所有插入物業經DNA序列分析確認。 DG44及DXB 11細胞之韓染及選擇/擴增。轉染前一天，將 補充有F12培養基及5% FCS之約4xl06 DG44及DXB11細胞 接種在P100培養盤中。每一 P100培養盤使用Lip feet amine 2000(Invitrogen)及 24 pg 線性化質粒 DNA(pIE/B_3m 或 pIE/C_2m)進行轉染作用。轉染後4小時換培養基。轉染後 約24小時施加篩選條件。 以含有5%經透析FBS、2 mM L-穀醯胺及G418(400 ug/ml)但 不含核糖核苷及脫氧核糖核苷之MEM培養基首先進行篩 選。將長滿到約90%之細胞分配至4χΡ 100培養盤中，並以 G418外加各種濃度胺曱嗓呤（methotrexate)進行共同篩 選。一週後，將存活細胞於篩選培養基存在下，以1 〇〇細胞 /培養盤的濃度接種至96槽孔盤中。以針對重組抗體表現作 用之ELIS A方法篩檢出存活的選殖細胞。在濃度增加之胺 曱喋呤下，藉由連續篩選擴增具有最高表現水平之1〇個選 殖細胞的基因複本數，並將鎖選出的選殖細胞適應於無血 清培養基，以製備主細胞庫。 前述說明書中提及之所有出版物及申請案均以引用的方 式併入本文。儘管已參照本發明特殊實施例來描述了本發 明，但是熟習此項技術者應當瞭解，在不背離本發明之真 正精神及範疇下可作出各種改變且可用等價形式取代。此 外，可作出諸多改進以使特殊情況、材料、物質組合物、 方法、方法步驟或多個步驟適合本發明之目的、精神及範 94497-990305.doc -62- / 1353992 疇。所有該等修改意欲屬於附加之申請專利範圍之範嘴内。 【圖式簡單說明】 7 圖1 :經U1ln標記之RG1抗體之生物分布：藉由⑴^對] 個RG1抗體（A、B及C)、一非特異性hlgGi對照抗體及 行放射性標記。將經放射性標記之抗體（特 異活性·· 0.3 mCi/mg)i.v.投藥至帶有腫瘤（LNCaP)裸鼠内。 -在第6、24、120及150小時p.i.犧牲每組12隻動物（每時間點 3隻動物）且監測腫瘤、企液及肝臟中之積聚。（參看實例11) 圖2 .經0γ標記之rg 1抗體的抗腫瘤效應··向帶有籲 腫瘤動物注射經9❶γ標記之抗體（抗R G i抗體B及c或非特異 [ 生IgGl特異活性，〇·5 mci/mg)。將單一劑量之125 pCi 90γ 標δ己之RG1抗體（β、c)ip投藥。小鼠在第32天犧牲且切除 腫瘤並將其稱重。（見實例12) 圖3 :人類單株抗體B之可變鏈區之胺基酸序列，包括變 異之可變重鏈區。Vl(SEq ID N〇:26)、Vh(seq ID N〇:27)、 VH_3m(SEQ l〇 n〇:28)。 圖4 :人類單株抗體c之可變鏈區之胺基酸序列，包括變 馨 異之可變重鏈區。Vl(SEQ ID ΝΟ··29)、VH(SEQ ID NO:3〇)、 VH一2m(SEQ ID N〇:31)。 94497-990305.doc •63- 1353992 β年3月γ曰修(更)正本序列表 agaaaggggt gcggcagcac gggcagggcg agttgggaaa tctcccacgt cctatctgcc gaactggagc ctcattggcc gctctggctg ggacccgacc tgccagggga agagggtgat gcggcagccc ccgccgcccc tctcgctgga ggccaggccg ggcccggggc gccggcctcg gctgccggcc gcgctcccgc ccgacccggg gaaggtcgct cgcagcccct tctcctcctt tgcagcatcg aagacaggag ggcttaaata ggagctccgg tgctcctgcc gggtg atg Met 1 <110〉 德商先靈公司 <120〉 RG1抗體及其用途 <130〉 51791BUSM1 <140〉 093121655 <141> 2004-07-20 <150〉 US 60/489, 032 〈151〉 2003-07-22 <160〉 31 <170> Patent In version <210〉 1 <211〉 1785 〈212〉 DNA <213> 〈220〉 智人 . <221〉 CDS <222〉 <223〉 (296)·. (1291) <400〉 1 gaa aac ccc age ccg gee gee gee ctg ggc aag gee etc tgc get etc Glu Asn Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala Leu 5 10 15 94497-990305.doc 3941353992 etc ctg gee act etc ggc gee gee ggc cag cct ett ggg gga gag tee Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Gin Pro Leu Gly Gly Glu Ser 20 25 30 ate tgt tee gee gga gee ccg gee aaa tac age ate acc ttc aeg ggc lie Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr Ser lie Thr Phe Thr Gly 35 40 45 aag tgg age cag aeg gee ttc ccc aag cag tac ccc ctg ttc ege ccc Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro Leu Phe Arg Pro -50 55 60 65 cct geg cag tgg tet teg ctg ctg ggg gee geg cat age tee gac tac Pro Ala Gin Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp Tyr 70 75 80 • age atg tgg agg aag aac cag tac gtc agt aac ggg ctg ege gac ttt Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp Phe 85 90 95 geg gag ege ggc gag gee tgg geg ctg atg aag gag ate gag geg geg Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu lie Glu Ala Ala 100 105 110 ggg gag geg ctg cag age gtg cac geg gtg ttt teg geg ccc gee gtc Gly Glu Ala Leu Gin Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val 115 120 125 ccc age ggc acc ggg cag aeg teg geg gag ctg gag gtg cag ege agg Pro Ser Gly Thr Gly Gin Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gin Arg Arg 130 135 140 145 442 490 538 586 634 682 730
cac teg ctg gtc teg ttt gtg gtg ege ate gtg ccc age ccc gac tgg His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg lie Val Pro Ser Pro Asp Trp 150 155 160 ttc gtg ggc gtg gac age ctg gac ctg tgc gac ggg gac cgt tgg egg Phe Val Gly Val Asp Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp Arg 165 170 175 gaa cag geg geg ctg gac ctg tac ccc tac gac gee ggg aeg gac age Glu Gin Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp Ser 180 185 190 ggc ttc acc ttc tee tee ccc aac ttc gee acc ate ccg cag gac aeg Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr lie Pro Gin Asp Thr 195 200 205 778 826 874 94497-990305.DOC -2- ί 922 1353992 gtg acc gag ata acg tcc tcc tct ccc age cac ccg gee aac tee ttc 970
Val Thr Glu lie Thr Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser Phe 210 215 220 225 tac tac cca egg ctg aag gee ctg cct ccc ate gee agg gtg aca ctg 1018
Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Pro lie Ala Arg Val Thr Leu 230 235 240 gtg egg ctg ega cag age ccc agg gee ttc ate cct ccc gee cca gtc 1066
Val Arg Leu Arg Gin Ser Pro Arg Ala Phe lie Pro Pro Ala Pro Val 245 250 255 ctg ccc age agg gac aat gag att gta gac age gee tea gtt cca gaa 1114
Leu Pro Ser Arg Asp Asn Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu 260 265 270 acg ccg ctg gac tgc gag gtc tcc ctg tgg teg tcc tgg gga ctg tgc 1162
Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys 275 280 285 gga ggc cac tgt ggg agg etc ggg acc aag age agg act ege tac gtc 1210
Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val 290 295 300 305 egg gtc cag ccc gee aac aac ggg age ccc tgc ccc gag etc gaa gaa 1258
Arg Val Gin Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu 310 315 320 gag get gag tgc gtc cct gat aac tgc gtc taa gaccagagcc ccgcagcccc 1311
Glu Ala Glu Cys Val Pro Asp Asn Cys Val 325 330 tggggccccc cggagccatg gggtgtcggg ggctcctgtg caggctcatg ctgcaggcgg 1371 ccgagggcac agggggtttc gcgctgctcc tgaccgcggt gaggccgcgc cgaccatctc 1431 tgcactgaag ggccctctgg tggccggcac gggcattggg aaacagcctc ctcctttccc 1491 aaccttgctt cttaggggcc cccgtgtccc gtctgctctc agcctcctcc tcctgcagga 1551 taaagtcatc cccaaggctc cagctactct aaattatgtc teettataag ttattgctgc 1611 tccaggagat tgtccttcat cgtccagggg cctggctccc acgtggttgc agatacctca 1671
gacctggtgc tctaggctgt gctgagccca ctctcccgag ggcgcatcca agcgggggcc 1731 94497-990305.DOC 1353992 1785 acttgagaag tgaataaatg gggcggtttc ggaagcgtca aaaaaaaaaa aaaa <210〉 2 <211〉 331 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 2
Met Glu Asn Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala 15 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Gin Pro Leu Gly Gly Glu 20 25 30
Ser lie Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr Ser lie Thr Phe Thr 35 40 45
Gly Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro Leu Phe Arg 50 55 60
Pro Pro Ala Gin Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp 65 70 75 80
Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp 85 90 95
Phe Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu lie Glu Ala 100 105 110
Ala Gly Glu Ala Leu Gin Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala 115 120 125
Val Pro Ser Gly Thr Gly Gin Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gin Arg 130 135 140
Arg His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg lie Val Pro Ser Pro Asp 94497-990305.DOC -4- 1353992 145 150 155 160
Trp Phe Val Gly Val Asp Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp 165 170 175
Arg Glu Gin Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp 180 185 190
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr lie Pro Gin Asp 195 200 205
Thr Val Thr Glu lie Thr Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser 210 215 220
Phe Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Pro lie Ala Arg Val Thr 225 230 235 240
Leu Val Arg Leu Arg Gin Ser Pro Arg Ala Phe lie Pro Pro Ala Pro 245 250 255
Val Leu Pro Ser Arg Asp Asn Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Val Pro 260 265 270
Glu Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu 275 280 285
Cys Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr 290 295 300
Val Arg Val Gin Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu 305 310 315 320
Glu Glu Ala Glu Cys Val Pro Asp Asn Cys Val 325 330
94497-990305.DOC 1353992 <210> 3 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 〈223>引子 <400〉 3 cgcgcatagc tccgactac 19 <210> 4 <211〉 15 <212> DNA <213〉人造序列 # <220> <223〉引子 <400> 4 gccgcgtccg caaag 15 <210〉 5 <211> 30 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223〉探針 φ <400> 5 aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg 30 <210> 6 <211〉 36 <212> DNA 〈213〉 人造序列 <220> <223〉 引子 <400> 6 36 tccctctaga gccaccatgg aaaaccccag cccggc 94497-990305.DOC -6- 1353992 <210> 7 <211〉 35 <212> DNA 〈213> 人造序列 <220〉 <223〉引子2 <400〉 7 aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg <210〉 8 〈211〉 19 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 8
Pro Leu Gly Gly Glu Ser lie Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr 1 5 10 15
Ser lie Thr 〈210〉 9 <211> 19 〈212〉 PRT <213〉智人 <400> 9
Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro 15 10 15
Leu Phe Arg <210〉 10 <211〉 15 <212〉 PRT <213〉智人
94497-990305.DOC 1353992 <400〉 10
His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser 15 10 15 1123PRT智 <210〉 <211〉 <212〉 〈213> <400〉 11
Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala
Thr lie Pro Gin Asp Thr Val 20 <210> 12 <211〉 12 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 12
Asn Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr 1 5 10
<210〉 13 <211〉 330 <212〉 PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13
Met Glu Asn Val Ser Phe Ser Leu Asp Arg Thr Leu Trp Val Phe Leu 15 10 15
Leu Ala Met Leu Gly Ser Thr Ala Gly Gin Pro Leu Gly Gly Glu Ser 20 25 30
94497-990305.DOC 1353992
Val Cys Thr Ala Arg Pro Leu Ala Arg Tyr Ser lie Thr Phe Thr Gly 35 40 45
Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro Leu Phe Arg Pro 50 55 60
Pro Ala Gin Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp Tyr 65 70 75 80
Ser Met Trp Arg Lys Asn Glu Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp Phe 85 90 95
Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu lie Glu Ala Ala 100 105 110
Gly Glu Lys Leu Gin Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val 115 120 125
Pro Ser Gly Thr Gly Gin Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val His Pro Arg 130 135 140
His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg lie Val Pro Ser Pro Asp Trp 145 150 155 160
Phe Val Gly lie Asp Ser Leu Asp Leu Cys Glu Gly Gly Arg Trp Lys 165 170 175
Glu Gin Val Val Leu Asp Leu Tyr Pro His Asp Ala Gly Thr Asp Ser 180 185 190
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr lie Pro Gin Asp Thr 195 200 205
Val Thr Glu lie Thr Ala Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser Phe 210 215 220 94497-990305.DOC -9- 1353992
Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ser Leu Pro Pro lie Ala Lys Val Thr Phe 225 230 235 240
Val Arg Leu Arg Gin Ser Pro Arg Ala Phe Ala Pro Pro Ser Leu Asp 245 250 255
Leu Ala Ser Arg Gly Asn Glu lie Val Asp Ser Leu Ser Val Pro Glu 260 265 270
Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys 275 280 285
Gly Gly Pro Cys Gly Lys Leu Gly Ala Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val 290 295 300
Arg Val Gin Pro Ala Asn Asn Gly Thr Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu 305 310 315 320
Glu Ala Glu Cys Ala Pro Asp Asn Cys Val 325 330 <210> 14 # <211> 34 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉引子 <400> 14 ggggaggctt ggtacaacct ggggggtccc tgag <210> 15 <211〉 45 <212> DNA 〈213> 人造序列 <220〉 94497-990305.DOC 10- 1353992 <223〉引子 <400〉 15 gaacagcctg agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcaag 45 <210〉 16 <211〉 30 〈212〉 DNA <213〉 人造序列 <220〉 <223〉 引子 <400〉 16 gggaagcttg ccaccatgga aaccccagcg 30
<210> 17 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉 人造序列 <220〉 <223〉 引子 <400〉 17 cagtcgtacg tttgatctcc accttggtcc 30 <210> 18 <211〉 39 <212〉 DNA <213> <220〉 人造序列 <223> 引子 <400〉 18
gtcaggatgc ggccgccacc atggagtttg tgctgagct 31 <210〉 19 <211〉 20 <212> DNA <213〉 人造序列 94497-990305.DOC -11 - 1353992 <220〉 <223〉引子 <400〉 19 accgatgggc ccttggtgga <210> 20 <211〉 381 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 20
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatagta gctcgctcac tttcggcggg gggaccaagg tggagatcaa a <210> 21 • <211> 441 <212> DNA <213〉智人 <400〉 21 atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgttatgc actggcttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcagttatt ggtactggtg gtgtcacaca ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa 94497-990305.DOC -12- 1353992 atgaacagcc tgagagccga ggacatggct atgtattact gtgcaagatg gggttactat 360 ggttcgggga gttatgagaa tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 420 gtctcttcag cctccaccaa g 441 <210〉 22 <211〉 441 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 22 atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacaacctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgttatgc actggcttcg ccaggctcca 180 ggaaaaggtc tggagtgggt atcagttatt ggtactggtg gtgtcacaca ctatgcagac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa 300 atgaacagcc tgagagccga ggacacggct gtgtattact gtgcaagatg gggttactat 360 ggttcgggga gttatgagaa tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 420 gtctcttcag cctccaccaa g 441 <210〉 23 <211〉 381 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 23 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 94497-990305.DOC -13- 3601353992 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcactcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a 381 <210> 24 <211〉 423 〈212〉 DNA .〈213〉 智人 <400〉 24
atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgtcatgc actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcagtaatt ggtactggtg gtgtcacaaa ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact gtgcaagatg gggggactgg gatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc aag 60 120 180 240 300 360 420 423
<210〉 25 〈211〉 423 <212〉 DNA <213〉 智人 <400〉 25 atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacaacctg gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgtcatgc actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcagtaatt ggtactggtg gtgtcacaaa ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa 60 120 180 240 94497-990305.DOC -14- 300 1353992 atgaacagcc tgagagccga ggacacggct gtgtattact gtgcaagatg gggggactgg 360 gatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc 420 aag 423 人 627^智 2 1 p <210> <211〉 <212〉 <213〉 <400> 26
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110
Ser Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 115 120 125 <210〉 27 94497-990305.DOC -15- 1353992 人 47RT智 11 D1 > > > 12 3 tl 11 n 2 2 2 < < < <400〉 27
Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Val Met His Trp Leu Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Val lie Gly Thr Gly Gly Val Thr His Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asn Asp 115 120 125
Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140
Ser Thr Lys 145 <210> 28 94497-990305.DOC -16- 1353992 <211> 147 <212> PRT <213〉 智人 <400> 28
Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Val Met His Trp Leu Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Val lie Gly Thr Gly Gly Val Thr His Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asn Asp 115 120 125
Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140
Ser Thr Lys 145 <210> 29 94497-990305.DOC -17- 1353992 人 27RT智 11 p <211> <212〉 〈213> <400> 29
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110
Gly Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 115 120 125 <210〉 30 <211〉 141 <212> PRT <213〉 智人 <400> 30
Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15 94497-990305.DOC -18- 1353992
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Val lie Gly Thr Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Trp Asp Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 <210> 31 <211> 141 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 31
Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 94497-990305.DOC -19- 1353992
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Val lie Gly Thr Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Trp Asp Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 94497-990305.DOC 20-

Claims (1)

1353992
第093121655號專利 中文申請專利範圍 十、申請專利运圍： 1. 一種經分離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包 含： a) 具有SEQIDNO:26之胺基酸序列之輕鏈可變區及具 有SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28之胺基酸序列之重 鏈可變區，或 b) 具有SEQ ID NO:29之胺基酸序列之輕鏈可變區及具 有SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重 鏈可變區， 且其中該抗體或其抗原結合片段結合至具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的RG1多肽。 2. 如請求項1之經分離人類抗體或其抗原結合片段，其中該 重鏈可變區具有SEQIDNO:27之胺基酸序列。 3. 如請求項1之經分離人類抗體或其抗原結合片段，其中該 重鏈可變區具有SEQIDNO:28之胺基酸序列。 4. 如請求項1之經分離人類抗體或其抗原結合片段，其中該 重鏈可變區具有SEQIDNO:30之胺基酸序列。 5. 如請求項1之經分離人類抗體或其抗原結合片段，其中該 重鏈可變區具有SEQIDNO:31之胺基酸序列。 6. —種經分離人類抗體或其抗原結合片段，其結合SEQ ID NO:2之RG1，其中該經分離人類抗體或其抗原結合片段 包含： a)輕鏈CDR3序列，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸殘基 110至117 ， 94497-1000722.doc 1353992 b)重鏈CDR3序列，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸殘基 117至132 ， ' c)輕鏈CDR1序列及CDR2序列，其分別包含SEQ ID NO:26之胺基酸殘基44至55及SEQ ID NO:26之胺基酸 殘基71至77，及 d)重鏈CDR1序列及CDR2序列，其分另ij包含SEQ ID NO:27之胺基酸殘基50至54及SEQ ID NO:27之胺基酸 殘基69至84。 # 7. —種經分離人類抗體或其抗原結合片段，其結合SEQ ID NO:2之RG1，其中該抗體包含： a) 輕鏈CDR3序列，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸殘基 110至 117， b) 重鏈CDR3序列，其包含SEQ ID NO:230之胺基酸殘基 117至126 ， c) 輕鏈CDR1序列及CDR2序列，其分別包含SEQ ID NO:29之胺基酸殘基44至55及SEQ ID NO:29之胺基酸 ^ 殘基71至77，及 d) 重鏈CDR1序列及CDR2序列，其分別包含SEQ ID NO:30之胺基酸殘基50至54及SEQ ID NO:30之胺基酸 殘基69至84。 8. 如請求項1、6或7之經分離人類抗體或其抗原結合片段， 其中該抗原結合片段選自由Fv、F(ab’）、F(ab')2、scFv、 微型抗體及雙功能抗體片段所組成之群。 9. 如請求項1、6或7之經分離人類抗體或其抗原結合片段， 94497-1000722.doc 1353992 其中該抗體為單株抗體。 ίο. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 一種免疫共輕物，其包含如請求項1、6或7之經分離人類 抗體或其抗原結合片段，其中該經分離人類抗體或其抗 原結合片段係與治療劑或可偵測標記分子共扼。 如請求項10之免疫共軛物，其中該治療劑係細胞毒素劑。 如請求項11之免疫共軛物’其中該細胞毒素劑係選自由 下列組成之群：蓖麻毒素' 阿黴素、道諾黴素、紫杉齡 (paclitaxe)、溴化乙錠、絲裂黴素、足葉乙甙、特諾波赛 (tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、二羥基炭 鲁 疽菌素二酮、放射菌素D、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素 (PE)A、PE40、蓖麻毒素、相思豆毒素及糖皮質激素及放 射性同位素。 如清求項Π之免疫共軛物，其中該細胞毒素劑為放射性 同位素，且係選自由下列組成之群：46Sc、47Se、48Sc、 72Ga、73Ga、90Y、67Cu、i〇9pd、mAg、u9pm' 153Sm、166h〇、 177Lu、186Re、i88Re、21〜、21lBi、212扪、213則及214別。 如請求項10之免疫共軛物，其中該可偵測標記為放射性 ® 標記、酵素、發色團或螢光劑。 如請求項14之免疫共軛物，其中該可偵測標記係放射性 標記，且係選自由下列組成之群：43Sc、44Sc、52以、55c〇、 68Ga、64Cu ' 86Y、94滅、"丨匕及”心。 如請求項10之免疫共軛物，其中該經分離人類抗體或其 抗原結合片段與治療劑或可偵測標記之共軛作用係使用 選自由下列組成之群之螯合劑：對_SCN_苄基_DpTA及其 94497-1000722.doc 1353992 衍生物，1，4,7，10-四氮雜環十二烷_队^"，；^，"_四乙酸 (DOTA)及其衍生物’及1，4,7-三氮雜環壬烷·Ν，N，，N·，-三 乙酸（ΝΟΤΑ)及其衍生物。 17. 如請求項16之免疫共軛物’其中所使用之螯合劑為環己 基-DTPA(CHX-A"-DTPA)或 MX-DTPA (1B4M-DTPA)。 18. 如請求項10至17中任一項之免疫共軛物’其係用於治療 或診斷。 19. 如請求項10至17中任一項之免疫共軛物，其係用於治療 或診斷癌症。 20. 如請求項19之免疫共軛物，其中該癌症為前列腺癌、腎 癌、卵巢癌或結腸直腸癌。 21. —種單鏈抗體分子，其結合至具有SEq ID n〇:2之胺基酸 序列的RG1多肽’其令該單鏈抗體分子包含如請求項1、6 或7之抗體之抗原結合區域。 22_ —種多肽’其結合至具有SEq id n〇:2之胺基酸序列的 RG1多肽’其中該多肽包含如請求項丨、6或7之抗體之抗 原結合區域。 23. —種如請求項10至17中任一項之免疫共軛物之用途，其 係用於製備治療或診斷癌症之醫藥組合物。 24. 如請求項23之用途’其中該癌症為前列腺癌、腎癌、卵 巢癌或結腸直腸癌。 25. —種如請求項10至17中任一項之免疫共軛物之用途，其 係用於製備選擇性破壞表現具有SEQ ID NO:2之胺基酸 序列的人類RG1多肽之細胞的醫藥組合物。 94497-1000722.doc 26. 種有效量之如請求項1至9中任一項之經分離人類抗體 或其抗原結合片段之用途，其係用於製備抑制表現具有 SEQ ID NO:2之胺基酸序列的人類RG1多肽之細胞的醫藥 組合物。 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 一種如請求項1至8之經分離人類抗體或其抗原結合片段 之用途，其係用於製備治療人類病患病狀之醫藥品，其 中該病狀係與與具有SEq ID N〇:2之胺基酸序列之RGi多 肽的表現相關聯。 如凊求項27之用途’其中該病狀為癌症。 如請求項28之用途，其中該癌症為前列腺癌、腎癌、卵 巢癌、結腸直腸癌或末期轉移性癌症。 如凊求項27之用途，其中該經分離人類抗體或其抗原結 合片段係與治療劑共軛。 如請求項30之用途，其中該治療劑係細胞毒素劑。 如喷求項3 1之用途，其中該細胞毒素劑係選自由下列組 成之群：蓖麻毒素、阿黴素、道諾黴素、紫杉酚、溴化 乙錠、絲裂黴素、足葉乙甙、特諾波賽、長春新鹼、長 春鹼、秋水仙鹼、二羥基炭疽菌素二酮、放射菌素D、白 喉毒素、綠膿桿菌外毒素（PE)A、PE4〇、蓖麻毒素、相思 豆毒素及糖皮質激素及放射性同位素。 如β求項3 1之用途’其中該細胞毒素劑為放射性同位 素’且係選自由下列組成之群：46Sc、47Sc、48Sc、72Ga、 73Ga、9°Y、67Cu、109Pd、丨1丨Ag、149Pm、153Sm、166Ho、 177Lu、！86Re、mRe、211射、川則、212則、213則及 214β卜 94497-1000722.doc 1353992 34.如請求項30之用途，其中該經分離人類抗體或其抗原結 合片段與治療劑之共軛作用係使用選自由下列組成之群 之螯合劑：對-SCN-苄基-DPTA及其衍生物，1，4,7，10-四 氮雜環十二烷-队^",1^"-四乙酸（00丁八）及其衍生物， 及1，4,7-三氮雜環壬烷-N，N'，N"-三乙酸（ΝΟΤΑ)及其衍生 物。 3 5.如請求項34之用途，其中所使用之螯合劑為環己基 -DTPA(CHX-A”-DTPA)或 MX-DTPA (1B4M-DTPA)。 • 36. —種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至8之 經分離人類抗體或其抗原結合片段。 3 7. —種如請求項1至8之經分離人類抗體或其抗原結合片段 之用途，其係用於製備治療或診斷癌症之醫藥組合物。 3 8. —種有效量之如請求項21之單鏈抗體分子之用途，其係 用於製備抑制表現具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的人 類RG1多肽之細胞的醫藥組合物。
94497-1000722.doc 6·
TW93121655A 2003-07-22 2004-07-20 Rg1 antibodies and uses thereof TWI353992B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48903203P 2003-07-22 2003-07-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200510459A TW200510459A (en) 2005-03-16
TWI353992B true TWI353992B (en) 2011-12-11

Family

ID=34102813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW93121655A TWI353992B (en) 2003-07-22 2004-07-20 Rg1 antibodies and uses thereof

Country Status (22)

Country Link
US (4) US7335748B2 (zh)
EP (1) EP1648510B1 (zh)
JP (1) JP4680902B2 (zh)
KR (1) KR101215218B1 (zh)
CN (1) CN1826138B (zh)
AU (1) AU2004259731B2 (zh)
BR (1) BRPI0412245A (zh)
CA (1) CA2532394C (zh)
CR (1) CR8231A (zh)
EC (1) ECSP066379A (zh)
ES (1) ES2427544T3 (zh)
GT (1) GT200400138A (zh)
IL (1) IL172871A (zh)
MX (1) MXPA06000798A (zh)
NO (1) NO20060843L (zh)
NZ (1) NZ544911A (zh)
PE (1) PE20050712A1 (zh)
RU (1) RU2377252C2 (zh)
TW (1) TWI353992B (zh)
UY (1) UY28424A1 (zh)
WO (1) WO2005010048A2 (zh)
ZA (1) ZA200601521B (zh)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ544911A (en) * 2003-07-22 2008-12-24 Schering Ag RG1 antibodies and uses thereof
US7294704B2 (en) 2003-08-15 2007-11-13 Diadexus, Inc. Pro108 antibody compositions and methods of use and use of Pro108 to assess cancer risk
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
EA201000921A1 (ru) * 2007-11-30 2010-12-30 Бристол-Маерс Сквибб Компани Конъюгаты антител против rg-1
US9260525B2 (en) 2008-02-04 2016-02-16 Xiao-Jia Chang Antibody molecules to oncogenic isoforms of fibroblast growth factor receptor-2 and uses thereof
WO2012021841A2 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Attogen Inc. Antibody molecules to oncogenic isoforms of fibroblast growth factor receptor-2 and uses thereof
US20110059091A1 (en) * 2008-02-04 2011-03-10 Xiao-Jia Chang Inhibitors of oncogenic isoforms and uses thereof
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
PE20141791A1 (es) 2012-02-13 2014-11-19 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de enediino, conjugados de los mismos y sus usos y metodos
WO2014126836A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin compounds, methods of making and use
CA2921401A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 William Marsh Rice University Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
AU2015261131B2 (en) 2014-05-13 2018-02-22 Paul Scherrer Institut Production of 43Sc radionuclide and radiopharmaceuticals thereof for use in Positron Emission Tomography
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
EP3789399A1 (en) 2014-11-21 2021-03-10 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
MX2017009144A (es) 2015-01-14 2017-11-22 Bristol Myers Squibb Co Dimeros de benzodiazepina unidos con puentes de heteroarileno, conjugados de estos, y sus metodos de preparacion y uso.
KR20180089433A (ko) 2015-12-21 2018-08-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 부위-특이적 접합을 위한 변이체 항체
KR20190005924A (ko) 2016-05-10 2019-01-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 향상된 안정성을 갖는 튜부리신 유사체의 항체-약물 접합체
WO2018035391A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
CA3064321A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
AU2019277094A1 (en) 2018-05-29 2021-01-21 Bristol-Myers Squibb Company Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
JP7389803B2 (ja) 2018-11-30 2023-11-30 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー グルタミンを含有する軽鎖ｃ末端に伸長部分を含む抗体およびそのコンジュゲートならびにその方法および用途
WO2020123425A2 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5246692A (en) 1986-09-05 1993-09-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6300129B1 (en) * 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) * 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5871969A (en) 1996-02-12 1999-02-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids encoding human neuronal attachment factor-1
US6287777B1 (en) * 1996-05-10 2001-09-11 Beth Israel Deaconess Medical Center NPG-1 gene that is differentially expressed in prostate tumors
US6177244B1 (en) * 1996-05-10 2001-01-23 Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. NPG-1 gene that is differentially expressed in prostate tumors
US5804382A (en) 1996-05-10 1998-09-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for identifying differentially expressed genes and differences between genomic nucleic acid sequences
WO1998045442A2 (en) 1997-04-10 1998-10-15 Zymogenetics, Inc. Secreted f-spondin homologs
WO1998050073A1 (en) 1997-05-09 1998-11-12 Smithkline Beecham Corporation Integrin ligand, human mindin
ES2312205T3 (es) 1998-03-10 2009-02-16 Genentech, Inc. Nuevo polipeptido y acidos nucleicos que lo codifican.
CA2347085A1 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Diadexus, Inc. Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer
EE05627B1 (et) * 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US6824780B1 (en) * 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US6682902B2 (en) * 1999-12-16 2004-01-27 Schering Aktiengesellschaft DNA encoding a novel RG1 polypeptide
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
CA2658221C (en) 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
IL149701A0 (en) 2001-05-23 2002-11-10 Pfizer Prod Inc Use of anti-ctla-4 antibodies
GB0124317D0 (en) * 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
NZ544911A (en) * 2003-07-22 2008-12-24 Schering Ag RG1 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL172871A (en) 2015-02-26
EP1648510B1 (en) 2013-06-19
CA2532394A1 (en) 2005-02-03
US7611706B2 (en) 2009-11-03
TW200510459A (en) 2005-03-16
NZ544911A (en) 2008-12-24
WO2005010048A3 (en) 2005-05-26
RU2006105339A (ru) 2006-06-27
US20080138899A1 (en) 2008-06-12
AU2004259731A1 (en) 2005-02-03
PE20050712A1 (es) 2005-11-02
CR8231A (es) 2006-07-14
US7608263B2 (en) 2009-10-27
GT200400138A (es) 2005-03-22
BRPI0412245A (pt) 2006-09-19
KR101215218B1 (ko) 2012-12-26
CN1826138A (zh) 2006-08-30
US20050019845A1 (en) 2005-01-27
CN1826138B (zh) 2012-05-23
ECSP066379A (es) 2006-08-30
RU2377252C2 (ru) 2009-12-27
NO20060843L (no) 2006-02-21
MXPA06000798A (es) 2006-04-07
IL172871A0 (en) 2006-06-11
JP4680902B2 (ja) 2011-05-11
ZA200601521B (en) 2007-04-25
UY28424A1 (es) 2005-02-28
ES2427544T3 (es) 2013-10-30
US20100081795A1 (en) 2010-04-01
CA2532394C (en) 2013-09-17
KR20060054329A (ko) 2006-05-22
WO2005010048A2 (en) 2005-02-03
EP1648510A2 (en) 2006-04-26
US20080226656A1 (en) 2008-09-18
JP2007527403A (ja) 2007-09-27
AU2004259731B2 (en) 2010-04-22
US7335748B2 (en) 2008-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI353992B (en) Rg1 antibodies and uses thereof
US8084029B2 (en) Alpha-fetoprotein Immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
CA2489467C (en) Humanized monoclonal antibody hpam4
CA2462653C (en) Nucleic acid and corresponding protein entitled 161p2f10b useful in treatment and detection of cancer
CA2563735C (en) Antibodies and molecules derived therefrom that bind to steap-1 proteins
US7893217B2 (en) Isolated human antibodies that bind epitopes on RG1
JP2006204290A (ja) ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法
US8084576B2 (en) Cancer associated glucose transporter 8 variant
ES2549405T3 (es) Anticuerpos y moléculas relacionadas que se unen con proteínas de PSCA
TW201021828A (en) Antibodies and related molecules that bind to 58P1D12 proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees