JP2006204290A - ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法 - Google Patents

ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2006204290A
JP2006204290A JP2005365540A JP2005365540A JP2006204290A JP 2006204290 A JP2006204290 A JP 2006204290A JP 2005365540 A JP2005365540 A JP 2005365540A JP 2005365540 A JP2005365540 A JP 2005365540A JP 2006204290 A JP2006204290 A JP 2006204290A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
steap
protein
antibody
expression
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2005365540A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2006204290A5 (ja
Inventor
Daniel E H Afar
ダニエル イー． エイチ． アファー
Rene S Hubert
レネ エス． ハバート
Arthur B Raitano
アーサー ビー． ライタノ，
Douglas C Saffran
ダグラス シー． サフラン，
Steve Chappell Mitchell
スティーブ チャッペル ミッチェル，
Mary Faris
メアリー ファリス，
Aya Jakobovits
アヤ ジャコボビッツ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agensys Inc
Original Assignee
Agensys Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/455,486 external-priority patent/US6833438B1/en
Application filed by Agensys Inc filed Critical Agensys Inc
Publication of JP2006204290A publication Critical patent/JP2006204290A/ja
Publication of JP2006204290A5 publication Critical patent/JP2006204290A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

【課題】ヒト前立腺癌などの種々の癌において有用な診断および治療方法の提供。
【解決手段】細胞表面ヘビ状（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）膜貫通抗原の新規ファミリーの内、前立腺ならびに前立腺癌において排他的にまたは優勢に発現される、前立腺の６つの膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）をコードするＳＴＥＡＰ遺伝子または相補的なポリヌクレオチドを用い遺伝子組み換え技術により、ＳＴＥＡＰタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを作製し、更に、それらに結合する抗体を作製する。
【選択図】なし

Description

本出願は、１９９９年１２月６日出願、米国特許出願第０９／４５５，４８６号の利益を請求する。
（発明の分野）
本明細書に記載の発明は、新規な遺伝子のファミリーおよびそれらのコードするタンパク質および腫瘍抗原（ＳＴＥＡＰと名付けられた）に関し、そして種々の癌（特に、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌を含む）の管理において有用な診断および治療の方法ならびに組成物に関する。
（発明の背景）
癌は、冠動脈疾患に次いで、ヒトの死亡の二番目に主要な原因である。世界中で、数百万の人々が毎年、癌で死んでいる。アメリカ合衆国単独でも、癌は、毎年に５０万人を軽く上回る死亡を引き起しており、１年あたりおよそ１４０万の新しい症例が診断されている。心疾患に起因する死亡は、有意に低下してきたが、癌に起因する死亡は、一般に増大している。次の世紀の初頭には、癌は死亡の主要な原因になると予想される。
世界中で、いくつかの癌が主な死亡原因として突出している。詳細には、肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌が、癌死の主要な原因である。これらおよび実質的に全ての他の癌は、共通の致死的特徴を共有する。ごくわずかな例外を除いて、癌腫由来の転移性疾患は、致死的である。さらに、原発性癌を最初に生きのびた癌患者にとってさえ、共通の経験として、患者らの生活が劇的に変化したことが示される。多くの癌患者は、再発または処置の失敗の可能性の認識から生じる強い不安感を経験する。多くの癌患者は、処置後の身体的衰弱を経験する。多くの癌患者は再発を経験する。
世界中で、前立腺癌は、ヒトにおいて４番目に最も流行している癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、前立腺癌は、間違いなく最も通常の男性の癌であり、そしてヒトにおける癌死の第二の主要な原因である。アメリカ合衆国単独でも、唯一肺癌に次いで、毎年、この疾患で４０，０００人を超える男性が死んでいる。これらの数字の大きさにもかかわらず、転移性前立腺癌の有効な処置はいまだに存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモンアブレーション（消失）療法、および化学療法が、主要な処置の様式であり続けている。不幸にも、これらの処置は、多くの場合無効であり、そしてしばしば望ましくない結果を伴う。
診断的分野では、初期の限局性腫瘍を正確に検出できる前立腺腫瘍マーカーがないことは、この疾患の管理における重要な限界となっている。血清ＰＳＡアッセイは非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的有用性は、いくつかの重要な事項を欠くと、広くみなされている。
前立腺癌に特異的なさらなるマーカーを同定するにおける進歩が、マウスにおいて疾患の種々の段階を再現し得る、前立腺癌異種移植片の生成によって改善されている。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて継代生存し、そして疾患進行（アンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への遷移、および転移性病変の発生を含む）を模倣する能力を示した、前立腺癌異種移植片である（米国特許第６，１０７，５４０号；Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。さらに最近になって同定された前立腺癌マーカーとしては、以下が挙げられる：ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５）、およびＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４５２３）。
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断および処置するための労力を容易にしたが、診断および治療をさらに改善するため、前立腺および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的の同定の必要性が存在する。
（発明の要旨）
本発明は、細胞表面のサーパンタインな（曲がりくねった）（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）膜貫通抗原の新規なファミリーに関する。このファミリーの２つのタンパク質は、前立腺および前立腺癌において排他的または優先的に発現され、従ってこのファミリーのメンバーは、「ＳＴＥＡＰ」（Ｓｉｘ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ（前立腺の６つの膜貫通上皮抗原））と名付けられている。４つの特定のヒトＳＴＥＡＰが、本明細書において記載されており、そして特徴付けられている。ヒトＳＴＥＡＰは、その間で高い程度の構造的保存を示すが、いずれの公知のヒトタンパク質に対しても有意な構造的相同性を示さない。
ＳＴＥＡＰファミリーのプトロタイプ（原型）のメンバーである、ＳＴＥＡＰ−１は、正常なヒト組織における前立腺細胞で優先的に発現されたＩＩＩａ型膜タンパク質であるようである。構造的に、ＳＴＥＡＰ−１は、６つの膜貫通ドメインならびに細胞内Ｎ末端およびＣ末端の分子トポロジーによって特徴付けられた３３９アミノ酸のタンパク質であり、このことは、ＳＴＥＡＰ−１が、３つの細胞外ループおよび２つの細胞内ループに「サーパンタイン（曲がりくねった）（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）」様式で折り畳むことを示唆する。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現は、種々の段階の前立腺癌にまたがって高レベルで維持されている。さらに、ＳＴＥＡＰ−１は、特定の他のヒト癌において非常に過剰発現されている。詳細には、ＳＴＥＡＰ−１の細胞表面発現は、種々の前立腺細胞および前立腺癌細胞、肺癌、膀胱癌細胞および結腸癌細胞において明確に決定されている。これらの特徴は、ＳＴＥＡＰ−１が、前立腺癌、膀胱癌、結腸癌および他の癌において高レベルで発現される特異的な細胞表面腫瘍抗原であることを示す。
このファミリーの第二のメンバーである、ＳＴＥＡＰ−２は、４５４アミノ酸のタンパク質であり、ＳＴＥＡＰ−１のトポロジーと類似の推定分子トポロジーを有する。ＳＴＥＡＰ−２は、ＳＴＥＡＰ−１と同様、正常なヒト組織において前立腺特異的であり、そしてまた前立腺癌において発現される。ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−１のＯＲＦのアラインメントは、２３７アミノ酸残基重複にわたって５４．９％の同一性を示し、そしてＳＴＥＡＰ−２中の６つの推定膜貫通ドメインの位置は、ＳＴＥＡＰ−１における膜貫通ドメインの位置と一致する（図１１Ａ−Ｂ）。
ＳＴＥＡＰ−３およびＳＴＥＡＰ−４がまた、本明細書に記載されている。これらはまた構造的に関連しており、そして特有の発現プロフィールを示す。詳細には、ＳＴＥＡＰ−３およびＳＴＥＡＰ−４は、異なる組織制限パターンを示すようである。４つのＳＴＥＡＰ全てのアミノ酸配列アラインメントを、図１１Ａ〜Ｂに示す。
本発明は、本明細書に記載されるＳＴＥＡＰ遺伝子、ｍＲＮＡ、および／またはコード配列の全てまたは一部に相当するかまたは相補的なポリヌクレオチドを、好ましくは単離した形態で提供する。これには、ＳＴＥＡＰタンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ＳＴＥＡＰ遺伝子またはｍＲＮＡ配列またはその部分に相補的なＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＳＴＥＡＰ遺伝子、ｍＲＮＡに対して、もしくはＳＴＥＡＰコードポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、ＳＴＥＡＰをコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離する手段も提供される。ＳＴＥＡＰポリヌクレオチドを含有する組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換されたまたは形質導入された細胞、およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物の発現のための宿主ベクター系がまた提供される。
本発明はさらに、ＳＴＥＡＰタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明はさらに、ＳＴＥＡＰタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供する。この抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体、ならびに検出マーカーで標識した抗体、そして放射性核種／放射性同位体、毒素または他の治療組成物に結合体化された抗体が挙げられる。本発明はさらに、種々の生物学的サンプルにおいて、ＳＴＥＡＰポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在を検出するための方法を提供する。本発明はさらに、前立腺癌および他の癌を処置するための種々の治療用組成物およびストラテジー（詳細には、抗体、ワクチン、および低分子治療を含む）を提供する。
本発明はさらに、種々の生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在を検出するための方法、ならびにＳＴＥＡＰを発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明はさらに、前立腺癌を処置するための種々の治療用組成物およびストラテジー（詳細には、抗体、ワクチン、および低分子治療を含む）を提供する。このタンパク質の細胞外の性質は、ＳＴＥＡＰおよびその機能を標的する分子、ならびにＳＴＥＡＰと相互作用する他のタンパク質、因子およびリガンドを標的する分子を用いる、多数の治療アプローチを提供する。これらの治療アプローチとしては、抗ＳＴＥＡＰ抗体を用いる抗体療法、低分子療法、およびワクチン療法が挙げられる。さらに、前立腺癌におけるそのアップレギュレートされた発現を考慮して、ＳＴＥＡＰは、前立腺癌の診断マーカー、段階決定マーカー、および／または予後マーカーとして有用であり、そして同様に、このタンパク質を発現する他の癌のマーカーであり得る。詳細には、ＳＴＥＡＰ−１は、前立腺癌転移を同定するための優れたマーカーを提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞表面ヘビ状（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）膜貫通抗原の新規ファミリーに関する。このファミリーにおけるこれらのタンパク質の２つは、前立腺、ならびに前立腺癌において排他的にかまたは優勢に発現され、従って、このファミリーのメンバーは、「ＳＴＥＡＰ」（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）と名付けられた。４つの特定のヒトＳＴＥＡＰは、本明細書中で記載されかつ特徴付けられる。ヒトＳＴＥＡＰは、これらの中で高度な構造的保存を示すが、任意の公知のヒトタンパク質と顕著な構造的相同性を示さない。本発明は、前立腺および他の癌の診断および治療のための方法および組成物に関する。本方法は、ヒトＳＴＥＡＰ遺伝子に対応する単離されたポリヌクレオチド、ＳＴＥＡＰ遺伝子によってコードされるタンパク質およびそのフラグメント、ならびにＳＴＥＡＰタンパク質を特異的に認識しそして結合し得る抗体を利用する。
他に規定しない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語、表記、および他の科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、共通して理解される意味を有する用語は、明確さおよび／または迅速な参照のために本明細書中で定義され、そしてこのような定義の本明細書中への包含は、当該分野において一般に理解されることにわたる実質的な相違を表すとは必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載または参照される技術および手順は、一般に、従来の方法論（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において記載されている方法論を広く利用した分子クローニングの方法論）を用いて、当業者によって十分に理解されかつ共通して用いられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、他に注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロトコールおよび／またはパラメーターに従って実行される。
本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」および「局所的に進行した疾患」とは、前立腺皮膜を通して伸長した前立腺癌を意味し、そして米国泌尿器学会（ＡＵＡ）システムの下でのステージＣ疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔシステムの下でのステージＣ１−Ｃ２疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移）システムの下でのステージＴ３−Ｔ４およびＮ＋疾患を含むことが意味される。一般に、手術は、局所的に進行した疾患を有する患者のためには推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化している（器官に限定されている）前立腺癌を有する患者と比較して、実質的により好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超える硬化の明白な証拠、または前立腺基部上の非対称もしくは硬化によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺皮膜に侵入するかもしくは浸透するか、外科的な境界まで伸長するか、または精嚢に侵入する場合、現在、徹底的な前立腺切除後に生理学的に診断される。
本明細書中で使用する場合、用語「転移性前立腺癌」および「転移性疾患」は、局所的なリンパ節、または異なる部位に拡がった前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステム下でステージＤ疾患、およびＴＮＭシステム下でステージＴｘＮｘＭ＋を包含することが意味される。局所的に進行した前立腺癌の場合、手術は一般的には転移性疾患を有する患者には示されず、そしてホルモン（アンドロゲン除去）治療が好ましい治療様式である。転移性前立腺癌を有する患者は、最終的に、処置の開始から１２〜１８ヶ月以内にアンドロゲン抵抗性の状態を発症し、そしてこれらの患者のおよそ半数がその後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、結局のところ、特徴として、溶骨性ではなくむしろ造血性である（すなわち、正味の骨の形成を生じる）。骨への転移は、脊椎において最も頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、胸郭、頭蓋、および上腕骨と続く。転移のための他の一般的な部位には、リンパ節、肺、肝臓、および脳が含まれる。転移性の前立腺癌は、代表的には、直視的または腹腔鏡的な骨盤のリンパ節切除術、全身の放射性核種スキャン、骨格のラジオグラフィー、および／または骨損傷生検によって診断される。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基または１０塩基対の長さのヌクレオチドのポリマー型を意味し、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変型のいずれかであり、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含むことを意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１０アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの状況において使用される、用語「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズする」「ハイブリダイズする」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％ ホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡにおけるハイブリダイゼーション）をいうことが意味される。ここで、ハイブリダイゼーションのための温度が、３７℃より高い温度であり、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中での洗浄のための５５℃がより高い温度であり、そして最も好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験による計算である。一般に、より長いプローブは、正しいアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、融解温度より下の環境において、相補鎖が存在する場合、変性したＤＮＡの再アニーリングする能力に依存する。プローブと、ハイブリダイズ可能な配列との間の所望される相同性の程度が高いほど、使用され得る相対的な温度が高くなる。結果として、相対的により高い温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度ではそのようなことがより少ない、ということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅrｓ，（１９９５）を参照のこと。
本明細書中に規定されるように、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の条件によって同定され得る：（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度を使用する条件（例えば、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤（例えば、ホルムアミド）を使用する条件（例えば、５０％ （ｖ／ｖ）ホルムアミドおよび０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ Ｆｉｃｏｌ／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）および７５０ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、４２℃）；または（３）５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％ 硫酸デキストラン、４２℃、さらに以下の洗浄工程、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド、５５℃、続いて、高ストリンジェンシー洗浄（ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる、５５℃）を使用する条件。
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ）の使用を含む。これは、上記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下を含む溶液中での３７℃、一晩のインキュベーションである：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡ、続いて約３７℃〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子（例えば、プローブ長など）を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況においてはまた、用語「相同性」は、ＢＬＡＳＴ分析の保存性アミノ酸の判断基準を使用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。例えば、同一性％の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって生成され得る。アミノ酸置換（これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる）に関するさらなる詳細は以下に提供される。
さらなる定義が、引き続くサブセクションを通して提供される。
（ＳＴＥＡＰポリヌクレオチド）
本発明の一つの局面は、ＳＴＥＡＰ遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは、ＳＴＥＡＰタンパク質およびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、ＳＴＥＡＰ遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＳＴＥＡＰ遺伝子、ｍＲＮＡもしくはＳＴＥＡＰをコードするポリヌクレオチド（集合的に、「ＳＴＥＡＰポリヌクレオチド」）にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における）のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびタンパク質は、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−３の遺伝子およびタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｒ８０９９１（ＳＴＥＡＰ−４）に対応する遺伝子およびタンパク質、ならびに他のＳＴＥＡＰタンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他のＳＴＥＡＰタンパク質および改変体は、一般的に、ＳＴＥＡＰコード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性、そして（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）少なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し、より好ましくは、（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）７０％以上の相同性を共有する。
本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰファミリーメンバー遺伝子配列は、他のタンパク質からＳＴＥＡＰタンパク質を区別する、独特な高度に保存されたアミノ酸配列を共有するＳＴＥＡＰタンパク質をコードする。１以上のこれらの独特な高度に保存されたドメインを含むタンパク質は、ＳＴＥＡＰファミリーメンバーに関し得るかまたは新たなＳＴＥＡＰタンパク質を示し得る。全長ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、およびＳＴＥＡＰ−３、ならびにＳＴＥＡＰ−４のタンパク質配列のアミノ酸配列アラインメントである図１１Ａ〜Ｂを参照して、ＳＴＥＡＰが構造レベルで密接に関連することは明らかである。ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２のタンパク質配列のアミノ酸配列のアラインメントである図１１Ｃを参照して、密接な構造的保存は、特に好ましくは、膜貫通ドメインにおいて明らかである。ＳＴＥＡＰ−１配列およびＳＴＥＡＰ−２配列は、２３７アミノ酸重複にわたって５４．９％同一性を共有する。ＳＴＥＡＰの間のさらなるアミノ酸配列アラインメントは、図１１Ｄおよび１１Ｅに示される。これらのアラインメントは、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−３が２６４アミノ酸領域にわたって４０．９％同一であるが、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−３は、４１６アミノ酸領域にわたって４７．８％同一である。
ＳＴＥＡＰポリヌクレオチドは、図１Ａ〜Ｂに示されるようなヒトＳＴＥＡＰ−１のヌクレオチド配列、図９Ａ〜Ｄに示されるようなヒトＳＴＥＡＰ−２のヌクレオチド配列、図１０Ａ〜Ｅに示されるようなヒトＳＴＥＡＰ−３のヌクレオチド配列、もしくは図１０Ｆに示されるようなヒトＳＴＥＡＰ−４のヌクレオチド配列、またはこれらに相補的な配列、あるいは、前述の任意のポリヌクレオチドフラグメントを有するポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態は、ヒトＳＴＥＡＰ−１タンパク質、ＳＴＥＡＰ−２タンパク質、ＳＴＥＡＰ−３タンパク質またはＳＴＥＡＰ−４タンパク質のアミノ酸配列、これらに相補的な配列、または前述の任意のポリヌクレオチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、図１Ａ〜Ｂに示されるヒトＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ、図９Ａ〜Ｄに示されるヒトＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡ、図１０Ａ〜Ｅに示されるヒトＳＴＥＡＰ−３ ｃＤＮＡ、または図１０Ｆに示されるようなＳＴＥＡＰ−４、あるいは、これらのポリヌクレオチドフラグメントに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡ配列の特定の一部分をコードするＳＴＥＡＰポリヌクレオチド（例えば、タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む：図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸１〜およそのアミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸２０〜およそのアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸３０〜およそのアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸４０〜およそのアミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸５０〜およそのアミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸６０〜およそのアミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸７０〜およそのアミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸８０〜およそのアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸９０〜およそのアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。このスキームの後、ＳＴＥＡＰタンパク質のさらなる部分をコードするポリヌクレオチド（少なくとも１０アミノ酸の）は、本発明の代表的な実施形態である。ＳＴＥＡＰタンパク質のこのような部分は、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸１００〜３３９、または図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−２タンパク質のアミノ酸１００〜４５４、または図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−３タンパク質のアミノ酸１００〜４５９、および図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−４のアミノ酸１００〜１３３を含む。ＳＴＥＡＰタンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドがまた意図される。例えば、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質のおよそのアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）〜およそのアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、ＳＴＥＡＰタンパク質配列内に含まれる、１つ以上の生物学的モチーフをコードするＳＴＥＡＰポリヌクレオチドフラグメントを含む。１つの実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、他のＳＴＥＡＰファミリーメンバー（例えば、１以上の膜貫通ドメイン）との相同性を示すＳＴＥＡＰの１つ以上の領域をコードし得る。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上のＳＴＥＡＰ選択的スプライシング改変体に独特である配列をコードし得る。本発明のさらに別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、ＳＴＥＡＰタンパク質の免疫原性部分をコードし得る。ＳＴＥＡＰタンパク質の免疫原性部分の１例は、図１Ａ〜Ｂ（ＷＫＭＫＰＲＲＮＬＥＥＤＤＹＬ；配列番号２）に示されるようなＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜２８である。
前述の段落のポリヌクレオチドは、多くの異なる特定の使用を有する。ＳＴＥＡＰは、前立腺癌および他の癌において差示的に発現されるので、これらのポリヌクレオチドは、正常な組織 対 癌性組織におけるＳＴＥＡＰ遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代表的には、ＳＴＥＡＰタンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドが使用されて、ＳＴＥＡＰ遺伝子産物の特定の領域において、混乱状態（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価し得る。例示的なアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方を含み、これらの両方は、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タンパク質内のこれらの領域を試験する。単一ヌクレオチド多型を検出する配列を分析するためのアッセイおよび方法はまた、利用可能である（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６（２）２２３−２３６）。
本明細書中で開示される本発明の他の具体的に意図された実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子（モルホリノアンチセンス分子を含む）、ならびに天然の供給源または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸分子である。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、あるいは他の分子（ペプチド核酸（ＰＮＡ）または塩基対依存様式でＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的に結合する非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業者は、ＳＴＥＡＰポリヌクレオチドおよび本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲得し得る。
アンチセンス技術は、細胞内部に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を必然的に伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、ＳＴＥＡＰ）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明のＳＴＥＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原子に置換される。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫酸転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）（これらの開示は、本明細書中で参考として完全に援用される）を参照のこと。本発明のさらなるＳＴＥＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ&Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６９−１７５を参照のこと）。
本発明のＳＴＥＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、ＳＴＥＡＰゲノムもしくは対応するｍＲＮＡの、最初の１００個のＮ末端コドンまたは最後の１００個のＣ末端コドンに相補的であり、そしてこれらのコドンと安定にハイブリダイズするか、あるいはＡＴＧ開始部位と重複する、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてタンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にしない。好ましくは、本発明のＳＴＥＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０ｍｅｒフラグメントである。必要に応じて、ＳＴＥＡＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰの最初の１０個のＮ末端コドンおよび最後の１０個のＣ末端コドンにおける領域に相補的な３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、ＳＴＥＡＰ発現の阻害において、リボザイムを利用するように改変される。Ｌ．Ａ．ＣｏｕｔｕｒｅおよびＤ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １２：５１０−５１５（１９９６）。
本発明のこの局面のさらなる特定の実施形態は、プライマーおよびプライマーペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素のような）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーが、サンプルにおけるＳＴＥＡＰポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得、そしてＳＴＥＡＰタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用され得る。このようなプローブの例としては、図１Ａ〜Ｂ（配列番号１）、図９Ａ〜Ｄ（配列番号７）または図１０Ａ〜Ｅ（配列番号９）に示されるヒトＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡ配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチドが挙げられる。ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーペアの例はまた、続く実施例において記載される。当業者に理解されるように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そしてＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡを有効に増幅および／または検出するために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ遺伝子ではない遺伝子に、対応するかまたは相補的である混入ポリヌクレオチド、またはＳＴＥＡＰ遺伝子産物もしくはそのフラグメントではないポリペプチドをコードする混入ポリヌクレオチドから実質的に分離されている場合、「単離された」と言われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離されたＳＴＥＡＰポリヌクレオチドを獲得し得る。
本発明のＳＴＥＡＰポリヌクレオチドは、種々の目的に有用である。この目的としては、ＳＴＥＡＰ遺伝子、ｍＲＮＡまたはそのフラグメントの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使用；前立腺癌および他の癌の、診断および／または予後のための試薬としての使用；前立腺細胞へのカルシウムの侵入を特異的に阻害する分子を同定するための手段としての使用；ＳＴＥＡＰポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としての使用；ＳＴＥＡＰ遺伝子の発現および／またはＳＴＥＡＰ転写物の翻訳を、調節または阻害するための手段としての使用；ならびに治療薬としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
（ＳＴＥＡＰの分子的特徴および生化学的特徴）
本発明は、ＳＴＥＡＰと命名された新規タンパク質ファミリーに関する。４つのＳＴＥＡＰが、構造特徴、分子特徴および生化学的特徴によって本明細書中に詳細に記載される。以下に続く実施例にさらに記載されるように、このＳＴＥＡＰは、種々の方法で特徴付けられている。例えば、ヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列の分析は、ＳＴＥＡＰファミリー内で保存された構造エレメントを同定するために実施された。ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡ発現の大量のＲＴ−ＰＣＲ分析およびノーザンブロット分析が、種々のＳＴＥＡＰメッセージを発現する正常組織および癌性組織の範囲を確立するために実施された。ＳＴＥＡＰタンパク質発現のウエスタンブロット分析、免疫組織化学分析、およびフローサイトメトリー分析は、ＳＴＥＡＰのタンパク質発現プロフィール、細胞表面局在および総分子トポロジーを決定するために実施された。
ＳＴＥＡＰファミリーの原型のメンバーであるＳＴＥＡＰ−１は、いずれの既知のヒトタンパク質とも識別可能な相同性を有さない、３３９アミノ酸の６回膜貫通細胞表面タンパク質である。ヒトＳＴＥＡＰ−１のｃＤＮＡヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、図１Ａ〜Ｂに示される。細胞膜内に組込まれたＳＴＥＡＰ−１の総トポロジーの模式図は、図１Ｂに示される。ＳＴＥＡＰ−１発現は、正常組織において主に前立腺特異的である。詳細には、正常ヒト組織におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現およびＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現の大量の分析により、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質が、前立腺に主に発現され、そしてはるかに少ない程度で膀胱に発現されることが示される。ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡはまた、相対的に前立腺特異的である、非常に低いレベルの発現のみが、いくつかの他の正常組織で検出される。癌において、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡおよびＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、一貫して、前立腺癌（アンドロゲン依存性腫瘍およびアンドロゲン非依存性腫瘍を含む）そしてこの疾患の全段階の間に高レベルで発現される。ＳＴＥＡＰ−１はまた、他の癌で発現される。詳細には、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡは、非常に高いレベルで、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌（ならびに他の癌）で発現される。さらに、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の細胞表面発現が、前立腺癌、膀胱癌、肺癌および結腸癌で確立されている。従って、ＳＴＥＡＰ−１は、特定の癌（詳細には、前立腺癌腫、結腸癌腫および膀胱癌腫を含む）の処置のための、優れた診断標的および治療標的の顕著な特徴の全てを有する。
このファミリーの第２のメンバーであるＳＴＥＡＰ−２は、異なる遺伝子によってコードされた４５４アミノ酸タンパク質であり、ＳＴＥＡＰ−１の推定分子トポロジーに類似した推定分子トポロジーを有する。ＳＴＥＡＰ−２のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、図９Ａ〜Ｄに示される。ＳＴＥＡＰ−１配列とＳＴＥＡＰ−２配列のアミノ酸アラインメントは、高い程度の構造的な保存（２３７アミノ酸残基の重複にわたって５４．９％の同一性）、およびＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の同時に生じる６つの推定膜貫通ドメインの位置を示す（図１１Ａ〜Ｂ、１１Ｃ）。これらのＳＴＥＡＰ−１とＳＴＥＡＰ−２との間の構造的な相同性は、第１の推定細胞外ループから第５の膜貫通ドメインに広がる領域において最も高い。しかし、ＳＴＥＡＰ−１とＳＴＥＡＰ−２との間のいくつかの有意な構造的な差異が、明らかである。例えば、ＳＴＥＡＰ−２は、２０５アミノ酸長の細胞内Ｎ末端（ＳＴＥＡＰ−１における６９アミノ酸に比較される）および短い４アミノ酸の細胞内Ｃ末端（ＳＴＥＡＰ−１における２６アミノ酸と比較される）を示す。さらに、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子およびＳＴＥＡＰ−２遺伝子の両方は、第７番染色体に位置するが、異なるアーム上である。これらの差異は、機能および／または細胞内シグナル伝達経路との相互作用における有意な差異を意味し得る。
ＳＴＥＡＰ−２は、試験されたヒト組織の間では正常な前立腺にのみ発現され（図１４および１５）、そしてまた、前立腺癌で発現される（図１５）。従って、これは、ＳＴＥＡＰ−１に対して発現プロフィールにいくらかの類似性を示す。しかし、ＳＴＥＡＰ−２は、前立腺癌サンプル（図３および１５を比較）および試験された他の非前立腺癌（図５および図１６を比較）において、ＳＴＥＡＰ−１に対して異なるｍＲＮＡ発現プロフィールを示す。ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の発現プロフィールにおけるこれらの差異は、これらが特異に調節されることを示唆する。
ＳＴＥＡＰ−３およびＳＴＥＡＰ−４は、構造レベルではＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の両方に密接に関連するようであり、これらの両方は、同様に膜貫通タンパク質のようである。ＳＴＥＡＰ−３は、ＳＴＥＡＰ−１（４０．９％の同一性）よりも、ＳＴＥＡＰ−２（４７．８％の同一性）により関連する。ＳＴＥＡＰ−３およびＳＴＥＡＰ−４は、特有の発現プロフィールを示す。例えば、ＳＴＥＡＰ−３は、主に胎盤に限定される発現パターンを有するようであり、より少ない程度で、発現は、前立腺に見出されるが試験された他の正常組織では見出されない。ＳＴＥＡＰ−４は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、主に肝臓で発現されるようである。ＳＴＥＡＰ−３もＳＴＥＡＰ−４も、高レベルのＳＴＥＡＰ−１発現およびＳＴＥＡＰ−２発現が示される前立腺癌異種移植片で発現されないようである。
ＳＴＥＡＰタンパク質は、細胞のシグナル伝達経路に関与するタンパク質の特徴を示す。詳細には、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２は、ＰＣ３細胞に発現された場合、ｐ３８（ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質）のリン酸化を活性化する。さらに、ＳＴＥＡＰ−２発現は、チロシンリン酸化を誘導し、そしてＳＴＥＡＰ−１は、臭気物質処理細胞においてチロシンキナーゼの活性化を媒介する。これらの知見は、ＳＴＥＡＰ関連分子および細胞のシグナル伝達経路を変更し得る分子を同定するための高スループットアッセイにおいてＳＴＥＡＰを発現するために改変される細胞の使用を支持し、新規治療剤の同定を導く。１つの実施形態において、このアッセイは、ＳＴＥＡＰ機能を阻害し得る分子を同定し、それによってこの分子は、癌または調節不全細胞の増殖と関連した他の疾患の進行を調節し得る。
本明細書中に記載された４つのＳＴＥＡＰのうちの３つは、ヒト第７番染色体にマップされる（ＳＴＥＡＰ−１、２および３）。興味深いことに、原発性前立腺癌および再発性前立腺癌の両方に関して報告された（Ｖｉｓａｋｏｒｐｉら、１９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３４２、Ｎｕｐｐｏｎｅｎら、１９９８ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１４１）、７ｐ２２（７ｐ２２．３）（対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ ｇａｉｎ）の大きい領域）内のＳＴＥＡＰ−１マップは、癌におけるＳＴＥＡＰ−１のアップレギュレーションが、ゲノム機構を含み得ることを示唆する。さらに、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−３の両方は、染色体７ｑ２１に位置し、これらの２つの遺伝子が、遺伝子重複によって発生したことを示唆する。
６回膜貫通ドメインを含む他の細胞表面分子としては、イオンチャネル（ＤｏｌｌｙおよびＰａｒｃｅｊ，１９９６ Ｊ Ｂｉｏｅｎｅｒｇ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ ２８：２３１）および水チャネルもしくはアクアポリン（Ｒｅｉｚｅｒら、１９９３ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２３５）が挙げられる。構造研究は、機能的なチャネルを形成するために４量体複合体に集合される両方の型の分子を示す（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，１９９５，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２２：９４４，Ｗａｌｚら、１９９７ Ｎａｔｕｒｅ ３８７：６２４，Ｃｈｅｎｇら，１９９７ Ｎａｔｕｒｅ ３８７：６２７）。前立腺におけるＳＴＥＡＰ−１の免疫組織化学染色は、細胞間境界において濃縮されるようであり、管腔側において染色はほとんど検出されない。これは、きつい接合点、ギャップの接合点、細胞の伝達、接着またはトランスポータータンパク質としてのＳＴＥＡＰ−１の役割を示唆し得る。
これらの可能性を試験するために、ＳＴＥＡＰを発現するツメガエルの卵母細胞（または他の細胞）は、ＳＴＥＡＰがイオンチャネルとして機能するか否かを決定するために、電圧クランプ実験およびパッチクランプ実験を用いて分析され得る。卵母細胞の容積はまた、ＳＴＥＡＰが水チャネル特性を示すか否かを決定するために測定され得る。ＳＴＥＡＰがチャネルタンパク質またはギャップ接合点タンパク質として機能する場合、これらは、例えば、発現または機能を阻害し得る抗体、小分子、およびポリヌクレオチドを使用して、阻害に関して優れた標的としてはたらき得る。正常組織における限定された発現パターンおよび癌組織における高レベルの発現は、ＳＴＥＡＰ機能を妨害することが、選択的に癌細胞を殺傷し得ることを示唆する。
ＳＴＥＡＰ遺伝子ファミリーは上皮組織で主に発現されるので、ＳＴＥＡＰタンパク質が、上皮細胞機能においてイオンチャネル、輸送タンパク質、またはギャップ接合点タンパク質として機能する可能性があるようである。イオンチャネルは、前立腺癌細胞の増殖および侵襲性に関与している（Ｌａｌａｎｉら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １６：２９）。ラットおよびヒト両方の前立腺癌細胞は、より高いまたはより低いナトリウムチャネルの発現レベルを有する細胞の亜集団を含む。より高いレベルのナトリウムチャネル発現は、インビトロにおいてより侵襲的な侵襲性と相関する（Ｓｍｉｔｈら、１９９８、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２３：１９）。同様に、ナトリウムチャネルの特定の遮断が、インビトロにおいてＰＣ−３細胞の侵襲性を阻害することが示されている（Ｌａｎｉａｄｏら、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：１２１３）が、ＬＮＣａＰ細胞における特定のカリウムチャネルの阻害は、細胞増殖を阻害した（Ｓｋｒｙｍａら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３３：１１２）。これらの報告は、前立腺癌中のイオンチャネルに関する役割を示唆し、そしてまた、イオンチャネル機能を阻害する小分子が前立腺癌増殖を妨害し得ることを証明する。
（ＳＴＥＡＰをコードする核酸分子の単離）
本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡ配列は、ＳＴＥＡＰ遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにＳＴＥＡＰ遺伝子産物ホモログ、選択的にスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物の変異体形態をコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。ＳＴＥＡＰ遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するために利用され得る種々の分子クローニング方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニング系を使用して慣用的に利用され得る（例えば、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ＳＴＥＡＰ遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識されたＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いてプローブ化することにより同定され得る。例えば、一つの実施形態において、ＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡまたはその一部分が、合成され、そしてプローブとして使用されて、ＳＴＥＡＰ遺伝子に対応する重複するｃＤＮＡおよびＳＴＥＡＰ遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを回収し得る。ＳＴＥＡＰ遺伝子自体は、ＳＴＥＡＰ ＤＮＡプローブまたはプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などをスクリーニングすることによって単離され得る。
（組換えＤＮＡ分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、ＳＴＥＡＰポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これには、当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに種々のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれるが、これらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。このような分子を生成するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと）。
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞においてＳＴＥＡＰポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス感染可能細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬｎＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＡＰＣ−４、ＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクト可能であるかまたは形質導入可能な前立腺細胞株）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、ＳＴＥＡＰのコード配列を含むポリヌクレオチドを使用し、当該分野で慣用的に使用され、そして広く知られた任意の数の宿主−ベクター系を用いて、ＳＴＥＡＰタンパク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
ＳＴＥＡＰタンパク質またはそれらのフラグメントの発現に適切な広範な種々の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（前出）を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現ベクターを使用して、ＳＴＥＡＰは、好ましくは、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、３Ｔ３、ＰＣ３、ＬＮＣａＰおよびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現され得る。本発明の宿主ベクター系は、ＳＴＥＡＰタンパク質またはそれらのフラグメントの産生のために有用である。このような宿主−ベクター系は、ＳＴＥＡＰおよびＳＴＥＡＰ変異の機能的特性を研究するために使用され得る。
ＳＴＥＡＰ遺伝子またはそれらのフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体の産生、およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための方法において。ＳＴＥＡＰタンパク質またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断および予後アッセイにおいて、画像化方法（特に、癌画像化を含む）において、そしてＳＴＥＡＰタンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（前立腺の癌を含むが、これに限定されない）の管理における治療方法において有用であり得る。ＳＴＥＡＰタンパク質の検出のために有用な種々の免疫学的アッセイが意図され、これには、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞学的方法などが意図されるが、これらに限定されない。このような抗体は、標識され得、そして前立腺細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として使用され得る（例えば、放射線シンチグラフィー画像化方法において）。ＳＴＥＡＰタンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンを生成するにおいて特に有用であり得る。
（ＳＴＥＡＰタンパク質）
本発明の別の局面は、種々のＳＴＥＡＰタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本明細書中に使用される場合、ＳＴＥＡＰタンパク質は、図１Ａ〜Ｂに提供されるようなヒトＳＴＥＡＰ−１、図９Ａ〜Ｄに提供されるようなヒトＳＴＥＡＰ−２、図１０Ａ〜Ｅに提供されるようなヒトＳＴＥＡＰ−３のアミノ酸配列、他の哺乳動物ＳＴＥＡＰホモログ（例えば、ＳＴＥＡＰ−４）のアミノ酸配列および改変体、ならびにＳＴＥＡＰ生物学的活性を有するこれらのタンパク質の対立遺伝子改変体および保存的置換改変体（このような改変体およびホモログが以下に概説される方法に従って過度な実験を伴わずに単離／生成および特徴付けされ得る限り）を、有するかまたは含むタンパク質をいう。異なるＳＴＥＡＰタンパク質またはそのフラグメントの部分を組合せる融合タンパク質、ならびにＳＴＥＡＰタンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。このようなＳＴＥＡＰタンパク質は、集合的に、ＳＴＥＡＰタンパク質、本発明のタンパク質、またはＳＴＥＡＰという。本明細書中で使用される場合、用語「ＳＴＥＡＰポリペプチド」は、少なくとも１０個のアミノ酸（好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸）のポリペプチドフラグメントまたはＳＴＥＡＰタンパク質をいう。
ＳＴＥＡＰタンパク質の特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｂに示されるようなヒトＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ＳＴＥＡＰタンパク質の別の実施形態は、図９Ａ〜Ｄに示されるようなＳＴＥＡＰ−２アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の実施形態は、図１０Ａ〜Ｅに示されるＳＴＥＡＰ−３アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに別の実施形態は、図１１Ａ〜Ｂに示される部分的なＳＴＥＡＰ−４アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一般的に、ヒトＳＴＥＡＰの天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の同一性）を共有する。代表的に、ＳＴＥＡＰタンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰ配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、またはＳＴＥＡＰホモログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を含む。ＳＴＥＡＰ対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定のＳＴＥＡＰアミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、この配列とは根本的な背反（例えば、非保存的置換、短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。
保存的アミノ酸置換はしばしば、タンパク質のコンフォメーションも機能もいずれも変更することなく、タンパク質中で作製され得る。このような変化としては、以下が挙げられる：任意のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）の、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸についての置換；グルタミン酸（Ｅ）に対するアスパラギン酸（Ｄ）、およびその逆の置換；アスパラギン（Ｎ）に対するグルタミン（Ｑ）、およびその逆の置換；ならびに、スレオニン（Ｔ）に対するセリン（Ｓ）、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能であり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であり得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そしてこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置において、交換可能である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る。
ＳＴＥＡＰタンパク質（改変体を含む）は、図１１Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列を有するＳＴＥＡＰタンパク質に共通した少なくとも１つのエピトープを含み、その結果、ＳＴＥＡＰタンパク質または改変体に特異的に結合する抗体はまた、図１１Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列を有するＳＴＥＡＰタンパク質に特異的に結合する。ＳＴＥＡＰタンパク質改変体の１つのクラスは、図１１Ａ〜Ｂのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を共有する。ＳＴＥＡＰタンパク質改変体のより特定のクラスは、上記のように細胞外タンパク質ＳＣＰモチーフを含む。好ましいＳＴＥＡＰタンパク質改変体は、本明細書中に記載される１つ以上のディフェンシン機能（例えば、腫瘍の死を誘導する能力または細胞移動を化学誘引および／もしくは誘導する能力を含む）を示し得る。
ＳＴＥＡＰタンパク質は、多くの形態、好ましくは単離された形態で具体化され得る。本明細書中で使用される場合、このタンパク質と正常に関連する細胞構成成分からＳＴＥＡＰタンパク質を取り出すために、物理的方法、機械的方法または化学的方法が使用される場合、タンパク質は「単離された」という。当業者は、単離されたＳＴＥＡＰタンパク質を得るために、標準的な精製方法を容易に使用し得る。精製されたＳＴＥＡＰタンパク質分子は、抗体または他のリガンドへのＳＴＥＡＰの結合を損なう他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。ＳＴＥＡＰタンパク質の実施形態は、精製されたＳＴＥＡＰおよび機能的な可溶性ＳＴＥＡＰタンパク質を含む。１つの形態においては、このような機能的な可溶性ＳＴＥＡＰタンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドに結合する能力を保持する。
本発明はまた、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含むＳＴＥＡＰポリペプチド（例えば、図１Ａ〜Ｂに示されるようなＳＴＥＡＰ−１、図９Ａ〜Ｄに示されるようなＳＴＥＡＰ−２、図１０Ａ〜Ｅに示されるようなＳＴＥＡＰ−３、または図１１Ａ〜Ｂに示されるようなＳＴＥＡＰ−４のアミノ酸配列の部分に対応するポリペプチド）を提供する。本発明のこのようなポリペプチドは、ＳＴＥＡＰタンパク質の特性（例えば、ＳＴＥＡＰタンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力）を示す。特定のＳＴＥＡＰタンパク質に対して特有（他のＳＴＥＡＰタンパク質に対して）であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、その特定のＳＴＥＡＰタンパク質と特異的に反応する抗体を作製するために使用され得る。例えば、図１１Ａ〜Ｅに示されるＳＴＥＡＰ構造のアミノ酸アラインメントを参照して、当業者は、各分子がその構造に特有な配列ストレッチを含むことを容易に認識する。これらの特有なストレッチは、特定のＳＴＥＡＰに特異的な抗体を作製するために使用され得る。同様に、保存配列の領域は、複数のＳＴＥＡＰに結合し得る抗体を作製するために使用され得る。
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、広範な種々の当該分野で認められたＳＴＥＡＰタンパク質の改変体（例えば、アミノ酸の挿入、欠失および置換を有するポリペプチド）を含む。ＳＴＥＡＰ改変体は、当該分野において公知の方法（例えば、部位指向型変異誘発、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）、およびＰＣＲ変異誘発）を使用して作製され得る。部位指向型変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）］、制限選択的変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）］または他の公知技術を、クローン化されたＤＮＡにおいて実施し、ＳＴＥＡＰ改変体ＤＮＡを産生し得る。スキャニングアミノ酸分析もまた、連続配列に沿って１以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。とりわけ好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンが、代表的に、この群の中で好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素を越えて側鎖を排除し、そして改変体の主鎖コンフォメーションを変更する可能性が低いからである。アラニンもまた、代表的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、埋没位置および露出位置の両方において、頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ&Ｃｏ．、ＮＹ）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合には、等配電子アミノ酸が使用され得る。
上記で考察したように、本願発明の実施形態は、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の全長アミノ酸配列未満を含むポリペプチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、以下が挙げられる：図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸１個〜約アミノ酸１０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸２０個〜約アミノ酸３０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸３０個〜約アミノ酸４０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸４０個〜約アミノ酸５０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸５０個〜約アミノ酸６０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸６０個〜約アミノ酸７０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸７０個〜約アミノ酸８０個からなるポリペプチド、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸８０個〜約アミノ酸９０個からなるポリペプチド、および図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸９０個〜約アミノ酸１００個からなるポリペプチドなど。このスキームに従って、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸１００〜３３９、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−２タンパク質のアミノ酸１００〜４５４、または図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−３タンパク質のアミノ酸１００〜４５９、または図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−４タンパク質のアミノ酸１００〜１３３のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドが、本発明の代表的な実施形態である。ＳＴＥＡＰタンパク質のより大きな部分からなるポリペプチドもまた意図される。例えば、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰタンパク質の約アミノ酸１（または、２０もしくは３０もしくは４０など）個〜約アミノ酸２０（または、３０もしくは４０もしくは５０など）個からなるポリペプチドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、図１１Ａ−Ｂに示されるようなＳＴＥＡＰポリペプチド配列内に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＳＴＥＡＰポリペプチドを含む。１つ以上のこれらのモチーフまたは本明細書中に記載される目的の他の選択領域を含むＳＴＥＡＰポリペプチドは、代表的に、選択されたモチーフの一面または両面上の隣接したＳＴＥＡＰタンパク質配列のさらなる５〜２５またはそれを超えるアミノ酸残基を含む。１つの実施形態では、本発明の代表的なポリペプチドは、１つ以上の他のＳＴＥＡＰタンパク質に対する相同性を示すＳＴＥＡＰの１つ以上の領域を含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＴＥＡＰタンパク質の１つ以上の免疫原性部分を含み得る。ＳＴＥＡＰタンパク質の免疫原性部分の１つの例は、図１Ａ−Ｂに示されるＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜２８である（ＷＫＭＫＰＲＲＮＬＥＥＤＤＹＬ；配列番号２２）。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１６５−１７３、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸８６−９４、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸２６２−２７０、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸３０２−３１０、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１５８−１６６、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸２２７−２３５、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸４０２−４１０、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸３０７−３１５、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸３０６−３１４、およびＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸１００−１０８のような１つ以上の推定されたＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを含み得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、図８に示されるＳＴＥＡＰ−２タンパク質のアミノ酸１−２４５、２−２０４、１２１−４５４、１５３−１６５、１８２−４５４、１８３−３８７、２７６−４５３、３４５−３５８、または４１９−４５４のようなＳＴＥＡＰ−２のフラグメントのすべてまたは一部からなる。これらの本発明の関連した実施形態としては、上記で考察された異なるモチーフの組合せを含むポリペプチドが挙げられ、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフまたは介在配列のいずれにも、挿入も欠失も置換も含んでいないポリペプチドである。
ＳＴＥＡＰポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒトＳＴＥＡＰタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、当該分野において周知の、標準的なペプチド合成技術または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、組換え方法を使用して、ＳＴＥＡＰタンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を生成し得る、この点において、本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰコード核酸分子は、ＳＴＥＡＰタンパク質の規定のフラグメントを生成するための手段を提供する。ＳＴＥＡＰポリペプチドは、ドメイン特異的抗体（例えば、ＳＴＥＡＰタンパク質の細胞外エピトープおよび細胞内エピトープを認識する抗体）の生成および特徴付け、ＳＴＥＡＰまたはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子の同定、および種々の治療状況（癌ワクチンを含むが、これらに限定されない）において、特に有用である。特定の興味深い構造を含むＳＴＥＡＰポリペプチドは、例えば、以下：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を含む、当該分野で周知の種々の分析技術を使用するか、または免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗ＳＴＥＡＰ抗体の生成、またはＳＴＥＡＰに結合する細胞因子の同定において、特に有用である。
以下の実施例に記載される特定の実施形態において、ＳＴＥＡＰの分泌形態は、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを有する、ＳＴＥＡＰをコードするＣＭＶ駆動発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｍｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において、簡便に発現され得る。培養液中に分泌されたＨＩＳタグ化ＳＴＥＡＰは、ニッケルカラムおよび標準的な技術を使用して精製され得る。あるいは、ＡＰ標識系が使用され得る。ＳＴＥＡＰの発現のための種々の構築物が、以下の実施形態に記載される。
ＳＴＥＡＰの改変（例えば、共有結合性改変）は、本発明の範囲内に含まれる。１つの型の共有結合性改変としては、ＳＴＥＡＰの選択された側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤での、ＳＴＥＡＰポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内のＳＴＥＡＰポリペプチドの別の型の共有結合性改変としては、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの変更が挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、ネイティブ配列ＳＴＥＡＰに見い出される１以上の炭水化物部分の欠失（基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および／または酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって）、および／またはネイティブ配列ＳＴＥＡＰに存在しない、１以上のグリコシル化部位の付加を意味するために、本明細書中で目的について意図される。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。ＳＴＥＡＰの別の型の共有結合性改変としては、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるような様式の、種々の非タンパク質様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つへの、ＳＴＥＡＰポリペプチドの連結が挙げられる。
本発明のＳＴＥＡＰはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＳＴＥＡＰを含むキメラ分子を形成する様式で、改変され得る。１つの実施形態において、このようなキメラ分子としては、ポリヒスチジンエピトープタグを有するＳＴＥＡＰの融合体が挙げられ、このタグは、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。このエピトープタグは、一般に、ＳＴＥＡＰのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は、ＳＴＥＡＰの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも呼ばれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の、ＳＴＥＡＰポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態での置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日公布）もまた参照のこと。
（ＳＴＥＡＰ抗体）
本発明の別の局面は、ＳＴＥＡＰタンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、ＳＴＥＡＰタンパク質に特異的に結合し、そして非ＳＴＥＡＰタンパク質およびポリペプチドに結合しない（または、弱く結合する）。特に意図される抗ＳＴＥＡＰ抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１以上の相補性決定領域を含むフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域（すなわち、抗原結合領域）の少なくとも一部として定義される。
いくつかの適用について、特定の構造的ドメイン内の特定のＳＴＥＡＰタンパク質および／またはエピトープと特異的に反応する抗体を産生することが所望であり得る。例えば、癌治療および診断画像化目的のために有用な好ましい抗体は、癌細胞において発現されるようなＳＴＥＡＰタンパク質の細胞外領域におけるエピトープと反応する抗体である。このような抗体は、免疫原として、本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰタンパク質を使用してか、またはその推定された細胞外ドメインに由来するペプチドを使用して産生され得る。この点で、図１Ｂにおいて示されるようなＳＴＥＡＰ−１タンパク質の形態的概略図を参照して、示された膜貫通ドメインの間の細胞外ループにおける領域が、細胞外特異的抗体を惹起するための適切な免疫原を設計する場合に使用され得る。
本発明のＳＴＥＡＰ抗体は、前立腺癌の治療ストラテジー、診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに画像化方法において特に有用であり得る。同様に、このような抗体は、ＳＴＥＡＰが他の型の癌においてもまた発現または過剰発現される程度に、他の癌の処置、診断および／または予後に有用であり得る。本発明は、ＳＴＥＡＰおよび変異体ＳＴＥＡＰのタンパク質およびポリペプチドの、検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、一般に、適切には、ＳＴＥＡＰまたは変異体ＳＴＥＡＰタンパク質を認識および結合し得る、１以上のＳＴＥＡＰ抗体を含み、そして、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）など。さらに、前立腺癌を検出可能な免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらには、標識したＳＴＥＡＰ抗体を使用するラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、前立腺癌（特に、進行型前立腺癌）の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用であり得る。
ＳＴＥＡＰ抗体はまた、ＳＴＥＡＰおよび変異体ＳＴＥＡＰのタンパク質およびポリペプチドの精製、およびＳＴＥＡＰホモログおよび関連分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、１つの実施形態において、ＳＴＥＡＰタンパク質を精製する方法は、ＳＴＥＡＰ抗体（これは、固体マトリックスに結合されている）を、ＳＴＥＡＰを含有する溶解物または他の溶液と共に、このＳＴＥＡＰ抗体がＳＴＥＡＰに結合するのを可能にする条件下でインキュベートする工程；固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程；およびＳＴＥＡＰをその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発明のＳＴＥＡＰ抗体の他の用途としては、ＳＴＥＡＰタンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の生成が挙げられる。
ＳＴＥＡＰ抗体はまた、例えば、ＳＴＥＡＰタンパク質の生物学的活性を調節または阻害することによって、あるいは、ＳＴＥＡＰタンパク質を発現する癌細胞を標的化および破壊することによって、治療学的に使用され得る。前立腺癌および他の癌の抗体治療は、以下の別々の小節においてより詳細に記載される。
抗体の調製のための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、単離または免疫結合体化された形態の、ＳＴＥＡＰのタンパク質、ペプチドまたはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ編、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。タンパク質免疫原の例としては、組換えＳＴＥＡＰ（バキュロウイルス系、哺乳動物系などにおいて発現される）、１つ以上の抗体定常領域（ＡＰ−標識化ＳＴＥＡＰなど）に結合体化されたＳＴＥＡＰタンパク質のＳＴＥＡＰ細胞外ドメインまたは細胞外ループが挙げられる。さらに、ＳＴＥＡＰの融合タンパク質（例えば、ＳＴＥＡＰのＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯまたはＭｙｓＨｉｓ（例えば、以下の実施例を参照のこと）との融合体のようなＳＴＥＡＰの融合タンパク質もまた使用され得る。
特定の実施形態において、図１１Ａ〜Ｂに示されるようなオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全てまたはほとんどを含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され得、そして適切な抗体を生成するための免疫原として使用され得る。ＳＴＥＡＰを発現するかまたは過剰発現する細胞がまた免疫のために使用され得る。同様にＳＴＥＡＰを発現するように操作された任意の細胞が使用され得る。このようなストラテジーは、内因性ＳＴＥＡＰを認識するための強化された能力を有するモノクローナル抗体の産生を生じ得る。別の有用な免疫原は、ヒツジの赤血球細胞の原形質膜に結合したＳＴＥＡＰペプチドを含む。
図１１Ａ〜Ｂに示されるようなＳＴＥＡＰタンパク質のアミノ酸配列を使用して、抗体を生成するためにＳＴＥＡＰタンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用して、ＳＴＥＡＰ構造の疎水性領域を同定し得る。免疫原性構造を示すＳＴＥＡＰタンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方法を使用して容易に同定され得る：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析。ＨＬＡ−Ａ２を結合することが推定されるＳＴＥＡＰのペプチドは、抗体の産生のために選択され得るか、またはＣＴＬ応答を産生するために使用され得る。このような推定されたＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドとしては、以下を含むがこれらに限定されない：ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１６５−１７３、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸８６−９４、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸２６２−２７０、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸３０２−３１０、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１５８−１６６、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸２２７−２３５、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸４０２−４１０、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸３０７−３１５、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸３０６−３１４、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸１００−１０８。以下の実施例において議論されるように、免疫原性は、ＳＴＥＡＰを用いて実証され得、これは、それぞれ、ウサギおよびマウスを使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するために使用される。このＢ細胞応答（抗体生成）は、ＳＴＥＡＰの免疫原性部分によって誘発された最初のＴ細胞応答の結果である。
免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法、およびキャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とのタンパク質の免疫結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体化が使用され得；他の例において、連結試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される連結試薬）が、効果的であり得る。ＳＴＥＡＰ免疫原の投与は一般に、当該分野で一般に理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を伴う注射によって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能力（ａｄｅｑｕａｃｙ）を決定することによって理解され得る。
ＳＴＥＡＰモノクローナル抗体は、好ましくは、当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一般に公知のように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または産生性（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）Ｂ細胞を不死化する改変を使用して調製され得る。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＳＴＥＡＰタンパク質またはＳＴＥＡＰフラグメントである免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が同定された場合、これらの細胞を拡大し、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用する、組換え手順によって産生され得る。ＳＴＥＡＰタンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体またはＣＤＲ移植化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化ＳＴＥＡＰ抗体またはヒトＳＴＥＡＰ抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック法が挙げられる（概要について、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照のこと）。
完全なヒトＳＴＥＡＰモノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒトＳＴＥＡＰモノクローナル抗体はまた、１９９７年１２月３日提出のＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
ＳＴＥＡＰ抗体のＳＴＥＡＰタンパク質との反応性は、適切には、ＳＴＥＡＰタンパク質、ＳＴＥＡＰペプチド、ＳＴＥＡＰ発現細胞またはその抽出物を使用する、多くの周知の手段（ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含む）によって確証され得る。
本発明のＳＴＥＡＰ抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または細胞毒または他の治療薬剤のような第２の分子に結合体化され得るか、ＳＴＥＡＰポジティブ細胞に第２の分子を標的化するために使用される（Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ、ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ら編、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第４版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２６２４−２６３６）。細胞障害性薬剤の例としては、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、メイタンシノイド、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリーチアミシン、サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、およびグルココルチコイドおよび他の化学療法剤、ならびに２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅのような放射性同位体が挙げられるがこれらに限定されない。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、プロドラッグをその活性化形態に変換し得る抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合体化され得る。例えば、米国特許第４，９７５，２８７号を参照のこと。
さらに、２つ以上のＳＴＥＡＰエピトープについて特異的な二重特異的抗体は、当該分野で一般的に公知の方法を使用して産生され得る。さらに、抗体エフェクター機能は、癌細胞に対するＳＴＥＡＰ抗体の治療効果を増強するために改変され得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域中に操作され得、鎖間ジスルフィド結合の形成、ならびに、内部移行、ＡＤＣＣおよび／または補体媒介細胞死滅について増強された能力を有し得るホモ二量体の産生を可能にし得る（例えば、Ｃａｒｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５；Ｓｈｏｐｅｓ，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２）。ホモダイマー性の抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって生成され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
（ＳＴＥＡＰトランスジェニック動物）
ＳＴＥＡＰまたはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得、これらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に、または出生前（例えば、胚段階）でその動物の祖先に導入される。導入遺伝子は、細胞のゲノム内に組み込まれるＤＮＡであり、トランスジェニック動物は、その細胞から発生する。１つの実施形態において、ＳＴＥＡＰをコードするｃＤＮＡが、確立された技術に従って、ＳＴＥＡＰコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得、そしてそのゲノム配列は、ＳＴＥＡＰをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。
トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を生成するための方法は、当該分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および４，８７０，００９号に記載される。代表的に、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーと共にＳＴＥＡＰ導入遺伝子の組み込みのために標的化される。胚段階の動物の生殖系列に導入された、ＳＴＥＡＰをコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用して、ＳＴＥＡＰをコードするＤＮＡの発現の増大の効果を試験し得る。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御を付与することが考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明のこの局面に従って、動物をその試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有する処置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病理学的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
あるいは、ＳＴＥＡＰの非ヒトホモログを使用して、ＳＴＥＡＰ「ノックアウト」動物を構築し得、この動物は、ＳＴＥＡＰをコードする内因性遺伝子とその動物の胚細胞に導入されたＳＴＥＡＰをコードする改変ゲノムＤＮＡと間の相同組換えの結果として、ＳＴＥＡＰをコードする欠損性または改変型遺伝子を有する。例えば、ＳＴＥＡＰをコードするｃＤＮＡを使用して、確立された技術に従って、ＳＴＥＡＰをコードするゲノムＤＮＡをクローニングし得る。ＳＴＥＡＰをコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。
代表的に、数キロベースの変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、そのベクターに含まれる（相同組換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えした細胞が、選択される［例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照のこと］。次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に導入し、凝集キメラを形成させる［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、１１３−１５２頁を参照のこと］。
次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そしてその胚は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種し得る。ノックアウト動物は、例えば、ＳＴＥＡＰポリペプチドの非存在に起因する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生について、特徴付けられ得る。
（ＳＴＥＡＰおよびその産物の状態のモニタリング）
個体におけるＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍潜在性に関する情報を提供し得る。例えば、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡは、多くの正常組織ではなく前立腺においてかなり多く発現され、その発現は特定の癌と関連するので、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質の相対レベルを評価するアッセイは、ＳＴＥＡＰ調節不全と関連する疾患（例えば、癌または良性の前立腺増殖（ＢＰＨ））を診断するために使用され得、そして適切な治療オプションを規定するに有用である予後情報を提供し得る。同様に、生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰヌクレオチドおよびアミノ配列の完全性を評価するアッセイもまた、この状況において使用され得る。
ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡが前立腺癌および他の癌において発現され、そして多くの正常組織において発現されないという知見は、この遺伝子が細胞増殖の調節不全に関連するという証拠を提供し、それによってこの遺伝子およびその産物を、当業者がＳＴＥＡＰ調節不全に関連する疾患を有することが疑われる個体由来の生物学的サンプルを評価するために使用し得る標的として同定する。別の実施形態において、ＳＴＥＡＰの発現は、通常前立腺に制限されるので、当業者はまた、転移の指標としてＳＴＥＡＰ発現を検出するために他の組織から採取された生物学的サンプルを評価し得る。例えば、図３１Ａ−Ｆにおいて示されるように、ＳＴＥＡＰ−１に対する抗体は、従来の前立腺癌マーカー（ＰＳＡ）と比較して、転移の検出のための優れたマーカーを提供する。このようなマーカーは、組織生検の評価において、そしてインビボ画像化ストラテジーの一部としての両方で有用である。この状況において、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびその産物の発現状態の評価は、組織サンプルに潜在的な疾患に関する情報を得るために使用され得る。この状況における用語「発現状態」は、遺伝子およびその産物の発現、機能および調節（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、発現された遺伝子産物（例えば、核酸およびアミノ酸配列）の完全性、ならびにこれらの分子に対する転写改変および翻訳改変）に関与する種々の因子を広範にいうために使用される。
ＳＴＥＡＰの発現状態は、特定の疾患の状態、進行および／または腫瘍攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、ＳＴＥＡＰ発現状態を決定し、そしてＳＴＥＡＰを発現する癌（例えば、前立腺癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。患者サンプルにおけるＳＴＥＡＰ発現状態は、当該分野で周知の多数の手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉マイクロ精査（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｓｓｅｃｔｅｄ）サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析が挙げられるがこれらに限定されない）によって分析され得る。ＳＴＥＡＰ遺伝子および遺伝子産物の発現状態を評価するための代表的なプロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ ２［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，４［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，１５［Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ］および１８［ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ］，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら（編）（１９９５）に見出され得る。
１つの局面において、本発明は、細胞増殖の調節不全と関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＳＴＥＡＰ遺伝子産物の状態を決定して、次いでそのように決定された状態を、対応する正常サンプル中のＳＴＥＡＰ遺伝子産物の状態と比較することによってＳＴＥＡＰ遺伝子産物をモニターための方法を提供し、正常サンプルと比較して試験サンプルにおける異常なまたは変更された状態のＳＴＥＡＰ遺伝子産物の存在は、この個体の細胞において細胞増殖の調節不全の存在の指標を提供する。
本発明はさらに、調節不全の細胞増殖の証拠について生物学的サンプルを調査する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、対応する正常なサンプル中でのＳＴＥＡＰの状態に対して生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰの状態を比較する工程を包含し、ここで、生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰの状態における変更が、調節不全の細胞増殖に関連している。生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰの状態は、例えば、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡ発現およびＳＴＥＡＰタンパク質発現のレベルを調査することによって、評価され得る。１つの実施形態において、ＳＴＥＡＰの状態における変更は、ＳＴＥＡＰ発現細胞が通常存在しない組織由来の生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ発現細胞の存在によって同定される。
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルと比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおけるＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する。ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡの存在は、例えば、結腸、肺、前立腺、膵臓、膀胱、乳房、卵巣、頚部、精巣、頭部および頸部、脳、胃、骨などを含むがこれらに限定されない組織サンプル中で評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意なＳＴＥＡＰ発現の存在は、これらの癌、または別の組織に由来する癌の転移の発生、存在および／または重篤度を示すために有用であり得る。なぜなら、対応する正常組織は、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡを発現しないかまたは低いレベルで発現するからである。
関連する実施形態において、ＳＴＥＡＰ発現状態は、核酸レベルではなくタンパク質レベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＳＴＥＡＰタンパク質のレベルを決定する工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現されるＳＴＥＡＰのレベルに対して比較する工程を包含する。１つの実施形態において、ＳＴＥＡＰタンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して評価される。ＳＴＥＡＰタンパク質発現を検出し得るＳＴＥＡＰ抗体または結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ形式において使用され得る。以下の実施例において示されるように、ＳＴＥＡＰ免疫反応性は、前立腺癌、膀胱癌および肺癌、ならびにＢＰＨおよび前立腺癌転移に関連している。
他の関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク質で観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｇｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９〜３７８（１９９９）を参照のこと）。この状況において、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、ＳＴＥＡＰ遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で議論されるノーザン、サザン、ウエスタン、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定プロトコールによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９５２，１７０号を参照のこと）。
別の実施形態では、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ遺伝子のメチル化状態を試験し得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧ島の異常な脱メチル化および／または過剰メチル化は、しばしば、不死化細胞および形質転換細胞中で生じ、そして種々の遺伝子の発現改変を生じさせ得る。例えば、πクラスグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるが、９０％より多くの前立腺癌においては発現されないタンパク質）のプロモーターの過剰メチル化は、この遺伝子の転写を持続的にサイレントにさせるようであり、そして前立腺癌において最も頻繁に検出されるゲノム改変である（Ｄｅ Ｍａｒｚｏら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２）。さらに、この改変は、高度前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の少なくとも７０％の症例において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．７：５３１−５３６）。
別の例では、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異遺伝子（これは、正常な前立腺においては発現されないが、２５〜５０％の前立腺癌において発現される）の発現は、リンパ芽球様細胞（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ）においてデオキシ−アザシチジンによって誘導される。このことは、腫瘍での発現が、脱メチル化に起因することを示唆する（Ｌｅｔｈｅら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７６（６）：９０３−９０８）。この状況下において、遺伝子のメチル化状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、ＣｐＧ島の全体的なメチル化状態を評価するために、メチル化ＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素が使用され得る。
さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、迅速に、所定の遺伝子のＣｐＧ島に存在するすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態をプロフィール付けし得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これは、すべての非メチル化シトシンをウラシルへと変換する）によるＤＮＡの最初の改変、次いで、非メチル化ＤＮＡに対してメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを使用する増幅を包含する。メチル化の干渉を含むプロトコールはまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１２単元、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５において見出され得る。
別の関連の実施形態では、本発明は、個体における癌の存在を検出するにおいて有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常な細胞または組織における発現レベルと比較して、試験細胞または組織サンプル中で発現されるＳＴＥＡＰ選択的スプライシング改変体の有意な変化を検出する工程を包含する。ＳＴＥＡＰの選択的スプライス改変体のモニタリングは有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシングの変化は、癌の進行へと導く一連の事象の工程のうちの１つであると示唆されるからである（例えば、Ｃａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５（２５０：３０５９−３０６５（１９９７））を参照のこと）。
遺伝子増幅は、ＳＴＥＡＰの状態を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子増幅は、本明細書中に提供された配列に基づく適切に標識されたプローブを用いる、例えば、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって直接的に、サンプル中で測定され得る。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体を使用し得る。次いで、この抗体を標識し得、そしてアッセイを実施し得る。ここでは、二重鎖は表面に結合され、その結果、表面上での二重鎖の形成に際して、この二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
上記に考察した組織に加えて、末梢血が、癌細胞（前立腺癌を含むが、これに限定されない）の存在について、ＲＴ−ＰＣＲを使用して従来的にアッセイされ、ＳＴＥＡＰ発現を検出し得る。ＲＴ−ＰＣＲで増幅可能なＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞に関するＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、現在、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理において使用するために評価されている。前立腺癌の分野において、これらとしては、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出についてのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野において周知である。
本発明の関連の局面は、個体における癌の発生に対する感受性予測に関する。１つの実施形態では、癌に対する感受性を予測するための方法は、以下の工程を包含する：組織サンプル中においてＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質を検出する工程であって、その存在は癌に対する感受性を示し、ここで、存在するＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度に対して比例する、工程。特定の実施形態では、前立腺組織中のＳＴＥＡＰの存在を試験し、サンプル中のＳＴＥＡＰの存在は、前立腺癌感受性（すなわち、前立腺腫瘍の発生または存在）の指標を提供する。密接に関連した実施形態では、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全性が評価されて、これらの分子の構造における摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、サンプル中のＳＴＥＡＰ遺伝子産物における１以上の摂動の存在は、癌感受性（すなわち、腫瘍の発生または存在）の指標を提供する。
本発明のさらに別の関連した局面は、腫瘍の攻撃性を測定するための方法に関する。１つの実施形態では、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、以下の工程を包含する：腫瘍のサンプル中の細胞によって発現されるＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質のレベルを決定する工程、そのようにして決定されたレベルを、同一個体から採取された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中において発現されるＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質のレベルに対して比較する工程であって、正常サンプルと比較した腫瘍サンプル中のＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質の発現程度は、攻撃性の程度を示す、工程。特定の実施形態では、前立腺腫瘍の攻撃性は、腫瘍細胞中においてＳＴＥＡＰが発現される程度を決定することによって評価され、より高い発現レベルは、より攻撃性の高い腫瘍を示す。密接に関連した実施形態では、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における摂動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、１以上の摂動の存在は、より攻撃性の高い腫瘍を示す。
本発明のさらに別の関連した局面は、経時的に、個体中の悪性疾患の進行を観察するための方法に関する。１つの実施形態では、経時的に、個体中の悪性疾患の進行を観察するための方法は、以下の工程を包含する：腫瘍のサンプル中の細胞によって発現されるＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質のレベルを決定する工程、そのようにして決定されたレベルを、異なる時間の同一個体から採取された等価な組織サンプル中で発現されるＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍サンプル中での経時的なＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰタンパク質の発現程度は、癌の進行に関する情報を提供する。特定の実施形態では、癌の進行は、腫瘍細胞中のＳＴＥＡＰ発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、より高い発現レベルは癌の進行を示す。密接に関連した実施形態では、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全性を評価して、このような分子の構造における摂動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、１以上の摂動の存在は、癌の進行を示す。
上記の診断アプローチは、当該分野において公知の広範な種々の予後プロトコールおよび診断プロトコールのいずれとも組み合わせられ得る。例えば、本明細書中に開示された本発明の別の実施形態は、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物の発現（または、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物における摂動）と、組織サンプルの状態を診断および予後判定する手段としての悪性疾患関連因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況下において、広範な種々の悪性疾患関連因子が利用され得る（例えば、さもなくば悪性疾患と関連付けられる遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭの発現を含む）ならびに全体的な細胞学的観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９９５、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５年２月；２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８−２４を参照のこと））。ＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物の発現（または、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物における摂動）と、さらなる悪性疾患関連因子との間の一致を観察するための方法は、例えば、一致する特定の因子のセットまたは型の存在が、組織サンプルの状態を診断および予後判定するために重要な情報を提供するので、有用である。
代表的な実施形態では、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物の発現（または、ＳＴＥＡＰ遺伝子およびＳＴＥＡＰ遺伝子産物における摂動）と、悪性疾患関連因子との間の一致を観察する方法は、以下の工程を内含する：組織サンプル中のＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、組織サンプル中のＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、およびＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現と、ＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現との一致を観察する工程。特定の実施形態では、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰおよびＰＳＡのｍＲＮＡ発現を試験する。好ましい実施形態では、サンプル中のＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡとＰＳＡ ｍＲＮＡとの過剰発現の一致は、前立腺癌、前立腺癌感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在の指標を提供する。
ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法は、本明細書中に記載されており、そして当該分野において周知の標準的な核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術を使用する。ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法としては、標識化ＳＴＥＡＰリボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ＳＴＥＡＰポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連技術、ＳＴＥＡＰに特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、および他の増幅型の検出方法（例えば、分枝（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどのような）が挙げられる。特定の実施形態では、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、以下に続く実施例に記載のように、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡの発現を検出および定量し得る。ＳＴＥＡＰを増幅し得るかなり多数のプライマー（本明細書中に具体的に記載された種々のプライマーセットを含むが、これらに限定されない）が、この目的のために使用され得る。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態では、野生型ＳＴＥＡＰタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。ＳＴＥＡＰタンパク質に対して指向された抗体をまた用いて、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）および／またはＥＬＩＳＡのような従来技術を使用して、患者標本（例えば、血液、尿、精液、または他のサンプル）中のＳＴＥＡＰを検出し得る。
（ＳＴＥＡＰと相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示されたＳＴＥＡＰタンパク質配列は、当業者が、当該分野で認められた種々のプロトコールのいずれかを介して、ＳＴＥＡＰおよびＳＴＥＡＰによって活性化される経路と相互作用するタンパク質、低分子、および他の因子を同定することを可能にする。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系（「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる）の１つが利用され得る。このような系では、相互作用する分子が、転写因子を再構築し、そしてレポーター遺伝子の発現を指示し、次いで、この発現をアッセイする。代表的な系は、真核生物の転写活性化因子の再構築を通して、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する。これらは、例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５２３号、同第５，８４６，７２２号、および同第６，００４，７４６号に開示される。
あるいは、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、ＳＴＥＡＰタンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法では、選択されたレセプター分子（例えば、ＳＴＥＡＰ）に結合するペプチドが、無作為のアミノ酸集合または制御されたアミノ酸集合をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。ライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、このバクテリオファージ粒子は、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。広範な種々の用途（例えば、治療用試薬または診断用試薬）を有するペプチドが、このようにして、予期されるリガンドまたはレセプター分子の構造に関する先行情報が全くなくとも同定され得る。ＳＴＥＡＰタンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法は、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７３３，７３１号に開示されている。
あるいは、ＳＴＥＡＰを発現する細胞株を使用して、ＳＴＥＡＰによって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定し得る。この可能性は、他者ら（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９、２６１：６４６−５１）によって示されたような免疫沈降技術を使用して試験され得る。代表的に、ＳＴＥＡＰタンパク質は、抗ＳＴＥＡＰ抗体を使用して、ＳＴＥＡＰを発現する前立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓ−タグに対する抗体が、ＳＴＥＡＰ（上述のベクター）を発現するように操作された細胞株において使用され得る。免疫沈降された複合体は、ウェスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識化、タンパク質の微小配列決定、銀染色、および二次元ゲル電気泳動のような手順によって、タンパク質の結合に関して試験され得る。
ＳＴＥＡＰと相互作用する低分子が、このようなスクリーニングアッセイの関連の実施形態を通して同定され得る。例えば、ＳＴＥＡＰ機能を阻害する低分子（ＳＴＥＡＰが、細胞に結合する能力ならびに／または腫瘍の形成、進行、移動、および／もしくはアポトーシスを調節する能力を阻害する分子を含む）が、同定され得る。代表的な方法は、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号において考察されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法が含まれる。例示的な実施形態では、ハイブリッドリガンドが細胞中に導入される（次いで、この細胞は、第一発現ベクターおよび第二発現ベクターを含む）。各発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結された標的タンパク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。この細胞はさらに、レポーター遺伝子を含み、このレポーター遺伝子の発現は、第一ハイブリッドタンパク質と第二ハイブリッドタンパク質の互いに対して近位に条件付けられ、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位にハイブリッドリガンドが結合する場合にのみ生じる事象である。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞を選択し、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質を同定する。
本発明の代表的な実施形態は、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰアミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法から構成され、これは以下の工程を包含する：分子集団とＳＴＥＡＰアミノ酸配列とを接触させる工程、分子集団とＳＴＥＡＰアミノ酸配列とを、相互作用を容易にする条件下で相互作用させる工程、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列と実際に相互作用する分子から、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列と相互作用しない分子を分離する工程。特定の実施形態では、この方法はさらに、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態では、ＳＴＥＡＰアミノ酸配列を、ペプチドのライブラリーと接触させる。ＳＴＥＡＰ機能を調節する分子を同定するためのさらなるアッセイを、以下に続く実施例に記載する。
本発明はさらに、ＳＴＥＡＰまたはＳＴＥＡＰ関連経路の活性化を調節する分子についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＳＴＥＡＰタンパク質を発現する細胞と分子を接触させる工程、およびＳＴＥＡＰまたはＳＴＥＡＰ関連経路の活性化を決定する工程を包含する。この決定する工程は、以下に続く実施例に記載のリン酸化アッセイの１つの使用（例えば、リン酸化されたシグナル伝達分子に対する抗体を用いるウェスタンブロッティング）を介し得る。シグナル伝達分子のリン酸化の改変は、ＳＴＥＡＰまたはＳＴＥＡＰ関連経路の活性化を調節する候補分子を示す。
（治療的方法および組成物）
前立腺癌タンパク質としてのＳＴＥＡＰの同定は、前立腺癌およびＳＴＥＡＰに関連した他の癌の処置に対する多数の治療的アプローチへの道を開いた。上記のように、ＳＴＥＡＰは、膜貫通タンパク質であり、そして他の細胞および分子とのその相互作用は、前立腺環境の調節、ならびに癌の開始、発達、および／または進行において役割を果たす可能性がある。ＳＴＥＡＰは、ＳＴＥＡＰタンパク質の活性化を阻害する目的、他の細胞および分子とのＳＴＥＡＰタンパク質の結合または会合を阻害する目的、ＳＴＥＡＰの転写または翻訳を阻害する目的、および／またはＳＴＥＡＰに基づく癌ワクチンの使用の目的のアプローチを介した治療のために標的化され得る。従って、治療的ストラテジーが、この分子の機能を阻害するようにか、またはＳＴＥＡＰ分子自体を標的化するように設計され得る。
ＳＴＥＡＰの発現プロフィールは、黒色腫および他の癌においてアップレギュレートされる組織特異的遺伝子であるＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡと類似する（Ｖａｎ ｄｅｎ ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｒｅｓ．２７：８１−８６、１９９７）。その組織特異的発現および癌における高い発現レベルに起因して、これらの分子は現在、癌ワクチンについての標的として研究されている（Ｄｕｒｒａｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ８：７２７−７３３、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２：９７２−９７６、１９９７）。ＳＴＥＡＰの発現パターンは、その発現が、大半の正常組織において検出されないので、前立腺癌に対する癌ワクチンアプローチについての理想的標的である可能性が高いという証拠を与える。
従って、ＳＴＥＡＰの特定のモチーフを標的化する治療的アプローチ、またはＳＴＥＡＰタンパク質の活性化を阻害する目的の治療的アプローチは、前立腺癌およびＳＴＥＡＰを発現する他の癌を罹患している患者に有用であることが予期される。ＳＴＥＡＰタンパク質の活性化を阻害する目的の治療的アプローチは、一般的に、２つのクラスに分類される。１つのクラスは、ＳＴＥＡＰタンパク質と、その結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害する種々の方法を含む。別のクラスは、ＳＴＥＡＰ遺伝子の転写またはＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する種々の方法を含む。
（抗体に基づく治療についての標的としてのＳＴＥＡＰ）
癌（前立腺癌を含む）におけるＳＴＥＡＰの細胞表面性質および発現プロフィールは、それらが、前立腺癌およびＳＴＥＡＰを発現する他の癌の抗体治療についての有望な標的であることを示す。本明細書中の実施例に記載の実験結果は、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２が、強力に、前立腺細胞および前立腺癌細胞内の腺上皮細胞の表面上で均一して発現されるという強い証拠を提供する。特に、免疫組織化学的分析の結果は、ヒト前立腺上皮細胞（正常および癌）の表面が、ＳＴＥＡＰ−１で均一にコーティングされているようであることを示す。生化学的分析によって、ＳＴＥＡＰ−１の細胞表面局在性が確認されている。これらは、当初、その推定６−膜貫通一次構造エレメントまたは細胞周囲染色（免疫組織化学的染色によって明白）によって示唆された。
ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２は、前立腺癌上皮（細胞外ＳＴＥＡＰエピトープを標的化する免疫療法介入ストラテジーについて理想的な位置）の表面にわたって高レベルで均一に発現される。ＳＴＥＡＰ免疫反応性組成物の全身投与は、ＳＴＥＡＰ細胞外エピトープへの結合を介して前立腺上皮細胞とその組成物の広範な接触を生じると予期される。さらに、正常なヒト組織ではＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現がほとんど存在しないことを考慮すると、非標的器官および組織におけるＳＴＥＡＰ−１への免疫療法組成物の結合によって引き起こされる、毒性、非特異性および／または非標的効果を有さない精巧な感受性を予期させる豊富な理由が存在する。
前立腺細胞および前立腺癌細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の高レベル発現に加えて、ＳＴＥＡＰ−１は、ヒトの種々の他の癌（膀胱癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌を含む）において実質的に過剰発現されるようである。特に、高レベルのＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現が、試験されたすべての前立腺癌組織および細胞株、ならびに試験された大半の膵臓癌、結腸癌、および膀胱癌の細胞株において検出されている。高レベルのＳＴＥＡＰ−１発現はまた、いくつかの卵巣癌細胞株において観察されている。低レベルの発現が、いくつかの乳癌、精巣癌、および子宮頸癌の細胞株において観察されている。非常に高レベルの発現はまた、ユーイング肉腫細胞株において検出されている。出願人は、細胞表面のＳＴＥＡＰ−１タンパク質が、膀胱癌、肺癌、および結腸癌において発現されるが、正常な結腸においては検出可能な細胞表面（または細胞内）ＳＴＥＡＰ−１タンパク質が存在せず、そして正常な膀胱では低い発現であることを示した。ＳＴＥＡＰ−１の細胞外ドメインと特異的に反応する抗体は、毒素もしくは治療剤の結合体としてか、または細胞の増殖もしくは機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかとして、全身的にこれらの癌を処置するために有用であり得る。
ＳＴＥＡＰ−２タンパク質もまた、前立腺癌、ならびに他の癌（結腸癌および肺癌を含む）においてまた発現される。ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロットによるＳＴＥＡＰ−２ ｍＲＮＡ分析によって、この発現が、正常な組織における前立腺に限定され、そしてまたいくつかの前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、精巣癌、卵巣癌、および他の癌において発現されることが示された。従って、ＳＴＥＡＰ−２と反応性の抗体は、前立腺癌および他の癌の処置において有用であり得る。同様に、ＳＴＥＡＰ−３およびＳＴＥＡＰ−４（ならびに、他のＳＴＥＡＰ）の発現は、いくつかの癌と関連付けられ得る。従って、これらのＳＴＥＡＰファミリーメンバータンパク質と反応性の抗体もまた、治療的に有用であり得る。
ＳＴＥＡＰ抗体は、この抗体が癌細胞上のＳＴＥＡＰに結合し、そして細胞および腫瘍の破壊を媒介し、細胞または腫瘍の増殖を阻害し、および／または循環している微小転移巣および／または確立された転移における原発性腫瘍のＳＴＥＡＰ機能を排除するように、患者に導入され得る。腫瘍の血管新生の程度は、指針（これに基づいて、送達アプローチが推奨される）を提供し得る。同様に、疾患の悪性度分類および／または病期は、これに関する有用な情報を提供することが予期される。例えば、より悪性度分類の高いより進行した腫瘍は、転移を蒔く可能性がより高い可能性があり、これは転移の発生を処置または予防するための全身投与を示唆する。このような抗体が治療的効果を発揮する機構は、以下を含み得る：補体媒介性細胞溶解、抗体依存性の細胞傷害性、ＳＴＥＡＰの生理的機能の調節、リガンド結合またはシグナル伝達経路の阻害、腫瘍細胞分化の調節、腫瘍新脈管形成因子プロフィールの改変、および／またはアポトーシスの誘導。毒性剤または治療剤に結合体化されたＳＴＥＡＰ抗体はまた、ＳＴＥＡＰ保有腫瘍細胞に直接的に毒性剤または治療剤を送達するために治療的に使用され得る。
抗ＳＴＥＡＰ抗体を使用する癌免疫療法は、他の癌の型（結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１−５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０−６１６６）；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８−４４０３）および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７）が挙げられるが、これらに限定されない）の処置において首尾良く使用された種々のアプローチによって生み出された教示に従い得る。いくつかの治療的アプローチは、毒素への裸の抗体の結合体化（例えば、抗ＣＤ２０抗体への１３１Ｉの結合体化（例えば、Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ））を含むが、他の治療的アプローチは、抗体と他の治療剤（例えば、パクリタキセルとのＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラツマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））との同時投与を包含する。前立腺癌の処置について、例えば、ＳＴＥＡＰ抗体は、照射、化学療法、またはホルモン除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）と組み合わせて投与され得る。
ＳＴＥＡＰ抗体療法は、すべての病期の癌に有用であり得るが、抗体療法は、特に、進行した癌または転移した癌において適切であり得る。本発明の抗体療法を用いる処置は、以前に１以上の化学療法を受けた患者に指示され得るが、化学療法または照射レジメンと本発明の抗体療法を組み合わせることは、化学療法による処置を受けていない患者に好適であり得る。さらに、抗体療法は、特に、化学療法剤の毒性に対してあまり耐性ではなかった患者に対する、同時化学療法の減少した投薬量の使用を可能にし得る。
いくつかの癌患者については、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的な評価、定量的なＳＴＥＡＰ画像化、またはＳＴＥＡＰの発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、ＳＴＥＡＰの発現の存在およびその発現のレベルを評価することが所望され得る。腫瘍の生検または外科的な標本の免疫組織化学的な分析が、この目的のために好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
前立腺および他の癌を処置するにおいて有用である抗ＳＴＥＡＰモノクローナル抗体として、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得るもの、および直接細胞傷害性であり得るものが挙げられる。これに関して、抗−ＳＴＥＡＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体によって媒介される細胞の細胞傷害性または抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の機構（これらの両方ともが、エフェクター細胞のＦｃレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする）のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂが、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性のｍＡｂが作用し得る可能性のある機構として、細胞の増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗−ＳＴＥＡＰ ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体によって媒介される細胞の溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロでのアッセイを使用して、当該分野で一般的に公知であるように評価され得る。
特定の抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂまたは抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂの組み合わせの抗腫瘍活性は、適切な動物モデルを使用してインビボで評価され得る。例えば、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）前立腺癌モデル（ここでは、ヒト前立腺癌外植片または継代異種移植片組織が、免疫無防備状態の動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入されている）が、前立腺癌に関連して適切であり、そして米国特許第６，１０７，５４０号；Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８に記載されている。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８（Ｓａｗｙｅｒｓら、１９９８年４月２３日付公開）は、原発性腫瘍、微小転移巣、および後期疾患に特徴的な骨芽細胞転移の形成の発生を反復し得るヒト前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載している。効力は、腫瘍形成、腫瘍の回帰または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測され得る。
マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラ ｍＡｂ抗体の使用が、何人かの患者で、中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの場合において、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的ＳＴＥＡＰ抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
本発明の治療法は、単一の抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂ抗体の投与、ならびに異なるｍＡｂ抗体の組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂを含むか、異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるのと同じ程度だけ、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂの投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、および免疫モジュレーター（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と組合され得る。抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂは、その「裸」の形態または非結合形態で投与され得るし、またはそれらに結合した治療薬剤を有し得る。
本発明の方法の実施において使用された抗ＳＴＥＡＰモノクローナル抗体は、所望の送達方法に適するキャリアを含む薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアは、抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂと併用された場合に抗体の抗腫瘍性の機能を保持しかつ被験体の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例として、例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水、静菌水などといった多数の標準的な薬学的キャリアのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
抗ＳＴＥＡＰ抗体処方物は、腫瘍部位にその抗体を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。投与の潜在的に有効な経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。投与の好ましい経路は、静脈内注射によってである。静脈内注射のために好ましい処方物は、保存静菌水の溶液中の抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂ、滅菌非保存水中の抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂおよび／あるいはＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＳＰ）用の０．９％滅菌塩化ナトリウムを含むポリビニルクロライドバッグまたはポリエチレンバッグ中で希釈された抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂを含む。抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂ調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌パウダーとして保存され得（好ましくは、真空下で）、次いで、注射の前に、例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む静菌水または滅菌水において再構成され得る。
処置は一般的に、受容可能な投与経路（例えば、静脈注射（ＩＶ））を介する、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量での、抗ＳＴＥＡＰ抗体調製物の反復投与を包含する。１０〜５００ｍｇ ｍＡｂ／週の範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｍＡｂを用いる臨床実験に基づいて、初回負荷量約４ｍｇ／ｋｇ患者の体重のＩＶに続いての、毎週の用量約２ｍｇ／ｋｇの抗ＳＴＥＡＰ ｍＡｂ調製物のＩＶが、受容可能な投薬レジメンを示し得る。好ましくは、この初回負荷量が、９０分以上注入として投与される。周期的維持用量は、３０分以上の注入として投与され得るが、ただし、その初回量が十分に許容された場合に限る。しかし、当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における初回量レジメンに影響する。このような因子としては、例えば、使用される抗体（Ａｂ）またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合親和性および半減期、患者におけるＳＴＥＡＰ発現の程度、循環し落ちた（ｓｈｅｄ）ＳＴＥＡＰ抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤の影響が、挙げられ得る。
最適には、患者は、最も有効な投薬レジメンおよび関連因子の決定を補助するために、血清中の循環する落ちたＳＴＥＡＰ抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じモニターする目的のために使用され得、そして他のパラメーター（例えば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組み合わせて、治療の成功を判断するために有用であり得る。
（ＳＴＥＡＰタンパク質機能の阻害）
本発明は、その結合パートナーまたはリガンドへのＳＴＥＡＰの結合あるいは他のタンパク質とのＳＴＥＡＰの会合を阻害するための、種々の方法および組成物、ならびにＳＴＥＡＰ機能を阻害するための方法を包含する。
（組換えタンパク質を用いるＳＴＥＡＰの阻害）
１つのアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰへの結合が可能で、その結果、ＳＴＥＡＰの結合パートナー（単数または複数）またはＳＴＥＡＰの関連する他のタンパク質（単数または複数）への、ＳＴＥＡＰの接近／結合の防止が可能である組換え分子は、ＳＴＥＡＰ機能の阻害に使用される。例えば、そのような組換え分子は、ＳＴＥＡＰ特異的な抗体分子の反応性部分（単数または複数）を含む。特定の実施形態において、ＳＴＥＡＰ結合パートナーのＳＴＥＡＰ結合ドメインは、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結される２つのＳＴＥＡＰリガンド結合ドメインを含む、二量体融合タンパク質の中に設計され得る。そのようなＩｇＧ部分は、ＣＨ１ドメインではなく、例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含み得る。そのような二量体融合タンパク質は、可溶性形態で、ＳＴＥＡＰの発現に関連する癌（前立腺癌に限定されない）を患う患者に投与され得る。ここで、二量体融合タンパク質は、特異的にＳＴＥＡＰに結合し、その結果、結合パートナーおよび／または調節ＳＴＥＡＰ機能とのＳＴＥＡＰ相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質は、さらに、公知の抗体関連性技術を使用する多量体タンパク質に併用され得る。
（細胞内抗体を用いるＳＴＥＡＰの阻害）
別のアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰに特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、ＳＴＥＡＰを発現する細胞中へと遺伝子移入技術を介して導入され得、その遺伝子移入技術において、そのコードされる単鎖抗ＳＴＥＡＰ抗体が細胞内発現され、ＳＴＥＡＰタンパク質に結合し、そしてそれによりＳＴＥＡＰタンパク質の機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され得、その処置の阻害活性が焦点を合わせる制御を提供する。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、他に豊富な細胞表面レセプターの発現を事実上除去することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと。
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより結合された、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に結合された単鎖可変領域フラグメントとして発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、発現される内部抗体を所望の細胞内区画に正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じてＣ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作され得る。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分が、原形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に結合され得る。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質内部抗体が、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞での終着点に輸送されることを防ぐために、使用され得る。
１つの実施形態では、ＳＴＥＡＰ内部抗体は、特定のＳＴＥＡＰドメインに特異的に結合するように設計される。例えば、ＳＴＥＡＰタンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体は、ＳＴＥＡＰが核へアクセスすることを防ぎ、それによりＳＴＥＡＰが核内で任意の生物学的活性を及ぼすのを防ぐ（例えば、ＳＴＥＡＰが他の因子と転写複合体を形成するのを防ぐ）ために使用され得る。
このような内部抗体の発現を特定の腫瘍細胞に特異的に向けるために、その内部抗体の転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置され得る。前立腺に特異的に内部抗体発現を標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
（ＳＴＥＡＰの転写または翻訳の阻害）
別の種類の治療アプローチにおいて、本発明は、ＳＴＥＡＰ遺伝子の転写を阻害するための、種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための、方法および組成物も提供する。
１つのアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ遺伝子の転写を阻害する方法は、ＳＴＥＡＰ遺伝子をＳＴＥＡＰアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ特異的リボザイムが、ＳＴＥＡＰメッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用され得る。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、ＳＴＥＡＰ遺伝子の調節領域（例えば、ＳＴＥＡＰプロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、ＳＴＥＡＰ遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、ＳＴＥＡＰ ｍＲＮＡ転写を阻害するために使用され得る。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
ＳＴＥＡＰ転写活性化を妨害することを介してＳＴＥＡＰの転写を阻害する他の因子もまた、ＳＴＥＡＰを発現する癌の処置に有用であり得る。同様に、ＳＴＥＡＰのプロセシングを妨害し得る因子は、ＳＴＥＡＰを発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内にある。
（治療ストラテジーについての一般的な考慮）
遺伝子移入および遺伝子治療の技術は、ＳＴＥＡＰを合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体をコードするポリヌクレオチドおよび他のＳＴＥＡＰ阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。ＳＴＥＡＰアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＳＴＥＡＰ転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターは、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
上記の治療アプローチは、広範な種々の化学療法または放射線療法のレジメンのいずれか１つと組み合わされ得る。これらの治療アプローチはまた、特に、化学療法剤の毒性に十分に寛容ではない患者において、化学療法の投薬量の減少、および／またはより頻度の少ない投与の使用を可能にし得る。
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロおよびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療の可能性を評価するためのインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟質ゲルアッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへのＳＴＥＡＰの結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
インビボでは、ＳＴＥＡＰ治療用組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、外因性前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌外植片または継代された異種移植組織が、免疫無防備動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）は、前立腺癌に関して適切であり、そして記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８，Ｓａｗｙｅｒｓら（１９９８年４月２３日公開）は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および後期段階疾患の特徴である骨芽細胞性転移の形成を要約し得る、ヒト前立腺癌の種々の異種移植モデルを記載している。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例もまた参照のこと。
アポトーシスの促進を和らげる（ｑｕａｌｉｆｙ）インビボアッセイもまた、潜在的な治療用組成物の評価において有用であり得る。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス病巣の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移植片保有マウスに比較され得る。アポトーシス病巣が処置マウスの腫瘍に見出される程度は、この組成物の治療効力の指標を提供する。
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物中（ワクチン組成物を含む）に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と非反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれらに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編，１９８０を参照のこと）。
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達させ得る任意の経路を通じて投与され得る。潜在的に効果的な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、眼内などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存された静菌水、滅菌非保存水の溶液における治療用組成物を含み、そして／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリビニルクロリドまたはポリエチレンバッグに希釈される。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で貯蔵され得、次いで注射する前に、例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む静菌水中に、または滅菌水中に再構成され得る。
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコールは、方法および標的の癌とともに変化し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の因子に依存する。
（癌ワクチン）
本発明はさらに、ＳＴＥＡＰタンパク質またはそのフラグメントを含む癌ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンを提供する。ＳＴＥＡＰの腫瘍により制限される発現を考慮すると、ＳＴＥＡＰ癌ワクチンは、非標的組織に対して非特異的効果を生成することなく、ＳＴＥＡＰを発現している癌の特異的な予防および／または処置に効果的であることが予期される。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトＰＳＭＡおよびげっ歯類ＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１〜２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３〜３１１７）。このような方法は、ＳＴＥＡＰタンパク質もしくはそのフラグメント、またはＳＴＥＡＰをコードする核酸分子、およびＳＴＥＡＰ免疫原を発現し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施され得る。
例えば、ウイルス遺伝子送達系は、ＳＴＥＡＰをコードする核酸分子を送達するために用いられ得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系は、以下を包含するが、これらに限定されない：ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に導入される（例えば筋内で）、ＳＴＥＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＤＮＡを用いることにより用いられ得る。１つの実施形態では、全長ヒトＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡが用いられ得る。
１つの実施形態では、ＳＴＥＡＰ癌ワクチンは、図１１Ａ〜Ｂに示されるＳＴＥＡＰアミノ酸配列内の免疫原性ペプチドの同一性に基づく。以下の実施例でさらに議論するように、ＳＴＥＡＰは、Ｔ細胞またはＢ細胞の応答を増加させることが示されている。従って、ＳＴＥＡＰのこれらの特定の部分およびこれらの部分をコードするポリヌクレオチドは、癌ワクチンの生成のために選択され得る。ＳＴＥＡＰタンパク質のこのような部分の１例は、図１Ａ〜Ｂに示されるようなＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基１４から２８（ＷＫＭＫＰＲＲＮＬＥＥＤＤＹＬ；配列番号２２）である。
別の実施形態では、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするＳＴＥＡＰ核酸分子が用いられ得る。ＣＴＬエピトープは、特定化されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る、ＳＴＥＡＰタンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され得る。１つの適切なアルゴリズムは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において利用可能であるＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子そして具体的にはＨＬＡ−Ａ２の溝における特定のペプチド配列の結合に基づく（Ｆｌａｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５１；２９０−６；Ｈｕｎｔら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３；Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７；Ｐａｒｋｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５）。ＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および他のクラスＩ分子への推定される結合について、完全タンパク質配列からの８マー、９マーおよび１０マーのペプチドの配置および順位を可能にする。ほとんどのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドは、９マーであり、好適には、２位でロイシンを含み、そして９位でバリンまたはロイシンを含む（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７）。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上のＨＬＡ−Ａ２発現の安定化により評価され得る（Ｘｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら、１９９８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−３８）。特定のペプチドの免疫現性は、樹状細胞の存在下でのＣＤ８＋ＣＴＬの刺激によりインビトロで評価され得る（Ｘｕｅら；Ｐｅｓｈｗａら、前出）。
特定のＳＴＥＡＰペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２への結合が推定され、そして癌ワクチンにおける使用に好ましいＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１６５〜１７３、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸８６〜９４、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸２６２〜２７０、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸３０２〜３１０、ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１５８〜１６６、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸２２７〜２３５、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸４０２〜４１０、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸３０７〜３１５、ＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸３０６〜３１４、およびＳＴＥＡＰ−２のアミノ酸１００〜１０８に対応するペプチドを含む。
種々のエキソビボストラテジーが、用いられ得る。１つのアプローチは、患者の免疫系にＳＴＥＡＰ抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７副刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、およびＩＬ−１２を発現し、そして従って高度に特化された抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために使用されている（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３８０）。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の関連においてＴ細胞に対してＳＴＥＡＰペプチドを提示するために使用され得る。１つの実施形態では、自己樹状細胞は、ＭＨＣ分子に結合し得るＳＴＥＡＰペプチドでパルスされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全ＳＴＥＡＰタンパク質でパルスされる。さらに別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、および腫瘍由来ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））を用いて樹状細胞におけるＳＴＥＡＰ遺伝子の過剰発現を操作することを含む。ＳＴＥＡＰを発現する細胞は、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
抗イディオタイプ抗ＳＴＥＡＰ抗体もまた、抗癌療法において、ＳＴＥＡＰタンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり、そしてＳＴＥＡＰタンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＳＴＥＡＰ抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
遺伝子免疫法は、ＳＴＥＡＰを発現する癌細胞に対する予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。ＳＴＥＡＰタンパク質／免疫原をコードするＤＮＡおよび適切な調節配列を含む構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、筋肉または皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされたＳＴＥＡＰタンパク質／免疫原を発現する。ＳＴＥＡＰタンパク質免疫原の発現は、前立腺癌およびＳＴＥＡＰ発癌性癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫技術が使用され得る（検討のために、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
（診断組成物およびキット）
上記で記載または示唆された診断適用および治療適用における使用のために、本発明によって、キットもまた提供される。このようなキットは、１つ以上のコンテナ手段（例えば、バイアル、チューブなど）を厳重に閉じ込めて受容するように区画化されるキャリア手段を備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法において、使用されるべき別々の要素の１つを含む。例えば、コンテナ手段の１つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれＳＴＥＡＰタンパク質もしくはＳＴＥＡＰ遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが、標的核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含むコンテナ、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識）に結合されるレポーター手段（例えば、ビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を含むコンテナを有し得る。
本発明のキットは、代表的には、上記コンテナ、および使用説明書と共に、市販および使用者の観点で所望の材料（緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む）を含む１つ以上の他のコンテナを含む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用（例えば、上記の使用）についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
ＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡは、ブダペスト条約の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に、プラスミドｐ５８Ｐ１Ｄ１２−２として１９９９年３月１０日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号２０７１５２で承認されている。
従って、本発明はまた、ＳＴＥＡＰ関連分子を含む診断組成物を提供する。このような分子は、本明細書中に記載の種々のＳＴＥＡＰポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、タンパク質、フラグメント、抗体を含む。診断組成物に含まれる分子は、必要に応じて、検出可能なマーカーで標識化され得る。ＳＴＥＡＰ診断組成物は、さらに、適切な緩衝液、希釈剤および所望される場合、他の成分を含み得る。
（実施例）
本発明の種々の局面を、以下に続くいくつかの例によってさらに記載および例示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
（実施例１：ＳＴＥＡＰ遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成単離）
（材料および方法）
（ＬＡＰＣ異種移植片）
ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）から入手し、記載のように生成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２−４０８；Ｃｒａｆｔら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：５０３０−５０３６）。アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４ ＡＤおよびＡＩ）ならびにアンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−９異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＣＰ−９異種移植片（それぞれＬＡＣＰ−９ ＡＤおよびＡＩ）をそれぞれインタクトな雄ＳＣＩＤマウスまたは雄去勢マウスにおいて増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ腫瘍から誘導し、ＬＡＰＣ−９ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍から誘導した。ＡＩ異種移植片を生成するために、ＬＡＰＣ ＡＤ腫瘍を有する雄マウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間飼育した。ＬＡＰＣ腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄ＳＣＩＤマウスにおいてまたは雌ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。
ＬＡＰＣ−４ＣＤ異種移植片は、以下のように脛骨内（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌｌｙ）で増殖した。皮膚下で増殖したＬＡＰＣ−４ＣＤ異種移植片腫瘍組織を、１〜２ｍｍ３の切片に細かく切断し、この組織を、１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地に浸した。次いで、切り刻んだ組織を、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、この上清を、１０ｍｌの氷冷１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地中に再懸濁し、そして１．３Ｋｒｐｍで、４分間遠心分離した。次いで、このペレットを、１％プロナーゼＥを含む１×Ｉｓｃｏｖｅｓ中に再懸濁し、そして穏やかなゆれ攪拌（ｒｏｃｋｉｎｇ ａｇｉｔａｔｉｏｎ）をしながら、室温で２０分間インキュベートした後に２〜４分間の氷上でインキュベートした。濾液を、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、そしてプロナーゼを、１０ｍｌのＩｓｃｏｖｅｓ中での再懸濁および再遠心分離によって吸引されたペレットから除去した。次いで、細胞の凝集塊を、ＰｒＥＧＭ培地にプレートし、そして一晩増殖させた。次いで、この細胞を収集し、濾過し、２×ＲＰＭＩで洗浄し、そしてカウントした。約５０，０００個の細胞を、氷上で、当量の氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、そして２７ゲージの針を介してＳＣＩＤマウスの近位脛骨幹端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｉｂｉａｌ ｍｅｔａｐｈｙｓｅｓ）に、外科的に注射した。１０〜１２週間後、骨髄において増殖したＬＡＰＣ−４腫瘍は、回復した。
（細胞株および組織）
ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中で維持した。
（ＲＮＡ単離）
腫瘍組織および細胞株を、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０８細胞を用いてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）においてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ ＭｉｎｉキットおよびＭｉｄｉキットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度計分析（Ｏ．Ｄ． ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー）： ５’ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴ３０３’（配列番号２３）
アダプター１： ５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧ３’ ３’ＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴＡＧ５’ （配列番号２４、２５）
アダプター２： ５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧ３’ ３’ＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧ５’ （配列番号２６、２７）
ＰＣＲプライマー１： ５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’ （配列番号２８）
ネスト化プライマー（ＮＰ）１： ５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＡ３’ （配列番号２９）
ネスト化プライマー（ＮＰ）２： ５’ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＡ３’ （配列番号３０）。
（抑制サブトラクティブ（ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）と比較して、アンドロゲン依存性前立腺癌で上方制御され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。
ＬＡＰＣ−４ＡＤ異種移植片（テスター）およびＢＰＨ組織（ドライバー）に対応する二本鎖ｃＤＮＡを、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＲＳＡＣＤＮを使用して、上記のように、異種移植片およびＢＰＨ組織から単離した２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成した。第一鎖および第二鎖合成を、このキットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．ＰＴ１１１７−１、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ１８０４−１）に記載のように実施した。この得られたｃＤＮＡを、ＲｓａＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
ドライバーｃＤＮＡ（ＢＰＨ）を、４：１比で、ＲｓａＩ消化したＢＰＨ ｃＤＮＡとマウス肝臓由来の消化したｃＤＮＡとを合わせることによって生成し、マウス遺伝子が、このテスターｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４ＡＤ）から差し引かれることを確実にした。
テスターｃＤＮＡを、５μｌの水中に１μｌのＲｓａＩ消化したＬＡＰＣ−４ＡＤ ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈することにより生成した。次いで、この希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、総容量１０μｌで、１６℃で一晩、別々の連結反応液中で、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡで、そして７２℃で５分間加熱して終結させた。
第一のハイブリダイゼーションを、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１を連結したテスターｃＤＮＡおよびアダプター２を連結したテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。４μｌの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ サーマルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、次いで、６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、この２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌの新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、この第二のハイブリダイゼーションを、２００μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
（ＳＳＨから生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、２つのＰＣＲ増幅を行った。第一のＰＣＲ反応において、１μｌの希釈した最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量２５μｌ中の１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ ｄＮＴＰミックス（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで２７サイクルの９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分。５つの別の第一のＰＣＲ反応を、各実験について行った。産物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応については、このプールしそして希釈した第一のＰＣＲ反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いた反応混合物と同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を用いて実施した。これらのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
これらのＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、青／白およびアンピシリン選択に供した。白色コロニーを選択し、９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲ１の条件ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を用いて、１ｍｌの細菌培養物に対して実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
細菌クローンを、９６ウェル形式で２０％グリセロール中に貯蔵した。プラスミドＤＮＡを、調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴおよびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析）
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いるオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングによって、１μｇのｍＲＮＡから生成した。製造者プロトコールを使用し、そしてこれは、４２℃で５０分間の逆転写酵素とのインキュベーション、それに続く、３７℃で２０分間のＲＮＡｓｅ Ｈ処理を含んだ。反応を完了した後、この容量を、正規化の前に水で２００μｌに増大させた。１６の異なる正常ヒト組織からの第一鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
複数の組織からの第一鎖ｃＤＮＡの正規化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号３１）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号３２）を用いてβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）および１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む、総容量５０μｌで増幅した。１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルで、５μｌのＰＣＲ反応物を取り出し、そしてアガロース電気泳動のために使用した。ＰＣＲを、以下の条件下で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを用いて実施した：初期変性は９４℃で１５秒間であり、続いて１８サイクル、２０サイクル、および２２サイクルの９４℃で１５、６５℃で２分、７２℃で５秒。７２℃での最終伸長を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβアクチンバンドのバンド強度を、可視検査によって比較した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいβアクチンバンド強度を生じるように、第一鎖ｃＤＮＡの希釈因数を算定した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいバンド強度を達成するには、３ラウンドの正規化が必要であった。
８Ｐ１Ｄ４遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの正規化した第一鎖ｃＤＮＡを、以下のプライマー対を用いる、２５、３０、および３５サイクルの増幅を用いるＰＣＲによって分析した：５’−ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＴＴ ＧＧＡ−３’（配列番号４）
５’−ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＡＣ−３’（配列番号５）。
半定量発現分析を、軽度のバンド強度を与えるサイクル数でのＰＣＲ産物を比較することにより達成した。
（結果）
いくつかのＳＳＨ実験を、上述の材料および方法に記載のように行い、そしてこれらのＳＳＨ実験は、多数の候補遺伝子フラグメントクローンの単離を導いた。全ての候補クローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体に関する情報を提供するためおよび差次的な発現について特定の遺伝子を分析するための決定を導くことを補助するために、主な公的な遺伝子データベースおよびＥＳＴデータベース中の全配列に対する相同性分析に供した。一般に、これらの検索したデータベースのいずれかにおいていかなる公知の配列とも相同性を有さず、従って新規な遺伝子を表すと考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析によって差次的発現分析に供した。
８Ｐ１Ｄ４と名付けた、これらのｃＤＮＡクローンの１つは、４３６ｂｐの長さであり、そしてＮＣＩ−ＣＧＡＰ腫瘍遺伝子データベースにおいてＥＳＴ配列に対する相同性を示した。その後、この８Ｐ１Ｄ４遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを、このｃＤＮＡを使用して単離し、ＳＴＥＡＰ−１と改名した。この８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、図１Ａ〜Ｂに示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５０〜５８５に対応する。２８Ｐ３Ｅ１と名付けた、別のクローンは、５６１ｂｐの長さであり、そしてＮＣＩ−ＣＧＡＰ腫瘍遺伝子データベースまたは他のデータベースにおいて、多くのＥＳＴ配列に対する相同性を示した。この２８Ｐ３Ｅ１配列（３５６ｂｐ）は、ヒト胎児組織由来のＥＳＴと同一である。全長ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを得てそして配列決定した後に、このクローンはまた、ＳＴＥＡＰ−１（より詳細には、図１Ａ〜Ｂに示されるような、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列の残基６２２から３’末端まで）に対応することが明らかとなった。
８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡクローン由来のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによる差次的発現分析は、８Ｐ１Ｄ４（ＳＴＥＡＰ−１）遺伝子が、正常前立腺ならびにＬＡＰＣ−４異種移植片およびＬＡＰＣ−９異種移植片において、ほぼ等しいレベルで発現されることを示した（図２、パネルＡ）。１６の正常組織由来の第１鎖ｃＤＮＡのさらなるＲＴ−ＰＣＲ発現分析は、前立腺における最も高いレベルの８Ｐ１Ｄ４発現を示した。いくつかの他の正常組織（すなわち、結腸、卵巣、小腸、脾臓および精巣）における実質的により低レベルな発現は、脳、膵臓、結腸および小腸における３０サイクルの増幅でのみ検出可能であった（図２、パネルＢおよびＣ）。
（実施例２：全長ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡのクローニング）
４３６ｂｐの８Ｐ１Ｄ４遺伝子フラグメント（実施例１）を使用して、８Ｐ１Ｄ４／ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をコードするさらなるｃＤＮＡを単離した。手短に言うと、正常なヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、この４３６ｂｐの８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡから作製した標識プローブを用いてスクリーニングした。陽性クローンの１つであるクローン１０は、１１９５ｂｐの長さであり、そして３３９アミノ酸のタンパク質をコードし、ヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列は、いかなる公知のヒト遺伝子またはタンパク質に対しても有意な相同性を保持しなかった（国際出願ＷＯ９８／５３０７１に最近記載されたラット腎臓損傷タンパク質に対する相同性）。このコードされるタンパク質は、少なくとも６つの推定膜貫通モチーフを含み、これは、細胞表面配向性を示す（図１Ａ〜Ｂ（下線を付した推定膜貫通モチーフ）を参照のこと）。これらの構造的特徴によって、ＳＴＥＡＰ（「前立腺の６つの膜貫通上皮抗原（Ｓｉｘ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ）」）と命名した。
引き続くさらなるＳＴＥＡＰタンパク質の同定によって、この８Ｐ１Ｄ４遺伝子産物を「ＳＴＥＡＰ−１」と改名した。このＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡおよびコードされるアミノ酸配列を、図１Ａ〜Ｂに示し、これらは、それぞれ、配列番号１および配列番号２に対応する。ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローン１０を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に、プラスミド８Ｐ１Ｄ４クローン１０．１として、１９９８年８月２６日に寄託し、ＡＴＣＣ登録番号９８８４９を付与された。このＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローンを、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩの二重消化（５’末端でＥｃｏＲＩ、３’末端でＸｂａＩ）を使用して、このプラスミドから切除した。
（実施例３：ＳＴＥＡＰ−１遺伝子およびタンパク質発現分析）
ＳＴＥＡＰ−１の生物学的特徴を特徴付けることを開始するために、種々のヒト組織試料にわたる、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡおよびＳＴＥＡＰ−１タンパク質の広範な評価を行った。この評価には、多くの正常ヒト組織、ヒト前立腺癌異種移植片および細胞株、ならびに種々の他のヒト癌細胞株における、ＳＴＥＡＰ−１発現のノーザンブロット分析、ウエスタンブロット分析および免疫組織化学的分析が含まれた。
（実施例３Ａ：正常ヒト組織におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析）
正常ヒト組織におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現の最初の分析を、標識ＳＴＥＡＰ−１クローン１０をプローブとして使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た２つの多組織ブロット（これは、総計１６の異なる正常ヒト組織を含む）をノーザンブロットに供することによって行った。ＲＮＡサンプルを、βアクチンプローブを使用して、定量的に正規化した。結果を、図３Ａに示す。最も高い発現レベルは、正常な前立腺において検出され、結腸および肝臓において検出された発現レベルより約５〜１０倍低かった。これらのノーザンブロットは、約１．４ｋｂおよび４．０ｋｂの２つの転写物を示し、前者は、全長ＳＴＥＡＰ−１クローン１０のｃＤＮＡに対応し、これは、ＳＴＥＡＰ−１のオープンリーディングフレーム全体をコードする。より大きい転写物が、正常な前立腺ライブラリーから３６２７ｂｐのｃＤＮＡとして別にクローニングされ、この配列は、２３９９ｂｐのイントロンを含む（図４）。
この最初の分析は、ＳＴＥＡＰ−１クローン１０プローブを使用して、３７の正常ヒト組織のＲＮＡドットブロットマトリクス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を分析することによって拡大した。これらの結果を図３Ｂに示し、これは、前立腺のみにおける強力なＳＴＥＡＰ−１発現を示した。非常に低いレベルのＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡ発現は、肝臓、肺、気管および胎児肝臓組織において検出され、おそらく、前立腺癌と比較して５倍低いレベルであった。残りの組織のいずれにおいても、発現は検出されなかった。これらの分析に基づいて、有意なＳＴＥＡＰ−１発現は、正常組織において前立腺特異的であるようである。
（実施例３Ｂ：前立腺癌の異種移植片および細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析）
ヒト癌組織および細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１発現を分析するために、ヒト前立腺癌異種移植片ならびに前立腺および非前立腺癌の細胞株の広範なパネル由来のＲＮＡを、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローン１０をプローブとして使用するノーザンブロットによって分析した。全てのＲＮＡサンプルを、エチジウムブロミド染色および標識βアクチンプローブでのその後の分析によって、定量的に正規化した。
図５に示される結果は、全てのＬＡＰＣ異種移植片および全ての前立腺癌細胞株における、高レベルのＳＴＥＡＰ−１発現を示す。ＬＡＰＣ−９異種移植片における発現は、ＬＡＰＣ−４異種移植片と比較して高かったが、アンドロゲン依存性亜株とアンドロゲン非依存性亜株との間には有意な差異は観察されなかった（図５Ａ）。ＬＡＰＣ−４異種移植片における発現は、正常前立腺における発現に匹敵した。より低いレベルの発現は、ＰｒＥＣ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）（これは、前立腺の基底細胞画分を表す）において検出された。前立腺癌細胞株の分析は、ＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性前立腺癌細胞株）における最も高い発現レベルを示した。有意な発現はまた、アンドロゲン非依存性細胞株ＰＣ−３およびＤＵ１４５においても検出された。高レベルのＳＴＥＡＰ発現はまた、前立腺癌の骨転移のモデルとしてマウスの脛骨内で増殖させた、ＬＡＰＣ−４腫瘍およびＬＡＰＣ−９腫瘍においても検出された。
有意に、非常に強力なＳＴＥＡＰ−１発現もまた、分析した多くの非前立腺ヒト癌細胞株においても検出された（図５Ａ）。特に高レベルの発現は、ＲＤ−ＥＳ細胞、Ｅｗｉｎｇ肉腫（ＥＷＳ）由来細胞株において観察された。さらに、非常に高レベルの発現はまた、結腸癌細胞株（例えば、ＣａＣｏ−２、ＬｏＶｏ、Ｔ８４およびＣｏｌｏ−２０５）、膀胱癌細胞株（例えば、ＳＣＡＢＥＲ、ＵＭ−ＵＣ−３、ＴＣＣＳＵＰおよび５６３７）、卵巣癌細胞株（例えば、ＯＶ−１０６３およびＳＷ６２６）および膵臓癌細胞株（例えば、ＨＰＡＣ、Ｃａｐａｎ−１、ＰＡＮＣ−１およびＢｘＰＣ−３）においても検出された。これらの結果は、対応する正常組織における強力な発現の不在（図３）と合わせて、ＳＴＥＡＰ−１が、一般に、これらの型（および他の型）のヒト癌において上方制御され得ることを示す。
（実施例３Ｃ：前立腺癌および他の癌におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現のウエスタンブロット分析）
図１Ａ〜Ｂに示されるようなＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜２８（ＷＫＭＫＰＲＲＮＬＥＥＤＤＹＬ；配列番号２２）に対応する１５マーのペプチドを合成し、そして以下のように、これを使用して、ヒツジを免疫し、このタンパク質のアミノ末端に対するヒツジモノクローナル抗体（抗ＳＴＥＡＰ−１）を作製した。このペプチドを、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合体化させた。ヒツジを、完全フロイントアジュバント中の４００μｇのペプチドで最初に免疫した。その後、この動物を、不完全フロイントアジュバント中の２００μｇのペプチドで２週間毎にブーストした。抗ＳＴＥＡＰ抗体を、アフィゲル１０（ａｆｆｉｇｅｌ １０）（Ｂｉｏ Ｒａｄ）に結合したＳＴＥＡＰペプチドを使用して、ヒツジ血清からアフィニティー精製した。精製した抗体を、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水中に保存する。
抗体特異性を試験するために、ＳＴＥＡＰ−１のｃＤＮＡを、レトロウイルス発現ベクター（ｐＳＲαｔｋｎｅｏ、Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）にクローニングした。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ＳＴＥＡＰ−１をコードするレトロウイルスで感染し、２週間、Ｇ４１８下で選択した。感染および非感染ＮＩＨ ３Ｔ３細胞のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、この感染細胞のみにおける、３６ｋＤの見かけの分子量を有するタンパク質の発現を示した（図６、「３Ｔ３ ＳＴＥＡＰ」および「３Ｔ３」と印したレーン）。
抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体を使用して、種々の前立腺癌異種移植片組織、前立腺癌細胞株および他の非前立腺癌細胞株から調製した細胞溶解物のウエスタンブロットを、プローブした。タンパク質サンプル（各２０μｇ）を、抗Ｇｒｂ−２抗体でのこのブロットのプローブによって、定量的に正規化した。
これらの結果を、図６示す。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、全てのＬＡＰＣ前立腺癌異種移植片、全ての前立腺癌細胞株、初代前立腺癌試料およびその適合する正常な前立腺コントロールにおいて検出された。最も高いＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現は、ＬＡＰＣ−９異種移植片およびＬＮＣａＰ細胞において検出され、これは、直前に記載したノーザンブロット分析と一致する。高レベルの発現はまた、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３においても観察された。他の癌細胞株における発現もまた、検出可能であった（図６）。
（実施例３Ｄ：前立腺腫瘍生検および外科的生検におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現の免疫組織化学的分析）
臨床的材料におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現の程度を決定するために、組織切片を、免疫組織化学的分析のために、種々の前立腺癌生検および外科的サンプルから調製した。組織を、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィンで包理し、そして標準的なプロトコールに従って切片化した。ホルマリン固定し、パラフィン包理した、ＬＮＣａＰ細胞の切片を、ポジティブコントロールとして使用した。切片を、ＳＴＥＡＰ−１ Ｎ末端エピトープに対するヒツジ抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体（直前に記載したような）で染色した。ＬＮＣａＰ切片を、このポリクローナル抗体を作製するために使用したＳＴＥＡＰ−１ Ｎ末端ペプチド免疫原（ペプチド１）、またはＳＴＥＡＰ−１の別の領域由来の非特異的ペプチド（ペプチド２；ＹＱＱＶＱＱＮＫＥＤＡＷＩＥＨ；配列番号３３）の過剰量の存在下で、染色した。
結果を、図８に示す。ＬＮＣａＰ細胞は、全ての細胞における均一に強力な細胞周囲染色を示した（図８Ｂ）。過剰なＳＴＥＡＰ Ｎ末端ペプチド（ペプチド１）は、抗体染色を競合的に阻害し得たが（図８Ａ）、ペプチド２は、効果を有さなかった（図８Ｂ）。同様に、均一に強力な細胞周囲染色が、ＬＡＰＣ−９（図８Ｆ）およびＬＡＰＣ−４前立腺癌異種移植片において見られた。これらの結果は明確であり、そしてこの染色がＳＴＥＡＰ特異的であることを示唆する。さらに、これらの結果は、形質膜に対するＳＴＥＡＰの局在を示し、これは、以下の実施例４において示された生化学的知見を確証する。
これらの種々の臨床的試料を用いて得られた結果を、図８Ｃ（正常な前立腺組織）、図８Ｄ（グレード３の前立腺癌）、および図８Ｅ（グレード４の前立腺癌）において示し、そしてこれらはまた、表１に示された、要約した結果に含まれる。強力な染色に対する光は、試験した全ての前立腺癌サンプルならびに正常な前立腺または良性疾患（例えば、ＢＰＨ）に由来する全てのサンプルにおける腺上皮において観察された。このシグナルは、上皮細胞の細胞膜、特に細胞−細胞接合部で最も強力であるようであり（図８Ｃ〜Ｅ）、そしてまた、ＳＴＥＡＰ Ｎ末端ペプチド１で阻害される。いくらかの基底細胞染色もまた、正常な前立腺において示され（図８Ｃ）、これは、萎縮性の腺を試験した場合により明らかである。ＳＴＥＡＰ−１は、全てのグレードの前立腺癌で発現されるようである。なぜなら、低グレード（図８Ｄ）、高グレード（図８Ｅ）および転移性の前立腺癌（ＬＡＰＣ−９によって示される；図８Ｆ；図３２Ａ〜Ｂに示されるヒト患者転移もまた参照のこと）の全てが、強力な染色を示すからである。
正常な非前立腺組織の大きいパネルの免疫組織化学的染色は、これらの正常組織のほとんどにおいて、検出可能なＳＴＥＡＰ−１発現を示さなかった（表１）。正常な膀胱は、移行性の上皮における低レベルの細胞表面染色を示した（図８Ｇ）。膵臓、胃、子宮、ファローピウス管および下垂体は、低レベルの細胞質染色を示した（表１）。ノーザンブロットは、膵臓におけるＳＴＥＡＰ−１発現をほとんど示さなかったので（図３）、この観察された細胞質染色が、特異的であるのかまたはこの抗体の非特異的結合に起因するのは明らかではない。これらの結果は、正常組織におけるＳＴＥＡＰ−１の細胞表面発現が、前立腺および膀胱に制限されるようであることを示す。
表１：抗ＳＴＥＡＰ−１ヒツジポリクローナル抗体でのヒト組織の免疫組織化学的染色
（実施例３Ｅ：膀胱癌および肺癌におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現の免疫組織化学的分析）
他の癌におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現の程度を決定するために、膀胱癌および肺癌の臨床試料由来の組織を、実施例３Ｄに記載のようなポリクローナル抗体および方法を使用する免疫組織化学的分析に供した。図２１Ａ〜Ｄに示される結果は、前立腺癌組織で観察されたパターンと類似の細胞周囲染色パターンを明らかにする。
（実施例４：ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の生化学的特徴付け）
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を最初に特徴付けるために、ｃＤＮＡクローン１０を、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これは、そのカルボキシル末端に６Ｈｉｓタグをコードする）にクローニングし、そして抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｈｉｓ−プローブ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）ならびに上記のような抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーによって分析した。細胞の染色を、インタクトな細胞および透過化処理した細胞に対して行った。これらの結果は、透過化処理した細胞のみが、両方の抗体で染色されることを示し、これは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の両末端が、細胞内局在されていることを示す。従って、１以上のＳＴＥＡＰ−１タンパク質末端は、形質膜よりもむしろ細胞内オルガネラに関連しているという可能性がある。
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質が細胞表面で発現されるか否かを決定するために、インタクトな、ＳＴＥＡＰ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、ビオチン化試薬（これは、生存細胞には侵入しない）で標識した。次いで、ＳＴＥＡＰ−１を、抗Ｈｉｓおよび抗ＳＴＥＡＰ抗体を使用して、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＳＶ４０ラージＴ抗原（２９３Ｔ細胞で高レベルで発現される細胞内タンパク質）および内因性細胞表面トランスフェリンレセプターを、それぞれ、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして免疫沈降させた。免疫沈降後、これらのタンパク質を膜に転写し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンで可視化した。この分析の結果を、図７に示す。トランスフェリンレセプター（ポジティブコントロール）およびＳＴＥＡＰ−１のみが、ビオチンで標識され、一方、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ネガティブコントロール）は、検出可能に標識されなかった（図７Ａ）。細胞表面タンパク質のみが、この技術で標識されるので、ＳＴＥＡＰ−１が細胞表面タンパク質であることが、これらの結果から明らかである。フローサイトメトリー分析から得られた結果を組み合わせて、ＳＴＥＡＰ−１が細胞内のアミノ末端およびカルボキシル末端を有する細胞表面タンパク質であることが、明らかである。
さらに、ＳＴＥＡＰ−１二次構造予想とともに、上記の結果は、ＳＴＥＡＰ−１が６つの潜在的膜貫通ドメイン、３つの細胞外ループ、２つの細胞内ループおよび２つの細胞内末端の分子位相を有するＩＩＩａ型膜タンパク質であることを示す。細胞膜に関するＳＴＥＡＰ−１タンパク質位相の模式的な例示を、図２に示す。
さらに、前立腺、膀胱および結腸の癌細胞は、ビオチン化研究によってＳＴＥＡＰ−１の細胞表面発現について直接分析される。簡単には、ビオチン化細胞表面タンパク質を、ストレプトアビジンゲルでアフィニティー精製し、そして上記の抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体でプローブした。清浄にストレプトアビジン精製されたタンパク質のウエスタンブロットは、試験した前立腺（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５）、膀胱（ＵＭ−ＵＣ−３、ＴＣＣＳＵＰ）および結腸癌（ＬｏＶｏ、Ｃｏｌｏ）細胞、ならびにＳＴＥＡＰ−１をコードするレトロウイルスで感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞の全てにおいて内因性ＳＴＥＡＰ−１の細胞表面ビオチン化を示すが、ネガティブコントロールとして使用した発現しないＮＩＨ３Ｔ３細胞においては示さない（図７Ｂ）。さらなるネガティブコントロールにおいて、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、非ビオチン化ＳＴＥＡＰ発現細胞由来のストレプトアビジン沈殿中に検出されなかった（図７Ｂ）。
（実施例５：ＳＴＥＡＰ−１の組換え発現）
（ｐＧＥＸ構築物）
細菌細胞中でＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１の一部を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ）中にクローニングすることによって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させた。全ての構築物を、Ｎ末端に融合したＧＳＴおよびＣ末端の６個のヒスチジンエピトープを有する組換えのＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列を生じるように作製した。６個のヒスチジンエピトープタグを、ＯＲＦの３’末端でクローニングプライマーにヒスチジンコドンを付加することによって作製した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位によって、ＳＴＥＡＰ−１からのＧＳＴタグの切断を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。以下のＳＴＥＡＰ−１のフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中にクローニングした： アミノ酸１４８〜２５１；アミノ酸１４４〜３３９；アミノ酸３９〜２５３；アミノ酸７０〜１３６；アミノ酸２５４〜３１３。
そして以下のフラグメントを、ｐＧＥＸ−４Ｔ中にクローン化した：アミノ酸２〜２４７；アミノ酸１３５〜３１８；およびアミノ酸１４４〜３３９。
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の以下の領域にわたるｐＧＥＸ−６Ｐ−１中に作製し得るさらなる例示的な構築物は：アミノ酸１〜３３９；アミノ酸１〜１４４を含む。
（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物）
哺乳動物細胞にＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、１，０１７ｂｐのＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ（翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサスを有する）を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｂ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターより駆動する。この組換えタンパク質は、ｍｙｃおよびＣ末端に融合した６つのヒスチジンを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、およびエピソームのＳＶ４０複製起点にそってｍＲＮＡの安定性を増強するための転写終止配列を含み、そして単純ベクターは、ラージＴ抗原を発現する細胞株において救助（ｒｅｓｃｕｅ）される。ネオマイシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドの選択および維持を可能にする。
（ｐＳＲα構築物）
ＳＴＥＡＰ−１を構成的に発現する哺乳動物細胞株を作製するために、１，０１７ｂｐのＯＲＦ（翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサスを有する）を、ｐＳＲαにクローニングした。アンホトロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）かつエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）なレトロウイルスを、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのｐＳＲα構築物のトランスフェクション、または２９３細胞へのｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（ψ−）の同時トランスフェクションによって作製する。レトロウイルスを使用して、種々の哺乳動物細胞株を感染し得、宿主細胞株にクローニングされた遺伝子（ＳＴＥＡＰ−１）の組み込みを生じる。タンパク質発現を、長末端反復（ＬＴＲ）より駆動する。ネオマイシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドの選択および維持を可能にする。抗ＦＬＡＧ抗体を使用する検出を可能にするために、ＦＬＡＧタグをＮ末端およびＣ末端に融合したさらなるｐＳＲα構築物を作製した。ＯＲＦの３’末端でのクローニングプライマーに、ＦＬＡＧコンセンサス配列 ５’ ｇａｔ ｔａｃ ａａｇ ｇａｔ ｇａｃ ｇａｃ ｇａｔ ａａｇ ３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３４）を付加した。アミノ酸１８２〜４５４を含む別のｐＳＲα構築物を作製した。この短縮型形態のＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、長い細胞外Ｎ末端領域の機能を決定することを補助する。
さらなるｐＳＲα構築物は、全長ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のｍｙｃ／６ＨＩＳ融合タンパク質を生成するように作製されている。
（実施例６：他のヒトＳＴＥＡＰの同定および構造的分析）
ＳＴＥＡＰ−１は、公知のヒト遺伝子のいずれとも相同性を有さない。ＳＴＥＡＰ−１に相同であるさらなる遺伝子の同定の試みに際して、ＳＴＥＡＰ−１のタンパク質配列を、電子プローブとして使用して公共のＥＳＴ（発現配列タグ）データベース（ｄｂＥＳＴ）でファミリーメンバーを同定した。ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の「ｔｂｌａｓｍ機能」を使用して、ｄｂＥＳＴデータベースをＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列と問い合わせた。この分析は、以下にさらに記載されるように、さらなる潜在的ＳＴＥＡＰ−１相同物またはＳＴＥＡＰファミリーメンバーを示した。
さらに、ＳＳＨクローニング実験はまた、ＳＴＥＡＰ−１関連ｃＤＮＡフラグメントであるクローン９８Ｐ４Ｂ６を同定した。このクローンを、正常前立腺ｃＤＮＡをテスターをして使用しかつＬＡＰＣ−４ ＡＤ ｃＤＮＡをドライバーとして使用するＳＳＨクローニングより単離した。９８Ｐ４Ｂ６クローンの大きな部分配列を、引き続いて正常前立腺ライブラリーより単離した；このクローンは、ＳＴＥＡＰ−１の一次構造に密接な相同性を有する１７３アミノ酸のＯＲＦをコードし、それゆえに、ＳＴＥＡＰ−２を名付けられた。２４５４ｂｐの全長ＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡは、前立腺ライブラリーより単離された。ＳＴＥＡＰ−２ヌクレオチドおよびコードされたＯＲＦアミノ酸配列を、図９Ａ〜Ｄに示す。ＳＴＥＡＰ−１の一次構造とＳＴＥＡＰ−２の部分一次構造とのアミノ酸アラインメントを、図１１Ａ〜Ｂおよび１１Ｃに示す。ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２は、１７１アミノ酸残基重複にわたって６１％同一性を共有する（図１１Ｃ）。ＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）にプラスミド９８Ｐ４Ｂ６−ＧＴＤ３として、１９９９年７月２日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１１として寄託された。
ＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡ（９８Ｐ４Ｂ６−ＧＴＤ３）は、７２％のＧＣリッチである３５５ｂｐの５’ＵＴＲ（非翻訳領域）を含み、このことは、翻訳調節エレメントを含むことを示唆する。このｃＤＮＡは、６つの潜在的膜貫通ドメインを有する５４アミノ酸（ａ．ａ．）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。これは、３３９ａ．ａ．の長さを有するＳＴＥＡＰ−１と対照的である。ＳＴＥＡＰ−１とのアラインメントは、２３７アミノ酸重複にわたって５４．９％の同一性を示す。驚くことに、ＳＴＥＡＰ−２における６つの潜在的膜貫通ドメインの位置は、ＳＴＥＡＰ−１における膜貫通ドメインの位置と一致する（アラインメントを参照のこと）。ＳＴＥＡＰ−２とＳＴＥＡＰ−１との相同性は、第一の潜在的細胞外ループから第五の膜貫通ドメインにわたる領域において最大である。この分析およびＳＴＥＡＰ−２の配列は、ＳＴＥＡＰ−１とＳＴＥＡＰ−２との間のいくつかの顕著な差異を示唆する：ＳＴＥＡＰ−２は、２０５ａ．ａ．の長さの細胞内Ｎ末端（ＳＴＥＡＰ−１では６９ａ．ａ．）、および短い４ａ．ａ．細胞内Ｃ末端（ＳＴＥＡＰ−１では２６ａ．ａ．）を示す。これらの差異は、機能、および／または細胞内シグナル伝達経路との相互作用における顕著な差異を意味し得る。ＳＴＥＡＰ−２に対応する独特のマウスＥＳＴを同定するために、ＳＴＥＡＰ−２の独特なＮ末端を使用して、ｄｂＥＳＴデータベースを問い合わせた。１つのマウスＥＳＴを単離した（ＡＩ７４７８８６、マウス腎臓）。これは、マウスＳＴＥＡＰ−２の同定、およびマウスにおけるＳＴＥＡＰ−２の発現分析において使用し得た。
ＳＴＥＡＰ−１配列およびＳＴＥＡＰ−２配列に密接な相同性を保有するＯＲＦをコードする２つのＥＳＴをまた、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列と電子プローブすることによって同定した。これらのＥＳＴ（ＡＩ１３９６０７およびＲ８０９９１）を、暫定的にＳＴＥＡＰ−３およびＳＴＥＡＰ−４と名付けた。ＳＴＥＡＰ−３をコードする全長ｃＤＮＡを、引き続きクローニングし、そしてそのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、図１０Ａ〜Ｅに示す。ＳＴＥＡＰ−３ ｃＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）にプラスミドｐＳＴＥＡＰ−３ ＥＢＢ４として、１９９９年１２月８日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０３３として寄託された。ＳＴＥＡＰに対応するＥＳＴのヌクレオチド配列を、図１０Ｆに示す。
ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ＳＴＥＡＰ−３および推定のＳＴＥＡＰ−４の部分配列の構造のアミノ酸アラインメントを、図１１Ａ〜Ｂに示す。このアラインメントは、４つのＳＴＥＡＰファミリータンパク質全ての間の、特に、推定膜貫通ドメインの密接な構造類似性を示す。上記のように、ＳＴＥＡＰ−１とＳＴＥＡＰ−２とは、２３７アミノ酸重複にわたって５４．９％同一性を示す。ＳＴＥＡＰ−１とＳＴＥＡＰ−３とは、２６４アミノ酸領域にわたって４０．９％同一性であるが、ＳＴＥＡＰ−２とＳＴＥＡＰ−３とは、４１６アミノ酸領域にわたって４７．８％同一性である。
（実施例７：ＳＴＥＡＰ−２の組換え発現のための構築物）
（ｐＧＥＸ構築物）
細菌細胞中でＳＴＥＡＰ−２を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−２の一部を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ）中にクローニングすることによって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させた。全ての構築物を、Ｎ末端に融合したＧＳＴおよびＣ末端の６個のヒスチジンエピトープを有する組換えのＳＴＥＡＰ−２タンパク質配列を生じるように作製した。６個のヒスチジンエピトープタグを、ＯＲＦの３’末端でクローニングプライマーにヒスチジンコドンを付加することによって作製した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位によって、ＳＴＥＡＰ−２からのＧＳＴタグの切断を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。以下のＳＴＥＡＰ−２のフラグメントを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中にクローニングした： アミノ酸２８７〜３９０；アミノ酸２８５〜４５４；アミノ酸１９３〜４５４。
ＳＴＥＡＰ−２タンパク質の以下の領域にわたるｐＧＥＸ−６Ｐ−１中に作製し得るさらなる例示的な構築物は：アミノ酸１〜１９３；アミノ酸１〜４５４を含む。
以下のフラグメントを、ｐＧＥＸ−４Ｔ中にクローンニングした：アミノ酸２〜２０４；１８３〜３８７；および２７６〜４５３。
（ｐＣＲＩＩ構築物）
ＲＮＡインサイチュ研究のためのセンスおよびアンチセンスのリボプローブを作製するために、ｐＣＲＩＩ構築物を、ＧＴＤ３ ＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡの３６７〜８７７ｂｐを使用して作製した。ｐＣＲＩＩベクターは、挿入物に隣接するＳｐ６プロモーターおよびＴ７プロモーターを有し、ＲＮＡインサイチュ実験において使用されるＳＴＥＡＰ−２ ＲＮＡリボプローブの生成を駆動する。
（ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯ構築物）
哺乳動物細胞にＳＴＥＡＰ−２を発現させるために、１，３６２ｂｐのＳＴＥＡＰ−２ ＯＲＦ（翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサスを有する）を、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（ｃａｔ＃Ｋ８６４−２０、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターより駆動する。この組換えタンパク質は、ＸｐｒｅｓｓＴＭおよびＮ末端に融合した６つのヒスチジンタグを有する。１，３６２ｂｐのＯＲＦのみを含む構築物に加えて、終止コドンの前のベクター配列から生じる２８アミノ酸融合物を含む組換えタンパク質のＣ末端を有するさらなる構築物を作製した。ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯベクターはまた、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、およびエピソームのＳＶ４０複製起点にそってｍＲＮＡの安定性を増強するための転写終止配列を含み、そして単純ベクターは、ラージＴ抗原を発現する細胞株において救助（ｒｅｓｃｕｅ）される。ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドの選択および維持を可能にする。
（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物）
哺乳動物細胞にＳＴＥＡＰ−２を発現させるために、１，３６２ｂｐのＳＴＥＡＰ−２ ＯＲＦ（翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサスを有する）を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターより駆動する。この組換えタンパク質は、ｍｙｃおよびＣ末端に融合した６つのヒスチジンを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、およびエピソームのＳＶ４０複製起点にそってｍＲＮＡの安定性を増強するための転写終止配列を含み、そして単純ベクターは、ラージＴ抗原を発現する細胞株において救助（ｒｅｓｃｕｅ）される。ネオマイシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドの選択および維持を可能にする。さらなるｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物を、ＳＴＥＡＰ−２アミノ酸の６〜４５４、１２１〜４５４および１８２〜４５４を使用して作製した。
（ｐＢｌｕｅＢａｃＨＩＳ２ａ）
ＳＦ９昆虫細胞にＳＴＥＡＰ−１を発現するために、ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦを、ｐＢｌｕｅＢａｃＨＩＳ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローニングした。タンパク質発現を、ポリヘドリンプロモーターより駆動する。Ｎ末端ポリＨＩＳおよびＸｐｒｅｓｓタグは、組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質の検出および精製を可能にする。Ｃ末端エンテロキナーゼ認識部位は、これらのタグの切断を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡを用いる共トランスフェクションに続いて、相同性組換え事象がこれらの配列間で生じ、その結果、目的の遺伝子およびポリヘドリンを有する組換えベクターを生じる。簡略化サブクローニングに対する種々の制限酵素部位が存在する。さらに、レポーター遺伝子（ｂ−ガラクトシダーゼ）は、便利に組換えプラークを同定し、それによって単調なプラークスクリーニングを容易にする。
（ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物）
哺乳動物細胞にＳＴＥＡＰ−２を発現させかつ蛍光を使用して組換えタンパク質の検出を可能にするために、１，３６２ｂｐ ＯＲＦ（翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサスを有する）を、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）にクローニングした。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターより駆動する。この組換えタンパク質は、非侵潤、インビボ検出および細胞生物学研究を容易にする、Ｃ末端に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、およびエピソームのＳＶ４０複製起点にそってｍＲＮＡの安定性を増強するための転写終止配列を含み、そして単純ベクターは、ラージＴ抗原を発現する細胞株において救助（ｒｅｓｃｕｅ）される。ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドの選択および維持を可能にする。
Ｎ末端ＧＦＰ融合物を有するさらなる構築物は、ＳＴＥＡＰ−２タンパク質の全長にわたってｐｃＤＮＡ３．１ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ中に作製されている。
（ｐＳＲα構築物）
ＳＴＥＡＰ−２を構成的に発現する哺乳動物細胞株を作製するために、１，３６２ｂｐのＯＲＦ（翻訳開始Ｋｏｚａｋコンセンサスを有する）を、ｐＳＲαにクローニングした。アンホトロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）かつエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）なレトロウイルスを、それぞれ２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのｐＳＲα構築物のトランスフェクション、または２９３細胞へのｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（ψ−）の同時トランスフェクションによって作製する。レトロウイルスを使用して、種々の哺乳動物細胞株を感染し得、宿主細胞株にクローニングされた遺伝子（ＳＴＥＡＰ−２）の組み込みを生じる。タンパク質発現を、長末端反復（ＬＴＲ）より駆動する。ネオマイシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドの選択および維持を可能にする。抗ＦＬＡＧ抗体を使用する検出を可能にするために、ＦＬＡＧタグをＮ末端およびＣ末端に融合したさらなるｐＳＲα構築物を作製した。ＯＲＦの３’末端でのクローニングプライマーに、ＦＬＡＧコンセンサス配列 ５’ ｇａｔ ｔａｃ ａａｇ ｇａｔ ｇａｃ ｇａｃ ｇａｔ ａａｇ ３’（配列番号３４）を付加した。アミノ酸１８２〜４５４を含む別のｐＳＲα構築物を作製した。この短縮型形態のＳＴＥＡＰ−２タンパク質は、長い細胞外Ｎ末端領域の機能を決定することを補助する。
さらなるｐＳＲα構築物は、全長ＳＴＥＡＰ−２タンパク質のｍｙｃ／６ＨＩＳ融合タンパク質を生成するように作製されている。
（実施例８：ＳＴＥＡＰ−２および他のヒトＳＴＥＡＰファミリーメンバーの発現分析）
（実施例８Ａ：正常ヒト組織におけるＳＴＥＡＰファミリーメンバーの組織特異的発現）
ＳＴＥＡＰ−２のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＬＡＰＣ前立腺癌異種移植片の全てにおける発現を示す（図１４、パネルＡ）。８つの正常ヒト組織の分析は、２５サイクルの増幅の後に前立腺特異的発現を示す（図１４、パネルＢ）。他の組織における低いレベルの発現は、３０サイクルの増幅の後にのみ検出された。ＳＴＥＡＰ−２についてのノーザンブロットは、前立腺にのみ発現した（およびＬＡＰＣ異種移植片における顕著に低いレベル）２つの転写物（約３ｋｂおよび８ｋｂのサイズ）のパターンを示し、他の１５の正常ヒト組織のいずれにも検出可能な発現はなかった（図１５、パネルＣ）。従って、正常ヒト組織におけるＳＴＥＡＰ−２発現は、高度に前立腺特異的であるようだ。
正常組織におけるＳＴＥＡＰファミリーメンバーの発現分析を、ノーザンブロットおよび／またはＲＴ−ＰＣＲによって実施した。ＳＴＥＡＰファミリーメンバーの全ては、組織制限発現パターンを示すようである。ＳＴＥＡＰ−３／ＡＩ１３９６０７発現を、図１２Ａ（ノーザン）および図１２Ｂ（ＲＴ−ＰＣＲ）に示す。ＳＴＥＡＰ−４／Ｒ８０９９１発現を、図１３に示す。
（実施例８Ｂ：種々の癌細胞株におけるＳＴＥＡＰ−２の発現）
上記のＲＴ−ＰＣＲの結果は、異なるＳＴＥＡＰファミリーメンバーが異なる組織発現パターンを示すことを示唆した。興味深いことに、前立腺に非常に特異的であるＳＴＥＡＰ−２は、正常前立腺組織および異常の前立腺組織の両方において高度に発現するＳＴＥＡＰ−１と対照的である。
（ＳＴＥＡＰ−１に比べた）ＳＴＥＡＰ−２前立腺癌発現プロファイルにおけるこの示唆された差異をよりよく特徴付けるために、ＬＡＰＣ異種移植片、ならびにいくつかの前立腺および他の癌細胞株由来のＲＮＡに対して、ＳＴＥＡＰ−２特異的プローブ（ｃＤＮＡクローン９８Ｐ４Ｂ６と標識された）を使用してノーザンブロッティングを実施した。これらの結果を、図１６に示し、以下のように概要し得る。ＳＴＥＡＰ−２は、正常前立腺、ならびにいくつかの前立腺異種移植片および細胞株に高度に発現する。より特定には、非常に強度の発現を、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ異種移植片およびＬＮＣａＰ細胞において観察した。顕著に減弱した発現または発現なしを、他の前立腺癌異種移植片および細胞株において観察した。非常に強度の発現をまた、Ｅｗｉｎｇ Ｓａｒｃｏｍａ細胞株ＲＤ−ＥＳにおいて明らかであった。膀胱、結腸、脾臓および卵巣の腫瘍由来の癌細胞株において高度に発現するＳＴＥＡＰ−１とは異なって、ＳＴＥＡＰ−２は、これらの同一の細胞株において低い〜検出可能でない発現を示した（図５と比較して）。驚くことに、ＳＴＥＡＰ−２はまた、前立腺の正常基底細胞区画の例示であるＰｒＥＣ細胞において検出可能でない。これらの結果は、ＳＴＥＡＰ−１の発現とＳＴＥＡＰ−２の発現とが差示的に調節されることを示唆する。ＳＴＥＡＰ−１は癌において一般にアップレギュレートされる遺伝子であり得るが、ＳＴＥＡＰ−２は、正常前立腺および前立腺癌により限定される遺伝子であり得る。
（実施例８Ｃ：正常前立腺および前立腺癌におけるＳＴＥＡＰ−２ ＲＮＡのインサイチュ発現の分析）
ＳＴＥＡＰ−２ ＲＮＡの発現を、標識したアンチセンスプローブでのインサイチュハイブリダイゼーションを使用して、そしてコントロールとして標識したセンスプローブを使用して評価した。試験した４つの正常前立腺組織標本の４つ全ては、ＳＴＥＡＰについてポジティブであった（図２２Ａ〜Ｂ）。同様に、５つの前立腺癌組織標本の５つは、ＳＴＥＡＰ ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを使用してポジティブであった（図２３Ａ〜Ｂ）。試験したＬＮＣａＰ細胞のＰＩＮ標本およびサンプルは、同様にポジティブであった。
（実施例８Ｄ：癌組織におけるＳＴＥＡＰ−２発現の分析）
種々の癌組織におけるＳＴＥＡＰ−２の発現を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して試験した。これらの結果を、図２４に示す。ここで、レーン１は、ＬＡＰＣ４ ＡＤ異種移植片由来のサンプルを示す；レーン２は、ＬＡＰＣ９ ＡＤ異種移植片である；レーン３は、ＬＡＰＣ９ ＡＤ２異種移植片である（ヒト骨移植片とともに増殖した）；レーン４は、ＬＡＰＣ９ ＡＤ ＩＴである（脛骨内で増殖した）；レーン５は、結腸癌患者由来のプールした組織である；レーン６は、肺癌患者由来のプールした組織である；レーン７は、患者の正常前立腺組織である；レーン８は、患者の前立腺癌組織である；レーン９は、腎癌患者由来のプールした組織である；レーン１０は、膀胱癌患者由来のプールした組織である；レーン１１は、Ｈｅｌａ細胞である；レーン１２は、水ブランクである。最高の発現を、３つのＬＡＰＣ９ ＡＤ異種移植片において見出す。高発現を、ＬＡＰＣ４ ＡＤ異種移植片、ならびに正常前立腺および肺癌において同様に観察する。顕著な発現をまた、結腸癌および膀胱がんにおいて検出した。低い発現を、前立腺癌および腎癌の患者サンプルにおいて検出した。
（実施例８Ｅ：正常組織におけるＳＴＥＡＰ−２発現の分析）
７６の正常組織におけるＳＴＥＡＰ−２の発現を、ＲＮＡサンプルのドットブロット分析を使用して試験した。図２５に示すように、ＳＴＥＡＰ−２は、正常前立腺においてのみ非常に高いレベルで発現される。
（実施例９：ＳＴＥＡＰ遺伝子の染色体上配置）
ＳＴＥＡＰ−１の染色体上配置を、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ Ｈｕｍａｎ／Ｈａｍｓｔｅｒ放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：２２）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ Ａｌ）を使用して決定したが、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ相同物を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３放射線ハイブリッドパネル（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４２２）を使用してマッピングした。
以下のＰＣＲプライマーをＳＴＥＡＰ−１について使用した：

９３の放射線ハイブリッドパネルＤＮＡについて生じたＳＴＥＡＰ−１マッピングベクター
および、<ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ>のインターネットアドレスで利用可能なマッピングプログラムは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子を染色体７ｐ２２．３、テロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）Ｄ７Ｓ５３１に位置付けた。
以下のＰＣＲプライマーを９８Ｐ４Ｂ６／ＳＴＥＡＰ−２について使用した：
生じたマッピングベクター
および、<ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒｆｏｒｍｎｅｗ．ｈｔｍｌ>のインターネットアドレスで利用可能なマッピングプログラムは、９８Ｐ４Ｂ６（ＳＴＥＡＰ−２）遺伝子を染色体７ｑ２１に位置付けた。
以下のＰＣＲプライマーをＡＩ１３９６０７について使用した：
生じたマッピングベクター
および、<ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒｆｏｒｍｎｅｗ．ｈｔｍｌ>のインターネットアドレスで利用可能なマッピングプログラムは、ＡＩ１３９６０７遺伝子を染色体７ｑ２１に位置付けた。
以下のＰＣＲプライマーをＲ８０９９１について使用した：
生じたマッピングベクター
および、<ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒｆｏｒｍｎｅｗ．ｈｔｍｌ>のインターネットアドレスで利用可能なマッピングプログラムは、Ｒ８０９９１遺伝子を染色体２ｑ１４〜ｑ２１（Ｄ２Ｓ２５９１の近く）に位置付けた。
要約すると、上記の結果は、推定のヒトＳＴＥＡＰファミリーメンバーの３つが７番染色体に位置することを示し、このことは、図１７に例示的に示される。特に、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子は、７番染色体の短腕のテロメア領域に７ｐ２２．３で位置したが、ＳＴＥＡＰ−２およびＡＩ１３９６０７は、７番染色体の長腕に７ｑ２１で位置した（図１７）。Ｒ８０９９１は、染色体２ｑ１４〜ｑ２１にマッピングされる。
（実施例１０：ＳＴＥＡＰ−１のイントロン−エキソンの同定）
ＳＴＥＡＰ−１についてのゲノムクローンを、ＳＴＥＡＰ−１配列を含むＢＡＣクローンについてのＧｅｎＢａｎｋ検索によって同定し、アクセッション番号ＡＣ００４９６９（ＰＡＣ ＤＪ１１２１Ｅ１０）およびＡＣ００５０５３（ＢＡＣ ＲＧ０４１Ｄ１１）を同定した。ＳＴＥＡＰについてのＰＡＣクローンおよびＢＡＣクローン由来のこれらの配列を使用して、イントロン−エキソン協会を規定した（図１８）。ＳＴＥＡＰ遺伝子のコード領域内に、合計４つのエキソンと３つのイントロンとを同定した。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の正確なエキソン−イントロン構造の知識は、イントロン配列内にプライマーを設計するために使用され得、同様に、エキソンのゲノム増幅のために使用され得る。このような増幅は、一本鎖コンフォメーションの多型（ＳＳＣＰ）分析によって癌関連多型についての検索することを可能にする。変異エキソンまたは多型エキソンは配列決定され得、そして、野生型ＳＴＥＡＰと比較され得る。このような分析は、攻撃的な前立腺癌、ならびに他の型の癌（特に結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌および精巣癌）に対してより感受性である患者を同定するために有用である。
サザンブロット分析は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子がマウスを含むいくつかの種において存在することを示す（図１９）。従って、マウスＢＡＣライブラリー（Ｍｏｕｓｅ ＥＳ １２９−Ｖ ｒｅｌｅａｓｅ Ｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＲＡＣ−４４３１）を、ＳＴＥＡＰ−１についてのヒトｃＤＮＡ（クローン１０、実施例２）でスクリーニングした。１つのポジティブクローンである１２Ｐ１１を、同定し、そしてサザンブロットによって確認した（図２０）。ヒトＳＴＥＡＰに関するイントロン−エキソン境界情報を使用して、マウスＳＴＥＡＰ−１コード配列を同定し得る。
マウスＳＴＥＡＰ−１ゲノムクローンを使用して、発生中および腫瘍形成中のＳＴＥＡＰ−１の生物学的役割を研究し得る。特に、マウスゲノムＳＴＥＡＰ−１クローンを、当該分野において一般に公知の方法を使用してマウスの遺伝子の標的した破壊を行うための遺伝子ノックアウト（Ｋ／Ｏ）ベクターに挿入し得る。さらに、代謝過程および上皮機能におけるＳＴＥＡＰの役割を、解明し得る。このようなＫ／Ｏマウスを、他の前立腺癌マウスモデル（例えば、ＴＲＡＭＰモデル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５、ＰＮＡＳ ９２：３４３９））と交配させて、多かれ少なかれ攻撃的および転移性の前立腺癌の発生および進行に影響するか否かを決定し得る。
（実施例１１：ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の推定ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド）
ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２タンパク質の完全アミノ酸配列を、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において見出されるＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力した。このＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子（そして特に、ＨＬＡ−Ａ２）の溝（ｇｒｏｏｖｅ）の特定のペプチド配列の結合に基づいて、Ｋｅｎ Ｐａｒｋｅｒ博士によって開発された（Ｆａｌｋら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−６；Ｈｕｎｔら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３；Ｐａｒｋｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７；Ｐａｒｋｅｒら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２．１６３−７５）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２ならびに他のＨＬＡクラスＩ分子に対して推定される結合についての完全タンパク質配列からの８マー、９マー、および１０マーのペプチドの位置付けおよび順位付けを可能にする。大半のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドは、９マーであり、これは優先的に、２位にロイシン（Ｌ）および９位にバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含む。
ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の推定結合ペプチドの結果を、下記の表２に示す。両方のタンパク質について、上位５つに順位付けされる候補を、その位置、各特異的ペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアと共に示す。この結合スコアは、ｐＨ６．５で３７℃での、ペプチドを含む複合体の解離に関する推定半減期に対応する。最高結合スコアを有するペプチド（すなわち、ＳＴＥＡＰ−１ペプチド１６５についての１０７７６．４７０；ＳＴＥＡＰ−２ペプチド２２７についての１７８９．６１２）が、細胞表面上のＨＬＡクラスＩに最も緊密に結合すると予測された。従って、これらは、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原性標的を表す。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、最終的には、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ−Ａ２発現の安定性によって評価され得る（参考文献５，６）。特異的ペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によって、インビトロで評価され得る（Ｘｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら、１９９８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−３８）。

（実施例１２：細胞性タンパク質のチロシンリン酸化のＳＴＥＡＰ−２誘導）
多重膜貫通タンパク質（ｍｕｌｔｉ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、膜からシグナルを伝達し、そして種々の下流の事象（遺伝子発現、細胞の分化、移動および増殖を含む）を調節するシグナル伝達カスケードを開始する能力を有する（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９７、１３４８：５６−６２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５；６９：６７５−８３）。下流のシグナル伝達事象におけるＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の関与を決定するために、ＰＣ３細胞のチロシンリン酸化に対するＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の効果を研究した（図２６）。ｎｅｏ、ＳＴＥＡＰ−１またはＳＴＥＡＰ−２を安定して発現するＰＣ３細胞を、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中において一晩増殖させて、レセプター占拠率およびバックグラウンド活性を低下させた。次いで、これらの細胞を、１％または１０％のいずれかのＦＢＳの存在下で５分間インキュベートし、溶解し、そして抗ホスホチロシン（４Ｇ１０ ｍＡｂ）を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。抗Ｇｒｂ２ Ａｂを使用する重壘を、ゲルが等しくロードされたことを示すために使用した。
この結果（図２６）は、ＰＣ３細胞中のＳＴＥＡＰ−２発現が、チロシン残基において、いくつかのタンパク質（ｐ１５０、ｐ１２０、およびｐ７５を含む）のリン酸化を誘導することを示している。対照的に、ＳＴＥＡＰ−１の発現は、ｐ１５０の脱リン酸化を誘導した。いくつかのリン酸化タンパク質は、既知のシグナル伝達タンパク質に対応する。このことは、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２が、特定のシグナル伝達カスケードの活性化を制御し得ることを示す。
（実施例１３：ＭＡＰＫカスケードのＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２媒介性活性化）
いくつかの多重膜貫通タンパク質は、タンパク質キナーゼカスケード（ＭＡＰＫ経路を含む）を活性化することによって、特定の生物学的応答を誘導する（Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００．７：９１１−４３，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０００；６７：３３５−６，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：４６６０−９）。ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の発現が、特定のシグナル伝達経路を調節するに十分である否か、さもなくば、ＰＣ３細胞を休止させるにおいて十分であるか否かを決定するために、ｐ３８ＭＡＰＫカスケードの活性化に対するこれらの遺伝子の効果を、前立腺癌細胞株ＰＣ３において研究した（図２７Ａ〜Ｂ）。ｐ３８キナーゼの活性化は、チロシンおよびセリン残基におけるそのリン酸化に依存する。リン酸化されたｐ３８は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８ ｍＡｂによって、非リン酸化状態から区別され得る。このリン酸特異的Ａｂを使用して、操作されたＰＣ３細胞株におけるｐ３８のリン酸化状態を研究した。
ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、またはｎｅｏを安定して発現するＰＣ３細胞を、１％または１０％のいずれかのＦＢＳ中において一晩増殖させた。全細胞溶解産物を、ウェスタンブロッティングによって分析した。既知のｐ３８活性化因子（ＮａＳａＩまたはＴＮＦ）で処理されたＰＣ３細胞を、ポジティブコントロールとして使用した。この結果によって、コントロールｎｅｏ遺伝子の発現は、ｐ３８リン酸化に対してなんら効果を有さないが、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の発現は、ｐ３８経路の活性化を誘導するに十分であることが示されている（図２７Ａ）。この結果は、抗ｐ３８ Ａｂを使用するウェスタンブロッティングによって確認された。このウェスタンブロッティングは、ゲルにおける等しいタンパク質ローディングを示している（図２７Ｂ）。
別の実験セットでは、マイトジェン性ＭＡＰＫ経路（すなわち、ＥＲＫカスケード）を活性化するための、前立腺癌細胞株ＰＣ３中におけるＳＴＥＡＰ−１またはＳＴＥＡＰ−２の発現の十分性を決定した（図２８Ａ〜Ｂ）。ＥＲＫの活性化は、チロシンおよびセリン残基におけるそのリン酸化に依存する。リン酸化されたＥＲＫは、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ ｍＡｂによって、非リン酸化状態から区別され得る。このリン酸特異的Ａｂを使用して、操作されたＰＣ３細胞株におけるＥＲＫのリン酸化状態を研究した。Ｒａｓの活性化形態を発現するＰＣ３細胞を、ポジティブコントロールとして使用した。
この結果によって、コントロールｎｅｏ遺伝子の発現は、ＥＲＫリン酸化に対してなんら効果を有さないが、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−２の発現は、ＥＲＫリン酸化における少なくとも３倍の増加を誘導するに十分であることが示されている（図２８Ａ）。ＳＴＥＡＰ−１の発現はまた、１％ＰＢＳ中で増殖されたＰＣ３細胞において、幾分かのＥＲＫリン酸化を誘導した。これらの結果は、抗ＥＲＫウェスタンブロッティングを使用して確認され（図２８Ａ）、そしてＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２によるＥＲＫ経路の活性化を確認している。
ＦＢＳは、レセプター媒介性のＥＲＫ活性化に寄与し得るいくつかの成分を含むので、本発明者らは、低レベルおよび最適レベルのＦＢＳ中でのＳＴＥＡＰ−１の効果を試験した。ｎｅｏまたはＳＴＥＡＰ−１を発現するＰＣ３細胞を、０．１％または１０％のいずれかのＦＢＳ中で一晩増殖させた。これらの細胞を、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫウェスタンブロッティングによって分析した。この実験によって、ＳＴＥＡＰ−１が、０．１％ＦＢＳ中においてＥＲＫのリン酸化を誘導することが示され、そしてＳＴＥＡＰ−１の発現が、さらなる刺激物の非存在下でＥＲＫシグナル伝達カスケードの活性化を誘導するに十分であることを確認している。
（実施例１４：ＳＴＥＡＰ−１のリガンド媒介性活性化）
いくつかの因子が、多重膜貫通タンパク質を活性化し、そして下流のシグナル伝達事象（イオン、ロイコトリエン、リゾホスファチド酸などを含む）を媒介することが示されている（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９９；３０：２１３−４２）。多重膜貫通タンパク質を活性化することが公知の化合物の一群は、臭気物質である（Ｎｅｕｒｏｎ ２０００；２５：５０３−４）。本実施例では、３つのクラスの臭気物質を、ＰＣ３細胞においてチロシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の活性化を誘導する能力についてスクリーニングした（図２９）。
ｎｅｏまたはＳＴＥＡＰ−１を安定して発現するＰＣ３細胞を、０．１％ＦＢＳ中において一晩増殖させて、レセプター占拠を可能にした。次いで、この細胞を、示される濃度（０．１〜１０μＭ）のシトラルバ（ｃｉｔｒａｌｖａ）、エチルバニリンまたはＩＢＭＰを用いて５分間処理した。１０％ＦＢＳでの処理を、コントロールとして使用した。異なる処理条件から生成された全細胞溶解産物（２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして抗ホスホチロシンウェスタンブロッティングによって分析した。
この実験によって、３つすべてのクラスの臭気物質が、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞において幾分かのチロシンリン酸化を誘導するが、ＩＢＭＰのみが、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子を発現しないＰＣ３−ｎｅｏ細胞のリン酸化に対して測定可能な効果を有していたことが示された。さらに、シトラルバおよびエチルバニリンは両方とも、ＳＴＥＡＰ−１特異的様式で、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞においてｐ１３６−１４０およびｐ２００−２１０のリン酸化の増加を誘導した。さらに、シトラルバは、１６０−２００ｋＤａのタンパク質のデノボでのリン酸化を誘導した。この結果は、ＳＴＥＡＰ−１が、臭気物質処理細胞においてチロシンキナーゼ経路の活性化を媒介していることを実証している。
シトラルバが、ＳＴＥＡＰ−１媒介様式で、タンパク質のチロシンリン酸化を誘導したという知見は、ＳＴＥＡＰ−１が１以上のシグナル伝達カスケードの活性化を開始し得ることを示唆する。ＳＴＥＡＰ−１の臭気物質活性化に関連した潜在的なシグナル伝達カスケードを同定するために、ＭＡＰＫカスケードの活性化に対する臭気物質の効果を、ＰＣ３細胞において研究した（図３０）。ｎｅｏまたはＳＴＥＡＰ−１のいずれかを安定して発現するＰＣ３細胞を、０．１％ＦＢＳ中で一晩増殖させた。次いで、細胞を、５分間シトラルバを用いて処理した。１０％ＦＢＳでの処理をコントロールとして使用した。リン酸特異的ｍＡｂ（抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ）を使用して観察されたように、シトラルバは、ＳＴＥＡＰ−２特異的様式で、ＥＲＫ経路を活性化した。これらの結果はまた、ＳＴＥＡＰ−１単独の発現が、ＥＲＫ経路の活性化を誘導するに十分であるという図２７〜２８に記載の知見と確認している。
（実施例１５：潜在的シグナル伝達経路の同定）
ＳＴＥＡＰが、細胞中において既知のシグナル伝達経路を直接的または間接的に活性化することを確認するため、そしてＳＴＥＡＰが媒介する下流事象を描写するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に基づいた転写レポーターアッセイを、ＳＴＥＡＰを発現する細胞において実施する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する既知の転写因子に対してコンセンサスな結合部位を含む。レポーター、およびこれらの関連した転写因子の例、シグナル伝達経路、ならびに活性化刺激物を、以下に列挙する： １．ＮＦｋＢ−ｌｕｃ，ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス ２．ＳＲＥ−ｌｕｃ，ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化 ３．ＡＰ−１−ｌｕｃ，ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス ４．ＡＲＥ−ｌｕｃ，アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス ５．ｐ５３−ｌｕｃ，ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス ６．ＣＲＥ−ｌｕｃ，ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス。
ＳＴＥＡＰ媒介性効果を、ｍＲＮＡ発現を示す細胞においてアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介性トランスフェクションによって導入し得る（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）。ルシフェラーゼ活性（相対的転写活性の指標）を、ルシフェリン基質を伴う細胞抽出物のインキュベーションによって測定し、そして反応の発光を、照度計においてモニターする。
（実施例１６：ＳＴＥＡＰ機能のインビトロアッセイ）
前立腺癌におけるＳＴＥＡＰの発現プロフィールは、腫瘍の開始、進行および／または維持における機能的役割を示唆する。ＳＴＥＡＰ機能を、インビトロアプローチを使用して、哺乳動物細胞中において評価し得る。哺乳動物発現のために、ＳＴＥＡＰを、多数の適切なベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−タグおよびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら，１９９１，ＭＣＢ １１：１７８５）を含む）中にクローニングし得る。このような発現ベクターを使用して、ＳＴＥＡＰを、いくつかの癌細胞株（例えば、ＰＣ−３、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、および２９３Ｔを含む）において発現させ得る。ＳＴＥＡＰの発現を、抗ＳＴＥＡＰ抗体を使用してモニターし得る。
ＳＴＥＡＰを発現する哺乳動物細胞株を、インビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて試験し得る（組織培養における細胞増殖、アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウスにおける原発性腫瘍および転移腫瘍の形成、ならびに膜侵襲（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ）培養システム（ＭＩＣＳ：Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：４４９−４５７）を使用するインビトロでの侵襲を含む）。ＳＴＥＡＰ細胞表現型を、ＳＴＥＡＰの発現を欠く細胞の表現型と比較する。さらに、外因的に添加されたＳＴＥＡＰタンパク質を伴ってまたは伴わずに処理された細胞を、増殖パラメーターの改変について分析し得る。
ＳＴＥＡＰを発現する細胞株はまた、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）コーティングされた多孔性膜チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通した細胞の通過を測定することによって、侵襲性および移動特性の改変についてアッセイされ得る。膜を通した反対側への細胞の通過は、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）−Ａｍ（Ｍｏｌｅｒｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をロードした指標細胞を用いる蛍光アッセイを使用して、モニターされる（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃４２８）。分析された細胞株は、親細胞ならびにＳＴＥＡＰを過剰発現するＰＣ３、３Ｔ３およびＬＮＣａＰ細胞を含む。ＳＴＥＡＰが、化学誘引物質特性を有するか否かをアッセイするために、コントロール培地と比較したＳＴＥＡＰ馴化培地の勾配に対する多孔性膜を通した通過について、親の指標細胞をモニターする。このアッセイはまた、癌治療組成物の候補によるＳＴＥＡＰ誘導効果の特異的中和を定性および定量するためにもまた使用され得る。
前立腺癌細胞および他の癌細胞または正常細胞において発現される細胞性タンパク質に対してＳＴＥＡＰが結合するか否かを確証するために、２つのアプローチを採択し得る。第一のアプローチでは、種々の細胞株への組換えＨＩＳ−タグ化ＳＴＥＡＰ結合についてのインビトロアッセイが使用される。別のアプローチでは、組換えアルカリホスファターゼ−ＳＴＥＡＰ融合タンパク質が、ＧｅｎＨｕｎｔｅｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡＰ−ＴＡＧシステム（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，カタログ番号Ｑ２０２）を使用して生成され、そしてこのＡＰ−ＴＡＧ融合物を使用して、記載のような種々の前立腺癌細胞株へのＳＴＥＡＰ結合を試験する（ＣｈｅｎｇおよびＦｌａｎａｇａｎ，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：１５７−１６８）。細胞を洗浄し、そしてＡＰ基質であるＢＣＩＰ（これは、脱リン酸化に際して、不溶性の青色沈殿を形成する）を添加した後、光学顕微鏡下で青色に染色されている細胞を同定することによって、ＳＴＥＡＰ結合を決定する。
種々の癌細胞株（種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ，ＰＣ−３，ＤＵ１４５，ＴＳＵＰＲ，ＩＡＰＣ４）を含むが、これに限定されない）が試験され得る。他の細胞株（例えば、ＰＲＥＣ前立腺細胞株，２９３Ｔ，ＰＩＮ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３などのような）もまた試験され得る。さらに、ＬＡＰＣおよび他の前立腺癌異種移植片が試験され得る。平衡状態の解離速度定数が、結合相互作用の強度を評価するために算出され得る。さらに、１細胞あたりの細胞表面レセプターの数が決定され得る。ＳＴＥＡＰに対する最高の結合能力を有する細胞株または組織が、ＳＴＥＡＰ結合パートナーをクローニングするために好ましい。
別の機能的アッセイでは、ＳＴＥＡＰを安定して発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞が、軟寒天においてコロニーを形成するその能力について分析され得る。これらの実験では、このような手順に使用される細胞（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）をトランスフェクトして、ＳＴＥＡＰもしくはｎｅｏまたは活性化Ｒａｓ（それぞれ、試験遺伝子、ネガティブコントロール、およびポジティブコントロールとして）を安定して発現させ、ＳＴＥＡＰの形質転換能力を評価し得る。代表的な実験は、二連で実施され、そしてこのアッセイは、細胞プレーティングの約４週間後に評価される。ＳＴＥＡＰが、ネガティブコントロール（例えば、ｎｅｏ）と比較して、コロニー形成における増加を誘導することが実験観察によって実証された場合には、このような結果は、ＳＴＥＡＰが、顕著な形質転換能力を有することを示す。
（実施例１７：ＳＴＥＡＰ腫瘍増殖の促進についてのインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対するＳＴＥＡＰタンパク質の効果は、腫瘍保有マウスにおける遺伝子過剰発現によって、インビボで評価され得る。例えば、ＳＣＩＤマウスに、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたはＳＴＥＡＰを含む１×１０６個の前立腺細胞株を、各フラスコにおいて皮下的に注射し得る。少なくとも２つのストラテジーが、使用され得る：（１）ＬＴＲプロモーターの調節下での構成的なＳＴＥＡＰ発現、および（２）誘導可能なベクター系（例えば、エクジソン、ｔｅｔなど）の制御下での調節発現。次いで、腫瘍体積を、触知可能な腫瘍の出現でモニターし、そしてＳＴＥＡＰ発現細胞が、より高速で増殖するか否かを決定するために経時的に追跡した。さらに、マウスに、１×１０５個の同一細胞を同所的に移植して、ＳＴＥＡＰが、標的組織（すなわち、前立腺）における局所的増殖に対する効果、またはその細胞が、転移（特に、肺、リンパ節、肝臓、骨髄などに）する能力に対する効果を有するか否かを決定し得る。骨腫瘍形成および増殖に対するＳＴＥＡＰの効果は、実施例１に記載のように、脛骨内（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌｌｙ）に前立腺腫瘍細胞を注射することによって評価され得る。
これらのアッセイはまた、治療用組成物候補（例えば、ＳＴＥＡＰ抗体、ＳＴＥＡＰアンチセンス分子、およびリボザイムなど）のＳＴＥＡＰ阻害性効果を決定するために有用である。
（実施例１８：抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体を使用する、マウスおよびヒトにおける前立腺癌転移の検出）
（マウス）
ＳＴＥＡＰ−１免疫組織化学的分析を、４μｇの同所性ＬＡＰＣ−９前立腺癌腫瘍を保有するマウス由来のホルマリン固定組織、ならびにそれに由来する肺およびリンパ節転移物において実施した。連続性の肺切片を、抗ＳＴＥＡＰ−１ヒツジポリクローナル抗体および抗ＰＳＡウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用して試験した。染色された組織の顕微鏡試験を使用して、ＬＡＰＣ−９前立腺癌細胞を検出した。これらの結果を、図３１Ａ〜Ｆに示す。
抗ＳＴＥＡＰ−１ヒツジｐＡｂは、マウス前立腺（図３１Ａ）、ならびにリンパ節（図３１Ｂ）および肺（図３１Ｃ〜Ｄ）への転移物において、ヒト前立腺癌細胞を容易に検出した。肺への小さな（図３１Ｃ）および大きな（図３１Ｄ）微小転移の両方が、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｐＡｂを使用して容易に検出された。肺での転移が、前立腺癌起源であることを確認するために、連続性の肺切片に対する免疫組織化学を、抗ＰＳＡ ｐＡｂを使用して実施した（図３１Ｅ〜Ｆ）。抗ＳＴＥＡＰ−１ ｐＡｂを用いて観察された強力な細胞表面染色は、抗ＰＳＡポリクローナル抗体の使用と比較して、微小転移の容易な検出を可能にする。
（ヒト）
ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナルＡｂを、ヒト患者由来の転移性前立腺癌標本の類似の免疫組織化学的アッセイにおいて使用した。ＳＴＥＡＰ−１の高い発現が、研究されたリンパ節および骨の両方の転移において検出された。図３２Ａ（リンパ節転移）および３２Ｂ（骨転移）において示されるように、強力な細胞周囲染色が、これらのヒト患者サンプルにおいて観察された。このことは、ＳＴＥＡＰ−１が、転移性前立腺癌の検出のために優れたマーカーであることを確認する。
（実施例１９：ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、およびＳＴＥＡＰ−３細胞外ループ−Ｆｃ融合構築物）
哺乳動物細胞株の馴化培地中にＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−３の細胞外ループを発現および分泌させるために、これらの遺伝子のフラグメントを、ｐＦｃベクター中にクローニングして、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣ末端融合物を生成し得る。ｐＦｃベクターは、５’ ｃｃｔｃｇａｃｃｔｃｃａａｃａｃｃｇｇｇｇ ３’（配列番号４７）によってコードされるＩｇＡプロテアーゼ切断部位（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１４６１２６５）を先行させて、ヒト免疫グロブリンＧ１であるＦｃ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７０４２１の塩基７４〜７６８）を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを使用してｐＴａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）中にクローニングすることによって生成された。この構築物は、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−３の細胞外領域のＣ末端にＩｇＧ Ｆｃ融合物を生成するが、Ｎ末端にＩｇＧＫシグナル配列を融合している。
生じる組換えタンパク質を、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地中への分泌について最適化し、そしてこれを使用して、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、およびＳＴＥＡＰ−３タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定し得る。これらのタンパク質融合物はまた、抗体を産生するための免疫原として使用され得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターに由来する。Ｚｅｏｓｉｎ耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選別を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選別を可能にする。
ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２およびＳＴＥＡＰ−３タンパク質の以下の細胞来ループが、ｐＦｃ中へのクローニングのために適切である。
（実施例２０：ＳＴＥＡＰ−２に対するポリクローナル抗体の産生）
３つの免疫原を使用して、ＳＴＥＡＰ−２に対して特異的な抗体を産生した。２つの免疫原は、ＳＴＥＡＰ−２タンパク質配列のアミノ酸１５３〜１６５（ＡＬＱＬＧＰＫＤＡＳＲＱＶ；配列番号４５）およびアミノ酸３４５〜３５８（ＩＥＮＳＷＮＥＥＥＶＷＲＩＥ；配列番号４６）をコードするペプチドであった。第一のペプチド残基は、ＳＴＥＡＰ−２のＮ末端に存在する（これは膜トポロジー予測プログラムＳＯＳＵＩを使用すると、細胞内である）。後者のペプチド残基は、膜貫通ドメイン３と４との間の領域に存在し、そしてこの領域は、３つの細胞外ループの第二をコードすることが予測されている。第三の免疫原は、ＳＴＥＡＰ−２タンパク質配列のアミノ酸２〜２０４を含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質であった。この組換えＧＳＴ−ＳＴＥＡＰ−２融合タンパク質は、グルタチオン−セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）アフィニティクロマトグラフィーによって、誘導された細菌から精製された。
上記の抗原に加えて、ＳＴＥＡＰ−２タンパク質の他の領域をコードするペプチド、ＳＴＥＡＰ−２タンパク質の全長配列または部分配列のいずれかをコードする細菌産生タンパク質およびバキュロウイルス産生タンパク質を使用して、種々のＳＴＥＡＰ−２特異的抗体を産生した。これらの抗体は、ＳＴＥＡＰ−２機能を調節し得る領域に対して指向している。
（ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）の産生）
ＳＴＥＡＰ−２に対するｐＡｂの産生のために、精製されたＧＳＴ−融合タンパク質およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化されたペプチドを使用して、以下のように個々のウサギに免疫した。ウサギに、完全フロイントアジュバントに混合された、２００μｇの融合タンパク質またはＫＬＨ−ペプチド抗原を用いて免疫した。次いで、これらのウサギに、２週間毎に、不完全フロイントアジュバント中の２００μｇの免疫原を用いて注射した。試験採血を、各免疫から約７〜１０日後に行った。ペプチド１５３〜１６５抗血清の力価は、個々の免疫原に対するＥＬＩＳＡによって決定された場合に、少なくとも２５，０００であり、そしてペプチド３４５〜３５８の力価は、少なくとも１０，０００であった。ＧＳＴ−融合血清の力価は、少なくとも３００，０００であった。ペプチド抗血清を、Ａｆｆｉｇｅｌマトリクス（ＢｉｏＲａｄ）に共有結合された個々のペプチドから構成されるアフィニティカラムに対して血清を通過させることによってアフィニティー精製した。ＧＳＴ融合物に対して惹起された血清を、まず、ＧＳＴアフィニティカラムに対して通過させることによって、ＧＳＴ−反応性抗体を除去することによって半精製する。次いで、ＳＴＥＡＰ−２特異的抗体を、ＧＳＴ−ＳＴＥＡＰ−２アフィニティカラムに対して通過させることによって単離する。あるいは、ＳＴＥＡＰ−２特異的抗血清を、同一アミノ酸をコードするマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＳＴＥＡＰ−２融合タンパク質を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって単離する。
（実施例２１：ＳＴＥＡＰタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生）
ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ＳＴＥＡＰ−３またはＳＴＥＡＰ−４タンパク質に対するｍＡｂを産生するために、Ｂａｌｂ Ｃマウスに、完全フロイントアジュバントに混合された、個々のＳＴＥＡＰメンバータンパク質配列の領域をコードする、２０〜５０μｇのＫＬＨ共役ペプチドまたは細菌性組換えポリペプチド（例えば、ＧＳＴ−融合タンパク質）を用いて、腹腔内で免疫する。次いで、引き続き、マウスに、２〜４週間毎に、フロイント不完全アジュバント中に混合された２０〜５０μｇの免疫原を用いて免疫する。あるいは、Ｒｉｂｉアジュバントを、初回免疫のために使用する。試験採血を、免疫から７〜１０日後に行い、免疫応答の力価および特異性をモニターする。
ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸１４８〜２５１を含むＧＳＴ−融合タンパク質で免疫されたマウス由来の血清は、ＥＬＩＳＡによって決定された場合に、少なくとも８×１０６の力価に達し、そしてウエスタンブロットによって、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を特異的に認識した（図３３）。一旦、適切な反応性および特異性が、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、およびフローサイトメトリー分析によって決定されるように得られると、次いで、融合物およびハイブリドーマの生成を、当該分野において周知の確立された手順を使用して実施する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）。
図３３は、抗ＳＴＥＡＰ−１マウスｐＡｂが、操作された細胞株中のＳＴＥＡＰ−１タンパク質、およびＬＮＣａＰ細胞中の内因性ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を認識することを示すウエスタンブロットである。ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＹＣ／ＨＩＳタグ化ＳＴＥＡＰ−１またはｎｅｏ空ベクターのいずれかでトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞および２９３Ｔ細胞、ならびにＳＴＥＡＰ−１またはｎｅｏコントロール遺伝子を発現するように操作されたＲＡＴ１細胞の溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロースに転写した。次いで、このブロットを、ＳＧＴ−ＳＴＥＡＰ−１融合タンパク質で免疫したマウス由来の血清の１：１０００希釈物を使用する抗ＳＴＥＡＰウエスタン分析に供した。
代替的な抗原および免疫ストラテジーもまた、ＳＴＥＡＰタンパク質の種々の領域に対して特異的な反応性および特異性を有するｍＡｂを生成するために使用される。このような抗原としては、各ＳＴＥＡＰファミリーメンバータンパク質配列の種々の領域（例えば、推定細胞外ドメイン）をコードする、バキュロウイルス産生組換えタンパク質、または哺乳動物発現および分泌ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質が挙げられ得る。細胞に基づく免疫ストラテジーもまた使用される。ここでは、ＳＴＥＡＰファミリーメンバーのｃＤＮＡを、ＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞または３００．１９マウスｐｒｅ−Ｂ細胞のような細胞中において過剰発現させ、そしてこれらの細胞由来の細胞全体または膜調製物を、免疫原として使用する。さらに、ＳＴＥＡＰ−１またはＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡをコードする哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）が使用される、ＤＮＡに基づく免疫プロトコールを使用して、プラスミドＤＮＡの直接注射によってマウスに免疫する。このプロトコールは、単独で、またはタンパク質および／もしくは細胞に基づく免疫ストラテジーと組み合わせてのいずれかで使用される。
本出願のいたるところに、種々の刊行物が、参照される。これらの刊行物の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明は、本明細書中に開示される実施形態による範囲に限定されず、この実施形態は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図され、機能的に等価な任意のものは、本発明の範囲内である。本明細書中に記載のモデルおよび方法に加えて本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変は、先の記載および教示から当業者にとって明らかとなり、そして本発明の範囲内に含まれることが同様に意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱なく実施され得る。
図１は、ＳＴＥＡＰの構造である。１Ａ〜Ｂ：ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｂ４）クローン １０ ｃＤＮＡ（それぞれ、配列番号１および２）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。開始メチオニンはアミノ酸残基位置１で太字で示され、そして６つの推定膜貫通ドメインは太字で示されており、そして下線が付されている。１Ｃ：ＳＴＥＡＰ−１膜貫通方向の模式図；推定の膜貫通ドメインを縁取るアミノ酸残基を示しており、そして図１Ａ〜Ｂの番号付けに相当する。１Ｄ：クローン１０およびクローン３の重複する配列によって決定される、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子（配列番号３）のＧ／Ｃリッチ５’非コード配列。 図１は、ＳＴＥＡＰの構造である。１Ａ〜Ｂ：ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｂ４）クローン １０ ｃＤＮＡ（それぞれ、配列番号１および２）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。開始メチオニンはアミノ酸残基位置１で太字で示され、そして６つの推定膜貫通ドメインは太字で示されており、そして下線が付されている。１Ｃ：ＳＴＥＡＰ−１膜貫通方向の模式図；推定の膜貫通ドメインを縁取るアミノ酸残基を示しており、そして図１Ａ〜Ｂの番号付けに相当する。１Ｄ：クローン１０およびクローン３の重複する配列によって決定される、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子（配列番号３）のＧ／Ｃリッチ５’非コード配列。 図１は、ＳＴＥＡＰの構造である。１Ａ〜Ｂ：ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｂ４）クローン １０ ｃＤＮＡ（それぞれ、配列番号１および２）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。開始メチオニンはアミノ酸残基位置１で太字で示され、そして６つの推定膜貫通ドメインは太字で示されており、そして下線が付されている。１Ｃ：ＳＴＥＡＰ−１膜貫通方向の模式図；推定の膜貫通ドメインを縁取るアミノ酸残基を示しており、そして図１Ａ〜Ｂの番号付けに相当する。１Ｄ：クローン１０およびクローン３の重複する配列によって決定される、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子（配列番号３）のＧ／Ｃリッチ５’非コード配列。 図１は、ＳＴＥＡＰの構造である。１Ａ〜Ｂ：ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｂ４）クローン １０ ｃＤＮＡ（それぞれ、配列番号１および２）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。開始メチオニンはアミノ酸残基位置１で太字で示され、そして６つの推定膜貫通ドメインは太字で示されており、そして下線が付されている。１Ｃ：ＳＴＥＡＰ−１膜貫通方向の模式図；推定の膜貫通ドメインを縁取るアミノ酸残基を示しており、そして図１Ａ〜Ｂの番号付けに相当する。１Ｄ：クローン１０およびクローン３の重複する配列によって決定される、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子（配列番号３）のＧ／Ｃリッチ５’非コード配列。 図２Ａは、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織、ＬＡＰＣ異種移植片（４ＡＤ、４ＡＩおよび９ＡＤ）およびＨｅＬａ細胞から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてＰＣＲによって中和を実施した。ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｄ４）ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いる半定量的ＰＣＲ（図１Ａ〜Ｂ）は、正常な前立腺およびＬＡＰＣ異種移植片におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現を示す。以下のプライマーをＳＴＥＡＰ−１を増幅するために用いた：８Ｐ１Ｄ４．１ ５’ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＡ３’（配列番号４）８Ｐ１Ｄ４．２ ５’ＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣ３’（配列番号５）。レーンは以下のとおりである：１脳；２前立腺；３ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；４ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；５ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；６ ＨｅＬａ；７マウス ｃＤＮＡ；８陰性コントロール。 図２Ｂは、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織、ＬＡＰＣ異種移植片（４ＡＤ、４ＡＩおよび９ＡＤ）およびＨｅＬａ細胞から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてＰＣＲによって中和を実施した。ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｄ４）ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いる半定量的ＰＣＲ（図１Ａ〜Ｂ）は、正常な前立腺およびＬＡＰＣ異種移植片におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現を示す。以下のプライマーをＳＴＥＡＰ−１を増幅するために用いた：８Ｐ１Ｄ４．１ ５’ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＡ３’（配列番号４）８Ｐ１Ｄ４．２ ５’ＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣ３’（配列番号５）。レーンは以下のとおりである：１脳；２心臓；３腎臓；４肝臓；５肺；６膵臓；７胎盤；８骨格筋。 図２Ｃは、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織、ＬＡＰＣ異種移植片（４ＡＤ、４ＡＩおよび９ＡＤ）およびＨｅＬａ細胞から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてＰＣＲによって中和を実施した。ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｄ４）ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いる半定量的ＰＣＲ（図１Ａ〜Ｂ）は、正常な前立腺およびＬＡＰＣ異種移植片におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現を示す。以下のプライマーをＳＴＥＡＰ−１を増幅するために用いた：８Ｐ１Ｄ４．１ ５’ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＡ３’（配列番号４）８Ｐ１Ｄ４．２ ５’ＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣ３’（配列番号５）。レーンは以下のとおりである：１結腸；２卵巣；３白血球；４前立腺；５小腸；６脾臓；７精巣；８胸腺。 種々の正常なヒト組織および前立腺癌異種移植片におけるＳＴＥＡＰ−１発現のノーザンブロット分析であり、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現を示す。２つの複数の組織のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を全長ＳＴＥＡＰ ｃＤＮＡクローン１０（図１Ａ〜Ｂ）でプローブした。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準を、一方の側で示す。各レーンは、２μｇのｍＲＮＡを含む、このｍＲＮＡは、βアクチンプローブを用いて正規化した。Ａ１脳；Ａ２扁桃；Ａ３尾状核；Ａ４小脳；Ａ５大脳皮質；Ａ６前頭葉；Ａ７海馬；Ａ８延髄；Ｂ１後頭葉；Ｂ２被殻；Ｂ３黒質；Ｂ４側頭葉；Ｂ５視床；Ｂ６視床下核；Ｂ７脊髄；Ｃ１心臓；Ｃ２大動脈；Ｃ３骨格筋；Ｃ４結腸；Ｃ５膀胱；Ｃ６子宮；Ｃ７前立腺；Ｃ８胃；Ｄ１精巣；Ｄ２卵巣；Ｄ３膵臓；Ｄ４脳下垂体；Ｄ５副腎；Ｄ６甲状腺；Ｄ７唾液腺；Ｄ８乳腺；Ｅ１腎臓；Ｅ２肝臓；Ｅ３小腸；Ｅ４脾臓；Ｅ５胸腺；Ｅ６末梢白血球；Ｅ７リンパ節；Ｅ８骨髄；Ｆ１盲腸；Ｆ２肺；Ｆ３喉頭；Ｆ４胎盤；Ｇ１胎児脳；Ｇ２胎児心臓；Ｇ３胎児腎臓；Ｇ４胎児肝臓；Ｇ５胎児脾臓；Ｇ６胎児胸腺；Ｇ７胎児肺。 種々の正常なヒト組織および前立腺癌異種移植片におけるＳＴＥＡＰ−１発現のノーザンブロット分析であり、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１の優先的発現を示す。図３Ｂは、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローン１０（図１Ａ〜Ｂ）でプローブした複数の組織ＲＮＡドットブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｂｌｏｔカタログ番号７７７０−１）であり、これは有意な検出可能発現を伴う他の組織に対して、前立腺における約５倍大きい発現を示す。 ノーザンブロット（図３Ａ）における４ｋｂのメッセージに対応するＳＴＥＡＰ−１ ＧＴＨ９クローンのヌクレオチド配列（配列番号６）。この配列は、図１Ａ〜ＢのＳＴＥＡＰ−１クローン１０配列に対して２３９９塩基対のイントロンを含む；コード領域は、ヌクレオチド９６〜８５７および３２５７〜３５１０（太字で示される）である。開始ＡＴＧは、太字でかつ下線を付してあり、終止コドンは、太字でかつ下線を付してあり、そしてイントロンとエキソンの境界には下線を付している。 前立腺および複数の癌細胞株ならびに前立腺癌異種移植片におけるＳＴＥＡＰ−１の発現。異種移植片および細胞株フィルターを、１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡで調製した。このブロットをプローブとしてＳＴＥＡＰ−１クローン１０を用いて分析した。全てのＲＮＡサンプルを臭化エチジウム染色、および引き続きβアクチンプローブを用いた分析によって正規化した。図５Ａ：種々の癌細胞株ならびに異種移植片および前立腺における発現。レーンは以下の通りである：（１）ＰｒＥＣ細胞、（２）正常前立腺組織、（３）ＬＡＰＣ−４ＡＤ異種移植片、（４）ＬＡＰＣ−４ ＡＩ異種移植片、（５）ＬＡＰＣ−９ ＡＤ異種移植片、（６）ＬＡＰＣ−９ ＡＩ異種移植片、（７）ＬＮＣａＰ細胞、（８）ＰＣ−３細胞、（９）ＤＵ１４５細胞、（１０）ＰＡＮＣ−１細胞、（１１）ＢｘＰＣ−３細胞、（１２）ＨＰＡＣ細胞、（１３）Ｃａｐａｎ−１細胞、（１４）ＣＡＣＯ−２細胞、（１５）ＬＯＶＯ細胞、（１６）Ｔ８４細胞、（１７）ＣＯＬＯ−２０５細胞、（１８）ＫＣＬ−２２細胞（急性リンパ球性白血病、ＡＬＬ）、（１９）ＨＴ１１９７細胞、（２０）ＳＣＡＢＥＲ細胞、（２１）ＵＭ−ＵＣ−３細胞、（２２）ＴＣＣＳＵＰ細胞、（２３）Ｊ８２細胞、（２４）５６３７細胞、（２５）ＲＤ−ＥＳ細胞（ユーイング肉腫、ＥＷＳ）、（２６）ＣＡＭＡ−１細胞、（２７）ＤＵ４４７５細胞、（２８）ＭＣＦ−７細胞、（２９）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞、（３０）ＮＴＥＲＡ−２細胞、（３１）ＮＣＣＩＴ細胞、（３２）ＴＥＲＡ−１細胞、（３３）ＴＥＲＡ−２細胞、（３４）Ａ４３１細胞、（３５）ＨｅＬａ細胞、（３６）ＯＶ−１０６３細胞、（３７ＰＡ−１細胞、（３８）ＳＷ ６２６細胞、（３９）ＣＡＯＶ−３細胞。図５Ｂ：マウスの脛骨（ｉｔ）において増殖したＬＡＰＣ−４およびＬＡＰＣ−９異種移植片における発現と比較した、皮下（ｓｃ）で増殖したＬＡＰＣ異種移植片中のＳＴＥＡＰ−１の発現。 組織および複数の細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現のウエスタンブロット分析。前立腺癌の異種移植片および細胞株から調製した細胞溶解物のウエスタンブロットを、ポリクローナル抗体ＳＴＥＡＰ−１抗体調製物でプローブした。このサンプルは、２０μｇのタンパク質を含み、そしてウエスタンブロットの抗Ｇｒｂ２プローブを用いて正規化した。 ＳＴＥＡＰ−１の細胞表面ビオチン化。図７Ａ：ベクター単独または６−Ｈｉｓタグ化ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡを含むベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞表面ビオチン化。細胞溶解物を特定の抗体を用いて免疫沈降し、膜に転写し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンを用いてプローブした。レーン１〜４および６は、ＳＴＥＡＰ−１発現２９３Ｔ細胞から調製した溶解物からの免疫沈降に相当する。レーン５および７は、ベクターで形質転換した細胞由来の免疫沈降である。この免疫沈降は、以下の抗体を用いて実施した：（１）ヒツジ（免疫なし）、（２）抗ラージＴ抗原、（３）抗ＣＤ７１（トランスフェリンレセプター）、（４）抗−Ｈｉｓ、（５）抗−Ｈｉｓ、（６）抗−ＳＴＥＡＰ−１、（７）抗ＳＴＥＡＰ−１。図７Ｂ：前立腺癌（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５）、膀胱癌（ＵＭ−ＵＣ−３、ＴＣＣＳＵＰ）および結腸癌（ＬＯＶＯ，ＣＯＬＯ）の各々の細胞株を溶解の前にビオチン化する（＋）か、またはしなかった（−）。ストレプトアビジンゲル精製タンパク質のウエスタンブロットを、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体でプローブした。分子量マーカーは、キロダルトン（ｋＤ）で示す。 抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体を用いた、ＳＴＥＡＰ−１発現の免疫組織化学分析。組織を１０％ホルマリンで固定し、そしてパラフィンに埋設した。組織切片を、Ｎ末端ペプチドを指向する抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体を用いて染色した。図８Ａ：Ｎ末端ＳＴＥＡＰ−１ペプチドの存在下でプローブしたＬＮＣａＰ細胞、図８Ｂ：ＬＮＣａＰおよび非特異的ペプチド２、図８Ｃ：正常前立腺組織、図８Ｄ：グレード３（３等級）前立腺癌、図８Ｅ：グレード２、グリースン（Ｇｌｅａｓｏｎ）７前立腺癌、図８Ｆ：ＬＡＰＣ−９ ＡＤ異種移植片、図８Ｇ：正常膀胱、図８Ｈ：正常結腸。全ての画像は、４００×倍率である。 ＳＴＥＡＰ−２（９８Ｐ４Ｂ６）クローンＧＴＤ３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）および推定アミノ酸配列（配列番号８）。開始メチオニンおよびコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を、太字で示し、そして推定膜貫通ドメインを太字下線で示す。５’ＵＴＲは、７２％という高ＧＣ含量を示す。 （図１０Ａ〜Ｅ）ＳＴＥＡＰ−３のヌクレオチド配列（配列番号９）および推定アミノ酸配列（配列番号１０）。コザック領域は、太字である。 （図１０Ａ〜Ｅ）ＳＴＥＡＰ−３のヌクレオチド配列（配列番号９）および推定アミノ酸配列（配列番号１０）。コザック領域は、太字である。 （図１０Ａ〜Ｅ）ＳＴＥＡＰ−３のヌクレオチド配列（配列番号９）および推定アミノ酸配列（配列番号１０）。コザック領域は、太字である。 （図１０Ａ〜Ｅ）ＳＴＥＡＰ−３のヌクレオチド配列（配列番号９）および推定アミノ酸配列（配列番号１０）。コザック領域は、太字である。 （図１０Ａ〜Ｅ）ＳＴＥＡＰ−３のヌクレオチド配列（配列番号９）および推定アミノ酸配列（配列番号１０）。コザック領域は、太字である。 （図１０Ｆ）ＳＴＥＡＰ−１のタンパク質配列を用いた検索によって得たさらなるＳＴＥＡＰファミリーメンバーに相当する、ｄｂＥＳＴデータベースエントリーのヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号１１〜１４）。 ＳＴＥＡＰファミリータンパク質の一次構造比較： （図１１Ａ〜Ｂ）ＰＩＭＡプログラム（インターネットアドレス：<ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｎｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ>のＰＩＭＡ １．４プログラム）を用いたＳＴＥＡＰ１〜４（それぞれ、配列番号２、８、１０および１５）のアミノ酸配列アラインメント；ＳＯＳＵＩプログラム（以下のインターネットアドレスから入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／〜ｍｉｔａｋｕ／ａｄｖ ｓｏｓｕｉ／ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）によって同定された膜貫通ドメインは太字である。ＰＩＭＡ最大連結クラスター化結果を示す；同一の残基は太字で示す。（図１１Ｃ）ＳＴＥＡＰ−１（８Ｐ１Ｄ４クローン１０；配列番号２）配列およびＳＴＥＡＰ−２（９８Ｐ４Ｂ６クローンＧＴＤ３；配列番号８）配列のアミノ酸配列アラインメント。このアラインメントは、ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｌａｕｎｃｈｅｒ ＷｅｂサイトのＳＩＭアラインメントプログラムを用いて実施した。膜貫通ドメインを太字で示す。結果は、２３７残基重複において５４．９％を示す（スコア：７１７．０；ギャップ頻度：０．０％）。（図１１Ｄ）ＳＴＥＡＰ−１（配列番号２）配列およびＳＴＥＡＰ−３（９８Ｐ４Ｂ６クローンＧＴＤ３；配列番号１０）配列のアミノ酸配列アラインメント。同一の残基にアスタリスク（＊）を付けて示す。ＳＩＭの結果：２６４残基重複において４０．９％同一性；スコア：６２５．０；ギャップ頻度：０．０％。（図１１Ｅ）ＳＴＥＡＰ−２（配列番号８）配列およびＳＴＥＡＰ−３（９８Ｐ４Ｂ６クローンＧＴＤ３；配列番号１０）配列のアミノ酸配列アラインメント。同一の残基にアスタリスク（＊）を付けて示す。ＳＩＭの結果：４１６残基重複において４７．８％同一性；スコア：１０７５．０；ギャップ頻度：０．２％。 ノーザンブロット（図１２Ａ〜Ｂ）およびＲＴ−ＰＣＲ（図１２Ｂ）による正常組織におけるＳＴＥＡＰ−３ ｍＲＮＡの発現。ＲＴ−ＰＣＲ分析については、一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（ＡＩ１３９６０７に対するプライマーを用いる）は、２５サイクルの増幅後、胎盤および前立腺におけるＡＩ１３９６０７の優先的発現を示す。ＡＩ１３９６０７を増幅するために、以下のプライマーを用いた： ＡＩ１３９６０７．１ ５’ＴＴＡＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡ ３’（配列番号１６）ＡＩ１３９６０７．２ ５’ＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴ ３’（配列番号１７）。レーンは（左から右に）以下の通りである：パネル１：心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓；パネル２：脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および白血球。 ノーザンブロット（図１２Ａ〜Ｂ）およびＲＴ−ＰＣＲ（図１２Ｂ）による正常組織におけるＳＴＥＡＰ−３ ｍＲＮＡの発現。ＲＴ−ＰＣＲ分析については、一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（ＡＩ１３９６０７に対するプライマーを用いる）は、２５サイクルの増幅後、胎盤および前立腺におけるＡＩ１３９６０７の優先的発現を示す。ＡＩ１３９６０７を増幅するために、以下のプライマーを用いた： ＡＩ１３９６０７．１ ５’ＴＴＡＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡ ３’（配列番号１６）ＡＩ１３９６０７．２ ５’ＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴ ３’（配列番号１７）。レーンは以下の通りである：１脳；２心臓；３腎臓；４肝臓；５肺；６膵臓；７胎盤；８骨格筋。 ノーザンブロット（図１２Ａ〜Ｂ）およびＲＴ−ＰＣＲ（図１２Ｂ）による正常組織におけるＳＴＥＡＰ−３ ｍＲＮＡの発現。ＲＴ−ＰＣＲ分析については、一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（ＡＩ１３９６０７に対するプライマーを用いる）は、２５サイクルの増幅後、胎盤および前立腺におけるＡＩ１３９６０７の優先的発現を示す。ＡＩ１３９６０７を増幅するために、以下のプライマーを用いた： ＡＩ１３９６０７．１ ５’ＴＴＡＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡ ３’（配列番号１６）ＡＩ１３９６０７．２ ５’ＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴ ３’（配列番号１７）。レーンは以下の通りである：１結腸；２卵巣；３白血球；４前立腺；５小腸；６脾臓；７精巣；８胸腺。 肝臓におけるＳＴＥＡＰ−４／Ｒ８０９９１の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（Ｒ８０９９１に対するプライマーを用いる）は、２５サイクルの増幅後、肝臓におけるＲ８０９９１の優先的発現を示す。Ｒ８０９９１を増幅するために、以下のプライマーを用いた： Ｒ８０９９１．１ ５’ＡＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＣ ３’（配列番号１８）Ｒ８０９９１．２ ５’ＧＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴ ３’（配列番号１９）。 肝臓におけるＳＴＥＡＰ−４／Ｒ８０９９１の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（Ｒ８０９９１に対するプライマーを用いる）は、２５サイクルの増幅後、肝臓におけるＲ８０９９１の優先的発現を示す。Ｒ８０９９１を増幅するために、以下のプライマーを用いた： Ｒ８０９９１．１ ５’ＡＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＣ ３’（配列番号１８）Ｒ８０９９１．２ ５’ＧＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴ ３’（配列番号１９）。レーンは以下の通りである：１脳；２心臓；３腎臓；４肝臓；５肺；６膵臓；７胎盤；８骨格筋。 肝臓におけるＳＴＥＡＰ−４／Ｒ８０９９１の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを１６の正常な組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（Ｒ８０９９１に対するプライマーを用いる）は、２５サイクルの増幅後、肝臓におけるＲ８０９９１の優先的発現を示す。Ｒ８０９９１を増幅するために、以下のプライマーを用いた： Ｒ８０９９１．１ ５’ＡＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＣ ３’（配列番号１８）Ｒ８０９９１．２ ５’ＧＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴ ３’（配列番号１９）。レーンは以下の通りである：１結腸；２卵巣；３白血球；４前立腺；５小腸；６脾臓；７精巣；８胸腺。 前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−２（９８Ｐ４Ｂ６）の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを８つの正常な組織、ＬＡＰＣ異種移植片（４ＡＤ、４ＡＩ、および９ＡＤ）、ならびにＨｅＬａ細胞から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（９８Ｐ４Ｂ６に対するプライマーを用いる）は、正常前立腺およびＬＡＰＣ異種移植片における９８Ｐ４Ｂ６の優先的発現を示す。ＳＴＥＡＰ ＩＩを増幅するために、以下のプライマーを用いた： ９８Ｐ４Ｂ６．１ ５’ＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴ ３’（配列番号２０）９８Ｐ４Ｂ６．２ ５’ＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧ ３’（配列番号２１） 前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−２（９８Ｐ４Ｂ６）の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを８つの正常な組織、ＬＡＰＣ異種移植片（４ＡＤ、４ＡＩ、および９ＡＤ）、ならびにＨｅＬａ細胞から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（９８Ｐ４Ｂ６に対するプライマーを用いる）は、正常前立腺およびＬＡＰＣ異種移植片における９８Ｐ４Ｂ６の優先的発現を示す。ＳＴＥＡＰ ＩＩを増幅するために、以下のプライマーを用いた： ９８Ｐ４Ｂ６．１ ５’ＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴ ３’（配列番号２０）９８Ｐ４Ｂ６．２ ５’ＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧ ３’（配列番号２１）レーンは以下の通りである：１脳；２前立腺、３ ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；４ ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；５ ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；６ ＨｅＬａ；７マウスｃＤＮＡ；８陰性コントロール。 前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−２（９８Ｐ４Ｂ６）の優先的発現。一本鎖ｃＤＮＡを８つの正常な組織、ＬＡＰＣ異種移植片（４ＡＤ、４ＡＩ、および９ＡＤ）、ならびにＨｅＬａ細胞から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を実施した。半定量的ＰＣＲ（９８Ｐ４Ｂ６に対するプライマーを用いる）は、正常前立腺およびＬＡＰＣ異種移植片における９８Ｐ４Ｂ６の優先的発現を示す。ＳＴＥＡＰ ＩＩを増幅するために、以下のプライマーを用いた： ９８Ｐ４Ｂ６．１ ５’ＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴ ３’（配列番号２０）９８Ｐ４Ｂ６．２ ５’ＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧ ３’（配列番号２１）レーンは以下の通りである：１結腸；２卵巣；３白血球；４前立腺；５小腸；６脾臓；７精巣；８胸腺。 ノーザンブロットによって決定した正常組織および前立腺癌異種移植片における、前立腺特異的ＳＴＥＡＰ−２／９８Ｐ４Ｂ６の発現。ヒト正常組織フィルター（ＡおよびＢ）をＣＬＯＮＴＥＣＨから入手し、そして１レーンあたり２μｇのｍＲＮＡを含む。異種移植片フィルター（Ｃ）を、１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いて調製した。プローブとして９８Ｐ４Ｂ６クローン由来のＳＳＨを用いてブロットを分析した。全てのＲＮＡサンプルを臭化エリジウム染色によって正規化した。 ノーザンブロットによって決定した正常組織および前立腺癌異種移植片における、前立腺特異的ＳＴＥＡＰ−２／９８Ｐ４Ｂ６の発現。ヒト正常組織フィルター（ＡおよびＢ）をＣＬＯＮＴＥＣＨから入手し、そして１レーンあたり２μｇのｍＲＮＡを含む。異種移植片フィルター（Ｃ）を、１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いて調製した。プローブとして９８Ｐ４Ｂ６クローン由来のＳＳＨを用いてブロットを分析した。全てのＲＮＡサンプルを臭化エリジウム染色によって正規化した。レーンは以下の通りである：１心臓；２脳；３胎盤；４肺；５肝臓；６骨格筋；７腎臓；８膵臓。 ノーザンブロットによって決定した正常組織および前立腺癌異種移植片における、前立腺特異的ＳＴＥＡＰ−２／９８Ｐ４Ｂ６の発現。ヒト正常組織フィルター（ＡおよびＢ）をＣＬＯＮＴＥＣＨから入手し、そして１レーンあたり２μｇのｍＲＮＡを含む。異種移植片フィルター（Ｃ）を、１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いて調製した。プローブとして９８Ｐ４Ｂ６クローン由来のＳＳＨを用いてブロットを分析した。全てのＲＮＡサンプルを臭化エリジウム染色によって正規化した。レーンは以下の通りである：１脾臓；２胸腺；３前立腺；４精巣；５卵巣；６小腸；７結腸；８白血球。 レーンは以下の通りである：１前立腺；２ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；３ ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；４ ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；ＬＡＰＣ−９ＡＩ。 ノーザンブロット分析によって決定した、前立腺および選択した癌細胞株における、ＳＴＥＡＰ−２の発現。異種移植片および細胞株フィルターを、１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いて調製した。プローブとして９８Ｐ４Ｂ６クローン由来のＳＳＨを用いてブロットを分析した。全てのＲＮＡサンプルを臭化エリジウム染色によって正規化した。レーンは以下の通りである：１前立腺；２ ＬＡＰＣ−４ ＡＤ；３ ＬＡＰＣ−４ ＡＩ；４ ＬＡＰＣ−９ ＡＤ；ＬＡＰＣ−９ＡＩ；６ ＴｓｕＰｒ１；７ ＤＵ１４５；８ ＬＮＣａＰ；９ ＰＣ−３；１０ ＬＡＰＣ−４ ＣＬ；１１ ＰｒＥＣ；１２ ＨＴ１１９７；１３ ＳＣａＢＥＲ；１４ ＵＭ−ＵＣ−３；１５ ＴＣＣＳＵＰ；１６ Ｊ８２；１７ ５６３７；１８ ＲＤ−ＥＳ；１９ ２９３Ｔ；２０ ＰＡＮＣ−１；２１ ＢｘＰＣ−３；２２ ＨＰＡＣ；２３ Ｃａｐａｎ−１；２４ ＬＳ１８０；２５ ＳＫ−ＣＯ−１；２６ ＣａＣｏ−２；２７ ＬｏＶｏ；２８ Ｔ８４；２９ Ｃｏｌｏ−２０５；３０ ＢＴ−２０；３１ ＣＡＭＡ−１；３２ ＤＵ ４４７５；３３ ＭＣＦ−７；３４ ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ；３５ ＮＴＥＲＡ−２；３６ ＮＣＣＩＴ；３７ ＴＥＲＡ−１；３８ ＴＥＲＡ−２；３９ Ａ４３１；４０ ＨｅＬａ；４１ ＯＶ−１０６３；４２ ＰＡ−１；４３ ＳＷ６２６；４４ ＣＡＯＶ−３。 ＳＴＥＡＰファミリーメンバーの染色体局在化。本明細書に記載されるＳＴＥＡＰ遺伝子の染色体局在化を、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４放射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＩ）を用いて決定した。ＳＴＥＡＰ−２およびＡＩ１３９６０７についてのマッピングを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３放射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＩ）を用いて実施した。 ヒトＳＴＥＡＰ−１遺伝子のＯＲＦ内のイントロン−エキソン境界の模式図。全部で３つのイントロン（ｉ）および４つのエキソン（ｅ）を同定した。 図１９は、種々の種におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子のＺｏｏｂｌｏｔサザン分析を示す。ゲノムＤＮＡを、ヒト、サル、イヌ、マウス、トリおよびショウジョウバエを含むいくつかの異なる生物から調製した。１０μｇの各ＤＮＡサンプルを、ＥｃｏＲＩで消化し、ニトロセルロース膜上にブロットし、そしてＳＴＥＡＰ−１プローブでプローブした。サイズ標準は、キロベース（ｋｂ）で側方に示す。 図２０は、ＳＴＥＡＰ−１プローブでのマウスＢＡＣのサザンブロット分析を示す。ＤＮＡを、ゲノムＤＮＡを単離するために、ヒト細胞、およびマウスＳＴＥＡＰ遺伝子を含むマウスＢＡＣクローン（１２Ｐ１１）から調製した。各ＤＮＡサンプルを、ＥｃｏＲＩで消化し、ニトロセルロース膜上にブロットし、そしてプローブした。８μｇのゲノムＤＮＡを、２５０ｎｇのマウスＢＡＣ ＤＮＡと比較した。レーンは以下である：（１）１ｋｂラダー；（２）ヒト雌ゲノム；（３）１２Ｐ１１ ＢＡＣマウス（ｍｕｓ）；（４）ヒト雌ゲノム；（５）１２Ｐ１１ ＢＡＣマウス；（６）３Ｔ３。 図２１Ａは、ＳＴＥＡＰ−１に対するヒツジポリクローナル抗体を使用する免疫組織化学染色であり、膀胱癌標本における細胞周囲（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）染色を示す。 図２１Ｂは、ＳＴＥＡＰ−１に対するヒツジポリクローナル抗体を使用する免疫組織化学染色であり、第二の膀胱癌標本における細胞周囲（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）染色を示す。 図２１Ｃは、ＳＴＥＡＰ−１に対するヒツジポリクローナル抗体を使用する免疫組織化学染色であり、肺癌標本における細胞周囲（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）染色を示す。 図２１Ｄは、ＳＴＥＡＰ−１に対するヒツジポリクローナル抗体を使用する免疫組織化学染色であり、第二の肺癌標本における細胞周囲（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）染色を示す。 図２２Ａは、アンチセンスプローブでのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションによる、正常前立腺におけるＳＴＥＡＰ−２の発現を示す。 図２２Ｂは、コントロールとしてセンスプローブを使用する、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションによる、正常前立腺におけるＳＴＥＡＰ−２の発現を示す。 図２３Ａは、アンチセンスプローブでのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションによる、前立腺癌におけるＳＴＥＡＰ−２の発現を示す。 図２３Ｂは、センスプローブを使用する、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションについての前立腺癌コントロールにおけるＳＴＥＡＰ−２の発現を示す。 図２４は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して試験したような種々の癌におけるＳＴＥＡＰ−２の発現を示す。レーン１は、ＬＡＰＣ４ ＡＤ異種移植片由来のサンプルを示す；レーン２は、ＬＡＰＣ９ ＡＤ異種移植片である；レーン３は、ＬＡＰＣ９ ＡＤ２異種移植片である（ヒト骨移植片と増殖した）；レーン４は、ＬＡＰＣ９ ＡＤ ＩＴである（脛骨内（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌｌｙ）で増殖した）；レーン５は、結腸癌患者由来の、プールした組織である；レーン６は、肺癌患者由来の、プールした組織である；Ｍは、マーカーレーンを示す；レーン７は、患者の正常前立腺組織である；レーン８は、患者の前立腺癌組織である；レーン９は、腎癌組織由来の、プールした組織である；レーン１０は、膀胱癌患者由来の、プールした組織である；レーン１１は、Ｈｅｌａ細胞である；および、レーン１２は、水ブランクである。 図２５は、７６の正常組織におけるＳＴＥＡＰ−２発現のＲＮＡドットブロット分析を示す。ＲＮＡ組織供給源：Ａ１ 全脳；Ａ２ 小脳、左；Ａ３ 黒質；Ａ４ 心臓；Ａ５ 食道；Ａ６ 結腸、逆行；Ａ７ 腎臓；Ａ８ 肺；Ａ９ 肝臓；Ａ１０ ＨＬ６０、白血病；Ａ１１ 胎児脳；Ｂ１ 大脳皮質；Ｂ２ 小脳、右；Ｂ３ ａｃｃｕｍｂｅｎｓ ｎｅｃｌｅｕｓ；Ｂ４ 大動脈；Ｂ５ 胃；Ｂ６ 結腸、下行；Ｂ７ 骨格筋；Ｂ８ 胎盤；Ｂ９ 脾臓；Ｂ１０ Ｈｅｌａ、Ｓ３；Ｂ１１ 胎児心臓；Ｃ１ 前頭葉；Ｃ２ 脳梁；Ｃ３ 視床；Ｃ４ 房、左；Ｃ５ 空腸；Ｃ６ 直腸；Ｃ７ 脾臓；Ｃ８ 膀胱；Ｃ９ 副腎；Ｃ１０ Ｋ５６２、白血病；Ｃ１１ 胎児腎臓；Ｄ１ 頭頂葉；Ｄ２ 扁桃；Ｄ３ 下垂体；Ｄ４ 房、右；Ｄ５ 空腸；Ｄ６ ブランク；Ｄ７ 胸腺；Ｄ８ 子宮；Ｄ９ 甲状腺；Ｄ１０ ＭＯＬＴ−４、白血病；Ｄ１１ 胎児肝臓；Ｅ１ 後頭葉；Ｅ２ 尾状核；Ｅ３ 脊髄；Ｅ４ 脳室、左；Ｅ５ 回腸；Ｅ６ ブランク；Ｅ７ 白血球；Ｅ８ 前立腺；Ｅ９ 唾液腺；Ｅ１０ ＲＡＪＩ、白血病；Ｅ１１ 胎児脾臓；Ｆ１ 側頭葉；Ｆ２ 海馬；Ｆ３ ブランク；Ｆ４ 脳室、右；Ｆ５ 回盲部；Ｆ６ ブランク；Ｆ７ リンパ節；Ｆ８ 精巣；Ｆ９ 乳腺；Ｆ１０ ＤＡＵＤＩ、白血病；Ｆ１１ 胎児胸腺；Ｇ１ 中心回；Ｇ２ 延髄；Ｇ３ ブランク；Ｇ４ 心室中隔；Ｇ５ 虫垂；Ｇ６ ブランク；Ｇ７ 骨髄；Ｇ８ 卵巣；Ｇ９ ブランク；Ｇ１０ ＳＷ４８０、結腸癌；Ｇ１１ 胎児肺；Ｈ１ 橋；Ｈ２ 被殻；Ｈ３ ブランク；Ｈ４ 心尖；Ｈ５ 結腸、横行；Ｈ６ ブランク；Ｈ７ 気管；Ｈ８ ブランク；Ｈ９ ブランク；Ｈ１０ Ａ５４９、肺癌；Ｈ１１ ブランク。 図２６は、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−２の発現がｐ１５０、ｐ１２０およびｐ７５を含む種々のタンパク質のチロシン残基へのリン酸化を誘導するために十分であることを示す、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０ ｍＡｂ）でのウエスタンブロットである。抗Ｇｒｂ２ Ａｂを使用するオーバーレイは、ゲルが等しくロードされたことを示す。 図２７は、ウエスタンブロットを示す。図２７Ａは、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の発現がＰＣ３−ｎｅｏと比較してｐ３８キナーゼを活性化することを示す、抗リン酸化ｐ３８を使用したウエスタンブロットである。ｐ３８アクチベーターであることが既知のＴＮＦ−ＮａＳａＩおよびＮａＳａＩは、ポジティブコントロールとして働く。図２７Ｂは、図２７Ａにおけるように、ゲル上を等量のタンパク質がロードすることを抗ｐ３８を使用して示すウエスタンブロットである。 図２８は、ウエスタンブロットを示す。図２８Ａは、１％ ＦＢＳ中のＥＲＫ経路の活性化を試験するための、抗リン酸化ＥＲＫを使用したウエスタンブロットである。Ｒａｓを発現するＰＣ３細胞（ポジティブコントロール）、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、またはｎｅｏ（ネガティブコントロール）を、１％ ＦＢＳ中で増殖した。これらの結果は、ｎｅｏコントロール遺伝子の発現はＥＲＫリン酸化に効果がないが、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２の発現はＥＲＫリン酸化を誘導することを示す。抗ＥＲＫ抗体を使用して、全てのレーンにおいてＥＲＫの存在を確認した。図２８Ｂは、０．１％ ＦＢＳおよび１０％ ＦＢＳ中のＥＲＫ経路の活性化を試験するための、抗リン酸化ＥＲＫを使用したウエスタンブロットである。ＳＴＥＡＰ−１またはｎｅｏ（ネガティブコントロール）を発現するＰＣ３細胞を、０．１％ ＦＢＳまたは１０％ ＦＢＳのいずれかにおいて増殖した。これらの結果は、ＳＴＥＡＰ−１の発現がＥＲＫシグナル伝達カスケードの活性化を誘導するために十分であることを確認する。 図２９は、臭気物質（ｏｄｏｒａｎｔ）によって媒介されるＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞におけるシグナル伝達を示す。図２９Ａは、ｎｅｏを安定に発現するＰＣ３細胞の抗ホスホチロシンウエスタンブロットを示し、この細胞は、０．１％ ＦＢＳ中で一晩増殖させ、レセプターの保有を可能にし、次いで、シトラルバ（ｃｉｔｒａｌｖａ）、エチルバニリンまたはＩＢＭＰで処理した。１０％ ＦＢＳでの処理は、コントロールとして使用した。図２９Ｂは、図２９Ａについて記載したように処理した、ＳＴＥＡＰ−１を安定に発現するＰＣ３細胞の抗ホスホチロシンウエスタンブロットを示す。これらの結果は、シトラルバ（ｃｉｔｒａｌｖａ）およびエチルバニリンが、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞においてｐ１３６〜１４０のリン酸化を特異的に誘導することを示す。さらに、シトラルバは、デノボでの１６０〜２００ｋＤａでのタンパク質のリン酸化を誘導する。 図３０は、臭気物質によるＥＲＫカスケードの活性化を示す。ｎｅｏまたはＳＴＥＡＰ−１のいずれかを安定に発現するＰＣ３細胞の抗ＥＲＫウエスタンブロットであり、この細胞は、０．１％ ＦＢＳ中で一晩増殖させた。次いで、細胞を、シトラルバで５分間処理した。１０％ ＦＢＳでの処理は、コントロールとして使用した。全細胞溶解物を、抗リン酸化ＥＲＫを使用して分析した。これらの結果は、シトラルバがＥＲＫをリン酸化し、これによってＳＴＥＡＰ−１特異的様式でＥＲＫ経路を活性化することを示す。 図３１は、抗ＳＴＥＡＰ−１免疫組織化学分析を示す。図３１Ａは、ＬＡＰＣ−９正常位（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）の前立腺癌腫瘍（２００倍の倍率）である。ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞は、核周囲の染色を示す。図３１Ｂは、ＬＡＰＣ−９リンパ節転移巣（４００倍の倍率）である。ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞は、核周囲の染色を示す。図３１Ｃ〜Ｄは、ＬＡＰＣ−９肺転移巣（８００倍の倍率）である。ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞は、核周囲の染色を示す。図３１R>１Ｅ〜Ｆは、ＬＡＰＣ−９前立腺癌の微小転移巣（８００倍の倍率）である。ＰＳＡを発現する細胞は、核周囲の染色を示す。 図３２は、ヒト患者のリンパ節転移巣（図３２Ａ）、および骨転移巣（図３２Ｂ）における強度の核周囲染色を示す、ＳＴＥＡＰ−１の免疫組織化学検出である。 図３３は、操作された細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質、およびＬＮＣａＰ細胞における内因性ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を抗ＳＴＥＡＰ−１マウスｐＡｂが認識することを示すウエスタンブロットである。ｐｃＤＮＡ３．１ＭＹＣ／ＨＩＳタグ化ＳＴＥＡＰ−１、またはｎｅｏ空ベクターのいずれかでトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞および２９３Ｔ細胞、ならびにＳＴＥＡＰ−１またはｎｅｏコントロール遺伝子を発現するように操作されたＲＡＴ１細胞の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロースに転写した。次いで、これらのブロットを、ＧＳＴ−ＳＴＥＡＰ−１融合タンパク質で免疫したマウス由来の血清の１：１０００希釈を使用した抗ＳＴＥＡＰウエスタンブロット分析に供した。

Claims (58)

  1. 図９Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号８）を有するＳＴＥＡＰ−２タンパク質。
  2. ＳＴＥＡＰ−２ポリペプチドであって、ここで該ＳＴＥＡＰ−２ポリペプチドが、図９Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号８）のアミノ酸１〜２４５、２〜２０４、１００〜１０８、１２１〜４５４、１５３〜１６５、１８２〜４５４、１８３〜３８７、２２７〜２３５、２７６〜４５３、３０６〜３１４、３０７〜３１５、３４５〜３５８、４０２〜４１０、および４１９〜４５４からなる群からから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、ＳＴＥＡＰ−２ポリペプチド。
  3. 図９Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号８）に、その全長にわたって少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  4. （ａ）図９Ａ〜Ｄに示されるような配列（配列番号７）を有するポリヌクレオチドであって、ここでＴがまたＵであり得る、ポリヌクレオチド；（ｂ）配列が、受託番号ＰＴＡ−３１１としてアメリカン タイプ コレクションに寄託されたプラスミド９８Ｐ４Ｂ６−ＧＴＤ３に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＳＴＥＡＰ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）請求項１に記載のＳＴＥＡＰ−２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドに十分に相補的であるポリヌクレオチドからなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
  5. 請求項２に記載のフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
  6. 請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  8. 検出可能なマーカーで標識された、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
  9. ＳＴＥＡＰ−２タンパク質を生成するプロセスであって、該プロセスは、ポリペプチドの生成に十分な条件下で請求項７に記載の宿主細胞を培養する工程および該培養物から該ＳＴＥＡＰ−２タンパク質を回収する工程を包含する、プロセス。
  10. 請求項１に記載のＳＴＥＡＰ−２タンパク質のアミノ酸１〜２４５、２〜２０４、１００〜１０８、１２１〜４５４、１５３〜１６５、１８２〜４５４、１８３〜３８７、２２７〜２３５、２７６〜４５３、３０６〜３１４、３０７〜３１５、３４５〜３５８、４０２〜４１０、または４１９〜４５４内のエピトープに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
  11. モノクローナルである、請求項１０に記載の抗体またはそのフラグメント。
  12. 請求項１１に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む、組換えタンパク質。
  13. 検出可能なマーカーで標識された、請求項１０または１１に記載の抗体またはそのフラグメント、あるいは請求項１２に記載の組換えタンパク質。
  14. 請求項１３に記載の抗体またはそのフラグメントまたは組換えタンパク質であって、ここで前記検出可能なマーカーが、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素または蛍光化合物、生物発光化合物もしくは化学発光化合物を含む、抗体またはそのフラグメントまたは組換えタンパク質。
  15. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＳｆｖフラグメントである、請求項１３に記載の抗体フラグメント。
  16. ヒト抗体である、請求項１０、１１、１３または１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
  17. マウス抗原結合領域残基およびヒト抗体残基を含む、請求項１０、１１、１３または１４に記載の抗体。
  18. 請求項１１に記載のモノクローナル抗体を産生する、トランスジェニック動物。
  19. 請求項１１に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
  20. 請求項１１に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む、単鎖モノクローナル抗体。
  21. 請求項２０に記載の単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  22. 毒素、放射性同位元素または治療薬剤に結合される、請求項１１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
  23. 請求項２２に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記毒素が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、ゲロニン、マイトジェリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリーチアミシン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、またはグルココルチコイドを含む、モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
  24. 前記放射性同位元素が２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、または１８６Ｒｅである、請求項２２に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
  25. 生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−２タンパク質の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイが該サンプルと請求項１３に記載の抗体を接触させる工程、および該サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−２タンパク質の該抗体への結合を検出する工程を包含する、アッセイ。
  26. 生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイが、以下：
    （ａ）該サンプルと請求項４に記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを接触させる工程；および
    （ｂ）該サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチドと該プローブとのハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出し、ここで該ハイブリダイゼーション複合体の存在が該サンプル中のＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチドの存在を示す、工程、を包含する、アッセイ。
  27. 生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−２ ｍＲＮＡの存在を検出するアッセイであって、該アッセイが、以下：
    （ａ）少なくとも１つのプライマーを使用する逆転写によって該サンプル由来のｃＤＮＡを生成する工程；
    （ｂ）そのように生成される該ｃＤＮＡを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチドを使用して増幅し、それによって該生物学的サンプル内でＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡを増幅する工程；
    （ｃ）該増幅されたＳＴＥＡＰ−２ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、
    を包含し、ここで、該センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用されるＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチドが、図９Ａ〜Ｄに示されるポリヌクレオチド（配列番号７）を増幅し得る、アッセイ。
  28. 薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、請求項１０、１１、１５、１６または１７に記載の抗体もしくはそのフラグメント、請求項１または２に記載のＳＴＥＡＰ−２タンパク質、あるいは請求項４または５に記載のＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  29. 請求項１もしくは２に記載のＳＴＥＡＰ−２タンパク質、または請求項４もしくは５に記載のＳＴＥＡＰ−２ポリヌクレオチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
  30. 患者においてＳＴＥＡＰ−２を発現する癌の発生または進行を阻害する、請求項２９に記載のワクチン組成物。
  31. 患者においてＳＴＥＡＰ−２を発現する細胞の増殖を阻害する、請求項２９に記載のワクチン組成物。
  32. 患者においてＳＴＥＡＰ−２を発現する細胞を殺す、請求項２９に記載のワクチン組成物。
  33. 請求項２に記載のＳＴＥＡＰ−２タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む単鎖モノクローナル抗体をコードするベクターであって、該ベクターが、ガン細胞に該単鎖モノクローナル抗体コード配列を送達し、そして該コードされた単鎖抗体が、該ガン細胞の細胞内に発現される、ベクター。
  34. ＳＴＥＡＰ−２を発現する細胞の増殖を阻害するための、請求項３３に記載のベクター。
  35. ＳＴＥＡＰ−２を発現する細胞を殺すための、請求項３３に記載のベクター。
  36. 図１０Ａ〜Ｅに示されるアミノ酸配列（配列番号１０）を有するＳＴＥＡＰ−３タンパク質。
  37. 請求項３６に記載のタンパク質の少なくとも１０個連続したアミノ酸配列のポリペプチド。
  38. 図１０Ａ〜Ｅに示されるアミノ酸配列（配列番号１０）に、その全長にわたって少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  39. （ａ）図１０Ａ〜Ｅに示されるような配列（配列番号９）を有するポリヌクレオチドであって、ここでＴがまたＵであり得る、ポリヌクレオチド；（ｂ）請求項３６に記載のＳＴＥＡＰ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに十分に相補的であるポリヌクレオチドからなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
  40. 請求項３６に記載のＳＴＥＡＰ−３タンパク質に特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
  41. モノクローナルである、請求項４０に記載の抗体またはそのフラグメント。
  42. 請求項４１に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む、組換えタンパク質。
  43. 検出可能なマーカーで標識された、請求項４０または４１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  44. 請求項４３に記載の抗体またはそのフラグメントまたは請求項４２に記載の組換えタンパク質であって、ここで前記検出可能なマーカーが、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素または蛍光化合物、生物発光化合物もしくは化学発光化合物を含む、抗体またはそのフラグメントまたは組換えタンパク質
  45. 毒素、放射性同位元素または治療薬剤に結合される、請求項４１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
  46. 請求項４１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記毒素が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、ゲロニン、マイトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアミシン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、またはグルココルチコイドを含む、モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
  47. 前記放射性同位元素が２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、または１８６Ｒｅである、請求項４１に記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
  48. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＳｆｖフラグメントである、請求項４１に記載の抗体フラグメント。
  49. ヒト抗体である、請求項４０、４１、および４３〜４８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
  50. マウス抗原結合領域残基およびヒト抗体残基を含む、請求項４０、４１、および４３〜４８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
  51. 請求項４１に記載のモノクローナル抗体を産生する、トランスジェニック動物。
  52. 請求項４１に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
  53. 請求項４１に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む、単鎖モノクローナル抗体。
  54. 請求項５３に記載の単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  55. 生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−３タンパク質の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイが、該サンプルと請求項４３または４４に記載の抗体を接触させる工程、および該サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−３タンパク質の該抗体への結合を検出する工程を包含する、アッセイ。
  56. 生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−３ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイが、以下：
    （ａ）該サンプルと請求項３９に記載のポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを接触させる工程；および
    （ｂ）該サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−３ポリヌクレオチドと該プローブとのハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程、を包含し、ここで該ハイブリダイゼーション複合体の存在が該サンプル中のＳＴＥＡＰ−３ポリヌクレオチドの存在を示す、アッセイ。
  57. 生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−３ ｍＲＮＡの存在を検出するアッセイであって、該アッセイが、以下：
    （ａ）少なくとも１つのプライマーを使用する逆転写によって該サンプル由来のｃＤＮＡを生成する工程；
    （ｂ）そのように生成される該ｃＤＮＡを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてＳＴＥＡＰ−３ポリヌクレオチドを使用して増幅し、それによって該生物学的サンプル内でＳＴＥＡＰ−３ ｃＤＮＡを増幅する工程；
    （ｃ）該増幅されたＳＴＥＡＰ−３ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含し、ここで、該センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用されるＳＴＥＡＰ−３ポリヌクレオチドが、図１０Ａ〜Ｅに示されるポリヌクレオチド（配列番号９）を増幅し得る、アッセイ。
  58. 薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントまたは組換えタンパク質、請求項３６に記載のＳＴＥＡＰ−３タンパク質、あるいは請求項３９に記載のＳＴＥＡＰ−３ポリヌクレオチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
JP2005365540A 1999-12-06 2005-12-19 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法 Withdrawn JP2006204290A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/455,486 US6833438B1 (en) 1999-06-01 1999-12-06 Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001541031A Division JP4827357B2 (ja) 1999-12-06 2000-12-06 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2006204290A true JP2006204290A (ja) 2006-08-10
JP2006204290A5 JP2006204290A5 (ja) 2008-01-31

Family

ID=23809010

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001541031A Expired - Lifetime JP4827357B2 (ja) 1999-12-06 2000-12-06 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法
JP2005365540A Withdrawn JP2006204290A (ja) 1999-12-06 2005-12-19 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法
JP2010212334A Pending JP2011062201A (ja) 1999-12-06 2010-09-22 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001541031A Expired - Lifetime JP4827357B2 (ja) 1999-12-06 2000-12-06 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010212334A Pending JP2011062201A (ja) 1999-12-06 2010-09-22 ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法

Country Status (12)

Country Link
EP (2) EP1244705B1 (ja)
JP (3) JP4827357B2 (ja)
AT (1) ATE456578T1 (ja)
AU (2) AU775366B2 (ja)
CA (1) CA2395053C (ja)
CY (1) CY1111034T1 (ja)
DE (1) DE60043784D1 (ja)
DK (1) DK1244705T3 (ja)
ES (1) ES2340249T3 (ja)
IL (3) IL150018A0 (ja)
PT (1) PT1244705E (ja)
WO (1) WO2001040276A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019532056A (ja) * 2016-09-23 2019-11-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体−薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040141975A1 (en) 1998-06-01 2004-07-22 Raitano Arthur B. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 useful in treatment and detection of cancer
US7037667B1 (en) 1998-06-01 2006-05-02 Agensys, Inc. Tumor antigen useful in diagnosis and therapy of prostate and colon cancer
JP4855577B2 (ja) 1998-06-01 2012-01-18 アジェンシス，インコーポレイテッド ヒト癌で発現される新規蛇行性膜貫通抗原およびその使用
US20060052321A1 (en) 2002-04-05 2006-03-09 Raitano Arthur B Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 useful in treatment and detection of cancer
US6833438B1 (en) 1999-06-01 2004-12-21 Agensys, Inc. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US20030149531A1 (en) 2000-12-06 2003-08-07 Hubert Rene S. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US7189565B2 (en) 2001-03-23 2007-03-13 Fahri Saatcioglu Prostate-specific or testis-specific nucleic acid molecules, polypeptides, and diagnostic and therapeutic methods
US7611892B2 (en) 2000-03-24 2009-11-03 President And Fellows Of Harvard College Prostate-specific or testis-specific nucleic acid molecules, polypeptides, and diagnostic and therapeutic methods
CA2420140A1 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2287186B1 (en) * 2001-09-06 2014-12-31 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled STEAP-1 useful in treatment and detection of cancer
US7494646B2 (en) 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
WO2003087306A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98p4b6 useful in treatment and detection of cancer
EP1569514A4 (en) * 2002-08-16 2007-10-31 SPECIFIC ANTIGEN OF TUMORS, PEPTIDES ASSOCIATED THERETO AND USE THEREOF AS IMMUNOMINAL VACCINES
JP5840351B2 (ja) 2002-09-06 2016-01-06 アジェンシス，インコーポレイテッド 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６と称される、核酸および対応タンパク質
JP2006522122A (ja) * 2003-03-05 2006-09-28 インネクサス バイオテクノロジー インコーポレイテッド 膜貫通抗体誘導型のアポトーシス阻害
BR122018071968B8 (pt) * 2003-11-06 2021-07-27 Seattle Genetics Inc conjugado de anticorpo-droga, composição farmacêutica, artigo de manufatura e uso de um conjugado de anticorpo-droga
CA2557053A1 (en) * 2004-02-19 2005-12-01 Biomedisinsk Innovasjon As Stamp2 nucleic acid molecules, polypeptides, and diagnostic and therapeutic methods
BRPI0418766B8 (pt) 2004-04-22 2021-05-25 Agensys Inc anticorpo ou seu fragmento, vetor, composição farmacêutica, ensaio e método para detectar a presença de proteína steap-1, bem como método para distribuir um agente citotóxico ou um agente de diagnóstico
JP4191189B2 (ja) 2005-12-08 2008-12-03 康生 梅津 がん関連遺伝子活性化能を有するペプチド
WO2008021290A2 (en) * 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
EP2061814B1 (en) 2006-10-27 2012-06-06 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
JP5394246B2 (ja) * 2007-03-30 2014-01-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体及びイムノコンジュゲートとこれらの使用方法
PE20140614A1 (es) 2007-07-16 2014-05-28 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados
CA2692819A1 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2009046739A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
SI2247620T1 (sl) 2008-01-31 2016-09-30 Genentech, Inc. Protitelesa proti CD79b in imunokonjugati in postopki za uporabo
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2014165818A2 (en) 2013-04-05 2014-10-09 T Cell Therapeutics, Inc. Compositions and methods for preventing and treating prostate cancer
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
EP4183806A3 (en) 2014-11-12 2023-08-02 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
IL302822A (en) 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
KR102653141B1 (ko) 2017-03-03 2024-04-01 씨젠 인크. 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법
CN110494452B (zh) 2017-04-03 2023-08-25 豪夫迈·罗氏有限公司 结合steap-1的抗体
WO2019125184A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Auckland Uniservices Limited Use of biomarker in cancer therapy

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5489525A (en) * 1992-10-08 1996-02-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies to prostate cells
US5919652A (en) 1994-11-09 1999-07-06 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules comprising the prostate specific antigen (PSA) promoter and uses thereof
AU5243198A (en) * 1996-10-30 1998-05-22 Uab Research Foundation, The Enhancement of tumor cell chemosensitivity and radiosensitivity using single chain intracellular antibodies
US6048970A (en) * 1998-05-22 2000-04-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate growth-associated membrane proteins
JP4855577B2 (ja) * 1998-06-01 2012-01-18 アジェンシス，インコーポレイテッド ヒト癌で発現される新規蛇行性膜貫通抗原およびその使用
JP2002532083A (ja) * 1998-12-17 2002-10-02 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
US20020015950A1 (en) * 1999-07-07 2002-02-07 Karen Anne Jones Atherosclerosis-associated genes
AU6906800A (en) * 1999-08-17 2001-03-13 Incyte Genomics, Inc. Membrane associated proteins

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019532056A (ja) * 2016-09-23 2019-11-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体−薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用
JP7078609B2 (ja) 2016-09-23 2022-05-31 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体－薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用
JP2022091976A (ja) * 2016-09-23 2022-06-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体－薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1244705A2 (en) 2002-10-02
DE60043784D1 (de) 2010-03-18
WO2001040276A2 (en) 2001-06-07
JP2011062201A (ja) 2011-03-31
ATE456578T1 (de) 2010-02-15
AU2004224964B2 (en) 2008-10-02
PT1244705E (pt) 2010-05-04
WO2001040276A3 (en) 2002-01-10
EP1642909A2 (en) 2006-04-05
CA2395053A1 (en) 2001-06-07
JP2003517306A (ja) 2003-05-27
ES2340249T3 (es) 2010-06-01
IL150018A (en) 2011-04-28
IL150018A0 (en) 2002-12-01
AU2004224964A1 (en) 2004-11-25
CY1111034T1 (el) 2015-08-05
IL199275A0 (en) 2011-07-31
AU775366B2 (en) 2004-07-29
EP1244705B1 (en) 2010-01-27
AU2062901A (en) 2001-06-12
EP1642909A3 (en) 2006-04-12
CA2395053C (en) 2012-05-29
JP4827357B2 (ja) 2011-11-30
DK1244705T3 (da) 2010-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4827357B2 (ja) ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法
AU2008264161B2 (en) Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US8241626B2 (en) Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
JP4373637B2 (ja) ヒト前立腺癌において発現されるｃ型レクチン膜貫通抗原およびその使用
US7834156B2 (en) 125P5C8: tissue specific protein highly expressed in various cancers
US7172898B2 (en) 103P2D6: tissue specific protein highly expressed in various cancers
JP4875671B2 (ja) 前立腺ガンにおいてアップレギュレートされるｇタンパク質結合レセプターおよびその使用
JP4325943B2 (ja) Ｓｇｐ２８関連分子を使用する、癌の診断および治療
JP5501550B2 (ja) ８４ｐ２ａ９：前立腺癌において高度に発現される前立腺および精巣特異的タンパク質
US6924358B2 (en) 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
US20020055478A1 (en) GTP-binding protein useful in treatment and detection of cancer
AU2005202361A1 (en) Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060510

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060612

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071206

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071206

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20090713