ES2524576T3 - Derivados de 6,7-dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona como moduladores de proteína cinasa - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** en el que: R1 es -NR3R4 o -OR3; R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo sustituido opcionalmente seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, arilo, heteroarilo, aril alquilo C1-C6 y heteroaril alquilo C1-C6; R3 y R4, iguales o diferentes, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2- C6, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o R3 y R4 tomados juntos con el átomo de nitrógeno al cual se unen, pueden formar un anillo heterociclilo o heteroarilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido, que contiene opcionalmente un heteroátomo o grupo heteroatómico adicional seleccionado de S, O, N y NH; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

Derivados de 6,7-dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5h)-ona como moduladores de proteína cinasa

5 La presente invención se refiere a ciertos derivados 3,5-disustituidos de compuestos 6,7-dihidroimidazo[1,5a]pirazin-8(5H)-ona, los cuales modulan la actividad de las proteína cinasas. Por consiguiente, los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento de enfermedades causadas por una actividad proteína cinasa desregulada. La presente invención se refiere también a métodos para la preparación de estos compuestos, bibliotecas combinatorias de los mismos, a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, y al

10 uso de estos compuestos en métodos de tratamiento de enfermedades.

La disfunción de las proteína cinasas (PKs, del inglés protein kinases) es el rasgo distintivo de numerosas enfermedades. Una gran parte de los oncogenes y proto-oncogenes implicados en los cánceres humanos codifican para PKs. Las actividades mejoradas de las PKs también están involucradas en muchas enfermedades no malignas,

15 como la hiperplasia benigna de próstata, la adenomatosis familiar, la poliposis, la neurofibromatosis, la psoriasis, la proliferación de células lisas vasculares asociada con aterosclerosis, la fibrosis pulmonar, la artritis, la glomerulonefritis y la estenosis y reestenosis post-quirúrgica.

Las PKs también están implicadas en estados inflamatorios y en la multiplicación de virus y parásitos. Las PKs 20 pueden jugar también un papel importante en la patogénesis y el desarrollo de trastornos neurodegenerativos.

Como referencia general sobre el mal funcionamiento o falta de regulación de las PKs, véase por ejemplo, Current Opinión in Chemical Biology 1999, 3, 459 – 465 y Carcinogenesis 2008, 29, 1087 – 191.

25 Los derivados de imidazol fusionados como inhibidores del factor X de coagulación sanguínea activado y útiles como anticoagulantes, se dan a conocer en la solicitud de patente WO2004048363 a nombre de Takeda Chemical Industries, Ltd., Japón. Los derivados de 7,8-dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8-ona con efecto inotrópico se dan a conocer en la solicitud de patente EP152077 a nombre de USV Pharmaceutical Corp., EUA.

30 Los presentes inventores han descubierto ahora que los nuevos compuestos de fórmula (I), descritos abajo, son inhibidores cinasa y por tanto son útiles en terapia como agentes antitumorales.

Correspondientemente, un primer objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto 6,7dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona de fórmula (I):

en el que:

40 R1 es –NR3R4 o –OR3;

R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo sustituido opcionalmente seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, arilo, heteroarilo, aril alquilo C1-C6 y heteroaril alquilo C1-C6;

45 R3 y R4, iguales o diferentes, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o R3 y R4 tomados juntos con el átomo de nitrógeno al cual se unen, pueden formar un anillo heterociclilo o heteroarilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido, que

50 contiene opcionalmente un heteroátomo o un grupo heteroatómico adicional seleccionado entre S, O, N y NH; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

La presente invención proporciona también métodos de síntesis de compuestos 3,5-disustituidos-6,755 dihidroimidazol[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona, representados por la fórmula (I), preparados mediante un proceso que

consiste en transformaciones sintéticas estándar.

La invención proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define arriba, para su uso como medicamento. En particular, la presente invención proporciona un compuesto de

5 fórmula (I) como se define arriba para el tratamiento de enfermedades causadas por y/o asociadas con la actividad proteína cinasa desregulada, en particular ABL, ACK1, AKT1, ALK, AUR1, AUR2, BRK, BUB1, CDC7/DBF4, CDK2/CYCA, CHK1, CK2, EEF2K, EGFR1, EphA2, EphB4, ERK2, FAK, FGFR1, FLT3, GSK3beta, Haspin, IGFR1, IKK2, IR, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, LCK, LYN, MAPKAPK2, MELK, MET, MNK2, MPS1, MST4, NEK6, NIM1, P38alpha, PAK4, PDGFR, PDK1, PERK, PIM1, PIM2, PKAalpha, PKCbeta, PLK1, RET, ROS1, SULU1, Syk, TLK2, TRKA, TYK, VEGFR2, VEGFR3, ZAP70.

Un uso farmacéutico preferido de un compuesto de fórmula (I) de la presente invención es para el tratamiento de una enfermedad causada por y/o asociada con la actividad proteína cinasa desregulada, seleccionada del grupo consistente en cáncer, infección vírica, prevención del desarrollo del SIDA en individuos infectados con VIH,

15 trastornos proliferativos celulares, trastornos autoinmunes y neurodegenerativos.

Otro uso farmacéutico preferido de los compuestos de la presente invención es para el tratamiento de tipos específicos de cáncer, incluyendo pero sin limitarse a: carcinoma, como el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, esófago, vesícula, ovario, páncreas, estomago, cerviz, tiroides, próstata, y piel, incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfático, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas y linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo las leucemias mielogénicas aguda y crónica, incluyendo síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y

25 rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentoso, queratoxantoma, cáncer folicular de tiroides y sarcoma de Kaposi.

Otro uso farmacéutico preferido de los compuestos de la presente invención es para el tratamiento de los trastornos de proliferación celular específicos, como por ejemplo, la hiperplasia benigna de próstata, la adenomatosis familiar, la poliposis, la neurofibromatosis, la psoriasis, la proliferación de células lisas vasculares asociada con aterosclerosis, la fibrosis pulmonar, la artritis, la glomerulonefritis y la estenosis y reestenosis post-quirúrgica.

De forma análoga, la presente invención proporciona también un método para el tratamiento de cualquiera de las

35 enfermedades indicadas arriba. Los compuestos de esta invención pueden ser útiles en la inhibición de la angiogénesis y la metástasis tumoral, así como en el tratamiento del rechazo en el trasplante de órganos y la enfermedad injerto contra huésped.

La presente invención proporciona además un método de tratamiento que comprende un compuesto de fórmula (I) en combinación con terapia de radiación o régimen de quimioterapia para un uso simultáneo, separado o secuencial en terapia contra el cáncer. Además, la invención proporciona un método in vitro para la inhibición de la actividad proteína cinasa que comprende el contacto de dicha proteína cinasa con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I).

45 La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende uno o varios compuestos de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula

(I)

en combinación con agentes citostáticos o citotóxicos conocidos, agentes tipo antibiótico, agentes de intercalado

o perjudiciales para el ADN, agentes basados en platino, agentes alquilantes, agentes anti-metabolito, agentes hormonales, agentes anti-hormonales, como anti-estrógenos, anti-andrógenos e inhibidores de la aromatasa, agentes inmunológicos, agentes tipo interferona, inhibidores de la ciclooxigenasa (p. ej. inhibidores de COX-2), inhibidores de metaloproteasa matriz, inhibidores de tirosina cinasa, otros inhibidores cinasa, agentes receptores del

55 factor anti-crecimiento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogénesis (p. ej. inhibidores de la angiogénesis), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de la ruta de transducción de señal ras-raf, inhibidores del ciclo celular, otros inhibidores del cdks, agentes de unión a tubulina, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, inhibidores de cinesinas, anticuerpos monoclonales terapéuticos, inhibidores de mTOR, inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de la respuesta hipóxica y similares, para el uso simultáneo, separado o secuencial en terapia contra el cáncer. Adicionalmente, la invención proporciona un producto

o kit que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define arriba, o composiciones farmacéuticas del mismo y uno o varios agentes quimioterapéuticos, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en la terapia contra el cáncer.

65 Además, la invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define arriba, en la preparación de un medicamento con actividad antitumoral.

Finalmente, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define arriba, para el uso en un método de tratamiento contra el cáncer.

5 Si no se especifica lo contrario, al referirse a los compuestos de fórmula (I) per se así como a cualquier composición farmacéutica de los mismos o a cualquier método terapéutico de tratamiento que los comprenda, la presente invención incluye todos los hidratos, solvatos, N-óxidos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención.

Los N-óxidos son compuestos de fórmula (I) en los que el nitrógeno y el oxígeno están unidos a través de un enlace dativo.

Todas las fórmulas de isómeros quirales u otras formas de isómeros que incluyen enantiómeros y diastereómeros, están destinadas a cubrirse aquí. Los compuestos que contienen un centro quiral se pueden usar como mezcla

15 racémica o como una mezcla enriquecida enantioméricamente, o la mezcla racémica se puede separar usando técnicas bien conocidas y se puede usar un enantiómero individual solo.

En los casos en los que los compuestos pueden existir en formas tautoméricas, como los tautómeros ceto-enol, cada forma tautomérica se contempla como si se incluyera en esta invención, tanto si existe en equilibrio o está predominantemente en una forma.

En la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, con el término “alquilo C1-C6 lineal o ramificado” se indica cualquier grupo como, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares.

25 Con el término “alquenilo C2-C6 lineal o ramificado” o “alquinilo C2-C6 lineal o ramificado” se indica cualquiera de los grupos alquenilo o alquinilo insaturados con 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo incluyendo vinilo, alilo, 1propenilo, isopropenilo, 1-, 2-o 3-butenilo, pentenilo, hexenilo, etinilo, 1-o 2-propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo y similares.

Con el término “cicloalquilo C3-C6” se indica, a menos que se especifique lo contrario, un anillo de carbono monocíclico de 3 a 6 miembros, el cual puede contener uno o varios enlaces dobles pero no tiene un sistema electrónico π completamente conjugado. Son ejemplos de grupos cicloalquilo, sin limitación, ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexeno y ciclohexadieno.

35 Con el término “heterociclilo” se indica un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 3 a 7 miembros, en el que uno o varios átomos de carbono se sustituyen por heteroátomos como nitrógeno, oxígeno y azufre. Son ejemplos no limitantes de grupos heterociclilo, por ejemplo, pirano, pirrolidina, pirrolina, imidazolina, imidazolidina, pirazolidina, pirazolina, tiazolina, tiazolidina, dihidrofurano, tetrahidrofurano, 1,3-dioxolano, piperidina, piperazina, morfolina y similares.

Con el término “arilo” se indica un hidrocarburo mono-, bi-o policarbocíclico con sistemas de 1 a 4 anillos, opcionalmente también fundidos o unidos entre sí mediante enlaces sencillos, en el que al menos uno de los anillos carbocíclicos es “aromático”, refiriéndoses el término “aromático” a un sistema electrónico π completamente

45 conjugado. Son ejemplos no limitantes de dichos grupos arilo, los grupos fenilo, α-o β-naftilo o bifenilo.

Con el término “heteroarilo” se indican anillos heterocíclicos aromáticos, típicamente heterociclos de 5 a 7 miembros con 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O o S; el anillo heteroarilo opcionalmente también puede estar fundido o unido a anillos carbocíclicos y heterocíclicos aromáticos o no aromáticos. Son ejemplos no limitantes de dichos grupos heteroarilo, por ejemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, fenil-pirrolilo, furilo, fenil-furilo, oxazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, tienilo, benzotienilo, isoindolinilo, benzoimidazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, 1,2,3-triazolilo, 1-fenil-1,2,3-triazolilo, 2,3-dihidroindolilo, 2,3dihidrobenzofuranilo, 2,3-dihidrobenzotiofenilo; benzopiranilo, 2,3-dihidrobenzoxazinilo, 2,3-dihidroquinoxalinilo y similares.

55 De acuerdo con las medidas previstas para R2, R3 y R4, cualquiera de los grupos anteriores puede estar sustituido opcionalmente también en cualquiera de sus posiciones libres por uno o varios grupos, por ejemplo 1 a 6 grupos, seleccionados entre: halógeno, nitro, grupos oxo (=O), carboxi, ciano, alquilo C1-C6, alquilo polifluorado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, heterociclilo, arilo, heteroarilo; grupos amino y derivados de los mismos, como por ejemplo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, ureido, alquilureido o arilureido; grupos carbonilamino y derivados de los mismos, como por ejemplo, formilamino, alquilcarbonilamino, alquenilcarbonilamino, arilcarbonilamino, alcoxicarbonilamino; grupos hidroxi y derivados de los mismos, como por ejemplo, alcoxi, alcoxi polifluorado, ariloxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, cicloalqueniloxi o alquilidenaminoxi; grupos carbonilo y derivados de los mismos, como por ejemplo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo,

65 ariloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo; derivados sulfurados, como por ejemplo, alquiltio, ariltio, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilsulfinilo, arilsulfinilo, arilsulfoniloxi,

aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo o dialquilaminosulfonilo.

A su vez, siempre que sea apropiado, cada uno de los sustituyentes anteriores puede estar sustituido también por uno o varios de los grupos mencionados anteriormente. 5 En la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, con el término “ciano” se indica un residuo –CN.

Con el término “nitro” se indica un grupo –NO2.

10 Con el término “halógeno” se indica un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.

Con el término “alquilo o alcoxi polifluorado” se indica un grupo alcoxi o alquilo C1-C6 lineal o ramificado, como se define arriba, en el que más de un átomo de hidrógeno se sustituye por átomos de flúor, como por ejemplo, trifluorometilo, trifluorometoxi, 2,2,2-trifluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetoxi, 1,2-difluoroetilo, 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropil-2

15 ilo, y similares.

A partir de todo lo anterior, resulta claro para un experto en la materia que cualquier grupo cuyo nombre se ha identificado como un nombre compuesto, como por ejemplo, cicloalquilalquilo, arilalquilo, heterociclilalquilo, alcoxi, alquiltio, ariloxi, arilalquiloxi, alquilcarboniloxi y similares, se tiene que entender como construido de forma

20 convencional a partir de las partes de las que deriva. Por tanto, como ejemplo, los términos heterociclil-alquilo y cicloalquil-alquilo representan un grupo alquilo lineal o ramificado que está sustituido por un grupo heterocíclico o cicloalquilo, respectivamente, como se define arriba.

El término “sales farmacéuticamente aceptables” abarca sales usadas comúnmente para formar sales metálicas

25 alcalinas y para formar sales de adición de ácidos libres o bases libres. La naturaleza de las sales no es crítica, en el supuesto de que es farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención se pueden preparar a partir de un ácido inorgánico o a partir de un ácido orgánico. Son ejemplos de dichos ácidos inorgánicos, el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido nítrico, ácido carbónico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados se

30 pueden seleccionar a partir de clases de ácidos orgánicos alifáticos, cicloalifáticos, aromáticos, aralifáticos, heterocíclicos, carboxílicos y sulfónicos, siendo ejemplos de los cuales, ácido fórmico, acético, trifluoroacético, propiónico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, glucurónico, maleico, fumárico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, antranílico, mesílico, salicílico, p-hidroxibenzoico, fenilacético, mandélico, embónico (pamoico), metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, pantoténico, toluenosulfónico, 2

35 hidroxietanosulfónico, sulfanílico, esteárico, ciclohexilaminosulfónico, algénico, hidroxibutírico, galactárico y galacturónico. Las sales de adición básica farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención incluyen sales metálicas de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y cinc o sales orgánicas hechas de N,N’-dibenziletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (Nmetil-glucamina) y procaína. Todas estas sales se pueden preparar por medios convencionales a partir de los

40 compuestos correspondientes de la presente invención, por ejemplo por reacción con el ácido o la base apropiados.

Son una clase preferida de compuestos de la presente invención aquellos de fórmula (I) en los que R1 es –NH2 o NHR3 y R3 es un grupo alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C6 lineal o ramificado o es un grupo arilo o arilalquilo opcionalmente sustituido. También se prefieren los compuestos de fórmula (I) en los que R2 es hidrógeno o un grupo

45 arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.

Para una referencia a cualquier compuesto específico de fórmula (I) de la invención, opcionalmente en forma de sales farmacéuticamente aceptables, véase la sección experimental.

50 La presente invención proporciona también un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el proceso comprende:

a)descarboxilación de un compuesto de fórmula (II):

b)reacción del compuesto resultante de fórmula (III):

con un compuesto de fórmula (IV) o una sal del mismo:

en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6, de modo que se obtiene un compuesto de fórmula (I):

en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6 y R2 es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y, si es necesario o se desea, se realizan una o varias de las etapas adicionales siguientes:

15 -Separación del compuesto de fórmula (I) en los isómeros individuales;

-

Conversión de un compuesto de fórmula (I) en diferentes compuestos de fórmula (I) mediante introducción de la fracción imidazol de un grupo R2 como se define arriba, distinto del hidrógeno;

20 -Conversión de un compuesto de fórmula (I) en un compuesto diferente de fórmula (I) mediante sustitución del grupo –OR3 con un grupo R1 diferente como se define arriba;

-

Conversión de un compuesto de fórmula (I) en una sal farmacéuticamente aceptable o conversión de una sal en el compuesto (I) libre.

25 La presente invención proporciona también un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (III) como se define arriba, caracterizado por que el proceso comprende:

a)descarboxilación de un compuesto de fórmula (II) como se define arriba.

30 La presente invención proporciona además un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el proceso comprende:

b)reacción de un compuesto de fórmula (III) como se define arriba con el compuesto de fórmula (IV) o una 35 sal del mismo como se define arriba de manera que se obtiene un compuesto de fórmula (I):

en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6 y R2 es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y, si es necesario o se desea, se realizan una o varias de las etapas adicionales siguientes: 5 -Separación del compuesto de fórmula (I) en los isómeros individuales;

-Conversión de un compuesto de fórmula (I) en diferentes compuestos de fórmula (I) mediante introducción de la fracción imidazol de un grupo R2 como se define arriba, distinto del hidrógeno;

10 -Conversión de un compuesto de fórmula (I) en un compuesto diferente de fórmula (I) mediante sustitución del grupo –OR3 con un grupo R1 diferente como se define arriba;

-

Conversión de un compuesto de fórmula (I) en una sal farmacéuticamente aceptable o conversión 15 de una sal en el compuesto (I) libre.

Las conversiones de un compuesto de fórmula (I) en otro compuesto de fórmula (I) se pueden realizar por ejemplo con una o varias de las reacciones siguientes:

20 c)reacción de un compuesto de fórmula (I) en el que R3 es alquilo C1-C6 y R2 es hidrógeno con un compuesto de fórmula R2-Z (V), en el que R2 se define como arriba pero no es hidrógeno y Z es un halógeno, para obtener un compuesto de fórmula (I):

25 en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6 y R2 se define como arriba pero no es hidrógeno;

d.1) hidrólisis ácida o básica de un compuesto de fórmula (I) en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6 para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OH, o una sal de los mismos;

30 d.2) transesterificación de un compuesto de fórmula (I) en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6, mediante reacciones con un compuesto de fórmula R3-OH (VI) en el que R3 es un alquilo C1-C6 diferente para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R3 es un alquilo C1-C6 diferente;

35 d.3) aminolisis de un compuesto de fórmula (I) en el que R3 es un alquilo C1-C6, por reacción con un compuesto de fórmula H – NR3R4 (VII) en el que R3 y R4 son como se define arriba para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es NR3R4 y R3 y R4 son como se define arriba;

40 d.4) esterificación de un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OH o una sal del mismo mediante reacciones con un compuesto de fórmula (VI) como se define arriba, para obtener un compuesto de fórmula

(I) en el que R1 es –OR3 y R3 es como se define arriba pero no es hidrógeno;

d.5) amidación de un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OH o una sal del mismo mediante 45 reacciones con un compuesto de fórmula (VII) como se define arriba, para obtener un compuesto de

fórmula (I) en el que R1 es –NR3R4 y R3 y R4 son como se define arriba;

Asimismo, la conversión de un compuesto de fórmula (I) en una sal farmacéuticamente estable del mismo o, alternativamente, la conversión en el compuesto libre (I) de una sal correspondiente, de acuerdo con procedimientos 5 bien conocidos en la técnica, se encuentra aún dentro del alcance de la invención.

Cuando se preparan los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con cualquier variante del proceso, los cuales se pretende que se encuentren dentro del alcance de la invención, los grupos funcionales opcionales en los materiales de partida, los reactivos o los intermedios de los mismos, los cuales podrían dar lugar a reacciones secundarias no

10 deseadas, se deben proteger apropiadamente de acuerdo con técnicas convencionales.

La presente invención proporciona además procesos para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el proceso comprende:

15 b’)reacción de un compuesto de fórmula (III´):

en el que R2 es como se define arriba pero no es hidrógeno o un grupo precursor apropiado del mismo, con un compuesto de fórmula (IV) o una sal del mismo como se define arriba, para obtener un compuesto de fórmula (I):

25 en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6 y R2 es como se define arriba pero no es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y, si es necesario o se desea, se realizan una o varias de las etapas adicionales necesarias descritas arriba, incluyendo la conversión de una fracción precursora de un grupo R2 como se define arriba diferente de hidrógeno en el grupo R2 deseado mediante las reacciones químicas adecuadas.

30 Los materiales de partida del proceso objeto de la presente invención, comprendiendo cualquier posible variante, así como cualquier reactivo de los mismos, son compuestos conocidos y si no están disponibles comercialmente per se, se pueden preparar según métodos bien conocidos.

35 Por ejemplo, los compuestos de fórmula (II), (III) y (III´) están disponibles comercialmente o se pueden preparar según métodos conocidos.

Los compuestos de fórmula (IV) se preparan partiendo de los correspondientes 4-bromocrotonatos que a su vez están disponibles comercialmente o se pueden preparar según métodos bien conocidos. 40 Por ejemplo, el 4-amino etilcrotonato se puede preparar mediante las etapas siguientes:

e)reacción de etil-4-bromo etilcrotonato de fórmula (VIII):

con sal sódica de diformilimida comercialmente disponible de fórmula (IX):

f)hidrólisis en condiciones ácidas del compuesto resultante de fórmula (X):

para obtener un compuesto de fórmula (IV) en el que R3 es etilo.

10 Los compuestos de fórmula (V), (VI) y (VII) son conocidos o se obtienen fácilmente de acuerdo con métodos conocidos, para una referencia general véase: Smith, Michael – March’s Advanced Organic Chemistry: reactions mechanisms and structure – 5ª edición, Michael B. Smith y Jerry March, John Wiley & Sons Inc., Nueva York (NY), 2001.

15 De acuerdo con la etapa (a) del proceso, la descarboxilación del compuesto de fórmula (II) se puede realizar de varias formas según métodos diferentes. Preferentemente, se lleva a cabo en un disolvente apropiado como 1-metilpirrolidin-2-ona o dimetilacetamida (DMA), a una temperatura entre 100º y 170º durante un periodo de 4 a 48 h bajo calefacción convencional o irradiación por microondas.

20 De acuerdo con la etapa (b) y (b´) del proceso, la conversión del compuesto de fórmula (III) o (III´) en un compuesto de fórmula (I) como se define arriba se puede realizar de varias formas según métodos diferentes. Dichos métodos son útiles para obtener derivados amido del correspondiente ácido carboxílico y para ciclar el intermedio resultante en el compuesto deseado de fórmula (I) como se define arriba, por ejemplo en presencia de una base. Preferentemente, el ácido carboxílico de fórmula (III) o (III´) se activa primeramente a cloruro de ácido, mediante

25 reacción con cloruro de tionilo u oxalilo, y después reacciona con una sal de amonio, preferentemente sal trifluoroacetato de un compuesto de fórmula (IV), y al mismo tiempo se cicla en presencia de piridina bajo reflujo durante un tiempo que va de 6 a 8 horas. De acuerdo con la etapa de conversión (c), la preparación de un derivado de fórmula (I) en la que R2 es como se define arriba pero no hidrógeno, partiendo del compuesto de fórmula (I) en el que R2 es hidrógeno, se puede llevar a cabo de diversas maneras, de acuerdo con métodos convencionales.

30 Preferentemente la reacción de la etapa (c) se lleva a cabo mediante una activación del enlace C-H entre el compuesto de fórmula (V) como se define arriba con un compuesto de fórmula (I) en el que R2 es H, para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R2 es un grupo como se define arriba pero no es un átomo de hidrógeno, en presencia de un catalizador de Pd y un aditivo como yoduro de cobre (I), usando N,N-dimetilformamida o N,Ndimetilacetamida como solvente, a una temperatura de 120º a 165ºC durante un tiempo entre 3 y 5 horas si la

35 reacción se realizó bajo irradiación de microondas, o 18-36 horas bajo calefacción convencional.

De acuerdo con cualquiera de las etapas (d.1 – d.5) la conversión de un compuesto de fórmula (I) en otro compuesto de fórmula (I) se puede llevar a cabo de formas variadas, según métodos diferentes.

40 Preferentemente de acuerdo con la etapa (d.1) del proceso, la hidrólisis de un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OCH2CH3, para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OH se puede llevar a cabo bajo condiciones ácidas o básicas. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo bajo condiciones básicas. De acuerdo con las condiciones operativas empleadas, el compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OH se puede obtener bien en su forma ácida o, alternativamente, como una sal.

45 Preferentemente de acuerdo con la etapa (d.2) del proceso, la transesterificación de un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OCH2CH3, para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R3 es un alquilo distinto de etilo, se puede llevar a cabo por reacción con un compuesto de fórmula (VII) como se define arriba en un disolvente apropiado, como el compuesto de fórmula (VII), como se define arriba él mismo o dioxano a temperatura de reflujo,

50 opcionalmente en presencia de un catalizador apropiado basado en metal, como óxido de dibutilina o alcóxidos de titanio, como por ejemplo, etóxido de titanio (IV), isopropóxido de titanio (IV) y similares.

Preferentemente de acuerdo con la etapa (d.3) del proceso, la aminolisis de un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OCH2CH3, para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –NR3R4, se puede llevar a cabo en un

disolvente apropiado como dioxano o diclorometano, opcionalmente en presencia de un catalizador adecuado basado en metal, como trimetil aluminio o DABAL.

Preferentemente de acuerdo con la etapa (d.4) del proceso, la esterificación de un compuesto de fórmula (I) en el

5 que R1 es un grupo –OH, para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OR3, se puede llevar a cabo en presencia de un agente de condensación apropiado, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3´dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (DHBTOH), Obenzotriazoliltetrametilisouronio tetrafluoroborato (TBTU), o benzotriazol-1-iloxitripirrolidinfosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), en un solvente apropiado como diclorometano, dimetilformamida.

10 Preferentemente de acuerdo con la etapa (d.5) del proceso, la amidación de un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –OH para obtener un compuesto de fórmula (I) en el que R1 es –NR3R4 se puede llevar a cabo de diversas formas, de acuerdo con métodos convencionales para la obtención de derivados amido a partir de los ácidos correspondientes. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo mediante reacción con el compuesto de fórmula (VII)

15 como se define arriba tras la activación de la función carboxílica del compuesto de fórmula (I) por reacción con cloruro de tionilo u oxalilo, TFFH o alternativamente en presencia de un agente de condensación adecuado, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3´-dimetilaminopropil)carbodiimmida (EDC), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4oxo-1,2,3-benzotriazina (HBTOH), tetrafluoroborato de O-benzotriazoliltetrametilisouronio (TBTU) o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinfosfonio (PyBOP), en un disolvente apropiado como diclorometano, y/o

20 dimetilformamida.

Además de lo anterior, los compuestos de fórmula (I) se pueden preparar ventajosamente de acuerdo con técnicas de química combinatoria ampliamente conocidas por la técnica, completando las reacciones mencionadas anteriormente entre los intermedios de forma secuencial y trabajando bajo condiciones de síntesis en fase sólida

25 (SPS), en las que la resina es una resina poliestirénica disponible comercialmente que incluye, por ejemplo, resina de Wang, resina tritilo, resina Cl-tritilo, resina amida de Rink, resina Tentagel OH y derivados de las mismas.

Claramente, trabajando de acuerdo con las técnicas de química combinatoria como se indica previamente, se pueden obtener una pluralidad de compuestos de fórmula (I).

30 Así, otro objeto de la presente invención es una biblioteca de dos o más compuestos de fórmula (I)

35 en la que R1 y R2 son como se define arriba.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la biblioteca mencionada anteriormente comprende los compuestos de fórmula (I) en los que R1 es –NH2 o –NHR3, y R3 es un grupo alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C6 lineal o ramificado o es un grupo arilo o arilalquilo opcionalmente sustituido.

40 También se prefiere una biblioteca de compuestos de fórmula (I) en los que R2 es hidrógeno o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.

Para una referencia general acerca de las bibliotecas anteriores de los compuestos de fórmula (I) véase la sección 45 experimental.

Por todo lo anterior, resulta evidente para el experto en la materia que una vez que se prepara de este modo una biblioteca de derivados de 6,7-dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona, por ejemplo consistente en treinta y ocho compuestos de fórmula (I), dicha biblioteca puede ser muy ventajosa cuando se usa para el cribaje frente a cinasas

50 dadas, como se ha indicado anteriormente.

Véase, como referencia general a bibliotecas de compuestos y usos de los mismos como herramientas para el cribaje de actividades biológicas, J. Med. Chem. 1999, 42, 2373-2382; y Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 (2000), 223

226.

FARMACOLOGÍA

La actividad inhibidora de inhibidores putativos de cinasa y la potencia de los compuestos seleccionados se

5 determina mediante un método de valoración basado en el uso de Kinase-Glo® Luminiscent Kinase Assay (disponible comercialmente en Promega Corporatión y descrito en Koresawa, M y Okabe. T. (2004) High-throughput screening with quantitatión of ATP consumption: A universal non-radioisotope, homogeneous assay for protein kinase. Assay Drug Dev. Technol. 2, 153-60).

La reducción de ATP como resultado de la actividad cinasa se puede monitorizar de forma altamente sensible mediante el uso de Kinase-Glo® y Kinase-Glo® Plus Reagent, los cuales usan luciferina, oxígeno y ATP como sustratos en una reacción que produce oxiluciferina y luz.

Las formas cortas y abreviaturas usadas aquí tienen el significado siguiente:

15 ATP Trifosfato de adenosina BSA Albúmina de suero bovino Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol Hepes Ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N’-(2-etanosulfónico) DTT treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol TFFH hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio THF tetrahidrofurano MTBE éter metil terciario butil DIPEA diisopropiletilamina

25 PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidin)fosfonio DABAL aducto de trimetilaluminio y 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano EDC 1-etil-3-(3´-dimetilaminopropil)carbodiimida DHBTOH 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina TFA ácido trifluoroacético TMOF trimetil orto formiato DCE dicloroetano DCM diclorometano DMF dimetilformamida DMA dimetilacetamida

35 DMSO dimetilsulfóxido KD akiloDalton mg miligramo µg microgramo ng nanogramo L litro mL mililitro µl microlitro M molar mM milimolar

45 µM micromolar nM nanomolar

r.t. tiempo de retención

Las condiciones de reacción de cinasa dependen de la diana (enzima) y por tanto sufren adaptaciones individuales. La Kinase-Glo® Luminiscent Kinase Assay se puede usar virtualmente con cualquier combinación de cinasa y sustrato.

Las condiciones tampón también pueden variar dependiendo de la cinasa de interés (p. ej. para PKA se usa una composición de Tris pH 7,5 40 mM, MgCl2 20 mM, BSA 0,1 mg/ml, en 50 µl de volumen final). Típicamente el 55 intervalo de titulación del ATP es 0,1 µM a 10 µM.

El sustrato cinasa óptimo da como resultado el mayor cambio en la luminiscencia, al comparar los pocillos de reacción con cinasa con los pocillos sin cinasa.

La cantidad óptima de cinasa se determina haciendo dos diluciones en serie a través de placas usando la cantidad óptima de ATP y el sustrato cinasa óptimo. La cantidad óptima de cinasa que se debe usar en los posteriores cribajes de compuestos y determinaciones de IC50 es la cantidad necesaria para que la luminiscencia se encuentre en el intervalo lineal de la curva de titulación de cinasa (respuesta sigmoidal según la dosis).

65 Ensayo Kinase-Glo® robotizado

Este ensayo se estableció para la medición de la actividad y/o la inhibición de cinasa. Es homogéneo, adecuado para todo tipo de proteína cinasas, es rápido y está exento de radioactividad.

Se estableció el ensayo en placas de 384 pocillos: la mezcla de ensayo consistió en:

5 1) 3x mezcla de enzimas (realizado en tampón cinasa 3X), 5 µl/pocillo 2) 3x mezcla de sustrato y ATP (realizado en D2O), 5 µl/pocillo 3) 3x compuesto de fórmula (I) (diluido en D2O – DMSO al 3%), 5 µl/pocillo

Como resultado, se evaluó el porcentaje de inhibición a 10 µM para cada compuesto ensayado: véase abajo la dilución del compuesto y el esquema del ensayo. Cada enzima tuvo su propia constitución de tampón, tipo de sustrato y concentración. En cambio, el tiempo de incubación fue 90 min para todas las dianas.

Los compuestos de ensayo se introdujeron en placas de 96 pocillos como una solución 1 mM en DMSO 100%. Las

15 placas se diluyeron hasta 30 µM en D2O, DMSO 3%; 4 placas se reorganizaron en placas de 384 pocillos dispersando 5 µl de cada placa de 96 pocillos en los cuatro cuadrantes de una placa de 384 pocillos. En el pocillo P23 y P24 se añadió el estándar interno inhibidor estaurosporina.

Esquema del ensayo

Las placas de ensayo se llenaron primero con 5 µl de dilución del compuesto (30 µM, correspondiente a dilución 3X) y después se cargaron sobre una estación robotizada junto con un depósito para la mezcla de enzima (3X) y uno para la mezcla de ATP (3X), específico para cada diana estudiada.

25 Para iniciar el estudio, el robot aspiró 5 µl de mezcla ATP/sustrato, creó un espacio de aire dentro de las puntas (5 µl) y aspiró 5 µl de la mezcla de enzima. El posterior dispensado en las placas de ensayo permitió el inicio de la reacción cinasa tras 3 ciclos de mezclado, realizado por el propio robot pipeteando arriba y abajo. En este punto, se restauró la concentración correcta para todos los reactivos.

El robot incubó las placas durante 90 minutos a temperatura ambiente y después paró la reacción mediante pipeteado de 15 µl de reactivo Kinase-Glo® en la mezcla de reacción. Se realizaron tres ciclos de mezclado inmediatamente después de la adición del reactivo.

El principio de la técnica Kinase-Glo® es la presencia en la mezcla de reactivo de oxígeno, luciferina y enzima

35 luciferasa: en presencia del ATP que queda de la reacción de cinasa, se produce oxi-luciferina con emisión de luz, que depende directamente de la cantidad de ATP. Para obtener rendimientos óptimos de esta técnica, la reacción de cinasa debería utilizar al menos un 15-20% del ATP disponible.

Tras otros 60 minutos de incubación para estabilizar la señal luminiscente, las placas se leyeron en un instrumento ViewLux®. Los datos se analizaron usando el paquete de software Assay Explorer® que proporciona datos de porcentajes de inhibición.

Como ejemplo, aquí se presentan las condiciones de ensayo usadas para probar los compuestos de fórmula (I) frente a ALKtide YFF APCo cinasa;

45 Concentración de ATP: 1 µM

Concentración de enzima: 100 nM

Tampón de reacción: Hepes 50 mM pH 7,5, MgCl2 5 mM, MnCl2 1 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 uM, BSA 0,2 mg/ml

Procedimiento de ensayo: añadir 5 ul de compuesto de fórmula (I) (3x), añadir 5 µl de mezcla (3x) ATP/S en tampón 1x; añadir 5 µl de enzima en tampón 2x+3x BSA; para el blanco, añadir 5 µl de tampón 2x+3x BSA sin enzima. Después de 90 minutos de incubación, añadir 15 µl/pocillo de reactivo Kinase-Glo. Tras 60-90 minutos de incubación

55 para estabilizar la señal de luminiscencia, se leen las placas en un instrumento ViuwLux.

La actividad inhibidora de los inhibidores cinasa putativos y la potencia de los compuestos seleccionados se determinan también usando un ensayo de trans-fosforilación.

Los péptidos específicos o sustratos de proteína se trans-fosforilan mediante su cinasa ser-thr o tyr específica en presencia de ATP marcado con 33P-γ-ATP, y en presencia de su propio tampón y cofactores óptimos. Al final de la reacción de fosforilación, más del 98% del ATP no marcado y el ATP radioactivo se captura mediante un exceso de resina dowex de intercambio iónico; después, la resina se asienta por gravedad en el fondo de la placa de reacción. Posteriormente se retira el sobrenadante y se transfiere a una placa de conteo, y se evalúa por conteo β. Las 65 condiciones de reacción dependen de la diana (enzima) y por tanto sufren adaptaciones individuales. Las condiciones tampón también pueden variar dependiendo de la cinasa de interés. El ensayo se puede usar con

virtualmente cualquier cinasa y combinación de sustrato y es adecuado para todo tipo de proteína cinasas, como ABL, ACK1, AKT1, ALK, AUR1, AUR2, BRK, BUB1, CDC7/DBF4, CDK2/CYCA, CHK1, CK2, EEF2K, EGFR1, EphA2, EphB4, ERK2, FAK, FGFR1, FLT3, GSK3beta, Haspin, IGFR1, IKK2, IR, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, LCK, LYN, MAPKAPK2, MELK, MET, MNK2, MPS1, MST4, NEK6, NIM1, P38alpha, PAK4, PDGFR, PDK1, PERK, PIM1, PIM2,

5 PKAalpha, PKCbeta, PLK1, RET, ROS1, SULU1, Syk, TLK2, TRKA, TYK, VEGFR2, VEGFR3, ZAP70.

Como ejemplo, aquí se indican las condiciones de ensayo usadas para el análisis de los compuestos de fórmula (I) frente a MPS1 y CDK2/CYCA.

10 Ensayo de inhibición de la actividad MPS1

i.Preparación de la resina Dowex

500 g de resina húmeda (SIGMA, resina DOWEX preparada para el cliente 1x8 200-400 mesh, 2,5 kg) se pesan y se 15 diluyen a 2 L en formiato sódico 150 mM, pH 3,00.

La resina se deja asentar (varias horas) y después se descarta el sobrenadante.

Tras tres lavados como arriba a lo largo de un par de días, la resina se deja asentar y se añaden dos volúmenes (wrt 20 el volumen de resina) de formiato sódico 150 mM. Entonces se mide el pH y debería estar alrededor de 3,00.

Las resina lavada es estable durante más de una semana; el stock de resina se mantiene a 4ºC antes del uso.

ii.Tampón Cinasa (KB, del inglés Kinase Buffer)

25 El tampón para el ensayo de MPS1 se compuso de HEPES 50 mM, a pH 7,5, con MgCl2 2,5 mM, MnCl2 1 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 3 microM, β-glicerofosfato 2 mM y BSA 0,2 mg/ml.

iii.Condiciones de ensayo

30 El ensayo se realizó con una concentración final de MPS1 de 5 nM, en presencia de ATP 15 microM y 33P-γ-ATP 1,5 nM; el sustrato fue P38-β-tide, usado a 200 microM.

Ensayo de inhibición de la actividad Cdk2/ciclina A

35 Reacción cinasa: sustrato histona H1 1,5 µM, 25 µATP (P33γ-ATP 0,2 µCi), 30 ng de Cdk2/ciclina A co-expresada en baculovirus, inhibidor 10 µM en un volumen final de 100 µl de tampón (TRIS HCl 10 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 7,5 mM) se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U. Tras una incubación de 10 min a 37ºC se paró la reacción mediante 20 l de EDTA 120 mM.

40 Captura: 100 µl se transfirieron desde cada pocillo a una placa MultiScreen, para permitir la unión del sustrato al filtro de fosfocelulosa. Las placas se lavaron entonces 3 veces con 150 µl/pocillo de PBS Ca++/Mg++ libre y se filtraron mediante un sistema de filtración MultiScreen.

45 Detección: se dejaron secar los filtros a 37ºC, después se añadieron 100 µl/pocillo de escintilante y se detectó histona H1 marcada con 33P mediante conteo de radioactividad en el instrumento Top-Count.

Resultados: Los datos se analizaron mediante una versión personalizada internamente del paquete SW “Assay Explorer” que proporciona, bien el % de inhibición para los ensayos primarios, o los ajustes sigmoidales de las diez 50 curvas de dilución para la determinación de IC50 en los ensayos secundarios/rutinas de confirmación de aciertos.

Como ejemplo, en la Tabla A se presentan datos de % de inhibición de varios compuestos de la presente invención ensayados frente a cinasas diferentes.

55 Tabla A: % inhibición

Entrada

Código % Inhibición (a 10 microM) Enzima

6

A3-M-B2 80,1 TRKA

7

A4-M-B1 59,6 GSK3beta

10

A7-M-B1 66,9 MPS1

14

A9-M-B1 53,3 CDK2/CYCA

12

A10-M-B1 60,6 GSK3beta

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar con tratamientos contra el cáncer conocidos, como terapia de radiación o régimen de quimioterapia en combinación con agentes citostáticos o citotóxicos, agentes tipo

antibiótico, agentes alquilantes, agentes antimetabolito, agentes hormonales, agentes inmunológicos, agentes tipo interferona, inhibidores de la ciclooxigenasa (p. ej. inhibidores de COX-2), inhibidores de metaloproteasa matriz, inhibidores de la telomerasa, inhibidores de tirosina cinasa, agentes receptores del factor anti-crecimiento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogénesis (p. ej. inhibidores de la angiogénesis), inhibidores de

5 farnesil transferasa, inhibidores de la ruta de transducción de señal ras-raf, inhibidores del ciclo celular, otros inhibidores del cdks, agentes de unión a tubulina, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, y similares.

Si se formulan como una dosis fija, dichos productos combinados emplean los compuestos de esta invención dentro del intervalo de dosificación descrito abajo y emplean el otro agente farmacéuticamente activo dentro del intervalo de dosificación aprobado.

Los compuestos de fórmula (I) se pueden usar secuencialmente con agentes anticancerígenos conocidos cuando una formulación combinada es inapropiada.

15 Los compuestos de fórmula (I) de la presente invención, adecuados para la administración a un mamífero, p. ej. a humanos, se pueden administrar mediante las rutas usuales y el nivel de dosificación depende de la edad, el peso, la condición del paciente y la vía de administración.

Por ejemplo, una dosificación adecuada adoptada para la administración oral de un compuesto de fórmula (I) puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 mg por dosis, de 1 a 5 veces al día. Los compuestos de la invención se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación, p. ej. oralmente, en forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos grajeados o recubiertos con película, soluciones líquidas o suspensiones; rectalmente en forma de supositorios; parenteralmente, p. ej. intramuscularmente, o mediante

25 inyección o infusión intravenosa y/o intratecal y/o intraespinal.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente estable del mismo en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual puede ser un portador o un diluyente.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención se preparan usualmente siguiendo métodos convencionales y se administran en una forma farmacéuticamente adecuada. Por ejemplo, las formas orales sólidas pueden contener, junto con el principio activo, diluyentes, p. ej. lactosa, dextrosa, sacarosa, sucrosa, celulosa, almidón de maíz o almidón de patata; lubricantes, p. ej. sílice, talco, ácido esteárico, estearato magnésico o

35 cálcico, y/o polietilenglicoles; agentes aglutinantes, p. ej. almidones, goma arábiga, gelatina metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinil pirrolidona; agentes desintegrantes, p. ej., almidón, ácido algínico, alginatos o glicolato de almidón de maíz; mezclas efervescentes; sustancias colorantes; edulcorantes; agentes humectantes como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; y, en general, sustancias no tóxicas y farmacológicamente inactivas usadas en formulaciones farmacéuticas. Estas preparaciones farmacéuticas se pueden preparar de forma conocida, por ejemplo, mediante procedimientos de mezcla, granulación, compresión, grajeado, o recubrimiento con película.

Las dispersiones líquidas para administración oral pueden ser, p. ej. jarabes, emulsiones y suspensiones. Como ejemplo, los jarabes pueden contener, como portador, sacarosa o sacarosa con glicerina y/o manitol y sorbitol.

45 Las suspensiones y las emulsiones pueden contener, como ejemplos de portadores, goma natural, agar, alginato sódico, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o alcohol polivinílico. La suspensión o soluciones para inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el principio activo, un portador farmacéuticamente aceptable, p. ej. agua estéril, aceite de oliva, etil oleato, glicoles, p. ej. propilenglicol y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaína. Las soluciones para inyecciones o infusiones intravenosas pueden contener, como portador, agua estéril o preferentemente deben encontrarse en forma de soluciones estériles, acuosas, isotónicas, salinas, o pueden contener propilenglicol como portador.

Los supositorios pueden contener, junto con el principio activo, un portador farmacéuticamente aceptable, p. ej. manteca de cacao, polietilenglicol, un detergente éster de ácido graso sorbitán polioxietileno o lecitina.

55 Con la intención de ilustrar mejor la presente invención, sin poner ninguna limitación a la misma, ahora se indican los ejemplos siguientes.

Sección experimental

Métodos generales

La cromatografía flash se realizó en gel de sílice (Merck grado 9395, 60A). Los tiempos de retención de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC: valores de r.t.) se determinaron mediante:

65 HPLC Método 1:

En esta aplicación se usó un equipo Waters Alliance LC mod. 2795 equipado con un detector de UV variable mod. 2487, un detector de nitrógeno por quimioluminiscencia (CLND, Antek 8060) y un detector de masas ZQ2000 (interfaz ESI). El flujo total se separó y se distribuyó en los tres detectores con una relación fija (64:15:21

5 UV:MS:CLND). La cromatografía líquida se equipó con una columna de 30 x 3,0 mm I.D. (Waters xBridge C18, partículas de 3,5 um), termostatizada a 50ºC. Se usaron dos fases móviles: la fase A fue ácido fórmico 0,05% p/v (1 ml/L de ácido fórmico al 50% Fluka 09676 en agua desionizada) y la fase B fue MeOH/iPrOH/H2O 70/25/5 (v/v/v) conteniendo ácido fórmico al 0,035% p/v (700 uL/L de ácido fórmico al 50% Fluka 09676).

Un volumen de 5 ul de solución de muestra nominal 1 mM en DMSO se inyectó (secuencial, modo “partial loop” sin espacios de aire) y se realizó un análisis genérico en gradiente de fase reversa (clasificado como método “#IN63SEQ79”), a 0,8 ml/min desde 0% a 100% de fase B (v/v) durante 5 min, mantenido 0,7 min a 100% B y revertido paso a paso hasta 0% de B a 5,71 min, con el tiempo de parada fijado a 6,3 min. El tiempo de análisis total (“entre inyecciones”) fue 7,9 min.

15 El detector de UV operó a 220 nm, velocidad de muestreo 5 Hz. El dispositivo MS operó a un voltaje capilar de 3,2 kV, cono 30 V, extractor 2 V, lente 0,5 V RF, flujo de desolvatación 400 Uh, flujo de cono 100 L/h, temperatura de la fuente 100ºC, temperatura de desolvatación 150 ºC, adquisición ESI(+) full scan 120 – 1200 amu, a una velocidad de muestreo de 1,7 Hz. El detector CLND operó a una temperatura de horno de 1050ºC, flujo de oxígeno de entrada 280 ml/min, entrada de argón 80 ml/min, salida de argón 25 ml/min, ozono 30 ml/min, vacío 28 torr, voltaje PMT 750 V, cámara PMT a +10ºC, sensibilidad alta, selección 5, velocidad de muestreo 4 Hz.

HPLC Método 2:

25 Los análisis HPLC-MS se realizaron en un espectrómetro de masas de trampa de iones Finnigan MAT mod. LCQ, equipado con una fuente de iones ESI (electroespray), el espectrómetro de masas se conecta directamente a un HPLC SSP4000 (Thermo Separation) equipado con un muestreador automático Lc Pal (CTC Analytics) y un detector PDA UV6000LP.

Condiciones de HPLC:

Columna: Phenomenex Gemini C18, 3 µm, 50 x 4,6 mm (por defecto)

Temperatura: 40ºC

35 Fase móvil A: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 95:5 (v:v)

Fase móvil B: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 5:95 (v:v)

Gradiente de elución:

Tiempo (min)

% Fase móvil A

0

100

7

0

9

0

11

100

13

100

Flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 10 µl 45 Temperatura de columna: 40ºC

Condiciones MS:

El espectrómetro de masas LCQ opera con una interfaz ionización por electroespray (ESI) en modo ión positivo y negativo siguiendo los parámetros de operación indicados en la Tabla 1. Los experimentos MS/MS se realizan en el ión más intenso de cada scan automáticamente con software Xcalibur. Se usó un 45% de energía de colisión para la fragmentación de los iones precursores.

Tabla 1. Parámetros del instrumento espectrómetro de masas

Parámetro

Valor

Temperatura del capilar (ºC)

255

Fuente de voltaje (kV)

4,00

Voltaje del capilar (V)

21,0

Offset de la lente del tubo (V)

-5,0

Amplificador multipolo RF (Vp-p)

400,0

Offset Multipolo 1 (V)

-3,00

Offset Multipolo 2 (V)

-6,50

Voltaje de lente intermultipolo (V)

-16,00

Voltaje offset trampa DC (V)

-10,00

Scans Full Micro

3

Iones diana Full AGC

5 x 107

Tiempo de ión Full Max (ms)

150

Scans Micro MSn

3

Iones diana MSn AGC

2 x 107

Tiempo de ión MSn Max (ms)

200

Multiplicador electrónico (V)

-950,0

HPLC Método 3:

Los análisis HPLC-MS se realizaron en un espectrómetro de masas de trampa de iones Finnigan MAT mod. LCQ,

5 equipado con una fuente de iones ESI (electroespray), el espectrómetro de masas se conecta directamente a un HPLC SSP4000 (Thermo Separation) equipado con un muestreador automático Lc Pal (CTC Analytics) y un detector PDA UV6000LP.

Condiciones de HPLC: 10 Columna: Phenomenex Gemini C18, 3 µm, 50 x 4,6 mm (por defecto)

Temperatura: 40ºC

15 Fase móvil A: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 95:5 (v:v)

Fase móvil B: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 5:95 (v:v)

Gradiente de elución: 20

Tiempo (min)

% Fase móvil A

0

100

2

80

9

60

10

0

12

0

12,10

100

Flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 10 µl Temperatura de columna: 40ºC

25 Condiciones MS:

El espectrómetro de masas LCQ opera con una interfaz ionización por electroespray (ESI) en modo ión positivo y negativo siguiendo los parámetros de operación indicados en la Tabla 1. Los experimentos MS/MS se realizan en el 30 ión más intenso de cada scan automáticamente con software Xcalibur. Se usó un 45% de energía de colisión para la fragmentación de los iones precursores.

Tiempos de retención (r.t. HPLC) se indican en minutos a 220 nm o a 254 nm. La masa se indica en relación m/z.

35 HPLC Método 4:

Los análisis HPLC-MS se realizaron en un sistema HPLC Waters 2795 equipado con un detector PDA 996 Waters y un espectrómetro de masas de cuadrupolo simple Micromass mod. ZQ, equipado con una fuente de iones de electroespray (ESI).

40 Condición cromatográfica: columna Waters Atlantis dC18, 3 µm, 4,6x50mm; la fase móvil A fue tampón acetato amónico 5 mM (pH 5,2 con ácido acético)/acetonitrilo (95:5), y la fase móvil B fue H2O/acetonitrilo (5:95). El intervalo del gradiente fue de 50 a 90% de B en 8 minutos. La detección UV se llevó a cabo a 220 nm y 254 nm, el flujo 1 ml/min y el volumen de inyección 20 µl. Full scan, intervalo de masas de 100 a 800 amu. El voltaje capilar fue 3,59

45 kV; la temp. de la fuente fue 120ºC; el cono fue 14V. Los tiempos de retención (r.t. HPLC) se registran en minutos a 220 nm o a 254 nm. Las masas se indican en relación m/z.

Condiciones LC:

Columna

Waters Atlantis dC18, 3 µm, 4,6x50mm

Fase móvil A

Acetato amónico 5 mM pH 5,2/acetonitrilo 95/5

Fase móvil B

Acetonitrilo/H2O 95/5

Flujo

1 ml/min

Tiempo (min)

% Fase A % Fase B

Gradiente

0 50% 50%

8

0% 100%

10

0% 100%

Volumen de inyección

10 µl

Temperatura de columna

30ºC

Canales PDA

220 nm, 254 nm

Condiciones de masas:

Modo de ionización

ESI+ y ESI-

Voltaje del capilar

3,84 kV (ES+); 2,76 kV (ES-)

Voltaje del cono

15 V (ES+); 27 V (ES-)

Voltaje extractor

1 V

Voltaje de lente RF

0,1 V

Temperatura de fuente

120ºC

Temperatura de desolvatación

240ºC

Resolución LM

15

Resolución HM

15

Energía del ion

0,5

Multipler

600

Modo Scan

Full Scan (intervalo = 100-800 m/z)

Tiempo de scan = 0,5 s

Retraso inter-scan = 0,3 s

HPLC Método 5:

10 Los análisis HPLC-MS se realizaron en un sistema UPLCTM Waters Acquity equipado con un detector PDA Waters Acquity UPLCTM 2996, detector ELSDTM Waters Acquity y un espectrómetro de masas Waters Acquity SQTM (cuadrupolo simple), equipado con una fuente de iones de electroespray (ESI). Condición cromatográfica: columna Waters Acquity UPLCTM BEH C18, 1,7 µm, 2,1x50 mm; la fase móvil A fue

15 NH4OH al 0,05% en H2O pH 10/Acetonitrilo 95/5 y la fase móvil B fue H2O/acetonitrilo (5:95). El gradiente fue de 50 a 100% de B en 2 minutos. La detección UV se llevó a cabo a 220 nm y 254 nm, el flujo 1 ml/min y el volumen de inyección 20 µl. Full scan, intervalo de masas de 100 a 800 amu. El voltaje capilar fue 3,59 kV; la temp. de la fuente fue 120ºC; el cono fue 14V. Los tiempos de retención (r.t. HPLC) se registran en minutos a 220 nm o a 254 nm. Las masas se indican en relación m/z.

20 Condiciones LC:

[

Columna

Waters Acquity UPLCTM BEH C18, 1,7 µm, 2,1x50 mm

Fase móvil A

NH4OH al 0,05% en H2O pH 10/Acetonitrilo 95/5

Fase móvil B

Acetonitrilo/H2O 95/5

Flujo

0,7 ml/min

Tiempo (min)

% Fase A % Fase B

Gradiente

0 50% 50%

2,1

0% 100%

Volumen de inyección

10 µl

Temperatura de columna

45ºC

Canales PDA

210 – 350 nm

Velocidad de muestreo 10 resolución 1,2

ELSD

Tubo de deriva 45ºC Nebuliz. 12ºC Ganancia 750 Gas 40 psi

25 Condiciones de masas:

Modo de ionización

ESI+ y ESI-

Voltaje del capilar

3 kV (ES+); 3 kV (ES-)

Voltaje del cono

30 V (ES+); 30 V (ES-)

Voltaje extractor

1 V

Voltaje de lente RF

0,1 V

Temperatura de fuente

120ºC

Temperatura de desolvatación

350ºC

Flujo del gas del cono

100 L/h

Flujo de gas de desolvatación

600 Uh

Resolución LM

15

Resolución HM

15

Energía del ion

0,3

Ganancia

1

Modo Scan

Full Scan (intervalo = 100-800 m/z)

Tiempo de scan = 0,1 s

Retraso inter-scan = 0,02 s

En caso necesario, los compuestos se purificaron mediante HPLC preparativo en una columna Waters X-Bridge Prep Shield RP18 (19 x 100 mm, 5 µm) o una columna Phenomenex Gemini C18 (21,2 x 250 mm, 10 µm), usando

5 un Sistema de autopurificación Waters FractionLynx equipado con un detector PDA Waters 996 y un espectrómetro de masas de cuadrupolo simple Micromass mod. ZQ, ionización por electroespray, modo positivo. La fase móvil fue agua 0,05% NH3/acetonitrilo 95:5, y la fase móvil B fue acetonitrilo. Gradiente de 50 a 90% de B en 8 min o 15 min. Flujo de 20 ml/min.

10 La espectrometría 1H-RMN se llevó a cabo en un instrumento single bay Bruker AVANCE 400MHz con gradientes. Se equipó con una muestra QNP (muestra intercambiable de 4 núcleos -1H, 13C, 19F y 31P) (método 1 de RMN) o en un Mercury VX 400 operando a 400,45 MHz equipado con una muestra de doble resonancia de 5 mm [1H (15N-31P)ID_PFG Varian](método 2 de RMN).

15 Los compuestos de fórmula (I), con un átomo de carbono asimétrico, y obtenidos como mezcla racémica, se resolvieron por separación HPLC en columnas quirales. En particular, por ejemplo, se pueden usar columnas preparativas CHIRALPACK® AD, CHIRALPACK® AS, CHIRALCELL® OJ.

Como se ha indicado anteriormente, varios compuestos de fórmula (I) de la invención se han sintetizado de acuerdo 20 con técnicas químicas en solución.

A este respecto, varios compuestos preparados de este modo se han identificado de forma conveniente e inequívoca, mediante el sistema de codificación de las tablas III junto con el tiempo de retención de HPLC (métodos 1, 2 y 3) y la masa.

25 Cada código, que identifica un compuesto específico individual de fórmula (I), consiste en tres unidades A-M-B.

A representa cualquier sustituyente R2-[véase fórmula (I)] y está unido en posición 3 de la fracción 6,7dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona; ejemplos no limitantes de los grupos A se representan en la tabla I siguiente.

30 B representa cualquier sustituyente R1-[véase fórmula (I)] y está unido al resto de la fracción 6,7-dihidroimidazo[1,5a]pirazin-8(5H)-ona a través del átomo de carbono del grupo carbonilo, como para obtener derivados de 6,7dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona ; ejemplos no limitantes de los grupos B se representan en la tabla II siguiente.

35 M se refiere al núcleo central de la fracción 6,7-dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona divalente, estando sustituido en la posición 3 por grupos A y en el grupo carbonilo por grupos B, esencialmente como sigue:

Para simplificar la referencia, cada grupo A o B de las tablas I y II se ha identificado con la fórmula química adecuada, indicando también el punto de unión con el resto de la molécula M.

Sólo como ejemplo, el compuesto A3-M-B3 de la tabla III (entrada 27) representa una 6,7-dihidroimidazo[1,5a]pirazin-8(5H)-ona M, estando sustituida en la posición 3 por el grupo A3 y por el grupo B3 a través del grupo carbonilo, como sigue:

Tabla I –grupos A Fragmento CÓDIGO Fragmento CÓDIGO

Tabla II –grupos B

Fragmento

CODIGO Fragmento CODIGO

B1 B8

B2

B9

B3 B10

B4 B11

B5 HO-M B12

B6 H2N-M B13

B7 B14

B15 B24

B16 B25

B17 B26

B18

B27

B19 B28

B20 B29

B21 B30

B22 B31

B23 B32

Preparación de ácido 3H-imidazol-4-carboxílico (III):

5 Método A:

Una mezcla de ácido 1H-imidazol-4,5-dicarboxílico (II) (24,7 g, 158,23 mmol) en N-metilpirrolidona (198 ml) se calentó a 160ºC durante 23 horas bajo nitrógeno. Después, la masa de reacción se enfrió a +4ºC y envejeció 48 horas. Los sólidos se recogieron por filtración, se lavaron con N-metilpirrolidona (50 ml) y éter metil terc-butílico (100 ml) y finalmente se secaron al vacío a 50ºC para obtener el producto del título ácido 3H-imidazol-4-carboxílico (III) como un sólido casi blanco (17,74 g, rendimiento del 75,6%), p. f. 288-290ºC.

LCMS (método 4 de HPLC): m/z 113 [M+H]+ a r.t. 0,72 min. 1H-RMN (401 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,68 (s, 1 H) 7,77 (s, 1 H).

15 Método B:

En un vial cerrado, una suspensión de ácido 1 H-imidazol-4,5-dicarboxílico II (1 g, 6,4 mmol) en DMA seca (10 ml) se calentó con irradiación por microondas a 165ºC durante 1 hora. El procedimiento se repitió 5 veces para evitar la descomposición del producto debida al calentamiento continuo. Durante cada fase el vial se abrió para evacuar el CO2 producido en la reacción. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura ambiente y se observó la precipitación de parte del producto deseado III. Se evaporó el solvente bajo presión reducida y el sólido crudo se trituró con éter metil terc-butílico obteniendo ácido 3H-imidazol-4-carboxílico como un sólido casi blanco con rendimiento cuantitativo.

25 LCMS (método 4 de HPLC): m/z 113 [M+H]+ a r.t. 0,72 min. 1H-RMN (401 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,68 (s, 1 H) 7,77 (s, 1 H).

Ejemplo 1

Éster etílico del ácido (8-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-imidazo[1,5-a]pirazin-5-il)-acético (I, A15-M-B1, R2= H, R1 = -OCH2CH3) ácido 3H-imidazol-4-carboxílico (0,50 g, 4,46 mmol) (III) se suspendió en tetrahidrofurano seco (34 ml) y se añadió cloruro de hidrógeno (solución de éter 2N, 6 ml, 12 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. A la suspensión se añadieron DMF seca (0,52 ml, 6,70 mmol) y cloruro de tionilo (3,26 ml, 44,70 mmol) y

35 la mezcla se agitó a reflujo durante la noche y se concentró a presión reducida. Al residuo amarillo pálido se añadieron piridina (50 ml) y etil (2E)-4-aminobut-2-enoato trifluoroacetato (IV) (2,17 g, 8,92 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 5 h. Los solventes se evaporaron a presión reducida, obteniendo un aceite que se disolvió en una mezcla de solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato (15 ml) y tetrahidrofurano (10 ml) y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente.

El solvente se evaporó al vacío y el residuo se recogió en diclorometano, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se filtró. El filtrado se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía flash con gel de sílice (DCM/MeOH 9:1). La purificación rindió un sólido marrón que se recristalizó en diclorometano y éter dietílico anhidro. La suspensión obtenida reposó toda la noche y se filtró y se obtuvo el compuesto del título como un sólido blanco (0,56 g,

45 rendimiento del 56%).

LCMS (método 2 de HPLC): m/z 224 [M+H]+ a r.t. 2,66 min. 1H-RMN (401 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 1,18 (t, J=7,08 Hz, 2 H) 2,90 (d, J=6,84 Hz, 1 H) 3,34 – 3,40 (m, 1 H) 3,66 (ddd, J=13,24, 4,27, 2,01 Hz, 1 H) 4,10 (q, J=7,08 Hz, 1 H) 4,79 (tt, J=6,73, 4,50 Hz, 1 H) 7,45 (d, J=0,61 Hz, 1 H) 7,81 (s, 1 H) 7,85 (br. S. 1 H)

Ejemplo 2

A2-M-B1

55 En un tubo de microondas cerrado relleno con argón se agitó una mezcla de éster etílico del ácido 8-oxo-5,6,7,8tetrahidro-imidazo[1,5-a]pirazin-5-il)-acético (I, R2= H, R1 = -OCH2CH3)(35 mg, 0,16 mmol), Pd(OAc)2 (5 mmol%), CuI (60 mg, 0,32 mmol) y un haluro de arilo en el que R2 corresponde al fragmento A2 de la tabla I (0,48 mmol) en DMF seco desgasificado (0,7 ml, 0,23 M relativo a I) a 160ºC durante 3 h, bajo atmósfera de argón. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con MeOH (1 ml), filtrado por tubos StratospheresTM SPE PLtiol MP SPE (lavado con MeOH) y el filtrado se evaporó al vacío. El residuo se purificó por cromatografía flash (DCM/MeOH 9:1), para obtener el compuesto del título A2-M-B1 (0,041 g, rendimiento del 80%).

LCMS (método 2 de HPLC): m/z 300 [M+H]+ a t. r. 4,31 min. 1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 7,93 (d, J = 4,6 Hz, 1 H) 7,76 (dd, J = 7,6, 1,7 Hz, 2H), 7,62 (s, 1H), 7,44 – 7,57 (m, 3H), 5,02 – 5,18 (m, J = 4,2 Hz, 1H), 3,82 – 3,95 (m, 2H),

65 3,76 (dq, J = 10,8, 7,1 Hz, 1H), 2,80 (dd, J = 15,3, 8,3 Hz, 1H), 1,05 (t, J = 7,1 Hz, 3H)

Ejemplo 3

A2-M-B12

5 Una solución de A2-M-B1 (0,032 g, 0,117 mmol) y hidróxido de litio monohidrato (0,005 g, 0,213 mmol) en una mezcla de THF-H2O (1:1, 0,1 M relativo a A2-M-B1) se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción se acidificó con HCl(conc) hasta pH<1 y se concentró bajo presión reducida obteniéndose el compuesto del título A2-M-B12 como un sólido marrón.

Ejemplo 4

A2-M-B2

A una suspensión del derivado A2-M-B12 (0,104 mmol) en DCM seco (2,0 ml, 0,05 M), se añadió EDC (0,030 g,

15 0,156 mmol), DHBTOH (0,025 g, 0,156 mmol), piridina (0,025 ml, 0,312 mmol) y 4-metoxibenzilamina (0,027 ml), 0,208 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas. El solvente se evaporó y el residuo se recogió con agua y se extrajo con EtOAc (2 veces). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, el solvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por HPLC RP para obtener el compuesto del título A2-M-B2 como un sólido (0,020 g, rendimiento del 50%).

LCMS (método 2 de HPLC): m/z 391 [M+H]+ a r.t. 4,31 min. 1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 8,42 (t, J = 5,7 Hz, 1 H) 7,92 (d, J = 4,9 Hz, 1 H), 7,72 – 7,83 (m, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,47 – 7,54 (m, 3H), 7,05 – 7,15 (m, 2H), 6,80 – 6,95 (m, 2H), 5,03 – 5,13 (m, 1H), 4,02 – 4,18 (m, 2H), 3,83 (dd, J = 13,4, 3,7 Hz, 1H), 3,71 – 3,74 (m, 3H), 2,78 (dd, J = 15,1, 10,0 Hz, 1H).

25 Ejemplo 5

A3-M-B2

A una suspensión de derivado A3-M-B12 (0,177 mmol) en una mezcla de dioxano seco-acetonitrilo 1:1 (1,17 ml, 0,1 M), se añadieron DIEA (0,060 ml, 3,50 mmol) y THF (0,040 g, 0,152 mmol) y la mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 1 h a temperatura ambiente. La suspensión obtenida se volvió amarilla durante la reacción. Se añadieron propilamina (0,020 ml, 0,24 mmol) y lutidina (0,021 ml, 0,176 mmol) y la reacción se agitó a 60ºC durante 3 h. El solvente se evaporó y el residuo se recogió con agua y se extrajo con DCM (1 ml, 2 veces) usando

35 tubos separadores AlltechTM. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, el solvente se concentró al vacío hasta la mitad del volumen y el precipitado se aisló por filtración para obtener el compuesto del título A3-M-B2 como un sólido blanco (0,019 g, rendimiento del 52%).

LCMS (método 2 de HPLC): m/z 459 [M+H]+ a t. r. 5,09 min. 1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 8,09 (d, J = 7,8 Hz, 1 H) 8,06 (s, 1H), 7,96 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,89 (t, J = 4,3 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,69 – 7,79 (m, 1 H), 7,64 (s, 1H), 5,12 (t, J = 8,4 Hz, 1 H), 3,81 – 3,93 (m, 1H), 3,34 (br. S., 1H), 2,77 – 2,85 (m, 2H), 2,62 – 2,69 (m, 1H), 2,36 (d, J = 14,9 Hz, 1 H), 1,23 – 1,34 (m, 1H), 0,77 (t, J = 7,4 Hz, 1 H).

Ejemplo 6

45 Ácido carboxílico (8-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-imidazo[1,5-a]pirazin-5-il)-acético (I, A15-M-B12, R1 = -OH R2 = H)

Se añadió hidróxido de litio monohidrato (0,055 g, 2,33 mmol) a una solución de éster etílico del ácido (8-oxo5,6,7,8-tetrahidro-imidazo[1,5-a]pirazin-5-il)-acético (I, R1 = -OCH2CH3, R2= H) (0,260 g, 1,16 mmol) en una mezcla de THF – H2O (1:1, 22 ml, 0,05 M relativo a I) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla de reacción se acidificó con HCl(conc) hasta pH<1 y se concentró a presión reducida obteniéndose clorhidrato del ácido carboxílico (8-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-imidazo[1,5-a]pirazin-5-il)-acético (I, R1 = R2 = H) como un sólido marrón (0,268 g, rendimiento del 100%).

55 LCMS (método 4 de HPLC): m/z 196 [M+H]+ a r.t. 0,8 min. 1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 12,73 (br. s., 1H), 8,69 (br. s., 1H), 8,28 (br. s., 1H), 7,97 (br. s., 1H),, 4,88 (quin, J = 5,5 Hz, 1H), 3,73 (ddd, J = 13,3, 3,6, 2,4 Hz, 1H), 3,46 (dt, J = 13,3, 4,4 Hz, 1H), 2,94 – 3,02 (m, 1H), 2,85 – 2,93 (m, 1H).

Ejemplo 7

A15-M-B9

A una suspensión de clorhidrato del ácido carboxílico (8-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-imidazo[1,5-a]pirazin-5-il)-acético I (0,030 g, 0,153 mmol) en una mezcla de DCM seco-DMF seco (9:1; 0,05 M) se añadieron EDC (0,044 g, 0,230 65 mmol), DHBTOH (0,037 g, 0,230 mmol), piridina (0,037 ml, 0,459 mmol) y ciclohexilamina (0,035 ml, 0,306 mmol), 0,208 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas. El solvente se evaporó y el

residuo se recogió con agua y se filtró el exceso de DHBTOH. La capa acuosa se evaporó al vacío y el residuo se purificó por HPLC para obtener el compuesto del título A15-M-B9 como un sólido blanco (0,020 g, rendimiento del 48%).

5 LCMS (método 2 de HPLC): m/z 277 [M+H]+ a t. r. 3,87 min. 1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 7,83 (br. s., 2H), 7,66 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 4,69 – 4,83 (m, 1H), 3,59 – 3,69 (m, 1H), 3,51 (br. s., 1H), 3,27 – 3,37 (m, 1H), 2,63 – 2,72 (m, 1H), 2,50 – 2,61 (m, 1H), 1,46 – 1,75 (m, 4H), 1,01 – 1,32 (m, 6H).

Ejemplo 8

10 Procediendo como se describe en los Ejemplos previos, se prepararon los compuestos siguientes:

Tabla III

15 Entrada Compuesto Método HPLC t.r(min)HPLC [M+H]+

Entrada Compuesto Método HPLC t.r(min)HPLC [M+H]+

Entrada Compuesto Método HPLC t.r(min)HPLC [M+H]+

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.Un compuesto de fórmula (I):

   5

   en el que:

   10 R1 es –NR3R4 o –OR3;

   R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo sustituido opcionalmente seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, arilo, heteroarilo, aril alquilo C1-C6 y heteroaril alquilo C1-C6;

   15 R3 y R4, iguales o diferentes, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o R3 y R4 tomados juntos con el átomo de nitrógeno al cual se unen, pueden formar un anillo heterociclilo o heteroarilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido, que

   20 contiene opcionalmente un heteroátomo o grupo heteroatómico adicional seleccionado de S, O, N y NH; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
2. 2.Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R1 es –NH2 o –NHR3 y R3 es un grupo alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C6 lineal o ramificado o es un grupo arilo o arilalquilo opcionalmente 25 sustituido.
3. 3.Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en el que R2 es hidrógeno o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.

   30 4.Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en el que M se refiere al núcleo central de la fracción divalente 6,7-dihidroimidazo[1,5-a]pirazin-8(5H)-ona:

   en el que R2 es un fragmento designado por cualquiera de los códigos A1-A18 y R1 es un fragmento designado por cualquiera de los códigos B1-B32:

   Fragmento CÓDIGO Fragmento CÓDIGO

   Fragmento

   CODIGO Fragmento CODIGO

   B1 B8

   B2 B9

   B3 B10

   B4 B11

   B5 HO-M B12

   B6 H2N-M B13

   B7 B14

   B15 B24

   B16 B25

   B17 B26

   B18

   B27

   B19 B28

   B20 B29

   B21 B30

   B22 B31

   B23 B32

4. 5.Un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) o de sales farmacéuticamente aceptables del mismo, como se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho proceso:

   a)descarboxilación de un compuesto de fórmula (II):

   10 b)reacción del compuesto resultante de fórmula (III):

   con un compuesto de fórmula (IV) o una sal del mismo:

   en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6, de modo que se obtiene un compuesto de fórmula (I):

   10 en el que R3 es un grupo alquilo C1-C6 y R2 es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y, si es necesario o se desea, se realizan una o varias de las etapas adicionales siguientes:

   -

   Separación del compuesto de fórmula (I) en los isómeros individuales;

   15 -Conversión de un compuesto de fórmula (I) en diferentes compuestos de fórmula (I) mediante introducción de la fracción imidazol de un grupo R2 como se define en la reivindicación 1 pero distinto del hidrógeno;

   -

   Conversión de un compuesto de fórmula (I) en un compuesto diferente de fórmula (I) mediante 20 sustitución del grupo –OR3 con un grupo R1 diferente como se define en la reivindicación 1;

   -

   Conversión de un compuesto de fórmula (I) en una sal farmacéuticamente aceptable o conversión de una sal en el compuesto (I) libre

5. 6.Una biblioteca de dos o más compuestos de fórmula (I):

   en el que R1 y R2 son como se define en la reivindicación 1. 7.Una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 6 en la que los compuestos tienen la fórmula:

   en el que los fragmentos A y B son como se define en la reivindicación 4, y en el que los compuestos son 10 los listados aquí abajo:

   Entrada Compuesto Entrada Compuesto Entrada Compuesto Entrada Compuesto

   Entrada Compuesto Entrada Compuesto Entrada Compuesto Entrada Compuesto

   5 8.Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I), como se define en la reivindicación 1, y al menos un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
6. 9.Un producto que comprende un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 o una

   10 composición farmacéutica del mismo como se define en la reivindicación 8, y uno o varios agentes quimioterapéuticos, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en la terapia contra el cáncer.
7. 10.Un compuesto de la fórmula (I), como se define en la reivindicación 1, para el uso como un 15 medicamento.
8. 11.Un compuesto de la fórmula (I), como se define en la reivindicación 1, para el uso en un método para el tratamiento de enfermedades causadas por y/o asociadas con una actividad cinasa alterada.

   20 12.Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que la enfermedad causada por y/o asociada con una actividad cinasa alterada es cáncer.
9. 13.Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que el cáncer se selecciona entre carcinoma, como el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, incluyendo cáncer de 25 pulmón de células pequeñas, esófago, vesícula, ovario, páncreas, estómago, cerviz, tiroides, próstata, y piel, incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfático, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas y linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo las leucemias mielogénicas aguda y crónica, incluyendo

   30 síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentoso, queratoxantoma, cáncer folicular de tiroides y sarcoma de Kaposi.

   35 14.Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que se usa para el tratamiento de enfermedades junto con una terapia de radiación o régimen de quimioterapia en combinación con al menos un agente citostático o citotóxico.

   40 15.Un método in vitro para la inhibición de la actividad cinasa, que comprende el contacto de dicho enzima con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1.