ES2511991T5 - Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor - Google Patents

Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor Download PDF

Info

Publication number
ES2511991T5
ES2511991T5 ES10184701.0T ES10184701T ES2511991T5 ES 2511991 T5 ES2511991 T5 ES 2511991T5 ES 10184701 T ES10184701 T ES 10184701T ES 2511991 T5 ES2511991 T5 ES 2511991T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
compound
fluorescence
probe
donor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10184701.0T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2511991T3 (es
Inventor
Ronald M Cook
Matt Lyttle
Daren Dick
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biosearch Technologies Inc
Original Assignee
Biosearch Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24268941&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2511991(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biosearch Technologies Inc filed Critical Biosearch Technologies Inc
Publication of ES2511991T3 publication Critical patent/ES2511991T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2511991T5 publication Critical patent/ES2511991T5/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C245/00—Compounds containing chains of at least two nitrogen atoms with at least one nitrogen-to-nitrogen multiple bond
    • C07C245/02—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides
    • C07C245/06—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C245/08—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings with the two nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings, e.g. azobenzene
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/36—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D241/38—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atoms
    • C07D241/46—Phenazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2408—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of hydroxyalkyl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B31/00—Disazo and polyazo dyes of the type A->B->C, A->B->C->D, or the like, prepared by diazotising and coupling
    • C09B31/02—Disazo dyes
    • C09B31/04—Disazo dyes from a coupling component "C" containing a directive amino group
    • C09B31/043—Amino-benzenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B56/00—Azo dyes containing other chromophoric systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B56/00—Azo dyes containing other chromophoric systems
    • C09B56/12—Anthraquinone-azo dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energfa donador-aceptor Antecedentes de la invencion
Hay una necesidad continua y en expansion de metodos rapidos, altamente espedficos de deteccion y cuantificacion de sustancias qmmicas, bioqmmicas y biologicas como analitos en mezclas de investigacion y diagnostico. De particular valor son los metodos para medir pequenas cantidades de acidos nucleicos, peptidos, productos farmaceuticos, metabolitos, microorganismos y otros materiales de valor diagnostico. Los ejemplos de tales materiales incluyen narcoticos y venenos, farmacos administrados para propositos terapeuticos, hormonas, microorganismos y virus patogenicos, anticuerpos, y enzimas y acidos nucleicos, particularmente aquellos implicados en estados de la enfermedad.
La presencia de un analito particular puede a menudo determinarse por metodos de union que explotan el alto grado de especificidad, que caracteriza muchos sistemas bioqmmicos y biologicos. Los metodos que se usan frecuentemente se basan, por ejemplo, en sistemas antfgeno-anticuerpo, tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos, y sistemas protema-ligando. En estos metodos, la existencia de un complejo de valor diagnostico se indica tipicamente por la presencia o ausencia de una "etiqueta" observable que se une a uno o mas de los materiales que interaction. El metodo espedfico de etiquetado escogido frecuentemente dicta la utilidad y versatilidad de un sistema particular para detectar un analito de interes. Las etiquetas preferidas son economicas, seguras y capaces de unirse eficientemente a una amplia variedad de materiales qmmicos, bioqmmicos y biologicos sin alterar significativamente las caractensticas de union importantes de estos materiales. La etiqueta debe dar una senal altamente caractenstica, y debe encontrarse raramente, y preferentemente nunca, en la naturaleza. La etiqueta debe ser estable y detectable en sistemas acuosos en penodos de tiempo en el intervalo de hasta meses. La deteccion de la etiqueta es preferentemente rapida, sensible, y reproducible sin la necesidad de instalaciones caras, especializadas o la necesidad de precauciones especiales para proteger al personal. La cuantificacion de la etiqueta es preferentemente relativamente independiente de variables tales como la temperatura y la composicion de la mezcla que se ensaya.
Se han desarrollado una amplia variedad de etiquetas, cada una con ventajas y desventajas particulares. Por ejemplo, las etiquetas radioactivas son bastante versatiles, y pueden detectarse a muy bajas concentraciones, tales etiquetas son, sin embargo, caras, peligrosas, y su uso requiere equipamiento sofisticado y personal entrenado. Asf, hay un amplio interes en las etiquetas no-radioactivas, particularmente en las etiquetas que son observables por tecnicas espectrofotometricas, de resonancia de spin, y de luminiscencia, y materiales reactivos tales como enzimas que producen tales moleculas.
Las etiquetas que se detectan por medio del uso de espectroscopia de fluorescencia son de particular interes, debido al gran numero de tales etiquetas que se conocen en la tecnica. Ademas, la literatura esta repleta de smtesis de etiquetas fluorescentes derivatizados para permitir su facil union a otras moleculas, y muchas de tales etiquetas fluorescentes estan comercialmente disponibles.
Ademas de detectarse directamente, muchas etiquetas fluorescentes operan para apagar la fluorescencia de una etiqueta fluorescente adyacente secundaria. Debido a su dependencia de la distancia y la magnitud de la interaccion entre el inhibidor de fluorescencia y el fluoroforo, la inhibicion de la fluorescencia de las especies fluorescentes proporciona una sonda sensible de configuracion molecular y union, u otras, interacciones. Un ejemplo excelente del uso de pares reportero fluorescente inhibidor de fluorescencia se encuentra en la deteccion y analisis de acidos nucleicos.
Las sondas de acidos nucleicos fluorescentes son herramientas importantes para el analisis genetico, en la investigacion y el desarrollo geneticos, y en la medicina clmica. A medida que se acumula la informacion del Proyecto del Genoma Humano, el nivel de interrogacion genetica mediada por sondas fluorescentes se expandera enormemente. Una clase de sondas fluorescentes particularmente utiles incluyen sondas de auto-apagado, ademas conocidas como sondas de transferencia de energfa de fluorescencia, o sondas FET. El diseno de diferentes sondas por medio del uso de estos motivos puede variar en detalles. En una sonda FET ilustrativa, ambos un fluoroforo y un inhibidor de fluorescencia estan atados a acidos nucleicos. La sonda se configura de forma tal que el fluoroforo esta proximo al inhibidor de fluorescencia y la sonda produce una senal solamente como resultado de su hibridacion a un objetivo previsto. A pesar de la disponibilidad limitada de sondas FET, las tecnicas que incorporan su uso desplazan rapidamente los metodos alterativos.
Las sondas que contienen un par fluoroforo-inhibidor de fluorescencia se desarrollaron para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos donde la sonda forma una estructura de horquilla, es decir, donde la sonda se hibrida consigo misma para formar un bucle de forma que la molecula inhibidora de fluorescencia se acerca a la molecula reportera en ausencia de una secuencia de acidos nucleicos complementaria para prevenir la formacion de la estructura de horquilla (ver, por ejemplo, documento WO 90/03446; solicitud de patente europea num. 0 601 889 A2). Cuando esta presente una secuencia objetivo complementaria, la hibridacion de la sonda a la secuencia objetivo complementaria
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
interrumpe la estructura de horquilla y provoca que la sonda adopte una configuracion donde la molecula inhibidora de fluorescencia ya no esta suficientemente cerca de la molecula reportera para inhibir la fluorescencia de la molecula reportera. Como resultado, las sondas proporcionan una senal de fluorescencia mayor cuando se hibridan a una secuencia objetivo que cuando estan sin hibridar.
Se han desarrollado ensayos para detectar una secuencia de acidos nucleicos seleccionada y para identificar la presencia de una estructura de horquilla por medio del uso de dos sondas separadas, una que contiene una molecula reportera y la otra una molecula inhibidora de fluorescencia (ver, Meringue, y otros, Nucleic Acids Research, 22: 920-928 (1994)). En estos ensayos, la senal de fluorescencia de la molecula reportera disminuye cuando se hibrida a la secuencia objetivo debido a que la molecula inhibidora de fluorescencia se aproxima a la molecula reportera.
Una aplicacion particularmente importante para las sondas que incluyen un par de moleculas reportera-inhibidor de fluorescencia es su uso en las reacciones de amplificacion de acidos nucleicos, tales como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), para detectar la presencia y amplificacion de una secuencia de acidos nucleicos objetivo. En general, las tecnicas de amplificacion de acidos nucleicos han abierto amplios nuevos enfoques para las pruebas geneticas y el analisis de ADN (ver, por ejemplo, Arnheim y otros. Ann. Rev. Biochem., 61: 131-156 (1992)). La PCR, en particular, se ha convertido en una herramienta de investigacion de gran importancia con aplicaciones en, por ejemplo, el clonaje, analisis de expresion genetica, secuenciacion de ADN, mapeo genetico y descubrimiento de farmacos (ver, Arnheim y otros, supra; Gilliland y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2725-2729 (1990); Bevan y otros, PCR Methods and Applications, 1: 222-228 (1992); Green y otros, PCR Methods and Applications, 1: 77-90 (1991); Blackwell y otros, Science, 250: 1104-1110 (1990)).
Los metodos que se usan comunmente para detectar los productos de amplificacion de acidos nucleicos requieren que el producto amplificado se separe de los iniciadores sin reaccionar. Esto se logra tipicamente ya sea mediante el uso de geles de electroforesis, que separan los productos de la amplificacion sobre la base de una diferencia de tamano, o mediante la inmovilizacion del producto, lo que permite lavar el iniciador libre. Sin embargo, se han descrito un numero de metodos para supervisar el proceso de amplificacion sin una separacion previa del iniciador. Todos ellos se basan en FET, y ninguno de ellos detecta el producto amplificado directamente. En lugar de esto, los metodos detectan algunos eventos relacionados con la amplificacion. Por esa razon, se acompanan de problemas de alto fondo, y no son cuantitativos, como se discute mas abajo.
Un metodo, descrito en Wang y otros (patente de los Estados Unidos num.. 5,348,853; y Anal. Chem., 67: 11971203 (1995)), usa un sistema de transferencia de energfa en el que la transferencia de energfa ocurre entre dos fluoroforos en la sonda. En este metodo, la deteccion de la molecula amplificada tiene lugar en los recipientes de reaccion de amplificacion, sin la necesidad de un paso de separacion. Este metodo, sin embargo, no detecta el producto amplificado, sino que en su lugar detecta la disociacion del iniciador del acido nucleico "disipador de energfa". Asf, este metodo depende de la deteccion de una disminucion en las emisiones; debe usarse una porcion significativa del iniciador etiquetado para lograr una diferencia confiable entre las senales antes y despues de la reaccion.
Un segundo metodo de deteccion de un producto amplificado sin una separacion previa del iniciador y el producto es el ensayo de PCR de nucleasa 5' (ademas llamado ensayo TaqMan™) (Holland y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7276-7280 (1991); Lee y otros, Nucleic Acids Res., 21: 3761-3766 (1993)). Este ensayo detecta la acumulacion de un producto de PCR espedfico por hibridacion y escision de una sonda fluorogenica doblemente etiquetada (la sonda "TaqMan") durante la reaccion de amplificacion. La sonda fluorogenica consiste de un acido nucleico etiquetado con un colorante reportero fluorescente y un colorante apagador. Durante la PCR, esta sonda se escinde por la actividad exonucleasa 5' de la ADN polimerasa si, y solo si, se hibrida al segmento que se amplifica. La escision de la sonda genera un aumento en la intensidad de fluorescencia del colorante reportero.
En el ensayo TaqMan, el donador y el inhibidor de fluorescencia se localizan preferentemente en los extremos 3'- y 5'- de la sonda, debido a que el requisito de que la hidrolisis 5'-3' se realice entre el fluoroforo y el inhibidor de fluorescencia debe alcanzarse solamente cuando estas dos porciones no esten demasiado cerca uno del otro. (Lyamichev y otros, Science, 260:778-783 (1993)). Este requisito es un serio inconveniente del ensayo ya que la eficiencia de la transferencia de energfa disminuye con el inverso de la sexta potencia de la distancia entre el reportero y el inhibidor de fluorescencia. Asf, si el inhibidor de fluorescencia no esta suficientemente cerca del reportero para alcanzar la inhibicion de la fluorescencia mas eficiente las emisiones de fondo de la sonda pueden ser bastante altas.
Aun otro metodo para detectar productos de amplificacion que descansa en el uso de transferencia de energfa es el metodo de "sonda de baliza" descrito por Tyagi y otros (Nature Biotech., 14:303-309 (1996)) que es ademas el tema de lapatente de los Estados Unidos num. 5,312,728 de Lizardi y otros Este metodo emplea sondas de hibridacion de acido nucleico que pueden formar estructuras de horquillas. En un extremo de la sonda de hibridacion (el extremo 5'- o 3'-) hay un fluoroforo donador, y en el otro extremo, una porcion aceptora. En este metodo, la porcion aceptora es un inhibidor de fluorescencia, que absorbe energfa del donador. Asf cuando la baliza esta en una configuracion abierta, la fluorescencia del fluoroforo donador es detectable, mientras que cuando la baliza esta en configuracion de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
horquilla (cerrada), la fluorescencia del fluoroforo donador esta inhibida. Cuando se emplea en la PCR, la sonda de baliza molecular, que se hibrida a una de las hebras del producto de PCR, esta en "configuracion abierta", y se detecta la fluorescencia, mientras aquellas que permanecen sin hibridar no van a fluorescer. Como un resultado, la cantidad de fluorescencia va a aumentar segun aumenta la cantidad de producto de PCR, y asf se puede usar como una medida del progreso de la PCR.
Ciertas limitaciones impiden la aplicacion y el uso de las sondas FET, o resultan en ensayos que son menos sensibles de lo que podnan ser. La principal de estas limitaciones es la presencia de fluorescencia de fondo atribuible a las emisiones del inhibidor de fluorescencia, que da a la sonda un ruido fluorescente de fondo mas alto que lo deseado. Un enfoque que se usa para mejorar esta limitacion es el uso de un inhibidor de fluorescencia que no es un fluoroforo ("inhibidores de fluorescencia oscuros"), tales como derivados de 4-(dimetilamino)azobenceno (DABCYL). DABCYL es util como agente inhibidor de fluorescencia para un numero limitado de fluoroforos con cuyas caractensticas de emision, las caractensticas de absorcion del DABCYL se superponen. El intervalo limitado de absorcion del DABCYL restringe la utilidad de este compuesto al permitir el uso de un numero limitado de fluoroforos en conjunto con el DABCYL. Debido a que relativamente pocos fluoroforos se pueden usar con DABCYL en pares FET, aplicaciones multiplex, donde se desea usar dos o mas fluoroforos con espectros de emision de fluorescencia claramente resueltos son diffciles de disenar por medio del uso de este inhibidor de fluorescencia.
En vista de las limitaciones de los inhibidores de fluorescencia oscuros y sondas disponibles actualmente, tales como sondas FET construidas con estos inhibidores de fluorescencia, existe en la tecnica una necesidad de inhibidores de fluorescencia mejorados que se puedan incorporar en sondas para detectar analitos rapidamente, sensiblemente, fiablemente y cuantitativamente. Los inhibidores de fluorescencia ideales senan los que tienen de poca a ninguna senal de fluorescencia de apagado, y que se preparan facilmente y economicamente. Ademas, una serie de inhibidores de fluorescencia que tengan propiedades ffsicas similares, pero distintas propiedades espectrales senan particularmente ventajosas. Bastante sorprendentemente, la presente invencion proporciona tales inhibidores de fluorescencia, sondas que incorporan estos inhibidores de fluorescencia y metodos para usar los inhibidores de fluorescencia y las sondas.
El documento WO 99/64431 describe compuestos que comprenden purinas sustituidas en la posicion C-8 y pirimidinas sustituidas en la posicion C-4 o C-5 con un enlazador y un inhibidor de fluorescencia.
La US 2,554,443 divulga el siguiente compuesto:
imagen1
como un colorante para tenir la piel.
La US 4,313,87 divulga un metodo para preparar el siguiente compuesto
imagen2
RESUMEN DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona una familia de inhibidores de fluorescencia de energfa de estado de excitacion que son sustancialmente no-fluorescentes, denominados "inhibidores de fluorescencia del Agujero Negro" ("BHQs"). Los inhibidores de fluorescencia de la invencion remedian muchas de las deficiencias de los inhibidores de fluorescencia oscuros usados actualmente, sondas ensambladas por medio del uso de estos inhibidores de fluorescencia y metodos que usan tales inhibidores de fluorescencia y sondas. La presente invencion proporciona
5
10
15
20
25
30
una clase de inhibidores de fluorescencia oscuros que se funcionalizan para permitir su rapida union a los componentes de la sonda por medio del uso de tecnicas bien conocidas en la tecnica, o modificaciones de tales tecnicas que estan dentro de las habilidades de los expertos en la tecnica. Ademas, la presente invencion proporciona una clase de inhibidores de fluorescencia oscuros que pueden modificarse para tener un perfil de absorcion de la luz deseado. La provision de esta clase de inhibidores de fluorescencia oscuros representa una mejora sustancial en el diseno de sondas que incorporan inhibidores de fluorescencia oscuros y metodos que usan tales sondas.
Muchas de las sondas de acidos nucleicos que se usan actualmente dependen de la interaccion entre el fluoroforo y el inhibidor de fluorescencia para minimizar la fluorescencia de la sonda en ausencia de su hibridacion a un acido nucleico complementario. La interaccion entre el fluoroforo y el inhibidor de fluorescencia se provoca tfpicamente por medio del uso de una secuencia de sonda de acidos nucleicos que forma una estructura secundaria (por ejemplo, horquilla, bucle, etc.). Requerir que la sonda adopte una estructura secundaria complica significativamente el diseno de la sonda y restringe grandemente las secuencias de acidos nucleicos que se pueden usar como componentes de las sondas. En contraste, las sondas de acidos nucleicos que usan BHQs de la presente invencion se encuentra que facilitan la interaccion entre el inhibidor de fluorescencia y el fluoroforo sin requerir la formacion concomitante de la estructura secundaria de acidos nucleicos, y de ese modo permite el uso de una diversidad de secuencias de acidos nucleicos mucho mayor como componentes de las sondas fluorescentes.
Ademas, al variar el numero y la identidad de los miembros del sistema conjugado de los BHQs, las propiedades espectrales (por ejemplo, la absorbancia) de un BHQ se puede "ajustar" para hacer coincidir las caractensticas espectrales (por ejemplo, la emision) de uno o mas fluoroforos. Por ejemplo, como los BHQs de la presente invencion se pueden seleccionar para tener un amplio intervalo de absorbancia maxima, estos inhibidores de fluorescencia son singularmente adecuados para usar en aplicaciones de multiplexacion. Ademas, la habilidad de seleccionar un BHQ que tiene caractensticas espectrales particulares permite el uso de BHQs en aplicaciones de multiplexacion por medio del uso de uno o mas fluoroforos distintos en combinacion con uno o mas BHQ distintos, y de ese modo expande las opciones de pares donador-aceptor que se pueden incorporar en las sondas.
Los objetos de la presente invencion se definen en las reivindicaciones acompanantes.
Asf, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:
imagen3
As^ en un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:
5
imagen4
Ciertos aspectos de la invencion descrita mas abajo involucran un compuesto de la siguiente Formula (I):
10
imagen5
En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:
5
10
15
20
25
imagen6
Ciertos aspectos de la invencion descrita mas abajo involucran un compuesto de la siguiente Formula (II):
imagen7
En un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para determinar si una muestra contiene una enzima. El metodo incluye: (a) poner en contacto la muestra con un constructo peptidico que incluye un fluoroforo; (b) excitar dicho fluoroforo; y (c) determinar una propiedad de fluorescencia de dicha muestra, en donde la presencia de dicha enzima en dicha muestra resulta en un cambio en dicha propiedad de fluorescencia.
Los constructos peptfdicos incluyen: i) un fluoroforo; ii) un compuesto de la invencion o un compuesto de la formula (I) o la formula (ll) anteriormente; y iii) un sitio de reconocimiento de escision para la enzima. Por otra parte, el peptido esta en una configuracion que permite la transferencia de energfa donador-aceptor entre el fluoroforo y el compuesto cuando el fluoroforo se excita.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para determinar si un compuesto altera una actividad de una enzima. El metodo comprende (a) poner en contacto una muestra que comprende la enzima y el compuesto con un constructo peptfdico que comprende i) un fluoroforo; ii) un compuesto de la invencion o un compuesto de la formula (I) o formula (lI); y iii) un sitio de reconocimiento de la escision para la enzima, en donde el peptido esta en una configuracion que permite la transferencia de energfa donador-aceptor entre el fluoroforo y el compuesto cuando el fluoroforo se excita; (b) excitar dicho fluoroforo; y (c) determinar una propiedad de fluorescencia de la muestra. La actividad de dicha enzima en dicha muestra resulta en un cambio de la propiedad de fluorescencia.
En un sexto aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para detectar una secuencia objetivo de acido nucleico. El metodo incluye: (a) poner en contacto la secuencia objetivo con un acido nucleico detector que incluye una secuencia de union objetivo monocatenaria; (b) hibridar la secuencia de union objetivo a la secuencia objetivo, y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de ese modo alterar la configuracion del acido nucleico detector, causando un cambio en un parametro de fluorescencia; y (c) detectar el cambio en el parametro de fluorescencia, y de ese modo detectar la secuencia objetivo de acido nucleico.
En los metodos descritos en la presente descripcion, a menos que se indique lo contrario, un acido nucleico detector preferido incluye una secuencia de union objetivo monocatenaria. La secuencia de union se enlaza a: i) un fluoroforo; y ii) un compuesto de la invencion o de la formula (I) o formula (II).
En un septimo aspecto, la invencion proporciona un metodo para detectar la amplificacion de una secuencia objetivo. El metodo incluye el uso de una reaccion de amplificacion que incluye las siguientes etapas: (a) hibridar la secuencia objetivo y un acido nucleico detector. El acido nucleico detector incluye una secuencia de union objetivo monocatenaria y una estructura 5' secundaria intramolecularmente asociada a la secuencia de union objetivo. al menos una porcion de la secuencia detectora forma una cola monocatenaria que esta disponible para la hibridacion de la secuencia objetivo; (b) extender el acido nucleico detector hibridado en la secuencia objetivo con una polimerasa para producir un producto de extension de acido nucleico detector y separar el producto de extension de acido nucleico detector desde la secuencia objetivo; (c) hibridar un iniciador para el producto de extension de acido nucleico detector y extender el iniciador con la polimerasa, y de ese modo linealizar la estructura secundaria intramolecularmente asociada y producir un cambio en un parametro de fluorescencia; y (d) detectar el cambio en el parametro de fluorescencia, y de ese modo detectar la secuencia objetivo.
En un octavo aspecto, la invencion proporciona un metodo para determinar si un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico se hibridan. En este metodo, el primer acido nucleico incluye un compuesto de acuerdo con la invencion o de la formula (I) o formula (II). El metodo incluye: (a) poner en contacto el primer acido nucleico con el segundo acido nucleico; (b) detectar una alteracion en una propiedad fluorescente de un elemento seleccionado del primer acido nucleico, el segundo acido nucleico y una combinacion de estos, y de ese modo determinar si ocurre la hibridacion.
La invencion proporciona adicionalmente un microarreglo que comprende un compuesto de la invencion o de la formula (I) o la formula (II). El compuesto se conjuga directamente con un soporte solido o con una molecula portadora unida al soporte solido.
La invencion proporciona ademas un metodo para probar un microarreglo para la presencia de un compuesto. El metodo incluye: (a) poner en contacto el microarreglo con una sonda que interactua con el compuesto. Las sondas incluyen un compuesto de la invencion o de la formula (I) o formula (II); y (b) detectar una diferencia en una propiedad de fluorescencia de un elemento seleccionado de la sonda, el compuesto y combinaciones de estos, y de ese modo determinar la presencia del compuesto.
La presente invencion incluye ademas una mezcla que incluye al menos una primera molecula portadora y una segunda molecula portadora. La primera molecula portadora une covalentemente a ella un compuesto de la invencion o de la formula (I) o formula (II). La segunda molecula portadora tiene covalentemente unida a ella un compuesto de la invencion o de la formula (I) o la formula (II). En relacion con esto, se proporciona un metodo para detectar o cuantificar unas especies moleculares, el metodo comprende: poner en contacto las especies moleculares con una mezcla como se describio; y detectar un cambio en la propiedad fluorescente de un componente de dicha mezcla, las especies moleculares y una combinacion de ellas, y de ese modo detectar o cuantificar dichas especies moleculares.
Los aspectos adicionales de la invencion son:
(A) un compuesto de la invencion que esta unido covalentemente a: una molecula pequena con un peso molecular de menos de 1000 dalton, una protema, un peptido, un polfmero sintetico, un soporte solido;
(B) una sonda que incluye un compuesto de la invencion o un compuesto de la formula (I) o formula (II) conjugado con un receptor, una enzima, un ligando para una especie objetivo que es un acido nucleico o un peptido, o a una molecula pequena con un peso molecular de menos de 1000 dalton;
(C) un compuesto de la invencion o un conjugado que comprende uno o mas de dichos compuestos inmovilizados en un polfmero, biomolecula o material solido o semisolido que tenga cualquier configuracion util;
(D) una especie que contiene un compuesto de la invencion y dentro una matriz de acrilamida.
Los objetos y ventajas adicionales de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica despues de examinar la descripcion detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Fig. 1 es un esquema sintetico ilustrativo para la preparacion de un BHQ de la invencion.
La Fig: 2 es una coleccion de estructuras de BHQ ilustrativas (BH1, BH2 y BH3) de la invencion.
La Fig. 3 es una coleccion de estructuras de un BHQ ilustrativas unidas a un soporte de vidrio de poro controlado (BH1-CPG) e intermedios a lo largo de smtesis de BH1-CPG.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La Fig. 4 es una coleccion de estructuras de un BHQ ilustrativo unido a un soporte de vidrio de poro controlado (BH2- CPG) e intermedios a lo largo de smtesis de BH2-CPG.
La Fig. 5 es una coleccion de estructuras de un BHQ ilustrativo unido a un soporte de vidrio de poro controlado (BH3- CPG) e intermedios a lo largo de smtesis de BH3-CPG.
La Fig. 6 es una coleccion de estructuras de derivados activados de BH1.
La Fig. 7 (a-b) es una comparacion del espectro de absorbancia del Dabcyl y los BHQs de la invencion:
(a) es un grafico de superposicion del espectro de absorbancia de BH1 y el espectro de emision de tres fluoroforos usados comunmente FAM, TET y JOE;
(b) es un grafico de superposicion del espectro de absorbancia de DABCYL y el espectro de emision de tres fluoroforos usados comunmente FAM, TET y JOE.
La Fig. 8 es una serie de estructuras de acido nucleico que incorporan los BHQ ilustrativos de la invencion.
Descripcion detallada de la invencion y modalidades preferidas
Abreviaturas
"BHQ," como se usa en la presente descripcion, se refiere a "Inhibidor de fluorescencia del Agujero Negro."
"FET," como se usa en la presente descripcion, se refiere a "Transferencia de energfa de fluorescencia." "FRET," como se usa en la presente descripcion, se refiere a "Transferencia de energfa de resonancia fluorescente." Estos terminos se usan en la presente descripcion para referirse a procesos de transferencia de energfa radioactivos y no radioactivos. Por ejemplo, los procesos en los que un proton se emite y aquellos que involucran transferencia de electrones de intervalo prolongado se incluyen en estos terminos. A lo largo de estas especificaciones, ambos fenomenos se subsuman bajo el termino general "transferencia de energfa donador-aceptor".
Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra forma, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente descripcion tienen, generalmente, el mismo significado que el conocido comunmente por aquellos con experiencia en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Generalmente, la nomenclatura usada en la presente descripcion y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genetica molecular, qrnmica organica y qrnmica de acidos nucleicos e hibridacion descritos mas abajo son aquellos bien conocido y empleados en la tecnica. Se usan tecnicas estandar para la smtesis de acidos nucleicos y polipeptidos. Generalmente, las reacciones enzimaticas y las etapas de purificacion se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las tecnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con metodos convencionales en la tecnica y varias referencias generales (ver generalmente, Sambrook y otros MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que se incorpora en la presente descripcion como referencia), que se proporcionan a traves de todo este documento. La nomenclatura usada en la presente descripcion y en los procedimientos de laboratorio en la qrnmica analttica, y smtesis organica descrita mas abajo son aquellos conocidos y que se emplean comunmente en la tecnica. Tecnicas estandar, o modificaciones de estas, se usan para smtesis qrnmica y analisis qmmicos.
"Analito", como se usa en la presente descripcion significa cualquier compuesto o molecula de interes para el cual se realiza una prueba diagnostica. Un analito puede ser, por ejemplo, una protema, peptido, carbohidrato, polisacarido, glicoprotema, hormona, receptor, antfgeno, anticuerpo, virus, sustrato, metabolito, analogo al estado de transicion, cofactor, inhibidor, farmaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento, etc.
Como se usa en la presente descripcion, "transferencia de energfa" se refiere al proceso por el cual la energfa en estado de excitacion de un grupo excitado se altera por un grupo modificador, tal como un inhibidor de fluorescencia. Si el grupo modificador de energfa del estado de excitacion es un grupo inhibidor de la fluorescencia, entonces la emision de fluorescencia del grupo fluorescente se atenua (se inhibe la fluorescencia). La transferencia de energfa puede ocurrir mediante la transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia, o mediante la transferencia de energfa directa. Los mecanismos exactos de transferencia de energfa en estos dos casos son diferentes. Ha de entenderse que cualquier referencia a transferencia de energfa en la presente aplicacion abarca todos estos fenomenos con mecanismos distintos.
Como se usa en la presente descripcion, "par de transferencia de energfa" se refiere a dos moleculas cualquiera que participan en la transferencia de energfa. Tfpicamente, una de las moleculas actua como un grupo fluorescente, y la otra actua como un grupo modificador de la fluorescencia. El par de transferencia de energfa preferido de la presente invencion comprende un grupo fluorescente y un grupo de inhibicion de fluorescencia de la invencion. Todo lo que se requiere es que las propiedades espectroscopicas del par de transferencia de energfa como un todo cambien en alguna forma medible si la distancia entre los miembros individuales se altera en alguna cantidad cntica. "Par de transferencia de energfa" se usa para referirse a un grupo de moleculas que forman un complejo dentro del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cual ocurre la transferencia de ene^a. Tales complejos pueden incluir, dos grupos fluorescentes, que pueden ser diferentes uno del otro y un grupo inhibidor de la fluorescencia, o multiples grupos fluorescentes y multiples grupos inhibidores de la fluorescencia. En los casos donde hay multiples grupos fluorescentes y/o multiples grupos inhibidores de la fluorescencia, los grupos individuales pueden ser diferentes unos de otros.
Como se usa en la presente descripcion, "grupo modificador de la fluorescencia" se refiere a una molecula de la invencion que puede alterar en cualquier forma la emision de fluorescencia de un grupo fluorescente. Un grupo modificador de la fluorescencia generalmente logra esto mediante un mecanismo de transferencia de energfa. En dependencia de la identidad del grupo modificador de la fluorescencia, la emision de fluorescencia puede sufrir un numero de alteraciones, que incluyen la atenuacion, la inhibicion de la fluorescencia completa, el aumento, un desplazamiento en la longitud de onda, un desplazamiento en la polaridad, y un cambio en la duracion de la fluorescencia. Un ejemplo de un grupo modificador de la fluorescencia es un grupo inhibidor de la fluorescencia.
Como se usa en la presente descripcion, "grupo inhibidor de la fluorescencia" se refiere a cualquier grupo modificador de la fluorescencia de la invencion que puede atenuar al menos parcialmente la luz emitida por un grupo fluorescente. A esta atenuacion se hace referencia en la presente descripcion como "inhibicion de la fluorescencia". Por lo tanto, la iluminacion del grupo fluorescente en presencia del grupo inhibidor de la fluorescencia lleva a una senal de emision que es menos intensa que la esperada, o incluso completamente ausente. La inhibicion de la fluorescencia tfpicamente ocurre por la transferencia de energfa entre el grupo fluorescente y el grupo inhibidor de la fluorescencia.
Como se usa en la presente descripcion, "acidos nucleicos" significa ADN, ARN, monocatenario, de doble cadena, o motivos de hibridacion mas altamente agregados, y cualquier modificacion de estos. Las modificaciones incluyen aquellas que proporcionan grupos qrnmicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrogeno, interacciones electrostaticas, y fluxionalidad a las bases del ligando de acido nucleico o al ligando de acido nucleico como un todo. Tales modificaciones incluyen acidos nucleicos peptfdicos (PNAs), modificaciones del grupo fosfodiester (por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos), modificaciones del azucar en la posicion 2', modificaciones de la pirimidina en la posicion 5, modificaciones de la purina en la posicion 8, las modificaciones en las aminas exodclicas, sustitucion de 4-tiouridina, sustitucion de 5-bromo o 5-iodo-uracilo; las modificaciones en la cadena principal, metilaciones, combinaciones de pareamiento de bases inusual tales como las isobases, isocitidina e isoguanidina y similares. Los acidos nucleicos pueden incluir ademas bases no naturales, tal como, por ejemplo, nitroindol. Las modificaciones pueden ademas incluir las modificaciones 3' y 5' tales como el tapado con un BHQ, un fluoroforo u otra porcion.
"Peptido" se refiere a un polfmero en el que los monomeros son aminoacidos y se unen mediante enlaces amida, alternativamente denominados polipeptidos. Cuando los amino acidos son a-amino acidos, se puede usar ya sea el isomero optico-L o el isomero optico-D. Ademas, se incluyen tambien los aminoacidos no naturales, por ejemplo, p- alanina, fenilglicina y homoarginina. Los aminoacidos que comunmente se encuentran y que no son codificados por genes tambien se pueden usar en la presente invencion. Todos los aminoacidos usados en la presente invencion pueden ser D-o L-isomeros. Se prefieren generalmente los L -isomeros. Adicionalmente, otros peptidomimeticos son utiles ademas en la presente invencion. Para una revision general, ver, Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, p. 267 (1983).
"Especies bioactivas" se refiere a moleculas que, cuando se administran al organismo afectan ese organismo. Las especies bioactivas ilustrativas incluyen productos farmaceuticos, pesticidas, herbicidas, reguladores de crecimiento y similares. Las especies bioactivas abarcan moleculas pequenas (por ejemplo, aproximadamente <1000 dalton), oligomeros, polfmeros y similares. Ademas se incluyen los acidos nucleicos y sus analogos, peptidos y sus analogos y similares.
El termino "alquilo" se usa en la presente descripcion para referirse a un radical hidrocarburo monovalente, ramificado o no ramificado, saturado o insaturado, que tiene generalmente aproximadamente de 1-30 carbonos y preferentemente, de 4-20 carbonos y con mayor preferencia de 6-18 carbonos. Cuando el grupo alquilo tiene de 1-6 atomos de carbono, se denomina "alquilo inferior". Los radicales alquilo incluyen, por ejemplo, estructuras que contienen uno o mas grupos metileno, metina y/o meteno. Las estructuras ramificadas tienen un motivo ramificador similar a i-propilo, t-butilo, i-butilo, 2-etilpropilo, etc. Como se usa en la presente descripcion, el termino abarca "alquilos sustituidos," y "alquilo dclico."
"Alquilo sustituido" se refiere a alquilo como se describio que incluyen uno o mas sustituyentes tales como, por ejemplo, alquilo inferior, arilo, acilo, halogeno (es dear, haloalquilos, por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, tioamido, aciloxi, ariloxi, ariloxialquilo, mercapto, tia, aza, oxo, hidrocarburos dclicos saturados e insaturados, heterociclos y similares. Estos grupos pueden unirse a cualquier carbono o sustituyente de la porcion alquilo. Ademas, estos grupos pueden ser colgantes de, o integrales con, la cadena de alquilo.
El termino "arilo" se usa en la presente descripcion para referirse a un sustituyente aromatico, que puede ser un solo anillo aromatico o multiples anillos aromaticos que se fusionan juntos, se enlazan covalentemente, o se enlazan a un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
grupo comun tal como porcion diazo, metileno o etileno. El grupo de enlace comun puede ser ademas un carbonilo como en la benzofenona. El(los) anillo(s) pueden incluir fenilo, naftilo, bifenilo, difenilmetilo y benzofenona entre otros. El termino "arilo" abarca "arilalquilo" y "arilo sustituido".
"Arilo sustituido" se refiere a arilo como se describio que incluye uno o mas grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halogeno, haloalquilos (por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, fenoxi, mercapto e hidrocarburos dclicos ambos saturados e insaturados que se funden al anillo(s) aromatico, enlazado covalentemente o enlazado a grupos comunes tales como una porcion diazo, metileno o etileno. El grupo de enlace puede ademas ser un carbonilo tal como ciclohexil fenil cetona. El termino "arilo sustituido" abarca "arilalquilo sustituido".
El termino "arilalquilo" se usa en la presente descripcion para referirse a un subconjunto de "arilo" en el cual el grupo arilo se une a otro grupo por un grupo alquilo como se define en la presente descripcion.
"Arilalquilo sustituido" define un subconjunto de "arilo sustituido" en donde el grupo arilo sustituido esta unido a otro grupo por un grupo alquilo como se define en la presente descripcion.
El termino "acilo" se usa para describir un sustituyente cetona, -C(O)R, donde R es aquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido como se define en la presente descripcion.
El termino "halogeno" se usa en la presente descripcion para referirse a atomos de fluor, bromo, cloro y yodo.
El termino "hidroxi" se usa en la presente descripcion para referirse al grupo -OH.
El termino "amino" se usa para -NRR', en donde R y R' son independientemente H, alquilo, arilo o analogos sustituidos de estos. "Amino" abarca "alquilamino" que denota aminas secundarias y terciarias y "acilamino" que describe el grupo RC(O)NR'.
El termino "alcoxi" se usa en la presente descripcion para referirse al grupo -OR, donde R es alquilo, o un analogo sustituido de este. Los radicales alcoxi adecuados incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, t-butoxi, etc.
Como se usa en la presente descripcion, el termino "ariloxi" denota grupos aromaticos que se enlazan a otro grupo directamente mediante un atomo de oxfgeno. Este termino abarca porciones "ariloxi sustituidas" en que el grupo aromatico se sustituye como se describio anteriormente para "arilo sustituido." Las porciones ariloxi ilustrativas incluyen fenoxi, fenoxi sustituido, benciloxi, fenetiloxi, etc.
Como se usa en la presente descripcion "ariloxialquilo" define grupos aromaticos unidos, mediante un atomo de oxfgeno a un grupo alquilo, como se define en la presente descripcion. El termino "ariloxialquilo" abarca porciones "ariloxialquilo sustituidas" en las que el grupo aromatico se sustituye como se describio para "arilo sustituido."
Como se usa en la presente descripcion, el termino "mercapto" define porciones de la estructura general -S-R en donde R es H, alquilo, arilo o heterodclico como se describe en la presente descripcion.
El termino "hidrocarburo dclico saturado" denota grupos tales como el ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, etc, y analogos sustituidos de esas estructuras. Estos hidrocarburos dclicos pueden ser estructuras de un solo o multiples anillos.
El termino "hidrocarburo dclico insaturado" se usa para describir un grupo no aromatico monovalente con al menos un enlace doble, tal como ciclopenteno, ciclohexeno, etc. y analogos sustituidos de estos. Estos hidrocarburos dclicos pueden ser estructuras de un solo o multiples anillos.
El termino "heteroarilo" como se usa en la presente descripcion se refiere a anillos aromaticos en los cuales uno o mas atomos de carbono del anillo aromatico se sustituyen por un heteroatomo tal como nitrogeno, oxfgeno o azufre. Heteroarilo se refiere a estructuras que pueden ser un solo anillo aromatico, anillo aromatico(s), multiple o uno o mas anillos aromaticos unidos a uno o mas anillos no-aromatico(s). En estructuras que tienen multiples anillos, los anillos se pueden fundir juntos, enlazarse covalentemente, o enlazarse a un grupo comun tal como una porcion diazo, metileno o etileno. El grupo de enlace puede ser ademas un carbonilo como en fenil piridil cetona. Como se usa en la presente descripcion, los anillos como tiofeno, piridina, isoxazol, ftalimida, pirazol, indol, furano, etc. o analogos benzo-fusionados de estos anillos se definen por el termino "heteroarilo."
"Heteroarilalquilo" define un subconjunto de "heteroarilo" en donde un grupo alquilo, como se define en la presente descripcion, une el grupo heteroarilo a otro grupo.
"heteroarilo sustituido" se refiere a heteroarilo como el descrito en donde el nucleo del heteroarilo es sustituido con uno o mas grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halogeno, haloalquilos (por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, mercapto, etc. Por lo tanto, los analogos sustituidos de anillos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
heteroaromaticos como tiofeno, piridina, isoxazol, ftalimida, pirazol, indol, furano, etc. o analogos benzo-fusionados de estos anillos se definen por el termino "heteroarilo sustituido."
"Heteroalquilo sustituido" se refiere a un subconjunto "heteroarilo sustituido " como se describe anteriormente en el que un grupo alquilo, como se define en la presente descripcion, enlaza el grupo heteroarilo a otro grupo.
El termino "heterodclico" se usa en la presente descripcion para describir un grupo monovalente saturado o insaturado no-aromatico que tiene un solo anillo o multiples anillos condensados desde 1-12 atomos de carbono y desde 1-4 heteroatomos seleccionados de nitrogeno, sulfuro u oxfgeno dentro del anillo. Tales heterociclos son, por ejemplo, tetrahidrofurano, morfolina, piperidina, pirrolidina, etc.
El termino "heterodclico sustituido" como se usa en la presente descripcion describe un subconjunto de "heterodclicos" en donde el nucleo heterodclo se sustituye con uno o mas grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halogeno, haloalquilos (por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, mercapto, etc.
El termino "alquilo heterodclico" define un subconjunto de "heterodclico" en donde un grupo alquilo, como se define en la presente descripcion, enlaza el grupo heterodclico a otro grupo.
Introduccion
La presente invencion proporciona una clase de modificadores de fluorescencia, particularmente inhibidores de fluorescencia, de energfa de estado de excitacion. Los compuestos de la invencion absorben energfa de estado de excitacion de un fluoroforo reportero, pero son ellos mismos sustancialmente no-fluorescentes. El fluoroforo que transfiere la energfa de estado de excitacion a los inhibidores de fluorescencia de la invencion sera generalmente una etiqueta que se une a un analito o una especie que interactua con, y permite la deteccion y/o cuantificacion del analito.
Las etiquetas fluorescentes tienen la ventaja de requerir pocas precauciones en su manipulacion, y ser dociles para tecnicas de visualizacion de alto flujo (los analisis opticos incluyen la digitalizacion de imagenes para el analisis en un sistema integrado que incluye una computadora) Las etiquetas preferidas se caracterizan tipicamente por uno o mas de los siguientes: alta sensibilidad, alta estabilidad, bajo fondo, baja sensibilidad ambiental y alta especificidad en el etiquetado. Muchas etiquetas fluorescentes estan disponibles comercialmente de la comparna qmmica SIGMA (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Reasearch , Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica- Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), y Applied Biosistems (Foster City, CA), asf como muchas otras fuentes comerciales conocidas por los expertos. Ademas, los expertos en la tecnica reconoceran como seleccionar un fluoroforo apropiado para una aplicacion particular y, si no esta facilmente disponible comercialmente, seran capaces de sintetizar el fluoroforo necesario de novo o modificar sinteticamente compuestos fluorescentes comercialmente disponibles para llegar a la etiqueta fluorescente deseada.
Adicionalmente un fluoroforos de moleculas pequenas, protemas fluorescentes de origen natural y analogos modificados de tales protemas son utiles en la presente invencion. Tales protemas incluyen, por ejemplo, protema verde fluorescente de los cnidarios (Ward y otros, Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine y otros, Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85 (1982)), protema amarilla fluorescente de la cepa Vibrio fischeri (Baldwin y otros, Biochemistry 29:5509-15 (1990)), Peridinina-clorofila de Symbiodinium dinoflagelado sp. (Morris y otros, Plant Molecular Biology 24:673:77 (1994)) ficobiliprotemas de cianobacterias marinas, tales como Synechococcus, por ejemplo, ficoeritrina y ficocianina (Wilbanks y otros, J. Biol. Chem. 268:1226-35 (1993)), y similares.
Inhibidor de fluorescencia del Agujero Negro
La presente invencion se refiere a una familia de inhibidores de fluorescencia oscuros que se denominan en la presente descripcion como "Inhibidor de fluorescencia del Agujero Negro™" ("BHQ"). Los inhibidores de fluorescencia de la invencion incluyen sistemas n-enlazados conjugados que son preferentemente especies aromaticas azo-enlazadas.
La presente invencion proporciona un inhibidor de fluorescencia de energfa de estado de excitacion que tiene una estructura que comprende al menos tres radicales seleccionados de arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido y combinaciones de estos, en donde al menos dos de los residuos se enlazan covalentemente a traves de un enlace diazo exodclico, el inhibidor de fluorescencia adicionalmente comprende un grupo funcional reactivo que proporciona un locus para la conjugacion del inhibidor de fluorescencia a la molecula portadora. Aunque los inhibidores de fluorescencia se pueden usar en su forma libre no enlazada, generalmente se prefiere que esten atados a otra especie, asf los inhibidores de fluorescencia preferidos ademas comprenden un grupo funcional reactivo que proporciona un locus para la conjugacion del inhibidor de fluorescencia a una molecula
5
10
15
20
25
30
35
40
45
portadora. Mas particularmente, las estructuras son como las que se expusieron anteriormente bajo el encabezamiento "Resumen de la invencion".
En otra modalidad preferida, los BHQs de la invencion descritos en la presente descripcion no tienen sustancialmente fluorescencia nativa, particularmente cerca de su absorbancia maxima o cerca de la absorbancia maxima del fluoroforos usado en conjunto con los BHQs. Los BHQ tendran preferentemente una absorbancia maxima de aproximadamente 400 nm a aproximadamente 760 nm, y con mayor preferencia, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 600 nm.
Grupos funcionales reactivos
Los compuestos de la invencion contienen un grupo funcional reactivo. Los grupos reactivos y clases de reacciones utiles en la practica de la presente invencion son generalmente aquellos que se conocidos en la tecnica de qmmica de bioconjugados. Actualmente las clases favorecidas de reacciones disponibles con reactivos BHQs son aquellas que proceden bajo condiciones relativamente suaves. Estas incluyen sustituciones nucleofflicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con acil haluros, esteres activos), sustituciones electrofflicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a multiples enlaces carbono-carbono y carbono-heteroatomo (por ejemplo, reaccion de Michael, adicion de Diels-Alder). Estas y otras reacciones utiles se discuten en, por ejemplo, Marzo, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3ra Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney y otros, MODIFICATION OF PROTEINS; Serie Advances in Chemistry, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
Los grupos funcionales reactivos utiles incluyen, por ejemplo:
(a) los grupos hidroxilo, que pueden convertirse a esteres, eteres, aldetudos, etc; y
(b) fosforamiditas y otros grupos funcionales estandar utiles en la smtesis de acidos nucleicos.
Los grupos funcionales reactivos se pueden elegir de forma que ellos no participen en, o interfieran con, las reacciones necesarias para ensamblar en analogo BHQ reactivo. Alternativamente, un grupo funcional reactivo se puede proteger de participar en la reaccion por la presencia de un grupo protector. Aquellos con experiencia en la tecnica entienden como proteger un grupo funcional particular de manera que no interfiera con un conjunto seleccionado de condiciones de reaccion. Para ejemplos de grupos protectores utiles, ver, por ejemplo, Greene y otros, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.
Porciones donadors y aceptoras.
Una de las ventajas de los compuestos de la invencion es que se pueden usar una amplia variedad de moleculas donadors de energfa en conjunto con los BHQs. Un amplio arreglo de fluoroforos se conoce por los expertos en la tecnica. Ver, por ejemplo, Cardullo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. of Chemical Physics 21: 836- 850 (1953); Hochstrasser y otros, Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992);Selvin, P., Methods in Enzyrnology 246: 300-334 (1995); Steinberg, I. Ann. Rev. Biochem., 40: 83- 114 (1971); Stryer, L. Ann. Rev. Biochem., 47: 819-846 (1978); Wang y otros, Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990); Wang y otros, Anal. Chem. 67: 1197-1203 (1995).
Una lista de donadores ilustrativos que se pueden usar en conjunto con los inhibidores de fluorescencia de la invencion se proporciona en la Tabla 1.
TABLA 1
Porciones adecuadas que se pueden seleccionar como donadores o aceptores en pares de transferencia de energia donador-aceptor
acido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfonico
acridina y derivados:
acridina
acridina isotiocianato
acido 5-(2'-aminoetilo)aminonaftaleno-1-sulfonico (EDANS)
4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato
N-(4-anilino-1-naftilo)maleimida
antranilamida
BODIPY
Porciones adecuadas que se pueden seleccionar como donadores o aceptores en pares de transferencia de energia donador-aceptor
Amarillo Brillante
cumarina y derivados:
cumarina
7-amino-4-metilcumarina (AMC, cumarina 120)
7-amino-4-trifluorometilcoumarina (Coumaran 151)
colorantes de cianina
cianosina
4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)
5', 5"-dibromopirogalol-sulfonaftalina (Bromopirogalol Rojo) 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina pentaacetato de dietilentriamina
acido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulf6nico
acido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulf6nico
cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, dansilcloruro)
acido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL)
4- dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC) eosina y derivados:
eosina
eosina isotiocianato eritrosina y derivados: eritrosina B eritrosina isotiocianato etidio
fluorescema y derivados:
5- carboxifluorescema (FAM)
5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluorescema (DTAF)
2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE) fluorescema
fluorescema isotiocianato
QFITC (XRITC)
fluorescamina
IR144
IR1446
verde malaquita isotiocianato
4-metilumbeliferona
orto cresolftalema
nitrotirosina
pararrosanilina
Rojo de fenol
B-ficoeritrina
5
10
15
20
25
Porciones adecuadas que se pueden seleccionar como donadores o aceptores en pares de transferencia de energia donador-aceptor
o-ftaldialdetudo
pireno y derivados:
pireno
pireno butirato succinimidil 1-pireno butirato puntos quantum
Rojo reactivo 4 (Cibacron™ Rojo brillante 3B-A) rodamina y derivados:
6-carboxi-X-rodamina (ROX)
6-carboxirodamina (R6G)
lisamina rodamina B sulfonil cloruro rodamina (rod)
rodamina B
rodamina 123
rodamina X isotiocianato
sulforodamina B
sulforodamina 101
derivado sulfonil cloruro de sulforodamina 101 (Texas Rojo)
N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) tetrametil rodamina
tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC)
riboflavina
acido rosolico
derivados de quelato de terbio
Hay gran cantidad de orientaciones practicas disponible en la literatura para seleccionar pares donador-aceptor apropiados para sondas particulares, como se ejemplifica por las siguientes referencias: Pesce y otros, Eds., FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, Nueva York, 1971); White y otros, FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, Nueva York, 1970); y similares. La literatura tambien incluye referencias que proporcionan listas exhaustivas de las moleculas fluorescentes y cromogenicas y sus propiedades opticas relevantes para la eleccion de parejas reportero-inhibidor de fluorescencia (ver, por ejemplo, Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2da Edicion (Academic Press, Nueva York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, Nueva York, 1976); Bishop, Ed., INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT sondas y RESEARCH CHEMICALS (Molecular sondas, Eugene, 1992) Pringsheim, FLUORESCENCE y PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, Nueva York, 1949); y similares. Mas aun, hay extensivas orientaciones en la literatura para derivatizar las moleculas reportera e inhibidora de fluorescencia para la union covalente a traves de grupos reactivos comunes que se pueden anadir a un acido nucleico, como se ejemplifica por las siguientes referencias: Haugland (supra); Ullman y otros, patente de los Estados Unidos num. 3,996,345; Khanna y otros, patente de los Estados Unidos num. 4,351,760. Asf, esta bien dentro de las habilidades de los expertos en la tecnica elegir un par intercambiador de energfa para una aplicacion particular y para conjugar los miembros de este par a una molecula sonda, tal como, por ejemplo, un acido nucleico, peptido u otro polfmero.
Generalmente, se prefiere que una banda de absorbancia del BHQ se superponga sustancialmente a la banda de emision de fluorescencia del donador. Cuando el donador (fluoroforo) es un componente de una sonda que usa transferencia de energfa donador-aceptor, la porcion donadora fluorescente y el inhibidor de fluorescencia (aceptor) de la invencion se seleccionan preferentemente de forma que las porciones donadora y aceptora exhiban transferencia de energfa donador-aceptor cuando la porcion donadora se excita. Un factor a considerar en la eleccion del par fluoroforo-inhibidor de fluorescencia es la eficiencia de la transferencia de energfa donador-aceptor entre ellos. Preferentemente, la eficiencia de FRET entre las porciones donador y aceptor es al menos 10%, con mayor preferencia al menos 50% y aun con mayor preferencia al menos 80%. La eficiencia de FRET se puede
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
probar empmcamente facilmente por medio del uso de los metodos descritos en la presente descripcion y conocidos en la tecnica.
La eficiencia de la transferencia de energfa entre el par donador-aceptor se puede ademas ajustar por el cambio de la habilidad de los grupos donador y aceptor de dimerizar o asociarse estrechamente. Si las porciones donador y aceptor se conoce o se determina que estan estrechamente asociadas, se puede promover un aumento o disminucion de la asociacion por el ajuste de la longitud de la porcion enlazadora, o de la misma sonda, entre el donador y el aceptor. La habilidad del par donador-aceptor de asociarse se puede aumentar o disminuir al ajustar las interacciones hidrofobicas o ionicas, o las repulsiones estericas en el constructo de la sonda. Asf, las interacciones intramoleculares responsables por la asociacion del par donador-aceptor se pueden aumentar o atenuar. Asf, por ejemplo, la asociacion entre el par donador-aceptor se puede aumentar por, por ejemplo, usar un donador que contiene una carga total negativa y un aceptor con una carga total positiva.
Adicionalmente a los fluoroforos que se unen directamente a una sonda, los fluoroforos pueden ademas unirse por medios indirectos. En esta modalidad, una molecula ligando (por ejemplo, biotina) se une generalmente covalentemente a las especies sonda. El ligando despues se une a otras moleculas (por ejemplo, estreptavidina) molecula, que es ya sea inherentemente detectable o se une covalentemente a un sistema senal, tal como un compuesto fluorescente, o una enzima que produce un compuesto fluorescente por la conversion de un compuesto no fluorescente. Las enzimas utiles de interes como etiquetas incluyen, por ejemplo, hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, hidrolasas, peptidasas u oxidasas, particularmente peroxidasas, y los compuestos fluorescentes incluyen fluorescema y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, etc., como se discutio anteriormente. Para una revision de diversos sistemas de etiquetado o produccion de la senal que se pueden usar, ver la patente de los Estados Unidos num. 4,391,904.
Actualmente los donadores preferidos para usar en conjunto con BHQ, incluyen, por ejemplo, colorantes de xanteno, que incluyen fluorescemas, colorantes de cianina y colorantes de rodamina. Muchas formas adecuadas de estos compuestos estan ampliamente disponibles comercialmente con sustituyentes en sus porciones fenilo, que se pueden usar como sitio para enlazamiento o como la funcionalidad de enlazamiento para la union a un acido nucleico. Otro grupo de compuestos fluorescentes preferidos son las naftilaminas, que tienen un grupo amino en la posicion alfa o beta. Incluidos entre tales compuestos naftilaminos estan 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1 -anilino-8- naftaleno sulfonato y 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato. Otros donadores incluyen 3-fenil-7-isocianatocumarina, acridinas, tales como 9-isotiocianatoacridina y naranja de acridina; N-(p-(2-benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazoles, estilbenos, pirenos, y similares.
Para claridad de ilustracion, la discusion mas abajo se enfoca en unir BHQs y fluoroforos a acidos nucleicos. Los expertos en la tecnica apreciaran que los BHQs pueden ademas unirse a moleculas pequenas, protemas, peptidos, polfmeros sinteticos, soportes solidos y similares por medio del uso de qmmica sintetica estandar.
En una modalidad preferida actualmente, en la que la sonda es una sonda de acidos nucleicos, la molecula reportera es un colorante fluorescema (FAM). La porcion fluorescema se une preferentemente a ya sea al 3'- o el 5'- terminal del acido nucleico, aunque los sitios internos son ademas accesibles y tienen utilidad para propositos seleccionados. A cualquier terminal que se una el derivado FAM, el BHQ generalmente se unira a su antfpoda, o a una posicion interna a la cadena de acidos nucleicos. El donador FAM se introduce preferentemente por medio del uso de una 6-FAM amidita. Grupos donadores diferentes se introducen ademas preferentemente por medio del uso de un derivado de amidita del donador. Alternativamente, los grupos donadores que comprenden grupos reactivos (por ejemplo, isotiocianatos, esteres activos, etc.) se pueden introducir a traves de una reaccion con una porcion reactiva en un brazo atador o enlazador unido a los acidos nucleicos (por ejemplo, hexil amina).
En otra modalidad preferida, la porcion donadora puede unirse al 3'-terminal de un acido nucleico por el uso de un soporte sintetico derivatizado. Por ejemplo, TAMRA (tetrametilrodamina acido carboxflico) se une al 3'-terminal de un acido nucleico por medio del uso de un soporte solido que se derivatiza con un analogo de este fluoroforo (Biosearch Technologies, Inc.)
En vista del bien desarrollado cuerpo de literatura relacionado a la conjugacion de moleculas pequenas a acidos nucleicos, muchos otros metodos de unir pares donador/aceptor a acidos nucleicos resultaran evidentes a los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los colorantes rodamina y fluorescema estan convenientemente unidos al 5'- hidroxilo de un acido nucleico en la conclusion de la smtesis de fase solida por via de colorantes derivatizados con una porcion fosforamidita (ver, por ejemplo, Woo y otros, patente de los Estados Unidos num. 5,231,191; y Hobbs, Jr., patente de los Estados Unidos num. 4,997,928).
Mas espedficamente, hay muchas porciones de enlace y metodologfas para unir los grupos a los 5'-o 3'-terminales de los acidos nucleicos, como se ejemplifica en las siguientes referencias: Eckstein, editor, Nucleic acids and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman y otros, Nucleic Acids Research, 15: 53055321 (1987) (grupo 3'-tiol en los acidos nucleicos); Sharma y otros, Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3'- sulfhidrilo); Giusti y otros, PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) y Fung y otros, patente de los Estados Unidos num. 4,757,141 (grupo 5'-fosfoamino via Aminolink TM II disponible de P.E. Biosistemas, CA.) Stabinsky,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
patente de los Estados Unidos num. 4,739,044 (grupo 3-aminoalquilfosforilo); Agrawal y otros, Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (union a traves de enlaces fosforamidato); Sproat y otros, Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (grupo 5-mercapto); Nelson y otros, Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (grupo 3-amino), y similares.
Los medios para detectar etiquetas fluorescentes son bien conocidos para los expertos en la tecnica. As^ por ejemplo, las etiquetas fluorescentes se pueden detectar por la excitacion del fluoroforo con la longitud de onda de luz adecuada y detectar la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, por medio de una pelmula fotografica, por el uso de detectores electronicos tales como dispositivos asociados a carga (CCDs) o fotomultiplicadores y similares. Similarmente, las etiquetas enzimaticas se pueden detectar al proporcionar el sustrato adecuado para la enzima y detectar el producto de reaccion resultante.
Smtesis
Los compuestos de la invencion se sintetizan por una combinacion adecuada de metodos sinteticos generalmente bien-conocidos. Las tecnicas utiles para sintetizar los compuestos de la invencion son evidentes y accesibles para los expertos en la tecnica relevante. La discusion mas abajo se ofrece para ilustrar algunos de los diversos metodos disponible para usar en el ensamblaje de los compuestos de la invencion, no se pretende que definan el alcance de las reacciones o secuencias de reacciones que son utiles para preparar los compuestos de la presente invencion.
Un metodo de sintetizar los compuestos de la invencion se expone en el Esquema 1 (Fig. 1). El esquema 1 es un esquematico generalizado de un esquema sintetico util con los BHQs de la invencion. Un derivado azido de un colorante se acopla a un derivado arilo 1, a pH 9, forma el aducto diazo correspondiente2. El diol 2 se monoprotege con un grupo, tal como el grupo dimetoxitritil para formar el compuesto 3, que tiene una porcion hidroxilo libre. El compuesto 3 se convierte a fosforamidita 4 al ponerlo en contacto con un agente, tal como 2-cianoetil diisopropilclorofosforamidita en presencia de un activador acfdico suave, tal como tetrazol. La fosforamidita se acopla a un soporte de vidrio de poro controlado que contiene hidroxilo y subsecuentemente se oxida al derivado de fosfotriester correspondiente, y de ese modo forma la materia prima adecuada, 5, para la smtesis de un arreglo de acidos nucleicos que se derivatizan en la posicion 3' con un BHQ.
Los esquemas sinteticos recitados anteriormente se pretenden que sean ilustrativos de una modalidad de la invencion, los expertos en la tecnica reconoceran que muchas otras estrategias sinteticas que emplean analogos reactivos de BHQ estan disponibles. Por ejemplo, por una ligera modificacion al metodo anterior, es facilmente accesible un derivado adecuado para la modificacion de un acido nucleico en la posicion 5'. En un esquema alternativo, el compuesto 4, no esta atado a un soporte solido, sino que se anade como la subunidad final durante la smtesis de acidos nucleicos, para preparar un acido nucleico con un grupo 5'-BHQ.
El esquema sintetico descrito anteriormente se puede practicar por medio del uso de una variedad de compuestos BHQ de la invencion, tales como aquellos que se exponen en la Fig. 2. La Fig. 2 proporciona las estructuras de tres BHQs ilustrativos, BH1 (6), BH2 (10) y BH3 (14).
La Fig. 3 expone las estructuras de una fosforamidita (8) de BH1 (7), y un derivado de BH1, que esta atado a un soporte de vidrio de poro controlado.9). Ambos la fosforamidita y el conjugado de CPG se pueden preparar por metodos reconocidos en la tecnica, que incluyen aquellos expuestos en la presente descripcion. Similarmente, la Fig. 4 expone las estructuras de una fosforamidita (12) de bH2 (11), y un derivado de BH2, que esta atado a un soporte de vidrio de poro controlado (13) y la Fig. 5 expone las estructuras de una fosforamidita (16) de BH1 (15), y un derivado deBH3, que esta atado a un soporte de vidrio de poro controlado (17).
Todavfa en una modificacion adicional del esquema de la Fig. 1, el compuesto 4se acopla a un acido nucleico
intermedio entre las posiciones 3'- y 5', el grupo DMT se elimina por medio del uso de qmmica estandar de acidos
nucleicos, o una modificacion de esta, y una subunidad de acido nucleico se ata al grupo hidroxilo primario
desprotegido como si el grupo hidroxilo fuera el 5'-hidroxilo de una subunidad de acido nucleico anterior, y de ese modo proporciona un acido nucleico que tiene una porcion BHQ en una posicion interna.
Ensayos y sondas que contienen BHQ.
En otra modalidad preferida, la presente invencion proporciona un BHQ que se ata a otra molecula, tal como una molecula sonda y ensayos que usan estas sondas.
Ensayos
La siguiente discusion es generalmente relevante para los ensayos descritos en la presente descripcion. Otros formatos de ensayo que usan los compuestos de la invencion resultaran evidentes a los expertos en la tecnica.
En general, para determinar la concentracion de una molecula objetivo, tal como, por ejemplo, un acido nucleico, se prefiere primero obtener datos de referencia en los que cantidades constantes de la sonda y el ligando de acido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
nucleico se ponen en contacto con cantidades variables del objetivo. La emision de fluorescencia de cada mezcla de referencia se usa para derivar un grafico o tabla en los que la concentracion del objetivo se compara a la emision de fluorescencia. Por ejemplo, una sonda que: a) hibrida a un ligando de acido nucleico libre de objetivo; y b) tiene una arquitectura de tallo-bucle con los 5' y 3' terminales que son los sitios del grupo fluorescente y el etiquetado BHQ, se puede usar para obtener tales datos de referencia. Tal sonda da un perfil de emision caractenstico en el que la emision de fluorescencia disminuye a medida que aumenta la concentracion del objetivo en presencia de una cantidad constante de sonda y ligando de acido nucleico. Despues, una mezcla de prueba con una cantidad desconocida del objetivo se pone en contacto con la misma cantidad primero del ligando de acido nucleico y segundo la sonda, y se determina la emision de fluorescencia. El valor de la emision de fluorescencia despues se compara con los datos de referencia para obtener la concentracion del objetivo en la mezcla de prueba.
Analisis Multiplex
En otra modalidad preferida, los inhibidores de fluorescencia de la invencion se usan como un componente de una o mas sondas usadas en el ensayo multiplex para detectar una o mas especies en una mezcla.
Las sondas que incluyen los BHQs de la invencion son particularmente utiles para realizar analisis y ensayos de tipo multiplex. En un analisis multiplex tfpico, dos o mas especies distintas (o regiones de una o mas especies) se detectan por medio del uso de una o mas sondas, en donde cada una de las sondas se etiqueta con un fluoroforo diferente. Las especies preferidas usadas en analisis multiplex que dependen de la transferencia de energfa donador-aceptor cumplen al menos dos criterios: la especie fluorescente es brillante y espectralmente bien-resuelta; y la transferencia de energfa entre la especie fluorescente y el inhibidor de fluorescencia es eficiente.
Asf, en una modalidad adicional, la invencion proporciona una mezcla que comprende al menos una primera molecula portadora y una segunda molecula portadora. La primera molecula portadora tiene covalentemente unido a ella un primer inhibidor de fluorescencia de energfa de estado de excitacion que tiene una estructura que comprende al menos tres radicales seleccionados de arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido y combinaciones de estos. Al menos dos de los radicales se enlazan covalentemente a traves de un enlace diazo exodclico. La mezcla incluye ademas una segunda molecula portadora. La segunda molecula portadora tiene covalentemente unido a ella un segundo inhibidor de fluorescencia de energfa de estado de excitacion que tiene una estructura que comprende al menos tres radicales seleccionados de arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido y combinaciones de estos, en donde al menos dos de los radicales estan covalentemente enlazados a traves de un enlace diazo exodclico.
Los BHQs de la invencion permiten el diseno de ensayos multiplex en los que se usa mas de una estructura inhibidora de fluorescencia en el ensayo. Un numero de ensayos multiplex diferentes que usan los BHQs de la invencion resultaran evidentes a los expertos en la tecnica. En un ensayo ilustrativo, cada uno de los al menos dos inhibidores de fluorescencia BHQ distintos se usan para inhibir la energfa derivada de uno o mas fluoroforos identicos. Alternativamente, se puede practicar un ensayo en el que distintos BHQ inhiben la energfa derivada de un fluoroforo distinto al cual el BHQ "corresponde." Los fluoroforos se pueden enlazar a la misma molecula que el BHQ o a una molecula diferente. Ademas, similar a los BHQs y los fluoroforos, las moleculas portadoras de uso en un sistema de ensayo particular pueden ser las mismas o diferentes.
Adicionalmente a las mezclas descritas anteriormente, la presente invencion ademas proporciona un metodo para detectar o cuantificar una especie molecular particular. El metodo incluye: (a) poner en contacto las especies con una mezcla tal como las descritas anteriormente; y (b) detectar un cambio en una propiedad fluorescente de uno o mas componentes de la mezcla, las especies moleculares o una combinacion de estas, y de ese modo detectar o cuantificar las especies moleculares.
Debido a la facil disponibilidad de BHQs de la invencion que tienen diferentes caractensticas de absorbancia, los compuestos de la invencion son particularmente adecuados para usar en aplicaciones multiplex. El acceso a BHQs que tienen una variedad de caractensticas absorbancia permiten el diseno de sondas de transferencia de energfa donador-aceptor en las que las propiedades de emision del aceptor y las propiedades de absorbancia del BHQ se corresponden sustancialmente, y de ese modo proporcionan un nivel util de superposicion espectral (ver, por ejemplo, Fig. 7).
El uso simultaneo de dos o mas sondas que usan la transferencia de energfa donador-aceptor se conoce en la tecnica. Por ejemplo, se han descrito ensayos multiplex que usan sondas de acidos nucleicos con diferentes especificidades de secuencia. Se usan sondas fluorescentes para determinar si un individuo es homocigoto silvestre, homocigoto mutante o heterocigoto para una mutacion particular. Por ejemplo, por medio del uso de una baliza molecular de fluorescema con la fluorescencia inhibida que reconoce la secuencia silvestre y otra baliza molecular de rodamina con la fluorescencia inhibida que reconoce un alelo mutante, es posible determinar el genotipo de individuos para el receptor de p-quimocina (Kostrikis y otros Science 279:1228-1229 (1998)). La presencia de solamente una senal de fluorescema indica que el individuo es silvestre, y la presencia de la senal de rodamina solamente indica que el individuo es homocigoto mutante. La presencia de ambas senales de rodamina y fluorescema es diagnostico de un heterocigoto. Tyagi y otros Nature Biotechnology 16: 49-53 (1998)) describieron el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
uso simultaneo de cuatro balizas moleculares etiquetadas diferentemente para la discriminacion alelica, y Lee y otros, BioTechniques 27: 342-349 (1999) describieron la deteccion homogenea de siete colores de seis productos de PCR.
Los inhibidores de fluorescencia de la presente invencion se pueden usar en ensayos multiplex disenados para detectar y/o cuantificar sustancialmente cualquier especie, lo que incluye, por ejemplo, celulas enteras, virus, protemas (por ejemplo, enzimas, anticuerpos, receptores), glicoprotemas, lipoprotemas, partmulas subcelulares, organismos (por ejemplo, Salmonella), acidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, y analogos de estos), polisacaridos, lipopolisacaridos, lfpidos, acidos grasos, poUmeros no-biologicos y moleculas pequenas (por ejemplo, toxinas, farmacos, pesticidas, metabolitos, hormonas, alcaloides, esteroides).
Sondas
La invencion proporciona sondas que incluyen porciones BHQ conjugadas a, por ejemplo, una especie objetivo (por ejemplo, receptor, enzima, etc.) un ligando para una especie objetivo (por ejemplo, acidos nucleicos, peptido, etc. una molecula pequena (por ejemplo, farmaco, pesticida, etc.), y similares. Las sondas pueden usarse para aplicaciones in vitro e in vivo.
Una ventaja particularmente inesperada y sorprendente de los BHQs es su habilidad de inhibir la energfa de estado de excitacion de fluoroforos unidos a molecula portadoras (por ejemplo, acidos nucleicos) sin la necesidad de disenar componentes que formen estructuras secundarias (por ejemplo, horquillas, bucles, etc.) dentro de la molecula portadora para aproximar el fluoroforo y el BHQ. Los pares de sondas de transferencia de energfa que se usan actualmente en la tecnica tipicamente requieren la introduccion de alguna forma de estructura secundaria para funcionar apropiadamente, y de ese modo limita seriamente la identidad de las especies que se pueden usar como moleculas portadoras. Asf, las sondas de la presente invencion pueden ser de diseno simple, se pueden producir mas economicamente y usarse para sondear una variedad de sistemas mucho mayor en mucho menos tiempo que las sondas actualmente reconocidas en la tecnica.
Aun, otra propiedad inesperada de los BHQs de la invencion es su robustez bajo una variedad de condiciones sinteticas usadas para unir los BHQs a una molecula portadora. Por ejemplo, muchos de los BHQs de la invencion sobreviven las condiciones necesarias para la smtesis automatica de acidos nucleicos sin sufrir ningun grado sustancial de degradacion o alteracion. En contraste, muchos de los inhibidores de fluorescencia reconocidos en la tecnica actualmente en uso requieren del uso de condiciones especiales para ensamblar la molecula portadora a la cual se unen, o tienen que unirse despues de completarse la smtesis de la molecula portadora. La complejidad adicional de la smtesis de una sonda aumenta la duracion y el costo de la smtesis.
Sondas de moleculas pequenas
Los BHQs de la invencion se pueden usar como componentes de sondas de moleculas pequenas. En un diseno preferido, una sonda de molecula pequena incluye un fluoroforo o precursor de fluoroforo y un BHQ. En una modalidad ilustrativa, un agente, tal como una enzima escinde el BHQ, el fluoroforo o ambos de la molecula pequena lo que genera fluorescencia en el sistema bajo investigacion (ver, por ejemplo, Zlokarnik y otros, Science 279: 84-88 (1998)).
Sondas de acidos nucleicos
Los inhibidores de fluorescencia oscuros de la invencion son utiles en conjunto con sondas de acidos nucleicos y se pueden usar como componentes de agentes de deteccion en una variedad de estrategias de amplificacion/cuantificacion de ADN que incluyen, por ejemplo, ensayo de nucleasa 5', amplificacion de desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion basada en secuencia de acidos nucleicos (NASBA), amplificacion en cmculo rodante (RCA), asf como para esayos de deteccion directa de objetivos en fase en solucion o fase solida (por ejemplo, arreglos). Ademas, los acidos nucleicos derivatizados de BHQ se pueden usar en sondas de practicamente cualquier formato, que incluyen, por ejemplo, el formato seleccionado de balizas moleculares, sondas Scorpion™, sondas Sunrise™, sondas conformacionalmente asistidas, sondas de encendido, sondas de deteccion de invasor, y sondas TaqMan™. Ver, por ejemplo, Cardullo, R., y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. Chem. Physics, 21:836-850 (1953); Hochstrasser, R.A., y otros, Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992) ; Selvin, P., Methods in Enzymology, 246:300-334 (1995); Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem., 40:83-114 (1971); Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47:819-846 (1978); Wang, G., y otros, Tetrahedron Letters, 31:6493-6496 (1990); Wang, Y. y otros, Anal. Chem., 67:1197-1203 (1995); Debouck, C. y otros, en suplemento a nature genetics, 21:48-50 (1999); Rehman, F.N., y otros, Nucleic Acids Research, 27:649-655 (1999); Cooper, J.P., y otros, Biochemistry, 29:9261-9268 (1990); Gibson, E.M., y otros, Genome Methods, 6:995-1001 (1996); Hochstrasser, R.A., y otros, Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992); Holland, P.M., y otros, Proc Natl. Acad. Sci USA, 88:7276-7289 (1991); Lee, L.G., y otros, Nucleic Acids Rsch., 21:3761-3766 (1993);Livak, K.J., y otros, PCR Methods y Applications, Cold Spring Harbor Press (1995); Vamosi, G., y otros, Biophysical Journal, 71:972-994
(1996) ;Wittwer, C.T., y otros, Biotechniques, 22:176-181 (1997); Wittwer, C.T., y otros, Biotechniques, 22:130-38
(1997) ; Giesendorf, B.A.J., y otros, Clinical Chemistry, 44:482-486 (1998); Kostrikis, L.G., y otros, Science, 279:1228-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
1229 (1998); Matsuo, T., Biochemica et Biophysica Acta, 1379:178-184 (1998); Piatek, A.S., y otros, Nature Biotechnology, 16:359-363 (1998);Schofield, P., y otros, Appl. Environ. Microbiology, 63:1143-1147 (1997);Tyagi S., y otros, Nature Biotechnology, 16:49-53 (1998); Tyagi, S., y otros, Nature Biotechnology, 14:303-308 (1996); Nazarenko, LA., y otros, Nucleic Acids Research, 25:2516-2521 (1997); Uehara, H., y otros, Biotecnicas, 26:552-558 (1999); D. Whitcombe, y otros, Nature Biotechnology, 17:804-807 (1999); Lyamichev, V., y otros, Nature Biotechnology, 17:292 (1999);Daubendiek, y otros, Nature Biotechnology, 15:273-277 (1997); Lizardi, P.M., y otros, Nature Genetics, 19:225-232 (1998); Walker, G., y otros, Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 (1992); Walker, G.T., y otros, Clinical Chemistry, 42:9-13 (1996); y Compton, J., Nature, 350:91-92 (1991).
Asf, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para detectar una secuencia objetivo de acido nucleico. El metodo incluye: (a) poner en contacto la secuencia objetivo con un acido nucleico detector; (b) hibridar la secuencia de enlace objetivo a la secuencia objetivo, y de ese modo alterar la configuracion del acido nucleico detector, lo que causa un cambio en un parametro de fluorescencia; y (c) detectar el cambio en el parametro de fluorescencia, y de ese modo detectar la secuencia objetivo de acido nucleico.
En los metodos descritos en la presente descripcion, a menos que se indique lo contrario, un acido nucleico detector preferido incluye una secuencia de union objetivo monocatenaria. La secuencia de union tiene enlazada a ella: i) un fluoroforo; y ii) un BHQ de la invencion. Ademas, antes de su hibridacion a una secuencia complementaria, el acido nucleico detector esta preferentemente en una configuracion que permite la transferencia de energfa donador- aceptor entre el fluoroforo y el BHQ cuando el fluoroforo se excita. Ademas, en cada uno de los metodos descritos en esta seccion, un cambio en la fluorescencia se detecta como una indicacion de la presencia de una secuencia objetivo. El cambio en la fluorescencia se detecta preferentemente en tiempo real.
Actualmente las sondas de acidos nucleicos preferidas no requieren que la molecula portadora adopte una estructura secundaria para que la sonda funcione.
En este metodo, y a menos que se indique lo contrario, en los otros metodos descritos en esta seccion, el detector de acido nucleico puede asumir practicamente cualquier estructura secundaria asociada intramolecularmente, pero esta estructura es preferentemente un miembro seleccionado de horquilla, estructura tallo-bucle, pseudonudos, triple helices y estructuras asistidas conformacionalmente. Ademas, la estructura secundaria de bases apareadas intramolecularmente comprende una porcion de la secuencia de union objetivo.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para detectar la amplificacion de una secuencia objetivo. El metodo incluye el uso de una reaccion de amplificacion que incluye las siguientes etapas: (a) hibridar la secuencia objetivo y un acido nucleico detector. El acido nucleico detector incluye una secuencia de union objetivo monocatenaria y una estructura 5' secundaria intramolecularmente asociada a la secuencia de union objetivo. Al menos una porcion de la secuencia detectora forma una cola monocatenaria que esta disponible para la hibridacion de la secuencia objetivo; (b) extender el acido nucleico detector hibridado sobre la secuencia objetivo con una polimerasa para producir un producto de extension de acido nucleico detector y separar el producto de extension de acido nucleico detector de la secuencia objetivo; (c) hibridar un iniciador para el producto de extension de acido nucleico detector y extender el iniciador con la polimerasa, y de ese modo linealizar la estructura secundaria intramolecularmente asociada y producir un cambio en un parametro de fluorescencia; y (d) detectar el cambio en el parametro de fluorescencia, y de ese modo detectar la secuencia objetivo.
Aun en un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo para determinar si un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico se hibridan. En este metodo, el primer acido nucleico incluye un BHQ de acuerdo con la invencion. El metodo incluye: (a) poner en contacto el primer acido nucleico con el segundo acido nucleico; (b) detectar una alteracion en una propiedad fluorescente de un elemento seleccionado del primer acido nucleico, el segundo acido nucleico y una combinacion de estos, y de ese modo determinar si ocurre la hibridacion.
Una sonda que contiene ambos un BHQ y un fluoroforo se puede usar o, alternativamente, uno o mas de los acidos nucleicos se puede etiquetar individualmente con un BHQ o fluoroforo. Cuando un acido nucleico individualmente etiquetado con un BHQ es la sonda, la interaccion entre el primero y el segundo acidos nucleicos se puede detectar por la observacion de la interaccion entre el BHQ y el acido nucleico o, con mayor preferencia, la inhibicion de la fluorescencia por el BHQ de la fluorescencia de un fluoroforo unido al segundo acido nucleico.
Ademas de su utilidad general en sondas disenadas para investigar la amplificacion, deteccion y cuantificacion de acidos nucleicos, los presentes inhibidores de fluorescencia oscuros se pueden usar en practicamente cualquier formato de sonda de acidos nucleicos conocido ahora o descubierto mas tarde. Por ejemplo, los inhibidores de fluorescencia oscuros de la invencion se pueden incorporar dentro de los motivos de la sonda, tales como sondas Taqman™ (Held y otros, Genome Res. 6: 986-994 (1996), Holland y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991), Lee y otros, Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993)), balizas moleculares (Tyagi y otros, Nature Biotechnology 14:303-308 (1996), Jayasena y otros, patente de los Estados Unidos num. 5,989,823, concedida el 23 de noviembre de 1999)) sondas Scorpion (Whitcomb y otros, Nature Biotechnology 17: 804-807 (1999)), sondas sunrise (Nazarenko y otros, Nucleic Acids Res. 25: 2516-2521 (1997)), sondas de conformacion asistida (Cook, R., solicitud provisional de los Estados Unidos copendiente y cedida en forma mancomunada 60/138,376, presentada el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9 de junio de 1999), sondas de encendido basadas en acido nucleico peptidico (PNA) (Kubista y otros, documento WO 97/45539, diciembre de 1997), colorantes espedficos de ADN de doble cadena(Higuchi y otros, Bio/Technology 10: 413-417 (1992), Wittwer y otros, BioTechniques 22: 130-138 (1997)) y similares. Estos y otros motivos de sonda con los que se pueden usar los presentes inhibidores de fluorescencia se revisan en NONISOTOPIC DNA PROBE TECHNIQUES, Academic Press, Inc. 1992.
Los acidos nucleicos que se usan en las sondas de la invencion pueden ser de cualquier tamano adecuado, y estan preferentemente en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleotidos, con mayor preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nucleotidos y aun con mayor preferencia, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleotidos. La secuencia y longitud precisa de una sonda de acidos nucleicos de la invencion depende en parte de la naturaleza del polinucleotido objetivo al que se une. La localizacion y longitud de la union puede variar para lograr las propiedades de hibridacion y fusion apropiadas para una modalidad particular. Las orientaciones para hacer tales elecciones de diseno se pueden encontrar en muchas referencias reconocidas en la tecnica.
Preferentemente, el nucleotido del extremo 3' de la sonda de acidos nucleicos se bloquea o incapacita para extenderse por una polimerasa de acidos nucleicos. Tal bloqueo se lleva a cabo convenientemente por la union de una porcion donadora o aceptora a la posicion 3' terminal de la sonda de acidos nucleicos, ya sea directamente o por una porcion de enlace.
Los acidos nucleicos pueden comprender ADN, ARN o mezclas quimericas o derivados o versiones modificadas de estos. Ambos la sonda y el acido nucleico objetivo se pueden presentar como monocatenario, bicatenario, tricatenario, etc. Ademas, el acido nucleico se puede modificar en la porcion base, la porcion azucar o el esqueleto fosfato con otros grupos tales como etiquetas radioactivas, enlazadores de hendidura menor, agentes intercalantes, porciones donadoras y/o aceptoras y similares.
Por ejemplo, los acidos nucleicos pueden comprender al menos una porcion base modificada que se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidroouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminonietiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, uracil-5-acido oxiacetico (v),
wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5-acido oxiacetico metil ester, uracil-5-acido oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouraciol, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, nitroindol, y 2,6-diaminopurina.
En otra modalidad, los acidos nucleicos comprenden al menos una porcion azucar modificada seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.
Aun en otra modalidad, los acidos nucleicos comprenden al menos un esqueleto fosfato modificado seleccionado del grupo que incluye, pero no se limita a, un hubrido acido nucleico peptfdico, un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriester, y un formacetal o analogo de estos.
Los acidos nucleicos de la invencion enlazados a fosfodiester se pueden sintetizar por metodos estandar conocidos en la tecnica, por ejemplo por el uso de un sintetizados automatico de ADN (tales como estan disponibles comercialmente de P.E. Biosystems, etc.) por medio del uso de qrnmicas de amidita comercialmente disponibles. Los acidos nucleicos que contienen grupos de enlace a fosfodiester modificado se pueden sintetizar por metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los acidos nucleicos fosforotioato se pueden sintetizar por el metodo de Stein y otros (Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)), los acidos nucleicos metilfosfonato se pueden preparar por el uso de soportes de polfmero de vidrio de poro controlado (Sarin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)). Otros metodos de sintetizar acidos nucleicos enlazados a ambos fosfodiester- y fosfodiester modificado resultaran evidentes a los expertos en la tecnica.
Las sondas de acido nucleico de la invencion pueden sintetizarse por un numero de enfoques, por ejemplo, Ozaki y otros, Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214 (1992); Agrawal y otros, Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423 (1990); o similares. Las sondas de acidos nucleicos de la invencion se sintetizan convenientemente en un sintetizador automatico de ADN , por ejemplo, un Sintetizador ADN/ARN modelo 392 o 394 P.E. Biosistemas, Inc. (Foster City, Calif.), por medio del uso que qrnmicas estandar, tales como qmmica de fosforamidita (ver, por ejemplo, descrito en las siguientes referencias,Beaucage y otros, Tetrahedron, 48: 2223-2311 (1992); Molko y otros, patente de los Estados Unidos num. 4,980,460; Koster y otros, patente de los Estados Unidos num. 4,725,677; Caruthers y otros, patente de los EE.UU. nums. 4,415,732; 4,458,066; y 4,973,679. Ademas se pueden emplear qrnmicas alternativas que resultan en grupos del esqueleto no naturales, tales como fosforotioato, fosforamidato, y similares.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Cuando los acidos nucleicos se sintetizan por medio del uso de un sintetizador automatico de acidos nucleicos, las porciones donadora y aceptora se introducen preferentemente durante la smtesis automatica. Alternativamente, una o mas de estas porciones se puede introducir ya sea antes o despues de que comience el procedimiento de smtesis automatica. Por ejemplo, los grupos donador y/o aceptor se pueden introducir en el 3'-terminal por medio del uso de un soporte solido modificado con el grupo(s) deseado. Ademas, los grupos donador y/o aceptor se pueden introducir en el 5'-terminal por, por ejemplo un derivado del grupo que incluye una fosforamidita. En otra modalidad ilustrativa, uno o mas de los grupos donador y/o aceptor se introduce despues de que la smtesis automatica esta completa.
En las sondas doble etiquetadas, la porcion donadora se separa preferentemente del BHQ por al menos aproximadamente 10 nucleotidos, y con mayor preferencia por al menos aproximadamente 15 nucleotidos. La porcion donadora se une preferentemente a cualquiera de los nucleotidos terminales 3'- o 5'- de la sonda. La porcion BHQ ademas se une preferentemente a cualquiera de los nucleotidos terminales 3'- o 5'- de la sonda. Con mayor preferencia, las porciones donadora y aceptora se unen a los nucleotidos terminales 3'- y 5'- o 5'- y 3'- de la sonda, respectivamente, aunque la localizacion interna es ademas util.
Una vez que se sintetiza el acido nucleico deseado, se escinde preferentemente del soporte solido en el que se sintetizo y se trata, por metodos conocidos en la tecnica, para eliminar cualquier grupo protector presente (por ejemplo, 60 °C, 5h, amoniaco concentrado). En aquellas modalidades en que un grupo sensible a base se une al acido nucleico (por ejemplo, TAMRA), la desproteccion usara preferentemente condiciones suaves (por ejemplo, butilamina: agua 1:3, 8 hours, 70 °C). La desproteccion bajo estas condiciones se facilita por el uso de amiditas desprotectoras rapidas(por ejemplo, dC-acetil, dG-dmf).
Despues de la escision del soporte y la desproteccion, el acido nucleico se purifica por cualquier metodo conocido en la tecnica, que incluyen cromatograffa, extraccion y purificacion en gel. En una modalidad preferida, los acidos nucleicos se purifican por medio del uso de HPLC. La concentracion y pureza de los acidos nucleicos aislados se determina preferentemente por la medicion de la densidad optica a 260 nm en un espectrofotometro.
Sondas de peptidos
Los peptidos, protemas y acidos nucleicos peptfdicos que se etiquetan con un fluoroforo y un inhibidor de fluorescencia de la invencion se pueden usar en ensayos enzimaticos ambos in vivo e in vitro.
As^ en otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para determinar si una muestra contiene una enzima. El metodo comprende: (a) poner en contacto la muestra con un constructo peptfdico; (b) excitar el fluoroforo; y (c) determinar una propiedad de fluorescencia de la muestra, en donde la presencia de una enzima en la muestra resulta en un cambio en la propiedad de fluorescencia.
Los constructos peptfdicos que se usan en la practica de este aspecto de la invencion son aquellos con las siguientes caractensticas: i) un fluoroforo; ii) un compuesto de la invencion o de formula (I) o formula (II); y iii) un sitio de reconocimiento de escision o ensamblaje para la enzima. Ademas, el constructo peptfdico es preferentemente de una longitud y orientacion y en una configuracion que permite la transferencia de energfa donador-aceptor entre el fluoroforo y dicho compuesto cuando el fluoroforo se excita.
Cuando la sonda se usa para detectar una enzima, tal como una enzima degradativa (por ejemplo, proteasa), y se observa un grado de transferencia de energfa donador-aceptor que es mas bajo que una cantidad esperada, esto es generalmente indicativo de la presencia de una enzima. El grado de transferencia de energfa donador-aceptor en la muestra se puede determinar, por ejemplo, como una funcion de la cantidad de fluorescencia de la porcion donadora, la cantidad de fluorescencia de la porcion aceptora, la relacion de la cantidad de fluorescencia de la porcion donadora a la cantidad de fluorescencia de la porcion aceptora o la duracion del estado de excitacion de la porcion donadora.
El ensayo ademas es util para determinar la cantidad de enzima en una muestra por la determinacion del grado de transferencia de energfa donador-aceptor en un primer y segundo tiempo despues del contacto entre la enzima y el constructo tandem, y la determinacion de la diferencia en el grado de transferencia de energfa donador-aceptor. La diferencia en el grado de transferencia de energfa donador-aceptor refleja la cantidad de enzima en la muestra.
En una modalidad preferida, la cantidad de actividad enzimatica en la muestra se determina como una funcion del grado de transferencia de energfa donador-aceptor en la muestra y la cantidad de actividad en la muestra se compara con una actividad estandar para la misma cantidad de la enzima. Una diferencia entre la cantidad de actividad enzimatica en la muestra y la actividad estandar indica que el compuesto altera la actividad de la enzima.
Las enzimas representativas con las que se puede practicar la presente invencion incluyen, por ejemplo, tripsina, enteroquinasa, VIH-1 proteasa, prohormona convertasa, enzima convertina de interleucina-lb, endopeptidasa de adenovirus, asemblina de citomegalovirus, leishmanolisina, p-secretasa para protema precursora amiloide, trombina, renina, enzima de conversion de angiotensina, catepsina-D y una quininogenasa, y proteasas en general.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las proteasas juegan papeles esenciales en muchos procesos de enfermedades tales como de Alzheimer, hipertension, inflamacion, apoptosis, y AIDS. Los compuestos que bloquean o aumentan su actividad tienen potencial como agentes terapeuticos. Debido a que los sustratos normales de las peptidasas son peptidos lineales y debido a que existen procedimientos establecidos para fabricar analogos no-peptidicos, los compuestos que afectan la actividad de las proteasas son sujetos naturales de la qmmica combinatoria. El tamizaje de compuestos producidos por qmmica combinatoria requiere ensayos enzimaticos convenientes.
Los ensayos mas convenientes para proteasas se basan en la transferencia de energfa donador-aceptor de un donador fluoroforo a un inhibidor de fluorescencia colocado en el extremo opuesto de una cadena peptfdica corta que contiene el sitio de escision potencialfver, Knight C. G., Methods in Enzymol. 248:18-34 (1995)). La proteolisis separa el fluoroforo y el inhibidor de fluorescencia, lo que resulta en una intensidad aumentada en la emision del donador fluoroforo. Los ensayos de proteasas existentes usan sustratos peptfdicos cortos que incorporan amino acidos cromoforos no naturales, ensamblados por smtesis de peptido en fase solida.
Los ensayos de la invencion son ademas utiles para determinar y caracterizar secuencias de escision del sustrato de proteasas o para identificar proteasas, tales como proteasas huerfanas. En una modalidad el metodo involucra la sustitucion de una secuencia de amino acidos de la porcion enlazadora definida con una que contiene una seleccion de aminoacidos aleatoria. Una genoteca de sondas fluorescentes que contienen BHQ, en donde el fluoroforo y el BHQ se enlazan por una porcion enlazadora peptfdica aleatorizada se puede generar por medio del uso de tecnicas de ingeniena recombinante o tecnicas de qmmica sintetica. El tamizaje de los miembros de la genoteca se puede lograr por la medicion de una senal relacionada a la escision, tal como transferencia de energfa donador-aceptor, despues de poner en contacto la enzima de escision con cada uno de los miembros de la genoteca del constructo peptfdico fluorescente en tandem. Un grado de transferencia de energfa donador-aceptor que es mas bajo que la cantidad esperada indica la presencia de una secuencia enlazadora que se escinde por la enzima. El grado de transferencia de energfa donador-aceptor en la muestra se puede determinar, por ejemplo, como una funcion de la cantidad de fluorescencia de la porcion donadora, la cantidad de fluorescencia de la porcion aceptora donadora, o la relacion de la cantidad de fluorescencia de la porcion donadora a la cantidad de fluorescencia de la porcion aceptora o la duracion del estado de excitacion de la porcion donadora.
En los constructos en tandem de la invencion, las porciones donadora y aceptora se conectan mediante una porcion enlazadora. La porcion enlazadora, preferentemente, incluye una porcion peptfdica, pero puede ser o puede incluir otra porcion molecular organica, tambien. En una modalidad preferida, la porcion enlazadora incluye un sitio de reconocimiento de escision espedfico para una enzima u otro agente de escision de interes. Un sitio de escision en la porcion enlazadora es util porque cuando un constructo tandem se mezcla con el agente de escision, el enlazador es un sustrato para la escision por el agente de escision. La ruptura de la porcion enlazadora resulta en la separacion del fluoroforo y el inhibidor de fluorescencia de la invencion. La separacion se mide como un cambio en la transferencia de energfa donador-aceptor. Alternativamente, el ensamblaje del peptido se puede detectar por un aumento en la transferencia de energfa donador-aceptor entre un fragmento de peptido que contiene un BHQ y un fragmento de peptido que contiene una porcion donadora.
Cuando el agente de escision de interes es una proteasa, el enlazador generalmente incluye un peptido que contiene una secuencia de reconocimiento de escision para la proteasa. Una secuencia de reconocimiento de escision para una proteasa es una secuencia de amino acidos espedfica reconocida por la proteasa durante la escision proteolftica. Muchos sitios de escision de proteasas se conocen en la tecnica, y estos y otros sitios de escision se pueden incluir en la porcion enlazadora. Ver, por ejemplo, Matayoshi y otros Science 247: 954 (1990); Dunn y otros Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah y otros Meth. Enzymol. 244: 175 (1994);Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber y otros Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith y otros Meth. Enzymol. 244: 412 (1994);Bouvier y otros Meth. Enzymol. 248: 614 (1995), Hardy y otros, en AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT, AGING, AND ALZHEIMER'S DISEASE, ed. Masters y otros pags. 190-198 (1994).
Analogos de BHQ inmovilizados en un soporte solido.
Los BHQs de la invencion se pueden inmovilizar en practicamente cualquier polfmero, biomolecula, y material solido o semi-solido que tiene cualquier configuracion util. Ademas, cualquier conjugado que comprende uno o mas BHQs se puede inmovilizar de manera similrar. Cuando el soporte es un solido o semi-solido, ejemplos de tipos preferidos de soportes para la inmovilizacion de la sonda de acidos nucleicos incluyen vidrio de poro controlado, placas de vidrio, poliestireno, perlas de poliestireno recubiertas de avidina, celulosa, nailon, gel de acrilamida y dextrana activada. Estos soportes solidos se prefieren debido a su estabilidad qmmica, facilidad de funcionamiento y area de superficie bien definida. Los soportes solidos tales como, vidrio de poro controlado (CPG, 500 A, 1000 A) y poliestireno altamente reticulado no-hinchado (1000 A) se prefieren particularmente.
La superficie de un soporte solido se puede funcionalizar con un inhibidor de fluorescencia de la invencion o una especie que incluye un inhibidor de fluorescencia de la invencion. Para claridad de ilustracion, la siguiente discusion se concentra en unir un BHQ reactivo a un soporte solido. La siguiente discusion es ademas ampliamente relevante para unir una especie que incluye dentro de su estructura un BHQ reactivo a un soporte solido, y la union de tal especie y analogos del BHQ reactivo a otras moleculas y estructuras.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los BHQs se unen preferentemente a un soporte solido por la formacion de un enlace entre un grupo reactivo en el BHQ y un grupo reactivo sobre la superficie del soporte solido o un enlazador unido al soporte solido, de ese modo derivatizar el soporte solido con uno o mas analogos de BHQ. El enlace entre el soporte solido y el BHQ es preferentemente un enlace covalente, aunque enlaces ionicos, dativos, y otros son utiles tambien. Los grupos reactivos que se pueden usar en la practica de la presente invencion se discuten en detalle anteriormente e incluyen, por ejemplo, aminas, grupos hidroxilo, acidos carboxflicos, derivados de acidos carboxflico, alquenos, sulfidrilos, siloxanos, etc.
Un gran numero de soportes solidos apropiados para practicar la presente invencion estan disponibles comercialmente e incluyen, por ejemplo, resinas de smtesis de peptidos, ambas con y sin amino acidos y/o peptidos unidos (por ejemplo, resina de alcoxibenzil alcohol, resina de aminometilo, resina de aminopoliestireno, resina de benzidrilamina, etc. (Bachem)), vidrio de poro controlado funcionalizado (BioSearch Technologies, Inc.), medio de intercambio ionico (Aldrich), membranas funcionalizadas (por ejemplo, membranas -COOH; Asahi Chemical Co., Asahi Glass Co., y Tokuyama Soda Co.), y similares.
Ademas, para aplicaciones en las que un soporte solido adecuado no esta comercialmente disponible, una amplia variedad de tipos de reacciones esta disponible para funcionalizar la superficie de un soporte solido. Por ejemplo, los soportes construidos de un plastico tales como polipropileno, se puede derivatizar por la superficie por oxidacion por acido cromico, y subsecuentemente convertirse en una superficie hidroxilada o aminometilada. El soporte funcionalizado despues se hace reaccionar con un BHQ de reactividad complementaria, tal como un BHQ ester activo, cloruro de acido o ester sulfonato, por ejemplo. Los soportes fabricados a partir de divinilbenceno altamente reticulado se pueden derivatizar por la superficie por clorometilacion y manipulacion subsecuente del grupo funcional. Ademas, los sustratos funcionalizados de pueden fabricar a partir de poliuretano grabado, reducido.
Cuando el soporte se construye de un material silfceo tal como el vidrio, la superficie se puede derivatizar al hacer reaccionar los grupos Si-OH, SiO-H, y/o Si-Si de la superficie con un reactivo funcionalizante
En una modalidad preferida, en donde los sustratos se fabrican de vidrio, el enlazamiento covalente del grupo reactivo a la superficie del vidrio se logra por la conversion de los grupos sobre la superficie del sustrato por reactivos modificadores de silicio tales como:
(RaO)3-Si-Rb-Xa VII)
Donde Ra es un grupo alquilo, tales como metilo o etilo, Rb es un grupo enlazador entre silicio y Xa, y Xa es un grupo reactivo o un grupo reactivo protegido. Derivados de silano que tienen halogenos u otros grupos salientes ademas de los grupos alcoxi expuestos son ademas utiles en la presente invencion.
En otra modalidad preferida, el reactivo usado para funcionalizar el soporte solido proporciona mas de un grupo reactivo por cada molecula reactiva. Por medio del uso de reactivos, tales como el compuesto mas abajo, cada sitio reactivo sobre la superficie del sustrato, en esencia, se "amplifica" a dos o mas grupos funcionales:
(RaO)3-Si-Rb-(Xa)n (VIII)
Donde Ra es un grupo alquilo (por ejemplo, metilo, etilo), Rb es un grupo enlazador entre silicio y Xa, Xa es un grupo reactivo o un grupo reactivo protegido y n es un entero entre 2 y 50, y con mayor preferencia entre 2 y 20. La amplificacion de un BHQ por su union a un sustrato que contiene silicio se pretende que sea ilustrativa del concepto general de amplificacion de BHQ. Esta estrategia de amplificacion se aplica igualmente a otros aspectos de la invencion en los que un analogo de BHQ se une a otra molecula o soporte solido.
Se puede usar un numero de agentes funcionalizantes de siloxano, por ejemplo:
1. hidroxialquil siloxanos (superficie de Sililato, funcionalizada con diborano, y H2O2 para oxidar a alcohol)
a. alil triclorosilano ^ ^ 3-hidroxipropilo
b. 7-oct-1-enil triclorclorosilano ^ ^ 8-hidroxioctilo
2. Diol (dihidroxialquil) siloxanos (superficie de sililato e hidrolizar a diol) a. (glicidil trimetoxisilano ^ ^ (2,3- dihidroxipropiloxi)propilo
3. Aminoalquil siloxanos (aminas que no requieren etapas de funcionalizacion intermedias) a. 3-aminopropil trimetoxisilano ^ aminopropilo
4. Aminoalquil siloxanos dimericos secundarios
a. bis (3-trimetoxisililpropil) amina ^ bis(sililoxilpropil)amina.
Resultara evidente a los expertos en la tecnica que un arreglo de qmmicas funcionalizadoras similarmente util esta disponible cuando se usan componentes del soporte diferentes de siloxanos. Asf, por ejemplo alquil tioles,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
funcionalizados como se discutio anteriormente en el contexto de reactivos modificadores de siloxano, se pueden unir a pelmulas de metal y subsecuentemente reaccionar con un BHQ para producir el compuesto inmovilizado de la invencion.
Los grupos R de uso por Rb en las modalidades descritas anteriormente de la presente invencion incluyen alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, acilo, halogeno, hidroxi, amino, alquilamino, acilamino, alcoxi, aciloxi, ariloxi, ariloxialquilo, mercapto, hidrocarburo dclico saturado, hidrocarburo dclico insaturado, heteroarilo, heteroarilalquilo, heteroarilo sustituido, heteroarilalquilo sustituido, heterodclico, heterodclico sustituido y grupos heterodclicoalquilo y combinaciones de estos.
Sondas de captura de acidos nucleicos
En una modalidad, un acido nucleico inmovilizado que comprende un BHQ se usa como una sonda de captura. La sonda de acido nucleico se puede unir directamente a un soporte solido, por ejemplo por union del nucleotido terminal 3'- o 5'- de la sonda al soporte solido. Con mayor preferencia, sin embargo, la sonda se une al soporte solido por un enlazador (es decir, brazo espaciador, supra). El enlazador sirve para distanciar la sonda del soporte solido. El enlazador es con la maxima preferencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 atomos en longitud, con mayor preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 atomos en longitud.
Aun en otra modalidad preferida, el soporte solido se usa ademas como soporte de la smtesis en la preparacion de la sonda. La longitud y estabilidad qmmica del enlazador entre el soporte solido y la primera unidad 3' de acidos nucleicos juega un papel importante en la smtesis eficiente e hibridacion de los acidos nucleicos unidos al soporte. El brazo enlazador debe ser suficientemente largo de forma que se alcance un alto rendimiento (> 97%) durante la smtesis automatica. La longitud requerida del enlazador dependera del soporte solido particular usado. Por ejemplo, un enlazador de seis atomos es generalmente suficiente para alcanzar un > 97% de rendimiento durante la smtesis automatica de acidos nucleicos cuando se usa poliestireno altamente reticulado como el soporte solido. El brazo enlazador es preferentemente de al menos 20 atomos de largo con el objetivo de lograr un alto rendimiento (> 97%) durante la smtesis automatica cuando se usa CPG como soporte solido.
La hibridacion de una sonda inmovilizada sobre un soporte solido generalmente requiere que la sonda se separe del soporte solido por al menos 30 atomos, con mayor preferencia al menos 50 atomos. Para lograr esta separacion, el enlazador generalmente incluye un espaciador posicionado entre el enlazador y el 3' terminal. Para la smtesis de acidos nucleicos, el brazo enlazador se une usualmente al 3'-OH del 3'-terminal por un enlace ester que puede escindirse con reactivos basicos para liberar los acidos nucleicos del soporte solido.
Una amplia variedad de enlazadores se conoce en la tecnica, que se pueden usar para unir la sonda de acidos nucleicos al soporte solido. El enlazador puede estar formado por cualquier compuesto, que no interfiera significativamente con la hibridacion de la secuencia objetivo a la sonda unida al soporte solido. El enlazador puede estar formado de, por ejemplo, un acido nucleico homopolimerico que se puede anadir facilmente al enlazador por smtesis automatica. Alternativamente, polfmeros tales como polietilen glicol funcionalizado se pueden usar como el enlazador. Tales polfmeros se prefieren en la actualidad sobre los acidos nucleicos homopolimericos porque no interfieren significativamente con la hibridacion de la sonda al acido nucleico objetivo. El polietilenglicol es particularmente preferido porque esta disponible comercialmente, es soluble en ambos medios organico y acuoso, facil de funcionalizar, y completamente estable bajo las condiciones de smtesis y post-smtesis de acidos nucleicos.
Los enlaces entre el soporte solido, el enlazador y la sonda preferentemente no se escinden durante la smtesis o eliminacion del grupo protector de base bajo condiciones basicas a alta temperatura. Estos enlaces pueden, sin embargo, seleccionarse del grupo que se escinde bajo una variedad de condiciones. Ejemplos de enlaces preferidos actualmente incluyen enlaces carbamato, ester y amida.
Sondas inmovilizadas en acrilamida.
En otra modalidad preferida, una especie esta dentro de una matriz, tal como una matriz de acrilamida y la especie contiene un BHQ, o la presencia de la especie inmovilizada se comprueba por medio del uso de una sonda que contiene un BHQ. En una modalidad preferida, la inmovilizacion se logra en conjunto con el proceso "Acrydite" inventado y comercializado por Mosaic Technologies (Cambridge, MA, ver, Rehman y otros, Nucleic Acids Research, 27: 649-655 (1999)). El metodo Acrydite permite la inmovilizacion de una sonda de captura etiquetada con alqueno dentro de una red de poliacrilamina polimerizada. Cuando las mezclas objetivo pasan sobre la banda de sonda inmovilizada bajo condiciones de electroforesis, el acido nucleico objetivo se captura sustancialmente cuantitativamente. Sin embargo, la deteccion de este evento actualmente requiere una segunda sonda. En una modalidad, sondas que contiene un BHQ, y/o un fluoroforo, se inmovilizan en una matriz de acrilamida y subsecuentemente se ponen en contacto con la mezcla objetivo. Por medio del uso de sondas fluorescentes como sondas de capturas, las senales de las mezclas objetivo se pueden detectar directamente en tiempo real.
Microarreglos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La presente invencion ademas proporciona microarreglos que incluyen BHQs y compuestos inmovilizados (por ejemplo, peptidos, acidos nucleicos, agentes bioactivos, etc.) funcionalizado con BHQs. Ademas, la invencion proporciona metodos de interrogar microarreglos por medio del uso de sondas que se funcionalizan con BHQs. La especie inmovilizada y las sondas se seleccionan de practicamente cualquier tipo de molecula, lo que incluye, pero no se limita a, moleculas pequenas, peptidos, enzimas, acidos nucleicos y similares.
Los microarreglos de acidos nucleicos que consisten en una multitud de acidos nucleicos inmovilizados son herramientas revolucionarias para la generacion de informacion genomica, ver, Debouck y otros, en suplemento a Nature Genetics, 21:48-50 (1999)**. La discusion que sigue se concentra en el uso de BHQs en conjunto con microoarreglos de acidos nucleicos.
En otra modalidad preferida, los compuestos de la presente invencion se usan en un formato de microarreglo. Los BHQs, o especies que contienen BHQs pueden ellos mismos ser componentes de un microarreglo o, alternativamente pueden usarse como herramientas para tamizar los componentes de un microarreglo.
Asf, en una modalidad preferida, la presente invencion proporciona un metodo de tamizar un microarreglo. El metodo incluye poner en contacto los miembros del microarreglo con, por ejemplo, una sonda que contiene un compuesto de la invencion o de formula (I) o formula (II) e interrogar al microarreglo por regiones de fluorescencia. En una modalidad ilustrativa, regiones fluorescentes son indicativas de la presencia de una interaccion entre la sonda y un componente del microarreglo. En otra version de este metodo, el microarreglo se interroga para regiones en las que la fluorescencia esta inhibida por dicho compuesto, lo que indica nuevamente la presencia de una interaccion entre la sonda y un componente del microarreglo.
En otra modalidad preferida, el arreglo comprende sondas de transferencia de energfa donador-aceptor que contienen BHQ inmovilizadas que contienen un compuesto de la invencion o de formula (I) o formula (II) como las especies a interrogar. En esta modalidad, la sonda "se enciende" cuando se hibrida a su objetivo. Tales arreglos se preparan y se leen facilmente, y se pueden disenar para dar datos cuantitativos. Los arreglos que comprenden sondas son herramientas valiosas para analisis de expresion y tamizaje genomico clmico.
En otra modalidad preferida, la sonda inmovilizada que contiene el compuesto de la invencion o de formula (I) o formula (II) no es una sonda de transferencia de energfa donador-aceptor. Un microarreglo basado en tal formato se puede usar para sondear la presencia de interacciones entre un analito y la sonda inmovilizada por, por ejemplo, la observacion de la inhibicion de la fluorescencia del analito a partir de la interaccion entre la sonda y el analito.
En una modalidad preferida adicional, los microarreglos comprenden n regiones que comprenden especies identicas o diferentes (por ejemplo, secuencias de acidos nucleicos, agentes bioactivos). Por ejemplo, el microarreglo puede comprender una mezcla de n regiones que comprenden grupos de especies identicas. En una modalidad preferida, n es un numero de 2 a 100, con mayor preferencia, de 10 a 1,000, y con mayor preferencia de 100 a 10,000. Aun en una modalidad preferida adicional, las n regiones se modelan sobre un sustrato como n localizaciones distintas en una manera que permite comprobar la identidad de cada una de las n localizaciones.
Todavfa en otra modalidad preferida, la invencion ademas proporciona un metodo para preparar un microarreglo de n sondas que contienen BHQ. El metodo incluye unir sondas que contienen BHQ a regiones seleccionadas de un sustrato. Una variedad de metodos esta actualmente disponible para fabricar arreglos de macromoleculas biologicas, tales como arreglos de moleculas de acidos nucleicos.
Un metodo para fabricar arreglos ordenados de sondas que contienen BHQ sobre un sustrato es un enfoque "membrana de transferencia puntual."En este metodo, un colector al vacfo transfiere una pluralidad, por ejemplo, 96, de muestras de sondas acuosas desde pozos de 3 milfmetros de diametro a un sustrato. La sonda se inmoviliza sobre la membrana porosa por la coccion de la membrana o exposicion a la radiacion UV. Una variante comun de este procedimiento es un metodo de "membrana de transferencia por ranuras" en el que los pozos tienen forma oval altamente alargada.
Otra tecnica empleada para fabricar arreglos ordenados de sondas usa un arreglo de pines sumergidos en los pozos, por ejemplo, los 96 pozos de una placa de microtitulacion, para transferir un arreglo de muestras a un sustrato, tal como una membrana porosa. Un arreglo incluye pines que se disenan para marcar una membrana de forma escalonada, para crear un arreglo de 9216 puntos en un area de 22 x 22 cm. Ver, Lehrach, y otros, HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SEQUENCING, GENOME ANALYSIS, Vol. 1, Davies y otros, Eds., Cold Springs Harbor Press, pags. 39-81 (1990).
Un metodo alternativo de crear arreglos ordenados de sondas es analogo al descrito por Pirrung y otros (patente de los Estados Unidos num. 5,143,854, concedida 1992), y ademas por Fodor y otros, (Science, 251: 767-773 (1991)). Este metodo involucra la smtesis de diferentes sondas en diferentes regiones discretas de una partfcula u otro sustrato. Este metodo se usa preferentemente con moleculas sonda relativamente cortas, por ejemplo, menos de 20 bases. Un metodo relacionado se describio por Southern y otros (Genomics, 13: 1008-1017 (1992)).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Khrapko, y otros, DNA Sequence, 1: 375-388 (1991) describe un metodo de fabricar una matriz de acidos nucleicos por el punteo de ADN en una capa fina de poliacrilamida. El punteo se hace manualmente con una micropipeta.
El sustrato tambien se puede modelar por medio del uso de tecnicas tales como la fotolitograffa (Kleinfield y otros, J. Neurosci. 8:4098-120 (1998)), fotograbado, grabado qmmico y la impresion por microcontacto (Kumar y otros, Langmuir 10:1498-511 (1994)). Otras tecnicas para formar patrones sobre un sustrato seran evidentes para los expertos en la tecnica.
El tamano y complejidad del patron sobre el sustrato se limita solamente por la resolucion de la tecnica usada y la finalidad para la que se destina el patron. Por ejemplo, por medio del uso de la impresion por microcontacto, elementos tan pequenos como de 200 nm se estratifican sobre un sustrato. Ver, Xia, Y., J. Am. Chem. Soc. 117:3274-75 (1995). Similarmente, por medio del uso de fotolitograffa, se producen patrones con elementos tan pequenos como 1 pm. Ver, Hickman y otros, J. Vac. Sci. Technol. 12:607-16 (1994). Los patrones que son utiles en la presente invencion incluyen aquellos que incluyen elementos tales como pozos, cerramientos, particiones, cavidades, entradas, salidas, canales, depresiones, redes de difraccion y similares.
En una modalidad preferida actualmente, el modelado se usa para producir un sustrato que tenga una pluralidad de pozos adyacentes, hendiduras u orificios para contener las sondas. En general, cada uno de estos elementos del sustrato se afsla de los otros pozos por una pared elevada o particion y los pozos no se comunican facilmente de manera fluida. Asf, una parffcula, reactivo u otra sustancia, colocada en el pozo particular permanece sustancialmente confinada a ese pozo. En otra modalidad preferida, el modelado permite la creacion de canales a traves del dispositivo por los cuales un analito u otra sustancia puede entrar y/o salir del dispositivo.
En otra modalidad, las sondas se inmovilizan por "imprimirlas" directamente sobre el sustrato o, alternativamente, se puede usar una tecnica de "despegue'. En la tecnica de despegue, una resistencia modelada se coloca sobre el sustrato, y una sonda se coloca en las areas no cubiertas por la resistencia y la resistencia subsecuentemente se elimina. Resistencias adecuadas para usar con los sustratos de la presente invencion se conocen por los expertos en la tecnica. Ver, por ejemplo, Kleinfield y otros, J. Neurosci. 8:4098-120 (1998). Despues de eliminar la fotoresistencia, una segunda sonda, que tiene una estructura diferente de la primera sonda se puede unir al sustrato en aquellas areas inicialmente cubiertas por la resistencia. Por medio del uso de esta tecnica, se pueden producir sustratos con patrones de sondas que tienen diferentes caractensticas. Configuraciones similares del sustrato son accesibles mediante la microimpresion de una capa con las caractensticas deseadas sobre el sustrato. Ver, Mrkish y otros Ann. Rev. Biophys. Biottiol. Struct. 25:55-78 (1996).
Grupos espaciadores
Como se usa en la presente descripcion, el termino "grupo espaciador," se refiere a constituyentes de sondas que contienen BHQ. El grupo espaciador enlaza las porciones donadora y/o aceptora y otros grupos al acido nucleico, peptido u otro componente de la sonda. El grupo espaciador puede ser hidrofflico (por ejemplo, tetraetilenglicol, hexaetilenglicol, polietilenglicol) o ellos pueden ser hidrofobicos (por ejemplo, hexano, decano, etc.).
En una modalidad preferida, por medio del uso de soportes solidos el constructo inmovilizado incluye un espaciador entre el grupo reactivo del soporte solido y el analogo de BHQ. El enlazador es preferentemente seleccionado de C6- C30 grupos alquilo, C6-C30 grupos alquilo sustituidos, polioles, polieteres (por ejemplo, poli(etilenglicol)), poliaminas, poliamino acidos, polisacaridos y combinaciones de estos.
En ciertas modalidades, es ventajoso tener el donador y/o aceptor de la sonda unidos a otro componente polimerico por un grupo que proporciona flexibilidad y distancia del componente polimerico. Por medio del uso de tales grupos espaciadores, las propiedades del donador y/o aceptor adyacente a otro componente de la sonda componente se modulan. Las propiedades que se controlan utilmente incluyen, por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, actividad superficial, la distancia del donador y/o porcion BHQ de los otros componentes de la sonda (por ejemplo, molecula portadora) y la distancia del donador al BHQ.
En una modalidad ilustrativa, el espaciador sirve para distanciar el BHQ de un acido nucleico. Los espaciadores con estas caractensticas tienen varios usos. Por ejemplo, un BHQ que se mantiene demasiado cerca del acido nucleico puede no interactuar con el grupo donador, o puede interactuar con una afinidad muy baja. Cuando un BHQ es el mismo estericamente exigente, la interaccion que conduce a la inhibicion puede debilitarse indeseablemente, o puede no ocurrir en absoluto, debido a una obstaculizacion de la aproximacion de los dos componentes inducida estericamente.
Cuando el constructo que comprende el BHQ se inmoviliza por union a, por ejemplo, un soporte solido, el constructo puede ademas incluir una porcion espaciadora entre el grupo reactivo del soporte solido y el analogo de BHQ, u otro componente de la sonda unido al soporte solido.
Aun en una modalidad adicional, un grupo espaciador que se usa en las sondas de la invencion se proporciona con un grupo que se puede escindir para liberar una porcion enlazada, tal como, por ejemplo, un BhQ, fluoroforo,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
enlazadores de hendidura menor, porcion intercalante, y similares del componente polimerico. Muchos grupos escindibles se conocen en la tecnica. Ver, por ejemplo, Jung y otros, Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi y otros, J. Biol. Chem., 265: 14518-14525 (1990); Zarling y otros, J. Immunol., 124: 913-920 (1980); Bouizar y otros, Eur. J. Biochem., 155: 141-147 (1986); Park y otros, J. Biol. Chem., 261: 205-210 (1986); Browning y otros, J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989). Ademas una amplia variedad de brazos espaciadores escindibles, bifuncionales (ambos homo- y hetero-bifuncionales) estan disponibles comercialmente de suministradores tales como Pierce.
Una modalidad ilustrativa que usa grupos espaciadores se expone en las formulas VII y VIII, anteriormente. En estas formulas, Rb es estable o puede escindirse por reacciones qmmicas o fotoqmmicas. Por ejemplo, grupos Rb que comprenden enlaces ester o disulfuro pueden escindirse por hidrolisis y reduccion, respectivamente. Ademas dentro del alcance de la presente invencion esta el uso de grupos Rb que se escinden por luz tales como, por ejemplo, derivados nitrobenzilo, grupos fenacilo, esteres de benzoma, etc. Otros grupos escindibles de este tipo se conocen bien por los expertos en la tecnica.
Kits
En otro aspecto, la presente invencion proporciona kits que contienen uno o mas de los BHQs o composiciones que contienen BHQ de la invencion. En una modalidad, un kit incluira un reactivo derivado de BHQ y orientaciones para unir este derivado a otra molecula. En otra modalidad, el kit incluye un acido nucleico etiquetado con BHQ que opcionalmente ademas se etiqueta con un fluoroforo y direcciones para usar este acido nucleico en uno o mas formatos de ensayo. Otros formatos para kits resultaran evidentes a los expertos en la tecnica y estan dentro del alcance de la presente invencion.
Los materiales y metodos de la presente invencion se ilustran mas aun por los ejemplos que siguen.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran la smtesis y la caracterizacion de las especies ilustrativas de la invencion.
Ejemplo 1 expone la smtesis del inhibidor de fluorescencia BH1 y su conversion en un vidrio de poro controlado conjugado. Ejemplos 2 y 3, proporcionan similares detalles con respecto a los inhibidores de fluorescencia BH2 y BH3.
Ejemplo 4 expone la incorporacion de inhibidores de fluorescencia ilustrativos de la invencion en sondas de transferencia de energfa donador-aceptor basadas en acidos nucleicos. La eficiencia de la inhibicion de la fluorescencia de los BHQs en las sondas se ensaya y compara a la del inhibidor de fluorescencia oscuro DABCYL reconocido en la tecnica.
EJEMPLO 1
Este ejemplo expone la smtesis y caracterizacion de BH1 y derivados de este.
1.1 Smtesis de 4-metil-2-nitrofenilazo-2'-metil-5'-metoxifenilazo-4"-N,N-di(2-hidroxietil) azobenceno, (BHI diol), 6
A una suspension agitada rapidamente de 25 g (60 mmol) sal Fast Corinth V (Aldrich 22,736-5) en 400 ml de agua helada (bano de hielo) se anadieron 50 g (276 mmol) N - fenildietanolamina disuelta en 400 ml de metanol y 300 ml NaHCO3 saturada durante 20 min. La mezcla cambio de color de amarillo a rojo intenso durante la adicion. La mezcla se enfrio por 1 hr adicional despues de la adicion, despues se filtro a traves de un filtro de vidrio poroso medio. El solido rojo oscuro se lavo con 300 ml de agua helada y se seco al aire por 3 dfas. El rendimiento de 6 fue 27 g, (91 %). TLC rf 0.15 (Placa de sflice, 5% MeOH en CH2Ch). MALDI M/e 493.11 (Calcul. 492.5). 1H NMR (CDCla, 8) 7.9 (d, 2H), 7.65 (m, 2H), 7.6 (s, 1H), 7.45(d, 1H), 7.4(s, 1H), 6.8(d, 2H), 4.0(s, 3H), 3.95(t, 2H), 3.85(t, 2H), 3.7(t, 2H), 3.6(t, 2H), 2.7(s, 3H), 2.5(s, 3H).
1.2 Smtesis de 4-metil-2-nitrofenilazo-2'-metil-5'-nietoxifenilazo-4"-N,N-(2-hidroxietil)-(2-O-
(4,4'dimetoxitritil)etilazobenceno (DMT-BH1), 7
Una solucion de 25 g (50 mmol) 6 en 400 ml de piridina seca evaporo a sequedad, y se anadieron 7 g (21 mmol) de DMT-cloruro en 300 ml de piridina seca. La solucion se asento por 3 dfas a temperatura ambiente, se elimino despues hasta un alquitran. El residuo negro se disolvio en 600 ml de acetato de etilo, y se lavo con 300 ml de 1 N acido cftrico acuoso, seguido por un lavado con 300 ml de NaHCO3 saturado acuoso. La capa organica se seco sobre MgSO4 y se elimino hasta un alquitran. El residuo se cargo en una columna de cromatograffa de 55 por 8 cm de alumina neutra, 7% en peso de agua, y se eluyo primero con una fase movil de 0.5% MeOH, 0.5% de piridina en CH2Cl2. Despues que 1 l de solvente se eluyo, se corrio un gradiente de 2 % de MeOH en 4 l. Las fracciones que contema 7 puro (0.42 rf, placa de sflice, 2% MeOH, 2% piridina en CH2Ch) se reunieron y se evaporaron. El rendimiento fue 2.8 g (17% de rendimiento) de 2 como una espuma oscura. MALDI M/e 793.88 (Calcul. 794.5). 1H
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
NMR (CDCI3, 8) 7.85 (d, 2H), 7.7 (m, 4H), 7.6 (s, 1H), 7.45(d, 1H), 7.4 - 7.1 (m, 10H), 6.8(m, 6H), 4.0(s, 3H), 3.85(m, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.7(m, 2H), 3.5 - 3.3(m, 4H), 2.7(s, 3H), 2.5(s, 3H).
1.3 S^ntesis de 4-metil-2-nitrofenilazo-2'-metil-5'-metoxifenilazo-4"-NN-(2-O-(N',N'-diisopmpil-2-danoetilfosfito)etil)-(2- O-4, 4'dimetoxitritil)-etil)azobenceno, (DMT BH1 amidita), 8
Una solucion de 2.8 g (3.5 mmol) de 7 en 50 ml de piridina seca se evaporo hasta secarse y se aplico alto vado por varias horas. Una solucion de 1.5 g (5 mmol) de N,N,N',N'-tetraisopropil-2-cianoetilfosfano y 60 mg de tetrazol se mezclaron en 20 ml de acetonitrilo seco y se anadio al matraz que contema el 7 seco. Despues de 2 hrs, el solvente se elimino, y el residuo se disolvio en 200 ml de EtOAc. La capa organica se lavo con 100 ml NaHCO3 saturado acuoso y se seco sobre MgSO4. El solvente se evaporo, y el residuo se aplico a una columna de cromatograffa de 25 por 3 cm de alumina neutra, 7% en peso de agua, y se eluyo con una fase movil de 75% eter de Pet., 23% EtOAc, 2% piridina. Las fracciones que contema 8 puro (0.67 rf, placa de sflice pre-corrida, 50% eter de pet., 48% EtOAc, 2% piridina) se reunieron y se evaporaron. El rendimiento fue 1 g (20% de rendimiento) de 8 como una espuma oscura.MALDI M/e 995.5 (Calcul. 994.5).
1.4 Smtesis de BH1-CPG, 9
11 g de vidrio de poro controlado DMT-2,2'-sulfonildietanol-succinil, 500A, Biosearch parte # BGS-5000, se lavo tres veces con acido dicloroacetico 3% para efectuar la eliminacion del grupo DMT. El CPG se lavo bien con tres porciones de 50 ml de CH2Cl2, seguido por un lavado de 50 ml con piridina seca. El CPG se anadio al matraz que contema 1 g de8. 25 ml de piridina seca se anadieron, y el solvente se elimino mediante evaporacion rotatoria, seguido por alto vado por 3 hrs. El CPG seco y la amidita se trataron con una solucion de 1 g S-etil tetrazol en 20 ml de acetonitrilo seco por 20 min. El CPG se lavo en un embudo de vidrio sinterizado dos veces con 50 ml de acetonitrilo, despues se anadieron 50 ml de 0.02 M yodo en 90% de THF, 8% de agua y 2% piridina. Despues de 5 min, la solucion de yodo se lavo fuera del CPG con tres porciones de 50 ml de acetonitrilo, y despues se anadio un solucion de recubrimiento de 10% Ac2O, 10% N-metilimidazol y 10 % piridina en THF. Despues de 20 min, la solucion se lavo fuera del CPG con tres porciones de 50 ml de acetonitrilo, seguido por tres porciones de 50 ml de CH2Cl2. El material se seco durante la noche bajo alto vado. La determinacion de la carga de DMT en el material seco fue 6 pM/g.
EJEMPLO 2
Este ejemplo expone la smtesis y caracterizacion de BH2 y derivados de este.
2.1 Smtesis de 4-nitrofenilazo-2',5'-dimetoxifenilazo-4"-N,N-di(2-hidroxietil) azobenceno, (BH2 diol), 10
A una suspension agitada rapidamente de 25 g (60 mmol) sal Fast Black K (Aldrich 20,151-0) en 400 ml de agua helada (bano de hielo) se anadieron 50 g (276 mmol) de N-fenildietanolamina disuelta en 400 ml de metanol y 300 ml NaHCO3 sat'd durante 20 min.. La mezcla cambio de color de marron a azul intenso durante la adicion. La mezcla se enfrio por 1 hr adicional despues de la adicion, despues se filtro a traves de un filtro de vidrio poroso medio. El solido azul intenso se lavo con 300 ml de agua helada y se seco al aire por 3 dfas. El rendimiento de 10 fue 22 g, (74%). TLC rf 0.2 (Placa de sflice, 5% MeOH en CH2Ch). MALDI M/e 493.13 (Calcul. 494.4). 1H NMR (CDCh, 8) 8.3 (d, 2H), 8.0(d, 2H), 7.85(d, 2H), 7.4(d, 2H), 6.7(m, 2H), 4.1(s, 3H), 3.95(s, 3H), 3.9(t, 2H), 3.8(t, 2H), 3.7(t, 2H), 3.5(t, 3H).
2.2 Smtesis de 4-nitrofenilazo-2',5'-dimetoxifenilazo-4"-N,N-(2-hidroxi-etil)-(2-O-(4,4' dimetoxitritil)etilazobencenol, (DMT-BH2), 11
Una solucion de 22 g (44 mmol) 10 en 400 ml de piridina seca se elimino hasta secarse, y 7 g (21 mmol) de DMT- cloruro se anadio en 300 ml de piridina seca. La solucion se asento por 3 dfas a temperatura ambiente, se elimino despues hasta un alquitran. El residuo negro se disolvio en 600 ml de acetato de etilo, y se lavo con 300 ml de 1 N acido dtrico acuoso, seguido por un lavado con 300 ml de NaHCO3 saturado acuoso. La capa organica se seco sobre MgSO4 y se elimino hasta un alquitran. El residuo se cargo en una columna de cromatograffa de 55 por 8 cm de alumina neutra, 7% en peso de agua, y se eluyo primero con una fase movil de 0.5% MeOH, 0.5% de piridina en CH2Cl2. Despues que 1 l de solvente se eluyo, se corrio un gradiente de 2 % de MeOH en 4 l. Las fracciones que conteman 11 puro (0.4 rf, placa de sflice, 2% MeOH, 2% piridina en CH2Ch) se reunieron y se evaporaron. El rendimiento fue 2.8 g (17% de rendimiento) de 11 como una espuma oscura. MaLDI M/e 794.2 (Calcul. 796.4). 1H NMR (CDCl3, 8) 8.3 (d, 2H), 7.9(d, 2H), 7.75(d, 2H), 7.4 - 7.1(m, 9H), 6.7 - 6.5(m, 6H), 4.1(s, 3H), 3.95(s, 3H), 3.9 - 3.6(m, 12H), 3.3(t, 3H).
2.3 Smtesis de 4-nitrofenilazo-2',5'-dimetoxifenilazo-4"-N,N-(2-O-(N',N'-diisopropil-2-cianoetilfosfito)etil)-(2-O-
(4,4'dimetoxi-tritil)etil)-azobenceno, (DMT-BH2 amidita), 12
Una solucion de 2.8 g (3.5 mmol) 11 en 50 ml de piridina seca se evaporo hasta secarse y se aplico alto vado por varias horas. Una solucion de 1.5 g (5 mmol) de N,N,N',N'-tetraisopropil-2-cianoetilfosfano y 60 mg de tetrazol se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mezclaron en 20 ml de acetonitrilo seco y se anadio al matraz que contema el 11 seco. Despues de 2 hrs, el solvente se elimino, y el residuo se disolvio en 200 ml de EtOAc. La capa organica se lavo con 100 ml NaHCO3 saturado acuoso y se seco sobre MgSO4. El solvente se evaporo, y el residuo se aplico a una columna de cromatograffa de 25 por 3 cm de alumina neutra, 7% en peso de agua, y se eluyo con una fase movil de 75% eter de pet., 23% EtOAc, 2% piridina. Las fracciones que contema 12 puro (0.71 rf, placa de sflice pre-corrida, 50% Pet. eter, 48% EtOAc, 2% piridina) se reunieron y se evaporaron. El rendimiento fue 1 g (20% de rendimiento) de 11 como una espuma oscura. MALDI M/e 996.06 (Calcul. 996.4).
2.4 Srntesis de BH2-CPG, 13
10 g de vidrio de poro controlado DMT-2,2'-sulfonildietanol-succinilo, 500A, Biosearch parte # BG5-5000, se lavaron tres veces con 3% acido dicloroacetico para efectuar la eliminacion del grupo DMT. El CPG se lavo bien con tres porciones de 50 ml de CH2Cl2, seguido por un lavado de 50 ml con piridina seca. El CPG se anadio al matraz que contema 1 g de12. 25 ml de piridina seca se anadieron, y el solvente se elimino mediante evaporacion rotatoria, seguido por alto vado por 3 hrs. El CPG seco y la amidita se trataron con una solucion de 1 g S-etil tetrazol en 20 ml de acetonitrilo seco por 20 min. El CPG se lavo en un embudo de vidrio sinterizado dos veces con 50 ml de acetonitrilo, despues se anadieron 50 ml de 0.02 M yodo en 90% de THF, 8% de agua y 2% piridina. Despues de 5 min, la solucion de yodo se lavo fuera del CPG con tres porciones de 50 ml de acetonitrilo, y despues se anadio un solucion de recubrimiento de 10% Ac2O, 10% N-metilimidazol y 10 % piridina en THF. Despues de 20 min, la solucion se lavo fuera del CPG con tres porciones de 50 ml de acetonitrilo, seguido por tres porciones de 50 ml de CH2Cl2. El material se seco durante la noche bajo alto vado. La determinacion de la carga de DMT en el material seco fue 30 pM/g.
EJEMPLO 3
Este ejemplo expone la srntesis y caracterizacion de BH3 y derivados de este.
3.1 Srntesis de cloruro de 3-dietilamino-5 fenilfenazium-7-(4'-N,N di(2-hidroxietil) azobenceno), (BH3 diol), 14
3-amino-7- (dietilamino)-5-fenilfenazium cloruro (metileno violeta 3RAX, Aldrich 30,750-5), 10 g (26 mmol) se agito en 200 ml 1 N HCl en un bano de hielo. Una solucion de 2 g NaNO2 en 20 ml de agua fna se anadio en forma de gotas durante 20 min. La solucion se agito por 30 min. N-fenildietanolamina, 4.7 g (27 mmol), se disolvio en 100 ml de metanol y se anadio a la solucion violeta de metileno, despues que el pH se ajusto a 6 con solucion de NaOH. La solucion cambio el color de violeta a verde oscuro. La solucion se agito por 1 hr, despues se extrajo tres veces con 200 ml de CH2Cl2. La capa acuosa se evaporo, y el solido verde oscuro se trituro con 3 porciones de 200 ml de piridina. La piridina se evaporo para dar 2.9g (21 % de rendimiento) de 14 como un solido verde oscuro. (0.85 rf, placa de sflice, 15% MeOH, 2% piridina en CH2Ch) MALDI M/e 535.6 (calcul. 535.75).
3.2 Srntesis de cloruro de 3-dietilanaino-5 phenylphenazium-7-(4'-N,N (2-hidroxietil)-(2-O-
(4,4'dimetoxitrityl)etilazobenceno, (DMT BH3), 15
El compuesto 14, 2.9 g (5.4 mmol) se seco por eliminacion con 100 ml de piridina seca, y despues se re-disolvio en 100 ml de piridina seca junto con 2 g (5.9 mmol) de cloruro de DMT. La mezcla se asento durante la noche, y el solvente se elimino. El residuo se disolvio nuevamente en 200 ml CH2Chy se lavo con 200 ml de 1 M acido dtrico acuoso. La capa acuosa se lavo nuevamente con dos porciones de 200 ml de CH2Cl2, las capas organicas combinadas se evaporaron hasta un alquitran. El residuo se cargo sobre una columna de cromatograffa de 20 por 3 cm de alumina neutra, 7% en peso de agua, y se eluyo primero con una fase movil de 2% MeOH, 1% piridina en CH2Cl2. Se corrio un gradiente de 6 % MeOH en 3 L. Las fracciones que conteman 15 puro (0.9 rf, placa de sflice, 15% MeOH, 1% piridina en CH2Ch) se reunieron y se evaporaron. El rendimiento fue 0.5 g (11% de rendimiento) de 15 como una espuma oscura. MALDI M/e 837.6 (calcul. 836.75)
3.3 Srntesis de 3-dietilamino-5-phenylphenazium-7-(4'-N,N-(2-O-(N,N'-diisopropil-2-cianoetilfosfito)etil)-(2-O-
(4,4'dimetoxi-tritil)etil)azobenceno cloruro, (DMT BH3 amidita), 16
Una solucion de 0.5 g (0.6 mmol) 15 en 50 ml de piridina seca se evaporo hasta secarse y se aplico alto vado por varias horas. Una solucion de 0.5 g (1.7 mmol) de N,N,N',N'-tetraisopropil-2-cianoetilfosfano y 20 mg de tetrazol se mezclaron en 20 ml de acetonitrilo seco y se anadio al matraz que contema el 15seco. Despues de 2 hrs, el solvente se elimino, y el residuo se disolvio en 100 ml de EtOAc. La capa organica se lavo con 50 ml NaHCO3 saturado acuoso y se seco sobre MgSO4. El disolvente se evaporo, y el residuo se aplico a una columna de cromatograffa de 15 por 3 cm de alumina neutra, 7% en peso de agua, y se eluyo primero con una fase movil de 1% MeOH, 1% piridina en CH2Cl2. Se corrio un gradiente de 6 % MeOH en 2 L. Las fracciones que contema 16 puro (0.82 rf, placa de sflice de pre-corrida, 5% MeOH, 1% piridina en CH2Ch) se reunieron y se evaporaron. El rendimiento fue 0.26 g (42% de rendimiento) de 16 como una espuma oscura. MALDI M/e 1037.3 (Calcul. 1036.75).
Sintesis de BH3-CPG, 17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2 g de vidrio de poro controlado DMT-2,2'-sulfonildietanol-succinil, 500A, Biosearch parte # BGS-5000, se lavaron tres veces con 3% acido dicloroacetico para efectuar la eliminacion del grupo DMT. El CPG se lavo bien con tres porciones de 20 ml de CH2Cl2, seguido por un lavado de 20 ml con piridina seca. El CPG se anadio al matraz que contema 0.26 g de 16. 25 ml de piridina seca se anadieron, y el solvente se elimino mediante evaporacion rotatoria, seguido por alto vado por 3 hrs. El CPG seco y la amidita se trataron con una solucion de 0.5 g S-etil tetrazol en 10 ml de acetonitrilo seco por 20 min. El CPG se lavo en un embudo de vidrio sinterizado dos veces con 20 ml de acetonitrilo, despues se anadieron 20 ml de 0.02 M yodo en 90% de THF, 8% de agua y 2% piridina. Despues de 5 min, la solucion de yodo se lavo fuera del CPG con tres porciones de 20 ml de acetonitrilo, y despues se anadio un solucion de recubrimiento de 10% Ac2O, 10% N-metilimidazol y 10 % piridina en THF. Despues de 20 min, la solucion se lavo fuera del CPG con tres porciones de 20 ml de acetonitrilo, seguido por tres porciones de 20 ml de CH2Cl2. El material se seco durante la noche bajo alto vado. La determinacion de la carga de DMT en el material seco fue 12 pM/g.
EJEMPLO 4
Este ejemplo expone la preparacion y caracterizacion de acidos nucleicos analogos de BHQs ilustrativos de la invencion. Los conjugados acido nucleico-BHQ se comparan a un conjugado similar de DABCYL.
La eficiencia de la transferencia de energfa donador-aceptor (FRET) es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre las moleculas donadora y aceptora (Stryer, L. Annu. Rev. Biochem. 1978, 47, 819846). Esta propiedad se puede usar para supervisar la hibridacion de los acidos nucleicos etiquetados en un extremo con un fluoroforo donador (reportero) y en el extremo opuesto con un aceptor (inhibidor de fluorescencia) (Parkhurst y otros, Biochemistry 1995, 34, 285-292). En ausencia de una secuencia objetivo complementaria la sonda doble etiquetada es muy flexible y sufre rapidos cambios de configuracion de forma que la distancia promedio entre el donador (D) y el aceptor (A) es suficientemente cercana para que ocurra FRET eficiente. A partir de la hibridacion a un objetivo complementario, se forma un ADN tnbrido ngido que separa el par D-A y reduce la eficiencia de la transferencia. Esto se manifiesta por si mismo en un aumento de la intensidad de fluorescencia del reportero.
4.1 Sntesis y Caracterizacion de sondas BHQ
Para evaluar la eficiencia de los colorantes inhibidores de la fluorescencia del agujero negro (BHQs), la habilidad de estos colorantes de inhibir una serie de fluoroforos comunes se comparo con los colorantes inhibidores de fluorescencia estandar DABCYL y TAMRA en un ensayo de complementacion. Como TAMRA exhibe su propia fluorescencia nativa, solo se puede usar para inhibir la fluorescencia de colorantes de longitudes de onda mas bajas y asf solo se uso para inhibir FAM en este ensayo.
4.1a Materiales y Metodos
Los acidos nucleicos se sintetizaron en un sintetizador de ADN automatico Biosearch 8700 por medio del uso de qmmica estandar de fosforamidita. Las fosforamiditas ABZ, CAC, T, y GDMF se suplementaron por Chruachem. Los soportes de vidrio de poro controlado (CPG) TAMRA, DABCYL, y BHQ de Biosearch Technologies se usaron para la union de los colorantes inhibidores de fluorescencia al 3'-terminal de los acidos nucleicos. El etiquetado 5' fluoroforo se logro por medio del uso de fluoroforos fosforamiditas con la excepcion de Cy5 que se anadio como un succinimidil ester a los acidos nucleicos amino 5' por medio del uso del protocolo del fabricante. 6-FAM y TFA-aminohexil amidita fueron de Biosearch. Cy3 fosforamidita y Cy5 succinimidil ester fueron de Amersham Pharmacia Biotech. La escision y desproteccion de los oligos se llevo a cabo en amoniaco a 60 °C por 3 hrs, con la excepcion de los oligos TAMRA 3' que se desprotegieron en 1:3 t-butilamina:H2O por 8 horas a 60 °C, y oligos BH3 3' que se desprotegieron por 1 hora a 60 °C en amoniaco. Despues de la desproteccion, las sondas doble etiquetadas se evaporaron hasta secarse despues se resuspendieron en agua grado HPLC y se filtraron a traves de filtros de 0.45 pM para prepararse para la filtracion HPLC. Un metodo de dos etapas de purificacion HPLC de intercambio anionico seguido por HPLC de fase reversa se uso para purificar todas las sondas doble etiquetadas. Las sondas purificadas se analizaron por ambas HPLC de intercambio anionico y fase reversa. El acido nucleico complementario se purifico en un cartucho de fase reversa Biosearch Micropure II por medio del uso del protocolo estandar.
Todas las mediciones de fluorescencia se tomaron por medio del uso de un lector de microplaca fluorescente Spectramax Gemini. Las sondas se disolvieron a 200 nM en un amortiguador compuesto de 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, y 3.5 mM MgCh, pH 8.3, ambos en presencia y ausencia de un exceso de cinco veces de acido nucleico perfectamente complementario. La fluorescema se excito a 470 nm y la emision se leyo a 530 nm con un filtro de corte de 515 nm en el lugar. Cy3 se excito a 510 nm y se leyo a 567 nm con un filtro de corte de 550 nm. Cy5 se excito a 630 nm y se leyo a 660 nm con un filtro de corte de 630 nm. La intensidad de fluorescencia promedio de un conjunto de ocho amortiguadores blanco se sustrajo de todas las medidas de fluorescencia de la sonda antes de calcular las relaciones senal a ruido.
El conjunto de acidos nucleicos expuestos en la Tabla 2 se sintetizo y purifico rigurosamente por HPLC:
Tabla 2. Sondas doble etiquetadas para ensayo de hibridacion
Reportero (5')
em max (nm) Secuencia (5' a 3') Inhibidor de fluorescencia (3')
FAM
518 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG TAMRA
FAM
518 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG DABCYL
FAM
518 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG BH1
FAM
518 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG BH2
Cy3
573 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG DABCYL
Cy3
573 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG BH1
Cy3
573 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG BH2
Cy5
678 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG DABCYL
Cy5
678 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG BH2
Cy5
678 ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGCG BH3
La relacion de senal a ruido (S:N) de hibridacion para cada sonda se midio en presencia de un exceso molar de 5 cinco veces de acidos nucleicos perfectamente complementarios. Todos los ensayos de hibridacion se realizaron en un amortiguador de 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, y 3.5 mM MgCl2, pH 8.3. S:N se calculo al dividir la intensidad de la fluorescencia de la sonda en presencia de complemento por la intensidad de fluorescencia de la sonda sola despues de sustraer la intensidad de fluorescencia del amortiguador blanco de cada una. Todas las mediciones de fluorescencia se tomaron en triplicado por medio del uso de un lector de placa fluorescente Spectramax Gemini.
4.2 Resultados
La inhibicion de la fluorescencia mejorada por los BHQs se demostro para tres fluoroforos ampliamente separados. Un aumento de dos veces en la relacion senal a ruido se alcanzo al remplazar DABCYL con BH1 para la sonda de fluorescema. Los aumentos de S:N son mas impactantes para las sondas etiquetadas con cianina, con aproximadamente un aumento de diez veces en S:N observada para la sonda Cy3 inhibida con BH2 y un aumento 5 de treinta veces S:N para la sonda Cy3 inhibida con BH3 sobre estructuras identicas inhibidas con DABCYL. Esto es consistente con la teona de que la eficiencia de FRET es proporcional a la magnitud de superposicion entre el donador y aceptor (Haugland y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1969, 63, 23-30). DaBcYl, que absorbe maximamente a 474 nm, inhibe la fluorescencia de los colorantes reporteros desplazados al rojo con eficiencia disminuida, mientras los BHQs se pueden elegir en consecuencia para tener maxima superposicion de espectros 10 con el reportero de interes.
Los datos del ensayo de hibridacion se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3. Relaciones senal a ruido de sondas doble etiquetadas FRET
donador/aceptor
Ruido Senal Ruido promedio Senal promedio S:N
num.de medicion
#1 #2 #3 #1 #2 #3
FAMTAM
89.18 91.50 89.54 279.13 277.08 272.78 90.08 276.33 3.07
FAMDAB
89.97 81.03 86.74 348.98 323.82 352.00 85.92 341.61 3.98
FAMBH1
39.24 37.05 38.85 296.53 316.24 311.15 38.38 307.97 8.02
FAMBH2
67.12 66.64 56.79 445.48 415.78 442.75 63.52 434.34 6.84
Cy3DAB
19.66 19.65 19.39 147.70 139.83 154.35 19.57 147.29 7.53
Cy3BH1
1.86 2.09 2.41 140.72 135.20 135.25 2.12 137.06 64.51
Cy3BH2
2.02 1.94 2.08 149.65 148.89 150.40 2.02 149.65 74.15
Cy5/DAB
57.09 59.15 50.50 157.36 176.04 216.59 55.58 183.33 3.30
Cy5/BH2
19.92 21.47 22.53 263.64 288.20 256.07 21.31 269.31 12.64
Cy5/BH3
1.65 2.17 1.55 197.96 210.71 208.06 1.79 205.58 114.79
15

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:
    imagen1
  2. 2. Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:
    10
    imagen2
  3. 3. Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:
    imagen3
    5
    imagen4
    5
  4. 4. Un microarreglo que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen5
    y
    imagen6
    10 en donde dicho compuesto se conjuga directamente con un soporte solido o con una molecula portadora unida a dicho soporte solido.
  5. 5. Una mezcla que comprende al menos una primera molecula portadora y una segunda molecula portadora:
    15 en donde dicha primera molecula portadora esta enlazada covalentemente a un primer compuesto, el primer compuesto es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen7
    y
    5
    10
    15
    20
    25
    imagen8
    y
    en donde dicha segunda molecula portadora esta enlazada covalentemente a un segundo compuesto, el segundo compuesto es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen9
    imagen10
  6. 6. Un metodo para detectar o cuantificar especies moleculares, dicho metodo comprende:
    poner en contacto dichas especies moleculares con una mezcla de acuerdo con la reivindicacion 5; y
    detectar un cambio en una propiedad fluorescente de un componente de dicha mezcla, dichas especies moleculares y una combinacion de estas, y de ese modo detectar o cuantificar dichas especies moleculares.
  7. 7. Un metodo para determinar si una muestra contiene una enzima, dicho metodo comprende:
    (a) poner en contacto dicha muestra con un constructo peptfdico que comprende
    i) un fluoroforo;
    ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen11
    y
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    imagen12
    y
    in) un sitio de reconocimiento de la escision para dicha enzima,
    en donde dicho peptido esta en una configuraciOn que permite la transferencia de energfa donador-aceptor entre dicho fluorOforo y dicho inhibidor de la fluorescencia cuando dicho fluorOforo se excita;
    (b) excitar dicho fluorOforo; y
    (c) determinar una propiedad de fluorescencia de dicha muestra, en donde la presencia de dicha enzima en dicha muestra resulta en un cambio en dicha propiedad de fluorescencia.
  8. 8. Un metodo para determinar si un compuesto altera una actividad de una enzima, dicho metodo comprende:
    (a) poner en contacto una muestra que comprende dicha enzima y dicho compuesto con un constructo peptfdico que comprende
    i) un fluorOforo;
    ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fOrmula seleccionada de
    imagen13
    imagen14
    y
    iii) un sitio de reconocimiento de la escisiOn para dicha enzima,
    en donde dicho peptido esta en una configuraciOn que permite la transferencia de energfa donador-aceptor entre dicho fluorOforo y dicho compuesto cuando dicho fluorOforo se excita;
    (b) excitar dicho fluorOforo; y
    (c) determinar una propiedad de fluorescencia de dicha muestra, en donde dicha actividad de dicha enzima en dicha muestra resulta en un cambio en dicha propiedad de fluorescencia.
  9. 9. Un metodo para detectar una secuencia objetivo de acido nucleico, dicho metodo comprende:
    (a) poner en contacto dicha secuencia objetivo con un acido nucleico detector que comprende una secuencia
    de uniOn objetivo monocatenaria, dicho acido nucleico detector esta enlazado a ella,
    i) un fluorOforo; y
    ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fOrmula seleccionada de
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    imagen15
    y
    imagen16
    en donde dicho acido nucleico detector esta en una configuracion que permite la transferencia de ene^a donador aceptor entre dicho fluoroforo y dicho compuesto cuando dicho fluoroforo se excita;
    (b) hibridar dicha secuencia de union objetivo a dicha secuencia objetivo, y de ese modo alterar dicha configuracion de dicho acido nucleico detector, causando un cambio en un parametro de fluorescencia; y
    (c) detectar dicho cambio en dicho parametro de fluorescencia, y de ese modo detectar dicha secuencia objetivo de acido nucleico.
  10. 10. Un metodo para detectar la amplificacion de una secuencia objetivo que comprende, en una reaccion de amplificacion :
    (a) hibridar a dicha secuencia objetivo un acido nucleico detector que comprende una secuencia de union objetivo monocatenaria y una estructura secundaria intramolecularmente asociada 5' a dicha secuencia de union objetivo, en donde al menos una porcion de dicha secuencia detectora forma una cola monocatenaria que esta disponible para la hibridacion a dicha secuencia objetivo, dicho oligonucleotido detector tiene unido a el,
    i) un fluoroforo; y
    ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen17
    y
    imagen18
    en donde dicho acido nucleico detector esta en una configuracion que permite la transferencia de energfa donador aceptor entre dicho fluoroforo y dicho compuesto cuando dicho fluoroforo se excita;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    (b) extender dicho acido nucleico detector hibridado en dicha secuencia objetivo con una polimerasa para producir un producto de extension de acido nucleico detector y separar dicho producto de extension de acido nucleico detector de dicha secuencia objetivo;
    (c) hibridar un iniciador a dicho producto de extension de acido nucleico detector y extender el iniciador con dicha polimerasa, y de ese modo linealizar dicha estructura secundaria intramolecularmente asociada y producir un cambio en un parametro de fluorescencia; y
    (d) detectar dicho cambio en dicho parametro de fluorescencia, y de ese modo detectar dicha secuencia objetivo.
  11. 11. Un metodo de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10 en donde el acido nucleico es un oligonucleotido.
  12. 12. Un metodo para determinar si un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico hibridan, dicho primer acido nucleico comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen19
    y
    imagen20
    covalentemente unido a dicho acido nucleico, dicho metodo comprende:
    (a) poner en contacto dicho primer acido nucleico con dicho segundo acido nucleico;
    (b) detectar una alteracion en una propiedad fluorescente de un elemento seleccionado de dicho primer acido nucleico, dicho segundo acido nucleico y una combinacion de estos, y de ese modo determinar si ocurre la hibridacion.
  13. 13. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que esta covalentemente unido a: una molecula pequena con un peso molecular de menos de 1000 dalton, una protema, un peptido, un polfmero sintetico o un soporte solido.
  14. 14. Una sonda que incluye un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una formula seleccionada de
    imagen21
    y
    imagen22
    conjugado a un receptor, una enzima, un ligando para una especie objetivo que es un acido nucleico o un peptido, o a una molecula pequena con un peso molecular de menos de 1000 dalton.
    5
  15. 15. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un conjugado que comprende uno o mas de dichos compuestos inmovilizados en un poUmero, biomolecula o material solido o semisolido que tenga cualquier configuracion util.
    10 16. Una especie que contiene un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y dentro
    de una matriz acrilamida.
  16. 17. Un metodo para probar un microarreglo para la presencia de un compuesto, el metodo incluye:
    15 (a) poner en contacto el microarreglo con una sonda que interactua con el compuesto, la sonda incluye un
    imagen23
    imagen24
    20
    y
    y
    (b) detectar una diferencia en una propiedad de fluorescencia de un elemento seleccionado de la sonda, el compuesto y combinaciones de estos, y de ese modo determinar la presencia del compuesto.
ES10184701.0T 2000-05-09 2001-05-08 Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor Expired - Lifetime ES2511991T5 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/567,863 US7019129B1 (en) 2000-05-09 2000-05-09 Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US567863 2000-05-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2511991T3 ES2511991T3 (es) 2014-10-23
ES2511991T5 true ES2511991T5 (es) 2017-10-26

Family

ID=24268941

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10184585.7T Expired - Lifetime ES2640940T3 (es) 2000-05-09 2001-05-08 Conjugados covalentes de ácidos nucleicos con derivados de 1,4-bis-fenilazo-benceno y fenilazo-fenazina como inhibidores oscuros de la transferencia de energía del donador-aceptor para uso por ejemplo en la síntesis automatizada de ácidos nucleicos
ES10184701.0T Expired - Lifetime ES2511991T5 (es) 2000-05-09 2001-05-08 Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor
ES01935256.6T Expired - Lifetime ES2639836T3 (es) 2000-05-09 2001-05-08 Conjugados covalentes de derivados de 1,4-bis-fenilazo-benceno y fenilazo-fenazina como inhibiodres oscuros de la transferencia de energía del donador-aceptor para la detección de fluorescencia de biomoléculas y fármacos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10184585.7T Expired - Lifetime ES2640940T3 (es) 2000-05-09 2001-05-08 Conjugados covalentes de ácidos nucleicos con derivados de 1,4-bis-fenilazo-benceno y fenilazo-fenazina como inhibidores oscuros de la transferencia de energía del donador-aceptor para uso por ejemplo en la síntesis automatizada de ácidos nucleicos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01935256.6T Expired - Lifetime ES2639836T3 (es) 2000-05-09 2001-05-08 Conjugados covalentes de derivados de 1,4-bis-fenilazo-benceno y fenilazo-fenazina como inhibiodres oscuros de la transferencia de energía del donador-aceptor para la detección de fluorescencia de biomoléculas y fármacos

Country Status (8)

Country Link
US (11) US7019129B1 (es)
EP (3) EP2316974B2 (es)
AU (1) AU2001261364A1 (es)
CY (2) CY1119349T1 (es)
DK (3) DK2333113T3 (es)
ES (3) ES2640940T3 (es)
PT (2) PT2333113T (es)
WO (1) WO2001086001A1 (es)

Families Citing this family (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040081959A9 (en) * 1999-12-08 2004-04-29 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US7892854B2 (en) * 2000-06-21 2011-02-22 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
GB0112868D0 (en) 2001-05-25 2001-07-18 Secr Defence Detection system
US20030082547A1 (en) * 2001-08-27 2003-05-01 Ewing Gregory J. Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays
US10539561B1 (en) 2001-08-30 2020-01-21 Customarray, Inc. Enzyme-amplified redox microarray detection process
US6818420B2 (en) 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
JP4481656B2 (ja) * 2002-02-27 2010-06-16 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ３’→５’エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含むｆｅｔ標識オリゴヌクレオチドを使用する方法およびそれを実施するための組成物
CA2498320A1 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Integrated Dna Technologies, Inc. Anthraquinone quencher dyes, their methods of preparation and use
BRPI0408967B8 (pt) 2003-03-31 2021-07-27 Hoffmann La Roche kit e métodos para detecção de um ácido nucléico de vários membros do sorogrupo do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica sob condições de hibridização rigorosas
CA2445420A1 (en) * 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
JP4912151B2 (ja) 2003-11-12 2012-04-11 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 西ナイルウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドおよび方法
WO2005049849A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 Integrated Dna Technologies, Inc. Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use
EP2287341B1 (en) 2003-12-01 2013-02-13 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US7635598B2 (en) * 2004-07-08 2009-12-22 Biosearch Technologies, Inc. Inducible fluorescence assay
US7745614B2 (en) * 2004-09-03 2010-06-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Universal linker compositions for the release or transfer of chemical agents from a polynucleotide
WO2006031851A1 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 Applera Corporation Multi-chromophoric quencher constructs for use in high sensitivity energy transfer probes
US20060102471A1 (en) 2004-11-18 2006-05-18 Karl Maurer Electrode array device having an adsorbed porous reaction layer
WO2006084067A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Berry & Associates, Inc. Dark quenchers, probes and other conjugates incorporating the same, their use
AU2006223384B2 (en) 2005-03-09 2012-08-02 Cepheid Polar dyes
US20070034513A1 (en) * 2005-03-25 2007-02-15 Combimatrix Corporation Electrochemical deblocking solution for electrochemical oligomer synthesis on an electrode array
JPWO2006106930A1 (ja) * 2005-04-01 2008-09-11 独立行政法人科学技術振興機構 Ｅｕ３＋錯体を含有してなる核酸プローブ、及びそれを用いた核酸解析方法
US9394167B2 (en) 2005-04-15 2016-07-19 Customarray, Inc. Neutralization and containment of redox species produced by circumferential electrodes
WO2006127507A2 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Integrated Dna Technologies, Inc. Compounds and methods for labeling oligonucleotides
US7919242B2 (en) 2005-06-30 2011-04-05 Roche Molecular Systems, Inc. Light emission modifiers and their uses in nucleic acid detection, amplification and analysis
US8227621B2 (en) 2005-06-30 2012-07-24 Li-Cor, Inc. Cyanine dyes and methods of use
US7868157B2 (en) * 2005-07-07 2011-01-11 Biosearch Technologies, Inc. Water soluble fluorescent compounds
JP4963164B2 (ja) * 2005-08-03 2012-06-27 浜松ホトニクス株式会社 蛍光共鳴エネルギー移動プローブの設計方法
US8968700B2 (en) 2005-08-11 2015-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging of protease activity in live cells using activity based probes
US20070065877A1 (en) * 2005-09-19 2007-03-22 Combimatrix Corporation Microarray having a base cleavable succinate linker
US8855955B2 (en) * 2005-09-29 2014-10-07 Custom Array, Inc. Process and apparatus for measuring binding events on a microarray of electrodes
US7741467B2 (en) 2005-10-05 2010-06-22 Roche Molecular Systems, Inc. Non-fluorescent energy transfer
EP1945818B1 (en) 2005-11-07 2018-01-03 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Chlamydia trachomatis specific oligonucleotide sequences
GB0525072D0 (en) * 2005-12-09 2006-01-18 Enigma Diagnostics Ltd Fluorescence-based detection methods and apparatus
US7807356B2 (en) * 2006-03-09 2010-10-05 Agilent Technologies, Inc. Labeled nucleotide composition
AU2007235282A1 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Neisseria gonorrhoeae specific oligonucleotide sequences
FR2900158A1 (fr) * 2006-04-25 2007-10-26 Biomerieux Sa Nouvelle sonde de detection agissant par reconnaissance moleculaire
CA2653321A1 (en) 2006-05-26 2007-12-06 Althea Technologies, Inc. Biochemical analysis of partitioned cells
WO2007143669A2 (en) 2006-06-05 2007-12-13 California Institute Of Technology Real time micro arrays
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
US8536319B2 (en) * 2006-06-29 2013-09-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Compounds and methods for detecting ricin and uses thereof
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US8048626B2 (en) 2006-07-28 2011-11-01 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US7524942B2 (en) * 2006-07-31 2009-04-28 Agilent Technologies, Inc. Labeled nucleotide composition
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US9938641B2 (en) 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
US9273345B2 (en) * 2006-12-28 2016-03-01 Conceptual Mindworks, Inc. Methods and compositions for processes of rapid selection and production of nucleic acid aptamers
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
US8790877B2 (en) * 2007-07-12 2014-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Using DNA aptamers and quantum dots for the detection of proteins or other targets
US20100068713A1 (en) * 2007-07-13 2010-03-18 Arkray, Inc. Probe for detecting mutation in jak2 gene and use thereof
LT2757091T (lt) * 2008-04-01 2017-09-11 Biosearch Technologies, Inc. Stabilizuotos nukleorūgšties tamsūs kvenčerio-fluoroforo zondai
FR2933410B1 (fr) * 2008-07-04 2010-08-20 Biomerieux Sa Nouvelle sonde de detection
JP5986745B2 (ja) 2008-07-15 2016-09-06 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｐｔｆｅ様のアルミニウム・コート・ガラススライド上のグリカンアレイおよび関連する方法
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
US8039215B2 (en) * 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US9927434B2 (en) 2010-01-20 2018-03-27 Customarray, Inc. Multiplex microarray of serially deposited biomolecules on a microarray
US9506057B2 (en) 2010-03-26 2016-11-29 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
AU2011230496B2 (en) 2010-03-26 2015-09-17 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for enhancing nucleic acid hybridization
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
BR112012030682B1 (pt) 2010-06-02 2021-09-21 Merck Patent Gmbh Bactéria geneticamente modificada da espécie listeria monocytogenes, método de fabricação da mesma, bem como kit e métodos para detectar e determinar a presença ou a quantidade de listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra
US7956169B1 (en) 2010-06-16 2011-06-07 Chemgenes Corporation Synthesis of novel azo-dyes and their use in oligonucleotide synthesis
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
WO2012027717A2 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 The Texas A&M University System Flourescence labeling reagents and uses thereof
WO2012033848A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
WO2012118715A2 (en) 2011-02-28 2012-09-07 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Non-peptidic quenched fluorescent imaging probes
WO2013049631A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Inguran, Llc Sperm staining and sorting methods
LT2828399T (lt) 2012-03-22 2017-04-10 Lgc Genomics Limited Polimerazės grandininės reakcijos aptikimo sistema, panaudojant oligonukleotidus, apimančius fosforotioato grupę
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
KR101717953B1 (ko) 2012-08-02 2017-03-20 (주)바이오니아 신규 아조화합물, 이의 이용 및 이의 제조방법
AU2013306098A1 (en) 2012-08-18 2015-02-12 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
EP2964785B8 (en) 2013-03-04 2020-10-21 Fry Laboratories LLC Method and kit for characterizing microorganisms
GB2515990B (en) 2013-03-06 2016-05-04 Lgc Genomics Ltd Polymerase chain reaction detection system
EP4218829A3 (en) 2013-03-15 2023-08-16 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Activity-based probe compounds, compositions, and methods of use
US10086054B2 (en) 2013-06-26 2018-10-02 Academia Sinica RM2 antigens and use thereof
EP3013347B1 (en) 2013-06-27 2019-12-11 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
US10392670B2 (en) 2013-07-25 2019-08-27 Dch Molecular Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting bacterial contamination
CN105682666B (zh) 2013-09-06 2021-06-01 中央研究院 使用醣脂激活人类iNKT细胞
WO2015062699A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 Merck Patent Gmbh Method for isolating microorganisms from a complex sample
US9982041B2 (en) 2014-01-16 2018-05-29 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
TWI687428B (zh) 2014-03-27 2020-03-11 中央研究院 反應性標記化合物及其用途
US10301310B2 (en) * 2014-05-09 2019-05-28 Biosearch Technologies, Inc. Cosmic quenchers
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
CN106573971A (zh) 2014-05-27 2017-04-19 中央研究院 抗cd20醣抗体及其用途
AU2015267045B2 (en) 2014-05-27 2021-02-25 Academia Sinica Anti-HER2 glycoantibodies and uses thereof
EP3149161B1 (en) 2014-05-27 2021-07-28 Academia Sinica Fucosidase from bacteroides and methods using the same
TWI732738B (zh) 2014-05-28 2021-07-11 中央研究院 抗TNF-α醣抗體及其用途
WO2016040369A2 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Academia Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS
EP3230467A1 (en) 2014-12-12 2017-10-18 ELITechGroup B.V. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
US9988670B2 (en) 2014-12-12 2018-06-05 Elitechgroup B.V. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
EP3248005B1 (en) 2015-01-24 2020-12-09 Academia Sinica Novel glycan conjugates and methods of use thereof
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
US9957393B2 (en) 2015-03-30 2018-05-01 Enzo Biochem, Inc. Monoazo dyes with cyclic amine as fluorescence quenchers
WO2016168174A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 The Translational Genomics Research Institute Predicting the occurrence of metastatic cancer using epigenomic biomarkers and non-invasive methodologies
PT3283499T (pt) 2015-04-15 2022-08-23 Biosearch Tech Inc Sondas de extintor dual
EP3124619B1 (en) 2015-07-31 2019-03-06 Menicon Co., Ltd Reagents, method and kit for across and within dog breed glaucoma diagnosis
US9499861B1 (en) 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
WO2017048982A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Biosearch Technologies, Inc. Oligophosphate dark quenchers and uses
US11066702B2 (en) 2016-01-15 2021-07-20 Quantapore, Inc. Optically-based nanopore analysis with reduced background
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
TW201808978A (zh) 2016-03-08 2018-03-16 中央研究院 N-聚醣及其陣列之模組化合成方法
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
EP3500684A4 (en) 2016-08-19 2020-02-26 Quantapore Inc. OPTICAL-BASED NANOPORE SEQUENCING USING EXTINGUISHING AGENTS
JP7213549B2 (ja) 2016-08-22 2023-01-27 シーエイチオー ファーマ インコーポレイテッド 抗体、結合性断片、および使用の方法
AU2017382460A1 (en) 2016-12-23 2019-05-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Activity-based probe compounds, compositions, and methods of use
WO2018162986A2 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Elitechgroup B.V. Nitrodiarylethenes as fluorescence quenchers for nucleic acid probes
CN107236815A (zh) * 2017-07-18 2017-10-10 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法
EP3441766B1 (en) 2017-08-11 2020-03-11 Life Science Inkubator Sachsen GmbH & Co. KG Novel antibody conjugates suitable for use in discrete fluorescence quenching displacement immunoassays
WO2019036225A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Elitechgroup, Inc. FLUORESCENCE EXTINGUISHERS STABILIZING DUPLEX FOR NUCLEIC PROBES
GB201713251D0 (en) 2017-08-18 2017-10-04 Lgc Genomics Ltd Methods and kits for detection of nucleic acid molecules
US11028439B2 (en) 2017-09-27 2021-06-08 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting hepatitis B virus (HBV)
EP3628059B1 (en) 2017-10-03 2023-04-12 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting human immunodeficiency virus (hiv)
US11021763B2 (en) 2017-10-03 2021-06-01 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting hepatitis C virus (HCV)
ES2941076T3 (es) 2018-01-09 2023-05-16 Abbott Molecular Inc Ensayo para detectar Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis y Mycoplasma genitalium
WO2019213619A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
CA3098443A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company Polymeric dyes and uses thereof
WO2020028729A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
WO2020132090A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting human papilloma virus (hpv)
EP3931313A2 (en) 2019-01-04 2022-01-05 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
MX2021010559A (es) 2019-03-07 2021-12-15 Univ California Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos.
EP3937780A4 (en) 2019-03-14 2022-12-07 InSilixa, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION
EP3766990A1 (en) 2019-07-15 2021-01-20 National University of Ireland Galway Primers for isothermal amplification
CN114727643A (zh) * 2019-11-14 2022-07-08 Bcd生物科学有限公司 高产过氧化物淬灭控制的多糖解聚及其组合物
CN115175922A (zh) 2019-12-23 2022-10-11 雅培实验室 用于检测小双核糖核酸病毒的组合物和方法
WO2021138325A1 (en) 2019-12-30 2021-07-08 Abbott Laboratories Compositions and methods for detecting bunyavirus
KR20230002943A (ko) 2020-04-22 2023-01-05 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 검출을 위한 등온 방법, 조성물, 키트, 및 시스템
WO2021215989A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Aman Russom Rapid detection of specific genetic sequences using a multi-labelled dna hybrid comprising a reporter strand and an anchor strand
WO2021240443A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 King Abdullah University Of Science And Technology Iscan: an rt-lamp-coupled crispr-cas module for rapid, sensitive detection of sars-cov-2
US20220195498A1 (en) 2020-12-23 2022-06-23 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection
EP4043588A1 (en) * 2021-02-10 2022-08-17 Procomcure Biotech GmbH Assays for the detection of sars-cov-2 mutants
CN115246866A (zh) * 2021-04-26 2022-10-28 苏州诺维康生物科技有限公司 一种健那绿b固相载体的合成方法
WO2023283442A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 10X Genomics, Inc. Methods for detecting analytes using sparse labelling
WO2023023673A2 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Kasa Bio, L.L.C. Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucelotides
WO2023095166A1 (en) * 2021-11-23 2023-06-01 Council Of Scientific And Industrial Research An Indian Registered Body Incorporated Under The Regn. Of Soc. Act (Act Xxi Of 1860) Substituted diazenylanilines as fluorescence quencher and use thereof
US11834714B2 (en) 2021-12-20 2023-12-05 Enumerix, Inc. Detection and digital quantitation of multiple targets
WO2024030985A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Abbott Laboratories Assays for detecting monkeypox virus
GB202214328D0 (en) 2022-09-29 2022-11-16 Freeline Therapeutics Ltd Method

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2653109A (en) * 1942-08-21 1953-09-22 Joseph L Switzer Light-responsive fluorescent media
US2554443A (en) 1947-11-13 1951-05-22 Gen Aniline & Film Corp Azo safranine leather dyestuffs
US2830943A (en) * 1955-11-03 1958-04-15 Gen Electric Method for controlling the irradiation of polyethylene
US2945849A (en) * 1957-03-04 1960-07-19 Bayer Ag Disazo compounds containing a quaternary ammonium group
US3121711A (en) 1960-05-27 1964-02-18 Du Pont Phenylphenazinium cationic dyes
US3369013A (en) * 1965-07-12 1968-02-13 Eastman Kodak Co Disazo dyes
US3445452A (en) * 1965-12-10 1969-05-20 Eastman Kodak Co Azobenzene-azo-aniline dyestuffs containing a pyrrolidinono,a piperidono or a phthalimidono group
FR1544951A (fr) 1966-11-21 1968-11-08 Inst Przemyslu Organiczego Procédé de préparation des colorants disazoïques
US3523936A (en) 1967-01-31 1970-08-11 Du Pont 2 - sulfonamido - 4 - (n,n - disubstituted amino)benzeneazo - 1,4 - naphthalene-or 1,4-benzene-azobenzene dyes
DE1930261C3 (de) * 1969-06-13 1979-05-03 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Disazofarbstoffe und ihre Verwendung zum Färben stickstoffhaltiger Fasermaterialien
NL7411909A (nl) * 1973-09-10 1975-03-12 Research Corp Werkwijze voor het bereiden van een samenstel- ling op basis van een kleurstof, werkwijze voor het isoleren van albumine.
US4069012A (en) * 1974-03-26 1978-01-17 Cassella Farbwerke Mainkur Aktiengesellschaft Dyeing of polyester fabric with disazo dye
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4313872A (en) * 1976-02-02 1982-02-02 Cassella Aktiengesellschaft Azo coupling in two-phase water-alcohol mixtures
DE2834054A1 (de) 1978-08-03 1980-02-21 Cassella Ag Wasserunloesliche disazofarbstoffe, ihre herstellung und verwendung
DE2840199A1 (de) 1978-09-15 1980-03-27 Cassella Ag Verfahren zum faerben und bedrucken von hochmolekularen polyestern und zellulosetriacetat
JPS5599967A (en) * 1979-01-26 1980-07-30 Mitsubishi Chem Ind Ltd Disazo dye for cellulose-containing fibers
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
DE3380031D1 (en) * 1982-06-30 1989-07-13 Hitachi Ltd Liquid crystal composition
GB8314918D0 (en) * 1983-05-31 1983-07-06 Vickers Plc Radiation sensitive compositions
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4623716A (en) * 1984-11-01 1986-11-18 Usv Pharmaceutical Corp. Process for the preparation and purification of peptides
US4739044A (en) 1985-06-13 1988-04-19 Amgen Method for derivitization of polynucleotides
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
FR2596761B1 (fr) 1986-04-08 1988-05-20 Commissariat Energie Atomique Derives de nucleosides et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
EG18377A (en) 1986-09-19 1993-04-30 Lilly Co Eli Process for preparing glycopeptide antibiotics
GB8629892D0 (en) 1986-12-15 1987-01-28 Wellcome Found Antiviral compounds
US4888385A (en) * 1987-04-30 1989-12-19 Millipore Corporation BOP reagent for solid phase peptide synthesis
US5231191A (en) 1987-12-24 1993-07-27 Applied Biosystems, Inc. Rhodamine phosphoramidite compounds
US4965349A (en) * 1987-12-24 1990-10-23 Applied Biosystems, Inc. Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports
US4997928A (en) 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5118801A (en) 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5401847A (en) 1990-03-14 1995-03-28 Regents Of The University Of California DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers
SE9003151D0 (sv) 1990-10-02 1990-10-02 Medivir Ab Nucleoside derivatives
US5313738A (en) * 1991-01-22 1994-05-24 Mdt Corporation Closure for doors used with small and medium sized pressure vessels
US5384411A (en) * 1991-06-20 1995-01-24 Hewlett-Packard Company Immobilization of PH-sensitive dyes to solid supports
JPH05142600A (ja) 1991-11-18 1993-06-11 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 低屈折率光非線形高分子材料
US5484908A (en) * 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5348853A (en) 1991-12-16 1994-09-20 Biotronics Corporation Method for reducing non-specific priming in DNA amplification
EP0601889A2 (en) 1992-12-10 1994-06-15 Maine Medical Center Research Institute Nucleic acid probes
US5536820A (en) 1993-02-26 1996-07-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Avidin-binding azo reagents
JPH06258676A (ja) 1993-03-03 1994-09-16 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> ２次非線形光学材料
WO1995002848A1 (en) 1993-07-12 1995-01-26 Minnesota Mining And Manufacturing Company Multifunctional azo compounds and polymers derived therefrom for nonlinear optics
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6291203B1 (en) * 1995-11-13 2001-09-18 Molecular Probes, Inc. Cyanine dyes that stain cells and mitochondria
GB9523575D0 (en) * 1995-11-17 1996-01-17 Zeneca Ltd Organic chemical compounds and processes
US5736626A (en) * 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
EP0892808B1 (en) * 1996-04-12 2008-05-14 PHRI Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
AU2735797A (en) 1996-04-12 1998-03-26 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Detection probes, kits and assays
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US5874587A (en) * 1996-06-25 1999-02-23 The Rockefeller University Imidazolium cations, processes for their preparation, and uses therefor
AU743011B2 (en) * 1997-09-12 2002-01-17 Phri Properties, Inc. Non-competitive co-amplification methods
US5935791A (en) 1997-09-23 1999-08-10 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
US6008379A (en) * 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US5989823A (en) 1998-09-18 1999-11-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction
US6117986A (en) * 1998-06-10 2000-09-12 Intergen Company, L.P. Pyrimidines linked to a quencher
KR100337169B1 (ko) 1998-07-20 2002-05-18 최중갑 복합염료 조성물을 이용한 폴리머 겔상의 ｄｎａ의 검출방법 및
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
US6288221B1 (en) * 1998-08-20 2001-09-11 Duke University Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction
US6232075B1 (en) 1998-12-14 2001-05-15 Li-Cor, Inc. Heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US20070059752A1 (en) * 1999-06-09 2007-03-15 Biosearch Technologies, Inc. Fluorescence energy transfer probes with stabilized conformations
US7160996B1 (en) * 1999-06-09 2007-01-09 Bioresearch Technologies, Inc. Fluorescence energy transfer probes with stabilized conformations
US6046049A (en) * 1999-07-19 2000-04-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of PI3 kinase p110 delta expression
EP1230387B1 (en) * 1999-10-22 2006-08-16 The Public Health Research Institute of the City of New York, Inc. Assays for short sequence variants
US7205105B2 (en) 1999-12-08 2007-04-17 Epoch Biosciences, Inc. Real-time linear detection probes: sensitive 5′-minor groove binder-containing probes for PCR analysis
US6727356B1 (en) * 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US20040081959A9 (en) 1999-12-08 2004-04-29 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US7309573B2 (en) * 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US20030082547A1 (en) * 2001-08-27 2003-05-01 Ewing Gregory J. Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays
JP4481656B2 (ja) 2002-02-27 2010-06-16 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ３’→５’エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含むｆｅｔ標識オリゴヌクレオチドを使用する方法およびそれを実施するための組成物
US6818420B2 (en) * 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
US7385043B1 (en) * 2003-04-30 2008-06-10 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Homogeneous multiplex screening assays and kits
EP1538154B1 (en) * 2003-11-20 2008-12-31 Exiqon A/S Quencher composition comprising anthraquinone moieties
WO2006002167A2 (en) 2004-06-17 2006-01-05 University Of Florida Research Foudation, Inc. Multi-acceptor molecular probes and applications thereof
WO2006049297A1 (ja) 2004-11-08 2006-05-11 Riken 新規なヌクレオシド若しくはヌクレオチド誘導体及びその利用
US20060178507A1 (en) * 2004-12-30 2006-08-10 Berry & Associates, Inc. Fluorous oligonucleotide reagents and affinity purification of oligonucleotides
WO2006084067A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Berry & Associates, Inc. Dark quenchers, probes and other conjugates incorporating the same, their use
JP4344330B2 (ja) * 2005-02-14 2009-10-14 富士通株式会社 ヌクレオチドオリゴマー、ヌクレオチドポリマー、機能性物質の構造決定方法および機能性物質の製造方法
WO2006127507A2 (en) 2005-05-20 2006-11-30 Integrated Dna Technologies, Inc. Compounds and methods for labeling oligonucleotides
LT2757091T (lt) * 2008-04-01 2017-09-11 Biosearch Technologies, Inc. Stabilizuotos nukleorūgšties tamsūs kvenčerio-fluoroforo zondai
US8815509B2 (en) 2011-06-14 2014-08-26 University Of Southern California Fluorescence-based assay for the rapid detection and quantification of deoxyribonucleoside triphosphates

Also Published As

Publication number Publication date
ES2640940T3 (es) 2017-11-07
US8410255B2 (en) 2013-04-02
US20140316118A1 (en) 2014-10-23
PT2333113T (pt) 2017-09-08
ES2511991T3 (es) 2014-10-23
US20110092679A1 (en) 2011-04-21
US20140187763A1 (en) 2014-07-03
EP2316974B1 (en) 2014-09-03
US10301349B2 (en) 2019-05-28
US8633307B2 (en) 2014-01-21
CY1119330T1 (el) 2018-02-14
EP2316974B2 (en) 2017-06-28
US8440399B2 (en) 2013-05-14
US9018369B2 (en) 2015-04-28
ES2639836T3 (es) 2017-10-30
EP1305445A1 (en) 2003-05-02
US20050272088A1 (en) 2005-12-08
AU2001261364A1 (en) 2001-11-20
EP1305445B1 (en) 2017-08-16
US7582432B2 (en) 2009-09-01
EP1305445B9 (en) 2017-11-08
US20100021922A1 (en) 2010-01-28
WO2001086001A1 (en) 2001-11-15
US9139610B2 (en) 2015-09-22
EP2316974A1 (en) 2011-05-04
US7109312B2 (en) 2006-09-19
US8946404B2 (en) 2015-02-03
CY1119349T1 (el) 2018-03-07
US20140323703A1 (en) 2014-10-30
US20060035262A1 (en) 2006-02-16
US20110178280A1 (en) 2011-07-21
PT1305445T (pt) 2017-09-08
EP2333113B1 (en) 2017-08-16
US20070154898A1 (en) 2007-07-05
DK1305445T3 (en) 2017-09-18
DK2333113T3 (en) 2017-09-18
EP2333113A1 (en) 2011-06-15
DK2316974T4 (en) 2017-09-25
DK2316974T3 (en) 2014-11-24
EP1305445A4 (en) 2003-08-13
US20150197792A1 (en) 2015-07-16
US7019129B1 (en) 2006-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2511991T5 (es) Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor
US8436153B2 (en) Cyanine dyes
US7344701B2 (en) Xanthene dyes
DK1740100T3 (en) xanthene
ES2931081T3 (es) Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados