BR112012030682B1 - Bactéria geneticamente modificada da espécie listeria monocytogenes, método de fabricação da mesma, bem como kit e métodos para detectar e determinar a presença ou a quantidade de listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra - Google Patents

Abstract

bactéria geneticamente modificada da espécie listeria monocytogenes. a presente invenção refere-se a uma bactéria geneticamente modificada da espécie listeria monocytogenes, em que foi deletado o lócus genômico do fator trancripcional prfa, caracterizado pelo fato de compreender ao nível genômico, uma sequência artificial que age como controle interno de amplificação, uso desta bactéria, bem como um método para detecção e determinação quantitativa e/ou qualitativa da ocorrência de listeria monocytogenes do tipo selvagem, em uma amostra com suspeita de ter sido contaminada com o referido micro-organismo, e um kit.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma bactériageneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes, em que o lócus genômico do fator trancripcional PrfA foi deletado, caracterizado pelo fato de compreender ao nível genômico, uma sequência artificial que age como controle interno de amplificação, uso desta bactéria, bem como um método para detecção e determinação qualitativa e/o quantitativa da ocorrência de Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra suspeita de ter sido contaminada com o referido micro-organismo, e um kit.

Antecedentes da Invenção

[0002] Listeria monocytogenes é uma bactéria patogênica gram-positiva, que causa listeriose sendo um dos patógenos mais virulentos que crescem no alimento A detecção de patógenos em amostras como amostras de alimento ou amostras clínicas como sangue, tecido ou fezes, está se tornando mais e mais importante. Contudo, de modo a identificar claramente e opcionalmente quantificar as células compostas em uma amostra, métodos confiáveis para sua detecção e quantificação devem ser proporcionados.

[0003] Deste a primeira implementação da reação em cadeia da polimerase (PCR) esta ferramenta biológica molecular foi desenvolvida em um método que obtém muitas oportunidades para a melhor detecção dos micro-organismos. Um pré-requisito importante para os métodos baseados na PCR tornarem-se um padrão internacionalmente reconhecido é o controle interno de amplificação (IAC). Um IAC é uma sequência de DNA não alvo presente no mesmo tubo de amostra, que é coamplificado simultaneamente com a sequência alvo. Em uma PCR sem um IAC um resultado negativo não é definitivo porque pode significar que não havia uma sequência alvo presente, porém também que a reação de amplificação foi inibida por vários fatores. Portanto, o Comitê de Padronização Europeu em colaboração com a Organização de Padrão Internacional (ISO) propôs uma linha de referência geral para PCR de diagnóstico que exige a presença de um IAC (ISO/DIS 22174).

[0004] O IAC deve ser competitivo usando os mesmos sítios de ligação ao iniciador como a PCR alvo sendo claramente distinguível dos amplicons do DNA alvo por meio do comprimento e comprimento de onda fluorescente do corante da sonda usada na PCR em tempo real. Resumidamente, as características do controle devem ser tão próximas das características do alvo, garantindo, não obstante, uma interferência insignificante na detecção alvo.

[0005] A implementação de um IAC para os testes da PCR garante a confiabilidade dos resultados negativos, contudo isto se aplica apenas para a reação enzimática que facilita a amplificação alvo na PCR e para a reação de detecção quantitativa e confirmativa com base no uso de testes fluorescentes na PCR em tempo real. Contudo, etapas preliminares metódicas como preparação da amostra e isolamento/purificação do DNA da amostra matriz não são cobertas por esta espécie de controle, sendo no máximo, verificada por controles externos. Isto não permite o controle de amostras individuais, sendo que resultados negativos implicam na possibilidade de uma verificação falsa do estado do patógeno nas amostras investigadas, por exemplo, em alimento.

[0006] Por conseguinte faz-se necessário um controle do processo da amostra interna (ISPC) que deverá abranger todas as etapas metódicas que são necessárias para detecção quantitativa confiável dos patógenos com PCR convencional ou em tempo real.

[0007] Para detecção de vírus de RNA transmitidos pela água e alimento, o uso de Calcivirus Felino e o bacteriófago MS2 como controles internos foi descrito (Mattison e outros, (2009) Int. J. Food Microbiol. 132, 73-77; Di e outros, (2010) J. Virol Methods 165, 57-63; Dreier e outros, (2005) J. Clin. l Microbiol. 43, 4551-4557).

[0008] Murphy e outros (2007, Int. J. Food Microbiol. 120, 110-119) revela um controle interno do processo da amostra bacteriana na detecção de Listeria monocytogenes e Salmonella enterica. Este controle tem como base uma cepa de E. coli recombinante incluindo fragmentos do gene fluorescente verde (gfp) e o gene iroB de S. entérica. O controle não foi usado para fins quantitativos e a cepa E. coli gram-negativa subjacente irá apresentar diferentes características durante a preparação da amostra comparado com Listeria monocytogenes.

[0009] Por conseguinte, existe uma necessidade quanto a novos e confiáveis métodos que permitam a detecção e quantificação do patógeno Listeria monocytogenes por meio da PCR em tempo real em amostras contaminadas.

[00010] Descobriu-se inesperadamente, que este problema pode ser solucionado pelo emprego de uma cepa IAC+, Δ-prfA L. monocytogenes EGDe como um controle interno do processo que abrange todo o processo de detecção.

Descrição da Invenção

[00011] Um primeiro aspecto da presente invenção é, portanto, uma bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes em que o lócus genômico do fator de transcrição PrfA foi deletado, caracterizado por compreender ao nível genômico, uma sequência artificial que age como um controle interno de amplificação (IAC).

[00012] Uma bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes significa uma espécie Listeria monocytogenes resultante da alteração de seu material genético usando técnicas de engenharia genética. A modificação genética compreende a inserção e/ou deleção de genes. A deleção do gene pfrA pode ser realizada, por exemplo, como apresentado em Bockmann e outros (1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653.

[00013] O lócus genômico do fator de transcrição PrfA significa a sequência de ácido nucleico codificando para a proteína PrfA. Isto é uma sequência de 705 pares de base (Leimeister-Wachter e outros, 1990; Proc. Natl. Acad Sci USA, 87, 8336- 40; Glaser e outros, 2001; Science, 294, 849-52). O gene está localizado dentro da região cromossômica em torno do gene listeriolysin (lisA) de Listeria monocytogenes (GeneID: 987031); http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/gene/987031#pageTop). A informação a respeito do fator transcripcional PrfA também é dada em Scortti e outros, (2007) Microbes and Infection 9, 1196-1207, que está ora incorporado por referência . PrfA controla a expressão de determinantes chave de virulência de Listeria monocytogenes. PrfA é uma proteína de 237 resíduos de 27 kDA. A deleção do lócus genômico do fator transcripcional PrfA torna o mutante não patogênico.

[00014] De acordo com a presente invenção o controle interno de amplificação (IAC) significa uma sequência de ácido nucleico artificial presente no tubo de ensaio durante a reação PCR co-amplificada com uma determinada sequência alvo conforme indicado por Hoorfar e outros. (2003) Lett. Appl. Microbiol. 38, 79-80. A presença de um IAC permite determinar resultados falso-negativos. A sequência IAC pode ser qualquer sequência de polinucleotídeo. O tamanho desta sequência pode variar dependendo das condições de reação e ensaio da PCR específicos da mesma.

[00015] A sequencia do IAC é preferivelmente uma sequência de nucleotídeo de cópia única, ou seja, uma sequência de nucleotídeo presente apenas uma vez no genoma haplóide de uma bactéria Listeria monocytogenes.

[00016] Preferivelmente, a sequência IAC é uma sequência que não ocorre em Listeria monocytogenes ou qualquer outras espécie que se espera como de ocorrência natural dentro de uma amostra para investigação, ou na própria amostra matriz.

[00017] Preferivelmente, a sequência IAC compreende sequência de ligação ao iniciador nas extremidades 5' e 3'.

[00018] De acordo com a presente invenção é preferido que o IAC seja um IAC competitivo, ou seja, o IAC de Listeria monocytogenes geneticamente modificada e a sequência alvo prfA de Listeria monocytogenes do tipo selvagem seja amplificada com um conjunto comum de iniciadores sob iguais condições e no mesmo tubo da PCR durante a PCR em tempo real. Portanto, as sequências de ligação ao iniciador do IAC são particularmente e preferivelmente idênticas às sequências de ligação do iniciador do lócus prfA genômico doe Listeria monocytogenes do tipo selvagem.

[00019] Em uma modalidade muito preferida da presente invenção, a sequência IAC artificial é a sequência de 100 pb de acordo com SEQ ID NO: 1: 5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACAC-3'.

[00020] Esta sequência IAC é apresentada em Rossmanith e outros. (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771. De acordo com a presente invenção as sequências do IAC com mais de 80% de homologia com a SEQ ID NO: 1 podem ser usadas. Preferivelmente, a homologia de sequência é maior do que 90%, mais preferivelmente maior do que 95%.

[00021] De acordo com a presente invenção prefere-se uma cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima descrito.

[00022] A cepa de Listeria monocytogenes EGDe é uma preparação clinica 1/2a de sorotipo de Listeria monocytogenes. Esta cepa é o organismo modelo mais disseminado em uso cientifico. (GenBank: AL591978; Glaser e outros . (2001) Science 294 (5543), 849-52).

[00023] Um aspecto adicional da presente invenção é uma cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modificada, em que o lócus genômico do fator transcripcional PrfA foi deletado, compreendendo a sequência de controle interno de amplificação (IAC) de SEQ ID NO: 1, conforme depositado no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) como Listeria monocytogenes ΔprfA/+lAC, sob DSM 23639 em 20 de maio de 2010.

[00024] A bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes de acordo com a presente invenção atende as exigências para um controle interno do processo da amostra confiável, estando tão proximamente relacionado com Listeria monocytogenes do tipo selvagem quanto possível. Ela não interfere com a reação de detecção principal por meio da PCR em tempo real e o desempenho da reação química subjacente para detecção do controle é igual à reação principal. Adicionalmente, a aplicação de célula de Listeria monocytogenes como ISPC permite abranger todo o progresso dos métodos necessários incluídos na detecção de patógeno no alimento, da preparação da amostra até a detecção usando PCR em tempo real.

[00025] Um outro aspecto da presente invenção é o uso de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima, para detecção e determinação qualitativa e/ou quantitativa da ocorrência de Listeria monocytogenes do tipo selvagem, em uma amostra com suspeita de estar contaminada com o dito micro-organismo.

[00026] Preferivelmente, a amostra é uma amostra de alimento, um fluido corpóreo, em particular, sangue, plasma ou soro, água ou uma amostra de tecido.

[00027] Amostras exemplares incluem sem limitação a alimento (por exemplo, leite de vaca, de ovelha, cabras, éguas, burros, camela, iaques, búfala e rena, produtos do leite, carne de bezerro, cabra, cordeiro, carneiro, porco, pernas de rã, vitela, roedores, cavalo, canguru, aves, incluindo, galinha, peru, pato, ganso, pombo ou pomba, avestruz, ema, peixes marinhos, incluindo peixes ósseos como salmão e tilápia e mariscos como moluscos e crustáceos e caracóis, produtos de carne, produtos vegetais, sementes cereais, incluindo milho, trigo, arroz, cevada, sorgo e painço, cereais que não de gramíneas incluindo trigo mourisco, amaranto, e quinua, legumes incluindo feijão, amendoim, ervilha e lentilha, nozes incluindo amêndoas, nozes e pinha, sementes oleaginosas, como girassol, colza e gergelim, vegetais como vegetais de raiz, que incluem batatas, cassava e nabos, vegetais de folha, incluindo amaranto, espinafre e couve, vegetais marinhos incluindo dulse, algas marinhas e algas dabberlocks, vegetais de caule, que incluem broto de bambu, cactos e aspargos, vegetais inflorescentes, como alcachofras, brócolis e lírios bem como vegetais frutíferos, incluindo abóbora, quiabo e berinjela, frutas, ervas e especiarias, sangue total, urina, escarro, saliva, fluido amniótico, plasma soro, lavagem pulmonar e tecidos, incluindo, sem limitação a fígado, baço, rim, pulmão, intestino, cérebro, coração, músculo, pâncreas e outros mais. O perito na técnica apreciará que lisados, extratos ou material homogeneizado obtido de quaisquer amostras dos exemplos supra ou de suas mistura ou composições, compreendendo uma ou mais amostras exemplares também se constituem em amostras dentro do escopo da invenção.

[00028] Particularmente preferido é uma amostra de alimento.

[00029] A amostra alimentar é preferivelmente um produto do leite, preferivelmente leite, particularmente leite cru, leite em pó, iogurte, queijo ou sorvete, um produto de peixe, preferivelmente peixe cru, um produto de carne, preferivelmente carne crua, caldo de carne ou salsichas, molho de salada, chocolate, ovo ou produtos de ovo, como maionese.

[00030] Particularmente e preferivelmente as amostras de alimento usada no método de acordo com a presente invenção são amostras que são normalmente conhecidas por compreender Listeria monocytogenes potencialmente patogênica, por exemplo, queijo.

[00031] Preferivelmente, a Listeria monocytogenes geneticamente modificada como descrito acima, é empregada como controle interno do processo de amostra (ISPC) para um ensaio com base na PCR em tempo real.

[00032] De acordo com a presente invenção um ISPC é um organismo modelo adicionado para a amostra original antes da preparação da amostra. Um ISPC fornece uma medida para a eficiência de toda a cadeia analítica da preparação da amostra até a detecção da molécula alvo e abrange todas as etapas metódicas que são necessárias para a detecção quantitativa confiável de patógenos com PCR convencional ou em tempo real.

[00033] Um outro aspecto da presente invenção trata-se de um método para detectar e determinar a ocorrência de Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de estar contaminada com o referido micro-organismo patogênico, compreendendo as seguintes etapas: a) adicionar para a amostra uma quantidade predefinida de células da bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima descrito, b) incubar a amostra com uma solução de extração, c) isolar o DNA por métodos padrão. d) aplicar PCR em tempo real usando para isso (i) iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima; e (ii) uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente com a referida sequência IAC, e) determinar qualitativa e/ou quantitativamente sinais fluorescentes gerados pela etapa (d), e f) determinar e/ou calcular da etapa (e) quanto à presença e/ou a quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amostra original com suspeita de estar contaminada com o referido micro-organismo.

[00034] Na etapa (a) uma quantidade predefinida de células da bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima descrito é adicionada para a amostra. A quantidade adicionada para a amostra depende do tamanho da amostra. Preferivelmente, uma quantidade de 25 a 100000 CFU (unidades formadoras de colônia) da bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada é adicionada para uma amostra de, por exemplo, 25 g. Particularmente preferido é uma quantidade de 100 a 5000 CFU por 25 g.

[00035] A unidade formadora de colônia (CFU) é uma medida de células viáveis em uma amostra. Ela pode ser determinada por métodos de cultura, por exemplo, por disseminação uniforme d amostra em um gel de cultura bacteriana. A incubação em condições adequadas de cultura, resulta na formação das colônias. O número das colônias representa o número de unidades formadoras de colônia na amostra. Alternativamente, a contagem de células é determinada por contagem ao microscópio de células manchadas fluorescentes, por exemplo, usando o kit Live/Dead(R) BacLight (TM) Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Willow Creek, OR, USA) ou métodos comerciais semelhantes.

[00036] A solução de extração usada na etapa (b) é uma solução aquosa de uma solução tampão, dotada, tipicamente de um valor de pH maior do que 5 e menor do que 9, preferivelmente maior do que 6 e menor do que 8, mais preferivelmente entre 6,5 e 7,5. A solução de extração pode compreender adicionalmente ate 20% de um ou mais solventes orgânicos miscíveis em água.

[00037] O tampão que pode ser utilizado no método da presente invenção é de preferência, selecionado do grupo de tampão de fosfato, solução salina tamponada com fosfato (PBS), 2-amino-2-hidroximetil- 1,3-propanodiol (TRIS), tampão salina tamponado com TRIS (TBS) e TRIS/EDTA (TE).

[00038] Em uma modalidade da presente invenção a solução de extração compreende ainda MgCl2 e;ou um líquido iônico. O MgCl2, caso esteja presente, estará presente em uma concentração entre 0,05 e 3 M, preferivelmente entre 0,1 e 2M, mais preferivelmente entre 0,3 e 1 M.

[00039] Em uma outra modalidade da presente invenção a solução de extração compreende ainda pelo menos um caótropo e pelo menos um detergente.

[00040] O líquido iônico - caso esteja presente - está presente, tipicamente, em concentrações entre 0,5 e 20% em peso, preferivelmente entre 1 e 10% em peso, com base no peso da mistura. O líquido iônico pode ser um líquido iônico ou uma mistura de dois ou mais líquidos iônicos. Em uma modalidade preferida, a solução de extração compreende ou MgCl2 ou líquido iônico.

[00041] Líquidos iônicos usados na presente invenção são espécies iônicas consistindo de um cátion orgânico e um anion geralmente inorgânico. Eles não contém quaisquer moléculas neutras tendo em geral, ponto de fusão abaixo de 373 K. Artigos periódicos sobre líquidos iônicos, são por exemplo, R. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001 , 2399-2407; M.J. Earle, K.R.Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasserscheid, W. Keim "lonische Flussigkeiten - neue Losungen fur die Übergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids - Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945; T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis", Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083 or R. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions", J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227).

[00042] Em geral, todos os líquidos iônicos de fórmula geral K+A- conhecidos aos de prática na técnica, em particular os que são miscíveis em água, são adequados no método de acordo com a invenção.

[00043] Caso um líquido iônico ou MgCl2 esteja presente, em uma outra modalidade preferida a solução de extração não compreende detergente, o que significa que nenhum detergente aniônico, zwitteriônico ou não iônico como dodecilsulfato de sódio, CHAPS, Lutensol AO-7 é adicionado para a solução de extração.

[00044] O termo "caótropo" como aqui empregado, refere-se a uma substância que ocasiona distúrbio em uma proteína ou ácido nucleico, por exemplo por alterar a estrutura secundária, terciária ou quaternária de uma proteína ou de um ácido nucleico enquanto deixa a estrutura primária intacta. Caótropos exemplares incluem, sem limitação a, cloridrato de guanidina (GuHCl), tiocianato de guanidínio (GuSCN), tiocianato de sódio (KSCN), iodeto de sódio, perclorato de soído, uréia, e outros que tais. As descrições de caótropos e sais caotrópicos podem ser encontradas, por exemplo, em K. Hamaguchi e outros. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1962) 62:1129-1136).

[00045] Como aqui empregado, o termo "detergente" refere-se a moléculas com características lipofílicas bem como hidrofílicas (ou seja, anfifílicas). Um detergente de acordo com a invenção, pode compreender, por exemplo, um resíduo de ácido graxo e uma parte hidrofílica (por exemplo, aniônica ou catiônica).

[00046] Além disso, é possível adicionar para a solução de extração uma ou mais substâncias adicionais como agentes desestabilizantes ou enzimas de degradação de biopolímero que ajudam a degradar as substâncias presentes em amostras específicas. Um exemplo é a adição de enzimas de degradação do amido, para uma amostra de alimento compreendendo altas quantidades de colágeno e/ou amido.

[00047] A incubação é tipicamente feita a temperaturas entre 18°C e 50°C, preferivelmente, entre 25°C e 45°C, mais preferivelmente entre 30°C e 42°C.

[00048] A amostra é tipicamente incubada com a solução de extração durante um tempo entre 120 minutos e 6 horas, preferivelmente entre 20 minutos e 1 hora.

[00049] De modo a facilitar a dissolução da amostra a referida amostra pode ser homogeneizada usando um "stomacher" antes de sua incubação com a solução de extração. A dissolução e ainda apoiada e/ou acelerada quando a mistura é agitada durante a incubação.

[00050] Outros métodos de extração podem ser encontrados, por exemplo, em Brehm-Stecher e outros. (2009) Journal of Food Protection 72: 1774-1789.

[00051] De acordo com a presente invenção o DNA do material bacteriano é isolado na etapa (c). Vários métodos conhecidos na técnica podem ser empregados para extrair o DNA, por exemplo, os métodos apresentados em Sambrook e outros. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

[00052] Em geral, a extração do DNA compreende a lise da célula e a purificação do DNA por, ou precipitação ou ligação específica em substratos variados, por exemplo, sílica.

[00053] A lise da célula pode ser realizada por métodos padrão, por exemplo, por métodos enzimáticos, métodos de microesferas, tratamento com som, métodos detergentes, ou combinações dos citados. Preferivelmente, são empregados métodos com detergente.

[00054] Enzimas adequadas para a lise celular enzimática são, por exemplo, lisozima, lisostafina, zimolase, celulase, mutanolisina, glicanases, proteases, manase.

[00055] Microesferas adequadas para rompimento celular são de vidro, cerâmica, zircônia ou aço. Após adição das microesferas às células aplica-se agitação da mistura. A agitação pode ser aplicada, por exemplo, por uma misturadora de vórtice laboratorial comum ou em um aparelho especialmente projetado.

[00056] De acordo com a presente invenção um outro método para a lise celular é o tratamento com som. Este método envolve a aplicação de ultrassom (tipicamente de 20 a 50 kHz) na amostra.

[00057] A lise celular com base em detergentes resulta no rompimento da barreira lipídica, que circunda as células. Detergentes adequados podem Sr escolhidos dentre detergentes não iônicos, zwitteriônicos e iônicos, por exemplo, CHAPS, Triton® X ou TWEEN®. Preferivelmente, são usados os detergentes iônicos, sendo um exemplo de detergente iônico adequado SDS.

[00058] Além da escolha do detergente, outras considerações importantes para a ótima lise celular inclui o tampão, pH, resistência iônica e temperatura:

[00059] A solução de lise possui, tipicamente um valor de pH maior do que 5 e menor do que 9, preferivelmente maior do que 6 e menor do que 8, mais preferivelmente entre 6,5 e 7,5;

[00060] O tampão adequado é preferivelmente selecionado do grupo de tampão de fosfato, tampão salino tamponado com fosfato (PBS), 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol (TRIS), tampão de solução salina tamponada com TRIS (TBS) e TRIS/EDTA (TE).

[00061] Opcionalmente um ou mais agentes quelantes podem ser adicionados para a solução de lise a fim de sequestrar os cátions divalentes. Quelantes adequados são, por exemplo, EDTA (ácido etilenodiamino tetracético), EGTA (ácido etileno glicol tetracético) ou etilenodiamina. Preferivelmente, usa-se EDTA.

[00062] Os métodos de lise celular supracitados são seguidos, tipicamente, por centrifugação de modo a separar o DNA do material celular. Um perito na técnica pode determinar, facilmente, os parâmetros para a centrifugação. Tipicamente a centrifugação é feita como apresentado em Sambrook e outros. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

[00063] Após a lise celular o DNA é normalmente precipitado por adição de um álcool, preferivelmente etanol ou isopropanol.

[00064] Adicionalmente, o DNA pode ser fornecido em uma forma adequada para amplificação usando-se um kit de isolamento de DNA comercialmente disponível, como o kit de tecido NucleoSpin® e o protocolo de suporte para bactérias Gram-positivas (Machery-Nagel, Duren, Germany) ou o kit NexttecR kit para DNA genômico de bactérias (Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen, Germany).

[00065] Em uma modalidade adicional da presente invenção o material bacteriano é separado antes do isolamento do DNA na etapa (c). Esta etapa adicional é particularmente preferida, visto permitir a aquisição de uma concentração maior de DNA na amostra de PCR resultante. A separação do material bacteriano pode ser realizada por qualquer método conhecido, como centrifugação, filtração, dieletroforese e ultrassom ou ligação de afinidade, por exemplo, usando-se anticorpos, lecitinas, proteínas de ligação viral, aptâmeros ou peptídeos antimicrobianos (AMP), que são preferivelmente imobilizados em microesferas. Preferivelmente, as células são isoladas por filtração ou centrifugação, mais preferivelmente por centrifugação. A filtração da amostra extraída é, particularmente, necessária quando a amostra complexa compreende material que é raramente extraível ou não extraível de todo, com o método da presente invenção. Tipicamente, esses materiais compreender amido e/ou fibras. Contudo, o método preferido para isolamento das células da mistura de extração é centrifugação.

[00066] A etapa de incubação pode ser repetida - dependendo da matriz da amostra - uma ou várias vezes, por exemplo, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou dez vezes. Entre essas etapas de incubação, o material bacteriano e a matriz de amostra residual podem ser separados do sobrenadante, por centrifugação, por exemplo.

[00067] Depois da separação do material bacteriano as células são preferivelmente lavadas com água, uma solução tampão e/ou soluções compreendendo detergente. A etapa de lavagem pode se repetir várias vezes.

[00068] Na etapa (d) aplica-se a reação de PCR, preferivelmente PCR em tempo real. PCR em tempo real é um método para detectar e medir produtos gerados durante cada ciclo de uma PCR, que são proporcionados para a quantidade de ácido nucleico matriz antes do inicio da PCR. A informação obtida, como uma curva de amplificação, pode ser usada para quantificar as quantidades iniciais da sequência de ácido nucleico da matriz.

[00069] A detecção é preferivelmente com base na fluorescência de monitoração em cada ciclo a uma temperatura ajustada. A fluorescência é monitorada normalmente usando-se um dispositivo óptico para colear os dados em cada excitação específica e comprimentos de onda emitidos para o corante fluorescente particular presente na amostra. O ciclo em que a fluorescência de uma amostra cruza o limite para detecção da fluorescência acima do fundamental é denominado limite do ciclo, Ct e permite a quantificação da matriz de partida.

[00070] As condições da PCR não são particularmente restritas porém condições ótimas podem ser selecionadas para cada aparelho da PCR. Por exemplo, podem ser usadas as seguintes condições: - desnaturação térmica de DNA de fita dupla em DNA de fita simples: aquecimento é geralmente feito a cerca de 90-98°C, preferivelmente em cerca de 92-96°C, geralmente por cerca de 3 segundos a 1 minuto, preferivelmente por cerca de 30 segundos a 1 minuto. - aquecimento: o aquecimento a é feito geralmente a cerca de 40-70°C, preferivelmente a 55-65°C, geralmente por cerca de 5 segundos a 2 minutos, preferivelmente por cerca de 30 segundos a 90 segundos. - reação de alongamento do DNA: o aquecimento é feito em geral a cerca de 60-75°C, preferivelmente a cerca de 70-74°C, em geral, por cerca de 10 segundos a 3 minutos, preferivelmente por cerca de 30 segundos a 2 minutos. - composição de íon Mg no líquido de reação: Geralmente cerca de 1-5 mM, preferivelmente cerca de 1,5-3,5 mM.

[00071] Esta reação é feita tipicamente em cerca de 20-50 ciclos, preferivelmente em cerca de 45 ciclos, pelo que, o DNA alvo pode ser amplificado até um nível detectável.

[00072] Qualquer aparelho de PCR em tempo real comercial pode ser empregado.

[00073] De acordo com a etapa (d) (i) do método da presente invenção são empregados os iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como indicado acima.

[00074] Em geral, o termo "iniciador" refere-se a uma molécula de ácido nucleico curta como um DNA oligonucleotídeo de 9 nucleotídeos ou mais em comprimento, ou seja, complementar a um segmento ao longo de uma fita do ácido nucleico alvo, ou seja, o lócus prfA genômico e a sequência IAC, em que a finalidade do iniciador é iniciar a replicação do ácido nucleico de um ácido nucleico maior ao longo da fita. De acordo com a presente invenção iniciadores de 15 a 40 nucleotídeos são preferidos. Na presente invenção o termo "iniciador" é usado para o par de iniciador, flanqueando a sequência visada para amplificação.

[00075] Preferivelmente, os iniciadores usados na etapa (d) (i) são Lip1 e Lip2. A sequência de Lip1 é: 5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3' (SEQ ID NO: 2) e a sequência de Lip2 é: 5'-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G-3' (SEQ ID NO: 3).

[00076] De acordo com a etapa (d) (ii) do método da presente invenção são empregadas, uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente com a sequência IAC.

[00077] De acordo com a presente invenção o termo "hibridiza especificamente" significa ligação detectável e especifica.Polinucleotídeos. oligonucleotídeos e seus fragmentos hibridizam seletivamente para fitas de ácido nucleico sob condições de hibridização que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável para ácidos nucleicos não específicos.

[00078] Um oligonucleotídeo fluorescente rotulado é um oligonucleotídeo que apresenta um fluoróforo covalentemente ligado. Um fluoróforo é um composto químico que, quando excitado pela exposição a um determinado comprimento de onda de luz, emite luz fluorescente, por exemplo, a um comprimento de onda diferente da luz.

[00079] Preferivelmente, as sondas de oligonucleotídeo que são capazes de hibridizar especificamente com o lócus prfA e a dita sequência IAC apresentam diferentes fluoróforos emissores de luz de diferentes comprimentos de onda. Isto permite detectar uma sonda independentemente da outra.

[00080] As sondas rotuladas com fluorescência usadas, tipicamente, para a PCR em tempo real, são sondas LightCycler (hibridização), indicadores moleculares, ou sondas de hidrólise (também denominadas sondas TaqMan®. Preferivelmente, são usadas sondas de hidrólise.

[00081] Sondas LightCycler utilizam a técnica de transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET). Para este método duas diferentes sondas de oligonucleotídeo ligadas a um doador de FRET e um receptor de FRET, respectivamente, são usadas, para CAD sequência alvo. Essas sondas ligam-se lado a lado à sequência alvo, mantendo os fluoróforos próximos.

[00082] Indicadores moleculares (Tyagi e outros., Nat. Biotechnol. 14:303-8 1996) são sondas de oligonucleotídeo ligadas a um fluorófo repórter e uma têmpera. Os nucleotídeos na extremidade 5' são complementares aos nucleotídeos na extremidade 3', formando uma estrutura em circuito rígido. Devido à proximidade do fluoróforo e a têmpera não é observada nenhuma fluorescência. A hibridização da sonda com a sequência alvo durante a PCR em tempo real, conduz a um aumento na distancia repórter-têmpera, resultando na fluorescência do gene repórter.

[00083] Preferivelmente, sondas de hidrólise (sondas TaqMan®) são usadas (Lee e outros., Nucleic Acids Res,. 21:3761-6, 1993).Essas sondas utilizam também a técnica de transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET). As sondas apresentam um repórter fluorescente em uma extremidade e uma têmpera de fluorescência na extremidade oposta. Devido à proximidade do gene reporte a têmpera, a detecção da fluorescência do repórter é suprimida. Durante o estágio de anelamento da PCR ambos, os iniciadores e a sonda anelam-se ao DNA alvo. A polimerização de uma nova fita de DNA leva à degradação da sonda pela atividade 5'-3' exonuclease da polimerase e a separação física do gene repórter fluorescente da têmpera, resultando em um aumento na fluorescência. A fluorescência pode ser vista e medida em um termociclador da PCR em tempo real, e seu aumento geométrico correspondente a um aumento exponencial do produto é usado par determinar o ciclo limite (Ct) em cada reação (vide a seguir).

[00084] Repórteres exemplares incluem, sem limitação a: 6- carboxifluoresceína; carboxifluoresceína (FAM); difluoreto dipirrometeno de boro (BODIPY); acridina, estilbeno, 6-carbóxi- fluoresceína (HEX), TET (tetrametil fluoresceína), 6-carbóxi-X- rodamina (ROX), Rodamina-6G, Texas Red, 2',7'-dimetóxi-4',5'-dicloro- 6-carboxifluoresceína (JOE), Cy®3, Cy®5, VIC® (Applied Biosystems), LC Red 640, LC Red 705, Texas Red, Yakima Yellow®, bem como seus derivados. Preferivelmente, um repórter selecionado de FAM e HEX é empregado na presente invenção.

[00085] Têmperas exemplares incluem, sem limitação a Black Hole Quenchers (WO 01/86001 A1) como BHQ1® e BHQ2®, MGB (Minorgroove-binder, EP 0819133 B1), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), Eclipse®Dark Quencher, DABCYL, DABSYL, DDQ I e DDQ II. De acordo com a presente invenção as temperas preferivelmente usadas são MGB ou BHQ1®.

[00086] Uma pessoa versada na técnica poderá facilmente escolher uma combinação de repórter-resfriador adequado. Tipicamente, o espectro de absorção da tempera necessita ter um bom cruzamento com o espectro de emissão do gene repórter para permitir uma ótima têmpera.

[00087] Preferivelmente, a sonda rotulada fluorescente que hibridiza com a sequência IAC da etapa (d) (II) é pLucLm4 (SEQ ID NO: 4), como revelado em Rossmanith e outros., (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771. A sonda rotulada fluorescente que hibridiza com o lócus prfA é preferivelmente LipProbe (SEQ ID NO: 5).

[00088] A sonda rotulada fluorescente pLucLm4 apresenta,preferivelmente HEX como fluoróforo reporte e BHQ1® como têmpera.

[00089] A sonda rotulada fluorescente LipProbe apresenta preferivelmente FAM como repórter e MGB como têmpera.

[00090] De acordo com a presente invenção os sinais fluorescentes gerados na etapa (d) são qualitativamente e ou quantitativamente determinados na etapa (e).

[00091] A detecção é preferivelmente baseada na monitoração da fluorescência em cada ciclo a uma dada temperatura. A fluorescência é normalmente monitorada usando-se um dispositivo óptico para coleta dos dados em comprimentos de onda específicos de emissão e excitação, para os fluoróforos particulares presentes na amostra.

[00092] Na etapa (f) a presença e/ou quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amostra original suspeita de estar contaminada com o dito microorganismo é determinada e/ou calculada pela etapa (e).

[00093] A presença de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amostra original é determinada, tipicamente, por determinar qualitativamente os sinais fluorescentes na etapa (e).

[00094] A quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amostra original é calculada, tipicamente, compreendendo as seguintes etapas: - cálculo da quantidade inicial de DNA por meio de cópias de DNA de Listeria monocytogenes geneticamente modificada e de Listeria monocytogenes do tipo selvagem usando-se o método Ct (método Limite) com base no respectivo sinal fluorescente após amplificação da PCR em tempo real. O método limite é baseado na comparação do respectivo sinal da amostra investigada com um padrão de calibração (Kaltenbock e outros., (2005). Advances in Clinical Chemistry 40:219-259). - cálculo da perda durante procedimento analítico (compreendendo a preparação da amostra, purificação e isolamento do DNA e PCR em tempo real de acordo com as etapas (b), (c) e (d) do método da presente invenção, com base no valor conhecido de células iniciais de Listeria monocytogenes geneticamente modificada dentro da amostra e do valor de células, conforme obtido pelo método Ct após PCR em tempo real. - cálculo do número de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem presentes na amostra com suspeita de estar contaminada com os referidos micro-organismos baseado na perda calculada de células de Listeria monocytogenes geneticamente modificada durante procedimento analítico.

[00095] O método da presente invenção é vantajoso visto o uso de Listeria monocytogenes como um controle interno do processo de amostra (ISPC) para detecção de patógenos biológicos moleculares, propiciar uma maior similitude com os organismo alvo e daí a maior aplicabilidade para detecção do patógeno bacteriano. Mesmo uma espécie proximamente relacionada como Listeria innocua conduziria a um controle interno não competitivo necessitando de um segundo par de iniciador durante a PCR em tempo real. O simples emprego de um ISPC com base no DNA derivado de um IAC existente, desde o começo do processo de detecção, não preencheria também o pré-requisito de maior similitude de controle e alvo. Além disso, a maior parte do DNA estaria perdida durante as várias etapas metódicas antes da detecção por PCR.

[00096] Um aspecto ulterior da presente invenção trata-se de um kit para uso em um ensaio para detectar e determinar Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de estar contaminada com micro-organismos, compreendendo pelo menos em um ou mais ensaios (i) Listeria monocytogenes geneticamente modificada como especificado acima; (ii) os iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como especificado supra; e (iii) uma sonda de oligonucleotídeo rotulada fluorescente capaz de hibridizar, especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo rotulada fluorescente capaz de hibridizar especificamente com a sequência IAC.

[00097] Preferivelmente, os iniciadores do kit são Lip1 (SEQ ID NO: 2) e Lip2 (SEQ ID NO: 3).

[00098] As sondas fluorescentes rotuladas são preferivelmente pLucLm4 (SEQ ID NO: 4), para detecção da sequência IAC e LipProbe (SEQ ID NO: 5) para detecção do lócus prfA.

[00099] De acordo com a presente invenção o kit pode compreender ainda uma solução de extração.

[000100] Um outro aspecto da presente invenção trata-se de um método para fabricação de uma bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima descrito compreendendo as etapas: (a) deletar o lócus genômico do fator de transcrição PrfA das espécies bacterianas Listeria monocytogenes, (b) clonagem de um vetor compreendendo um IAC. (c) transformar o vetor da etapa (b) em espécies bacterianas da etapa (a).

[000101] A deleção do lócus genômico de PrfA de acordo com a etapa (a) é realizada por técnicas do conhecimento da técnica podendo por exemplo, ser realizada conforme exposto em Bockmann e outros. (1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653. A principio, um plasmídeo de nocaute é construído. Este plasmídeo é transformado em células de Listeria monocytogenes. O sobrecruzamento resulta na excisão do gene prfA. O organismo resultante também é referido como Listeria monocytogenes Δ-prfA.

[000102] Condições ótimas de cultura para a bactéria Listeria monocytogenes podem ser facilmente determinadas por um versado na técnica. Tipicamente as bactérias crescem em TSB-Y (caldo de soja Trypton com extrato de levedo) a 37°C com aeração.

[000103] Na etapa (b) é produzido um vetor compreendendo o IAC.

[000104] Quantidades adequadas da sequência IAC para clonagem são tipicamente produzidas por amplificação da sequência por PCR convencional (Rossmanith e outros. (2006) Res. Microbiol. 157, 763771). Os iniciadores usados para PCR compreendem tipicamente, sítios de restrição para enzimas de restrição especiais permitindo uma integração posterior ao vetor. Para uma sequência IAC de acordo com SEQ ID NO: 1 os iniciadores modificados LipBam (SEQ ID NO: 6) e LipSaI (SEQ ID NO: 7) compreendendo os sítios de restrição BamHI e SaII, respectivamente, são usados de preferência.

[000105] A sequência de LipBam é : 5' GCG CGG ATC CGA TAC AGA AAC ATC GGT TGG C'3 (SEQ ID NO:6).

[000106] A sequência de LipSal é 5'GCG CGT CGA CGT GTA ATC TTG ATG CCA TCA GG'3 (SEQ ID NO:7).

[000107] Após a purificação do produto de amplificação, a digestão de restrição, desfosforilação e ligação com um vetor de integração adequado são realizadas.

[000108] A digestão de restrição é feita tipicamente por incubação do produto de amplificação com enzimas de restrição comercialmente disponíveis correspondentes aos sítios de restrição dos iniciadores usados para a PCR. Preferivelmente, são usados BamHI e SaII.

[000109] A desfosforilação dos fragmentos do IAC pode ser realizada por incubação com uma fosfatase adequada, por exemplo, Fast AP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase (Fermentas). Um vetor de integração adequado pode ser escolhido facilmente pelo versado na técnica. O vetor compreende uma sequência genética que confere resistência a um antibiótico em que a linhagem hospedeira pretendida de bactéria é sensível (por exemplo, cloranfenicol) de modo a permitir para seleção posterior dos clones positivos. Preferivelmente, um vetor de inserção de fago por exemplo, pPL1 ou pPL2 como apresentado em Lauer e outros . (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186 é usado. O vetor de inserção de fago pPL2 (6123 pb) é particularmente preferido, visto proporcionar inserção de cópia única estável ao genoma de Listeria monocytogenes.

[000110] Quantidades adequadas do vetor de inserção podem Sr produzidas amplificando-se o vetor em uma bactéria, por exemplo, E. coli TOP 10F', e subsequente isolamento, digestão de restrição e desfosforilação conforme descrito acima. Tipicamente, os sítios de restrição podem ser vistos em um sítio de clonagem múltipla (MCS) do vetor.

[000111] A ligação é tipicamente feita por adição de uma DNA ligase, por exemplo, DNA ligase T4 disponível de Fermentas.

[000112] O vetor resultante é transformado em uma bactéria adequada, por exemplo, E. coli TOP 10F' para amplificação e seleção dos clones positivos. Esta seleção é realizada, tipicamente, por deposição em lâmina da bactéria em um meio compreendendo o antibiótico supracitado.

[000113] Na etapa (c), o vetor da etapa (b) é transferido para as células de Listeria monocytogenes da etapa (a). A transformação pode ser realizada usando-se os diversos métodos do conhecimento da técnica. São exemplos a transformação por choque térmico ou eletroporação. Preferivelmente, a transformação é realizada por eletroporação.

[000114] A transformação por choque térmico é realizada resfriando- se as células na presença de cátions divalentes como Ca++ (em CaCl2) ou Rb++ (RbCl2) preparando a membrana da célula para ficar permeável ao DNA de plasmídeo. AS células são incubadas em gelo com o DNA e a seguir passada por choque térmico brevemente (tipicamente a 41 a 43°C por 30 a 120 segundos).

[000115] Para a eletroporação as células são brevemente passada por coque com um campo elétrico de 10 a 25 kV/cm. Preferivelmente, a eletroporação é realizada de acordo com Park e outros. (1990) Gene 94, 129-132.

[000116] O organismo resultante pode ser testado com clonagem com um resultado positivo. A inserção de sucesso do vetor ao genoma da Δ-prfA Listeria monocytogenes pode ser testada por amplificação do fragmento de 499 pb por PCR (de acordo com Lauer e outros, (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186) e também por sequenciamento.

[000117] A inserção de cópia única do IAC ao genoma de Δ-prfA Listeria monocytogenes pode ser verificada comparando-se as proporções do DNA genômico de Listeria monocytogenes transformada medido por espectroscopia de UV/VIS com os dados após PCR em tempo real comprando-se com os dados do tipo selvagem do tamanho conhecido do genoma de Listeria (Nelson e outros , (2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395).

[000118] A presente invenção está ilustrada ainda pelas seguintes figuras e exemplos sem, contudo, estar a estes restrita.

[000119] Figura 1 - Confirmação de pPL2-IAC, E. coli e IAC+ Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe (de acordo com os Exemplos 1.4 e 1.6) (A) amplificação por PCR em tempo real de pPL2-IAC, clones de E. coli após transformação e isolamento do plasmídeo visando IAC artificial dentro do plasmídeo. Os gráficos de amplificação do lado esquerdo incluem a preparação do plasmídeo como alvo. Os gráficos de amplificação do lado direito (SS IAC) representam a função de calibração (Eficiência: 96,8% Rsq: 0,999). (B) Amplificação da PCR em tempo real de IAC+, clones de Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe visando IAC artificial dentro do genoma para confirmação da integração do vetor pPL2-IAC ao genoma de Listeria (Eff.: 96,0%; Rsq.: 0,999). Os gráficos de amplificação do lado esquerdo incluem DNA genômico de quatro clones de IAC +, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe como alvo.

[000120] Figura 2 - Confirmação da integração positiva de pPL2-IAC ao genoma de Listeria e confirmação do IAC + resultante, linhagem de Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe por PCR convencional (de acordo com o Exemplo 1.6). (A) gel de agarose das cepas clonadas, confirmado como Listeria monocytogenes, M. Marcador; 1 L ivanovvi, L seeligeri e L welshimeri, 2, L innnocua; 3, L monocytogenes; 4, L grayi, 5-8 quatro clones de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe. (B) Confirmação do IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe amplificando o gene rRNA 16S específico para todas as Listeria spp e o gene hly específico para Listeria monocytogenes. 9, L. spp; 10, Listeria monocytogenes 11-14, Quatro clones IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe. (C) conformação da integração do pPL2-IAC ao genoma da linhagem EGDe de Δ-prfA Listeria monocytogenes. 1-4, Quatro clones IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe. O fragmento de 499 pb resultante após PCR indica integração. Os produtos da PCR são separados em um gel de agarose a 1% e manchados com brometo de etídeo.

[000121] Toda a apresentação de todas as aplicações, patentes e publicações citadas acima e abaixo estão ora incorporados por referência ao presente.

1. Exemplos:

[000122] Os exemplos a seguir descrevem aplicações práticas da invenção.

1.1 CEPAS BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTURA.

[000123] Listeria monocytogenes EGDe (1/2a, número interno 2964) é uma parte da coleção de cepas bacterianas no Instituto de Higiene do Leite, Tecnologia do Leite e Ciência Alimentar, Departamento de Saúde Pública Veterinária e Ciência Alimentar, Universidade de Medicina Veterinária, Viena, Áustria, (IMML). Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe (1/2a) é uma parte da coleção de cepas bacterianas do Departamento de Microbiologia, Theodor Boveri Institute, Universidade de Wurzburg, Wurzburg, Germany, E. coli TOP 10F' eletrocompetente está disponível em Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Todas as cepas bacterianas são mantidas a - 80°C usando-se tecnologia MicroBank™ (Pro-Lab Diagnostics, Richmont Hill, Canada).

[000124] A medição da densidade óptica das culturas bacterianas é realizada a 600 nm (OD60o) em duplicada com um espectrofotômetro HP8452 (Hewlett Packard, Paolo Alto CA, USA). A deposição seletiva em placas de Listeria monocytogenes EGDe wt e IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe é realizada em RAPID' L.mono (laboratórios Bio-Rad GmbH, Munchem Alemanha), OCLA (Agar Listeria Oxoide Cromogenica, Oxoid, Hampshire UK), PALCAM (Solabia Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, França) e Agar de sangue (Biomerieux, Marcy l'Etoile, França), seja por estrias de 100 μl de cultura bacteriana às placas ou pela técnica de laço.

[000125] A eem umeração das suspensões bacterianas é feita usando-se o método de contagem de placa de Live/Dead®BacLight ®Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Willow Creek, OR, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

1.2 OLIGONUCLEOTÍDEOS, PLASMÍDEOS E REAÇÕES ENZIMÁTICAS.

[000126] As sequências de oligonucleotídeos e de plasmídeos estão apresentadas na Tabela 1. Os iniciadores para PCR convencional e em tempo real e a sonda rotulada com HEX pLUclm4 estão disponíveis de MWG Biotech (Ebersberg, Germany); a sonda Lip modificada com MGB de Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). O alvo de 100 pb artificial para o IAC é sintetizado por VBC Genomics (Vienna, Austria). O vetor de inserção do fago pPL2 de acordo com Lauer e outros, (2002) J. Bactriol. 184, 4177-4186.Tabela 1

a - especifico para Listeria monocytogenes wt b- iniciador contendo sítio de restrição Bam Hi c - iniciador contendo sítio de restrição Sal I d -IMML = Instituto de Higiene do Leite, Tecnologia e Ciência Alimentar do Leite , Universidade de Medicina Veterinária Tabela 1A

a - Refere-se ao relatório Blast b- Como obtido pelo sequenciamento

[000127] A digestão de restrição é realizada usando-se enzimas de restrição FastDigest® BamHI e SaII disponíveis de Fermentas (Fermentas International Inc., Burlington, Canada) de acordo com as instruções do fabricante. Um volume total de reação de 20 μl é incubado por uma hora a 37°C. A desfosforilação do vetor e os fragmentos de IAC antes da ligação é realizada usando-se FastAP® Thermosensitive Akaline Phosphatase (Fermentas) de acordo com as instruções do fabricante por 30 minutos a 37°C. DNA ligase T4 (Fermentas) é usado para ligação do vetor pPL2 e o fragmento IAC artificial durante a noite a 4°C.

[000128] A detecção da PCR em tempo real de Listeria monocytogenes por visualização de um fragmento de 274 pb do gene prfA é realizada de acordo com o formato previamente publicado usando-se os iniciadores Lip1 e Lip2 e a sonda Lip rotulada de FAM (D'Agostino e outros, (2004 (D'Agostino e outros . (2004) J. Food Prot. 67, 1646-1655; Rossmanith e outros (2006) Res. Microbiol. 157, 763771).

[000129] A detecção da PCR em tempo real do fragmento IAC artificial é feita de acordo com Rossmanith e outros. (2006) usando Lip1 e Lip2 e pLuclm4 HEX-rotulado.

[000130] O iniciador dianteiro (Lip1 :5'-GATACAGAAACATCGGTTGGC-3') e o iniciador inverso (Lip2:5'- GTGTAATCTTGATGCCATCAGG-3') amplificam um fragmento de 274 pb do gene prfA. Dois diferentes formatos de sonda TaqMan (TM) temperatura de fusão aumentada são usados. A sonda Lip (5'-FAM- CAGGATTAAAAGTTGACCGCA-MGB-3') usa uma modificação MGB. A sonda para o IAC do ensaio (pLucLm 4: 5'-HEX-TTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC -BHQ1-3") é rotulada com HEX. Os iniciadores e a sonda pLucLm 4 podem ser adquiridos de MWG Biotech (Ebersberg, Germany). a sonda MGB-modificada é adquirida de Applied Biosystems. A PCR convencional para a confirmação da inserção de pPL2-IAC ao genoma EGDe de Δ-prfA de Listeria monocytogenes é realizada usando-se os iniciadores NC16 e PL95 (Lauer e outros . (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186). IAC+, Δ-prfA L. monocytogenes EGDe é identificada como EGDe de Listeria monocytogenes por amplificação do lócus iap de Listeria monocytogenes de acordo com Bubert e outros . (1999, Appl. Environ. Microbiol. 65, 4688-4692) visando o gene rRNA 16S específico para todas as espécies Listeria e o gene hly específico para Listeria monocytogenes de acordo com Border e outros. (1990, Lett. Appl. Microbiol. 11, 158-162).

[000131] Reações da PCR convencional e de tempo real são realizadas em um termociclador Mx3000p da PCR em tempo real (Stratagene, La Jolla, CA, USA).O volume total de 25μl contém 20 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 3.5 mM MgCI2, 500 nM de cada iniciador, 250 nM de cada sonda, 200μM (cada) de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1,5 U de Taq DNA polimerase Platinum® (Invitrogen, Lofer, Austria); e 5 μl de DNA isolado. A amplificação seguinte à desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos é feita em 45 ciclos, a 94°C por 15 s, e 64°C por 1 minuto.

[000132] Para o DNA padrão para quantificação da PCR em tempo real um mililitro de uma cultura pura de Listeria monocytogenes linhagem EGDe é submetido ao isolamento do DNA usando-se um kit de tecido NucleoSpin® e o protocolo de suporte para bactérias Gram- positivas. A concentração do DNA é medida fluorimetricamente usando-se um dispositivo Hoefer DyNA Quant200 (Pharmacia Biotech). O número de copias do gene prfA é determinada presumindo-se que, com base no peso molecular do genoma de Listeria monocytogenes, 1 ng de DNA equaliza 3,1 x 105 cópias de todo o genoma, e de que o gene prfA é um gene de cópia única. A inclinação da curva padrão é usada para calculo a eficiência (E) da PCR com a seguinte equação: E = 10-1/s - 1 [21].

[000133] Os resultados da PCR em tempo real são expressos como equivalentes de célula bacteriana (BCE). O número de cópias do gene prfA e do inserto IAC é determinado presumindo-se, no fato de que, com base no peso molecular do genoma de Listeria monocytogenes, 1 ng de DNA é igual a 3,1 x 105 cópias de todo o genoma, e de que o gene prfA e o inserto IAC são um gene de cópia única. e um inserto de cópia única dentro do genoma, respectivamente. (Nelson e outros, (2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395). Todas as reações da PCR em tempo real são realizadas em duplicata exceto se observado em contrário.

[000134] Os produtos da PCR de PCR convencional são separados em 1,5% de geles de agarose a 90V por 25 minutos e manchados com 0,5 μg/ml de brometo de etídio (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany). GeneRuler 100 pb (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) foi usado como um padrão.

1.3 Extração e Medição do DNA

[000135] O DNA genômico de um mililitro de cultura bacteriana noturna é extraído usando-se o kit de tecido NucleoSpin® (Macherey - Nagel) e o protocolo de suporte para bactérias gram-positivas. DNA de plasmídeo para experimentos de clonagem é extraído usando-se o kit Quiagen Plasmid Midi (Hilden Germany) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração do DNA é analiticamente determinada por medição fluorimétrica usando-se um aparelho Hoefer DyNA Quant200 (Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA) e um Espectrofotometro 8452A Diode Array (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA).

1.4 Clonagem de pPL2-IAC

[000136] Quantidades adequadas do IAC (IAC: 5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3') para clonagem são produzidas por amplificação do fragmento de 100 pb por PCR convencional de acordo com Rossmanith e outros, (2006, REs. Microbiol 157, 763-771) usando-se os iniciadores modificados LipBam e LipSaI contendo os sítios de restrição BamHI e SaII. Após purificação do produto de amplificação usando NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel) a digestão da restrição e a desfosforilação são realizadas conforme descrito acima, seguindo-se a ligação com o vetor pPL2. Antes da ligação ao vetor de integração ao fago pPL2 ser transformada em E. coli TOP 10F' por técnicas de choque térmico padrão (Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual 2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) para amplificação. O vetor é extraído como descrito acima e usado para ligação após purificação, digestão de restrição e desfosforilação. O plasmídeo resultante pPL2-IAC é a seguir transformado em E. coli TOP10F' via choque térmico. Os clones positivos de pPL2-IAC são selecionados por deposição em caldo Luria-Bertani (LB; Oxoid) contendo 25 μg/ml de cloranfenicol.

[000137] Colônias bacterianas simples são coletadas e selecionadas para transformação positiva de E. coli com pPL2-IAC. A analise de digestão por restrição resulta em dois fragmentos de um comprimento de ~ 6.000 pb e 100 pb correspondendo aos comprimentos do vetor e do inserto indicando a transformação de pPL2-IAC em E. coli. PCR em tempo real visando o IAC usando pLucLm4 resulta na amplificação do alvo, confirmando assim, a análise de digestão por restrição. (Figura 1A).

1.5 Transformação de pPL2-IAC em Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe

[000138] Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe é transformado com pPL2-IAC usando-se um protocolo de eletroporação modificado (Park e outros ., (1990) Gene 94, 129-132). Células eletrocompetentes de EGDe de Δ-prfA Listeria monocytogenes são preparadas como a seguir: As células são cultivadas em caldo de infusão de cérebro- coração (BHI; Oxoid) contendo 5 μg/ml de penicilina G a um OD600 de 0,3 a 37oC. As células são coletadas a 8000 x g, 10 minutos a 4°C e o precipitado é lavado duas vezes em 1/10 volume de tampão 3,5 x SM HEM (72 mM sacarose, 1 mM MgCl2 e 2 mM de HEPES). Após ressuspensão do precipitado em 1/100 volumes, tampão 3,5 x SMHEM 100 μl de alíquotas são armazenadas a -80°C.

[000139] Para a eletroporação 100 μl de alíquotas de EGDe de Δ- prfA Listeria monocytogenes eletrocompetente são descongeladas em gelo sendo misturadas com 5 μl de suspensão de DNA (~1 μg/reação) contendo pPL2-IAC. Após incubação por um minuto em gelo, é feita a eletroporação (100Q, 50 μF, 1000 V) em um sistema de eletroporação Gene Pulser Xcell™ (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, Ca, USA). Um mililitro de BHI pré-aquecido é adicionado, sendo a amostra incubada 6h a 37oC e a seguir depositada em placas de Agar BHI contendo 25 μg/ml de cloranfenicol. Após 24 - 48 horas de incubação a 37°C, são coletadas colônias individuais e selecionadas quanto a clones de EGDe de Δ-prfA Listeria monocytogenes positivas para pPL2-IAC.

1.6 - Confirmação de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe

[000140] Quatro clones positivos da seleção com cloranfenicol de IAC+ EGDe de Δ-prfA Listeria monocytogenes são confirmados p teste da presença da sequência IAC em EGDe de Δ-prfA Listeria monocytogenes. Realiza-se isto por amplificação do fragmento de 100 pb do IAC usando uma sonda pLucLm4. DNA genômico de IAC+, EGDe Δ-prfA Listeria monocytogenes é submetido a PCR em tempo real resultando na amplificação positiva (Figura 1B). Os clones testados adquirem um valor Ct médio de 11,5 (desvio padrão SD): 0,16), correspondendo a uma média de 5,36 x 107 cópias. O estado do Δ-prfA da cepa clonada é testado por PCR em tempo real usando a sonda Lip-sonda hibridizando o fragmento de 274 pb do lócus de prfA de Listeria monocytogenes do tipo selvagem, resultando na amplificação negativa.

[000141] A integração do vetor ao genoma é testada com PCR convencional conforme descrito no parágrafo 1.2. Os fragmentos resultantes após eletroforese correspondem ao comprimento proposto do produto de amplificação de 499 pb (Figura 2C) Isto indica a inserção do vetor ao genoma de Listeria como os iniciadores NC16 e PL95 que permitem amplificação através do sitio de ligação tRNA Arg- attBP' em sorotipo de Listeria monocytogenes 1/2a resultando em um amplificado híbrido contendo partes das sequências do vetor (3') e do genoma de Listeria (5').

[000142] A análise do sequenciamento de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe é realizada usando este amplificado da PCR híbrido usando os iniciadores NC16 e PL95. A sequência obtida é 100% idêntica ao fragmento de 210 pb do vetor de integração de transporte pPL2 e 100% idêntica a um fragmento de 261 pb de Listeria monocytogenes incluindo o sítio de ligação proposto tRNA Arg-attBP' (Cepa EGDe, genoma completo, segmento 6/12; emb/AL591978.1). A confirmação do teste do IAC+ linhagem Δ-prfA como Listeria monocytogenes EGDe é adicionalmente realizada por PCR convencional como descrito no parágrafo 1.2. Os resultados apresentam-se na Figura 2A e B., demonstrando tamanhos de fragmento combinantes para IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDE e de Listeria monocytogenes EGDE de controle para ambos os ensaios da PCR.

1.7 Sequenciamento de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe

[000143] Os produtos da PCR dos clones positivos após amplificação são purificados usando o kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel), seguindo as instruções do fabricante.

[000144] Os produtos da PCR purificados são submetidos a Macrogen Inc. (Seul, Coréia) para sequenciamento do DNA. As amostras são sequenciadas em ambas as fitas usando os iniciadores NC16 e PL95 na reação de sequenciamento em ciclo.

[000145] As sequências obtidas são analisadas e alinhadas usando o servidor BLAST disponível do website National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/BLAST/).

1.8 PCR quantitativa em tempo real párea confirmação de inserção de cópia única de pPL2-IAC ao genoma de EGDe de Δ-prfA Listeria monocytogenes e calibração contra dados de EGDe de Listeria monocytogenes do tipo selvagem

[000146] Padrões de calibração de DNA genômico de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe e EGDe Listeria monocytogenes do tipo selvagem são comparados usando-se o ensaio de PCR em tempo real em um sistema multiplex com as sondas pLucLm4 e sonda Lip. Presumindo-se, com base no fato de que prfA é um gene de cópia única , diluições decimais de ambos os alvos de DNA são comparados. AS diluições em dez vezes começam a 1,58 x 106 copias totalizando 5 ng de DNA genômico conforme determinado por medição fluorimétrica e UV-VIS. Os resultados apresentam-se na Tabela 3 mostrando boa concordância com os valores Ct de ambas as sereis padrão. Isto também demonstra desempenho comparável de ambas as sondas nas reações. Os dados subjacentes resultam de duplicatas repetidas em quatro operações da PCR em tempo real. Para confirmação desses resultados as concentrações das culturas de IAC+, EGDe Δ-prfA Listeria monocytogenes são determinadas por manchamento de viabilidade e comparados com os resultados da PCR em tempo real. O número de 3,2 x 103 (RSD: 6,7%) BCE por amostra conforme obtido por PCR em tempo real compara-se a 2,8 x 103 (RSD: 25,0% )CFU por amostra como determinado por manchamento viável. Tabela 3

[000147] Comparação de valores Ct após PCR em tempo real derivado de uma diluição padrão décuplo de DNA genômico de EGDe de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e de EGDe clonado Δ-prf, IAC+ demonstrando inserção de cópia única de pPL2-IAC ao genoma de Listeria monocytogenes EGDe Δ-prfA.

a - baseado na presunção de que prfA é um gene de cópia única.b - series de diluição derivadas de uma solução contendo DNAgenômico 1 ng/μl representando 1,58 x 106 copias em 5 μl de matrizde DNA c - ensaio de prfA em PCR em tempo real usando sonda pLucLM4 rotulada com HEX, amplificando a sequência IAC artificial d - ensaio de prfA em PCR em tempo real usando sonda Lip rotulada com FAM, amplificando 274 pb da sequência lócus prfA e - DNA genômico de EGDe Listeria monocytogenes contra 1,58 x 105 cópias de suporte do genoma da linhagem IAC+, EGDe Δ-prfA em uma reação multiplex.

[000148] A influência de quantidades crescentes de DNA genômico derivado de EGDe IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes no desempenho da reação principal amplificando o lócus prfA da cepa do tipo selvagem e o alvo bacteriano principal é investigado com PCR em tempo real multiplex. Usando a sonda Lip e pLucLm4, em diluições decimais de DNA do tipo selvagem de EGDe Listeria monocytogenes genômico a 1,58 x 106 copias a 1,58 x 101 são testados em uma matriz ascendente bem como descendente, contra uma base de diluições decimais de 1,58 x 106 a 1,58 x 101 cópias de DNA genômico IAC+, Δ- prfA Listeria monocytogenesEGDe . Os valores Ct resultantes para todas as combinações testadas desviam-se dos respectivos valores conforme obtido pelos experimentos monoplex do padrão genômico de ambas as linhagens com um desvio padrão médio de 0,3 para todas as combinações de concentração padrão. Exemplarmente, os valores Ct resultantes para uma diluição de dez vezes do DNA genômico de EGDe de Listeria monocytogenes são apresentados na Tabela 3 contra uma base de 1,58 x 105 copias de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe.

1.9 Amostras de alimento contaminadas artificialmente e naturalmente

[000149] Leite UHT para contaminação artificial é adquirido em supermercados locais sendo testado para Listeria monocytogenes negativo antes da inoculação realizando PCR em tempo real visando o lócus prfA de Listeria monocytogenes. A contaminação artificial é realizada usando uma série de 10 diluições em solução de Ringer (Oxoid) de uma cultura pura de EGDe Listeria monocytogenes contendo 8,5 x 108 CFU/ml. 100 μl das diluições apropriadas são adicionados para as amostras. A série de diluição é preparada para conter 101 -10 2, 10 2 -10 3, 10 3 -104 e 10 4 -105 CFU/ml. O número de CFU para cada etapa de diluição serial é obtido pelo método de contagem de placa usando triptona de Agar de soja com 0,6% de levedura (TSA-Y; Oxoid) O experimento é realizado em triplicatas.

[000150] Amostras de queijo mole naturalmente contaminadas são obtidas pela autoridade regulatória e foram originadas de um recente surto de Listeria monocytogenes em Styria, Austria, sendo armazenadas a 4°C. Duas amostras de duas diferentes origens de produção são processadas em quadruplicatas resultando em oito amostras individuais. Adicionalmente, ISO 11290-2 é realizado de acordo para cada amostra para comparação dos resultados quantitativos dos experimentos com esta método padrão. (ISO 1 12902; ISO 1 1290-2/Amd1).

1.10 Tratamento da Amostra

[000151] O tratamento da amostra é feito usando-se o protocolo de lise de matriz conforme publicado por Mester e outros . (2010) J. Food Protect. 73, 680- 687 and Rossmanith e outros . (2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-51 1.1.10.

1.11 Análise Estatística

[000152] Comparações em dois grupos são analisadas pelo teste quadrado de x. Valores P são calculados e os valores < 0,05 são considerados significativos.

2. Exemplos de Aplicação 2.1 Fenótipo de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe em OCLA, PALCAM Agar em sangue e meio Agar RAPID' L.mono

[000153] Em Agar de sangue IAC+ Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDE não mostraram hemólise, Em Agar PALCAM IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe mostraram o mesmo fenótipo de EGDe Listeria monocytogenes do tipo selvagem como apresentado na Tabela 2. A morfologia e cor de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe em OCLA também é semelhante ao do tipo selvagem exceto pela formação de halo que não se observa para IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe após 24 e 48 horas de incubação. Depois de 72 horas de incubação IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe demonstram alguma formação halo fraca também. Colocados em RAPID' L mono a cepa clonada desenvolve cor branca, carecendo da característica de cor verde de EGDE Listeria monocytogenes do tipo selvagem em agar RAPID' L. mono. Tabela 2

a - formação halo terminou depois de 24 h de incubação a 37°C para Listeria monocytogenes EGDe tipo selvagem b - não se observou formação halo para Listeria monocytogenes EGDe Δ-prfA,IAC+ após 24 h e 48 h de incubação.

2.2 Aplicação de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe como controle de processo interno parra leite UHT artificialmente contaminado e queijo Quargel naturalmente contaminado.

[000154] Amostras de alimento tanto artificial como naturalmente contaminadas são processadas de acordo com o método apresentado por Rossmanith e outros, (2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-511: Este método é baseado na preparação da amostra por lise da matriz alimentar e a seguir separação da bactéria alvo usando centrifugação seguido por isolamento do DNA e detecção por PCR em tempo real. É usado líquido iônico tiocianato de 1-etil-3-metilimidazólio ([emim])SCN) é usado como solvente durante a preparação da amostra.

[000155] Para a contaminação artificial 12,5 g de amostras de leite UHT são salpicadas com uma diluição serial decimal em quatro etapas de Listeria monocytogenes EGDe tipo selvagem como descrito no parágrafo 1.8. Adicionalmente, é adicionado 1,4 x 103 (RSD.: 29.0%) CFU por amostra do controle interno de processo de amostra IAC+, Δ- prfA Listeria monocytogenes EGDe.

[000156] O patógeno alvo principal Listeria monocytogenes EGDe tipo selvagem é recuperado do leite UHT por um fator de 55% (RSD (desvio padrão relativo): 10,9%) comprado com contagem ao microscópio. O desvio padrão relativo dentro de escalas log é de 10,9% representando um alto nível de precisão e capacidade reprodutiva em termos de recuperação em escala log indicando sem influencia de desvio do controle de processo da amostra interno por meio de células IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe.

[000157] O controle interno do processo de amostra indica uma recuperação de 49% (RSD.: 27.1 %) comparado com a contagem microscópica. Inicialmente, 1.4 x 103 (RSD.: 29.0%) CFU (unidades formadoras de colônia) por amostra resulta em 6.9 x 102 (RSD.: 27.0%) BCE após recuperação e detecção por PCR em tempo real.

[000158] O sistema é a seguir aplicado a amostras naturalmente contaminadas de queijo Quargel. Adicionalmente 1.4 x 103 (RSD.: 29.0%) CFU IAC+, Δ-prfA L monocytogenes EGDe são adicionados por amostra.

[000159] As amostras são processadas de duas maneiras: Uma quantificação direta do valor de Listeria monocytogenes é obtida por lise da matriz e a seguir, PCR em tempo real. Ainda, ISO 11290-2 é realizado para comparação. Adicionalmente, as amostras são processadas por lise da matriz e a seguir PCR em tempo real usando um protocolo de isolamento do DNA omitindo a etapa da Proteinase K. Isto desvia artificialmente o desempenho de digestão e o resultado da mesma na eficiência de todo o protocolo.

[000160] Os valores de contaminação por Listeria monocytogenes das amostras obtidos diretamente após PCR em tempo real, atinge uma média de 1.4 x 106 (RSD.: 5.9%) BCE e 1.1 x 108 (RSD.: 8.9%) BCE para as duas respectivas cargas de queijo Quargel. Esses valores são corrigidos de acordo com a taxa de eficiência para CAD amostra como obtido comparando-se os valores de cada replica para o valor médio do controle de processo de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDe de 6.9x 102 (RSD.: 5.9%) BCE após PCR em tempo real. Após esta correção a média de contaminação por Listeria monocytogenes 1,1 x 106(RSD.; 35,8%) BCE e 2,3 x 108 (RSD .: 10,2%) para as duas cargas. Uma correção adicional incluindo a perda total de IAC+, Δ-prfA Listeria monocytogenes EGDE de células de controle do processo de 1.4 x 103 (RSD.: 29.0%) CFU a 6.9 x 102 (RSD.: 5.9%) BCE após PCR em tempo real é feita. Resultando em 2.32 x 106 (RSD.: 36.0%) BCE/g e 5.0 x 108 (RSD.: 9.9%) BCE/g para as duas cargas de queijo, comparando-se com 2.07 x 106 (RSD.: 91.1%) CFU/g e 4.9 x 108 (RSD.: 73.2%) CFU/g conforme obtido por ISO 11290-2.

[000161] As amostras processadas por de isolamento de DNA artificialmente desviado tinham em média valores básicos de 4.9 x 105 (RSD.: 6.3%) BCE e 3.7 x 107 (RSD.: 2.9%) para as respectivas cargas de queijo. Após correção como apresentado acima, as respectivas contaminações por Listeria monocytogenes foram 1.8x 106 (RSD.: 47%) BCE e 4.6 x108 (RSD.: 10.1%) BCE.

Claims (14)

1. Bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes, caracterizada pelo fato de que compreende uma deleção do lócus genômico do fator transcripcional PrfA e compreende ainda, ao nível genômico, uma sequência artificial consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que age como controle interno de amplificação (IAC).

2. Cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que é como definida na reivindicação 1.

3. Cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modificada, caracterizado pelo fato de que compreende uma deleção do lócus genômico do fator transcripcional PrfA e que compreende ainda, ao nível genômico, uma sequência de controle interno de amplificação (IAC) integrada de SEQ ID NO: 1, cuja cepa geneticamente modificada foi depositada em DSMZ como Listeria monocytogenes ΔprfA /+IAC sob DSM 23639 em 20 de maio de 2010.

4. Método para detecção e determinação qualitativa e quantitativa de Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de estar contaminada com a referida Listeria monocytogenes, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida amostra com Listeria monocytogenes geneticamente modificada, como definida na reivindicação 1, e processar adicionalmente a amostra por (a) uma primeira lise de matriz e PCR em tempo real subsequente para quantificar diretamente um nível de L. monocytogenes na referida amostra; (b) uma segunda lise de matriz e subsequente PCR em tempo real usando um protocolo de isolamento de DNA omitindo a etapa de Proteinase K para quantificar um nível de L. monocytogenes na referida amostra; e (c) opcionalmente realizar uma quantificação ISO 11290-2 para comparação.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de alimento.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a Listeria monocytogenes geneticamente modificada como definida na reivindicação 1 é empregada como controle de processo de amostra interna (ISPC) para um ensaio baseado em PCR em tempo real.

7. Método para detectar e determinar a presença ou a quantidade de Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra suspeita de estar contaminada com a referida Listeria monocytogenes, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) adicionar para a referida amostra uma quantidade predefinida de células da bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada como definida na reivindicação 1, (b) incubar a amostra com uma solução de extração, (c) isolar o DNA por métodos padrão; (d) aplicar PCR em tempo real usando para isso (i) iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como definida na reivindicação 1; e (ii) uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente marcada capaz de hibridizar especificamente com o referido lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente marcada capaz de hibridizar especificamente com a referida sequência IAC, (e) determinar qualitativa ou quantitativamente sinais fluorescentes gerados pela etapa (d), e (f) determinar ou calcular a partir da etapa (e) quanto à presença ou a quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amostra original com suspeita de estar contaminada com o referido micro-organismo Listeria monocytogenes.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que iniciadores usados na etapa (d) (i) são Lip1 (SEQ ID NO: 2) e Lip2 (SEQ ID NO: 3).

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as sondas fluorescentes marcadas usadas na etapa (d) (ii) são pLucLm4 (SEQ ID NO: 4) para detecção da sequência IAC, e LipProbe (SEQ ID NO: 5) para detecção do lócus prfA.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a solução de extração da etapa (b) compreende pelo menos MgCl2 e/ou um líquido iônico.

11. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende, em uma ou mais embalagens: (i) a Listeria monocytogenes geneticamente modificada como definida na reivindicação 1; (ii) os iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC da Listeria monocytogenes geneticamente modificada como definida na reivindicação 1; e (iii) uma sonda de oligonucleotídeo marcada fluorescente capaz de hibridizar especificamente com o referido lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo marcada fluorescente capaz de hibridizar especificamente com a referida sequência IAC.

12. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os iniciadores são Lip1 (SEQ ID NO: 2) e Lip2 (SEQ ID NO: 3).

13. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as sondas fluorescentes marcadas são pLucLm4 (SEQ ID NO: 4) para detectar a sequência IAC e LipProbe (SEQ ID NO: 5) para detectar o lócus prfA.

14. Método para fabricação de uma bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) deletar o lócus genômico do fator transcripcional PrfA de Listeria monocytogenes, (b) clonar um vetor compreendendo o referido IAC, (c) transformar o vetor da etapa (b) na cepa de Listeria monocytogenes d-PrfA da etapa (a).

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