CN106978381A - prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，缺失prfA基因，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2016521。本发明还提供了一种疫苗，含有上述基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。本发明还提供了一种抗体，由上述基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。本发明还提供了上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法。通过实验表明，prfA基因缺失后的菌株生长趋势与野生株并无明显差异。prfA基因缺失后的菌株inlA、inlB、inlC、actA、vip表达量均有明显下调；plcA、plcB表达量分别上升至原来的2.5和2倍，EGDe‑ΔprfA基因缺失株的侵袭能力明显下降。

Description

prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法
技术领域：
本发明属于生物学领域，涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌，具体来说是一种prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法。
背景技术：
李斯特菌属以低GC的DNA含量(38％)被划分为厚壁菌门，有鞭毛、不形成芽胞，是兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是李斯特菌属中唯一可以引起人类疾病的病原菌，它引起疾病的方式分为两种：一种是非侵入性的方式，在免疫功能正常的个体发展为发热性胃肠炎；另一种是侵入性的方式，在具有免疫缺陷的宿主例如老人或接受免疫抑制疗法的病人体内可以表现为败血症或脑膜脑炎，通过胎盘感染婴儿导致孕妇流产、死产。此外，Lm可诱发多种局灶性感染，例如心内膜炎、皮肤感染、关节感染、心肌炎和坏死性筋膜炎等。95％人类感染病例是由血清型1/2a、1/2b 和4b的Lm造成。Lm感染的食物被人类宿主摄入体内，通过肠腔吸收，穿过上皮细胞层传播到血液和肠系膜淋巴结，然后Lm到达肝脏和脾脏并在巨噬细胞和上皮细胞内进行繁殖，此外Lm可以进入树突状细胞从而逃离吞噬体在细胞间传播。
Lm对哺乳动物细胞表面的粘附是细胞感染周期的初始阶段，通过与宿主细胞受体结合激活细胞信号转导通路促进Lm对宿主细胞的侵袭。蛋白内化素A (internalin A，InlA)和内化素B(internalin B，InlB)是最先被确定参与到侵袭当中的两种蛋白，和宿主细胞的特异性受体结合并引导Lm被吞噬细胞吞噬后，细胞溶解素酶O(ListeriolysinO，LLO，由hly编码)在plcA和plcB 编码的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)和卵磷脂酶(PC-PLC)协助下裂解吞噬胞膜，帮助Lm逃离吞噬小体；Lm利用磷酸己糖(HP)在细胞浆中繁殖，HP的摄取是由hpt编码的6-磷酸葡萄糖转移酶Hpt完成，Hpt酶的缺失会导致Lm毒力受损和侵入小鼠能力下降，Hpt是第一个被确定参与细胞内病原菌增值的毒力因子；与此同时，actA基因编码的肌动蛋白A(actin assembly-inducing protein,ActA)诱导宿主细胞肌动蛋白纤丝聚合在细菌末端，推动细菌移动，进入新的细胞裂解繁殖。上述所有毒力基因的表达均受到PrfA蛋白全部或部分调控。hly、plcA、plcB、mpl、actA和prfA基因组成的基因簇是Lm入侵宿主的关键因素，它的转录表达依赖PrfA蛋白。
方春等将菌株EGDe和M7的prfA基因进行相互替换得到EGDe-prfAM7和 M7-prfAEGDe，发现较低致病性的M7携带的prfA基因替换到EGDe后，菌株的InlA、 InlB、LLO和ActA蛋白表达量上调，同时细胞的侵袭和粘附能力上升。除此之外，prfA基因的缺失也会导致细菌菌膜形成能力下降。PrfA对毒力基因的调控是一个复杂的机制，用EGDe-△prfA、EGDe-△inlA、EGDe-△inlB和EGDe-△hly(hly，编码LLO蛋白)几种毒力基因缺失株感染鸡胚胎，发现prfA基因缺失和hly基因缺失降低了EGDe的毒力，然而EGDe-△inlA和EGDe-△inlB两种基因缺失株对鸡胚胎的致死率与野生株相比并未下降，这证明了PrfA对EGDe毒力起到调控作用。
发明内容：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法，所述的这种prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法要解决现有技术中没有合适的单核细胞增生李斯特氏菌用于减毒疫苗的技术问题。
本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失prfA基因。
进一步的，所述的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为： CCTCCNO:M 2016521。
本发明还提供了一种疫苗，含有上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。
本发明还提供了一种抗体，由上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。
本发明还提供了上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，包括如下步骤：
1)挑取EGD-e单菌落过夜摇床培养，使用细菌基因组提取获得EGD-e基因组；
2)分别用引物A1/A2和A3/A4扩增prfA基因的上下游片段，引物A1的序列如SEQ INNO.1所示，引物A2的序列如SEQ IN NO.2所示，引物A3 的序列如SEQ IN NO.3所示，引物A4的序列如SEQ IN NO.4所示，上游片段的序列如SEQ IN NO.7所示，下游片段的序列如SEQIN NO.8所示，产物使用限制性内切酶XbaI单酶切处理；酶切产物使用T4DNA连接酶进行上下游同源臂连接；
3)将pMD19-T vector、上下游连接产物置于16℃金属浴30min，转入DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃90s热激，再冰浴1min；37℃摇床培养60min；离心弃上清，重悬，涂布含100μg/mL Amp的LB平板上，37℃培养；
4)将抗性平板上的单菌落挑下，于含100μg/mLAmp的LB培养基中摇床培养；取菌液使用引物A1/A4进行PCR鉴定上下游连接片段，电泳后将阳性克隆对应的菌液扩大培养抽提质粒；
5)以pKSV7和连有同源臂的pMD19-T载体为样本，使用SmaI和SalI两种内切酶，37℃水浴5～6h，电泳后分离产物并割胶回收；割胶回收后的产物使用T4DNA连接酶连接，然后导入DH5α感受态细胞中，涂布含 100μg/mLAmp的LB平板并鉴定；
6)将阳性克隆的质粒抽提后进行SmaI和SalI限制性内切酶双酶切，获得 prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌减毒菌株。
将上述的基因敲除单核细胞增生李斯特氏菌(prfA)，进行保藏，保藏号为： CCTCCNO:M 2016521；菌株名称：单核细胞增生李斯特氏菌EGD-e(prfA基因缺失)Listeriamonocytogenes EGD-e(prfA基因缺失)；保藏日期：2016年9 月26日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：中国武汉、武汉大学。
本发明是为了了解毒力调控基因prfA对EGDe菌株起到的作用，对食源性致病菌Lm致病机理研究提供重要材料和依据。首先使用温敏型穿梭质粒pKSV7运用同源重组技术构建单基因缺失菌株EGDe-△prfA，然后通过测定生长曲线、毒力基因表达、侵袭Caco-2细胞能力探究prfA基因缺失对EGDe毒力的影响。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。通过实验表明，prfA基因缺失后的菌株生长趋势与野生株并无明显差异。prfA基因缺失后的菌株inlA、inlB、 inlC、actA、vip表达量均有明显下调(p<0.05)；sigB基因的表达量无明显变化；plcA、plcB表达量分别上升至原来的2.5和2倍。同时，与EGDe侵袭能力相比，EGDe-ΔprfA基因缺失株的侵袭能力明显下降，EGDe-ΔprfA细菌侵袭数量仅为野生株1/5。
附图说明
图1显示了EGDe-ΔprfA的构建原理。
图2显示了上下游同源臂扩增结果。
图3显示了上下游同源臂连接结果。
图4显示了导入DH5α感受态细胞鉴定结果。
图5显示了pKSV7重组质粒鉴定结果。
图6显示了prfA基因缺失菌株的筛选结果。
图7显示了EGDe、EGDe-ΔprfA生长曲线。
图8显示了EGDe-ΔprfA毒力基因RealTime-PCR结果。
图9显示了各菌株菌落总数。
具体实施方式
各个实验采用的试剂盒用量如下：
反转录反应
1.基因组DNA的去除
2.反转录反应
RealTime-PCR反应
表1EGDe--△prfA构建及鉴定所需引物
实施例1
挑取EGD-e(ATCC BAA-679)单菌落过夜摇床培养，使用天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组提取试剂盒(No：DP302-02)获得EGD-e基因组，分别用引物A1/A2和A3/A4(表1)扩增prfA基因的上下游片段,上游片段(A1/A2，如SEQ IN NO.7所示)、下游片段(A3/A4，如SEQ IN NO.8所示)，产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收并测定浓度，以OD260/OD280判断纯度，割胶回收产物使用限制性内切酶XbaI单酶切处理，37℃水浴5～6h，电泳后割胶回收；酶切产物使用T4DNA连接酶16℃金属浴14～16h进行上下游同源臂连接，电泳并割胶回收。pMD19-T vector、上下游连接产物、solubionI置于16℃金属浴30min，转入DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃90s热激，再冰浴1min；加入890μL LB培养基37℃摇床培养60min；离心弃上清，剩余100μL重悬，涂布含100μg/mL Amp的LB平板上，37℃培养。将抗性平板上的单菌落挑下，于含100μg/mLAmp 的LB培养基中摇床培养；取菌液使用引物A1/A4进行PCR鉴定上下游连接片段，电泳后将阳性克隆对应的菌液扩大培养抽提质粒。
以pKSV7和连有同源臂的T载体为样本，使用SmaI和SalI两种内切酶， 37℃水浴5～6h，电泳后分离产物并割胶回收；割胶回收后的产物使用T4DNA连接酶16℃金属浴15～16h，后导入DH5α感受态细胞中，涂布含100μg/mLAmp 的LB平板并鉴定，方法同T载体；脱盐的质粒样本约20μL送测序并比对。电转化法将重组质粒Lm感受态细胞，电转条件为：电击杯加入8μL质粒和 200μLLm感受态细胞，电转场强2.5kV，时间4ms；电转后菌体移入3～5mLBHI中，37℃培养1～2h，离心弃上清重悬涂布于含10μg/mLCam BHI平板，30℃摇床培养48～72h。挑取平板中单菌落于含10μg/mLCam BHI培养基中培养41℃过夜，按1：100转接8～10次，一天两次仍在41℃下培养，末代细菌划线接种于含10μg/mLCam BHI平板，41℃过夜培养；挑取上述平板中的单菌落于BHI液体中培养，30℃过夜后按1∶100转接6～8次，一天两次在相同条件下培养；末代培养物划线BHI平板30℃培养，挑单菌落使用引物A1/A4和A5/A6PCR鉴定上下游连接片段和prfA基因片段，并将疑似株分别划线抗性和无抗性平板培养，抗性平板不生长、无抗性平板生长的为可疑突变株，扩增相应基因片段进行测序。缺失株EGDe-△prfA的构建如图1所示。
将上述的基因敲除单核细胞增生李斯特氏菌(prfA)，进行保藏，保藏号为： CCTCCNO:M 2016521；菌株名称：菌株名称：单核细胞增生李斯特氏菌EGD-e(prfA 基因缺失)Listeria monocytogenes EGD-e(prfA基因缺失)；保藏日期：2016 年9月26日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：中国武汉武汉大学。
实施例2
本发明对菌株的鉴定方法包括如下步骤：
分别使用A1/A2、A3/A4(表1)引物进行上下游同源臂的扩增，用限制性内切酶XbaI单酶切并连接上下游同源臂，连接T载体并导入DH5α感受态细胞中进行阳性克隆鉴定；以pKSV7和连有同源臂的T载体为样本，使用SmaI和SalI 两种内切酶构建重组质粒；使用A5/A6引物PCR鉴定prfA基因是否缺失(图6)，涂布无抗性平板对突变株进行鉴定，鉴定结果为阳性的菌株命名为EGDe-△prfA。
本发明菌株的鉴定结果如下：
1.prfA基因上下游同源臂的扩增
以EGDe基因组为模板扩增prfA基因的上下游同源臂，进行电泳后结果见图 2。上游同源臂626bp，下游同源臂636bp，M为DL1000bp Marker，扩增的片段与预期的片段大小相符且特异性良好无杂带。
2.prfA基因上下游同源臂的连接
上下游同源臂连接结果见图3。2、3泳道为上下游连接片段，大小为1262bp，由图可知prfA基因上下游同源臂均连接成功，M为500bp DNA Ladder Marker，图中1号泳道为阴性对照。
3.导入DH5α感受态细胞
上下游连接产物转入DH5α感受态细胞中鉴定结果见图4。图4为菌落PCR 鉴定，其中阳性片段大小1200bp左右，为筛选菌株，进行扩大培养并-80℃冻存。 M为500bp DNALadder Marker，图中1号泳道为阴性对照。
4.pKSV7重组质粒的构建
pKSV7重组质粒的鉴定结果见图5。泳道阳性片段在1200bp附近，表明prfA 上下游连接片段成功插入质粒pKSV7中。提取质粒送测序，比对结果显示序列相似度为100％，可以进行后续实验。
5.prfA基因缺失突变株的筛选与鉴定
电转后的菌体在一定条件下进行培养筛选，预期得到筛去质粒的目的菌株，挑取单菌落使用同源臂引物和目的基因引物进行PCR鉴定，鉴定结果见图6。同源臂引物A1/A4结合位点位于目的基因的外侧，即目的基因缺失后扩增产物应明显小于EGDe野生株为模板的阳性对照扩增产物；A5/A6位于目的基因内侧，目的基因缺失后无法扩增出相应片段，疑似菌株的电泳结果应为空白。
图6中，1号泳道为阴性对照，2号泳道为以EGDe基因组DNA作为模板的阳性对照，19号同源臂引物扩增产物比阳性对照片段小约1000bp左右，而用A5、 A6引物则未扩增出任何产物，说明19号泳道菌株可能为突变菌株。将疑似突变菌株扩大培养涂布抗性平板和无抗性平板，结果抗性平板无菌落生长，将产物进行测序结果表明prfA基因已经缺失，prfA基因缺失菌株构建完成，并命名为 EGDe-ΔprfA。
实施例3
本发明使用酶标仪测定12h内EGDe、EGDe-ΔprfA在OD600下的生长曲线，挑单菌落接种于BHI液体培养基中过夜培养，次日取1mL饱和菌液转接到100mL 新鲜BHI液体培养基中摇床培养，每隔1h取200μL菌液加入96孔板中测定OD600。
测定结果如下：prfA基因缺失后的菌株生长趋势与野生株并无明显差异(图 7)。
实施例4
本发明使用RT-PCR检测EGDe-ΔprfA菌株prfA、plcA、plcB、inlA、inlB、 inlC、actA、vip等多种毒力基因的表达情况，将提取的EGDe、EGDe-ΔprfA总 RNA反转录获得cDNA(反转录试剂盒中含有去除基因组DNA的相关试剂)、以cDNA 为模板进行SYBR Green荧光染料法RealTime-PCR，以EGDe的16s核糖体RNA 为内参基因，以2-△△Ct表示所有基因的表达量，即EGDe所有基因的表达量均为1， EGDe-ΔprfA的各基因表达量大于1的为表达上调，小于1的为表达下调。
检测结果为：以野生EGDe毒力基因的表达水平为1为基准，EGDe-ΔprfA 中的prfA基因几乎没有表达，说明基因缺失菌株构建成功；inlA、inlB、inlC、 actA、vip表达量均有明显下调(p<0.05)；sigB基因的表达量无明显变化；plcA、 plcB表达量分别上升至原来的2.5和2倍(图8)。
实施例5
本发明为考察prfA基因缺失后EGDe对人结肠癌腺细胞Caco-2的侵袭能力，将Caco-2细胞转移到12孔板中培养，显微镜观察生长至铺满孔板；挑取EGDe、突变株单菌落过夜培养，调菌至OD 0.3，菌数约108CFU/mL；孔板废液取出加入2mL非完全培养基，加100μL菌液，37℃培养箱4h；吸掉废液用生理盐水洗涤，加庆大霉素1mL/孔，放37℃培养箱30min；1％Triton室温处理30min，裂解后溶液取出放入1.5mL离心管振匀，稀释10倍涂BHI平板37℃培养并计数。
检测结果为：与EGDe侵袭能力相比，EGDe-ΔprfA基因缺失株的侵袭能力明显下降，EGDe-ΔprfA细菌侵袭数量仅为野生株1/5(图9)。
实施例6
本发明构建的prfA基因缺失菌株的inlA、inlB、actA等多种毒力基因表达情况明显下调，细胞侵袭实验表明缺失菌株的侵袭能力明显下降，细菌的毒性大大降低，安全性高，适合用作外源性抗原的载体。重组减毒李斯特菌载体疫苗能有效的刺激机体产生高水平的细胞免疫反应，抗原的提呈既有MHC Ⅰ类途径，又有MHC Ⅱ类途径，故可以同时诱导出CD4+和CD8+T细胞反应。使用本发明构建的 prfA基因缺失菌株静脉注射小鼠，7天后检测小鼠体内的IFN-γ和CD8+T细胞，结果显示IFN-γ量增加，CD8+T细胞数量大量增加。因此使用本发明构建的prfA 基因缺失菌株作为载体可以制备不同的Lm疫苗对相应免疫性疾病进行实验研究及进一步临床治疗。
序列表
<110> 上海理工大学
<120>prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法
<160> 8
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物A1
<400> 1
aatcccgggactcccagaactgacacgag 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物A2
<400> 2
atttctagagctgttgaaagaaagtcacgc 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物A3
<400> 3
atttctagacatgtcctgctacttgggga 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物A4
<400> 4
attgtcgacacttgatatgcatgcaccgc 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物A5
<400> 5
tgaacgctcaagcagaagaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物A6
<400> 6
caagcttcccgttaatcgaa 20
<210> 7
<211> 585
<212> DNA
<213> 上游片段A1/A2
<400> 7
caataaaatccctacattaaaagatgtccgcggaaaaatattattactttcagagaacca 60
cacaaaaaagccattagtcattaactcacgcaaattcggcatgcagttcggcgcacctaa 120
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attcctacaaaaaagggttagtatatctccgagcaacctcggaaccatatactaactcta 480
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tcaaaatttgtataataaaatcctatatgtaaaaaacatcattta 585
<210> 8
<211> 596
<212> DNA
<213> 下游片段A3/A4
<400> 8
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Claims (5)

1.一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失prfA基因。
2.根据权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：其保藏编号为：CCTCC NO:M 2016521。
3.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。
4.一种抗体，其特征在于：由权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。
5.权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)挑取EGD-e单菌落过夜摇床培养，使用细菌基因组提取获得EGD-e基因组；
2)分别用引物A1/A2和A3/A4扩增prfA基因的上下游片段，引物A1的序列如SEQ INNO.1所示，引物A2的序列如SEQ IN NO.2所示，引物A3的序列如SEQ IN NO.3所示，引物A4的序列如SEQ IN NO.4所示，上游片段的序列如SEQ IN NO.7所示，下游片段的序列如SEQ INNO.8所示，产物使用限制性内切酶XbaI单酶切处理；酶切产物使用T4DNA连接酶进行上下游同源臂连接；
3)将pMD19-T vector、上下游连接产物置于16℃金属浴30min，转入DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃90s热激，再冰浴1min；37℃摇床培养60min；离心弃上清，重悬，涂布含100μg/mL Amp的LB平板上，37℃培养；
4)将抗性平板上的单菌落挑下，于含100μg/mLAmp的LB培养基中摇床培养；取菌液使用引物A1/A4进行PCR鉴定上下游连接片段，电泳后将阳性克隆对应的菌液扩大培养抽提质粒；
5)以pKSV7和连有同源臂的pMD19-T载体为样本，使用SmaI和SalI两种内切酶，37℃水浴5～6h，电泳后分离产物并割胶回收；割胶回收后的产物使用T4DNA连接酶连接，然后导入DH5α感受态细胞中，涂布含100μg/mLAmp的LB平板并鉴定；
6)将阳性克隆的质粒抽提后进行SmaI和SalI限制性内切酶双酶切，获得prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌减毒菌株。
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