CN113969321B - 用于lamp检测牛结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents
用于lamp检测牛结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物，试剂盒及其应用。本申请提供的环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的组合物及其试剂盒可用于LAMP检测和数字LAMP检测中，可定性或定量检测样品中的牛结核分枝杆菌，具有高特异性、高灵敏度、耐核酸扩增抑制剂等优点，能够实现对样品中低浓度牛结核分枝杆菌的绝对定量，对于牛结核病的防控和流行病学的研究具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本申请属于人畜共患病原菌检测领域，具体地，涉及一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物、试剂盒，以及基于LAMP和数字LAMP检测方法检测样品中牛结核分枝杆菌的应用。
背景技术
牛结核分枝杆菌属于结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)，牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是引起牛结核病的病原菌。牛结核病是一种人畜共患的传染病，世界动物卫生组织(Office international desépizooties，OIE)将其列为必须通报的疫病，在我国属二类动物传染病，该病可以通过病畜传染给人类或其他动物，其在畜间主要易感染奶牛和役用牛，会引起役牛消瘦无力，甚至因心力衰竭而死亡；奶牛的产奶量下降且产出的牛奶中也含有病原菌。人结核病多发生于青壮年，特别是饮食营养差且从事繁重体力和脑力劳动的人感染此病的几率更高。患者会出现抵抗力下降、身体消瘦、呼吸困难、咯血等症状，严重时会引起死亡。根据目前的研究，牛结核病感染人类一般发生在食用不经巴氏消毒的牛奶制品的特殊人群以及经常接触畜牧业的人群中。
牛结核分枝杆菌的检测方法主要包括细菌学检验、免疫学检验、分子生物学检验等方法。由于在细菌学检验中牛分枝杆菌的体外培养对营养要求苛刻，且生长缓慢，常规方法对其分离时操作复杂，耗时长，且危险性高、分离的成功率不高；而在免疫学检验中又容易出现假阳性，灵敏度不高，因此这两种方法均不能满足快速、准确检疫的要求。较之以上两种常规检疫方法，分子生物学检验方法具有特异性好、简单快速等优点。常规的分子生物学检验方法有聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，实时荧光定量核酸扩增反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)，以及环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)。qPCR，和LAMP方法较PCR方法灵敏度高，特异性好，因此在低浓度的病原菌检测上更有优势。在过去20年中，qPCR已经成为许多病原微生物核酸诊断和定量检测的标准。尽管如此，qPCR仍有其不可忽视的局限性。阈值(Ct)的设定不可避免地引入了人为主观因素，且绝对定量依赖于标准曲线，但标准样品与实验样品的来源不同，扩增效率也不同，导致标准曲线的准确度不够。因此，即便是使用相同商品化的试剂盒以及实验流程，不同实验室之间得出的结论可能会相差很大，尤其是当起始模板量较低时，较低的阳性信号与背景信号不易区分，使qPCR的精确度降低。因此，qPCR技术的准确性与重复性仍然不能很好地满足分子生物学定量分析的要求。qPCR的局限性在于高通量的样品分析较为困难，花费大而且有一定的时间约束。
LAMP技术已在核酸的科学研究、疾病诊断和动物胚胎性别的鉴定等领域得到了广泛的应用。它的优点有以下几点：一是高效性。反应时间<1h，能检测几个拷贝的靶标序列；二是终点检测便捷。主要通过人眼识别颜色的变化即可。三是特异性强：两对引物识别靶标序列的六个区域，不受非靶标序列的影响，不受其他杂质的干扰。四是，设备简单：反应恒温在60～65℃之间，只需要一个恒温装置即可。数字LAMP，是基于LAMP的反应原理结合微液滴生成的装置，将反应体系分割成多个微液滴，从而精确地对样品中提取的核酸进行绝对定量检测。其原理是在有限稀释模式下，使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中，每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个DNA模板分子，模板分子的分散符合泊松分布。在数字LAMP中，扩增结束后有荧光信号单元记为1，无荧光信号则记为0，即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式即可计算出DNA模板分子的起始浓度。与传统的qPCR相比，数字LAMP提供的核酸绝对定量方法能有效避免信号域值设定而引入的人为因素，也无需制作标准曲线，因而在分析过程中更具优势。另外，当一个混合样品中目标分子的拷贝数很低而背景核酸分子拷贝数很高时，利用qPCR很难对目标分子进行定量。数字LAMP能够将稀有目标模板分子分配到独立的微单元中，而背景分子也被有效隔离到其它单元中，提高了稀有目标分子的起始扩增浓度，避免了其在扩增中受到竞争抑制，从而增加检测的灵敏度。此外，数字LAMP还能有效降低PCR抑制剂或者样品中存在的抑制剂对扩增的影响，所以这对于在环境样品中低浓度核酸或者病原菌的检测具有很大的优势。
因此，急需开发一种适合用于LAMP检测或者数字LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物。
发明内容
本申请的技术问题是，用细菌学和免疫学检测牛结核分枝杆菌存在检测灵敏度低、容易出现假阳性等问题。而用PCR和qPCR的分子学检测牛结核分枝杆菌，虽然解决了灵敏度低，特异性低等问题，但是仍然存在检测结果容易受核酸扩增抑制剂影响，阈值(Ct)的设定引入了人为因素，绝对定量依赖于标准曲线，起始模板量较低时准确性与重复性不好，不能进行高通量绝对定量检测的局限。针对现有技术中存在的问题，本申请提供了一种用于环介导等温扩增(LAMP)或者数字LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物，包含该组合物的试剂盒，及其在LAMP和数字LAMP检测中的应用。
具体来说，本申请涉及以下内容：
1.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述mpb70基因序列如SEQ ID No.8所示，SEQ ID No.8：ATGAAGGTAAAGAACACAATTGCGGCAACCAGTTTCGCGGCGGCCGGCCTGGCGGCTCTGGCGGTGGCTGTCTCACCGCCGGCGGCCGCAGGCGATCTGGTGGGCCCGGGCTGCGCGGAATACGCGGCAGCCAATCCCACTGGGCCGGCCTCGGTGCAGGGAATGTCGCAGGACCCGGTCGCGGTGGCGGCCTCGAACAATCCGGAGTTGACAACGCTGACGGCTGCACTGTCGGGCCAGCTCAATCCGCAAGTAAACCTGGTGGACACCCTCAACAGCGGTCAGTACACGGTGTTCGCACCGACCAACGCGGCATTTAGCAAGCTGCCGGCATCCACGATCGACGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGGTGTACATGATTGACAGCGTGCTAATGCCTCCGGCGTAA；
所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
2.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；
其中，所述靶区域为SEQ ID No.9:CGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGT；
所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
3.根据项1或2所述的组合物，其特征在于，所述引物为以下引物组合物中的一种或两种以上：
1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；
2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；
3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。
4.根据项1或2所述的组合物，其特征在于，所述探针为以下探针组合物：
探针FIP,其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，
探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。
5.根据项4所述的组合物，其特征在于，所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。
6.根据项5所述的组合物，其中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
7.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的引物组合物，其包含：
引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示。
8.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的引物组合物，其包含：
引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示。
9.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的引物组合物，其包含：
引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。
10.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的引物组合物，其包含：
1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；
和
2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCT-CGTTACCGACCTTGAGGC所示；
和/或
3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。
11.一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的探针组合物，其包含：
探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，
探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。
12.根据项11所述的探针组合物，其中，所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。
13.根据项12所述的探针组合物，其中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
14.一种核酸组合物，所述组合物包含如项7-10中任一项所述的引物组合物和如项11-13中任一项所述的探针组合物。
15.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的基因芯片，所述芯片包括如项7-10中任一项所述的引物组合物和如项11-13中任一项所述的探针组合物。
16.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的基因芯片，所述芯片包括如项7-10中任一项所述的引物组合物和荧光染料。
17.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，其包括如项15所述的基因芯片。
18.如项17所述的试剂盒，其中，所述探针FIP:Fd在进行PCR反应时的终浓度为0.2-1μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的终浓度为0.1-0.5μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM。
19.如项17或18所述的试剂盒，其还包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20、dNTPs、甜菜碱、牛血清白蛋白、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照，和/或液滴发生油。
20.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，其包括如项16所述的基因芯片。
21.如项20所述的试剂盒，其中，所述荧光染料的浓度为10-50μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的浓度为0.1-0.5μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM。
22.如项20或21所述的试剂盒，其还包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20、dNTPs、MnCl2、甜菜碱、牛血清白蛋白、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照，和/或液滴发生油。
23.如项7-10中任一项所述的组合物和项11-13中任一项所述的组合物，或如项7-10中任一项所述的组合物和荧光染料在制备用于检测牛结核分枝杆菌的试剂盒中的用途。
24.一种检测牛结核分枝杆菌的方法，其包括：
1)取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；
2)对该样本进行DNA提取；
3)使用包括引物组合物和连接有荧光报告基团或荧光猝灭基团的探针组合物的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；
4)通过所述荧光报告基团被激发出的荧光的结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌；
或
1)取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；
2)对该样本进行DNA提取；
3)使用包括引物组合物和荧光染料的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；
4)通过所述荧光染料的显色结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌。
25.根据项24所述的方法，
其中，所述引物组合物包含：
1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1：CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2：ACACCCCACCACAGACG所示；
和
2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；
和/或
3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB；其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。
26.根据项24或25所述的方法，
其中，所述探针组合物包含：
探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，
探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。
27.根据项26所述的方法，其中，所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。
28.根据项27所述的方法，其中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
29.根据项24-28中任一项所述的方法，其中所述扩增的温度为52-68℃，优选为66℃。
30.根据项24-28中任一项所述的方法，其中所述扩增的时间为30-70min，优选为60min。
31.根据项1至6中任一项所述的组合物在制备用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的试剂盒中的用途。
本申请的用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物解决了现有技术中存在的问题，其优点在于：1)相较于传统方法和现有技术，具有高特异性、低检测限和高精确度的特点；2)在数字LAMP检测中，能实现对低浓度牛结核分枝杆菌的绝对定量；3)在LAMP检测中，只需在恒温装置中进行，对设备的温控准确度要求低。
附图说明
图1为反应中不添加环引物时，数字LAMP对牛结核分枝杆菌基因组DNA扩增的结果。(a)数字LAMP对牛结核分枝杆菌核酸扩增60分钟后的液滴阵列的荧光图；(b)数字LAMP对牛结核分枝杆菌核酸扩增90分钟后的液滴阵列的荧光图；(c)数字LAMP对牛结核分枝杆菌核酸扩增2小时后的液滴阵列的荧光图；(d)图c中虚线对应的阳性液滴和阴性液滴的荧光信号值。图片标尺为200μm。
图2为FIP:Fd复合探针含量的增加对数字LAMP扩增效率的影响。(a)LAMP探针的设计原理；(b)探针FIP:Fd与引物FIP不同浓度的比例对扩增效率的影响；(c)探针FIP:Fd与引物FIP在不同浓度的比例下液滴阵列扩增后的荧光图。图片标尺为200μm。
图3为牛结核分枝杆菌的特异性检测。(a)qPCR和(b)数字LAMP对黏液分枝杆菌,戈登氏分枝杆菌，拟分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，黄分枝杆菌，大肠杆菌，李斯忒氏菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，牛结核分枝杆菌基因组DNA检测的结果。液滴阵列图的标尺为200μm。
图4为利用数字LAMP扩增牛结核分枝杆菌基因组DNA的结果及检测灵敏度。(a)牛结核分枝杆菌核酸扩增后的液滴阵列的荧光图；(b)图a中虚线对应的阳性液滴和阴性液滴的荧光信号值；(c)阴性对照(无牛结核分枝杆菌基因组)扩增后的液滴阵列的荧光图。图片标尺为200μm。(d)数字LAMP对牛结核分枝杆菌核酸的检测灵敏度。
图5为不同扩增温度对数字LAMP扩增效率的影响。(a)不同扩增温度下液滴阵列的荧光图，标尺为200μm；(b)数字LAMP对牛结核分枝杆菌核酸的定量检测结果(加入反应中的核酸模板浓度为250拷贝/μL)。
图6为不同扩增时间对数字LAMP扩增效率的影响。(a)不同扩增时间下液滴阵列的荧光分布图及液滴阵列的荧光图，标尺为200μm。(b)数字LAMP对牛结核分枝杆菌核酸的定量检测结果(加入反应中的核酸模板浓度为280拷贝/μL)。
图7为数字LAMP和qPCR对牛奶中抑制剂耐受程度的评价。(a)数字LAMP反应中加入不同浓度的牛奶扩增后的液滴阵列荧光图像；(b)qPCR反应中加入不同浓度的牛奶后的扩增曲线；(c)牛奶对数字LAMP和qPCR扩增效率的抑制程度。
图8为评价数字LAMP和qPCR这两种方法对牛奶和生理盐水样品中牛结核分枝杆菌定量检测的结果。(a)随着牛奶和生理盐水样品中BCG菌株浓度的增加，数字LAMP反应后的液滴阵列荧光成像图；(b)数字LAMP和qPCR对牛奶和生理盐水样品中牛结核分枝杆菌定量检测结果的比较。*代表qPCR的检测结果不可靠，因为Cq检测值高于阴性对照。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施例。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
使用标准命名法来描述化合物。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本申请中使用的术语本申请，“环介导等温扩增(LAMP)”是指一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在Bst DNA聚合酶(Bacillusstearothermophilus DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增。
在本申请中使用的术语“数字定量环介导等温扩增(数字LAMP)”是指在微液滴中进行基于环介导等温扩增技术的基因扩增，该方法采用微液滴生成装置将大体积反应体系分割为纳升级反应微室，从而实现对反应中目的片段或目的基因的绝对定量。
在本申请中使用的术语“牛结核分枝杆菌”是指一种人畜共患的病原菌，其属于结核分枝杆菌复合群。
靶区域是指基因的靶区域，又称为靶基因，即目的基因。在分子遗传中，它不仅要具有识别结合功能，还应该具有与位点结合后能表达所需要的相应功能的作用。
核酸是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用。
引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂(如同位素、酶或有色基团)进行标记；在适当的pH值、温度和离子强度下，DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。
本申请所使用的术语“引物组合物”指在对目标基因进行扩增时所使用的一对引物。“探针组合物”指在对目标基因进行扩增时所使用的一对探针。
本申请所使用的术语“引物探针组合物”指一种或两种以上的本申请所述的引物组合物和本申请所述的探针组合物组合而成的物质。
本申请所使用的术语“引物荧光染料组合物”指一种或两种以上的本申请所述的引物组合物和本申请所述的荧光染料组合而成的物质。
一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述mpb70基因序列如SEQ ID No.8所示，SEQ ID No.8：ATGAAGGTAAAGAACACAATTGCGGCAACCAGTTTCGCGGCGGCCGGCCTGGCGGCTCTGGCGGTGGCTGTCTCACCGCCGGCGGCCGCAGGCGATCTGGTGGGCCCGGGCTGCGCGGAATACGCGGCAGCCAATCCCACTGGGCCGGCCTCGGTGCAGGGAATGTCGCAGGACCCGGTCGCGGTGGCGGCCTCGAACAATCCGGAGTTGACAACGCTGACGGCTGCACTGTCGGGCCAGCTCAATCCGCAAGTAAACCTGGTGGACACCCTCAACAGCGGTCAGTACACGGTGTTCGCACCGACCAACGCGGCATTTAGCAAGCTGCCGGCATCCACGATCGACGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGGTGTACATGATTGACAGCGTGCTAATGCCTCCGGCGTAA；所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
在本申请的一个具体实施方式中，所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示，和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
另一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述靶区域为SEQ ID No.9:CGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGT；所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
在本申请的一个具体实施方式中，所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示，和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
另一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的引物组合物。
在本申请的一个具体实施方式中，所述引物组合物包含：1)引物F3，其序列如SEQID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示。
在本申请的一个具体实施方式中，所述引物组合物包含：1)引物F3，其序列如SEQID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。
另一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的探针组合物。
在本申请的一个具体实施方式中，所述探针组合物包含探针FIP，其序列如SEQ IDNO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
另一方面，本申请提供了一种核酸组合物。
在本申请的一个具体实施方式中，所述核酸组合物包含：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCT-CGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述核酸组合物包含：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
另一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的基因芯片。
在本申请的一个具体实施方式中，所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ IDNO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ IDNO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ IDNO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，荧光染料。
在本申请的一个具体实施方式中，所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ IDNO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，荧光染料。
另一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的试剂盒。
在本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒包含基因芯片。所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ IDNO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。所述探针FIP:Fd在进行PCR反应时的终浓度为0.2-1μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的终浓度为0.1-0.5μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM。
在本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒包含基因芯片。所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ IDNO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCT-CGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ IDNO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述探针FIP:Fd在进行PCR反应时的终浓度为0.2-1μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的终浓度为0.1-0.5μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM。
在上述具体实施方式中，所述试剂盒包括A、C、D溶液，或包括A、B、C、D溶液，且它们均分别独立包装。溶液A：引物FIP和BIP各1.6μM，F3和B3各0.2μM，LF和LB各0.8μM；Tris-HCl为10-50mM、KCl为20-100mM、(NH4)2SO4为5-20mM、MgSO4为4-10mM、Tween-20为0.05-0.2％、dNTPs为1-4mM、甜菜碱为0.2-1M、牛血清白蛋白为0.5-5mg/mL、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶为0.1-1U/μL。溶液B：液滴发生油。溶液C：阴性对照为RNase Free ddH2O。溶液D：制备方法如下：包含mpb70基因的T克隆载体质粒(pEAST-T3-mpb70)，将该质粒使用RNase FreeddH2O进行梯度稀释，使得质粒浓度均为1000拷贝/微升。
在上述具体实施方式中，所述荧光染料选自钙黄绿素、Syto9、Eva Green、SYBRGreen中的一种。环介导等温扩增法包括：LAMP和数字LAMP。
在本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒包含基因芯片。所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ IDNO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，荧光染料。所述荧光染料的浓度为10-50μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的浓度为0.1-0.5μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM。
在本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒包含基因芯片。所述基因芯片包括：所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ IDNO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ IDNO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，荧光染料。所述荧光染料的浓度为10-50μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的浓度为0.1-0.5μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM。
在上述具体实施方式中，所述试剂盒包括A、C、D溶液，或包括A、B、C、D溶液，且它们均分别独立包装。溶液A：引物FIP和BIP各1.6μM，F3和B3各0.2μM，LF和LB各0.8μM；Tris-HCl为10-50mM、KCl为20-100mM、(NH4)2SO4为5-20mM、MgSO4为4-10mM、Tween-20为0.05-0.2％、dNTPs为1-4mM、MnCl2为0.2-1mM、甜菜碱为0.2-1M、牛血清白蛋白为0.5-5mg/mL、Bst2.0WarmStart DNA聚合酶为0.1-1U/μL。溶液B：液滴发生油。溶液C：阴性对照为RNase FreeddH2O。溶液D：制备方法如下：包含mpb70基因的T克隆载体质粒(pEAST-T3-mpb70)，将该质粒使用RNase Free ddH2O进行梯度稀释，使得质粒浓度均为1000拷贝/微升。
在上述具体实施方式中，所述荧光染料选自钙黄绿素、Syto9、Eva Green、SYBRGreen中的一种。环介导等温扩增法包括：LAMP和数字LAMP。
另一方面，本申请提供了一种检测牛结核分枝杆菌的方法。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法包括：1)取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；2)对该样本进行DNA提取；3)使用包括引物组合物和连接有荧光报告基团或荧光猝灭基团的探针组合物的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；4)通过所述荧光报告基团被激发出的荧光的结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌。所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ IDNO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法包括：1)取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；2)对该样本进行DNA提取；3)使用包括引物组合物和连接有荧光报告基团或荧光猝灭基团的探针组合物的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；4)通过所述荧光报告基团被激发出的荧光的结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌。所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCT-CGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，探针组合物，其包含：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法包括：1)取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；2)对该样本进行DNA提取；3)使用包括引物组合物和荧光染料的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；4)通过所述荧光染料的显色结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌。所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；以及，荧光染料。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法包括：1)取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；2)对该样本进行DNA提取；3)使用包括引物组合物和荧光染料的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；4)通过所述荧光染料的显色结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌。所述引物组合物，其包含：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ IDNO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；以及，荧光染料。
在上述具体实施方式中，所述所述扩增的温度为52-68℃，例如，52、53、54、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68℃，优选为66℃。所述扩增的时间为30-70min，例如，30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70min，优选为60min。
在上述具体实施方式中，所述样本为待测病原菌牛结核分枝杆菌，或者疑似有牛结核分枝杆菌的反刍动物组织、唾液、尿液、粪便等，或疑似有牛结核分枝杆菌的水源，土壤，牛奶样品等。
在上述具体实施方式中，具体检测步骤如下：(1)提取待测样本的总DNA，将总DNA或其稀释液作为DNA模板；(2)取无菌PCR管，加入23μL的溶液A，加入2μL的DNA模板溶液。用2μL溶液D代替DNA模板溶液作为阴性对照处理。用2μL溶液C代替DNA模板溶液作为阳性对照处理；(3)如果要进行数字定量检测，可以将上述配置好的混合溶液制备成为微液滴，具体步骤为：取无菌的96孔板，每个孔加入400μL的溶液B，然后将步骤2配制的体系加入到液滴生成装置的PTFE管中，设置好参数(振动频率50HZ；流速50nL/s；注入体积为2.5μL)后生成液滴；(4)将配置反应的PCR管或者生成完液滴的96孔板放到恒温仪中，设置程序：66℃，1h；(5)将步骤4扩增完的反应在日光下进行目视检测或者将扩增的液滴置于荧光倒置显微镜下进行检测。
另一方面，本申请提供了一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的组合物在制备用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的试剂盒中的用途。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述mpb70基因序列如SEQ ID No.8所示，SEQ ID No.8：ATGAAGGTAAAGAACACAATTGCGGCAACCAGTTTCGCGGCGGCCGGCCTGGCGGCTCTGGCGGTGGCTGTCTCACCGCCGGCGGCCGCAGGCGATCTGGTGGGCCCGGGCTGCGCGGAATACGCGGCAGCCAATCCCACTGGGCCGGCCTCGGTGCAGGGAATGTCGCAGGACCCGGTCGCGGTGGCGGCCTCGAACAATCCGGAGTTGACAACGCTGACGGCTGCACTGTCGGGCCAGCTCAATCCGCAAGTAAACCTGGTGGACACCCTCAACAGCGGTCAGTACACGGTGTTCGCACCGACCAACGCGGCATTTAGCAAGCTGCCGGCATCCACGATCGACGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGGTGTACATGATTGACAGCGTGCTAATGCCTCCGGCGTAA；所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和2)引物FIP，其序列如SEQ IDNO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ IDNO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述mpb70基因序列如SEQ ID No.8所示，SEQ ID No.8：ATGAAGGTAAAGAACACAATTGCGGCAACCAGTTTCGCGGCGGCCGGCCTGGCGGCTCTGGCGGTGGCTGTCTCACCGCCGGCGGCCGCAGGCGATCTGGTGGGCCCGGGCTGCGCGGAATACGCGGCAGCCAATCCCACTGGGCCGGCCTCGGTGCAGGGAATGTCGCAGGACCCGGTCGCGGTGGCGGCCTCGAACAATCCGGAGTTGACAACGCTGACGGCTGCACTGTCGGGCCAGCTCAATCCGCAAGTAAACCTGGTGGACACCCTCAACAGCGGTCAGTACACGGTGTTCGCACCGACCAACGCGGCATTTAGCAAGCTGCCGGCATCCACGATCGACGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGGTGTACATGATTGACAGCGTGCTAATGCCTCCGGCGTAA；所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ IDNO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示，和，3)引物LF，其序列如SEQ IDNO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述靶区域为SEQ ID No.9:CGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGT；所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述靶区域为SEQ ID No.9:CGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGT；所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。所述引物为以下引物组合物为：1)引物F3，其序列如SEQ ID NO.1:CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO.2:ACACCCCACCACAGACG所示；和，2)引物FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO.4:TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示，和，3)引物LF，其序列如SEQ ID NO.5:CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO.6:ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示。所述探针为以下探针组合物：探针FIP，其序列如SEQ ID NO.3:ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，探针Fd，其序列如SEQ ID NO.7:AAACCAGCCCGGCCAACGT所示。所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
在上述具体实施方式中，所述探针FIP和Fd经退火过程相结合，作为复合探针使用。
在上述具体实施方式中，所述荧光报告基团为FAM，例如包括但不限于：AMCA、TET、JCE、HEX、VIC、CY3、NED、Rhodamine Green、Rhodamine Red、TAMRA、TAMRA(AMIDITE,FORSTR)、PET、Texas Red-X、ROX、CY5。所述荧光猝灭基团为BHQ1、MGB，例如包括但不限于：BHQ2、BHQ3、QSY7、DABCYL、TAMRA。
在上述具体实施方式中，所用恒温加热装置为PCR扩增仪(杭州柏恒公司)。
在上述具体实施方式中，可以使用多种本领域已知的制备数字LAMP微滴的方法，包括但不限于XiE界面打印生成液滴装置。
在上述具体实施方式中，用于观察数字LAMP微液滴终点荧光强度的荧光成像装置为设置有CCD的荧光倒置显微镜(Eclipse Ti，Nikon，Tokyo，Japan)。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方式进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购而获得的常规产品。
下述实施例中的定量检测均设置三次重复检测，结果取平均值，误差取标准误差。
下述实施例涉及的各种材料如下：
1)模板、引物和探针
利用Minibest基因组DNA提取试剂盒(ver 3.0，TakaRa，Japan)提取以下菌种的总DNA：牛结核分枝杆菌(Mycolicibacterium bovis)BCG菌株Pasteur 1173P2、黏液分枝杆菌(Mycolicibacterium mucogenicum)ATCC 49650、戈登氏分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)DSM 44160、拟分枝杆菌(Mycobacterium paraense)IEC26(T)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478、黄分枝杆菌(Mycobacterium lentiflavum)ATCC51985、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 ATCC 43895、李斯忒氏菌(Listeriamonocytogenes)S3、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)RN4220、沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC 39184(T)。
利用Primer Explorer第4版进行LAMP检测中使用的引物的设计和筛选，扩增的特异性保守序列为mpb70基因(牛结核分枝杆菌保守基因)的一段序列(GenBank登录号:EU683971)，引物由中国上海博尚生物技术有限公司合成，其序列如表1所示：
表1
根据与引物FIP的5’端上游的序列：SEQ ID NO.10:ACGTTGGCCGGGCTGGTTT反向互补设计探针Fd，探针由中国上海博尚生物技术有限公司合成，其序列如表2所示，探针FIP的5’末端标记荧光基团FAM，探针Fd的3’末端标记荧光猝灭基团BHQ1，荧光基团FAM在蓝光激发下为绿色荧光。
表2
2)试剂
Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、dNTPs、牛血清白蛋白、SsoFast Evagreen Supermix、10x ThermoPol buffer均购自纽英伦生物技术公司(New England Biolabs，Ipswich，MA，US)；氨苄青霉素、甜菜碱、MgSO4、钙黄绿素、MnCl2、RNase Free ddH2O、LB固体培养基、LB液体培养基均购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO,US)。2x Taq Master PCR mix购自北京康为世纪生物科技有限公司。Ex-DNA结核分枝杆菌核酸提取试剂盒购自西安天隆公司。EasyPure快速凝胶提取试剂盒、pEASY-T1简单克隆试剂盒和Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞均购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司。Plasmid Mini试剂盒购自OmegaBio-tek公司(Omega Bio-tek,Inc，GA，US)
实施例1牛结核分枝杆菌mpb70基因标准质粒pEASY-T1-mpb70的建立
1)Mpb70基因的克隆：20μL体系包含10μL的2x Taq Master PCR mix；0.5μL的Mpb70-F3(10μM)；0.5μL的Mpb70-B3(10μM)；2μL的牛结核分枝杆菌DNA；7μL灭菌双蒸水。PCR反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；最后72℃延伸10min。PCR结束后，取PCR反应产物5μL于0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
2)PCR扩增产物的胶回收：将跑胶后的目的条带切胶后，按照胶回收试剂盒EasyPure快速凝胶提取试剂盒的说明书进行目的片段的纯化回收。
3)T载体的连接：按照pEASY-T1简单克隆试剂盒的试剂盒说明书，将目的片段与pEASY-T1载体进行连接反应。
4)转化：将连接有目的片段的T载体转化到Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞中，并涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上进行培养(37℃的条件下培养12～14h)。
5)重组质粒的筛选：将旁边无卫星菌落的白色的单克隆挑出，并接种于含氨苄青霉素(0.05mg/mL)的5mL LB液体培养基中，37℃培养12个小时。
6)质粒的提取：按照Plasmid Mini试剂盒的试剂盒说明书进行质粒的提取。
7)标准质粒的定量：通过测序分析鉴定的质粒的浓度通过Qubit 3.0荧光计(Thermo Scientific,Waltham,WA)测得，然后将高浓度的pEASY-T1-mpb70质粒进行10倍梯度稀释，用于qPCR标准曲线的构建以及以下实施例中的定量检测实验。
实施例2.在数字LAMP中，用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物定量地检测牛结核分枝杆菌的可行性
配置25μL数字LAMP反应液，其包含：20mM Tris-HCl；50mM KCl；10mM(NH4)2SO4；8mMMgSO4；0.1％Tween-20；1.4mM dNTPs；0.5mM MnCl2；0.6M甜菜碱；2mg/mL牛血清白蛋白；0.32U/μL Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶；25μM钙黄绿素；用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物：引物FIP和引物BIP各1.6μM，引物F3和引物B3各0.2μM；模板为1μL牛结核分枝杆菌的总DNA，余量为ddH2O。阴性对照以去离子水代替模板加入反应中，每组实验设置3次重复检测，来验证方法的可重复性。
数字LAMP反应过程：将特氟龙(Teflon)软管连接于第一微量进样器(50μL)的出口端，向所述特氟龙软管中吸取一定体积的反应液，使反应液充满所述特氟龙软管，将上述特氟龙软管的两端分别与石英毛细管的一端和已充满驱动液体(如矿物油)的第二微量进样器(50μL)的出口端连接，将所述第二微量进样器固定设置于微量注射泵，连接有石英毛细管的特氟龙软管的一端固定设置于振动装置，且所述石英毛细管的轴线垂直于其下方水平设置的96孔板，所述孔板盛有含3％EM 90的矿物油，所述石英毛细管下端开口与所述矿物油的液面的距离为1-2mm，设置DG4162函数发生器的振动的频率为50Hz，微量注射泵的流速为50nL/s，所述振动装置带动所述石英毛细管下端开口在矿物油液面上和液面下进行加速度变化的周期性往复运动，利用界面张力和界面拖拽力，泵出石英毛细管下端开口的反应液变会形成微液滴，沉降并平铺在96孔板底部。
数字LAMP的反应程序为66℃恒温，1h，其反应结果如图1所示：采用上述的组合物，数字LAMP反应后产生阳性微液滴和阴性微液滴，其中，阳性微液滴荧光信号(即荧光强度)是阴性微液滴荧光信号的2倍以上；同时，阴性对照组(无牛结核分枝杆菌DNA)均为阴性液滴。随着扩增时间延长，阳性液滴数增加，阳性液滴数至2h后无增加。上述引物组合物可用于检测牛结核分枝杆菌。
实施例3.在数字LAMP中，用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物定量地检测牛结核分枝杆菌的可行性
探针的制备：将50μM的FIP和50μM的Fd混合在一起，经过98℃，20s的升温变性后将其放到室温中进行缓慢冷却，使得两者退火结合到一起作为复合探针使用。
配置25μL数字LAMP反应液，其包含：2.5μL 10x ThermoPol缓冲液；用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物：引物BIP 1.6μM，引物F3和引物B3各0.2μM，引物LF和引物LB各0.8μM；1.6μM的不同浓度比例的FIP：Fd探针与FIP引物(浓度比例为：0、20、40、50、60、80、100)；探针的荧光报告基团为FAM；荧光猝灭基团为BHQ1；0.32U/μL Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶；1.4mM dNTPs；0.6M甜菜碱；6mM MgSO4；2mg/mL牛血清白蛋白；模板为2μL标准化的质粒pEASY-T1-mpb70，余量用水补齐。阴性对照以去离子水代替模板加入反应中，每组实验设置3次重复检测，来验证方法的可重复性。配置好的反应置于66℃恒温，扩增1个小时。
根据LAMP探针的设计原理(如图2a所示)，我们针对牛结核分枝杆菌的保守基因mpb70设计了相应的LAMP引物和探针，并探索了反应中FIP:Fd探针与FIP引物不同比例对扩增效率的影响。探针的浓度比例越大，液滴阵列中液滴的荧光信号越强(如图2c所示)，其中当反应中加入的探针比例为0时，检测的拷贝数是为原始拷贝数，液滴的荧光信号为钙黄绿素被激发的绿色荧光信号。当反应中FIP:Fd探针与FIP引物的比例增大时，数字LAMP的扩增效率降低(如图2b所示)。这种抑制现象很可能是因为在LAMP扩增的起始阶段，FIP更容易和模板结合使得模板得到快速地扩增。当处于扩增的对数期时，模板才会快速地和FIP:Fd探针结合，通过链置换产生荧光。因此，在相同扩增时间内，当探针的量越少，数字LAMP的扩增效率越高，但是产生的荧光信号就越微弱。同理，当探针的量越多，液滴阵列的终点荧光信号就越强，但是数字LAMP的扩增效率越低。综合以上的结果，在LAMP反应中加入等比例的FIP:Fd探针与FIP引物可以显著降低探针带来的抑制效应，同时也能获得较强的荧光信号，从而不影响后续的图片识别和数据分析。
实施例4
1.在qPCR法中，用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的特异性
配置20μL qPCR反应液，其包含：荧光染料：2×SsoFast Evagreen Supermix；用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物：引物F3和引物B3各0.25μM；1μL DNA模板分别提取自黏液分枝杆菌(Mycolicibacterium mucogenicum)ATCC 49650、黏液分枝杆菌(Mycolicibacterium mucogenicum)DSM 44160、拟分枝杆菌(Mycobacterium paraense)IEC26(T)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478、黄分枝杆菌(Mycobacterium lentiflavum)ATCC 51985、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 ATCC43895、李斯忒氏菌(Listeria monocytogenes)S3、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)RN4220、沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC 39184(T)、牛结核分枝杆菌(Mycolicibacterium bovis)BCG菌株Pasteur1173P2，余量为ddH2O。阴性对照组以去离子水代替DNA模板加入反应中，每组实验设置3次重复检测，来验证方法的可重复性。利用qPCR检验本申请的用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的特异性，所述qPCR的反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性5s，60℃退火20s，共40个循环。
检验结果如图3a所示，结果以Cq(quantification threshold)值进行区分，Cq值>33.6的反应为阴性反应，Cq值<33.6的反应为阳性反应。利用本申请提供的用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物(引物F3和引物B3)对黏液分枝杆菌，戈登氏分枝杆菌，拟分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，黄分枝杆菌，大肠杆菌，李斯忒氏菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌进行荧光定量PCR检测的Cq值均大于33.6，阴性对照组的Cq值为33.6，即为无效扩增；对牛结核分枝杆菌进行检测的Cq值为19.1，即为有效扩增。
2.在数字LAMP中，用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的特异性
配置25μL数字LAMP反应液，其包含：20mM Tris-HCl；50mM KCl；10mM(NH4)2SO4；8mMMgSO4；0.1％Tween-20；1.4mM dNTPs；0.5mM MnCl2；0.6M甜菜碱；2mg/mL牛血清白蛋白；0.32U/μL Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶；25μM钙黄绿素；用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物：引物FIP和引物BIP各1.6μM，引物F3和引物B3各0.2μM，引物LF和引物LB各0.8μM；1μLDNA模板分别提取自黏液分枝杆菌(Mycolicibacterium mucogenicum)ATCC 49650、黏液分枝杆菌(Mycolicibacterium mucogenicum)DSM 44160、拟分枝杆菌(Mycobacteriumparaense)IEC26(T)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478、黄分枝杆菌(Mycobacterium lentiflavum)ATCC 51985、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 ATCC43895、李斯忒氏菌(Listeria monocytogenes)S3、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)RN4220、沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC39184(T)、牛结核分枝杆菌(Mycolicibacterium bovis)BCG菌株Pasteur 1173P2，余量为ddH2O。阴性对照组以去离子水代替DNA模板加入反应中，每组实验设置3次重复检测，来验证方法的可重复性。利用数字LAMP检验本申请提供的用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的特异性，所述数字LAMP的反应条件为：66℃恒温，1h。
检测结果通过以下来判读：在液滴的终点检测反应中，包裹有牛结核分枝杆菌核酸的液滴在荧光倒置显微镜蓝光激发下呈现绿色荧光，而没有包裹有牛结核分枝杆菌核酸的液滴则没有绿色荧光。液滴终点荧光检测同时满足三个条件说明定量结果可信：(A)每微升阳性对照中，pEAST-T3-mpb70标准质粒的检测值为1000±10拷贝(标准曲线如实施例1构建)；(B)每微升阴性对照中，牛结核分枝杆菌的检测值为0；(C)如果待测样本中检测到牛结核分枝杆菌阳性的液滴，说明待测样本中含有牛结核分枝杆菌，可根据阳性液滴的数量和总液滴数量得到牛结核分枝杆菌的拷贝数；如果待测样本中没有检测到牛结核分枝杆菌阳性的液滴，说明待测样本中不含有牛结核分枝杆菌或者样本中模板数量低于检测限。
利用本申请提供的用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物对黏液分枝杆菌，戈登氏分枝杆菌，拟分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，黄分枝杆菌，大肠杆菌，李斯忒氏菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌进行数字LAMP检测。如图3b所示，牛结核分枝杆菌检测组有阳性液滴，即为有模板扩增，其它细菌菌种检测组在扩增终点没有任何阳性液滴出现，即都没有核酸扩增产物。通过数字LAMP检测中阳性液滴的数量可以对牛结核分枝杆菌进行绝对定量。
实施例5.在数字LAMP中，用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的灵敏度
配置25μL数字LAMP反应液，其包含：20mM Tris-HCl；50mM KCl；10mM(NH4)2SO4；8mMMgSO4；0.1％Tween-20；1.4mM dNTPs；0.5mM MnCl2；0.6M甜菜碱；2mg/mL牛血清白蛋白；0.32U/μL Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶；25μM钙黄绿素；用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物：引物FIP和引物BIP各1.6μM，引物F3和引物B3各0.2μM，引物LF和引物LB各0.8μM；模板为1μL牛结核分枝杆菌的总DNA；余量为ddH2O。阴性对照以去离子水代替模板加入反应中，每组实验设置3次重复来验证方法的可重复性。
数字LAMP反应过程如实施例2所述。
数字LAMP的反应程序为66℃恒温，1h，其反应结果如图4所示：采用上述的组合物，数字LAMP反应后产生阳性微液滴和阴性微液滴，其中，阳性微液滴荧光信号(即荧光强度)是阴性微液滴荧光信号的2倍以上；同时，阴性对照组(无牛结核分枝杆菌DNA)均为阴性液滴；此外，本申请提供的用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的数字LAMP检测灵敏度为0.13fg(即3.88拷贝/μL)。
数字LAMP在有引物组合物：LF+LB的情况下，扩增速度明显加快，且扩增时间由原来的2个小时减少到了1小时，这是由于引物组合物：LF+LB通过结合到扩增产物的茎环结构上，提高了链置换反应的进程，极大地缩短了环介导等温扩增反应的时间，大大缩短了反应的时间。
实施例6.在数字LAMP中，优化用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的反应温度
利用实施例5中的数字LAMP反应液，优化本申请提供的组合物所需最佳数字LAMP反应温度，结果如图5所示，当扩增温度为66℃时，数字LAMP的扩增效率最高。
实施例7.在数字LAMP中，优化用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物的反应时间
利用实施例5中的数字LAMP反应液，优化本申请提供的组合物所需最佳数字LAMP反应时间，结果如图6所示，60min扩增效率达到最大为99.75％，含模板的微液滴实现高效率扩增，扩增时间继续延长时，可能会出现背景扩增或者非特异性扩增，无法区分阳性和阴性微液滴。
实施例8.在数字LAMP中，使用用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物评价数字LAMP法对牛奶中存在的抑制剂的耐受程度
利用实施例5中的数字LAMP反应液，评价数字LAMP方法对反应中存在的牛奶抑制剂的耐受程度。检测牛奶中的病原菌常常涉及到离心，核酸提取及核酸扩增步骤。而对核酸进行扩增往往容易受到反应中抑制剂的影响，因此，核酸的不完全扩增便会造成核酸定量检测的不准确性。因此在对牛奶中病原菌进行定量检测的过程中我们必须考虑样品处理前和核酸提取过程中残留的成分对核酸扩增定量的影响。据报道，牛奶中的钙离子和蛋白酶等物质会抑制PCR的扩增，从而导致了扩增的失败。此外，核酸的百分百扩增和被精准定量检测要求扩增反应能耐受一定量的抑制剂，而不同的扩增反应中所用的扩增酶对抑制剂的耐受程度不一样，同时，不同的扩增方式对抑制剂的耐受浓度也不一样。因此，为了实现对牛奶中病原菌的精准定量，我们评价了数字LAMP对牛奶中抑制剂的耐受程度。在该实施例中，我们利用标准化的质粒pEASY-T1-mpb70(516拷贝/μL)作为检测的模板，在数字LAMP反应液中加入不同浓度的牛奶作为反应中的抑制剂来测试数字LAMP对牛奶中潜在抑制的容忍浓度。数字LAMP对牛奶中潜在抑制的耐受程度主要是比较反应中存在牛奶抑制剂和反应中无牛奶抑制剂时反应对标准化质粒的扩增效率。为了更好地评价数字LAMP对牛奶中潜在抑制剂的耐受程度，我们将其和常规的qPCR方法进行了对比。结果如图7a所示，当数字LAMP中加入少于1％的牛奶时，牛奶中潜在的抑制剂并不会显著地影响数字LAMP的扩增效率，当反应加入大于1％的牛奶时，数字LAMP的扩增效率会逐渐地降低，当反应中加入14％的牛奶时就能完全抑制数字LAMP的扩增。当qPCR中加入0.03％的牛奶就能抑制扩增的进行(图7b)，且牛奶的量增大到3％时便能完全抑制扩增的进行(图7c)。与qPCR相比，数字LAMP更不容易受抑制剂的影响。因此，数字LAMP对牛奶中潜在抑制剂的耐受程度是qPCR的33倍。综上，数字LAMP对于复杂样品如牛奶中潜在抑制剂耐受程度较高，主要是Bst聚合酶潜在的抗抑制性和数字LAMP这种方法对LAMP反应大体系的分割使得对反应中的抑制剂得以分散和稀释的原因。
实施例9.在数字LAMP中，使用用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物来评价数字LAMP对牛奶中牛结核分枝杆菌定量检测的灵敏度和可靠性
利用实施例5中的数字LAMP反应液，以牛奶作为待测样本，以生理盐水作为对照样品，评价数字LAMP对牛奶中牛结核分枝杆菌定量检测的灵敏度和可靠性。检测流程简述如下：取100μL 10倍稀释的牛结核分枝杆菌(原始浓度为1.4x107 cfu/mL)分别加入到10mL的巴氏消毒的全脂牛奶和生理盐水中，然后经过4700xg离心15分钟，牛奶样品需要除去上层的脂质和蛋白层，离心到底部的菌体用800μL 4％的氢氧化钠进行重悬，消化10分钟，然后把重悬物加入到结核分枝杆菌自动核酸提取试剂盒(购自西安天隆公司)的深孔板中，最后将深孔板置于天隆核酸提取仪器(购自西安天隆公司)中进行核酸提取，30分钟后将提取的样品的核酸保存于-20℃中，并用于后续核酸的定量检测。实验结果如图8a和图8b所示。数字LAMP对牛奶样品和对生理盐水样品中的牛结核分枝杆菌定量检测的结果相一致，这说明了数字LAMP对牛奶具有很好的抗抑制性以及对牛奶中的病原菌的定量检测具有很好的稳定性和可靠性。同时，数字LAMP不管是对牛奶中还是对生理盐水(对照样品)中10倍稀释的牛结核分枝杆菌定量检测的结果都具有很好的线性关系(牛奶样品，R2＝0.9906；生理盐水样品：R2＝0.9836)，而qPCR的定量检测结果则较差(牛奶样品，R2＝0.9420；生理盐水样品，0.9479)。在检测灵敏度上，数字LAMP则高于qPCR，数字LAMP的检测灵敏度为14cfu/mL，而qPCR的为140cfu/mL。以上结果同时也说明了数字LAMP在牛奶样品病原菌的整个检测流程中的检测可靠性，稳定性和灵敏度都大大高于qPCR。因此我们利用数字LAMP技术为复杂样品中病原菌的定量检测提供了一个很好的检测平台。该平台的自动化，高灵敏度和高稳定性将会对以后大规模的样品检测提供便利的技术支持。
以上所述仅是本申请的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术原理的前体下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 用于LAMP检测牛结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用
<130> TPD00876
<141> 2020-07-24
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgagctcaag accaattcgt 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acaccccacc acagacg 17
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acgttggccg ggctggtttc actgctgacc agcatcct 38
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcggcacccg tcagaccctc gttaccgacc ttgaggc 37
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccggccacta cgtggtaggt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
acggtgaccg gtcagggta 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aaaccagccc ggccaacgt 19
<210> 8
<211> 582
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atgaaggtaa agaacacaat tgcggcaacc agtttcgcgg cggccggcct ggcggctctg 60
gcggtggctg tctcaccgcc ggcggccgca ggcgatctgg tgggcccggg ctgcgcggaa 120
tacgcggcag ccaatcccac tgggccggcc tcggtgcagg gaatgtcgca ggacccggtc 180
gcggtggcgg cctcgaacaa tccggagttg acaacgctga cggctgcact gtcgggccag 240
ctcaatccgc aagtaaacct ggtggacacc ctcaacagcg gtcagtacac ggtgttcgca 300
ccgaccaacg cggcatttag caagctgccg gcatccacga tcgacgagct caagaccaat 360
tcgtcactgc tgaccagcat cctgacctac cacgtagtgg ccggccaaac cagcccggcc 420
aacgtcgtcg gcacccgtca gaccctccag ggcgccagcg tgacggtgac cggtcagggt 480
aacagcctca aggtcggtaa cgccgacgtc gtctgtggtg gggtgtctac cgccaacgcg 540
acggtgtaca tgattgacag cgtgctaatg cctccggcgt aa 582
<210> 9
<211> 182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cgagctcaag accaattcgt cactgctgac cagcatcctg acctaccacg tagtggccgg 60
ccaaaccagc ccggccaacg tcgtcggcac ccgtcagacc ctccagggcg ccagcgtgac 120
ggtgaccggt cagggtaaca gcctcaaggt cggtaacgcc gacgtcgtct gtggtggggt 180
gt 182
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acgttggccg ggctggttt 19
Claims (21)
1. 一种用于数字环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含用于检测mpb70基因的至少一个靶区域的引物和探针；其中，所述mpb70基因序列如SEQ ID No. 8所示，SEQ ID No. 8：ATGAAGGTAAAGAACACAATTGCGGCAACCAGTTTCGCGGCGGCCGGCCTGGCGGCTCTGGCGGTGGCTGTCTCACCGCCGGCGGCCGCAGGCGATCTGGTGGGCCCGGGCTGCGCGGAATACGCGGCAGCCAATCCCACTGGGCCGGCCTCGGTGCAGGGAATGTCGCAGGACCCGGTCGCGGTGGCGGCCTCGAACAATCCGGAGTTGACAACGCTGACGGCTGCACTGTCGGGCCAGCTCAATCCGCAAGTAAACCTGGTGGACACCCTCAACAGCGGTCAGTACACGGTGTTCGCACCGACCAACGCGGCATTTAGCAAGCTGCCGGCATCCACGATCGACGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGTCTACCGCCAACGCGACGGTGTACATGATTGACAGCGTGCTAATGCCTCCGGCGTAA；
其中，所述靶区域为SEQ ID No. 9: CGAGCTCAAGACCAATTCGTCACTGCTGACCAGCATCCTGACCTACCACGTAGTGGCCGGCCAAACCAGCCCGGCCAACGTCGTCGGCACCCGTCAGACCCTCCAGGGCGCCAGCGTGACGGTGACCGGTCAGGGTAACAGCCTCAAGGTCGGTAACGCCGACGTCGTCTGTGGTGGGGTGT；
所述引物为以下引物组合物：
1) 引物F3，其序列如SEQ ID NO. 1: CGAGCTCAAGACCAATTCGT所示，和引物B3，其序列如SEQ ID NO. 2: ACACCCCACCACAGACG所示；
2) 引物FIP，其序列如SEQ ID NO. 3: ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和引物BIP，其序列如SEQ ID NO. 4: TCGGCACCCGTCAGACCCTCGTTACCGACCTTGAGGC所示；和
3) 引物LF，其序列如SEQ ID NO. 5: CCGGCCACTACGTGGTAGGT所示，和引物LB，其序列如SEQ ID NO. 6: ACGGTGACCGGTCAGGGTA所示；
所述探针为以下探针组合物：
探针FIP，其序列如SEQ ID NO. 3: ACGTTGGCCGGGCTGGTTTCACTGCTGACCAGCATCCT所示，和
探针Fd，其序列如SEQ ID NO. 7: AAACCAGCCCGGCCAACGT所示；
所述引物和探针等同、互补或杂交于所述靶区域。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
所述引物和探针在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
5.一种核酸组合物，所述组合物包含如权利要求1-4中任一项所述的组合物。
6.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的基因芯片，所述芯片包括如权利要求1-4中任一项所述的组合物。
7.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的基因芯片，所述芯片包括如权利要求1-4中任一项所述的引物组合物和荧光染料。
8.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，其包括如权利要求6所述的基因芯片。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述探针FIP:Fd在进行PCR反应时的终浓度为0.2-1μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的终浓度为0.1-0.5μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的终浓度为0.5-2μM。
10. 如权利要求8或9所述的试剂盒，其还包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20、dNTPs、甜菜碱、牛血清白蛋白、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、液滴发生油、阴性对照和阳性对照。
11.一种用于环介导等温扩增检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，其包括如权利要求7所述的基因芯片。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其中，所述荧光染料的浓度为10-50μM，所述引物FIP和BIP在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM，所述引物F3和B3在进行PCR反应时的浓度为0.1-0.5μM，所述引物LF和LB在进行PCR反应时的浓度为0.5-2μM。
13. 如权利要求11或12所述的试剂盒，其还包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20、dNTPs、MnCl2、甜菜碱、牛血清白蛋白、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、液滴发生油、阴性对照和阳性对照。
14.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，或如权利要求1-4中任一项所述的组合物和荧光染料在制备用于环介导等温扩增(LAMP)检测牛结核分枝杆菌的试剂盒中的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述试剂盒进行检测牛结核分枝杆菌的方法包括：
1) 取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；
2) 对该样本进行DNA提取；
3) 使用包括引物组合物和连接有荧光报告基团或荧光猝灭基团的探针组合物的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；
4) 通过所述荧光报告基团被激发出的荧光的结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌；
或
1) 取得含有目标DNA的样本，所述样本选自待测病原菌，或待测反刍动物组织、唾液、尿液、粪便，或疑似牛结核分枝杆菌的水源、土壤、牛奶样本；
2) 对该样本进行DNA提取；
3) 使用包括引物组合物和荧光染料的LAMP反应液对提取到的DNA进行扩增；
4) 通过所述荧光染料的显色结果以判断是否存在牛结核分枝杆菌。
16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光报告基团；所述探针FIP的5’末端或3’末端或者所述探针Fd的5’末端或3’末端连接荧光猝灭基团。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1或MGB。
18. 根据权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述扩增的温度为52-68 °C。
19. 根据权利要求18所述的用途，其中所述扩增的温度为66 °C。
20. 根据权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述扩增的时间为30-70 min。
21. 根据权利要求20所述的用途，其中所述扩增的时间为60 min。
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| Loop‑mediated isothermal amplification assay targeting the mpb70 gene for rapid differential detection of Mycobacterium bovis;Zhang H等;Archives of Microbiology;第198卷(第9期);摘要、第907页右栏右栏最后1段、表2 * |
Also Published As
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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