CN108531626A - 一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物及包含该引物的检测试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物及包含该引物的检测试剂和方法，所述引物包括上游序列和下游序列，其序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；包含该引物的检测试剂包括上游引物85BPF1、下游引物85BPR1和探针85BPB1(SEQ ID NO:3)；利用所述检测试剂等温扩增检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：将待检测基因样本与所述检测试剂混合，放置在可收集FAM荧光的仪器中，在35‑45℃条件下孵育，检测荧光值，根据有无阳性扩增反应，判断待检测基因样本是否属于结核分枝杆菌的基因。相对于现有技术，本发明通过检测结核杆菌中的基因组，可以特异地检测结核杆菌基因，能够有效区分结核分枝杆菌和非结核分支杆菌，特异性高，反应时间短，温度过程简单。

Description

一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物及包含该引物的 检测试剂和方法

技术领域

本发明涉及一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物及包含该引物的检测试剂和方法，属于结核分枝杆菌检测试剂技术领域。

背景技术

分枝杆菌属，包括结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。结核分枝杆菌，不是一种菌，而是结核分枝杆菌复合群，包括人结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis、牛结核分枝杆菌Mycobacterium bovis、非洲分枝杆菌Mycobacteriumafricanum、田鼠分枝杆菌Mycobacterium microti)，其中人结核分枝杆菌为人类结核病的主要病原体，免疫接种用的卡介苗来源于牛结核分枝杆菌。

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)目前报道的菌种已超过150多种，少部分对人体致病，其中部分是致病菌或条件致病菌，根据NTM的生长速度，伯杰系统细菌学手册(Bergy′smanual of systematic bacteriology)将其分为快速生长型和缓慢生长型。国际细菌命名委员会审定的NTM有猿猴分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、海分支杆菌、苏加分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、瘰疬分支杆菌、戈登分支杆菌、鸟分支杆菌复合群(M1avium complex,MAC)、玛尔摩分支杆菌、土地分支杆菌、溃疡分支杆菌、嗜血分支杆菌、偶然分支杆菌、龟分支杆菌、脓肿分支杆菌、耻垢分支杆菌等。

结核分枝杆菌复合群是引起人类肺结核的病原体。肺结核的病原学诊断，目前已有三种方法，涂片镜检法、分离培养法和分子生物学方法。目前常用的常规检测方法是涂片镜检法和分离培养法，以涂片镜检法为主。涂片染色阳性只能说明抗酸杆菌存在，不能区分是结核菌还是非结核分枝杆菌。分离培养法灵敏度高于涂片镜检法，可直接获得菌落，便于与非结核分枝杆菌鉴别，是结核病诊断金标准，但是培养周期长达2-4周。分子生物学技术主要是PCR，即聚合酶链式反应。该技术利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。其引物采用能够识别靶序列上2个特异区域的2条引物，一条上游引物，一条下游引物。另外，新近出现了LAMP等温扩增方法，该方法不同于PCR，使用4-6条引物，不需要不断变性、复性、延伸，循环往复，不需要调整温度，将反应时间缩短二分之一到三分之一。

但是现有技术中仍然存在一些缺陷，如：

(1)常规检测方法是通过形态学区别鉴定来检测，实际操作时痰中成分各异，如果不是经验丰富的检测者，有时很难制备出合乎检测使用的痰片并染色；

(2)常规检测方法是对痰涂片进行抗酸染色，在显微镜下观察到红色短杆菌为阳性，而染色阳性只能说明抗酸杆菌存在，不能区分于其他抗酸染色阳性菌，尤其是不能区分结核菌与非结核分枝杆菌。分离培养法灵敏度高于涂片镜检法，但是培养周期长达2-4周。

(3)目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为结核分枝杆菌的重复序列，少数为其他基因，如结核菌的DNA异构酶B亚单位(DNA gyrase subunit B)。这些靶基因存在于大多数结核分枝杆菌复合群，但是新近发现的菌株对重复序列是缺失的，所以无法扩增获得阳性结果。例如常用的重复序列IS6110，虽然在结核分枝杆菌AP018035.1菌株中有高达二十二个拷贝，在田鼠分枝杆菌CP010333.1菌株中有八个拷贝，山羊分枝杆菌CP016401.1三个拷贝，在非洲分枝杆菌CP014517.1菌株、牛分枝杆菌CP015773.2株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝，卡内蒂分枝杆菌FO203507.1菌株中有两个拷贝，但是在卡内蒂分枝杆菌FO203510.1菌株和F0203509.1菌株中则缺失该重复序列，无法得到基因扩增，从而造成假阴性的结果；

(4)目前分子生物学主要是PCR，该法由于需要不断变性、复性、延伸，循环往复，温度需要不断调整，而温度调整的过程，使得整个反应时间延长近一倍；

(5)目前的LAMP法需要62-65℃的高温，并需要85℃的高温终止反应。需要特殊的加热装置，因为其需要相对精准的温度。

发明内容

发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物及包含该引物的检测试剂和方法。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明提供了一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物，包括上游序列和下游序列，其序列分别如下：

上游引物85BPF1：gacagacgtgagccgaaagattcgagcttggggacg；(SEQ ID NO:1)

下游引物85BPR1：ggcagccccggccgggagaacgcgcccgcggttg。(SEQ ID NO:2)

本发明还提供了包含所述引物的结核分枝杆菌等温扩增检测试剂，包括如下组分：

上游引物85BPF1、下游引物85BPR1和探针85BPB1；

所述探针85BPB1的序列和结构如下所示：

5’-cgattgatgatcggcacggcagcggctgtag(F)(H)C(Q)tccgggcctggtggggct(SEQ IDNO:3)--Spacer C3，

其中F＝dT-FAM,H＝tetra hydrofuran and Q＝dT-Black HoleQuencher 1.

所述的结核分枝杆菌等温扩增检测试剂，所述50ul检测试剂中，含有15-35pmol上游引物85BPF1，15-35pmol下游引物85BPR1、5-15pmol探针85BPB1。

本发明最后还提供了利用所述检测试剂等温扩增检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

将待检测基因样本与TwistAmp Buffer、MgOAc以及所述检测试剂混合，放置在可收集FAM荧光的仪器中，在35-45℃条件下孵育，检测荧光值，根据有无阳性扩增反应，判断待检测基因样本是否属于结核分枝杆菌的基因。

所述仪器为Twista仪器或荧光定量PCR仪器。

本发明根据结核分枝杆菌X62398.1(M.tuberculosis(strain Erdman)gene for85-B antigen)的基因序列设计引物和探针，具体设计思路见附图1，探针85BPB1的结构示意图如图2所示。

结核分枝杆菌复合群特有的基因(二酰基甘油酰基转移酶/肌醇转移酶diacylglycerolacyltransferase/mycolyltransferase Ag85B)的原序列见SEQ ID NO:4。

通过说明书附图3、4、5、6、7和8所示可得，引物、探针BLAST结果表明，该组引物探针只识别结核分枝杆菌复合群的Ag85B基因，与非结核分枝杆菌的Ag85B基因不匹配，不能反应。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1)常规检测方法是通过形态学区别鉴定来检测，实际操作时痰中成分各异，如果不是经验丰富的检测者，有时很难制备出合乎检测使用的痰片并染色；本发明通过检测结核杆菌中的基因组，可以特异地检测结核杆菌基因，而不扩增其他生物的基因；而且对形态学没有依赖；另外，随着分子生物学的普及，方法也都耳熟能详，易于掌握和操作。

2)常规检测方法是对痰涂片进行抗酸染色，在显微镜下观察到红色短杆菌为阳性，而染色阳性只能说明抗酸杆菌存在，不能区分于其他抗酸染色阳性菌，尤其是不能区分结核菌与非结核分枝杆菌。分离培养法灵敏度高于涂片镜检法，但是培养周期长达2-4周。本发明通过对结核分枝杆菌复合群特有的基因(二酰基甘油酰基转移酶/肌醇转移酶diacylglycerolacyltransferase/mycolyltransferase Ag85B)作为靶基因进行扩增，不但可以区分于其他抗酸染色阳性的细菌，而且可以区分于非结核分枝杆菌，具有严格的特异性。

3)目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为结核分枝杆菌的重复序列，少数为其他基因，如结核菌的DNA异构酶B亚单位(DNA gyrase subunit B)。这些靶基因存在于大多数结核分枝杆菌复合群，但是新近发现的菌株对重复序列是缺失的，所以无法扩增获得阳性结果。例如常用的重复序列IS6110，虽然在结核分枝杆菌AP018035.1菌株中有高达二十二个拷贝，在田鼠分枝杆菌CP010333.1菌株中有八个拷贝，山羊分枝杆菌CP016401.1三个拷贝，在非洲分枝杆菌CP014517.1菌株、牛分枝杆菌CP015773.2株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝，卡内蒂分枝杆菌FO203507.1菌株中有两个拷贝，但是在卡内蒂分枝杆菌FO203510.1菌株和F0203509.1菌株中则缺失该重复序列，无法得到基因扩增，从而造成假阴性的结果。本发明针对的是二酰基甘油酰基转移酶/肌醇转移酶diacylglycerolacyltransferase/mycolyltransferase Ag85B基因，该基因在分枝杆菌中只有一个拷贝，但是该基因在结核分枝杆菌复合群中高度保守，基因序列相似度为99％，而与非结核分支杆菌相似度低于85％，根据其保守片断设计的引物可以将结核分枝杆菌复合群所有菌株进行扩增，而对非结核分支杆菌不扩增，特异性高；

4)目前分子生物学主要是PCR，该法由于需要不断变性、复性、延伸，循环往复，温度需要不断调整，而温度调整的过程，使得整个反应时间延长近一倍；本发明采用等温扩增技术，则不需要调整温度，将反应时间缩短二分之一到三分之一。原有PCR扩增反应需要至少2小时，而本发明只需要1小时。

5)目前的LAMP法需要62-65℃的高温，并需要85℃的高温终止反应。需要特殊的加热装置，因为其需要相对精准的温度。本发明在常温反应，35-45℃，不需要精准的温度，在一个相对温度范围内都可以进行有效扩增，所以不需要特殊的加热装置。

附图说明

图1为本发明引物和探针的具体设计思路；

图2为本发明探针85BPB1的结构示意图；

图3为本发明探针85BPB1的序列比对结果1(显示53bp的探针存在于结核分枝杆菌基因组序列中)；

图4为本发明探针85BPB1的序列比对结果2(显示探针与2株结核分枝杆菌基因组序列完全一致，且在基因组中只有一个拷贝)；

图5为本发明上游引物85BPF1的序列比对结果1(显示36bp的上游引物序列存在于结核分枝杆菌基因组序列中)；

图6为本发明上游引物85BPF1的序列比对结果2(显示上游引物与2株结核分枝杆菌基因组序列完全一致，且在基因组中只有一个结合位点)；

图7为本发明下游引物85BPR1的序列比对结果1(显示34bp的上游引物序列存在于结核分枝杆菌基因组序列中)；

图8为本发明下游引物85BPR1的序列比对结果2(显示上游引物与2株结核分枝杆菌基因组序列完全一致，且在基因组中只有一个结合位点)；

图9为高拷贝模板(10⁷-10⁵拷贝/毫升)的检测结果；

图10为低拷贝模板(10⁴-10³拷贝/毫升)的检测结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物，包括上游序列和下游序列，其序列分别如下：

上游引物85BPF1：gacagacgtgagccgaaagattcgagcttggggacg；(SEQ ID NO:1)

下游引物85BPR1：ggcagccccggccgggagaacgcgcccgcggttg。(SEQ ID NO:2)

实施例2

包含所述引物的结核分枝杆菌等温扩增检测试剂，包括如下组分：

上游引物85BPF1、下游引物85BPR1和探针85BPB1；

所述探针85BPB1的序列和结构如下所示：

5’-cgattgatgatcggcacggcagcggctgtag(F)(H)C(Q)tccgggcctggtggggct(SEQ IDNO:3)--Spacer C3，

其中F＝dT-FAM,H＝tetra hydrofuran and Q＝dT-Black Hole Quencher 1.

其具体结构示意图见说明书附图2所示。

所述50ul检测试剂中，含有15-35pmol上游引物85BPF1，15-35pmol下游引物85BPR1、5-15pmol探针85BPB1。

实施例3利用所述检测试剂等温扩增检测结核分枝杆菌的方法

(一)DNA的提取：

1、样本处理：取痰标本，加入等体积的化痰液(含4％NaOH和2.94％枸橼酸钠，用前加入0.5％N-乙酰-L-半胱氨酸)，充分混匀后室温放置15-20分钟。5000g室温离心15分钟，弃上清。加入1毫升0.1M PBS，充分混匀后5000g室温离心15分钟，弃上清。

2、裂解：沉淀中依次加入200微升裂解液(4M尿素，200mM Tris,20mM NaCl，200mMEDTA,pH7.4)和40微升蛋白酶K(1mg/mL)，迅速混匀，55度孵育0.5-1小时，直到液体澄清。用1毫升注射器(去针头)来回吹吸3次。

3、核酸沉淀：加200微升结合液(6M盐酸胍，10M尿素，10mM Tris-HCL,20％TritonX-100(v/v),pH 4.4),立刻混匀，70度孵育10分钟。加入100微升异丙醇，充分混匀。

4、膜吸附核酸：将所有液体转移到吸附柱，8,000g离心1分钟，弃穿透液；

5、去抑制剂：吸附柱中加入500微升抑制剂去除液(5M盐酸胍，20mM Tris-HCL,40％无水乙醇(v/v)，pH 6.6)，8,000g离心1分钟，弃穿透液；

6、洗涤：吸附柱中加入500微升洗涤液(20mM NaCl，2mM Tris-HCL,80％无水乙醇(v/v),pH 7.5)，8,000g离心1分钟，弃穿透液。重复一次；

7、洗脱DNA：吸附柱中加入100微升70度预热的洗脱液(10mM Tris-HCL,pH 8.5)，8,000g离心1分钟。

8、冻存洗脱下来的DNA液待测。

(二)检测方法：

RPA反应总体系50ul：29.5ul TwistAmp Buffer，2.1ul上游引物，2.1ul下游引物，0.6ul探针，13.2ul样本DNA/水，2.5ul 280mM MgOAc。将该体系放在Twista仪器上孵育，37-42度，并用Twista Studio软件在总30min反应过程中每20s实时检测荧光值。注：反应体系在孵育前及孵育第4分钟均混匀1次。实验设置阳性对照、阴性对照、空白对照。

(三)检出最低限检测：

合成Ag85B基因，克隆到T载体，提取质粒DNA，测定浓度，倍比稀释为不同浓度作为模板对检出限进行实验。结果用50微升反应体系，选择FAM为17％，可以在十分钟之内明显区分10⁷-10⁵拷贝/毫升的阳性质粒与阴性水对照，二十分钟内明显区分10⁴拷贝/毫升的阳性质粒与阴性水对照，30分钟内10³拷贝/毫升的阳性质粒与阴性对照都没有明显扩增曲线，所以该条件下检出最低限为10⁴拷贝/毫升，如图9所示。

反应体系不变，设定FAM为60％，以倍比稀释质粒作为模板再进行实验。结果用50微升反应体系，可以在十分钟之内明显区分10⁴-10³拷贝/毫升的阳性质粒与阴性水对照，30分钟内10²拷贝/毫升的阳性质粒与阴性对照都没有明显扩增曲线，所以该条件下检出最低限为10³拷贝/毫升，如图10所示。

(四)结核分枝杆菌检测实例：

1、对分离培养的TB和NTB菌核酸，进行等温扩增。结果结核杆菌分离株有阳性扩增反应，而非结核分枝杆菌分离株和水阴性对照无阳性扩增反应。

2、对BCG疫苗株进行扩增，对2.5*10⁴-2.5*10³U/毫升菌提取核酸进行扩增，结果为阳性扩增反应，而水阴性对照无阳性扩增反应。

3、对临床痰标本提取核酸，进行等温扩增。与分离培养结果相比，结核杆菌分离株有阳性扩增反应，而非结核分枝杆菌分离株和水阴性对照无阳性扩增反应。

序列表

<110> 东南大学，南京市疾病预防控制中心

<120> 一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物及包含该引物的检测试剂和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacagacgtg agccgaaaga ttcgagcttg gggacg 36

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagccccg gccgggagaa cgcgcccgcg gttg 34

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgattgatga tcggcacggc agcggctgta gtccgggcct ggtggggct 49

<210> 4

<211> 978

<212> DNA

<213> 二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerolacyltransferase/mycolyltransferase Ag85B)

<400> 4

atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca 60

gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccggcg gagcggcaac cgcgggcgcg 120

ttctcccggc cggggctgcc ggtcgagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgc 180

gacatcaagg ttcagttcca gagcggtggg aacaactcac ctgcggttta tctgctcgac 240

ggcctgcgcg cccaagacga ctacaacggc tgggatatca acaccccggc gttcgagtgg 300

tactaccagt cgggactgtc gatagtcatg ccggtcggcg ggcagtccag cttctacagc 360

gactggtaca gcccggcctg cggtaaggct ggctgccaga cttacaagtg ggaaaccttc 420

ctgaccagcg agctgccgca atggttgtcc gccaacaggg ccgtgaagcc caccggcagc 480

gctgcaatcg gcttgtcgat ggccggctcg tcggcaatga tcttggccgc ctaccacccc 540

cagcagttca tctacgccgg ctcgctgtcg gccctgctgg acccctctca ggggatgggg 600

cctagcctga tcggcctcgc gatgggtgac gccggcggtt acaaggccgc agacatgtgg 660

ggtccctcga gtgacccggc atgggagcgc aacgacccta cgcagcagat ccccaagctg 720

gtcgcaaaca acacccggct atgggtttat tgcgggaacg gcaccccgaa cgagttgggc 780

ggtgccaaca tacccgccga gttcttggag aacttcgttc gtagcagcaa cctgaagttc 840

caggatgcgt acaacgccgc gggcgggcac aacgccgtgt tcaacttccc gcccaacggc 900

acgcacagct gggagtactg gggcgctcag ctcaacgcca tgaagggtga cctgcagagt 960

tcgttaggcg ccggctga 978

Claims (5)

1.一种用于等温扩增检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，包括上游序列和下游序列，其序列分别如下：

上游引物85BPF1：gacagacgtgagccgaaagattcgagcttggggacg(SEQ ID NO:1)；

下游引物85BPR1：ggcagccccggccgggagaacgcgcccgcggttg(SEQ ID NO:2)。

2.包含权利要求1所述引物的结核分枝杆菌等温扩增检测试剂，其特征在于，包括如下组分：

上游引物85BPF1、下游引物85BPR1和探针85BPB1；

所述探针85BPB1的序列和结构如下所示：

5’-cgattgatgatcggcacggcagcggctgtag(F)(H)C(Q)tccgggcctggtggggct--Spacer C3(SEQ ID NO:3)，

其中F＝dT-FAM,H＝tetra hydrofuran and Q＝dT-Black HoleQuencher 1。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌等温扩增检测试剂，其特征在于，所述50ul检测试剂中，含有15-35pmol上游引物85BPF1，15-35pmol下游引物85BPR1、5-15pmol探针85BPB1。

4.利用权利要求2-3任一项所述检测试剂等温扩增检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待检测基因样本与TwistAmp Buffer、MgOAc以及所述检测试剂混合，放置在可收集FAM荧光的仪器中，在35-45℃条件下孵育，检测荧光值，根据有无阳性扩增反应，判断待检测基因样本是否属于结核分枝杆菌的基因。

5.根据权利要求4所述的等温扩增检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，所述仪器为Twista仪器或荧光定量PCR仪器。