BR112012030682A2 - bactéria geneticamente modificada da espécie listeria monocytogenes - Google Patents

Abstract

BACTÉRIA GENETICAMENTE MODIFICADA DA ESPÉCIE LISTERIA MONOCYTOGENES. A presente invenção refere-se a uma bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes, em que foi deletado o lócus genômico do fator trancripcional prfA, caracterizado pelo fato de compreender ao nível genômico, uma sequência artificial que age como controle interno de amplificação, uso desta bactéria, bem como um método para detecção e determinação quantitativa e/ou qualitativa da ocorrência de Listeria monocytogenes do tipo selvagem, em uma amostra com suspeita de ter sido contaminada com o referido micro-organismo, e um kit.

Description

. 1/43 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BACTÉRIA GENETICAMENTE MODIFICADA DA ESPÉCIE LISTERIA MONOCYTO- a GENES". A presente invenção refere-se a uma bactéria geneticamente modificadada espécie Listeria monocytogenes, em que o lócus genômico do fator trancripcional PrfA foi deletado, caracterizado pelo fato de compreender ao nível genômico, uma sequência artificial que age como controle interno de amplificação, uso desta bactéria, bem como um método para detecção e | determinação qualitativa e/o quantitativa da ocorrência de Listeria monocy- -—. 10 togenesdotipo selvagem em uma amostra suspeita de ter sido contaminada | ' Co ' com o referido micro-organismo, e um kit. à Ss Antecedentes da Invenção ; Listeria monocytogenes é uma bactéria patogênica gram- positiva, que causa listeriose sendo um dos patógenos mais virulentos que crescem no alimento A detecção de patógenos em amostras como amostras de alimento ou amostras clínicas como sangue, tecido ou fezes, está se tor- nando mais e mais importante.

Contudo, de modo a identificar claramente e : opcionalmente quantificar as células compostas em uma amostra, métodos confiáveis para sua detecção e quantificação devem ser proporcionados. | 20 Deste a primeira implementação da reação em cadeia da poli- l merase (PCR) esta ferramenta biológica molecular foi desenvolvida em um método que obtém muitas oportunidades para a melhor detecção dos micro- organismos.

Um pré-requisito importante para os métodos baseados na PCR tornarem-se um padrão internacionalmente reconhecido é o controle interno de amplificação (IAC). Um IAC é uma sequência de DNA não alvo presente no mesmo tubo de amostra, que é coamplificado simultaneamente com a sequência alvo.

Em uma PCR sem um IAC um resultado negativo não é de- finitivo porque pode significar que não havia uma sequência alvo presente, porém também que a reação de amplificação foi inibida por vários fatores.

Portanto, o Comitê de Padronização Europeu. em colaboração com a Orga- nização de Padrão Internacional (ISO) propôs uma linha de referência geral para PCR de diagnóstico que exige a presença de um IAC (ISO/DIS 22174).

| : 2/43 O IAC deve ser competitivo usando os mesmos sítios de ligação | ' ao iniciador como a PCR alvo sendo claramente distinguível dos amplicons | Po do DNA alvo por meio do comprimento e comprimento de onda fluorescente do corante da sonda usada na PCR em tempo real.

Resumidamente, as ca- racterísticas do controle devem ser tão próximas das características do alvo, garantindo, não obstante, uma interferência insignificante na detecção alvo. ' A implementação de um IAC para os testes da PCR garante a confiabilidade dos resultados negativos, contudo isto se aplica apenas para | a reação enzimática que facilita a amplificação alvo na PCR e para a reação de detecção quantitativa e confirmativa com base no uso de testes fluores- & | centes na PCR em tempo real.

Contudo, etapas preliminares metódicas co- 2 mo preparação da amostra e isolamento/purificação do DNA da amostra ma- triz não são cobertas por esta espécie de controle, sendo no máximo, verifi- cada por controles externos.

Isto não permite o controle de amostras indivi- duais, sendo que resultados negativos implicam na possibilidade de uma verificação falsa do estado do patógeno nas amostras investigadas, por e- xemplo, em alimento.

Por conseguinte faz-se necessário um controle do processo da amostra interna (ISPC) que deverá abranger todas as etapas metódicas que são necessárias para detecção quantitativa confiável dos patógenos com PCR convencional ou em tempo real.

Para detecção de vírus de RNA transmitidos pela água e alimen- to, o uso de Calcivirus Felino e o bacteriófago MS2 como controles internos foi descrito (Mattison e outros, (2009) Int.

J.

Food Microbiol. 132, 73-77; Di e outros, (2010) J.

Virol Methods 165, 57-63; Dreier e outros, (2005) J.

Clin. | Microbiol. 43, 4551-4557). Murphy e outros (2007, Int.

J.

Food Microbiol. 120, 110-119) re- vela um controle interno do processo da amostra bacteriana na detecção de Listeria monocytogenes e Salmonella enterica.

Este controle tem como base uma cepa de fF.colirecombinante incluindo fragmentos do gene fluorescente verde (gfp) e o gene iroB de S. entérica.

O controle não foi usado para fins quantitativos e a cepa E. coli gram-negativa subjacente irá apresentar dife-

. 3/43

S rentes características durante a preparação da amostra comparado com Lis- ' teria monocytogenes. A Por conseguinte, existe uma necessidade quanto a novos e con- fiáveis métodos que permitam a detecção e quantificação do patógeno Liste- riamonocytogenes por meio da PCR em tempo real em amostras contami- nadas. ' Descobriu-se inesperadamente, que este problema pode ser so- lucionado pelo emprego de uma cepa IAC+, A-prfA L. monocytogenes EGDe como um controle interno do processo que abrange todo o processo de de- tecção. f S Descrição da Invenção ao Um primeiro aspecto da presente invenção é, portanto, uma bac- téria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes em que o lócus genômico do fator de transcrição PrfA foi deletado, caracterizado por compreender ao nível genômico, uma sequência artificial que age como um controle interno de amplificação (IAC). : Uma bactéria geneticamente modificada da espécie Lísteria mo- nocytogenes significa uma espécie Listeria monocytogenes resultante da alteração de seu material genético usando técnicas de engenharia genética. A modificação genética compreende a inserção e/ou deleção de genes. A deleção do gene pfrA pode ser realizada, por exemplo, como apresentado | em Bockmann e outros (1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653. | O lócus genômico do fator de transcrição PrfA significa a se- quência de ácido nucleico codificando para a proteína PIÍA. Isto é uma se- —quência de 705 pares de base (Leimeister-Wachter e outros, 1990; Proc. Natl. Acad Sci USA, 87, 8336- 40; Glaser e outros, 2001; Science, 294, 849- 52). O gene está localizado dentro da região cromossômica em torno do ge- ne listeriolysin (lisA) de Listeria monocytogenes (GenelD: 987031); http:/Avww.ncbi.nlm.nih.gOv/gene/987031ttpageTop). A informação a respei- : 30 to do fator transcripcional PrfA também é dada em Scortti e outros, (2007) Microbes and Infection 9, 1196-1207, que está ora incorporado por referên- | cia . PrfA controla a expressão de determinantes chave de virulência de Lis-

: 4/43 i teria monocytogenes. PrfA é uma proteina de 237 resíduos de 27 kDA. À . deleção do lócus genômico do fator transcripcional PrfA torna o mutante não 1 : patogênico. De acordo com a presente invenção o controle interno de ampli- ficação (IAC) significa uma sequência de ácido nucleico artificial presente no | tubo de ensaio durante a reação PCR co-amplificada com uma determinada sequência alvo conforme indicado por Hoorfar e outros.. (2003) Lett. Appl. Microbio!. 38, 79-80. A presença de um IAC permite determinar resultados falso-negativos. A sequência IAC pode ser qualquer sequência de polinucle- otídeo. O tamanho desta sequência pode variar dependendo das condições | de reação e ensaio da PCR específicos da mesma. 2 : A sequencia do IAC é preferivelmente uma sequência de nucleo- i tídeo de cópia única, ou seja, uma sequência de nucleotídeo presente ape- nas uma vez no genoma haplóide de uma bactéria Listeria monocytogenes. Preferivelmente, a sequência IAC é uma sequência que não o- corre em Listeria monocytogenes ou qualquer outras espécie que se espera como de ocorrência natural dentro de uma amostra para investigação, ou na | própria amostra matriz. ' , | Preferivelmente, a sequência IAC compreende sequência de |li- | 20 gação ao iniciador nas extremidades 5' e 3'.

De acordo com a presente invenção é preferido que o IAC seja um IAC competitivo, ou seja, o IAC de Listeria monocytogenes geneticamen- te modificada e a sequência alvo prfA de Listeria monocytogenes do tipo sel- vagem seja amplificada com um conjunto comum de iniciadores sob iguais condições e no mesmo tubo da PCR durante a PCR em tempo real. Portan- to, as sequências de ligação ao iniciador do IAC são particularmente e prefe- rivelmente idênticas às sequências de ligação do iniciador do lócus prfA ge- nômico doe Listeria monocytogenes do tipo selvagem.

Em uma modalidade muito preferida da presente invenção, a sequência AC artificial é a sequência de 100 pb de acordo com SEQ ID NO: 1: S5-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT

CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT

| . | . 5/43 | GAT GGC ATC AAG ATT ACAC-3'. Esta sequência IAC é apresentada em Rossmanith e outros. o (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771. De acordo com a presente invenção as ' sequências do IAC com mais de 80% de homologia com a SEQ ID NO: 1 podem ser usadas. Preferivelmente, a homologia de sequência é maior do que 90%, mais preferivelmente maior do que 95%. De acordo com a presente invenção prefere-se uma cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima descrito. | A cepa de Listeria monocytogenes EGDe é uma preparação cli- nica 1/2a de sorotipo de Listeria monocytogenes. Esta cepa é o organismo e modelo mais disseminado em uso científico. (GenBank: AL591978; Glaser e o outros . (2001) Science 294 (5543), 849-52). i Um aspecto adicional da presente invenção é uma cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modificada, em que o lócus ge- —nômico do-fator transcripcional PrfA foi deletado, compreendendo a sequên- cia de controle interno de amplificação (IAC) de SEQ ID NO: 1, conforme depositado no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell- kulturen — GmbH, — Braunschweig) como Listeria monocytogenes ApríA/+IAC, sob DSM 23639 em 20 de maio de 2010.

A bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria mo- nocytogenes de acordo com a presente invenção atende as exigências para um controle interno do processo da amostra confiável, estándo tão proxima- mente relacionado com Listeria monocytogenes do tipo selvagem quanto possível. Ela não interfere com a reação de detecção principal por meio da PCR em tempo real e o desempenho da reação química subjacente para detecção do controle é igual à reação principal. Adicionalmente, a aplicação de célula de Listeria monocytogenes como ISPC permite, abranger todo o progresso dos métodos necessários incluídos na detecção de patógeno no alimento, da preparação da amostra até a detecção usando PCR em tempo real Um outro aspecto da presente invenção é o uso de Listeria mo- nocytogenes geneticamente modificada como acima, para detecção e de-

. 6/43 | terminação qualitativa e/ou quantitativa da ocorrência de Listeria monocyto- : genes do tipo selvagem, em uma amostra com suspeita de estar contamina- e da com o dito micro-organismo. . Preferivelmente, a amostra é uma amostra de alimento, um flui- ] 5 do corpóreo, em particular, sangue, plasma ou soro, água ou uma amostra de tecido. Amostras exemplares incluem sem limitação a alimento (por e- xemplo, leite de vaca, de ovelha, cabras, éguas, burros, camela, iaques, bú- fala e rena, produtos do leite, carne de bezerro, cabra, 'cordeiro, carneiro, ' 10 porco, pernas de rã, vitela, roedores, cavalo, canguru, aves, incluindo, gali- | e nha, peru, pato, ganso, pombo ou pomba, avestruz, ema, peixes marinhos,

1. incluindo peixes ósseos como salmão e tilápia e mariscos como moluscos e | crustáceos e caracóis, produtos de carne, produtos vegetais, sementes ce- , reais, incluindo milho, trigo, arroz, cevada, sorgo e painço, cereais que não de gramíneas incluindo trigo mourisco, amaranto, e quínua, legumes incluin- | do feijão, amendoim, ervilha e lentilha, nozes incluindo amêndoas, nozes e pinha, sementes oleaginosas, como girassol, colza e gergelim, vegetais co- mo vegetais de raiz, que incluem batatas, cassava e nabos, vegetais de fo- lha, incluindo amaranto, espinafre e couve, vegetais marinhos incluíndo dul- se,algasmarinhas e algas dabberlocks, vegetais de caule, que incluem bro- to de bambu, cactos e aspargos, vegetais inflorescentes, como alcachofras, brócolis e lírios bem como vegetais frutíferos, incluindo abóbora, quiabo e berinjela, frutas, ervas e especiarias, sangue total, urina, escarro, saliva, flui- do amniótico, plasma soro, lavagem pulmonar e tecidos, incluindo, sem limi- tação afígado, baço, rim, pulmão, intestino, cérebro, coração, músculo, pân- creas e outros mais. O perito na técnica apreciará que lisados, extratos ou material homogeneizado obtido de quaisquer amostras dos exemplos supra ou de suas mistura ou composições, compreendendo uma ou mais amostras exemplares também se constituem em amostras dentro do escopo da inven- ção. Particularmente preferido é uma amostra de alimento. t A amostra alimentar é preferivelmente um produto do leite, pre-

| » 7/43 . ferivelmente leite, particularmente leite cru, leite em pó, iogurte, queijo ou ? sorvete, um produto de peixe, preferivelmente peixe cru, um produto de car- ro ne, preferivelmente carne crua, caldo de carne ou salsichas, molho de sala- da, chocolate, ovo ou produtos de ovo, como maionese.

Particularmente e preferivelmente as amostras de alimento usa- da no método de acordo com a presente invenção são amostras que são normalmente conhecidas por compreender Listeria monocytogenes potenci- i almente patogênica, por exemplo, queijo. | : Preferivelmente, a Listeria monocytogenes geneticamente modi- ficadacomo descrito acima, é empregada como controle interno do processo e de amostra (ISPC) para um ensaio com base na PCR em tempo real. 1a De acordo com a presente invenção um ISPC é um organismo modelo adicionado para a amostra original antes da preparação da amostra. Um ISPC fornecê uma medida para a eficiência de toda a cadeia analítica da i preparação da amostra até a detecção da molécula alvo e abrange todas as | etapas metódicas que são necessárias para a detecção quantitativa confiá- vel de patógenos com PCR convencional ou em tempo real. ' Um outro aspecto da presente invenção trata-se de um método | para detectar e determinar a ocorrência de Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de estar contaminada com o referi- do micro-organismo patogênico, compreendendo às seguintes etapas: a) adicionar para a amostra uma quantidade predefinida de célu- las da bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada como a- cima descrito, b) incubar a amostra com uma solução de extração, , c) isolar o DNA por métodos padrão.

d) aplicar PCR em tempo real usando para isso (i) iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria monocytogenes geneticamente mo- —dificada como acima; e (ii) uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotu- : lada capaz de hibridizar especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente

. 8/43 com a referida sequência IAC, : e) determinar qualitativa e/ou quantitativamente sinais fluores- ' o centes gerados pela etapa (d), e i f) determinar e/ou calcular da etapa (e) quanto à presença e/ou a ' 5 quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amos- tra original com suspeita de estar contaminada com o referido micro- organismo. Na etapa (a) uma quantidade predefinida de células da bactéria | Listeria monocytogenes geneticamente modificada como acima descrito é | o 10 adicionada para a amostra. A quantidade adicionada para a amostra depen- | a de do tamanho da amostra. Preferivelmente, uma quantidade de 25 a o 100000 CFU (unidades formadoras de cólônia) da bactéria Listeria monocy- togenes geneticamente modificada é adicionada para uma amostra de, por exemplo, 25 g. Particularmente preferido é uma quantidade de 100 a 5000 CFUpor254.

A unidade formadora de colônia (CFU) é uma medida de células viáveis em uma amostra. Ela pode ser determinada por métodos de cultura, por exemplo, por disseminação uniforme d amostra em um gel de cultura bacteriana. A incubação em condições adequadas de cultura, resulta na formação das colônias. O número das colônias representa o número de uni- dades formadoras de colônia na amostra. Alternativamente, a contagem de células é determinada por contagem ao microscópio de células manchadas fluorescentes, por exemplo, usando o kit Live/Dead(R) BacLight (TM) Bacte- rial Viability Kit (Molecular Probes, Willow Creek, OR, USA) ou métodos co- merciais semelhantes. A solução de extração usada na etapa (b) é uma solução aquosa de uma solução tampão, dotada, tipicamente de um valor de pH maior do que 5 e menor do que 9, preferivelmente maior do que 6 e menor do que 8, mais preferivelmente entre 6,5 e 7,5. A solução de extração pode compreen- der adicionalmente ate 20% de um ou mais solventes orgânicos miscíveis em água.

| O tampão que pode ser utilizado no método da presente inven-

| » o 9/43 ção é de preferência, selecionado do grupo de tampão de fosfato, solução ? salina tamponada com fosfato (PBS), 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol e (TRIS), tampão salina tamponado com TRIS (TBS) e TRIS/EDTA (TE). Em uma modalidade da presente invenção a solução de extra- ção compreende ainda MgCl, e;ou um líquido iônico.

O MgCl, caso esteja presente, estará presente em uma concentração entre 0,05 e 3 M, preferi- | velmente entre 0,1 e 2M, mais preferivelmente entre 0,3 e 1 M. ' Em uma outra modalidade da presente invenção a solução de | extração compreende ainda pelo menos um caótropo e pelo menos um de- tergente. e O líquido iônico - caso esteja presente - está presente, tipica- = mente, em concentrações entre 0,5 e 20% em peso, preferivelmente entre 1 i o e 10% em peso, com base no peso da mistura.

O líquido iônico pode ser um liquido iônico ou uma mistura de dois ou mais líquidos iônicos.

Em uma mo- dalidade preferida, a solução de extração compreende ou MgCl2 ou líquido iônico. ' Líquidos iônicos usados na presente invenção são éspécies iô- nicas consistindo de um cátion orgânico e um anion geralmente inorgânico.

Eles não contém quaisquer moléculas neutras tendo em geral, ponto de fu- | 20 são abaixo de 373 K.

Artigos periódicos sobre líquidos iônicos, são por e- xemplo, R.

Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids”, Chem, Commun., 2001 , 2399-2407; M.J.

Earle, K.R.

Seddon "lonic liquids.

Green solvent for the future", Pure Appl.

Chem., 72 (2000), 1391-1398; P.

Wasserscheid, W.

Keim "lonische Flussigkeiten - neue Losungen fur die Úbergangsmetallka- talyse" (lonic Liquids - Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], An- gew.

Chem., 112 (2000), 3926-3945; T.

Welton "Room temperature ionic li- quids.

Solvents for synthesis and catalysis", Chem.

Rev., 92 (1999), 2071- 2083 or R.

Hagiwara, Ya.

Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazo- : lium cations and fluoroanions", J.

Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227). Em geral, todos os líquidos iônicos de fórmula geral KA" conhe- cidos aos de prática na técnica, em particular os que são miscíveis em água, são adequados no método de acordo com a invenção.

o, 10/43 Caso um líquido iônico ou MgCl, esteja presente, em uma outra ? modalidade preferida a solução de extração não compreende detergente, o no que significa que nenhum detergente aniônico, zwitteriônico ou não jônico i como dodecilsulfato de sódio, CHAPS, Lutensol AO-7 é adicionado para a soluçãode extração. O termo "caótropo" como aqui empregado, refere-se a uma substância que ocasiona distúrbio em uma proteína ou ácido nucleico, por exemplo por alterar a estrutura secundária, terciária ou quaternária de uma proteína ou de um ácido nucleico enquanto deixa a estrutura primária intac- ta. Caótropos exemplares incluem, sem limitação a, cloridrato de guanidina :s (GuHCl]), tiocianato de guanidínio (GUSCN), tiocianato de sódio (KSCN), io- o. deto de sódio, perclorato de soído, uréia, e outros que tais. As descrições de caótropos e sais caotrópicos podem ser encontradas, por exemplo, em K. Hamaguchi e outros. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1962) 62:1129-1136). Como aqui empregado, o termo "detergente" refere-se a molécu- las com características lipofílicas bem como hidrofílicas (ou seja, anfifílicas). Um detergente de acordo com a invenção, pode compreender, por exemplo, um resíduo de ácido graxo e uma parte hidrofílica (por exemplo, aniônica ou catiônica).

Além disso, é possível adicionar para a solução de extração uma ou mais substâncias adicionais coma agentes desestabilizantes ou enzimas ' de degradação de biopolimero que ajudam a degradar as substâncias pre- sentes em amostras específicas. Um exemplo é a adição de enzimas de de- gradação do amido, para uma amostra de alimento compreendendo altas quantidades de colágeno e/ou amido.

A incubação é tipicamente feita a temperaturas entre 18ºC e 50ºC, preferivelmente, entre 25ºC e 45ºC, mais preferivelmente entre 30ºC e 42ºC.

A amostra é tipicamente incubada com a solução de extração durante um tempo entre 120 minutos e 6 horas, preferivelmente entre 20 minutos e 1 hora.

De modo a facilitar a dissolução da amostra a referida amostra e pode ser homogeneizada usando um "stomacher" antes de sua incubação ? com a solução de extração. A dissolução e ainda apoiada e/ou acelerada o quando a mistura é agitada durante a incubação. Outros métodos de extração podem ser encontrados, por exem- ' : 5 plo em Brehm-Stecher e outros. (2009) Journal of Food Protection 72: 1774-

1789.

i De acordo com a presente invenção o DNA do material bacteria- . no é isolado na etapa (c). Vários métodos conhecidos na técnica podem ser empregados para extrair o DNA, por exemplo, os métodos apresentados em Sambrook e outros. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.

e Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

“o. Em geral, a extração do DNA compreende a lise da célula e a purificação do DNA por, ou precipitação ou ligação específica em substratos variados, por exemplo, sílica.

A lise da célula pode ser realizada por métodos padrão, por e- xemplo, por métodos enzimáticos, métodos de microesferas, tratamento com som, métodos detergentes, ou combinações dos citados. Preferivelmente, são empregados métodos com detergente. ' Enzimas adequadas para a lise celular enzimática são, por e- xemplo, lisozima, lisostafina, zimolase, celulase, mutanolisina, glicanases, proteases, manase.

Microesferas adequadas para rompimento celular são de vidro, cerâmica, zircônia ou aço. Após adição das microesferas às células aplica- se agitação da mistura. A agitação pode ser aplicada, por exemplo, por uma —misturadora de vórtice laboratorial comum ou em um aparelho especialmen- te projetado.

De acordo com a presente invenção um outro método para a lise celular é o tratamento com som. Este método envolve a aplicação de ultras- ' som (tipicamente de 20 a 50 kHz) na amostra.

A lise celular com base em detergentes resulta no rompimento da barreira lipídica, que circunda as células. Detergentes adequados podem | Sr escolhidos dentre detergentes não iônicos, zwitteriônicos e iônicos, por

. 12/43 exemplo, CHAPS, Triton& X ou TWEENÔO. Preferivelmente, são usados os : detergentes iônicos, sendo um exemplo de detergente iônico adequado W : SDS. Além da escolha do detergente, outras considerações importan- tes paraa ótima lise celular inclui o tampão, pH, resistência iônica e tempe- ratura: A solução de lise possuí, tipicamente um valor de pH maior do que 5 e menor do que 9, preferivelmente maior do que 6 e menor do que 8, mais preferivelmente entre 6,5 e 7,5; O tampão adequado é preferivelmente selecionado do grupo de CU tampão de fosfato, tampão salino tamponado com fosfato (PBS), 2-amino-2- as hidroximetil-1,3-propanodiol (TRIS), tampão de solução salina tamponada com TRIS (TBS) e TRIS/EDTA (TE).

Opcionalmente um ou mais agentes quelantes podem ser adi- cionados para a solução de lise a fim de sequestrar os cátions divalentes. Quelantes adequados são, por exemplo, EDTA (ácido etilenodiamino tetra- cético), EGTA (ácido etileno glicol tetracético) ou etilenodiamina. Preferivel- mente, usa-se EDTA.

Os métodos de lise celular supracitados são seguidos, tipica- | 20 mente, por centrifugação de modo a separar o DNA do material celular. Um perito na técnica pode determinar, facilmente, os parâmetros para a centrifu- gação. Tipicamente a centrifugação é feita como apresentado em Sambrook e outros. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Após a lise celular o DNA é normalmente precipitado por adição de um álcool, preferivelmente etanol ou isopropanol.

Adicionalmenté, o DNA pode ser fornecido em uma forma ade- quada para amplificação usando-se um Kit de isolamento de DNA comerci- almente disponível, como o kit de tecido NucleoSpinQ& e o protocolo de su- porte para bactérias Gram-posiítivas (Machery-Nagel, Duren, Germany) ou o kit Nexttec? kit para DNA genômico de bactérias (Nexttec GmbH Biotechno- logie, Leverkusen, Germany).

. 13/43 Em uma modalidade adicional da presente invenção o material | ? bacteriano é separado antes do isolamento do DNA na etapa (c). Esta etapa o adicional é particularmente preferida, visto permitir a aquisição de uma con- centração maior de DNA na amostra de PCR resultante. A separação do material bacteriano pode ser realizada por qualquer método conhecido, co- mo centrifugação, filtração, dieletroforese e ultrassom ou ligação de afinida- ! de, por exemplo, usando-se anticorpos, lecitinas, proteínas de ligação viral, : aptâmeros ou peptídeos antimicrobianos (AMP), que são preferivelmente imobilizados em microesferas. Preferivelmente, as células são isoladas por filtração ou centrifugação, mais preferivelmente por centrifugação. A filtração : da amostra extraída é, particularmente, necessária quando a amostra com- co plexa compreende material que é raramente extraível ou não extraível de | todo, com o.método da presente invenção. Tipicamente, esses materiais | compreender amido e/ou fibras. Contudo, o método preferido para isolamen- todas células da mistura de extração é centrifugação.

A etapa de incubação pode ser repetida - dependendo da matriz * da amostra - uma ou várias vezes, por exemplo, duas, três vezes, quatro SS vezes, cinco vezes ou dez vezes. Entre essas etapas de incubação, o mate- | rial bacteriano e a matriz de amostra residual podem ser separados do so- | 20 brenadante, por centrifugação, por exemplo.

Depois da separação do material bacteriano as células são pre- ferivelmente lavadas com água, uma solução tampão e/ou soluções com- preendendo detergente. A etapa de lavagem pode se repetir várias vezes.

Na etapa (d) aplica-se a reação de PCR, preferivelmente PCR emtempo real. PCR em tempo real é um método para detectar e medir pro- dutos gerados durante cada ciclo de uma PCR, que são proporcionados pa- ra a quantidade de ácido nucleico matriz antes do inicio da PCR. A informa- ' ção obtida, como uma curva de amplificação, pode ser usada para quantifi- car as quantidades iniciais da sequência de ácido nucleico da matriz.

A detecção é preferivelmente com base na fluorescência de mo- nitoração em cada ciclo a uma temperatura ajustada. A fluorescência é mo- | nitorada normalmente usando-se um dispositivo óptico para colear os dados

. 14/43 em cada excitação específica e comprimentos de onda emitidos para o co- ê rante fluorescente particular presente na amostra. O ciclo em que a fluores- o cência de uma amostra cruza o limite para detecção da fluorescência acima do fundamental é denominado limite do ciclo, Ct e permite.a quantificação da | 5 matrizde partida.

As condições da PCR não são particularmente restritas porém condições ótimas podem ser selecionadas para cada aparelho da PCR. Por exemplo, podem ser usadas as seguintes condições: ss - desnaturação térmica de DNA de fita dupla em DNA de fita 2º 10 simples: - ? Y aquecimento é geralmente feito a cerca de 90-98ºC, preferivel- JL. mente em cerca de 92-96ºC, geralmente por cerca de 3 segundos a 1 minu- | to, preferivelmente por cerca de 30 segundos a 1 minuto. - aquecimento: o aquecimento a é feito geralmente a cerca de | 15 40-70ºC, preferivelmente a 55-65ºC, geralmente por cerca de 5 segundos a 2 minutos, preferivelmente por cerca de 30 segundos a 90 segundos. | - reação de alongamento do DNA: o aquecimento é feito em ge- | ral a cerca de 60-75ºC, preferivelmente a cerca de 70-74ºC, em geral, por cerca de 10 segundos a 3 minutos, preferivelmente por cerca de 30 segun- dosa2 minutos.

- composição de íon Mg no líquido de reação: Geralmente cerca i de 1-5 mM, preferivelmente cerca de 1,5-3,5 mM.

] Esta reação é feita tipicamente em cerca de 20-50 ciclos, prefe- rivelmente em cerca de 45 ciclos, pelo que, o DNA alvo pode ser amplificado até umníveldetectável.

Qualquer aparelho de PCR em tempo real comercial pode ser empregado.

De acordo com a etapa (d) (i) do método da presente invenção são empregados os iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria mo- nocytogenes geneticamente modificada como indicado acima.

Em geral, o termo "iniciador" refere-se a uma molécula de ácido

. 15/43 nucleico curta como um DNA oligonucleotídeo de 9 nucleotídeos ou mais em | à comprimento, ou seja, complementar a um segmento ao longo de uma fita o do ácido nucleico alvo, ou seja, o lócus prfA genômico e a sequência IAC, em que a finalidade do iniciador é iniciar a replicação do' ácido nucleico de i 5 um ácido nucleico maior ao longo da fita.

De acordo com a presente inven- ção iniciadores de 15 a 40 nucleotídeos são preferidos.

Na presente inven- ção o termo "iniciador" é usado para o par de iniciador, flanqueando a se- quência visada para amplificação. | : Preferivelmente, os iniciadores usados na etapa (d) (1) são Lip1 e : 10 Lip2.A sequência de Lip1 é: 5-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3' (SEQ ..s ID NO: 2) e a sequência de Lip2 é: 5-GTG TAA TCT TGA TGC CAT-CAG G- KM 3' (SEQ ID NO: 3). De acordo com a etapa (d) (ii) do método da presente invenção são empregadas, uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada ca- pazde hibridizar especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonu- | cleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente com a | sequência IAC.

De acordo com a presente invenção o termo "hibridiza especifi- camente" significa ligação detectável e específica.

Polinucleotídeos. oligonu- ' 20 cleotíideos e seus fragmentos hibridizam seletivamente para fitas de ácido nucleico sob condições de hibridização que minimizam quantidades apreciá- veis de ligação detectável para ácidos nucleicos não específicos. | Um oligonucleotídeo fluorescente rotulado é um oligonucleotídeo que apresenta um fluoróforo covalentemente ligado.

Um fluoróforo é um composto químico que, quando excitado pela exposição a um determinado : , comprimento de onda de luz, emite luz fluorescente, por exemplo, a um comprimento de onda diferente da luz.

Preferivelmente, as sondas de oligonucleotídeo que são capazes de hibridizar especificamente com o lócus prfA e a dita sequência IAC apre- | sentam diferentes fluoróforos emissores de luz de diferentes comprimentos de onda.

Isto permite detectar uma sonda independentemente da outra.

As sondas rotuladas com fluorescência usadas, tipicamente, pa-

. 16/43 ra a PCR em tempo real, são sondas LightCycler (hibridização), indicadores Í moleculares, ou sondas de hidrólise (também denominadas sondas Taq- "o ManãQ.

Preferivelmente, são usadas sondas de hidrólise. | ' Sondas LightCycler utilizam a técnica de transferência de ener- gia por ressonância fluorescente (FRET). Para este método duas diferentes sondas de oligonucleotídeo ligadas a um doador de FRET e um receptor de FRET, respectivamente, são usadas, para CAD sequência alvo.

Essas son- das ligam-se lado a lado à sequência alvo, mantendo os fluoróforos próxi- mos. . 10 Indicadores moleculares (Tyagi e outros, Nat.

Biotechnol. "ss 14:303-8 1996) são sondas de oligonucleotídeo ligadas a um fluorófo repór- a ter e uma têmpera.

Os nucleotídeos na extremidade 5' são complementares aos nucleotídeos na extremidade 3', formando uma estrutura em circuito rí- gido.

Devido à proximidade do fluoróforo e a têmpera não é observada ne- —nhuma fluorescência.

A hibridização da sonda com a sequência alvo durante a PCR em tempo real, conduz a um aumento na distancia repórter-têmpera, resultando na fluorescência do gene repórter.

Preferivelmente; sondas de hidrólise (sondas TaqManO) são u- sadas (Lee e outros., Nucleic Acids Res,. 21:3761-6, 1993). Essas sondas utilizam também a técnica de transferência de energia por ressonância fluo- rescente (FRET). As sondas apresentam um repórter fluorescente em uma extremidade e uma têmpera de fluorescência na extremidade oposta.

Devido à proximidade do gene reporte a têmpera, a detecção da fluorescência do repórter é suprimida.

Durante o estágio de anelamento da PCR ambos, os iniciadores e a sonda anelam-se ao DNA alvo.

A polimerização de uma nova fita de DNA leva à degradação da sonda pela atividade 5'-3' exonuclease da polimerase e a separação física do gene repórter fluorescente da têmpera, resultando em um aumento na fluorescência.

A fluorescência pode ser vista e medida em um termociclador da PCR em tempo real, e seu aumento geo- métrico correspondente a um aumento exponencial do produto é usado par determinar o ciclo limite (Ct) em cada reação (vide a seguir). Repórteres “exemplares incluem, sem limitição a: 6-

. 17/43 carboxifluoresceína; carboxifluoresceína (FAM); difluoreto dipirrometeno de | ç boro (BODIPY); acridina, estilbeno, 6-carbóxi-fluoresceina (HEX), TET (te- : . trametil fluoresceína), 6-carbóxi-X-rodamina (ROX), Rodamina-6G, Texas Red, 2',7'-dimetóxi-4',5'-dicloro-S-carboxifluoresceina (JOE), Cy63, CyOS5, 1 5: VICO (Applied Biosystems), LC Red 640, LC Red 705, Texas Red, Yakima YellowO, bem como seus derivados.

Preferivelmente, um repórter seleciona- do de FAM e HEX é empregado na presente invenção.

Têmperas exemplares incluem, sem limitação a Black Hole Quenchers (WO 01/86001 A1) como BHQ1º e BHQ2º, MGB (Minor-groove- binder, EP 0819133 B1), N.N,N' N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), Ts Eclipse&Dark Quencher, DABCYL, DABSYL, DDQ | e DDQ Il.

De acordo e. com a presente invenção as temperas preferivelmente usadas são MGB ou BHQ16. Uma pessoa versada na técnica poderá facilmente escolher uma combinação de repórter-resfriador adequado.

Tipicamente, o espectro de absorção da tempera necessita ter um bom cruzamento com o espectro de emissão do gene repórter para permitir uma ótima têmpera: Preferivelmente, a sonda rotulada fluorescente que hibridiza com a sequência IAC da etapa (d) (11) é pLucLm4 (SEQ ID NO: 4), como revelado em Rossmanithe outros., (2006) Res.

Microbiol. 157, 763-771. A sonda rotu- lada fluorescente que hibridiza com o lócus prfA é preferivelmente LipProbe (SEQ ID NO: 5). A sonda rotulada fluorescente pLuclLm4 apresenta, preferivel- mente HEX como fluoróforo reporte e BHQ1º como têmpera.

A sonda rotulada fluorescente LipProbe apresenta preferivel- mente FAM como repórter e MGB como têmpera.

De acordo com a presente invenção os sinais fluorescentes ge- rados na etapa (d) são qualitativamente e ou quantitativamente determina- dos na etapa (e). A detecção é preferivelmente baseada na monitoração da fluo- rescência em cada ciclo a uma dada temperatura.

A fluorescência é nor- malmente monitorada usando-se um disposítivo óptico para coleta dos da-

. 18/43 dos em comprimentos de onda específicos de emissão e excitação, para os : fluoróforos particulares presentes na amostra. Ê . Na etapa (f) a presença e/ou quantidade de células de Listeria Ú monocytogenes do tipo selvagem na amostra original suspeita de estar con- Í 5 taminada com o dito microorganismo é determinada e/ou calculada pela eta- pa (e). : A presença de células de Listeria monocytogenes.do tipo selva- gem na amostra original é determinada, tipicamente, por determinar qualita- -- tivamente os sinais fluorescentes na etapa (e). A quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo sel- Ts vagem na amostra original é calculada, tipicamente, compreendendo as se- 1 guintes etapas: o - cálculo da quantidade inicial de DNA por meio de cópias de DNA de Listeria monocytogenes geneticamente modificada e de Listeria mo- nocytogenes do tipo selvagem usando-se o método Ct (método Limite) com base no respectivo sinal fluorescente após amplificação da PCR em tempo real. O método limite é baseado na comparação do respectivo sinal da a- - mostra investigada com um padrão de calibração (Kaltenbôóck e outros., (2005). Advances in Clinical Chemistry 40:219-259).

-- cálculo da perda durante procedimento analítico (compreen- dendo a preparação da amostra, purificação e isolamento do DNA e PCR em tempo real de acordo com as etapas (b), (c) e (d) do método da presente invenção, com base no valor conhecido de células iniciais de Listeria mo- nocytogenes geneticamente modificada dentro da amostra e do valor de cé- lulas, conforme obtido pelo método Ct após PCR em tempor'real.

| - cálculo do número de células de Listeria monocytogenes do ti- po selvagem presentes na amostra com suspeita de estar contaminada com os referidos micro-organismos baseado na perda calculada de células de Listeria monocytogenes geneticamente modificada durante procedimento analítico.

O método da presente invenção é vantajoso visto o uso de Liste- | ria monocytogenes como um controle interno do processo de amostra

: 19/43 (ISPC) para detecção de patógenos biológicos moleculares, propiciar uma Í maior similitude com os organismo alvo e daí a maior aplicabilidade para o detecção do patógeno bacteriano.

Mesmo uma espécie proximamente rela- : É cionada como Listeria innocua conduziria a um controle interno não competi- f 5 tivo necessitando de um segundo par de iniciador durante a PCR em tempo real.

O simples emprego de um ISPC com base no DNA derivado de um IAC existente, desde o começo do processo de detecção, não preencheria tam- bém o pré-requisito de maior similitude de controle e alvo.

Além disso, a maior parte do DNA estaria pérdida durante as várias etapas metódicas an- tesdadetecção por PCR. ; "os Ú Um aspecto ulterior da presente invenção trata-se de um kit para oa uso em um ensaio para detectar e determinar Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de estar contaminada com mi- cro-organismos, compreendendo pelo menos em um ou mais ensaios | 15 () Listeria monocytogenes geneticamente modificada como es- | pecificado acima; (ii) os iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Lis- | teria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria mo- nocytogenes geneticamente modificada como especificado supra; e (ii) uma sonda de oligonucleotídeo rotulada fluorescente capaz de hibridizar, especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonucleo- tídeo rotulada fluorescente capaz de hibridizar especificamente com a se- quência IAC.

Preferivelmente, os iniciadores do kit são Lip1 (SEQ ID NO: 2) e Lip2(SEQIDNO:3). i As sondas fluorescentes rotuladas são preferivelmente pLucLm4 (SEQ ID NO: 4), para detecção da sequência IAC e LipProbe (SEQ ID NO: 5) para detecção do lócus prfA.

De acordo com a presente invenção o kit pode compreender a- indauma solução de extração.

Um outro aspecto da presente invenção trata-se de um método para fabricação de uma bactéria Listeria monocytogenes geneticamente mo-

. 20/43 dificada como acima descrito compreendendo as etapas: : (a) deletar o lócus genômico do fator de transcrição PrfA das es- o pécies bacterianas Listeria monocytogenes, . (b) clonagem de um vetor compreendendo um IAC. : 5 (c) transformar o vetor da etapa (b) em espécies bacterianas da etapa (a). A deleção do lócus genômico de PrfA de acordo com a etapa (a) é realizada por técnicas do conhecimento da técnica podendo por exemplo, ser realizada conforme exposto em Bockmann e outros. (1996) Mol.

Microbi- | ol 22,643-653. A principio, um plasmídeo de nocaute é construído.

Este 7 plasmídeo é transformado em células de Listeria monocytogenes.

O sobre- o cruzamento resulta na excisão do gene prfA.

O organismo resultante tam- bém é referido como Listeria monocytogenes A-prfA.

Condições ótimas de cultura para a bactéria Listeria monocyto- genes podem ser facilmente determinadas por um versado na técnica.

Tipi- camente as bactérias crescem em TSB-Y (caldo de soja Trypton com extrato de levedo) a 37ºC com aeração.

Na etapa (b) é produzido um vetor compreendendo o IAC.

Quantidades adequadas da sequência IAC para clonagem são tipicamente produzidas por amplificação da sequência por PCR convencio- nal (Rossmanith e outros. (2006) Res.

Microbiol. 157, 763-771). Os iniciado- res usados para PCR compreendem tipicamente, sítios de restrição para enzimas de restrição especiais permitindo uma integração posterior ao vetor.

Para uma sequência IAC de acordo com SEQ ID NO: 1 os iniciadores modi- ficados LipBam (SEQ ID NO: 6) e LipSal (SEQ ID NO: 7) compreendendo os sítios de restrição BamHlI e Sall, respectivamente, são usádos de preferên- | cia.

A sequência de LipBam é : 5º GCG CGG ATC CGA TAC AGA AAC ATC GGT TGG C'3 (SEQ ID NO:6). A sequência de LipSal é GCG CGT CGA CGT GTA ATC TTG | ATG CCA TCA GG'3 (SEQ ID NO:7). Após a purificação do produto de amplificação, a digestão de

. 21/43 restrição, desfosforilação e ligação com um vetor de integração adequado : são realizadas. o A digestão de restrição é feita tipicamente por incubação do pro- duto de amplificação com enzimas de restrição comercialmente disponíveis ' 5 correspondentes aos sítios de restrição dos iniciadores usados para a PCR. Preferivelmente, são usados BamHlI e Saill.

A desfosforilação dos fragmentos do IAC pode ser realizada por incubação com uma fosfatase adequada, por exemplo, Fast AP*M” Thermo- sensitive Alkaline Phosphatase (Fermentas). Um vetor de integração ade- quado pode ser escolhido facilmente pelo versado na técnica. O vetor com- 7 preende uma sequência genética que confere resistência a um antibiótico a em que a linhagem hospedeira pretendida de bactéria é sensível (por exem- plo, cloranfenicol) de modo a permitir para seleção posterior dos clones posi- tivos. Preferivelmente, um vetor de inserção de fago por exemplo, pPL1 ou | 15 pPL2 comó apresentado em Lauer e outros . (2002) J. Bacteriol. 184, 4177- 4186 é usado. O vetor de inserção de fago pPL2 (6123 pb) é particularmente preferido, visto proporcionar inserção de cópia única estável ao genoma de Listeria monocytogenes. ' | Quantidades adequadas do vetor de inserção podem Sr produ- | 20 zidas amplificando-se o vetor em uma bactéria, por exemplo, E. coli TOP 10F', e subsequente isolamento, digestão de restrição e desfosforilação con- forme descrito acima. Tipicamente, os sítios de restrição podem ser vistos em um sítio de clonagem múltipla (MCS) do vetor. A ligação é tipicamente feita por adição de uma DNA ligase, por exemplo, DNA ligase T4 disponível de Fermentas.

O vetor resultante é transformado em uma bactéria adequada, por exemplo, E. coli TOP 10F' para amplificação e seleção dos clones positi- vos. Esta seleção é realizada, tipicamente, por deposição em lâmina da bac- téria em um meio compreendendo o antibiótico supracitado.

Na etapa (c), o vetor da etapa (b) é transferido para as células de Listeria monocytogenes da etapa (a). A transformação pode ser realizada usando-se os diversos métodos do conhecimento da técnica. São exemplos s 22/43 a transformação por choque térmico ou eletroporação. Preferivelmente, a ? transformação é realizada por eletroporação. o A transformação por choque térmico é realizada resfriando-se as i células na presença de cátions divalentes como Ca** (em CaCl-) ou Rb"* ' 5 — (RbCl-)) preparando a membrana da célula para ficar permeável ao DNA de plasmídeo. AS células são incubadas em gelo com o DNA e a seguir passa- da por choque térmico brevemente (tipicamente a 41 a 43ºC. por 30 a 120 segundos). Para a eletroporação as células são brevemente passada por | 10 coque com um campo elétrico de 10 a 25 kVlcm. Preferivelmente, a eletro- -? poração é realizada de acordo com Park e outros. (1990) Gene 94, 129-132. 1 O organismo resultante pode ser testado com clonagem com um resultado positivo. A inserção de sucesso do vetor ao. genoma da A-prfA Lis- teria monocytogenes pode ser testada por amplificação do fragmento de 499 pb porPCR (de acordo com Lauer e outros, (2002) J. Bacteriol. 184, 4177- 4186) e também por sequenciamento. i A inserção de cópia única do IAC ao genoma de A-prfA Listeria monocytogenes pode ser verificada comparando-se as proporções do DNA genômico de Listeria monocytogenes transformada medido por espectrosco- piade UV/WVIS com os dados após PCR em tempo real comprando-se com os dados do tipo selvagem do tamanho conhecido do genoma de Listeria (Nelson e outros , (2004) Nucleic Acids Res, 32, 2386-2395). A presente invenção está ilustrada ainda pelas seguintes figuras e exemplos sem, contudo, estar a estes restrita.

Figura 1 - Confirmação de pPL2-IAC, E. coli e IAC+ A-prfA Liste- ria monocytogenes EGDe (de acordo com os Exemplos 1.4 e 1.6) (A) ampli- ficação por PCR em tempo real de pPL2-IAC, clones de E. coli após trans- ' formação e isolamento do plasmídeo visando IAC artificial dentro do plasmí- deo. Os gráficos de amplificação do lado esquerdo incluem a preparação do plasmídeo como alvo. Os gráficos de amplificação do lado direito (SS IAC) representam a função de calibração (Eficiência: 96,8% Rsq: 0,999). (B) Am- | plificação da PCR em tempo real de IAC+, clones de A-prfA Listeria monocy-

. 23/43 togenes EGDe visando IAC artificial dentro do genoma para confirmação da É integração do vetor pPL2-IAC ao genoma de Listeria (Eff.: 96,0%; Rsq.: o 0,999). Os gráficos de amplificação do lado esquerdo incluem DNA genômi- co de quatro clones de IAC +, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe como alo. : Figura 2 - Confirmação da integração positiva de pPL2-IAC ao genoma de Listeria e confirmação do IAC + resultante, linhagem de A-prfA | Listeria monocytogenes EGDe por PCR convencional (de acordo com o E- | xemplo 1.6). (A) gel de agarose das cepas clonadas, confirmado como Liste- riamonocytogenes, M. Marcador; 1 L ivanovvi, L seeligeri e L welshimeri, 2, o L innnocua; 3, L monocytogenes; 4, L grayi, 5-8 quatro. clones de IAC+, A- 10 prfA Listeria monocytogenes EGDe. (B) Confirmação do IAC+, A-prfA Liste- ria monocytogenes EGDe amplificando o gene rRNA 168 específico para todas as Listeria spp e o gene hly específico para Listeria monocytogenes. 9, L spp;10, Listeria monocytogenes 11-14, Quatro clones IAC+, A-prfA Liste- ria monocytogenes EGDe. (C) conformação da integração do pPL2-IAC ao genoma da linhagem EGDe de A-prfA Listeria monocytogenes. 1-4, Quatro clones IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe. O fragmento de 499 pb resultante após PCR indica integração. Os produtos da PCR são separados emum gelde agarose a 1% e manchados com brometo de etídeo. Toda a apresentação de todas as aplicações, patentes e publi- cações citadas acima e abaixo estão ora incorporados por referência ao pre- | sente. : |

1. Exemplos: ' Os exemplos a seguir descrevem aplicações práticas da inven- ção.

1.1 CEPAS BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTURA. Listeria monocytogenes EGDe (1/2a, número interno 2964) é uma parte da coleção de cepas bacterianas no Instituto de Higiene do Leite, Tecnologia do Leite e Ciência Alimentar, Departamento de Saúde Pública Veterinária e Ciência Alimentar, Universidade de Medicina Veterinária, Vie- | na, Áustria, (IMML). A-prfA Listeria monocytogenes EGDe (1/2a) é uma parte

. da coleção de cepas bacterianas do Departamento de Microbiologia, Theo- : dor Boveri Institute, Universidade de Wurzburg, Wurzburg, Germany, E. coli o TOP 10F' eletrocompetente está disponível em Invitrogen (Carlsbad, CA, i USA). Todas as cepas bacterianas são mantidas a -80ºC usando-se tecno- logia MicroBank'" (Pro-Lab Diagnostics, Richmont Hill, Canada). A medição da densidade óptica das culturas bacterianas é reali- zada a 600 nm (ODçoo) em duplicada com um espectrofotômetro HP8452 (Hewlett Packard, Paolo Alto CA, USA). A deposição seletiva em placas de Listeria monocytogenes EGDe wt e IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe é realizada em RAPID' L.mono (laboratórios Bio-Rad GmbH, Mun- CU chem Alemanha), OCLA (Agar Listeria Oxoide Cromogenica, Oxoid, Hamp- NS shire UK), PALCAM (Solabia Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, França) e Agar de sangue (Biomerieux, Marcy I'Etoile, França), seja por estrias de 100 | pl de cultura bacteriana às placas ou pela técnica de laço. A eem umeração das suspensões bacterianas é feita usando-se o método de contagem de placa de Live/DeadOBacLight OBacterial Viability i Kit (Molecular Probes, Willow Creek, OR, USA) de acordo com as instruções do fabricante. '

1.2 OLIGONUCLEOTÍDEOS, PLASMÍDEOS E REAÇÕES ENZIMÁTICAS. As sequências de oligonucleotídeos e de plasmídeos estão a- presentadas na Tabela 1. Os iniciadores para PCR convencional e em tem- po real e a sonda rotulada com HEX pLUcIm4 estão disponíveis de MWG Biotech (Ebersberg, Germany); a sonda Lip modificada com MGB de Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). O alvo de 100 pb artificial para o IAC é sintetizado por VBC Genomics (Vienna, Austria). O vetor de inserção do fago | pPL2 de acordo com Lauer e outros, (2002) J. Bactriol. 184, 4177-4186. |

Tabela 1 Sequências de oligonucleotídeos e iniciadores e organismos . Oligonucleotíi- Sequência/Rótulo Ref/ Fonte | º deos . : Lip1 iniciador di- S"-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3" D' Agostino e Ú anteiro? outros 2004 Lip2 iniciador in- S"-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC+3" D' Agostino e verso? outros 2004 Lip Bam iniciador — s'GCG CGH ATC CGA TAC AGA AAC ATC GGT TGG C'3 SEQ ID NO: dianteiro? 6 Lip Sal iniciador S5'GCGCGT CGA CGT GTA ATCTTG ATGCCA TCAGG'3 SEQ ID NO: inverso“ 7 LipProbe lócus FAM-CAG GAT TAA AAGTIGACCGCA-MGB —. Rossmanithe .-. prfA de ligação a outros 2006, sonda? SEQ ID NO:

O pLucLmd4 alvo HEX-TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTGGC-BHQ1 Rossmanith e artificial de liga- outros 2006, ção à sonda SEQ ID NO: 4 IAC alvo artificial 5 A AAA AA GITA AGA CAT ACO CGO, Rossmanith e TGG AAC CTGGAA CCT GAT GGC ATCAAG ATT ACA C:3' outros 2006, SEQ ID NO 1 NC 16 confirma- S'-GTC AAA ACA TAC GCT CTT ATC-3* Lauer e ou- ção da inserção : tros., 2002 de pPL2 PL95 confirma- 5”-ACATAA TCA GTC CAA AGT AGA TGC-3" Lauer e ou- ção da inserção : tros., 2002 de pPL2 Sequência 1 (NC Sequência inclusa na Tabela 1A Este pedido | 16) confirmação de patente ; da inserção de ' pPL2 sequência 2 (PL Sequência inclusa na Tabela 1A este pedido 95) confirmação de patente da inserção de pPL2 | | |

: Espécies/ plas- Cepa Referência míideo . Listeria monocy- — EGDe (1/2a) linhagem do tipo selva- IMMLº cepa : fogenes wt gem detectada por prfA de PCR em no. 2964 : i tempo real ' Listeria monocy- * EGDe (1/2a) A-prfA - cepa EGDe de — Bóckmann e . togenes alvo À Listeria monocytogenes com deleção — outros, 1996 total do lócus prfA - E.coli TOP 10F' E. coli quimicamente competente Invitrogen vetor de inserção — Listeria monocytogenes específica - Lauer e ou- do fago pPL2 sítio de integração ao PSA integrantes — tros ., 2002 de cópia única estáveis: - 10º doador a - especifico para Listeria monocytogenes wt : b- iniciador contendo sítio de restrição Bam Hi | .. c - iniciador contendo sítio de restrição Sal | : d-IMML= Instituto de Higiene do Leite, Tecnologia e Ciência Alimentar do Leite , Universidade de Medicina Veterinária |

Tabela 1A Sequências e genes repórteres blast da análise dos produtos de amplifica- e - ção da PCR de acordo com Lauer e outros, 2002 ? aaa ara A A» a —— Nomefiniciador — repórter Blast Referência & Sequência p : picadas buins A nica ão faia DDD SC : 'ANONNANNNACGTATCCAGTTOGATTCATÓGACCOGAGATGAC. AMCGAACTAACAGACCTAACOCAAACCTICCCATTAAÇGAAG. identidades =219/210 (090. sab AuivarA — ” C A MOMAAACGAAGCOMTITAMERTA Gai=08IO(M). — vetordeintearacão o SARAGARARCOAT ' Sasad-Plas/Plas: Vetor de trane parte” — ARATGOTATITGGCTGTTGAAAAGACAGTGOCATITGTCCTO R plz ATAGCTCAGCTOGATAGAGCAACOGOCTTCTAAGOCGTOGOT sequência 1 OGGGOGITOGAATOCCTCTCAGGACGTTAAATAGTAATGITAA Clone INÇAS AGARATCTCTARAACGTTGAAAAGCCITGATATTARAGOGCG

GATGAATGTTITOGAGTIITITTITATATOGTATAATAÇOCGTT identidades =267/248 (99%), embALINIVIS.E — TTATICCGITGTITITGIGGCATITGIGGTAAMATITGIGGTA intervalos » 17268 (0%), Liseria monocyiogens — TTITICATCTGTTITIAGIGTGAAMAAAGCATCTACTITGGACT Stmad=Plus/Ples sruin EGD, complete — GATTATGOTAAAACCACCAACTTGOAATGGATAAGATCATCT geromme, acpoment (12 — COATIGGAGAGAGTATGTGCACOCACTACTTACGGATGATTT as - 'GONNNTGAAACONNCNAGTTCGATICATOGACCGAGATGAC .AACGAACTAACAGACCTAACCCAAACCTTCCCATTAACGARG identidades =216/210 (100%) cobaias — CGTAARCTAGGTCARAAGACACOCGAAMMAGAARAAAA TOCAR Aicadios = enI0 (O, E etor da menracão ao TAACITAMAGAAAACCATTGACARACAAGEGATITAMACATA .. StrandePhus/Plus Vetor de trans.porte — AAATGGTATITGGCTGTYGAAAAGACAGIGCCATITGTECTG ria ATAGCTCACCTGGATAGAGCAACÓGOCTTCTAAGOCGTCGOT sequência 1 COGGGGTTCGAATOCCTCTCAGGACGTTAAATAGIAATGTAA | Clone ENCI6 AGAMATÇTCTAMAACUTIGAAAAGCCITGATATTAAAGOGOS AAA GATOAATGITIAOGAGTTTITITIA TATA TARA ceara ideridades =: e PATICCGTIGTTITTGIGGCATITGIGGTAMAATITGTGOTA Mentiras TOS » tais apoie raçtas TTITCATCTGTITITAGTGTGAANAAAGCATCTACTITGGACT Standenlas/Plis suÉn EGD, complete — GATTATGGTAAMAMACAACCTACTTGGGATGGTTAAGGGCACA genome, segment 6/12 — TCCATTGGAGAGAGIATGTGTANOCTCTTTGGAGGACTGATG aos 'NNAANNNGTATCCAGTTOGATTCATGGACCGAGATGACAAC 'GAACTANCAGACCTAACCCAMACCTICCCATTAACGAAGEGT identidades =209/210 (99%, emb AJUITAMDA DIDI MM CNEAMALAAOEOATA TAAAGATARA: intervalos = 219%) — vetor de intearacão AAAGAA AA) IACAAA CARD! ARA StandoPlas/Plus Tetorde Date porte ATGGTATTTGGCTGTIGAAMAAGACAGTOCCATITGTCCTGAT tz AGCICAGCTGOATAGAGCAACGGCCTTCTAAGCCGTOGATCG sequência 1 GOGGTTCOANTCCCTCTCAGGACGTTARATAGTAATGTAAAG

ARATCTCTAAAA CUT TGAAMAGCCTFGATATT AAAGOGCOGGA Clone INC16 TGASTGITITOGAGITTTITITATATCGTATAATACCCGTTTT ua cmaLMTA — ATICEGTIGITITTGTGUCATITGIGOTAAAATITOIGGTATT identidades «267M9SÉ NA — | saia monccytagenes — TICATCTGTITTTAGTGTGAMAAMAGCATCTACTTTGGETGAT intervalos = V268 (0%, . susin EGD. coaeplere — TATOGTAAATCCACCTACTTTGAATGGATAAGGTCATOTOCA StanônPhs/Pias genome segracar&eia — TTGGAGAGAGTATGIGTATCYTACTTIGTAGGGATGATGATGT

ACCACCTAGGTTGGACTGAATAGGTCCCCCCTICTTCGATTA AMCARCGGGATAMAGTA NINNNTNNCNAAGTATCCAGTTCGATTCATGGACOGAGATGA,

CACGAACTAACAGACCTAACOCAAACCTTCOCATIANCGAAG identidades =2I/21L 000%), — embaMITas2 — COTAAGTAGGTCAAAAGACACCOGAAAMAGAAMAAATICAA intervalos =0/211(0%), — vetor de intearacão ao TAACTTAMAGAAAACCATTGACARACAAGOOATITAMACATA SeandePia/Plos vetor de trans-portê — AAATGGTATITGGCTGTTGAAAAGACAGTGCCATTTATÉCTG prAz ATAGCTCAGCTGGATAGAGCAACGGCETTCTAAGOCGTOGOT sequência 1 “COGOGGTTCGAATCCETCTCAGGACGTTAMATAGTAATGTAR. Cloe IMNTIS AGAAATCTCTAAAACGTTGAAAAGCCTTGATATTAAAGGGOSG 'GATGAATGTTITGGAGTTTTITITATATOGTATAATACCOGTT identidades « 266/2168 (99%9, paca TTATTCCGTIGTTI TTGTGGCATTTGTGGTAAAATITGTGGTA Intervalos + 2/268(0%). A EGO, comglas — TUTTCATCTGTITTTAGIGTGAMAAAGCATCTACTTTGGACT Stand=Piç/Plis pmona, euenemo — GATTATGTAAMACAACCTACTTTGGATGGATTAGGTAATATC

TTVITGACAGAGTATGTGTACCATCTTTITAGGACTGATTATO

TA a marea Et a t——— E, Nomefiniciador — repárier Blast Referência? Sequência p Nomelniciadar — repêntetiasOOO O CA ana DI Ao a * NNNNANNAAAAACGNATGAAATACCACAAATTITACCACAA

ATOCCACAAAMACAACGGAATAARACGGOTATTATACGATA + identidades = 172/176 7%), embaMITMO2 — TARAAAAAACTOCAAMAACATICATCOGCCCTTTAATATOAAG intervalos = 3176 (1%), wetor de intearacão 20 é Strend=Plus/Mimus vetor de transpone — GCTTITCAACGTTITAAMAGATTTCTITACATTACIATTTAACG . prl2 TCCTGAGAGGGATTOGAACCCCCGACCOACIGETTAAAAGE 7 gequência | COGTTGCTCTATCCAGCTGAGOTATCAGGACAAATÓGCACTG Cloné LPLOS TCTTTTCAACAGCCAAATACCATTITATGTITTAAATCGCOTTGT

TTGTCAATOGTTITCTITAAGITATIGCATITITICITITTCO N enbALSII9IS.1 posa Lideria mosccyingens . GOTGTCTITTGACCTATITACGCTTCGITAATGGGAAGOTTT Sumôntias Minas vaia EGD, cometa 'GOGTTAGGTCTGTTAGTTOGTTGTCATCTOGGTCCATGAATC . Benea, sepnent SH2 — q, ACTIGGATACCTTCTGGTGTTGAATCGATAAGAGCGTATG

TTTTGAACAMCCACCTACÇTITGOGACTGATTAGGTAA TNNTNNANACGATGACATACCAÇAAATTTTACCACAAATGCOC

ACAAAAACAACGOGAATAAAACGGGTATIATACGATATAAMA identidades = 165/168 (98%%), emb AMIDAS2 ARAACTCCAAMACATTCATOCGOCCTITAATATCAAGGCTTT intervalos = 1/168 (0%), vetor de intearacão so. — TCAACGTTITAAAGATTTCITTACATTACTATITAACGTCCTG Swamd-Plas/Mina Vetor de trans.porte — AGAGGGATTCGAACCCCOGACOGACAGCTTARAAGOCCGTT + pri 'GCTCTATOCAGCTGAGCTATCAGGACAMATGGCACTGTCTIT *: ência 1 TCAACAGOCAAATACCATTTITATGTTTAAATCGCTTGTITGTC | sequência ARTGGTTITCTITAAGTYATTGCATTITIICTIITICGOGOTOT une UPLSS CTIITGACCTAGITACGCTTCGTIAATGGGAAGGTTTGGGTT exala, ASGTCIGITAGTICGITOTCATCTCGGTCCATGAATCGAACT a identidades =292/293 (99%), Limeri je TGGATACCTTOTGGTGTTGAATOGATAAGAGCNNTGGTTITT intenralos = 0/293 (0%), suaia EGD, netas 'GTANACAAAACCTITTACTITGGACTGAATAAGGTÁCCCCCC Semó-Plus/Mins gesome. segmentó/i2 — CITGTAMAGGTTTTATGTGAACONCCTITGTAGAGTIAATIT

GOAACCACCGAGGCGGGATTGATTAGGCCACOCTOCETITAR GTITCAGOTGGGCGACAN NNTTAGNT, ARAACGATGAAATACCACAAATTTTACCACAAAT

GCOCACAAAAATAACGGAATAAAAOGGGTATTATACGATATA identidades = 171/174 (98%, exbAHMITMI2 — ARAAAAACTCCAAAACATICATCOGCCCTTITAATATCAAGGC intervalos = 2N174 (199). vetor de intearacão ao TITICAAMCGTITIAMAGATTTCITTACATIACTATITAACGTC Suend=Phus/Minas vetor de trans-porte CIGAGAGGGATTICGAACOCOCGACOGACGGCTTAAAAGGCC sri2 GTTGCTCTATCCAGCTGAGCTATCAGGACAAATGGCACTGTC sequência 1 TTTTCAACAGCCAAATACCATTITATGTTTAAATCGCTTGTTT Clone VPLOIS GTCAATGGTITICTTTAAGTTATIGCATITITICITIITCGGG

TGTCTITTGACCTAGTTACGCTTOGTTAATGGGAAGGTTTGG idertidades =301/302 (999, — MEALSPISTAI > grTAGGTOTGTTAGITCGTTGTICATOTCOGTCCATGAATCGA intervalos = 0/302 (0%). a Antão ACTIGGATACCTTCIGGIGTIGAATOGATAAGAGCGTATOTT Strand=Plos/Minms Benome, segmen: PT TITGACCAAOCATCAACTTTGGACGGATTAGGTAACCTCCAT "TEIGAGAGAGTATATGTAACACCTATTTIGGGAGGTATGATGA : AAAN

TNNNNGTANAAANGATGAAATACCACARATTTIACCACAAA TGOCACAAAAACAACGGAATAAMACGGGTATTAT! ACGATAT identidades = 167/168 (99%), emb AII7409 3 ABAARAAAACTCCAMAACATTCATOCGOCCTITAATATCAAGG intervalos = 168 (0%), vetor de intearacão 2o — CTITFICAACGTTITAGAGATTTCTITACATIACIATITANCOT Striad=Plus/Mimas. vetor de trans-potê — crTGAGAGGGATTCGAACCOCCGACCGACGGCTTAAMAGECT P.. nn” COTIGOTCTATCCAGCTGAGCTATCAGGACAAATGGCACTOT uess CTTTICAACAGCOCAMATACCATTTTATGTTTAMATOGCTTGTT

TGTCAATGGTTTTCTITAAGTTATTGCATTTIITOIIIITOSS + eibALSSI978.) GTGTCTITTIGACCTAGTTACGOTTCGITAATGGGAAGGOTTTG aa CALDO, * —Ligcbmoncenagess — GGTTAGGTCTGITAGTTCGITGICATCTCOGTCCATOANTOG Sumd=PlasMims seia POD, ts AACTTGGATACCTTCTGGTGTIGAATCGATAAAAGOGTATGT son sem TITOAAAAACCATCANCTTTGAACGGATTAGGTAACCTCCAT : TITGGAGAGA a — Refere-se ao relatório Blast b- Como obtido pelo sequenciamento A digestão de restrição é realizada usando-se enzimas de restri- ção FastDigestê BamHlI e Sall disponíveis de Fermentas (Fermentas Inter- national Inc., Burlington, Canada) de acordo com as instruções do fabricante.

: 29/43 Um volume total de reação de 20 ul é incubado por uma hora a 37ºC. A des- fosforilação do vetor e os fragmentos de IAC antes da ligação é realizada o usândo-se FastAPO Thermosensitive Akaline Phosphatase (Fermentas) de acordo com as instruções do fabricante por 30 minutos a 37ºC. DNA ligase : 5 T4(Fermentas)é usado para ligação do vetor pPL2 e o fragmento IAC artifi- cial durante a noite a 4ºC.

A detecção da PCR em tempo real de Listeria monocytogenes por visualização de um fragmento de 274 pb do gene prfA é realizada de acordo com o formato previamente publicado usando-se os iniciadores Lip1 eLip2ea sonda Lip rotulada de FAM (D'Agostino e outros, (2004 (D'Agosti- o no e outros . (2004) J. Food Prot. 67, 1646-1655; Rossmanith e outros o (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771). | | A detecção da PCR em tempo real do fragmento IAC artificial é feita de acordo com Rossmanith e outros. (2006) usando Lip1 e Lip2 e pLu- cim4 HEX-rotulado. O iniciador dianteiro (Lip1 :S-GATACAGAAACATCGGTTGGC- 3 e o iniciador inverso (Lip2:5-GTGTAATCTTGATGCCATCAGG-3') ampli- | ficam um fragmento de 274 pb do gene prfA. Dois diferentes formatos de sonda TaqMan (TM) temperatura de fusão aumentada são usados. A sonda Lip(5-FAM- CAGGATTAMAAGTTGACCGCA-MGB-3') usa uma modificação MGB. A sonda para o IAC do ensaio (pluclLm 4: 5-HEX- TTCGAA- ATGTCCGTTCGGTTGGC -BHQ1-3") é rotulada com HEX. Os iniciadores e a sonda pLucLm 4 podem ser adquiridos de MWG Biotech (Ebersberg, Ger- many). à sonda MGB-modificada é adquirida de Applied Biosystems. A PCR convencional para a confirmação da inserção de pPL2-IAC ao genoma EG- De de A-prfA de Listeria monocytogenes é realizada usando-se os iniciado- res NC16 e PL95 (Lauer e outros . (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186). |- AC+, A-príA L. monocytogenes EGDe é identificada como EGDe de Listeria monocytogenes por amplificação do lócus jap de Listeria monocytogenes de — acordocom Bubert e outros . (1999, Appl. Environ. Microbiol. 65, 4688-4692) visando o gene rRNA 168 específico para todas as espécies Listeria e o ge- | ne hly específico para Listeria monocytogenes de acordo com Border e ou-

. 30/43 tros. (1990, Lett. Appl. Microbiol. 11, 158-162). Reações da PCR convencional e de tempo real são realizadas ; : em um termociclador Mx3000p da PCR em tempo real (Stratagene, La Jolla, CA, USA).O volume total de 254! contém 20 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 3.5 Ú 5 mM MgCI2, 500 nM de cada iniciador, 250 nM de cada sonda, 200pyM (cada) de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 1,5 U de Taq DNA polimerase PlatinumO (Invitrogen, Lofer, Austria); e 5 ul de DNA isolado. A amplificação seguinte à desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos é feita em 45 ciclos, a 94ºC por 15 s, e 64ºC por 1 minuto. Para o DNA padrão para quantificação da PCR em tempo real Cê um mililitro de uma cultura pura de Listeria monocytogenes linhagem EGDe a é submetido ao isolamento do DNA usando-se um kit de tecido NucleoSpinO& e o protocolo de suporte para bactérias Gram-positivas. A concentração do DNA é medida fluorimetricamente usando-se um dispositivo Hoefer DyYNA

15. Quant200 (Pharmacia Biotech). O número de copias do gene prfA é deter- minada presumindo-se que, com base no peso molecular do genoma de Lis- teria monocytogenes, 1 ng de DNA equaliza 3,1 x 10º cópias de todo o ge- noma, e de que o gene prfA é um gene de cópia única. A inclinação da curva padrão é usada para calculo a eficiência (E) da PCR com a seguinte equa- | 20 ção E=10""º-1[21]. Os resultados da PCR em tempo real são expressos como equi- | valentes de célula bacteriana (BCE), O número de cópias do gene prfA e do inserto IAC é determinado presumindo-se, no fato de que, com base no peso l molecular do genoma de Listeria monocytogenes, 1 ng de DNA é igual a 3,1 | 25 x10º cópias de todo o genoma, e de que o gene prfA e o inserto IAC são um gene de cópia única. e um inserto de cópia única dentro do genoma, respec- tivamente. (Nelson e outros, (2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395). To- ! das as reações da PCR em tempo real são realizadas em duplicata exceto se observado em contrário. Os produtos da PCR de PCR convencional são separados em 1,5% de geles de agarose a 90V por 25 minutos e manchados com 0,5 pg/ml de brometo de etídio (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany).

. 31/43 GeneRuler 100 pb (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) foi usado como ' um padrão. i o 1.3 Extração e Medição do DNA Ú : O DNA genômico de um mililitro de cultura bacteriana noturna é extraído usando-se o kit de tecido NucleoSpin& (Macherey - Nagel) e o pro- tocolo de suporte para bactérias gram-positivas. DNA de plasmídeo para experimentos de clonagem é extraído usando-se o kit Quiagen Plasmid Midi. (Hilden Germany) de acordo com as instruções do fabricante. A concentra- ção do DNA é analiticamente determinada por medição fluorimétrica usando- seum aparelho Hoefer DYNA Quant200 (Pharmacia Biotech, San Francisco, CU CA, USA) e um Espectrofotometto 8452A Diode Array o (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA).

1.4 Clonagem de pPL2-IAC i Quantidades adequadas do IAC (IAC: 5-GAT ACA GAA ACA

TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA

AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3') para clonagem são produzidas por amplificação do fragmento de 100 pb por PCR convencional de acordo com Rossmanith e outros, (2006, | REs. Microbiol 157, 763-771) usando-se os iniciadores modificados LipBam e LipSal contendo os sítios de restrição BamHI e Sall. Após purificação do produto de amplificação usando NucleoSpin& Extract 1! (Macherey-Nagel) a digestão da restrição e a desfosforilação são realizadas conforme descrito acima, seguindo-se a ligação com o vetor pPL2. Antes da ligação ao vetor de integração ao fago pPL2 ser transformada em E. coli TOP 10F' por técni- cas de choque térmico padrão (Sambrook e outros, (1989) Molecular Clo- ning: a laboratory manual 2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) para amplificação. O vetor é extraído como descrito a- cima e usado para ligação após purificação, digestão de restrição e desfos- forilação. O plasmídeo resultante pPL2-IAC é a seguir transformado em E. —coliTOP1OF' via choque térmico. Os clones positivos de pPL2-IAC são sele- cionados por deposição em caldo Luria-Bertani (LB; Oxoid) contendo 25 pg/ml de cloranfenicol.

: 32/43 Colônias bacterianas simples são coletadas e selecionadas para : transformação positiva de E. coli com pPL2-IAC. A analise de digestão por o restrição resulta em dois fragmentos de um comprimento de — 6.000 pb e 100 pb correspondendo aos comprimentos do vetor e do inserto indicando a i 5 transformação de pPL2-IAC em E. coli. POR em tempo real visando o IAC usando pLucLm4 resulta na amplificação do alvo, confirmando assim, a aná- lise de digestão por restrição. (Figura 1A).

1.5 Transformação de pPL2-IAC em A-prfA Listeria monocytogenes EGDe A-prfA Listeria monocytogenes EGDe é transformado com pPL2- * IAC usando-se um protocolo de eletroporação modificado (Park e outros ., VU (1990) Gene 94, 129-132). Células eletrocompetentes de EGDe de A-prfA o Listeria monocytogenes são preparadas como a seguir: As células são culti- vadas em caldo de infusão de cérebro-coração (BHI; Oxoid) contendo 5 pg/ml de penicilina G a um ODgoo de 0,3 à 37ºC. As células são coletadas a 8000xg,10 minutos a4C e o precipitado é lavado duas vezes em 1/10 vo- lume de tampão 3,5 x SM HEM (72 mM sacarose, 1 mM MgCl; e 2 mM de HEPES). Após ressuspensão do precipitado em 1/100 volumes, tampão 3,5 “x SMHEM 100 ul de alíquotas são armazenadas a -80ºC. : Para a eletroporação 100 ul de alíquotas de EGDe de A-prfA Lis- teria monocytogenes eletrocompetente são descongeladas em gelo sendo misturadas com 5 ul de suspensão de DNA (-1 pg/reação) contendo pPL2- IAC. Após incubação por um minuto em gelo, é feita a eletroporação (1000, 50 uF, 1000 V) em um sistema de eletroporação Gene Pulser Xcell'" (Bio- Rad Laboratories, Inc, Hercules, Ca, USA). Um mililitro de BHI pré-aquecido é adicionado, sendo.a amostra incubada 6h a 37ºC e a seguir depositada em placas de Agar BHI contendo 25 pg/ml de cloranfenicol. Após 24 - 48 horas de incubação a 37ºC, são coletadas colônias individuais e selecionadas quanto a clones de EGDe de A-prfA Listeria monocytogenes positivas para pPL2-IAC.

1.6- Confirmação del AC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe Quatro clones positivos da seleção com cloranfenicol de IAC+ EGDe de A-prfA Listeria monocytogenes são confirmados p teste da presen-

. 33/43 : ça da sequência IAC em EGDe de A-prfA Listeria monocytogenes. Realiza- Í se isto por amplificação do fragmento de 100 pb do IAC usando uma sonda : . pLucLm4. DNA genômico de IAC+, EGDe A-prfA Listeria monocytogenes é | submetido a PCR em tempo real resultando na amplificação positiva (Figura ' 5 18). Os clones testados adquirem um valor Ct médio de 11,5 (desvio padrão SD): 0,16), correspondendo a uma média de 5,36 x 107 cópias. O estado do A-prfA da cepa clonada é testado por PCR em tempo real usando a sonda ' Lip-sonda hibridizando o fragmento de 274 pb do lócus de prfA de Listeria monocytogenes do tipo selvagem, resultando na amplificação negativa. A integração do vetor ao genoma é testada com PCR conven- VU cional conforme descrito no parágrafo 1.2. Os fragmentos resultantes após ee eletroforese correspondem ao comprimento proposto do produto de amplifi- cação de 499 pb (Figura 2C) Isto indica a inserção do vetor ao genoma de Listeria como os iniciadores NC16 e PL95 que permitem amplificação atra- | 15 vésdo sitio de ligação tRNA *-attBP' em sorotipo de Listeria monocytoge- nes 1/2a resultando em um amplificado híbrido contendo partes das sequên- ' cias do vetor (3') e do genoma de Listeria (5"). A análise do sequenciamento de IAC+, A-prfA Listeria monocy- fogenes EGDe é realizada usando este amplificado da PCR híbrido usando os iniciadores NC1I6 e PL95. A sequência obtida é 100% idêntica ao frag- - | mento de 210 pb do vetor de integração de transporte pPL2 e 100% idêntica a um fragmento de 261 pb de Listeria monocytogenes incluindo o sítio de ligação proposto tRNA 89.attBP' (Cepa EGDe, genoma completo, segmento 6/12; emb/AL591978.1). A confirmação do teste do IAC+ linhagem A-prfA como Listeria monocytogenes EGDe é adicionalmente realizada por PCR convencional como descrito no parágrafo 1.2. Os resultados apresentam-se na Figura 2A e B., demonstrando tamanhos de fragmento combinantes para IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDE e de Listeria monocytogenes i EGDE de controle para ambos os ensaios da PCR.

1.6 Sequenciamento de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe Os produtos da PCR dos clones positivos após amplificação são | purificados usando o kit NucleoSpin& Extract |! (Macherey-Nagel), seguindo

. 34/43 as instruções do fabricante. Í Os produtos da PCR purificados são submetidos a Macrogen : . Inc. (Seul, Coréia) para sequenciamento do DNA. As amostras são sequen- i ciadas em ambas as fitas usando os iniciadores NC16 e PL95 na reação de É 5. sequenciamento em cíclo.

As sequências obtidas são analisadas e alinhadas usando o ser- vidor BLAST disponível do website National Center for Biotechnology Infor- | mation (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLASTY/). :

1.7 PCR quantitativa em tempo real párea confirmação de inserção de cópia únicade pPL2-IAC ao genoma de EGDe de A-prfA Listeria monocytogenes e o calibração contra dados de EGDe de Listeria monocytogenes do tipo selva- .. gem Padrões de calibração de DNA genômico de IAC+, A-prfA Liste- | ria monocytogenes EGDe e EGDe Listeria monocytogenes do tipo selvagem : | 15 são comparados usando-se o ensaio de PCR em tempo real em um sistema multiplex com as sondas pLucLm4 e sonda Lip. Presumindo-se, com base | no fato de que prfA é um gene de cópia única , diluições decimais de ambos os alvos de DNA são comparados. AS diluições em dez vezes começam a 1,58 x 10º copias totalizando 5 ng de DNA genômico conforme determinado pormedição fluorimétrica e UV-VIS. Os resultados apresentam-se na Tabela 3 mostrando boa concordância com os valores Ct de ambas as sereis pa- drão. Isto também demonstra desempenho comparável de ambas as sondas nas reações. Os dados subjacentes resultam de duplicatas repetidas em quatro operações da PCR em tempo real. Para confirmação desses resulta- i dosas concentrações das culturas de IAC+, EGDe A-prfA Listeria monocy- togenes são determinadas por manchamento de viabilidade e comparados com os resultados da PCR em tempo real. O número de 3,2 x 10º (RSD: 6,7%) BCE por amostra conforme obtido por PCR em tempo real compara- se a 2,8 x 10º (RSD: 25,0% )CFU por amostra como determinado por man- chamento viável. .

. 35/43 Tabela 3 º Comparação de valores Ct após PCR em tempo real derivado de uma dilui- : . ção padrão décuplo de DNA genômico de EGDe de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e de EGDe clonado A-prf, IAC+ demonstrando inserção de cópia única de pPL2-IAC ao genoma de Listeria monocytogenes EGDe À- pra. Linhagem EGDe A-prfA EGDe wt EGDe wt contra EGDe IAC+ EGDe wt A-prfA, |- AC+ suporte

1. PCR Monoplex PCR Duplex ' Cópia Alvo valores Ct valores Ct valores Ct (SD)ºº Nº (SD)* (SD) | 1,58x10º — 16,8(0,08) 16,6(0,11) | 1,58 x 10º 20,1 (0,13) 20,0 (0,02) 19,9 (0,13) | 1,58 x 10º 23,4 (0,14) 23,1 (0,18) 23,4 (0,26) 1,58 x 10º 26,8 (,013) 26,7 (0,06) 26,7 (0,31) 1,58 x 10? 30,4 (0,07) 30,1 (0,02) 29,9 (0,68) ; 1,58 x 10º 33,8 (0,27) 34,1 (0,91) 33,4 (0,77) a - baseado na presunção de que prfA é um gene de cópia única. b - series de diluição derivadas de uma solução contendo DNA genômico 1 ng/ul representando 1,58 x 10º copias em 5 pl de matriz de DNA c-ensaiode prfá em PCR em tempo real usando sonda pLucLM4 rotulada com HEX, amplificando a sequência IAC artificial . ' d - ensaio de prfA em PCR em tempo real usando sonda Lip rotulada com FAM, amplificando 274 pb da sequência lócus prfA e - DNA genômico de EGDe Listeria monocytogenes contra 1,58 x 10º có- piasde suporte do genoma da linhagem IAC+, EGDe A-prfA em uma reação multiplex. A influência de quantidades crescentes de DNA genômico deri- ' vado de EGDe IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes no desempenho da re- ação principal amplificando o lócus prfA da cepa do tipo selvagem e o alvo bacteriano principal é investigado com PCR em tempo real multiplex. Usan- do a sonda Lip e pLucLm4, em diluições decimais de DNA do tipo selvagem

: 36/43 de EGDe Listeria monocytogenes genômico a 1,58 x 10º copias a 1,58 x 10º : são testados em uma matriz ascendente bem como descendente, contra o uma base de diluições decimais de 1,58 x 10º a 1,58 x 10º cópias de DNA : genômico IAC+, A-prfA Listeria monocytogenesEGDe . Os valores Ct resul- tantes para todas as combinações testadas desviam-se dos respectivos va- lores conforme obtido pelos experimentos monoplex do padrão genômico de ambas as linhagens com um desvio padrão médio de 0,3 para todas as combinações de concentração padrão. Exemplarmente, os valores Ct resul- tantes para uma diluição de dez vezes do DNA genômico de EGDe de Liste- riamonocytogenes são apresentados na Tabela 3 contra uma base de 1,58 GU x 10º copias de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe. . Í 1.8 Amostras de alimento contaminadas artificialmente e naturalmente Leite UHT para contaminação artificial é adquirido em supermer- cados locais sendo testado para Listeria monocytogenes negativo antes da inoculação realizando PCR em tempo real visando o lócus prfA de Listeria monocytogenes. A contaminação artificial é realizada usando uma série de 10 diluições em solução de Ringer (Oxoid) de uma cultura pura de EGDe | Listeria monocytogenes contendo 8,5 x 10º CFU/ml. 100 pl das diluições a- propriadas são adiciónados para as amostras. A série de diluição é prepara- | 20 da para conter 10º -102?, 10? -10?, 10 ? -10º e 10º -10º CFU/ml. O número | de CFU para cada etapa de diluição serial é obtido pelo método de conta- | gem de placa usando triptona de Agar de soja com 0,6% de levedura (TSA- Y; Oxoid) O experimento é realizado em triplicatas. Amostras de queijo mole naturalmente contaminadas são obti- das pela autoridade regulatória e foram originadas de um recente surto de | Listeria monocytogenes em Styria, Austria, sendo armazenadas a 4ºC. Duas amostras de duas diferentes origens de produção são processadas em qua- | druplicatas resultando em oito amostras individuais. Adicionalmente, ISO 11290-2 é realizado de acordo para cada amostra para comparação dos re- —sultados quantitativos dos experimentos com esta método padrão. (ISO 1 1290-2; ISO 1 1290-2/Amd1).

1.9. Tratamento da Amostra

. 37/43 O tratamento da amostra é feito usando-se o protocolo de lise de : matriz conforme publicado por Mester e outros . (2010) J. Food Protect. 73, : . 680- 687 and Rossmanith e outros . (2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-51 1110 “5 140 Análise Estatística ' Comparações em dois grupos. são analisadas pelo teste quadra- do de x. Valores P são calculados e os valores < 0,05 são considerados sig- nificativos.

2. Exemplos de Aplicação 21 Fenótipo de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe em OCLA VU PALCAM Agar em sanque e meio Agar RAPID' L.mono . : Em Agar de sangue IAC+ A-prfA Listeria monocytogenes EGDE não mostraram hemólise, Em Agar PALCAM IAC+, A-prfA Listeria monocy- togenes EGDe mostraram o mesmo fenótipo de EGDe Listeria monocytoge- nesdo tipo selvagem como apresentado na Tabela 2. A morfologia e cor de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe em OCLA também é semelhan- te ao do tipo selvagem exceto pela formação de halo que não se observa para IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe após 24 e 48 horas de in- cubação. Depois de 72 horas de incubação IAC+, A-prfA Lisferia monocyto- genes EGDe demonstram alguma formação halo fraca também. Colocados ' em RAPID' L mono a cepa clonada desenvolve cor branca, carecendo da característica de cor verde de EGDE Lísteria monocytogenes do tipo selva- gem em agar RAPID' L. mono.

à o E 8 8 8 ; R 2 o = S Ss S 2 E = | on el. 1 Bl TO Ê 3 o E Cc Cc : E [é + E E à 7 DP 8 | 3 3158 S >) E Fr o o. : > S > 3 C 23 SC " o E R o E = ã É 28 2 2 o | E 8 5 28S |» 8$ 2 8$ 25 8 O o Po 8 TF? 8 SS? &% 2Z< > o o o 7 E 8 o 2 2 ú SS )s o o o gs |) 8 so 8 o Ss o S 5 E& E O 9 6 je - & oz o s Q o E 8 o 2a.

S = se < .. O FS es, 8 s/l 3/8 w 3 o/& ss FS E à F : & Sole o S sã | ec E E s 8 3 SC Ss 2 % 8 8 yo o . se 8 = E s 8 SS ão & So FE E Se So 2 se o o 2ir E E DE o o o o Ot SS Dil, o 8 FC) E xl 8 o Rx 1 P e OS. & S E = o o Cc sc SE 2 2 voo > Ss e? | 3 El& & o Zz É << se os za E ã E ” ” 3 2 E. j E GE | ss S Ss DD) os BE C õ s 5 > AS E E EE 3 7 ls Ss ss Sã 2 ie 1 f=) = : 2 8. oe8 ses 52/28 588 88 se S5S Sã Zoo & Ss |S & ES &E Ss? € Ss = Fi = õ Ss S&S E 8 = 6 0/07 | e É É e 2 E E e E E E & o ES x o + + õ 3 = ' F) 23 S Ae) 323 282 o e) ro) oo gs É ” o 5 é Dê 8” DX Ss co WS FS 2 E = o 2 Ss E EIS õ go = es "Ego É Sã > E So = o O Sd & E he SS NSE 28 So " E w SS SE Ss Ê 58 2 e sS o Ss O - So 8 me -— : da H 2 E

| - 39/43

2.2 Aplicação de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe como controle Í de processo interno parra leite UHT artificialmente contaminado e queijo Í : Quargel naturalmente contaminado. ' : i Amostras de alimento tanto artificial como naturalmente conta- minadas são processadas de acordo com o método apresentado por Ross- manith e outros, (2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-511: Este método é baseado na preparação da amostra por lise da matriz alimentar e a seguir separação da bactéria alvo usando centrifugação seguido por isolamento do DNA e detecção por PCR em tempo real. É usado líquido iônico tiocianato de 1-etil-3-metilimidazólio ((emim])SCN) é usado como solvente durante a CU preparação da amostra. . | ' í Para a contaminação artificial 12,5 g de amostras de leite UHT ) são salpicadas com uma diluição serial decimal em quatro etapas de Listeria | monocytogenes EGDe tipo selvagem como descrito no parágrafo 1.8. Adi- cionalmente, é adicionado 1,4 x 10º (RSD.: 29.0%) CFU por amostra do con- trole interno de processo de amostra IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe.

O patógeno alvo principal Listeria monocytogenes EGDe tipo i selvagem é recuperado do leite UHT por um fator de 55% (RSD (desvio pa- * drão relativo): 10,9%) comprado com contagem ao mictoscópio. O desvio padrão relativo dentro de escalas log é de 10,9% representando um alto ní- vel de precisão e capacidade reprodutiva em termos de recuperação em es- : cala log indicando sem influencia de desvio do controle de processo da a- mostra interno por meio de células IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe.

O controle interno do processo de amostra indica uma recupera- ção de 49% (RSD.: 27.1 %) comparado com a contagem microscópica. Inici- almente, 1.4 x 10º (RSD.: 29.0%) CFU (unidades formadoras de colônia) por amostra resulta em 6.9 x 10º (RSD.: 27.0%) BCE após recuperação e detec- çãoporPCRem tempo real.

O sistema é a seguir aplicado a amostras naturalmente contami- nadas de queijo Quargel. Adicionalmente 1.4 x 10º (RSD.: 29.0%) CFU |-

« 40/43 AC+, A-prfA L monocytogenes EGDe são adicionados por amostra. ? As amostras são processadas de duas maneiras: Uma quantifi- Í , cação direta do valor de Listeria monocytogenes é obtida por lise da matriz e . a seguir, PCR em tempo real. Ainda, ISO 11290-2 é realizado para compa- ' 5 ração. Adicionalmente, as amostras são processadas por lise da matriz e a seguir PCR em tempo real usando um protocolo de isolamento do DNA omi- tindo a etapa da Proteinase K. Isto desvia artificialmente o desempenho de digestão e o resultado da mesma na eficiência de todo o protocolo. Os valores de contaminação por Listeria monocytogenes das amostras obtidos diretamente após PCR em tempo real, atinge uma média CU de 1.4 x 10º (RSD.: 5.9%) BCE e 1.1 x 10º (RSD.: 8,9%) BCE para as duas ' respectivas cargas de queijo Quargel. Esses valores são corrigidos de acor- do com a taxa de eficiência para CAD amostra como obtido comparando-se os valores de cada replica para o valor médio do controle de processo de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDe de 6.9x 10? (RSD.: 5.9%) BCE | após PCR em tempo real. Após esta correção a média de contaminação por | Listeria monocytogenes 1,1 x 10º(RSD.; 35,8%) BCE e 2,3 x 10º (RSD :: 10,2%) para as duas cargas. Uma correção adicional incluíndo a perda total de IAC+, A-prfA Listeria monocytogenes EGDE de células de controle do | 20 processo de 1.4 x 10º (RSD.: 29.0%) CFU a 6.9 x 10? (RSD.: 5.9%) BCE | após PCR em tempo real é feita. Resultando em 2.32 x 10º (RSD.: 36.0%) | BCE/g e 5.0 x 10º (RSD.: 9.9%) BCE/g para as duas cargas de queijo, com- parando-se com 2.07 x 10º (RSD.: 91.1%) CFU/g e 4.9 x 10º (RSD.: 73.2%) CFU/g conforme obtido por ISO 11290-2. | 25 As amostras processadas por de isolamento de DNA artificial- mente desviado tinham em média valores básicos dé 4,9 x 10º (RSD.: 6.3%) BCE e 3.7 x 10º (RSD.: 2.9%) para as respectivas cargas de queijo. Após correção como apresentado acima, as respectivas contaminações por Liste- ria monocytogenes foram 1.8x 10º (RSD.: 47%) BCE e 4.6 x10º (RSD.:

10.1%)BCE. .

. . 41/43 ê Número de referência de arquivo da requerente | International application No. ou agente: P 10/091-lwsw PCT/EP2011/002147

Ú INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO . ' (PCT Rule 13bis) A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo napágina6 linha — 1-3. . B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional O Nome da instituição depositária ts DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH to: Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) .. TInhoffenstr. 7 B 38124 Braunschweig Germany Data de depósito Número de acesso de maio de 2010 DSM 23639 C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional L) 2 páginas de recibos de depósito emitidos pela instituição depositária D. Estados designados para os quais as indicações são feitas: 1 cópia de autorização sob Regra 31(1)(d) EPC arquivada para o pedido de prioridade EP10005731.4 E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável) As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito) Para uso apenas da repartição receptora —=— Para uso apenas do Escritório Internacional —=— [X Essa folha foi recebido com o pedido inter- [Eska folha foi rêcebida pelo escritório internacio- nacional nal Responsável autorizado: Responsável autorizado: Koestel, Gilbert

« 42/43

TRATADO DE BUDAPESTE a SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPOSITO DE MI- . CROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATERIA DE ? PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL Institut far Milchlygiene Ú Department/Universitátsklinik fur Nutztiere und óffentl. Gesundheitswesen RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL Veterinãrmedizinische Universitát Wien emitido por força da tsgra 7.1 pela. ó Veterinárplatz 1 e nada OS INTERNACIONAL DE DEPÓSITO 1210 Wien Tenda abano - a Osterreich .- |. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO ; ' . - Referência de identificação fomecida pelo depositante | Número de acesso fornecido pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Delta priA/+IAC DSM 23639

11. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA O microorganismo identificado acima (1) foi acompanhado por: ( X ) descrição científica | : ( X ) designação taxonômica proposta ' (marcar com um X quando aplicável). ' UI. RECIBO E ACEITAÇÃO A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (1), o qual foi re- cebido em 20.05.2010 (data do depósito original)". IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO. O microorganismo identificado acima (1) foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requerimento para conversão). V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de re- MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH presentação da Autoridade Internacional de Depó- sito ou de oficial(is) responsável(is) Endereço : Inhoffenstr. 7 B D-38124 Braunschweig . Data: 26.05.2010 * Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacio- nal de depósito foi obtido. Formato DSMZ-BP/A(página única) 08/2006

TRATADO DE BUDAPESTE 2 SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPOSITO DE MI- ' CROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATERIA DE a. PATENTES z FORMATO INTERNACIONAL Institut far Milchiygiene Department/Universitátsklinik far DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Nutztiere o Gesundheitswesen Emitido por força da regra 10.2 pela : Veterinârmedizinische Universitát Wien AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Veterinárplatz 1 identi , 1210 Wien identificada abaixo Osterreich + Nome: Institut fúr Milchlygiene Número de acesso fornecido pela

2. *Depariment/Universitáfekdink for AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nutztiere und óffentl. Gesundheitswesen 3 Veterinãrmedizinische Universitát Wien BSM 23659 Endereço: Veterinârplatz 1 Data do depósito ou da transferência": 1210 Wien 20.05.2010 Osterreich NM. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE : A Viabilidade do microorganismo identificado acima (11) foi testado em 21.05.2010 ?. Nessa data, o referido microorganismo foi (X ) viável (9º inviável - IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TSTE DE VIABILIDADE É CONDUZIDA V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de re- MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH presentação da autoridade Internacional de Depó- sito ou de oficial(is) responsável(is) Endereço : Inhoffenstr. 7 B D-38124 Braunschweig Data: 2 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do nóvo depósito ou data de transferência ? “Noscasos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente. ? “Marcar com um X o campo aplicável * Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos Formato DSMZ-BP/9 (única página) 0196

Claims (1)

1. . 13

   REIVINDICAÇÕES : 1. Bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria mo- , : nocytogenes em que foi deletado o lócus genômico do fator transcripcional | . | PrfA, caracterizada pelo fato de compreender ao nível genômico, uma se-

   5. quência artificial que age como controle interno de amplificação (IAC).

   2. Bactéria Listeria monocytogenes de acordo com a reivindica- ção 1, em que a sequência artificial que age como IAC compreende sequên- cias de ligação ao iniciador nas extremidades 5' e 3'.

   3. Bactéria Listeria monocytogenes de acordo com a reivindica- ção2,em que as sequências de ligação ao iniciador são idênticas às se- | ' quências de ligação ao iniciador do lócus prfA genômico de Listeria monocy- ' í togenes do tipo selvagem.

   4. Bactéria Listeria monocytogenes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a sequência artificial que age como IAC é uma sequência de 100 pb de acordo com a SEQ ID NO:1.

   5. Cepa EGDe de Listeria monocytogenes geneticamente modi- ficada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a:4.

   6. Cepa EGDe Listeria monocytogenes geneticamente modifica- da, em que o lócus genômico do fator transcripcional PrfA é deletado, com- preendendo a sequência de controle interno de amplificação (IAC) de SEQ ID NO: 1, depositada em DSMZ como Listeria monocytogenes A-prfA +IAC sob DSM 23639 em 20 de maio de 2010.

   7. Uso de Listeria monocytogenes geneticamente modificada como especificado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para detecção e determinação qualitativa e/ou quantitativa da ocorrência de Listeria mo- nocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de estar con- taminada com o referido micro-organismo. .

   8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da amostra ser um alimento.

   9. Uso de Listeria monocytogenes geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, como controle interno do processo da amostra (ISPC) para um ensaio com base na PCR em tempo real. Í 10. Método para detecção e determinação da ocorrência de Lis- 7 À teria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com suspeita de 2 estar contaminada com o referido micro-organismo patogênico, compreende asseguintes etapas: a) adicionar para a referida amostra uma quantidade predefinida de células da bactéria Listeria monocytogenes geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, b) incubar a amostra com uma solução de extração, c) isolar o DNA por métodos padrão; : ] d) aplicar PCR em tempo real usando para isso (i) iniciadores í í específicos para o lócus prfA genômico de Listeria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria monocytogenes geneticamente mo- | dificada como de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (ii) | 15 uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar es- pecificamente com o referido lócus prfA e uma sonda de oligonucleotídeo fluorescente rotulada capaz de hibridizar especificamente com a referida se- quência IAC, = e) determinar qualitativa e/ou quantitativamente sinais fluores- centes gerados pela etapa (d), e ' . f) determinar e/ou calcular da etapa (e) quanto à presença e/ou a . “quantidade de células de Listeria monocytogenes do tipo selvagem na amos- tra original com suspeita de estar contaminada com o referido micro- organismo.

   11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que iniciado- res usados na etapa (d) (i) são Lip1 (SEQ ID NO: 2) e Lip2 (SEQ ID NO: 3).

   12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que as sondas rotuladas fluorescente usadas na etapa (d) (ii) são pLucLm4 (SEQ ID NO: 4) para detecção da sequência IAC, e LipProbe (SEQ ID NO: 5) para detecção do lócus prfA. '

   13. Método de acordo com qualquer uma dás reivindicações 10 a 12, em que solução de extração da etapa (b) compreende pelo menos

   : 3/3 - MgCl, e/ou um líquido iônico. ' 14. Kit para emprego em uma análise para detecção e determi- $ Ú nação de Listeria monocytogenes do tipo selvagem em uma amostra com 2 suspeita de estar contaminada com o referido micro-organismo, compreende | 5 pelomenosem uma ou mais embalagens: (1) Listeria monocytogenes geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6; (ii) os iniciadores específicos para o lócus prfA genômico de Lis- teria monocytogenes do tipo selvagem e a sequência IAC de Listeria mo- nocytogenes geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das : : reivindicações 1 a 6; e ! ' & (ii) uma sonda de oligonucleotídeo rotulada fluorescente capaz de hibridizar especificamente com o lócus prfA e uma sonda de oligonucleo- tídeo rotulada fluorescente capaz de hibridizar especificamente com a referi- dasequêncialAC.

   15. Kit, de acordo com'a reivindicação 14, em que iniciadores são Lip1 (SEQ ID NO: 2) e Lip2 (SEQ ID NO: 3).

   16. Kit de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que as son- das fluorescentes rotuladas são pLucLma (SEQ ID NO: 4) para detectar a sequência lAC e LipProbe (SEQ ID NO: 5) para detectar o lócus prfA.

   17. Método para fabricação de uma bactéria Listeria monocyto- genes geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, compreende as etapas : . (a) deletar o lócus genômico do fator transcripcional PrfA da es- pécie bacteriana Listeria monocytogenes, (b) clonagem de um vetor compreendendo um IAC, (c) transformar o vetor da etapa (b) na espécie bactéria da etapa (a).

   o Fig. 1 Ro ET IN. À A bra, A sa. Leo

   É .. Rocole] , É = ES,

   MO

   BE s 2/2 : a é Fig. 2 M1 2345678 MM 9 1011121314 M M1i1234M " Pesa EE A en dure " CU e ERES Laticínios aaiaA < [ :0>5> | A - B [9

   ” 11 é RESUMO | ? Patente de Invenção: "BACTÉRIA GENETICAMENTE MODIFICADA DA í ESPÉCIE LISTERIA MONOCYTOGENES". ' ' : i A presente invenção refere-se a uma bactéria geneticamente modificada da espécie Listeria monocytogenes, em que foi deletado o lócus genômico do fator trancripcional prfA, caracterizado pelo fato de compreen- der ao nível genômico, uma sequência artificial que age como controle inter- | no de amplificação, uso desta bactéria, bem como um método para detecção e determinação quantitativa e/o qualitativa da ocorrência de Listeria monocy- - fogenes do tipo selvagem, em uma amostra com suspeita de ter sido conta- "o minada com o referido micro-organismo, e um kit. ie : : | !

   Í