ES2471980T3 - Método de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro - Google Patents

Método de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro Download PDF

Info

Publication number
ES2471980T3
ES2471980T3 ES07817923.1T ES07817923T ES2471980T3 ES 2471980 T3 ES2471980 T3 ES 2471980T3 ES 07817923 T ES07817923 T ES 07817923T ES 2471980 T3 ES2471980 T3 ES 2471980T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
blood
biological liquid
sample
test compound
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07817923.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Gunnar Houen
David M. Hougaard
Kristin Skogstrand
Charlotte Sv�Rke J�Rgensen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Statens Serum Institut SSI
Original Assignee
Statens Serum Institut SSI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Statens Serum Institut SSI filed Critical Statens Serum Institut SSI
Application granted granted Critical
Publication of ES2471980T3 publication Critical patent/ES2471980T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Un método para preparar una muestra de sangre u otro líquido biológico para su análisis, donde dicho método consiste en (a) iniciar una reacción mediante mezcla de una muestra de sangre u otro líquido biológico con un compuesto de prueba, donde el compuesto de prueba interacciona con los componentes de la muestra de sangre u otro líquido biológico para causar una alteración en la composición de la muestra de sangre u otro líquido biológico (b) detener la reacción sembrando gotas de la mezcla de sangre u otro líquido biológico y el compuesto de prueba en papel de filtro; donde el compuesto de prueba se elige entre una toxina, un alérgeno, un autoantígeno, una proteína o un polisacárido bacterianos, una proteína viral, una proteína o un polisacárido fúngicos, una proteína o un polisacárido de un parásito o un lipopolisacárido bacteriano.

Description

M�todo de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro
5 Campo de la invención
La presente invención da a conocer un método para preparar una muestra de sangre u otro líquido biológico para su análisis mediante la mezcla de la muestra de sangre u otro líquido biológico con un compuesto de prueba y la siembra de sangre u otro líquido biológico en un papel de filtro para el análisis posterior del efecto de dicho
10 compuesto de prueba sobre la muestra de sangre o líquido.
Antecedentes generales
La sangre es una mezcla compleja compuesta por plasma y células (1-3). El plasma se puede separar de las células
15 por centrifugaci�n y otras técnicas. Si el plasma se deja en reposo coagular� y el suero se puede separar del coágulo de sangre. La coagulación puede ser inhibida por adición de diversos anticoagulantes, por ejemplo EDTA, EGTA, heparina, citrato y otros. Las células sanguíneas incluyen células dendr�ticas, macr�fagos, monocitos, neutr�filos, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citol�ticos naturales, glóbulos rojos y diversos citoblastos como los hemocitoblastos. Además est�n presentes en grandes cantidades plaquetas derivadas de megacariocitos. El plasma
20 contiene miles de proteínas, en principio cualquier proteína del proteoma humano (4, 5). Algunas de las proteínas est�n involucradas en el transporte, la coagulación de la sangre o la inmunidad, mientras que otras actúan como moléculas de se�alizaci�n entre las células de la sangre y las células de los tejidos. En particular, la actividad de las células del sistema inmunitario (células dendr�ticas, macr�fagos, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citol�ticos naturales) est� regulada por una red compleja de moléculas de se�alizaci�n (por ejemplo interleucinas, quimiocinas,
25 factores de crecimiento), ant�genos tisulares y receptores (3, 6-9). Se pueden investigar y cuantificar la actividad y la especificidad de las células del sistema inmunitario por varios métodos y ensayos. Los linfocitos T, los linfocitos B y otras células se pueden cuantificar mediante clasificación celular activada por fluorescencia usando anticuerpos contra moléculas marcadoras de la superficie c�lular (10, 11). Los linfocitos T específicos se pueden medir mediante ensayos de citotoxicidad, ensayos de liberación de cromo y ensayos de liberación de citocinas (por ej. ELISPOT)
30 (12-16) y usando diversos constructos proteicos p�ptido-complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (17, 18). La actividad de los linfocitos B se puede medir mediante la determinación de los niveles de anticuerpos específicos liberados por los linfocitos B (19, 20).
Un problema importante en la medición de las moléculas de se�alizaci�n liberadas de las células sanguíneas es el
35 del almacenamiento y transporte en relación con la cuantificación. Muchos componentes sanguíneos por ej. citocinas) son l�biles y de vida corta, lo que resulta en una degradación durante la incubaci�n, el almacenamiento y el transporte. Por esta razón, los análisis comparativos y las pruebas diagnósticas se deben llevar a cabo inmediatamente después de la extracción de la sangre y la incubaci�n en los laboratorios centrales. Idealmente, se deben analizar consecutivamente todas las muestras que se van a comparar usando un instrumento calibrado.
40 Esto no siempre es práctico, por ej. cuando se extraen muestras de sangre en áreas alejadas, cuando se hacen estudios en el tiempo in vitro e in vivo o cuando se comparan muestras de muchos individuos diferentes. Una solución a este problema es congelar las muestras para el transporte y el almacenamiento. Esto, no obstante, no garantiza la conservación de los componentes, requiere gran capacidad de congelación, transporte y
45 almacenamiento, requiere descongelar cada vez que se realiza el análisis y es vulnerable con respecto a la falta de suministro de energía eléctrica. Por esta razón, existe la necesidad de métodos confiables de conservación de las muestras de sangre y biológicas, y existe la necesidad de pruebas diagnósticas que empleen una conservación de la muestra en combinación con la manipulación de la muestra que sea confiable.
50 El uso de papel de filtro para la siembra de gotas de sangre para el análisis posterior es muy conocido, por ejemplo, para el análisis de muestras de sangre de recién nacidos en busca de enfermedades metabólicas hereditarias (21). Las ventajas de esto son la buena conservación de los componentes sanguíneos, el fácil transporte y el fácil almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, el uso de papel de filtro y de métodos similares para el secado y el almacenamiento de muestras de sangre luego de la incubaci�n con compuestos de prueba no ha sido utilizado ni
55 descrito antes posiblemente porque se preveía que fuera imposible o impracticable.
Skogstrand et al (22) dan a conocer un método para preparar una muestra de sangre para el análisis que consiste en sembrar gotas de sangre en papel de filtro, permitir que se sequen y posteriormente analizar dichas muestras de sangre seca en busca de marcadores inflamatorios.
60 Aburuz et al (24) y Koal et al (25) dan a conocer métodos para preparar una muestra de sangre en la que la sangre se siembra como gotas en papel de filtro, se seca y posteriormente se analiza.
Resumen de la invención
Esta invención da a conocer un método para preparar una muestra de sangre (u otro líquido biológico) para análisis, donde dicho método consiste en
5 (a) iniciar una reacción mediante mezcla de una muestra de sangre (u otro líquido biológico) con un compuesto de prueba, donde el compuesto de prueba interacciona con los componentes de la muestra de sangre (u otro líquido biológico) para causar una alteración en la composición de la muestra de sangre (u otro líquido biológico)
(b) detener la reacción sembrando gotas de sangre (u otro líquido biológico) en papel de filtro; donde el
10 compuesto de prueba se elige entre una toxina, un al�rgeno, un autoant�geno, una proteína o un polisac�rido bacterianos, una proteína viral, una proteína o un polisac�rido f�ngicos, una proteína o un polisac�rido de un parásito o un lipopolisac�rido bacteriano.
Divulgaci�n detallada de la invención
15 La presente invención da a conocer un método que consiste en mezclar una muestra de sangre u otro líquido biológico con un compuesto de prueba y sembrar gotas de sangre u otro líquido biológico en papel de filtro para el análisis posterior del efecto de dicho compuesto de prueba sobre la muestra de sangre u otro líquido biológico. El líquido biológico puede ser líquido cefalorraqu�deo, líquido peritoneal, líquido qu�stico, líquido amni�tico, líquido de
20 lavado, saliva, extracto celular o extracto tisular. El compuesto se elige entre un amino�cido, un p�ptido, una proteína, un carbohidrato, un oligosac�rido, un polisac�rido, una glucoprote�na, un lípido, una lipoprote�na, un glucosaminoglucano, una hormona, un esteroide, una vitamina, un compuesto sintético o natural de bajo peso molecular que afecta a la sangre para causar una alteración de su composición por ejemplo una toxina, un al�rgeno, un autoant�geno, una proteína o un polisac�rido bacterianos, una proteína viral, una proteína o un polisac�rido
25 f�ngicos, una proteína o un polisac�rido de un parásito o un lipopolisac�rido bacteriano o cualquier otro compuesto relacionado con las enfermedades.
El método según la invención analiza la muestra para determinar el contenido de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento y/o neurotransmisores y otros polip�ptidos y proteínas por ej. CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, anticuerpos
30 específicos (por ej, específicos del ant�geno), transferrina, albúmina o transtiretina.
El efecto del compuesto de prueba se analiza mediante inmunoensayo, bioensayo, espectrometr�a de masas, HPLC, GC, GC-MS por ejemplo ensayos ELISA, ensayos FLISA, ensayos DELFIA, ensayos Luminex, ensayos de luminiscencia, ensayos de electroquimioluminiscencia, ensayos de proximidad de centelleo, radioinmunoensayos,
35 MALDI-MS, ESI-MS y MS ambiental (por ej. DESI-MS).
Tambi�n se da a conocer un método de mezcla de sangre u otro líquido biológico con un compuesto de prueba y la siembra de gotas de la mezcla en papel de filtro para el almacenamiento, el transporte o la manipulación antes del análisis posterior del efecto del compuesto de prueba sobre la sangre, el líquido biológico o la muestra.
40 Definiciones:
Analito significa cualquier compuesto que se puede detectar o cuantificar por medios analíticos.
45 Por el efecto del compuesto de prueba se entiende que éste interacciona con los componentes de la sangre o cualquier otro líquido biológico o muestra para causar una alteración de cualquier tipo en la composición de la sangre.
Secado significa eliminación del agua.
50 Papel de filtro significa cualquier trozo de papel, tela u otro material adecuado para recoger, secar y almacenar sangre.
Papel de PKU significa papel/papel de filtro utilizado para la detección sistemática del síndrome de fenilcetonuria en 55 muestras de sangre de recién nacidos.
Sembrar gotas significa aplicar una muestra de sangre o cualquier otro líquido biológico o extracto o muestra a un trozo de papel estandarizado adecuado para tomar de forma precisa muestras de sangre. La siembra de gotas se realiza aplicando un volumen fijo de sangre a un trozo de papel o aplicando sangre al papel hasta que una zona
60 definida quede cubierta de sangre. A continuación, el papel se deja secar completamente y se almacena inmediatamente en condiciones de baja humedad o se transporta a un lugar de almacenamiento para el análisis posterior.
Compuesto de prueba significa cualquier sustancia o compuesto químico, biológico o físico que se pueda mezclar
con, o añadirse a, sangre o cualquier otro líquido biológico o muestra.
Muestra significa cualquier formulación o mezcla de compuestos de prueba.
Se utilizan las abreviaturas siguientes:
BCG significa Bacillus Calmette-Guerin
BDNF significa factor neurotr�fico derivado del cerebro
BSA significa seroalb�mina bovina
CRP significa proteína C reactiva
DBSS significa muestra de gotas de sangre seca
EGF significa factor de crecimiento epid�rmico
ELISA significa enzimoinmunoan�lisis de adsorción
ELISPOT significa enzimoinmunoan�lisis de recuento de puntos
ESI significa ionizaci�n por electronebulizaci�n
FLISA significa inmunoensayo fluorescente
GC significa cromatograf�a de gases
G-CSF significa factor estimulante de las colonia de granulocitos
GM-CSF significa factor estimulante de las colonias de granulocitos y macr�fagos
HPLC significa cromatograf�a líquida de alto rendimiento
IFN significa interfer�n
Ig significa inmunoglobulina
IGF significa factor de crecimiento semejante a la insulina
II significa interleucina
LPS significa lipopolisac�rido
MALDI significa desorci�n/ionizaci�n láser asistida por matriz
M-CSF factor estimulante de las colonias de macr�fagos
MCP significa proteina quimioatrayente de monocitos
MHC significa complejo mayor de histocompatibilidad
MIF significa factor inhibidor de la migración de macr�fagos
MIP significa proteína inflamatoria/inhibidora de macr�fagos
MMP significa metaloproteasa de matriz
MS significa espectrometr�a de masas
NT significa neurotrofina
PBS significa solución salina amortiguada con fosfato
PCR significa reacción en cadena de la polimerasa
PKU significa fenilcetonuria
PPD significa derivado proteico purificado
TGF significa factor de crecimiento transformante
TNF significa factor de necrosis tumoral
TREM significa activación de receptores expresados en células mieloides
VEGF significa factor de crecimiento endotelial vascular
La presente invención da a conocer un método en el que la reacción entre un compuesto de prueba y una muestra de sangre o cualquier otra muestra de líquido biológico se inicia, se deja continuar por un tiempo determinado y después se detiene sembrando gotas y/o secando la muestra en un papel de filtro que se utiliza posteriormente para el análisis del efecto del compuesto de prueba sobre la muestra de sangre o líquido y cualquiera de sus componentes.
En una realización preferida se extrae una muestra de sangre (por ejemplo 10 ml) de una persona utilizando recipientes para sangre con anticoagulantes, EDTA, heparina o citrato estándar o tubos de vidrio. La muestra de sangre se divide en dos alícuotas y se agrega un compuesto de prueba a una alícuota de la sangre, mientras que la otra alícuota se utiliza como una referencia de control a la cual se añade solamente el tampón/la solución en que se disuelve el compuesto de prueba. El compuesto de prueba también se puede agregar como un polvo sólido para disolver directamente en la sangre. Las muestras de sangre se incuban a temperatura ambiente o a una temperatura definida (por ejemplo, 5 �C, 20 �C, 37 �C) con o sin mezcla o agitaci�n. A determinados intervalos de tiempo (por ejemplo 0.1 min, 2 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 10 h, 15 h, 20 h, 24 h, 48 h) se extraen alícuotas de las muestras de sangre y se siembran gotas en papel de filtro (por ejemplo, papel de PKU) y se dejan secar tan rápido como sea posible. Después de secar, el papel de filtro se puede utilizar inmediatamente para el análisis o almacenar para el análisis posterior. En una realización particular el papel de filtro se puede transportar (por ej. por correo ordinario) a cierta distancia antes del almacenamiento o el análisis en un laboratorio.
La siembra de gotas, el secado y el almacenamiento de la sangre se realizan de la manera siguiente: se siembran gotas de sangre en papel de filtro con un tubo capilar, una pipeta o similar en una sola capa y se secan a
temperatura ambiente, por ejemplo, en una campana bien ventilada o en un lugar al ambiente. Para el almacenamiento, los papeles de filtro se pueden mantener en sobres de papel, bolsas de plástico o recipientes similares, preferentemente recipientes herméticos para mantener la humedad lo más baja posible. Es preferible una temperatura de almacenamiento de -20 �C o inferior, pero también es posible a temperatura ambiente siempre y cuando el papel se mantenga seco. Sin embargo, el almacenamiento puede tener lugar a temperatura ambiente o a una temperatura inferior a 0 �C (por ej., -20 �C, -50 �C, -80 �C, -180 �C) siempre que la humedad se mantenga baja para evitar el deterioro de las muestras. Las muestras se pueden almacenar durante períodos prolongados de tiempo (por ej. meses o años).
Los compuestos de prueba son toxinas, al�rgenos, autoant�genos, proteínas y polisac�ridos bacterianos, proteínas virales, proteínas y polisac�ridos f�ngicos, proteínas y polisac�ridos de parásitos o lipopolisac�ridos bacterianos. El uso de estos compuestos de prueba aportar� un importante conocimiento sobre cómo un determinado compuesto afecta a las células y las señales entre las células.
En una realización, el método se usa para determinar el efecto de los compuestos tóxicos sobre la sangre, por ejemplo como parte de un programa de pruebas toxicológicas o un programa de ensayos precl�nicos.
El análisis de las muestras de sangre seca se puede llevar a cabo por diversas técnicas (por ejemplo inmunoensayo, bioensayo, espectrometr�a de masas, HPLC, GC, GC-MS). Los métodos preferidos de análisis son los ensayos ELISA, ensayos FLISA, ensayos DELFIA, ensayos Luminex, ensayos de luminiscencia, ensayos de electroquimioluminiscencia, ensayos de proximidad de centelleo, radioinmunoensayos, MALDI-MS, ESI-MS y PCR.
La extracción de DBSS se puede llevar a cabo utilizando cualquier tampón o solvente adecuado. En una realización preferida, se perforan discos de papel de filtro, por ejemplo de 3.2 mm de diámetro, de DBSS o patrones en papel de filtro y se colocan juntos en pocillos de microtitulaci�n. Se agregan a cada pocillo 140 μl o 180 μl (para mediciones dobles o triples, respectivamente) de tampón de extracción, PBS con "cóctel inhibidor de proteasa completo con ácido etilendiaminotetraac�tico (EDTA)" (Roche, Alemania) 1 comprimido disuelto por 25 ml de tampón de ensayo (PBS con 0.5 por ciento de Tween 20 y 1% de BSA), y los analitos se extraen protegidos de la luz a temperatura ambiente en un agitador de placa fijado a 600 rpm, durante 60 minutos.
En una realización de la invención, los analitos se miden mediante un ensayo Luminex de la manera siguiente: se realiza el acoplamiento de anticuerpos de captura a perlas carboxiladas (Luminex corp., Austin Texas, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante: 2.5 X 106 perlas se lavan dos veces con tampón de activación (0.1 mol/l de fosfato de sodio, pH 6.2), se resuspenden en 80 μl de tampón de activación y se someten a ultrasonido hasta que se observa una distribución homogénea de las perlas. Se agregan 10 μl de soluciones de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS de Pierce, Rockford EE.UU.) y 10 μl de clorhidrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC de Pierce), ambos diluidos en tampón de activación a una concentración de 50 mg/ml, para estabilizar la reacción y activar las perlas. Después de mezclar, las perlas se incuban durante 20 min girando en la oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente las perlas activadas se lavan con tampón de acoplamiento (mmol/l de ácido 2-(N-morfolino etanosulf�nico, MES), pH 5.0), se agregan 500 μl de solución de anticuerpo de captura exenta de azida (100 μg/ml) y se incuban girando durante 2 horas o toda la noche. La azida se elimina de los anticuerpos por di�lisis (cassette de di�lisis Slide-A-Lyzer�, MWCO = 10 000 de Pierce) en 3 l de PBS durante la noche a 4 �C. Después de la incubaci�n, las perlas se lavan con tampón de lavado (PBS con un 0.05% de Tween 20) y se resuspenden en 75 μl de tampón de bloqueo/almacenamiento (PBS con 1% de seroalb�mina bovina (BSA) y 0.05% de azida sádica).
Las perlas se cuentan con un hemocit�metro, se ajustan hasta una concentración de 20 X 106 perlas/ml con el tampón de bloqueo/almacenamiento y se almacenan protegidas de la luz a 2-8 �C.
El procedimiento del ensayo se realiza de la manera siguiente: una placa de filtro (MultiScreen MABVN 1.2 μm 96 pocillos, Millipore, Burlington EE.UU) se prepara humedeciéndola previamente con tampón de ensayo (PBS con 0.5% de Tween 20 y 1% de BSA). A cada pocillo se le agregan 50 μl de muestra transferidos con pipeta desde los pocillos de microtitulaci�n luego de la extracción (100 μl divididos en duplicados o 150 μl divididos en triplicados) y una suspensión de 50 μl de perlas conjugadas a anticuerpos de captura, 1500 perlas por analito en tampón de ensayo que contiene 1% de suero de conejillo de Indias/cerdo (1:1). Los anticuerpos de captura reaccionan con los ant�genos correspondientes durante 1½ hora de incubaci�n y el material sin unir se elimina de las perlas filtr�ndolo a través de los pocillos utilizando un colector de vacío MultiScreen (Millipore). Las perlas se lavan dos veces con 200 μl de tampón de lavado (PBS con 0.5% de Tween) por pocillo. Los ant�genos ahora capturados se hacen reaccionar durante 1½ hora con una mezcla (50 μl) de anticuerpos de detección biotinilados cada uno diluido 1:1000 en tampón de ensayo. Se agregan 50 μl de estreptavidina-ficoeritrina 20 μg/ml en tampón de ensayo (Molecular Probes, los Países Bajos) a los pocillos y la incubaci�n continúa durante otros 30 minutos. Las perlas se lavan finalmente dos veces con 200 μl de tampón de lavado y se resuspenden en 125 μl de tampón de lavado. Después de 15 minutos de agitaci�n, las muestras se analizan en el Luminex 100™ según las instrucciones del fabricante.
En una realización preferida, las muestras se analizan para determinar el contenido de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento (por ejemplo las interleucinas como II-1, II-2, II-3, II-4, II-5, II-6, II-7, II-8, II-9, II-10, II-11, II12, II-13, II-14, II-15, II-16, II-17, II-18, II-19, II-20, II-21, II-22, II-23, II-24, II-25, II-26, IFN, TNF, MCP, MIP, MMP-9, TREM, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, quimiocinas como CC, CXC, factores de crecimiento como TGFα, TGFβ, EGF, VEGF, IGF I, IGF II, insulina, mediadores inflamatorios como histamina, prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos)
5 y/o neurotransmisores.
En otra realización las muestras se analizan para determinar parámetros cl�nicos estándar y específicos como CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, anticuerpos específicos (por ejemplo, específicos del ant�geno), transferrina, albúmina, transtiretina, etc.
10 En otra realización el líquido biológico que se va a analizar es líquido cefalorraqu�deo, líquido peritoneal, líquido qu�stico, líquido amni�tico, líquido de lavado, saliva, extracto celular o extracto tisular.
A�n en otra realización la fuente de células son líneas celulares o células sanguíneas aisladas, células manipuladas, 15 células transg�nicas, células transinfectadas o cualquier tipo de célula o tipo de célula alterada o manipulada.
La invención se puede aplicar a la sangre y otros líquidos corporales y extractos tisulares de cualquier especie y tipo de animal (por ej. ser humano, mono, ratón, rata, vaca, perro, caballo, gato, ave, pez y cualquier otra especie) incluidos los animales transg�nicos.
20 En una realización especial el compuesto de prueba se inmoviliza en una superficie sólida (por ejemplo, papel de filtro) y luego se incuba con una muestra de sangre o líquido o extracto biológico. Luego de la incubaci�n, el papel de filtro se deja secar o la sangre se siembra en gotas en el papel de filtro y se seca.
25 En un uso particular de la invención, el volumen de sangre, líquido o extracto biológico se ajusta para permitir la interacción con un compuesto inmovilizado o un compuesto en solución durante un tiempo fijo mientras se seca al mismo tiempo en el papel de filtro.
Las muestras de sangre pueden ser extraídas de individuos de prueba utilizando equipos y agujas estándar, y por 30 personal capacitado. Sin embargo, la extracción de sangre puede también se puede llevar a cabo utilizando dispositivos que permitan la toma de muestra individual local.
Ejemplos
35 Ejemplo 1. Extracción, incubaci�n, siembra de gotas, secado y almacenamiento de sangre.
Se extraen 10 ml de sangre de una persona de prueba en un tubo de ensayo con anticoagulante utilizando una jeringa y aguja estériles. La sangre se divide en alícuotas de 1 ml utilizando tubos de ensayo con anticoagulante estériles. De una muestra se siembra directamente en el papel una muestra de sangre hasta que se llene el círculo 40 marcado (el volumen utilizado es de aproximadamente 0.2 ml). A los otros tubos de ensayo se les agregan los compuestos de prueba en concentraciones predeterminadas y los tubos de ensayo se incuban a 37 �C o a temperatura ambiente durante 1 hora. Después se siembran muestras de 0.2 ml de cada tubo en papel de filtro. Las muestras de sangre se siembran en papel de filtro con un tubo capilar, una pipeta o similar en una sola capa y se secan a temperatura ambiente, por ej. en una cámara bien ventilada o en un lugar al ambiente. Después las
45 muestras se almacenan a -20 �C o a temperatura ambiente en condiciones de baja humedad, de modo que el papel se mantenga seco. Con este fin, se pueden utilizar congeladores corrientes y los papeles se pueden mantener en sobres o en desecadores.
Ejemplo 2. Extracción de papel de filtro y análisis.
50 Se perforan dos discos de papel de filtro, de 3.2 mm de diámetro, de DBSS o patrones en papel de filtro y se colocan juntos en pocillos de microtitulaci�n. Se agregan a cada pocillo 140 μl o 180 μl (para mediciones dobles o triples, respectivamente) de tampón de extracción, PBS con "cóctel inhibidor de proteasa completo con ácido etilendiaminotetraac�tico (EDTA)" (Roche, Alemania) 1 comprimido disuelto por 25 ml de tampón de ensayo (PBS
55 con 0.5 por ciento de Tween 20 y 1% de BSA), y los analitos se extraen protegidos de la luz a temperatura ambiente en un agitador de placa fijado a 600 rpm, durante 60 minutos.
Ejemplo 3. Ensayo Luminex
60 Acoplamiento de los anticuerpos a las perlas:
El acoplamiento de anticuerpos de captura a las perlas carboxiladas (Luminex corp., Austin Texas, EE.UU.) se realiza según las instrucciones del fabricante: 2.5 X 106 perlas se lavan dos veces con tampón de activación (0.1 mol/l de fosfato de sodio, pH 6.2), se resuspenden en 80 μl de tampón de activación y se someten a ultrasonido
hasta que se observa una distribución homogénea de las perlas. Se agregan 10 μl de soluciones de Nhidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS de Pierce, Rockford EE.UU.) y 10 μl de clorhidrato de 1-etil-3(3dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC de Pierce), ambos diluidos en tampón de activación a una concentración de 50 mg/ml, para estabilizar la reacción y activar las perlas. Después de mezclar, las perlas se incuban durante 20 min 5 girando en la oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente las perlas activadas se lavan con tampón de acoplamiento (mmol/l de ácido 2-(N-morfolino etanosulf�nico, MES), pH 5.0), se agregan 500 μl de solución de anticuerpo de captura exenta de azida (100 μg/ml) y se incuban girando durante 2 horas o toda la noche. La azida se elimina de los anticuerpos por di�lisis (cassette de di�lisis Slide-A-Lyzer�, MWCO = 10 000 de Pierce) en 3 l de PBS durante la noche a 4 �C. Después de la incubaci�n, las perlas se lavan con tampón de lavado (PBS con 0.05% de
10 Tween 20) y se resuspenden en 75 μl de tampón de bloqueo/almacenamiento (PBS con 1% de seroalb�mina bovina (BSA) y 0.05% de azida sádica).
Las perlas se cuentan con un hemocit�metro, se ajustan hasta una concentración de 20 X 106 perlas/ml con el tampón de bloqueo/almacenamiento y se almacenan protegidas de la luz a 2-8 �C. 15 Ejemplo 4. Procedimiento del ensayo:
Una placa de filtro (MultiScreen MABVN 1.2 μm 96 pocillos, Millipore, Burlington EE.UU) se prepara humedeciéndola previamente con tampón de ensayo (PBS con 0.5% de Tween 20 y 1% de BSA). A cada pocillo se le agregan 50 μl 20 de muestra transferidos con pipeta desde los pocillos de microtitulaci�n luego de la extracción (100 μl divididos en duplicados o 150 μl divididos en triplicados) y una suspensión de 50 μl de perlas conjugadas a anticuerpos de captura, 1500 perlas por analito en tampón de ensayo que contiene 1% de suero de conejillo de Indias/cerdo (1:1). Los anticuerpos de captura reaccionan con los ant�genos correspondientes durante 1½ hora de incubaci�n y el material sin unir se elimina de las perlas filtr�ndolo a través de los pocillos utilizando un colector de vacío 25 MultiScreen (Millipore). Las perlas se lavan dos veces con 200 μl de tampón de lavado (PBS con 0.5% de Tween) por pocillo. Los ant�genos ahora capturados se hacen reaccionar durante 1½ hora con una mezcla (50 μl) de anticuerpos de detección biotinilados cada uno diluido 1:1000 en tampón de ensayo. Se agregan 50 μl de estreptavidina-ficoeritrina 20 μg/ml en tampón de ensayo (Molecular Probes, los Países Bajos) a los pocillos y la incubaci�n continúa durante otros 30 minutos. Las perlas se lavan finalmente dos veces con 200 μl de tampón de
30 lavado y se resuspenden en 125 μl de tampón de lavado. Después de 15 minutos de agitaci�n, las muestras se analizan en el Luminex 100™ según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 5. Prueba de globulina Gc, toxoide dift�rico, toxoide tetánico y lipopolisac�rido (LPS) para la liberación de citocinas 35 Las 13 soluciones siguientes se mezclan con sangre de diferentes personas y se incuban a 37 �C:
1) 1 ml de EDTA-sangre (persona X) + 30 μl de Gc lote 11 2) 1 ml de EDTA-sangre (persona X) + 30 μl de Gc lote 13
40 3) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de Gc lote 11 4) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de Gc lote 13 5) 1 ml de EDTA-sangre (persona X) + 30 μl de PBS 6) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de PBS 7) 1 ml de EDTA-sangre (persona X) + 30 μl de Gc lote 11 + 50 μl de LPS de Klebsiella pneumoniae (5
45 mg/ml) 8) 1 ml de EDTA-sangre (persona X) + 50 μl de LPS de Klebsiella pneumoniae (5 mg/ml) 9) 1 ml de EDTA-sangre (persona Z) + 30 μl de toxoide dift�rico (5.78 mg/ml) 10) 1 ml de EDTA-sangre (persona Z) + 30 μl de toxoide tetánico (993 Lf/ml) 11) 1 ml de EDTA-sangre (persona Z) + 30 μl de LPS de Klebsiella pneumoniae (5 mg/ml)
50 12) 1 ml de EDTA-sangre (persona Z) + 30 μl de LPS de Salmonella typhimurium (5 mg/ml) 13) 1 ml de EDTA-sangre (persona Z) + 30 μl de agua milliQ
Despu�s de 1 min (A), 2 h (B), 24 h (C) y 48 h(D) se siembran 180 μl de cada una de las 13 soluciones en papel de filtro y se dejan secar. Posteriormente las muestras (después de 14 días de almacenamiento a -20 �C) se analizan 55 para determinar el contenido de citocinas utilizando tecnología Luminex (22). Los resultados se muestran en la tabla
1. Se puede ver en la tabla que el LPS induce aumentos grandes en IL-1b IL-6, IL-8, MIP-1a, MIP-1b, mientras que se observan cambios más pequeños pero estadísticamente significativos para otros analitos. El toxoide dift�rico induce un aumento en MIP-1b
Ejemplo 6. Prueba de toxoide dift�rico, toxoide tetánico, tuberculina PPD y BCG para la liberación de citocinas.
40 Las 6 soluciones siguientes se mezclan y se incuban a 37 �C:
1) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de toxoide dift�rico (5.78 mg/ml) 2) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de toxoide tetánico (993 Lf/ml) 3) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de BCG (4-16 x 106 ufc/ml)
45 4) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de tuberculina PPD (0.4 μg/ml) 5) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de agua milliQ 6) 1 ml de EDTA-sangre (persona Y) + 30 μl de solvente de vacuna BCG (control)
Despu�s de 1 min (A), 2 h (B), 4 h (C) 6 h (D) y 24 h (E) se sembraron 180 μl de cada una de las 6 soluciones en papel filtro y se dejaron secar. Posteriormente las muestras (luego del almacenamiento a -20 �C durante 30 días) se analizan para determinar el contenido de citocinas utilizando tecnología Luminex (22). Los resultados se muestran en la tabla 2.
En la tabla se observa que BCG induce un gran aumento de IL-8 y MIP-1b en comparación con el control. Del mismo modo, el toxoide dift�rico, el toxoide tetánico y PPD inducen incrementos en IL-8 y MIP-1b, mientras que se observan cambios más pequeños pero estadísticamente significativos para otros analitos.
50 Ejemplo 7. Almacenamiento de muestras durante períodos de tiempo prolongados.
Las muestras de sangre sembradas secas (DBSS) se deben almacenar secas y preferentemente a aproximadamente -20 �C. También se puede utilizar la temperatura ambiente en la medida en que las muestras se protejan de la humedad.
5 En Dinamarca todas las DBSS residuales han sido almacenados desde 1982 en un banco de muestras biológicas a -24 �C, de conformidad con las normas del Ministerio de Salud (23). Para estudios de estabilidad, se tomaron anónimamente DBSS almacenadas durante 23 años, 3 años y 1 mes respectivamente, del Banco de muestras de DBSS danés. Se calcularon las concentraciones medias de cada analito para cada período de las 10 muestras y se compararon con DBSS anónimas recogidas rutinariamente que habían sido almacenadas en el laboratorio durante
10 dos semanas a -20 �C (Tabla 3). Se puede observar que dentro del error experimental, no hay ningún deterioro de las muestras incluso tras 23 años de almacenamiento.
References
1.
Beck WS (Ed.). Hematology. MIT Press 1985.
2.
Bloom AL, Thomas, DP (Eds.). Haemostasis and thrombosis. Longman 1987.
5 3. Janeway CA, Travers P, Walport M, Capra JD. Immunobiology. Elsevier 1999.
4.
Thadikkaran L, Siegenthaler MA, Crettaz D, Queloz PA, Schneider P, Tissot JD. Recent advances in blood-related proteomics, Proteomics. 2005;5:3019-34.
5.
Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 2002; 1:845-67.
10 6. Steinke JW, Borish L. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol. 2006;117:S441-5.
7.
Blach-Olszewska Z. Innate immunity: cells, receptors, and signaling path-ways. Arch Immunol Ther Exp. 2005;53:245-53.
8.
Lapidot T, Petit I. Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp Hematol. 2002;30:973-81.
15 9. Cravens PD, Lipsky PE. Dendritic cells, chemokine receptors and autoimmune inflammatory diseases. Immunol Cell Biol. 2002;80:497-505.
10.
Villas BH. Flow cytometry: an overview. Cell Vis. 1998;5:56-61,
11.
Stelzer GT, Robinson JP. Flow cytometric evaluation of leukocyte function. Diagn Clin Immunol. 1988;5:223-31.
12.
Jerome KR, Sloan DD, Aubert M. Measurement of CTL-induced cytotoxicity: the caspase 3 assay. Apoptosis. 20 2003;8:563-7
13.
Andersen MH, Schrama D, Straten TP, Becker JC, Cytotoxic T cells. J Invest Dermatol. 200G;12G:32-41,
14.
Troutt AB, Maraskovsky E, Rogers LA, Pech MH, Kelso A. Quantitative analysis of lymphokine expression in vivo and in vitro. Immunol Cell Biol. 1992;70:51-7.
15.
Schmittel A, Keilholz U, Thiel E, Scheibenbogen C. Quantification of tumor-specific T lymphocytes with the 25 ELISPOT assay. J Immunother. 2000;23:289-95.
16.
House RV. Theory and practice of cytokine assessment in immunotoxicology. Methods. 1999;19:17-27.
17.
Meidenbauer N, Hoffmann TK, Donnenberg AD. Direct visualization of antigen-specific T cells using peptideMHC-class I tetrameric complexes. Methods. 2003;31:160-71.
18.
Bousso P. Generation of MHC-peptide tetramers: a new opportunity for dissecting T-cell immune responses. 30 Microbes Infect. 2000;2:425-9.
19.
Hogrefe WR. Biomarkers and assessment of vaccine responses, Biomarkers. 2005;10:S50-7.
20.
Manz RA, Hauser AE, Hiepe F, Radbruch A. Maintenance of serum antibody levels. Annu Rev Immunol. 2005;23:363-8G.
21.
Mei JV, Alexander JR, Adam BW, Hannon WH. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole 35 blood specimens. J Nutr. 2001;131:16315-6S.
22. Skogstrand K, Thorsen P, Norgaard-Pedersen B, Schendel DE, Sorensen LC, Hougaard DM. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 2005;51:1854-G6.
23. Norgaard-Pedersen B, Simonsen H. Biological specimen banks in neonatal screening. Acta Paediatr Suppl 40 1999;88:106-9.
24.
Aburuz S et al. Dried blood spot liquid chromatography assay for therapeutic drug monitoring of metformin. Journal of Chromatography B 2006; 832: 202-207.
25.
Koal T et al. Quantification of antiretroviral drugs in dried blood spot samples bymeans of liquid
chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry 2005; 19: 2995-3001 45

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para preparar una muestra de sangre u otro líquido biológico para su análisis, donde dicho método
    consiste en 5
    (a)
    iniciar una reacción mediante mezcla de una muestra de sangre u otro líquido biológico con un compuesto de prueba, donde el compuesto de prueba interacciona con los componentes de la muestra de sangre u otro líquido biológico para causar una alteración en la composición de la muestra de sangre u otro líquido biológico
    (b)
    detener la reacción sembrando gotas de la mezcla de sangre u otro líquido biológico y el compuesto de
    10 prueba en papel de filtro; donde el compuesto de prueba se elige entre una toxina, un al�rgeno, un autoant�geno, una proteína o un polisac�rido bacterianos, una proteína viral, una proteína o un polisac�rido f�ngicos, una proteína o un polisac�rido de un parásito o un lipopolisac�rido bacteriano.
    15 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el líquido biológico que se va a analizar es líquido cefalorraqu�deo, líquido peritoneal, líquido qu�stico, líquido amni�tico, líquido de lavado, saliva, extracto celular o extracto tisular.
  2. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 donde el trato celular deriva de líneas celulares, células sanguíneas
    20 aisladas, células manipuladas, células transg�nicas, células transinfectadas o cualquier tipo de célula o tipo de célula alterada o manipulada.
  3. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, donde la muestra se analiza para determinar el contenido de
    citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento y/o neurotransmisores u otros polip�ptidos y proteínas. 25
  4. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 a 4 donde la muestra se analiza para determinar el contenido de parámetros cl�nicos como CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, anticuerpos específicos (por ejemplo, específicos del ant�geno), transferrina, albúmina y/o transtiretina.
    30 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, donde el efecto del compuesto de prueba se analiza mediante inmunoensayo, bioensayo, espectrometr�a de masas, HPLC, GC, GC-MS.
  5. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde los métodos de análisis preferidos son ensayos ELISA,
    ensayos FLISA, ensayos DELFIA, ensayos de luminiscencia, ensayos de electroquimioluminiscencia, ensayo de 35 proximidad de centelleo, radioinmunoensayos, MALDI-MS, ESI-MS y MS ambiental (por ej. DESI-MS).
  6. 8. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1a 7, donde el compuesto de prueba se inmoviliza en una superficie sólida y se incuba con la muestra de sangre o líquido biológico.
    40 9. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además:
    (c) analizar el efecto del compuesto de prueba sobre la muestra de sangre u otro líquido biológico.
ES07817923.1T 2006-12-01 2007-11-30 Método de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro Active ES2471980T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK200601587 2006-12-01
DKPA200601587 2006-12-01
PCT/DK2007/000528 WO2008064684A1 (en) 2006-12-01 2007-11-30 Screening method using sample adsorption on filter paper

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2471980T3 true ES2471980T3 (es) 2014-06-27

Family

ID=39106328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07817923.1T Active ES2471980T3 (es) 2006-12-01 2007-11-30 Método de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9140691B2 (es)
EP (1) EP2087348B1 (es)
JP (1) JP5539724B2 (es)
CN (1) CN101542285B (es)
AU (1) AU2007327150B2 (es)
CA (1) CA2670989C (es)
DK (1) DK2087348T3 (es)
ES (1) ES2471980T3 (es)
HK (1) HK1132040A1 (es)
PL (1) PL2087348T3 (es)
WO (1) WO2008064684A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110282050A1 (en) * 2007-01-24 2011-11-17 Merz Gunnar R Method of preparing alkali cellulose or a cellulose derivative
GB0911007D0 (en) 2009-06-25 2009-08-12 Univ Hospital Of North Staffordshire Analyzer apparatus and methods for lung disease
WO2012139591A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Hvidovre Hospital Monitoring liver fibrosis in a hepatitis c infected patient
JP2014521084A (ja) * 2011-07-13 2014-08-25 デナトール アクティエボラグ 液状生体試料の安定化法
EP2747859A4 (en) 2011-08-22 2015-04-22 Waters Technologies Corp MICROFLUIDIC DEVICE WITH INTERFACE FOR DBS CARD
EP2994759B1 (en) 2013-05-06 2018-09-12 Bio-rad Laboratories, Inc. Stabilization of labile analytes in reference materials
WO2015059065A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Roche Diagnostics Gmbh Methods for measuring cell-free virus particles from dried blood spots
CN106501528A (zh) * 2016-10-27 2017-03-15 杭州量康科技有限公司 基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法
FR3060745B1 (fr) * 2016-12-19 2020-01-10 Biomerieux Procede de mise en suspension des analytes contenus dans un echantillon sanguin prealablement seche sur un papier buvard
CN110376383A (zh) * 2018-04-13 2019-10-25 中国科学院大连化学物理研究所 一种在纸靶片上进行蛋白质样品酶解检测的方法
EA202190867A1 (ru) * 2018-10-09 2021-07-02 Медицинише Универзитет Вин СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ IgE И IgG

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1206532B (it) * 1985-10-15 1989-04-27 Marcucci Francesco Metodo allergodiagnostico mucosale e relativo dispositivo per il rilievo in vivo delle ige specifiche e totali
JP3177658B2 (ja) * 1991-03-25 2001-06-18 東ソー株式会社 生体試料用濾紙
US5747265A (en) * 1992-10-30 1998-05-05 T Cell Diagnostics, Inc. Method for measuring the amount of a cell-associated molecule
CA2176811C (en) * 1993-12-10 2008-01-29 David Tai Wai Fei Methods for diagnosis of allergy and screening of anti-allergy therapeutics
JPH08201382A (ja) * 1995-01-24 1996-08-09 Nippon Kayaku Co Ltd 体液中成分の分析法及び体液採取用シート
JP3770986B2 (ja) 1997-01-22 2006-04-26 大成建設株式会社 環境中の酵母、放線菌からのｄｎａの直接抽出による酵母、放線菌の検出方法
JP2002520073A (ja) * 1998-07-16 2002-07-09 インビトロゲン・コーポレーション ベクターの保管
US6331541B1 (en) * 1998-12-18 2001-12-18 Soo S. Ko N-ureidoalkyl-piperidines as modulators of chemokine receptor activity
CN1156707C (zh) * 2000-04-19 2004-07-07 上海第二医科大学附属新华医院 纸片法筛查儿童铅中毒的方法
US6451611B1 (en) * 2000-07-28 2002-09-17 Statens Serum Institute Quantitative analysis of hexose-monophosphates from biological samples
JP3691803B2 (ja) * 2002-03-14 2005-09-07 三洋化成工業株式会社 血液中の心不全マーカー定量方法
US20040121305A1 (en) 2002-12-18 2004-06-24 Wiegand Roger Charles Generation of efficacy, toxicity and disease signatures and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DK2087348T3 (da) 2014-07-07
EP2087348A1 (en) 2009-08-12
JP2010511154A (ja) 2010-04-08
EP2087348B1 (en) 2014-04-09
AU2007327150A1 (en) 2008-06-05
CN101542285A (zh) 2009-09-23
CA2670989A1 (en) 2008-06-05
WO2008064684A1 (en) 2008-06-05
CA2670989C (en) 2015-02-10
US9140691B2 (en) 2015-09-22
HK1132040A1 (zh) 2010-02-12
AU2007327150B2 (en) 2012-07-12
PL2087348T3 (pl) 2014-09-30
JP5539724B2 (ja) 2014-07-02
US20080153116A1 (en) 2008-06-26
CN101542285B (zh) 2015-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2471980T3 (es) Método de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro
AU2017202628B2 (en) Method of diagnosing cancer and diagnosis kit using measurement of NK cell activity
JP4686611B2 (ja) 医療品中の非エンドトキシン性発熱物質夾雑物を検出することがより優れて可能となる改良された単球活性化試験
Sankiewicz et al. SPR imaging biosensor for the quantitation of fibronectin concentration in blood samples
JP2009521690A5 (es)
Vrolyk et al. Mouse model to study pulmonary intravascular macrophage recruitment and lung inflammation in acute necrotizing pancreatitis
CN111024956A (zh) 一种检测ptx3的时间分辨荧光免疫层析试剂盒
US20150010918A1 (en) Immunochromatographic assay with minimal reagent manipulation
US9841429B2 (en) Method for real-time measurement of the individual secretions of a cell
ES2235231T3 (es) Metodos para la medicion de la funcion linfocitica.
KR20170102344A (ko) 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법
TWI842742B (zh) 模擬糞便、及使用其之糞便潛血檢查的精確度管理方法
US5891728A (en) Test for determining pyrogenic effect of a material
Negherbon et al. Whole blood cytokine response to local traffic-related particulate matter in Peruvian children with and without asthma
JP4105793B2 (ja) 生物系による試験法
CN115586338A (zh) 用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法
Eickhoff et al. Measurement of phagocytosis and oxidative burst of canine neutrophils: high variation in healthy dogs
JP5757624B2 (ja) 抗アレルギー因子のスクリーニング方法
JP2008064475A (ja) 標的物質の高感度検出方法、検出用キットおよび検出装置
JP2019045215A (ja) ナチュラルキラー細胞活性の測定方法
Riihimäki Inflammatory response in equine airways: cytokines in bronchial epithelium and bronchoalveolar lavage cells
WO1995014081A1 (en) Method for detection of inflammatory agents
CN118707102A (zh) 一种测定人粘液病毒抗性蛋白a和c反应蛋白的试剂盒及其制备方法与应用
Riegman Platelet-surface interactions
Schuitemaker et al. Detection of Cytokines by Flow Cytometry