ES2453365T3 - Moléculas quiméricas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP - Google Patents

Moléculas quiméricas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP Download PDF

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ES2453365T3 ES06837570.8T ES06837570T ES2453365T3 ES 2453365 T3 ES2453365 T3 ES 2453365T3 ES 06837570 T ES06837570 T ES 06837570T ES 2453365 T3 ES2453365 T3 ES 2453365T3
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Abstract

Molecule quimerica del anticuerpo frente al activador del receptor de ligando de NF-KB (RANKL)-hormona paratiroidea/proteina relacionada con la hormona paratiroidea (PTH/PTHrP), que comprende: (a) un anticuerpo que se une a RANKL; y (b) un primer peptido de PTH/PTHrP; en la que el peptido de PTH/PTHrP este unido covalentemente al anticuerpo, y en la que la molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP (i) inhibe la uni6n de RANKL a un activador del receptor de NF-KB (RANK) y (ii) se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2.

Description

Moldculas quimericas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP
Campo
Se proporcionan moloculas quimericas que comprenden anticuerpos que se unen at activador del receptor de
ligando de NF-x13 (RANKL) y peptidos de la hormona paratiroidea/protefna relacionada con la hormona paratiroidea (PTH/PTHrP) (moldculas quimericas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP). Tambien se describen composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades Oseas.
Antecedentes
El tejido Oseo proporciona soporte para el cuerpo e incluye minerales (incluyendo calcio y fOsforo), una matriz de
protefnas de coldgeno y no de coldgeno, y celulas. El tejido Oseo vivo muestra un equilibrio dindmico entre la formaciOn de hueso, que se denomina deposicion, y la degradacion del hueso, que se denomina resorciOn. En este equilibrio estan implicados tres tipos de celulas encontradas en el hueso, osteocitos, osteoblastos y osteoclastos. Los osteoblastos promueven la formacion de tejido Oseo mientras que los osteoclastos estan asociados con la resorciOn. La resorcion, o la disoluciOn de matriz Osea y minerales, es un proceso rapido y eficaz en comparaciOn con la formacion osea y puede liberar grandes cantidades de minerales desde el hueso. Los osteoclastos estan implicados en la regulaciOn de la remodelaciOn normal de tejido esqueldtico y en la resorciOn inducida por hormonas. Por ejemplo, la resorciOn se estimula mediante la secrecion de la hormona paratiroidea en respuesta a concentraciones decrecientes de i6n calcio en fluidos extracelulares. Por el contrario, la inhibiciOn de la resorciOn es una fund& de calcitonina. Ademds, los metabolitos de la vitamina D alteran la capacidad de respuesta del hueso a la hormona paratiroidea y calcitonina.
El activador del receptor de ligando de NF-x13 (RANKL; tambien denominado ligando de osteoprotegerina, u OPGL), que es un miembro de la familia de TNF de citocinas, promueve la formacion de osteoclastos mediante la uniOn al activador del receptor de NF-K13 (RANK, tambien denominado receptor de diferenciaci6n y activacion de osteoclastos, u ODAR). La osteoprotegerina (OPG), por otro lado, inhibe la formacion de osteoclastos secuestrando
RANKL e impidiendo la asociaci6n de RANKL con RANK. Por tanto, la cantidad de RANKL asociado con RANK se corresponde con el equilibrio entre deposicion y resorcion oseas.
Tras la madurez del esqueleto, la cantidad de hueso en el esqueleto refleja el equilibrio (o desequilibrio) de formaci6n 6sea y resorci6n &ea. La masa 6sea maxima se produce tras la madurez del esqueleto antes de la cuarta decada. Entre las docadas cuarta y quinta, el equilibrio se desplaza y predomina la resorcion osea. La inevitable
disminucion de la masa Osea con el paso de los afios comienza antes en mujeres que en hombres y se acelera de manera distintiva tras la menopausia en algunas mujeres (principalmente las de ascendencia caucasica y asiatica).
La hormona paratiroidea (PTH) se secreta en respuesta a hipocalcemia. La PTH activa los osteoclastos, posiblemente a trues de la union a y la activaciOn del receptor PTH1. La activaciOn del receptor PTH1 conduce a la secreciOn de RANKL, que estimula la resorcion osea y un aumento de los niveles de calcio serico.
De manera paradOjica, la administraciOn intermitente de PTH o protefna relacionada con PTH (PTHrP) puede provocar realmente un aumento de la densidad Osea. Este aumento se debe a la activaciOn de osteoblastos, que aumentan la formaciOn Osea, ademds de la activacion de osteoclastos, que aumentan la resorcion &ea. Cuando la de activacion osteoblastos supera la activacion de osteoclastos, el resultado neto es un aumento de la densidad 6sea. Sin embargo, la estimulaciOn fuerte de los osteoblastos se ha asociado con osteosarcoma en ratones.
La osteopenia es un estado que se refiere generalmente a cualquier disminuciOn de la masa Osea por debajo de niveles normales. Un estado de este tipo puede surgir a partir de una disminucion de la tasa de sintesis 6sea o un aumento de la tasa de destrucci6n 6sea o ambos. Una forma corniin de osteopenia es la osteoporosis primaria, tambien denominada osteoporosis postmenopausica y senil. Esta forma de osteoporosis es una consecuencia de la perdida universal de hueso con la edad y a menudo es resultado del aumento de la resorciOn Osea con una tasa
normal de formaciOn 6sea. Muchas mujeres de raza blanca en los Estados Unidos desarrollan osteoporosis sintomatica. Existe una relaciOn directa entre la osteoporosis y la incidencia de fracturas de cadera, femorales, de cuello e intertrocantericas en mujeres de 45 afios y mayores. Las mujeres ancianas pueden desarrollar osteoporosis sintomatica entre las edades de 50 y 70.
El documento W02004/060386 Al da a conocer agentes terapeuticos que comprenden un dominio de modulacion
de PTH/PTHrP unido covalentemente a un vehfculo, tat como un dominio Fc. El documento WO 2004/060386 da a conocer adernds que pueden usarse agonistas de PTH con semivida prolongada (por ejemplo, los unidos a los dominios de Fc) con un inhibidor de resorciOn Osea, tal como anticuerpos frente a OPG-L (RANKL).
Sumario de la invencion
Se proporciona lo siguiente:
1. Una molecula quimerica del anticuerpo frente al activador del receptor de ligando de NF-KB (RANKL)-hormona paratiroidea/proteina relacionada con la hormona paratiroidea (PTH/PTHrP), que comprende:
(a)
un anticuerpo que se une a RANKL; y
(b)
un primer *tido de PTH/PTHrP;
enla que el peptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente at anticuerpo, y en la que la molacula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP (i) inhibe la union de RANKL a un activador del receptor de NF-xEl (RANK) y
(ii) se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2.
2. La molecula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 1, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende una secuencia
de aminoacidos que tiene at menos una identidad del 92% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 11.
3. La molacula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 1 6 2, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 90% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID
NO: 12.
4.
La molecula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 3, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene at menos una identidad del 95% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 11.
5.
La molacula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seg6n cualquiera de 1 a 4, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 95% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 12.
6.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 5, en la que el
anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene at menos una identidad del 99% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 11.
7. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 6, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera
comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 99% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 12.
8. La molecula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 7, en la que el
anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos tat como se expone en SEQ ID NO: 11.
9.
La molecula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 8, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 12.
10.
La molacula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 1, en la que el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos
tat como se expone en SEQ ID NO: 2 desde el residuo 20 hasta el residuo 427, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos tat como se expone en SEQ ID NO: 4 desde el residuo 21 hasta el residuo 235.
11.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 10, en la que el primer paptido de PTH/PTHrP comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP que se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2.
12.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 10, en la que el primer peptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente a una cadena pesada.
13.
La molacula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 10, en la que el primer peptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente a una cadena ligera.
14.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 9, en la que el
anticuerpo se selecciona de un anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo Fab, un anticuerpo Fab', un anticuerpo (Fab')2, un anticuerpo frente a dominio, un nanocuerpo, un minicuerpo, un maxicuerpo y un diacuerpo.
15. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segiin cualquiera de 1 a 10, que comprende
adernas un segundo peptido de PTH/PTHrP, en la que los peptidos de PTH/PTHrP primero y segundo son iguales o diferentes.
16. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn 14, en la que el segundo peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP.
5 17. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 14, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y en la que el primer peptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente a la cadena ligera y el segundo paptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente a la cadena pesada.
18. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 10, en la que el 10 anticuerpo es completamente humano.
19. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn cualquiera de 1 a 17, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP seleccionado de los polipeptidos de fOrmula I:
XNHX1 0)(11)(12Kx14x15)(16)(17)(18x19Rx21x22x23x24x25x26x27x28)(0
15 (FOrmulaI; SEQ ID NO: 13) en la que:
x2x3x4x5x6x7,x1x2x3x4x5--76
XN esta ausente o es X3X4X5X6X7,X X 0 YX1X2X3X4X5X6X7; x10, x11, x12, x14 as.28
X1 a X7, A son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
x29x30 x29x30x31 x29x30x31x32, x29x30x31x32x33,
Xc esta ausente o es X29,X29X39X31X32X33X34, x29x30x31x32x33x34-35
20 X 0 '
X29X39X31X32X33X34X39X36;
X29 a X36 son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
siempre que uno o mas de X14 a X36 sean un residuo de cisteina; y en la que el peptido de PTH/PTHrP se une a un receptor PTH-1 o a un receptor PTH-2.
20. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 19, en la que:
25 XNes X1X2X3X4X6X6X7; X1 es un residuo hidrOfilo o no funcional; X2 es V; X3 es S; X4 es E;
30 X6es un residuo no funcional o basico; X6 es Q; X7 es L; X19 es un residuo acido o hidrOfilo; X11 es un residuo no funcional o basico; 35 X12es un residuo no funcional; X14 es un residuo basic° o hidrOfilo; X16 es un residuo no funcional; X16 es un residuo no funcional o hidrOfilo; X17 es un residuo acid°, hidrofilo o no funcional;
40 X" es un residuo no funcional; X19 es un residuo acid° o basico;
X21 es un residuo no funcional o basico; X22 es un residuo hidrOfilo, acido o aromatico; X23 es un residuo aromatic° o lipdfilo; X24 es un residuo lipOfilo;
5 X25 es un residuo hidrOfilo o basico; X26 es un residuo hidrOfilo o basico; X27 es un residuo lipofflo, basic° o no funcional; y X28 es un residuo lipofilo o no funcional,
en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos 10 yaromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
21. Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 19O20, en la que: xc es x29x30x31x32x33x34;
X29 es un residuo hidrOfilo o no funcional; X3° es un residuo hidrofilo o acido;
15 x3'es un residuo lipotho o no funcional; X32 es H; X33 es una cisterna o un residuo hidrOfilo; y X34 es un residuo no funcional o aromatic°,
en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos 20 yaromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
22. Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtin la reivindicaciOn 19 O 20, en la que:
c29 30 X es XX X31;
X29 es un residuo hidrOfilo o no funcional; X3° es un residuo hidrofilo o acido; y 25 x31es un residuo lipofflo o no funcional, en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido on forma D o L quo carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido quo son iguales o diferentes.
23.
Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 19 O 20, on la quo: Xc es X29X39; 30 X29es un residuo hidrofilo o no funcional; y X3° es un residuo hidrOfilo o acid°,
en la quo el residuo no funcional es un residuo de aminoacido on forma D o L quo carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido quo son iguales o diferentes.
24.
La molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 19 ci 20, en la quo: 35 Xces X29; y; X29 es un residuo hidrOfilo o no funcional,
on la quo el residuo no funcional es un residuo de aminoacido on forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
25. La molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 19 a 24, on la quo al
menos uno de X" y X" es cistelna.
26.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 19 ei 20, en la que Xc esta ausente.
27.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 19, en la que: X' es A, S o Y;
5 X5es H o I; X16 es N o D; X L, R OK; X12 es G, F o W; X14 es H o S;
10 X15es L o I; X16 es Q, N, S o A; X17 es S, D o L; X18 es M, L, V o Nle; X19 es E o R;
15 X2'es V, M, R o Nle; X22 es E o F; X" es W o F; X25 es R o H;
X26 es K o H; 20 X27es C; y X25 es L o I.
28. La molecula quirnOrica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 27, en la que:
29x30x31 x32 x33x34;
Xc es X X25 es Q o A;
25 X"es D o E; X31 es V o I;
X33 es C;
X34 es N o T; y X35 es A, F o Y. 30 29. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 27, en la que:
x30x31;
Xc es X25 X25 es Q o A; X3° es D o E; y X31 es V o I;
35 30. La molOcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 27, en la que: Xc es X29X36; X29 es Q o A; y
X3° es D o E.
31.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 27, en la que: Xc es X29; y; X29 es Q o A.
32.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 27, en la que Xc esta ausente.
33.
La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP seleccionado de polipeptidos de formula II:
JNI j7 j8HN j11 j12KHul6s j18 j19.-. 21. I-1J EWLRKKLJc
(FOrmulaII; SEQ ID NO: 14)
en la que: Ji j2 j3 J.4 j5 j8, j2 j3 j4J5 j6 0 ja ja j5 j6;
J" esta ausente o es a J8, j12, J16, j18 y21
J1 J son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente; J11 es un residuo no funcional o basico; J19es un residuo acid° o basico; j29 j30, j29 j30 j31, J29282,22, j29 j30 jai j32 J33 0 j29 Jae j32 j33 j34;
Jc esta ausente o es J29,
J29 a J34 son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
siempre que uno o mas de J14 al residuo del extremo C-terminal del dominio de modulacion de PTH/PTHrP sean un residuo de cisteina;
enla que el peptido de PTH/PTHrP se une a un receptor PTH-1 o a un receptor PTH-2, en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipoptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
34. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 33, en la que: J" es J1J2J3J4J5J6;
J1es un residuo no funcional o aromatico; J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrOfilo; J4 es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional;
J6es un residuo basico; J7 es un residuo no funcional o aromatico; J8 es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromatico; J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo;
J18 es un residuo no funcional; J21 es un residuo no funcional; Jc es J29J30J31J32J33J34; J29 es un residuo hidrofilo o no funcional; J3° es un residuo hidrOfilo o acido;
J31 es un residuo lipofilo o no funcional;
J32 es un residuo basico;
J33 es un residuo acido; y
J34 es un residuo aromatic°.
5 35. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtin 34, en la que: J1 es A, S o Y;
J2 es V;
J3 es S;
J4 es E;
10 J5es I;
J6 es 0;
J7 es L o F;
J8 es M o Nle;
J11 es L, R o K;
15 J12es G o W; J16 es N, S o A; J18 es hi,
Nle, L o V; J19 es E o R; 21
es V, M o Nle;
20 J29es Q o A; J3° es D o E; J31 es V o I; J32 es H; J33 es N; y
25 J34es F o Y.
36. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 33, en la que: J" es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromatico; J2 es un residuo no funcional;
30 J3es un residuo hidrofilo; J4 es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo basico; J7 es un residuo no funcional o aromatico;
35 J8es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromatico;
J16 es un residuo no funcional o hidrofilo;
J18 es un residuo no funcional; J21 es un residuo no funcional; Jc es J29J30J31; J29 es un residuo hidrOfilo o no funcional;
5 J3°es un residuo hidrOfilo o acido; y J31 es un residuo lipOfilo o no funcional.
37. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 36, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V;
10 J3es S; J4 es E; J5 es I; J6 es Q;
J7 es L o F;
15 J8es M o Nle; J11 es L, R o K; J12 es G o W; J16 es N, S o A; J18 es M, Nle, L o V;
20 J19es E o R; J21 es V, M o Nle; J29 es Q o A; J3° es D o E; y J31 es V o I.
25 38. La molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn 33, en la que:
1 j2 j3 j4 j5 j6;
J" es J J1 es un residuo no funcional o arornatico; J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidnifilo;
30 J4es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo basico; J7 es un residuo no funcional o arornatico; J8 es un residuo no funcional;
35 J12 es un residuo no funcional o arornatico; J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo; J18 es un residuo no funcional;
J21 es un residuo no funcional; Jc es J29,136; J29 es un residuo hidrOfilo o no funcional; y J3° es un residuo hidrcifilo o acido.
5 39. La molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segLin 36, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V; ..13 es S; J4 es E;
10 J5es I; J6 es Q; J7 es L o F: J8 es M o Nle; J11 es L, R o K;
15 J12es G o W; J16 es N, S o A; jis es ..,
m Nle, L o V; J19 es E o R; J21as V, M o Nle;
20 J29es Q o A; y J3° es D o E.
40. La molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 33, en la que: J" es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromatico;
25 J2es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrOfilo; J4 es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo basico; 30 J7es un residuo no funcional o aromatico; J8 es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o arornatico; J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo; J18 es un residuo no funcional;
35 J21es un residuo no funcional; Jc es J29; y J29 es un residuo hidrOfilo o no funcional.
10
41. La molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn 40, en la que:
J1 es A, S o Y; J2 es V; J3 es S;
5 J4es E; J5 es I; J6 es Q; J7 es L o F;
J8 es M o Nle;
10 J11es L, R o K; J12 es G o W; J16 es N S o A; J18 es M, Nle, L o V; J19 es E o R;
j21
15 es V, M o Nle; y J29 es Q o A.
42. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 33, en la que: J" es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o arornatico;
20 J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrofilo; J4 es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo basico;
25 J7 es un residuo no funcional o aromatico; J8 es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o aromatico; J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo; J18 es un residuo no funcional;
30 J21es un residuo no funcional; y Jc esta ausente.
43. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 42, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V;
35 J3es S; J4 es E; J5 es I;
11
J8 es Q; J7 es L o F;
J8 es M o Nle; J11 es L, R o K;
5 J12es G o W; J18 es N, S o A; J18 es M, Nle, L o V; J19 es E o R; y
J21 es V, M o Nle.
10 44. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtIn cualquiera de 1 a 18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP seleccionado de polipeptidos de fOrmula III:
10...11 2 S1 R117
1 ONLHO u 0 -KSIO -0 -0-LRRRF023LHHLI0c
(FOrmula III; SEQ ID NO: 15)
15 enla que:
Y01020304050607, 01020304050607, 020304050607, 0304050607, 04050607,
ON esta ausente o es 050607,0607
0 U 07;
010 a 012, 023
01 a 07,Om a 017 y son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
029030, 029030031 029030031032, 029030031032033, 029030031032033034,
OCesta ausente o es 029
029030031032033034035 26030031032033034035036;
'
u 0 026 a 036 son cada uno independientemente residuos de aminoacido; siempre que uno o mas de 014 at residuo del extern° C-terminal del dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP sean un residuo de cisteina; y en la que el peptido de PTH/PTHrP se une a un receptor PTH-1 o a un receptor PTH-2.
25 45. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtin 44, en la que: ON es 07; 07 es un residuo no funcional; 019 es un residuo acid° o hidrofilo; 011 es un residuo basic° o no funcional;
30 012es un residuo aromatico o no funcional; 016 es un residuo hidrofilo o no funcional;
016 es un residuo hidrOfilo;
017 es un residuo acido o no funcional;
023 es un residuo aromatico; Y 35 OCesta ausente,
en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
46. La molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segiln 44, en la que:
020304050607;
ON es 01 40 01es un residuo de aminoacido no funcional;
02 es un residuo de aminoacido no funcional;
03 es un residuo de aminoacido hidrOfilo;
04 es un residuo de aminoacido acido;
05 es un residuo de aminoacido basic° o no funcional;
5 06es un residuo de aminoacido hidrofilo; 07 es un residuo no funcional; 010 es un residuo acido o hidrofilo; 0" es un residuo basic° o no funcional; 012 es un residuo aromatic° o no funcional;
10 015es un residuo hid rOfilo o no funcional; 016 es un residuo hidrOfilo; 017 es un residuo acid° o no funcional; y
023 es un residuo aromatic°,
en la quo el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos 15 yaromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
47. La molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun 44, en la quo: 01 es A; 02 es V; 03 es S;
20 04es E; 05 es H 01; 06 es Q; 07 es L; 010 es N o D;
25 011 es K o L; 012 es G, F o W; 015 es I o S;
016 es Q o N; 017 es D o L; 30 023es F o W.
48. La molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segLin cualquiera de 1 a 18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP, en la quo el dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende:
a) una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 16 a 89; o
35 b)una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 90 a 107 excepto porque uno o mas residuos en la posiciOn 14 al extremo C-terminal del dominio de modulaci6n de PTH/PTHrP estan sustituidos por un residuo de cisteina.
49. La molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 48, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulacion de PTH/PTHrP, on la quo el dominio pre-pro comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO:
40 188 a 207.
50.
La moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segiin 49, en la que el dominio pre-pro comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 188 y el dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende la secuencia de aminodcidos de SEQ ID NO: 22.
51.
La moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 18, en la que el
peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285.
52. Una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seleccionada de:
(a) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 desde el residuo 20 hasta el residuo
427y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285;
(b) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 desde el residuo 32 hasta el residuo 518 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 desde el
residuo21 hasta el residuo 235; y
(c) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 desde el residuo 32 hasta el residuo 518 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285.
53. Una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seleccionada de:
(a) una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285; y
(b)una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 desde el residuo 32 hasta el residuo 518 y un segundo polipeptido que tiene una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12.
54.
Un polinucleOtido que codifica para una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 53.
55.
Un vector que comprende un polinucleOtido que codifica para una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 53.
56.
Una celula huesped que comprende un polinucleotido que codifica para una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 53.
57.
Un metodo de produccion de una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende cultivar la cdlula hudsped segun 56.
58.
Una composici6n farmaceutica que comprende una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP segun cualquiera de 1 a 53.
59.
Uso de la composiciOn farmaceutica segun 58 para la preparacion de un medicamento para tratar la perdida osea en un paciente.
60.
El uso segun 59, en el que el medicamento comprende ademds al menos un agente terapeutico seleccionado de anakinra, etanercept, infliximab, adalimumab y metotrexato.
61.
El uso segun 59 6 62, en el que el medicamento comprende ademds al menos un anticuerpo terapeutico seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un anticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo frente a EGFR, un
anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente al receptor de vegF, un anticuerpo frente al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a CDC33.
62. El uso segiin cualquiera de 59 a 61, en el quo el medicamento comprende ademds al menos un agente
seleccionado de un agente contra la resorcion osea, un agente anabolic° Oseo, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor y un agente de terapia contra el cancer.
63. El uso de 62, en el que al menos un agente de terapia contra el cancer se selecciona de un inhibidor del receptor
del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de vegF, un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR)
64. El uso segun cualquiera de 59 a 63, en el que el medicamento comprende ademas al menos un agente terapeutico seleccionado de un factor morfogenetico Oseo, factor de crecimiento transformante (TGF-r3), un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1ra, anakinra, un inhibidor de TNFa, un receptor de TNFa soluble, etanercept, un anticuerpo anti-INFa, infliximab, adalimumab, una prostaglandina, un bisfosfonato, alendronato, fluoruro, calcio, un tarmac° antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un inhibidor de COX-2, celecoxib, rofecoxib, un inmunosupresor,
metotrexato, leflunomida, un inhibidor de serina proteasa, un inhibidor de la proteasa de leucocitos secretores (SLPI), un inhibidor de IL-6, un anticuerpo frente a IL-6, un inhibidor de IL-8, un anticuerpo frente a IL-8, un inhibidor de IL-18, una proteina de uniOn a IL-18, un anticuerpo frente a IL-18, un modulador de la enzima convertidora de
interleucina-1 (ICE), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un modulador de FGF, un antagonista de PAF, un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), una molecula relacionada con KGF, un modulador de KGF; un
modulador de metaloproteinasa de matriz (MMP), un modulador de la Oxido nitric° sintasa (NOS), un modulador del receptor de glucocorticoides, un modulador del receptor de glutamato, un modulador de los niveles de lipopolisacaridos (LPS), una noradrenalina, un mimetic° de noradrenalina y un modulador de noradrenalina.
65.
El uso segt5n cualquiera de 59 a 64, en el que la perdida 6sea este asociada con al menos un estado seleccionado de un estado inflamatorio, un estado autoinmunitario, artritis reumatoide y cancer.
66.
El uso segijn 59, en el que la perdida Osea este asociada con cancer, y en el que el medicamento comprende ademas al menos un agente terapeutico seleccionado de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de vegF, un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de
angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), un inhibidor de glicoproteinas similares a mucina, un inhibidor de CDC20 y un inhibidor de CDC33.
67. El uso segun 59, en el que la perdida osea este asociada con cancer, y en el que el medicamento comprende adernas al menos un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un anticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente al receptor de vegF, un anticuerpo
frente al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersi6n (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a CDC33.
68.
El uso segt:m 59, en el que la perdida Osea este asociada con cancer, y en el que el medicamento es para la administracion con al menos un agente de terapia contra el cancer seleccionada de radioterapia y quimioterapia.
69.
La molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segCin cualquiera de 1 a 53 o la composicion farmaceutica segt:in 54 para su uso en el tratamiento de pardida 6sea en un paciente.
70.
La composicion farmaceutica para su uso segim 69, en la que la composicion comprende adernas al menos un agente terapeutico seleccionado de anakinra, etanercept, infliximab, adalimumab y metotrexato.
71.
La composici6n farmacoutica para su uso segtIn 69 6 70, en la que la composiciOn comprende ademas al menos un anticuerpo terapeutico seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un anticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo
frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente al receptor de vegF, un anticuerpo frente al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a C0C33.
72. La composici6n farmaceutica para su uso segtIn cualquiera de 69 a 71 en la que la composici6n comprende
ademas al menos un agente seleccionado de un agente contra la resorcion osea, un agente anabOlico 6seo, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor y un agente de terapia contra el cancer.
73. La composiciOn farmaceutica para su uso segtIn 72, en la que el al menos un agente de terapia contra el cancer se selecciona de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de vegF, un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersi6n (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un
inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), un inhibidor de glicoproteinas similares a mucina, un inhibidor de CDC20 y un inhibidor de CDC33.
74. La composici6n farmaceutica para su uso segt:in cualquiera de 69 a 73, en la quo la composici6n comprende ademas al menos un agente terapeutico seleccionado de un factor morfogenetico Oseo, factor de crecimiento transformante J (TGF-f3), un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1ra, anakinra, un inhibidor de TNFa, un receptor de
INFa soluble, etanercept, un anticuerpo anti-TNFa, infliximab, adalimumab, una prostaglandina, un bisfosfonato, alendronato, fluoruro, calcio, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un inhibidor de COX-2, celecoxib,
rofecoxib, un inmunosupresor, metotrexato, leflunomida, un inhibidor de serina proteasa, un inhibidor de la proteasa de leucocitos secretores (SLPI), un inhibidor de IL-6, un anticuerpo frente a IL-6, un inhibidor de IL-8, un anticuerpo frente a IL-8, un inhibidor de IL-18, una proteina de uniOn a IL-18, un anticuerpo frente a IL-18, un modulador de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un modulador de FGF,
un antagonista de PAF, un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), una molecula relacionada con KGF, un modulador de KGF; un modulador de metaloproteinasa de matriz (MMP), un modulador de la Oxido nitric° sintasa (NOS), un modulador del receptor de glucocorticoides, un modulador del receptor de glutamato, un modulador de los niveles de lipopolisacaridos (LPS), una noradrenalina, un mimetic° de noradrenalina y un modulador de noradrenalina.
75.
La composiciOn farmaceutica para su uso segun cualquiera de 69 a 74, en el que la p6rdida 6sea esta asociada con al menos un estado seleccionado de un estado inflamatorio, un estado autoinmunitario, artritis reumatoide y cancer.
76.
La composicion farmaceutica para su uso segun 69, en el que la perdida Osea esta asociada con cancer y la
• composiciOn comprende ademds al menos un agente terapeutico seleccionado de un inhibidor del receptor del factor
decrecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de vegF, un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), un inhibidor de glicoproternas similares a mucina, un inhibidor de CDC20 y un inhibidor de CDC33.
77.
La composiciOn farmaceutica para su uso segun 69, en el que la perdida osea esta asociada con cancer y en la que la composiciOn comprende ademas al menos un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un anticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente al receptor de vegF, un anticuerpo frente al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a CDC33.
78.
La composiciOn farmaceutica para su uso segtin 69, en el que la perdida Osea esta asociada con cancer y en la que la composici6n es para la administraci6n con al menos un agente de terapia contra el cancer seleccionada de radioterapia y quimioterapia.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 muestra una secuencia de ADNc que codifica para la cadena pesada del anticuerpo frente a aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1) (SEQ ID NO: 1). La secuencia de ADNc empieza en un sitio Hindi!l y termina en un sitio Sall. El codOn de inicio empieza en el nucleOtido 14 y el cod& de terminaciOn empieza en el nucle6tido 1415.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del anticuerpo frente a aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1) (SEQ ID NO: 2). El peptido serial de la cadena pesada esta subrayado. La regi6n variable esta en letras mayrisculas y no esta subrayada. La region constante estd en minCisculas.
Lafigura 3 muestra una secuencia de ADNc que codifica para la cadena ligera del anticuerpo frente a aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1) (SEQ ID NO: 3). La secuencia de ADNc empieza en un sitio Xbal y termina en un sitio Sall. El cod6n de inicio empieza en el nucleOtido 12 y el codOn de terminaciOn empieza en el nucleOtido 717.
La figura 4 muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera del anticuerpo frente a aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1) (SEQ ID NO: 4). El peptido de sena' kappa esta subrayado. La region variable esta en letras
mayirsculas y no esta subrayada. La region constante esta en minusculas.
La figura 5 muestra un diagrama esquematico del plasmido de expresi6n de la cadena ligera kappa de aRANKL-1, aRANKL-1-Kappa/pDSRal 9 (tambien denominado a0PGL-1-Kappa/pDSRa1 9; veanse por ejemplo, la publicacion de patente estadounidense n.° U.S. 2004/0033535 Al y la publicacion PCT n.° WO 2003/002713 A3).
La figura 6 muestra un diagrama esquematico del plasmido de expresi6n de la cadena pesada de IgG2 de aRANKL1, aRANKL-1-IgG2/pDSRa1 9 (tambien denominado a0PGL-1-IgG2/pDSRa1 9; veanse por ejemplo, la publicaciOn de patente estadounidense n.° U.S. 2004/0033535 Al y la publicacion PCT n.° WO 2003/002713 A3).
La figura 7 muestra una secuencia de ADNc que codifica para synPTH (SEQ ID NO: 5). El sitio Xbal (TCTAGA) y la secuencia Kozak (CCACC) estan en negrita. El dominio pre-pro esta subrayado. Un dominio de modulacion a modo de ejemplo de PTH/PTHrP esta como texto sin formato. La secuencia que codifica para el ligador GGGAP esta en
cursiva. Un sitio BssHII (GCGCGC) se ubica dentro de la secuencia de ligador.
La figura 8 muestra la secuencia de aminoacidos de synPTH (SEQ ID NO: 6). El dominio pre-pro esta subrayado. Un dominio de modulacion a modo de ejemplo esta como texto sin formato. El ligador GGGAP esta en cursiva.
La figura 9 muestra una secuencia de ADNc que codifica para el synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 (tambien denominado synPTH-aRANKL-1 kappa; SEQ ID NO: 7). El sitio Xbal (TCTAGA) y la secuencia Kozak (CCACC)
estan en negrita al comienzo de la secuencia. El dominio pre-pro esta subrayado. La secuencia que codifica para el ligador GGGAP esta en cursiva. El coder' de terminaciOn empieza en el nucleetido 867. Un sitio Sall esta en negrita al final de la secuencia.
La figura 10 muestra la secuencia de aminoacidos del synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 (tambien denominado synPTH-aRANKL-1 kappa; SEQ ID NO: 8). El dominio pre-pro esta subrayado. El ligador GGGAP esta en cursiva.
La figura 11 muestra una secuencia de ADNc que codifica para el synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (tambien denominado synPTH-aRANKL-1 IgG2; SEQ ID NO: 9). El sitio Xbal (TCTAGA) y la secuencia Kozak (CCACC) estan en negrita al comienzo de la secuencia. El dominio pre-pro esta subrayado. La secuencia que codifica para el ligador GGGAP esta en cursiva. El cod6n de terminacien empieza en el nucleOtido 1566. Un sitio Sall estd en negrita al final
dela secuencia.
La figura 12 muestra la secuencia de aminoacidos del synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (tambien denominado synPTH-aRANKL-1 IgG2; SEQ ID NO: 10). El dominio pre-pro esta subrayado. El ligador GGGAP esta en cursiva.
La figura 13 muestra un diagrama esquematico del pldsmido de expresiOn del synPTH-cadena ligera (kappa) de aRANKL-1 synPTH-aRANKL-1-kappa/pDSRa20.
Lafigura 14 muestra un diagrama esquematico del pldsmido de expresi6n del synPTH-cadena pesada (IgG2) de aRANKL-1, synPTH-aRANKL-1-IgG2/pDSRa20.
La figura 15 muestra niveles de calcio ionizado en sangre en ratones huRANKL ancianos y en ratones silvestres ancianos segun el trabajo en el ejemplo 5. Se trataron ratones huRANKL con vehiculo, PTH(1-34) humana 100 jig/kg, aRANKL-1 2 mg/kg, aRANKL-1 10 mg/kg, fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg (synPTH-aRANKL-1 HCF) o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg (synPTH-aRANKL-1 HCF). Se trataron ratones silvestres con vehiculo o con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg (synPTH- aRANKL-1 HCF). Se midieron los niveles de calcio ionizado sanguine° antes del tratamiento, y a 2, 6, 24, 48 y 72
horas tras el tratamiento.
La figura 16 muestra niveles de TRAP-5b en suero en ratones huRANKL ancianos tratados con vehiculo (PBS),
PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segun el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 17 muestra niveles de osteocalcina en suero en ratones huRANKL ancianos tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segt.in el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 18 muestra el cambio en la densidad mineral osea (BMD) de vertebras lumbares en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusion de synPTH-cadena
pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segCin el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 19 muestra el cambio en la densidad mineral Osea (BMD) de pata completa en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH- aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segun el trabajo en el ejemplo 5.
Lafigura 20 muestra el cambio en el volumen Oseo de metafisis proximal de la tibia en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH- aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segun el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 21 muestra el cambio en el porcentaje de superficie de osteoclastos en ratones huRANKL tratados con
vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH- aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segun el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 22 muestra el cambio en el porcentaje de superficie de osteoblastos en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTHaRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segOn el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 23 muestra la tasa de formaciOn 6sea en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34)
humana, aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF); y en ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH- aRANKL-1 HCF) segim el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 24 muestra tomografia microcomputerizada (microCT) de didfisis femorales de ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH- aRANKL-1 HCF); y de ratones silvestres ancianos tratados con vehiculo (PBS) o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF) segun el trabajo en el ejemplo 5.
La figura 25 muestra tomografia microcomputerizada (microCT) de vertebras L6 de ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTHaRANKL-1 HCF).
La figura 26 muestra tomografia microcomputerizada (microCT) de tibias izquierdas de ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH- aRANKL-1 HCF).
La figura 27 muestra tomografia microcomputerizada (microCT) de femures izquierdos de ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana, aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (synPTH-aRANKL-1 HCF).
La figura 28 muestra la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo frente a aRANKL-1 (SEQ ID NO: 11).
La figura 29 muestra la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo frente a aRANKL-1 (SEQ ID NO: 12).
Descripcion detallada de determinadas realizaciones
Los encabezamientos de seccion usados on el presente documento son solo para fines organizativos y no debe considerarse quo limiten el objeto descrito.
Pueden usarse tecnicas convencionales para la sintesis de ADN recombinante, oligonucleotidos y cultivos tisulares y
transformacion (por ejemplo, electroporaciOn, lipofecciOn). Pueden realizarse reacciones enzimaticas y tecnicas de purificaciOn segun las instrucciones del fabricante o tal como se logra comunmente en la tecnica o tal como se describe en el presente documento. Las tecnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente segim metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y tal como se describen en diversas referencias generales y mds especificas que se citan y se tratan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva. \tease por ejemplo,
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (28 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). A menos que se proporcionen definiciones especificas, las nomenclaturas utilizadas junto con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, quimica analitica, quimica organica sintetica y quimica medica y farmacoutica descritas on el presente documento son las quo se conocen bien y se usan comunmente on la tecnica. Pueden usarse tecnicas convencionales para sintesis quimicas, andlisis quimicos, preparacion, formulaciOn, y
administraciOn farmaceutica y tratamiento de pacientes.
En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique especificamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos quo se indique lo contrario. Ademds, el uso del termino "quo incluye", asi como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Ademds, terminos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes quo comprende una unidad y elementos y componentes
quo comprenden mds de una subunidad a menos quo se indique especificamente lo contrario.
Definiciones
Tal como se utiliza segun la presente descripciOn, los siguientes terminos, a menos que se indique lo contrario, debe entenderse que tiene los siguientes significados:
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "proteina" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se
refieren a un polimero de dos o mas aminoacidos unidos entre si mediante enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados. Los terminos se aplican a polimeros de aminoacidos que contienen aminoacidos que se producen de manera natural asi como polimeros de aminoacidos en los quo uno o mas residuos de aminoacido son un aminoacido quo no se produce de manera natural o un analog° quimico de un aminoacido que se produce de manera natural. Un polimero de aminokido puede contener uno o mas residuos de aminoacido quo se han
modificado mediante uno o mds procedimientos naturales, tales como procesamiento postraduccional, y/o uno o mas residuos de aminoacido quo se han modificado mediante una o mds tecnicas de modificaciOn quimica conocidas en la tecnica.
El termino "polipeptido aislado" se refiere a cualquier polipeptido quo (1) esta libre de al menos algunos polipeptidos con los que se le encontraria normalmente, o (2) esta esencialmente libre de otros polipeptidos de la misma fuente,
por ejemplo, que se encuentran en el mismo entomo, tal como en las misma celula o fluido, o (3) se expresa por una celula de una especie diferente de la especie de origen del polipeptido, (4) se expresa en un sistema de expresi6n libre de celulas, (5) se prepara de manera sintetica, o (6) no se produce en la naturaleza.
Un "fragmento" de un polipeptido de referencia se refiere a un tramo contiguo de aminoacidos de cualquier parte del polipeptido de referencia. Un fragmento puede ser de cualquier longitud que sea menor que la longitud del polipeptido de referencia.
Una "variante" de un polipeptido de referencia se refiere a un polipeptido que tiene una o mas sustituciones, deleciones o inserciones de aminoacidos con respecto al polipeptido de referencia.
Las variantes de un polipeptido de referencia incluyen, pero no se limitan a, variantes de cisteina. Las variantes de
cisteina incluyen variantes en las que uno o mas residuos de cisterna del polipeptido de referencia estan reemplazados por uno o mas residuos distintos de cisteina; y/o uno o mas residuos distintos de cisteina del polipeptido de referencia estan reemplazados por uno o mas residuos de cisteina. Las variantes de cisteina pueden ser utiles, en determinados casos, cuando un polipeptido particular debe replegarse en una conformaciOn biolOgicamente activa, por ejemplo, tras el aislamiento de cuerpos de inclusiOn insolubles. En determinados casos,
las variantes de cisteina de un polipeptido de referencia tienen menos residuos de cisteina que el polipeptido de referencia. En determinados casos, las variantes de cisteina tienen mas residuos de cisteina que el polipeptido de referencia. En determinados casos, las variantes de cisteina de un polipeptido de referencia tienen un ntimero par de cisteinas para minimizar las interacciones que resultan de las cisteinas desapareadas.
Las variantes de un polipeptido de referenda incluyen, pero no se limitan a, variantes de glicosilaciOn. Las variantes
deglicosilaciOn incluyen variantes en las que el numero y/o tipo de sitios de glicosilaciOn se han alterado en comparaciOn con el polipeptido de referencia. En determinados casos, las variantes de glicosilaciOn de un polipeptido de referencia comprenden un numero mayor o menor de sitios de glicosilacion con union a N que el polipeptido de referencia. En determinados casos, un sitio de glicosilaciOn con uniOn a N esta caracterizado por la secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoacido designado como X puede ser cualquier
residuo de aminoacido excepto prolina. En determinados casos, las variantes de glicosilacion incluyen transposiciones de cadenas de hidratos de carbono con uni6n a N en las que se eliminan uno o mas sitios de glicosilaciOn con uniOn a N (incluyendo, pero sin limitarse a, sitios de glicosilaciOn que se producen de manera natural) y se crean uno o mas sitios de glicosilaciOn con uniOn a N.
Un "derivado" de un polipeptido de referencia se refiere a un polipeptido (1) que tiene una o mas modificaciones de
uno o mas residuos de aminoacido del polipeptido de referencia; y/o (2) en el que una o mas uniones de peptidilo se han reemplazado por una o mas uniones no de peptidilo; y/o (3) en el que se ha modificado el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal.
En determinados casos, los polipeptidos pueden ser ramificados y/o cfclicos. Los polipeptidos cfclicos, ramificados y ramificados ciclicos pueden resultar de procesos naturales postraduccionales (incluyendo, pero sin limitarse a,
ubiquitinaciOn) o pueden prepararse mediante metodos sinteticos.
El termino "polipeptido" abarca moleculas quimericas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, el termino "polipeptido" abarca moleculas quimericas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, en las que uno o mas anticuerpos frente a RANKL y uno o mas peptidos de PTH/PTHrP se han traducido a partir de una secuencia codificante individual para producir un polipeptido contiguo individual. En determinadas realizaciones, el termino "polipeptido" abarca moleculas quimericas de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, en las que uno o mas anticuerpos frente a RANKL y uno o mas peptidos de PTH/PTHrP se han sintetizado quirnicamente como un polipeptido contiguo individual. En determinadas realizaciones, el termino "polipeptido" abarca moleculas quimericas de anticuerpo frente a RANKL-PTI-J/PTHrP, en las que uno o mas anticuerpos frente a RANKL y uno o mas peptidos de PTH/PTHrP se han producido por separado, o bien enzimatica o bien quirnicamente, y luego se han unido
quimica o enzimaticamente entre sm.
En determinados casos, un polipeptido comprende uno o mas aminoacidos y/o tramos de aminoacidos aleatorizados. En determinadas realizaciones, un polinucleotido comprende uno o mas nucleotidos y/o tramos de nucleOtidos aleatorizados.
El termino "aleatorizado" se refiere a un residuo o tramo de residuos que estan sustituidos de manera aleatoria. Un tramo de residuos comprende dos o mas residuos contiguos. En determinados casos, sustitucion aleatoria significa que una posiciOn de aminoacido particular esta sustituida de manera aleatoria por un aminoacido seleccionado de un conjunto de dos o mas aminoacidos. En determinados casos, una posicion de aminoacido particular esta sustituida de manera aleatoria por un aminoacido seleccionado de un conjunto de cinco o mas aminoacidos. En determinados casos, una posiciOn de aminoacido particular esta sustituida de manera aleatoria por un aminoacido seleccionado de un conjunto de diez o mas aminoacidos. En determinados casos, una posiciOn de aminoacido particular esta sustituida de manera aleatoria por un aminoacido seleccionado de un conjunto de quince o mas aminoacidos. En determinados casos, una posiciOn de aminoacido particular esta sustituida de manera aleatoria por un aminoacido seleccionado de un conjunto de veinte o mas aminoacidos. En determinados casos, un polipeptido
que tiene una caracteristica deseada puede seleccionarse de un conjunto de polipeptidos aleatorizados usando al menos una tecnica seleccionada de presentacien en fagos, presentacien en E. coli, presentacion en ribosomas, seleccien de ARN-peptido, seleccien quimica, y similares.
En determinados casos, sustitucien aleatoria significa que una posiciOn de nucleotido particular este sustituida de
nnanera aleatoria por un nucleotido seleccionado de un conjunto de dos o mas nucleetidos. En determinados casos, una posicien de nucleetido particular este' sustituida de manera aleatoria por un nucleetido seleccionado de un conjunto de tres o mas nucleotidos. En determinados casos, una posicien de nucleetido particular este sustituida de manera aleatoria por un nucleetido seleccionado de un conjunto de cuatro o mas nucleotidos. En determinados casos, un polinucleotido que tiene uno o mas nucleetidos y/o tramos de nucleetidos aleatorizados codifica para un
polipeptido que tiene uno o mas aminoacidos y/o tramos de aminoacidos aleatorizados.
El termino "dominio de modulacien de PTH/PTHrP" se refiere a un polipeptido que se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2. En determinados casos, un dominio de modulacion de PTH/PTHrP comprende una secuencia que se produce de manera natural. En determinados casos, un dominio de modulacien de PTH/PTHrP comprende al menos un residuo y/o secuencia aleatorizados. Determinados dominios de modulacion de PTH/PTHrP a modo de
ejemplo se tratan en o pueden identificarse o derivarse de los documentos enumerados en las tablas lA y 2.
El termini° "PTH/PTHrP" o "peptido de PTH/PTHrP" se refiere a un polipeptido que comprende un dominio de modulacien de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio prepro edemas de un dominio de modulacion de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP comprende una parte de un dominio pre-pro edemas de un dominio de modulacien de PTH/PTHrP. El
termino "peptido de PTH/PTHrP" abarca peptidos de PTH/PTHrP maduros que resultan del procesamiento de un peptido de PTH/PTHrP que tiene un dominio pre-pro para eliminar ese dominio pre-pro. El termino "peptido de PTH/PTHrP" abarca cualquier producto intermedio que se forme durante el procesamiento de un peptido de PTH/PTHrP quo tiene un dominio pre-pro, incluso silos productos intermedios no se procesan adicionalmente.
El termino "agonista de PTH" se refiere a una molecula que se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2 y
provoca una respuesta en uno o mas ensayos de actividad de PTH como PTH de longitud complete. En determinados casos, una "respuesta similar" significa que el agonista de PTH aumenta una serial en un ensayo de actividad de PTH con respecto a un control en las mismas condiciones que PTH de longitud complete aumenta la serial con respecto al control en el mismo ensayo de actividad de PTH. En determinados casos, una "respuesta
similar" significa que el agonista de PTH disminuye una serial con respecto a un control en un ensayo de actividad
de PTH en las mismas condiciones que PTH de longitud complete disminuye la serial con respecto al control en el mismo ensayo de actividad de PTH. Determinados ensayos de actividad de PTH a modo de ejemplo se describen, por ejemplo, en el ejemplo 5 y en la publicacion PCT n.° WO 01/81415.
El tormino "antagonista de PTH" se refiere a una molecula que se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2 y bloquea o impide el efecto normal que PTH de longitud completa tiene sobre el receptor. Determinados ensayos de
actividad de PTH a modo de ejemplo se describen, por ejemplo, en el ejemplo 5 y en la publicacien PCT n.° WO 01/81415.
El termino "quo se produce de manera natural" tal como se aplica a un objeto significa que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipeptido o polinuclecitido que este presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza, se produce de manera natural.
El termino "molecule quimerica" se refiere a una molecule que comprende al menos dos componentes que normalmente no forman parte de la misma molecule. Cada componente de una molecule quimerica este unido a al menos otro componente de la molecule quimerica. En determinadas realizaciones, un primer componente de una molecule quimerica puede unirse covalentemente a un segundo componente que es igual a, o diferente de, el primer componente. Por tanto, como ejemplo no limitativo, en una molecule quimerica que comprende un anticuerpo frente
a RANKL y dos peptidos de PTH/PTHrP que tienen la misma secuencia, el anticuerpo frente a RANKL puede estar unido al primer peptido de PTH/PTHrP y el segundo peptido de PTH/PTHrP tambien puede estar unido al primer peptido de PTH/PTHrP.
El termino "unido" se refiere a componentes que ester) asociados o bien covalente o bien no covalentemente de manera que permanecen sustancialmente asociados en condiciones fisiologicas. En determinadas realizaciones, un
primer polipeptido y un segundo polipeptido pueden estar unidos covalentemente. En determinadas realizaciones, un primer polipeptido y un segundo polipeptido pueden estar unidos covalentemente traduciendo los polipeptidos primero y segundo como un polipeptido contiguo individual. En determinadas realizaciones, un primer polipeptido y un segundo polipeptido pueden estar unidos covalentemente sintetizando los polipeptidos primero y segundo como
un polipeptido contiguo individual. En determinadas realizaciones, un primer polipeptido y un segundo polipeptido pueden estar unidos covalentemente traduciendo y/o sintetizando los polipeptidos primero y segundo por separado, y luego uniendolos entre 51 quimica y/o enzimaticamente.
En determinadas realizaciones, cuando un polipeptido primero y segundo se traducen como un polipeptido contiguo individual, puede incluirse una secuencia de ligador entre el extremo C-terminal del primer polipeptido y el extremo
N-terminal del segundo polipeptido. En determinadas realizaciones, una secuencia de ligador es de entre 1 y 100 aminoacidos de longitud. En determinadas realizaciones, una secuencia de ligador es de entre 5 y 50 aminoacidos de longitud. En determinadas realizaciones, una secuencia de ligador es de entre 10 y 30 aminoacidos de longitud.
En determinadas realizaciones, un primer polipeptido y un segundo polipeptido ester) unidos covalentemente. En
determinadas realizaciones, un primer polipeptido y un segundo polipeptido se producen por separado, y luego se unen covalentemente entre si. Determinados ligadores covalentes peptidicos y no peptidicos a modo de ejemplo se conocen en la tecnica y/o se tratan en el presente documento.
En determinadas realizaciones, un primer polipaptido y un segundo polipeptido ester) unidos no covalentemente. En determinadas realizaciones, un primer polipeptido y un segundo polipeptido ester' unidos no covalentemente
incorporando en una primera secuencia de polipeptido un primer miembro de un par de uni6n e incorporando en una segunda secuencia de polipeptido un segundo miembro de un par de uni6n, de manera que cuando los polipeptidos primero y segundo se exponen el uno al otro en condiciones apropiadas, los miembros primero y segundo del par de union interaccionan y unen no covalentemente los polipeptidos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "par de uniOn" se refiere a dos molecules que se unen
especificamente entre si. Determinados pares de uniOn a modo de ejemplo incluyen biotina y avidina, biotina y estreptavidina, cola de His6 y niquel, albomina serica humana y sus peptidos de union, albilmina serica humana y un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo y su antigen°, un fragmento de anticuerpo y su antigen°, a NanobodyTM y su antigen°, y un anticuerpo frente a un dominio y su antigen°. Determinados NanobodiesTM a modo de ejemplo se
describen, por ejemplo, en las publicaciones PCT n. WO 03/050531, WO 04/041862, WO 04/041863, WO
04/041865, WO 04/041867, WO 04/062551 y la solicitud europea n.° 1456410. Determinados anticuerpos frente a dominio a modo de ejemplo se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.696.245 y las publicaciones PCT n.0's WO 04/058821, WO 04/003019 y WO 03/002609.
El termino "unido operativamente" se refiere a componentes que se encuentran en una relaciOn que les permite funcionar de su manera prevista. Por ejemplo, en el context° de una secuencia de polinucleOtido, una secuencia
control puede estar "unida operativamente" a una secuencia codificante cuando la secuencia control y la secuencia codificante estan asociadas de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con el funcionamiento de la secuencia control.
El termino "secuencia control" se refiere a secuencias de polinucleOtido que pueden efectuar la expresiOn y el procesamiento de secuencias codificantes a las que estan asociadas. La naturaleza de tales secuencias control
puede diferir dependiendo del organismo huesped. Determinadas secuencias control a modo de ejemplo para procariotas incluyen, pero no se limitan a, promotores, sitios de union ribosomicos y secuencias de terminaci6n de transcripciOn. Determinadas secuencias control a modo de ejemplo para eucariotas incluyen, per° no se limitan a, promotores y secuencias de terminacion de transcripci6n.
En determinadas realizaciones, una primera secuencia codificante de polinucle6tido este unida operativamente a una segunda secuencia codificante de polinucle6tido cuando las secuencias codificantes de polinucleotido primera y segunda se transcriben en un ARNm contiguo individual que puede traducirse en un polipeptido contiguo individual.
En el contexto de polipeptidos, dos o mas polipeptidos ester' "unidos operativamente" si cada polipeptido unido puede funcionar de su manera prevista. Un polipeptido que puede funcionar de su manera prevista cuando este unido operativamente a otro polipeptido puede funcionar o no de su manera prevista cuando no este unido operativamente a otro polipeptido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, puede que un primer polipeptido no pueda funcionar de su manera prevista cuando no este unido, pero puede estabilizarse al unirse a un segundo polipeptido de manera que Ilega a poder funcionar de su manera prevista. Alternativamente, en determinadas
realizaciones, un primer polipeptido puede funcionar de su manera prevista cuando no este unido, y puede retener esa capacidad cuando se une operativamente a un segundo polipeptido.
Tal como se usa en el presente documento, dos o mas polipeptidos estan "fusionados" cuando los dos o mas polipeptidos se unen traduciendose como una secuencia de polipeptido contiguo individual o sintetizandose como una secuencia de polipeptido contiguo individual. En determinadas realizaciones, dos o mas polipeptidos fusionados
pueden haberse traducido in vivo a partir de dos o mas secuencias codificantes de polinucleOtido unido operativamente. En determinadas realizaciones, dos o mas polipeptidos fusionados pueden haberse traducido in vitroa partir de dos o mas secuencias codificantes de polinucleOtido unido operativamente.
Tal como se usa en el presente documento, dos o mas polipeptidos estan "fusionados operativamente" si cada polipeptido unido puede funcionar de su manera prevista.
En determinadas realizaciones, un primer polipeptido quo contiene dos o mas unidades de polipeptido distintas se considera quo este unido a un segundo polipeptido siempre quo al menos una de las unidades de polipeptido distintas del primer polipeptido este unida al segundo polipeptido. Como ejemplo no limitativo, en determinadas realizaciones, un anticuerpo se considera unido a un segundo polipeptido en todos los siguientes casos: (a) el segundo polipeptido este unido a uno de los polipeptidos de la cadena pesada del anticuerpo; (b) el segundo polipeptido este unido a uno de los polipeptidos de la cadena ligera del anticuerpo; (c) una primera molecule del
segundo polipeptido esta unida a uno de los polipeptidos de la cadena pesada del anticuerpo y una segunda molecula del segundo polipeptido esta unida a uno de los polipdptidos de la cadena ligera del anticuerpo; y (d) las moldculas primera y segunda del segundo polipeptido estan unidas a los polipdptidos primero y segundo de la cadena pesada del anticuerpo y las moleculas tercera y cuarta del segundo polipdptido estan unidas a polipeptidos
primero y segundo de la cadena ligera del anticuerpo.
En determinadas realizaciones, la expresiOn "un primer polipeptido unido a un segundo polipeptido" abarca situaciones en las que: (a) sOlo una moldcula de un primer polipeptido esta unida a sOlo una molocula de un segundo polipeptido; (b) sal° una moldcula de un primer polipeptido esta unida a mas de una molecula de un segundo polipeptido; (c) mas de una molecula de un primer polipeptido esta unida a sOlo una molOcula de un segundo polipeptido; y (d) mds de una molecula de un primer polipdptido esta unida a mds de una molecula de un segundo polipdptido. En determinadas realizaciones, cuando una molecula unida comprende mas de una molocula de un primer polipdptido y sOlo una molecula de un segundo polipeptido, todas o casi todas las moldculas del primer polipeptido pueden estar unidas covalente o no covalentemente at segundo polipeptido. En determinadas realizaciones, cuando una moldcula unida comprende mds de una moldcula de un primer polipeptido, una o mds
moleculas del primer polipeptido pueden estar unidas covalente o no covalentemente a otras moldculas del prither polipeptido.
Tal como se usa en el presente documento, un "ligador flexible" se refiere a cualquier ligador quo no se prove, segun su estructura quimica, que vaya a fijarse en el espacio tridimensional. El expert° en la tecnica puede predecir Si un ligador particular es flexible en su context° previsto.
Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen su uso convencional. \lease Immunology--A Synthesis, 2a ediciOn, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991). En determinadas realizaciones, uno o mds aminoacidos no convencionales pueden incorporarse en un polipeptido. El termino "aminoacido no convencional" se refiere a cualquier aminokido que no sea uno de los veinte aminoacidos convencionales. El termino "aminoacidos que no se producen de manera natural"
serefiere a aminokidos que no se encuentran en la naturaleza. Los aminoacidos quo se no producen de manera natural son un subconjunto de aminoacido no convencionales. Los aminoacidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a, estereoisOmeros (por ejemplo, D-aminoacidos) de los veinte aminoacidos convencionales, aminoacidos a-,a-disustituidos, N-alquilaminodcidos, acid° lactic°, homoserina, homocisteina, 4-hidroxiprolina, ycarbo xi glutam at o, c-N,N,N-trimetil-lisina, E-N-acetil-lisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3
metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y cualquier otro aminoacido e iminoacido no convencional (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) y conocido en la tecnica. Los residuos de aminoacidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a, peptidomimeticos y otras formas inversas o invertidas de restos de aminoacido. En la notaciOn de polipdptido usada en el presente documento, la direcciOn hacia la izquierda es la direcciOn amino terminal y la direcciOn hacia la derecha es la direcci6n carboxilo terminal, segun el uso y convenciOn habituates.
En determinados casos, las sustituciones de aminokidos conservativas incluyen la sustituciOn por uno o mas residuos de aminoacidos no convencionales. En determinados casos, los residuos de aminoacidos no convencionales se incorporan mediante sintesis de peptidos quimica en vez de sintesis en sistemas biolOgicos.
El termino "residuo acido" se refiere a un residuo de aminoacido en forma D o L quo comprende al menos un grupo acid° cuando se incorpora en un polipdptido entre otros dos residuos de aminoacido quo son iguales o diferentes.
En determinadas realizaciones, un residuo acid° comprende una cadena lateral quo comprende al menos un grupo acid°. Los residuo acidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, acid° aspartico (D) y acid° glutdmico (E). En determinadas realizaciones, un residuo acid° puede ser un aminoacido no convencional.
El tannin° "residuo aromatico" se refiere a un residuo de aminoacido en forma D o L quo comprende al menos un grupo aromatic°. En determinadas realizaciones, un residuo aromatic° comprende una cadena lateral que
comprende al menos un grupo aromatic°. Los residuos aromaticos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptofano (W). En determinadas realizaciones, un residuo aromatic° puede ser un aminodcido no convencional.
El termino "residua basico" se refiere a un residuo de aminoacido en forma D o L quo puede comprender al menos un grupo basic° cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, un residuo basic° comprende una cadena lateral quo comprende al menos un grupo basic°. Los residuos basicos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, histidina (H), lisina
(K) y arginina (R). En determinadas realizaciones, un residuo basic° puede ser un aminoacido no convencional.
Los terminos "residuo hidrOfilo" y "Haa" se refieren a un residuo de aminoacido en forma D o L quo comprende al menos un grupo hidrofilo y/o un grupo polar cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminokido
que son iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, un residuo hidrOfilo comprende una cadena lateral quo comprende al menos un grupo hidrofilo y/o un grupo polar. Los residuos hidrofilos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, alanina (A) cisteina (C), acid° aspartico (D), acid° glutdmico (E), histidina (H), lisina (K), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R), serina (S) y treonina (T). En determinadas realizaciones, un residuo hidrOfilo puede ser un aminoacido no convencional.
El termino "residuo hidrOfilo neutro" se refiere a un residuo de aminoacido en forma D o L que comprende al menos un grupo hidrOfilo y/o polar, pero no comprende un grupo acid° o basic° cuando se incorpora en un polipaptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes. Los residuos hidrOfilos neutros a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, alanina (A), cisteina (C), serina (S), treonina (T), asparagina (N) y glutamina (Q). En
determinadas realizaciones, un residuo hidrofilo neutro puede ser un aminoacido no convencional.
Los tarminos "residuo lipofilo" y "Laa" se refieren a un residuo de aminoacido en forma D o L que tiene al menos un grupo no cargado, alifatico y/o aromatic°. En determinadas realizaciones, un residuo lipofilo comprende una cadena lateral que comprende al menos un grupo no cargado, alifatico y/o aromatic°. Las cadenas laterales lip6filas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, alanina (A), fenilalanina (F), isoleucina (I), leucina (L), norleucina (Nle),
metionina (M), valina (V), triptofano (W) y tirosina (Y). En determinadas realizaciones, un residuo lipOfilo puede ser un aminoacido no convencional.
El termini "residuo anfifilo" se refiere a un residuo de aminoacido en forma D o L que puede ser un residuo o bien hidrofilo o bien lip6filo. Un residuo anfifilo a modo de ejemplo incluye, pero no se limita a, alanina (A). En determinadas realizaciones, un residuo anfifilo puede ser un aminoacido no convencional.
El tannin° "residuo no funcional" se refiere a un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes. Los residuos no funcionales de aminoacido a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, metionina (M), glicina (G), alanina (A), valina (V), isoleucina (I), leucina (L) y norleucina (Nle). En determinadas realizaciones,
un residuo no funcional puede ser un aminoacido no convencional.
En determinadas realizaciones, glicina (G) y prolina (P) se consideran residuos de aminoacido que pueden influir en la orientaciOn de la cadena de polipeptido.
En determinados casos, una sustituci6n conservativa puede implicar reemplazar un miembro de un tipo de residuo por un miembro del mismo tipo de residuo. Como ejemplo no limitativo, en determinados casos, una sustituciOn conservativa puede implicar reemplazar un residuo acido, tal como D, por un residuo acido diferente, tal como E. En
determinados casos, una sustitucion no conservativa puede implicar reemplazar un miembro de un tipo de residuo por un miembro de un tipo de residuo diferente. Como ejemplo no limitativo, en determinados casos, una sustituciOn no conservativa puede implicar reemplazar un residuo acid°, tal como D, por un residuo basic°, tal como K. En determinados casos, un residuo de cisteina esta sustituido por otro residuo de aminoacido para impedir la formaciOn de enlaces disulfuro con esa posiciOn en el polipeptido.
Alrealizar sustituciones conservativas o no conservativas, segun determinados casos, debe considerarse el indice hidropatico de los aminoacidos. A cada aminoacido se le ha asignado un indice hidropatico basandose en sus caracteristicas de hidrofobicidad y carga. Estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteina/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina
(-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
En la tecnica se entiende la importancia del indice hidropatico de los aminoacidos para conferir funciOn biologica interactiva a un polipeptido. Vease, por ejemplo, Kyte et al. , J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). En determinados casos se sabe que determinados aminoacidos pueden sustituirse por otros aminoacidos que tienen una puntuaciOn
o indice hidropatico similar y aun mantener una actividad biolOgica similar. Al realizar cambios basandose en el
indice hidropatico, en determinadas realizaciones, se incluye la sustituciOn de aminoacidos cuyos indices hidropaticos estan dentro de ±2. En determinadas realizaciones, se incluyen los que estan dentro ±1 y en determinadas realizaciones, se incluyen los que estan dentro de ±0,5.
En la tecnica tambien se entiende que la sustituci6n de aminoacidos similares puede realizarse eficazmente basandose en la hidrofilicidad, particularmente cuando el polipeptido biolOgicamente funcional creado de esta manera se preve para su uso en realizaciones inmunolOgicas, tal como el presente caso. En determinadas
realizaciones, la hidrofilicidad promedio local mas alta de un polipeptido, tal como viene determinada por la hidrofilicidad de sus aminoacidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biolOgica del polipeptido.
Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoacido: arginina (+3,0); lisina
(+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y tript6fano (-3,4). Al realizar cambios basandose en valores de hidrofilicidad similares, en determinados casos, se incluye la sustituciOn de aminoacidos cuyos valores de hidrofilicidad estan dentro de ±2, en determinados casos, se incluyen los que estan dentro de ±1, y en determinados
casos, se incluyen los que estan dentro de ±-0,5. En determinados casos, tambien pueden identificarse epitopos a partir de secuencias primarias de aminoacidos basandose en la hidrofilicidad. Estas regiones tambien se denominan "regiones de nixie° epitOpico".
En la tabla 1 se exponen sustituciones de aminoacidos a modo de ejemplo.
Tabla 1: Sustituciones de aminoacidos
Resi duos ori gi nal es Sustituciones a modo de ejempl o Sustituci ones a modo de
ejempl o mds especificas
Al a
Val , Leu, I l e Val
Arg
Lys, Gi n, Asn Lys
Asn
Gi n Gi n
Asp
Gl u Gl u
Cys
Ser, Al a Ser
Gi n
Asn Asn
Gl u
Asp Asp
Gly
Pro, Al a Al a
Hi s
Asn, Gi n, Lys, Arg Arg
I l e
Leu, Val , Met, Al a, Phe, Norl euci na Leu
Leu
Norl euci na, I le, Val , Met, Al a, Phe I l e
Lys
Arg, aci do 1 , 4-di ami nobutfrico, Gi n, Asn Arg
Met
Leu, Phe, I l e Leu
Phe
Leu, Val , I le, Al a, Tyr Leu
Pro
Al a Gl y
Ser
Thr, Al a, Cys Thr
Thr
Ser Ser
Trp
Tyr, Phe Tyr
Tyr
Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val
I l e, Met, Leu, Phe, Al a, Norl euci na Leu
En determinados casos, un experto en la tecnica podra determinar var'antes de sustitucion adecuadas de un polipeptido de referencia usando tecnicas bien conocidas. En determinados casos, un expert° en la tecnica puede identificar areas adecuadas de la molecula que pueden cambiarse sin destruir la actividad seleccionando como
5 diana regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En determinados casos, pueden identificarse residuos y partes de las moleculas que se conservan entre polipeptidos similares. En determinados casos, las areas que pueden ser importantes para la actividad biolOgica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoacidos conservativas sin destruir la actividad biolOgica o sin afectar de manera adversa la estructura del polipeptido.
10 Adicionalmente, en determinados casos, un expert° en la tecnica puede revisar estudios de fund& estructural que identifican residuos en polipdptidos similares que son importantes para la actividad y/o la estructura. En vista de una comparaciOn de este tipo, en determinados casos, puede predecirse la importancia de los residuos de aminoacido en un polipeptido que corresponden a residuos de aminoacido que son importantes para la actividad o la estructura en polipeptidos similares. En determinados casos, un expert() en la tecnica puede optar por sustituir aminoacidos
15 similares quirnicamente para tales residuos de aminoacido importantes predichos.
En determinados casos, un expert° en la tecnica tambion puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoacidos en relaciOn con la estructura en polipdptidos similares. En vista de tal informacion, en determinados casos, un expert() en la tecnica puede predecir el alineamiento de residuos de aminokido de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En determinados casos, un expert° en la tecnica puede elegir no realizar 20 cambios de radicales a los residuos de aminokido que se predice que estan en la superficie del polipeptido, puesto que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moldculas. Ademds, en determinados casos, un expert° en la tecnica puede generar variantes de prueba que contienen una unica sustituci6n de aminoacido en cada residuo de aminokido deseado. En determinados casos, las variantes pueden seleccionarse entonces usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la tecnica. En determinados 25 casos, tales variantes podrian usarse para reunir informaciOn sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, en determinados casos, si se ha descubierto que un cambio en un residuo de aminoacido particular dio como resultado activad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, pueden evitarse variantes con un cambio de ese tipo. En otras palabras, basandose en la informaci6n reunida a partir de tales experimentos de rutina, un expert() en la tecnica puede determinar fdcilmente los aminoacidos en los que deben evitarse sustituciones adicionales o bien
30 solas o bien en combinacion con otras mutaciones.
Varias publicaciones cientificas se han dedicado a la prediccion de la estructura secundaria. \Manse, por ejemplo, Moult J., Curr, Op. en Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al. , Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al. , Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al. , Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et aL, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al. , Biophys. J., 26:367-384 (1979). Ademds, actualmente estan
35 disponibles programas informaticos para ayudar con la prediccion de la estructura secundaria. Un metodo a modo de ejemplo de prediccion de la estructura secundaria se basa en el modelado por homologia. Por ejemplo, en determinados casos, dos polipeptidos que tienen una identidad de secuencia mayor del 30%, o de manera similar mayor del 40% pueden tener topologias estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural de proteinas (PDB) ha proporcionado predictibilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el
nOmero posible de plegamientos dentro de la estructura de un polipeptido. \tease, por ejemplo, Holm etal. , Nucl. Acido. Res., 27(1):244-247 (1999). Se ha sugerido que existe un n6mero limitado de plegamientos en un polipeptido dado y que una vez se han resuelto un numero critic° de estructuras, la predicci6n estructural se volverd drasticamente mds precisa. Vease, por ejemplo, Brenner etal. , Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997).
5 M6todos a modo de ejemplo adicionales de predicciOn de la estructura secundaria incluyen, pero no se limitan a, "reconocimiento de plegamiento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al. , Structure, 4(1):15-19 (1996).), "andlisis de perfil" (Bowie et aL, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et aL, Met. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al. , Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), y "union evolutiva" (vease Holm, citado anteriormente (1999) y Brenner, citado anteriormente (1997)).
10 En determinados casos, la identidad y la similitud de los polipeptidos pueden calcularse facilmente mediante metodos conocidos. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Secuence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,
15 Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo etaL,SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988).
En determinados casos, los metodos para determinar la identidad se disetian para dar la maxima coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Determinados metodos para determinar la identidad a modo de ejemplo se describen en programas informaticos disponibles para el public°. Los metodos de programa informatico a modo de 20 ejemplo para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete del programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al. , Nucl. Acido. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et aL, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX esta disponible al public° a partir del Centro nacional de informacion biotecnolOgica (National Center forBiotechnology Information) (NCB') y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul etaL NCB/NLM/NIH Betesda,
25 MD20894; Altschul etal. , citado anteriormente (1990)). En determinados casos, el algoritmo de Smith Waterman, que se conoce en la tecnica, tambien puede usarse para determinar la identidad.
Determinados esquemas de alineacion para alinear dos secuencias de aminoacidos pueden dar como resultado el
acoplamiento de solo una region coda de las dos secuencias, y esta region alineada pequelia puede tener una
identidad de secuencia muy alta incluso aunque no haya ninguna relacion significativa entre las dos secuencias de
30 longitud completa. Por consiguiente, en determinados casos, el metodo de alineaciOn seleccionado (programa GAP) dard como resultado un alineamiento que abarca al menos 50 aminoacidos contiguos del polipeptido diana.
Por ejemplo, usando el algoritmo informatico GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), se alinean dos polipeptidos para los que el porcentaje de identidad de secuencia va a determinarse para la coincidencia Optima de sus respectivos aminoacidos (el "intervalo de coincidencia", tal como se determina mediante 35 el algoritmo). En determinados casos, se usan una penalizaciOn por apertura de hueco (que se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparaci6n que se esta usando; la "diagonal" es la puntuaciOn o numero asignado a cada coincidencia de aminoacido perfecta mediante la matriz de comparaciOn particular) y una penalizacian por extension de hueco (que es habitualmente 1/10 veces la penalizacion por apertura de hueco), asi como una matriz de comparaciOn tal como PAM 250 o BLOSUM 62 junto
40 conel algoritmo. En determinados casos, tambien se usa una matriz de comparacion habitual mediante el algoritmo. Vease, por ejemplo, Dayhoff et aL, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para la matriz de comparaciOn PAM 250; Henikoff et aL, Proc. Natl. Acad Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparaciOn BLOSUM 62.
En determinados casos, los parametros para una comparaci6n de la secuencia de polipeptido incluyen los 45 siguientes:
Algoritmo: Needleman etaL, J. Mol. Blol., 48:443-453(1970);
Matriz de comparaciOn: BLOSUM 62 de Henikoff etal., citado anteriormente (1992); PenalizaciOn de hueco: 12
Penalizacion de longitud de hueco: 4
Umbral de similitud: 0
En determinados casos, el programa GAP puede ser 6til con los parametros anteriores. En determinados casos, los
parametros mencionados anteriormente son los parametros por defecto para comparaciones de polipeptidos (junto
con ninguna penalizaciOn para huecos finales) usando el algoritmo GAP.
Segtin determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoacidos son las que: (1) reducen la susceptibilidad a la
50 proteOlisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidaciOn, (3) alteran la afinidad de uniOn para formar complejos de proteinas, (4) alteran afinidades de uni6n, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquirnicas o funcionales en tales polipeptidos. Segun determinados casos, pueden realizarse sustituciones de aminoacidos individuales o m6Itiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoacidos conservativas) en la
secuencia que se produce de manera natural (en determinados casos, en la parte del polipeptido fuera del/de los dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares).
En determinados casos, una sustituci6n de aminoacido conservative normalmente no puede cambiar sustancialmente las caracteristicas estructurales de la secuencia original (por ejemplo, en determinadas realizaciones, un aminoacido de reemplazo no debe tender a romper una hOlice que se produce en la secuencia original, ni alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia original). Determinados ejemplos de estructuras secundaria y terciaria de polipeptido reconocidas en la tecnica se describen, por ejemplo, en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y
Thornton etaL Nature 354:105 (1991).
En determinados casos, una sustituciOn de aminoacido conservative tiene poco o ningen efecto sobre la polaridad de la carga en esa posicion. En determinadas realizaciones, cualquier residuo nativo en un polipeptido puede sustituirse con alanina, tal coma se ha descrito anteriormente para "mutagenesis de exploraciOn de alanina". \tease, par ejemplo, MacLennan etaLActa Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67 (1998); y Sasaki ofal.Adv. Biophys. 35: 1-24
(1998).
El t6rmino "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto o a un fragmento de un anticuerpo que compite con el anticuerpo intacto par la uni6n a antigen°. En determinadas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo se producen mediante tecnicas de ADN recombinante. En determinadas realizaciones, fragmentos de anticuerpo se producen mediante escisiOn enzimatica o quimica de anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpo a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv. Los fragmentos de anticuerpo a modo de ejemplo tambien incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de dominio, nanocuerpos, minicuerpos ((scFv-CH3)2), maxicuerpos ((scFv-CH2-CH3)2), diacuerpos (dimero no covalente de scFv). Un fragmento de anticuerpo puede estar unido, opcionalmente, a una regi6n de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) que comprende una o mas de regiones CH1, CH2 y CH3. En determinadas realizaciones, un anticuerpo puede comprender una o mas cadenas
pesadas, una o mas cadenas ligeras, o una o mas de cadenas tanto ligeras coma pesadas, o fragmentos de las mismas que pueden unirse a antigen°.
Pueden producirse anticuerpos especificos para un antigen° de varies maneras. En determinados casos, un antigen° que contiene un epitopo de inter6s puede introducirse en un huesped animal (par ejemplo, un ratOn), produciendo asi anticuerpos especificos para ese epitopo. En determinados casos, los anticuerpos especificos para
un
epitopo de interes pueden obtenerse a partir de muestras biologicas tomadas de huespedes que se expusieron de manera natural al epitopo. En determinados casos, la introducci6n de loci de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los que se han inactivado los genes de Ig end6gena, ofrece la oportunidad de obtener anticuerpos
monoclonales (MAb) completamente humanos.
Las unidades estructurales de anticuerpo que se producen de manera natural comprenden normalmente un
tetramero. Un tetramero comprende normalmente dos pares identicos de cadenas de polipeptido, teniendo cada par una cadena ligera (en determinadas realizaciones, de aproximadamente 25 kDa) y una cadena pesada (en determinadas realizaciones, de aproximadamente 50-70 kDa).
El termino "cadena pesada" se refiere a una polipeptido de cadena pesada que tiene suficiente secuencia de regi6n variable para conferir especificidad para un antigen° particular. Par tanto, el termino "cadena pesada", tal coma se
usa en el presente documento, abarca una cadena pesada de longitud complete y fragmentos de la misma. Una cadena pesada de longitud complete comprende normalmente un dominio de region variable, VH, y tres dominios de region constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH se encuentra en el extremo amino terminal del polipeptido, y el
dominio CH3 se encuentra en el extremo carboxilo terminal. Una "cadena pesada" puede comprender un dominio VH,
o una parte de un dominio VH quo comprende una o mas de las regiones determinantes de complementariedad
(CDR). Una "cadena pesada" puede incluir opcionalmente uno o mas dominios de region constante, CH1, C92 y/o CH3.
El tannin° "cadena ligera" se refiere a cualquier polipeptido que tiene suficiente secuencia de regi6n variable de cadena ligera para conferir especificidad para un epitopo particular. Par tanto, el termino "cadena ligera", tal coma se usa en el presente documento, abarca una cadena ligera de longitud complete y fragmentos de la misma. Una cadena ligera de longitud complete comprende normalmente un dominio de regi6n variable, VL, y un dominio de
regi6n constante, CL. El dominio de region variable de la cadena ligera se encuentra en el extremo amino terminal del polipeptido. Una "cadena ligera" puede comprender un dominio VL, o una patio de un dominio VL quo comprende una o mas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Una "cadena ligera" puede incluir
opcionalmente un dominio de region constante (CL).
Laparte amino terminal de cada cadena incluye normalmente una regi6n variable (VH en la cadena pesada y VL en la cadena ligera) de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman normalmente el sitio de uni6n a antigen°. La parte carboxilo terminal de cada cadena define normalmente una region constante (dominios CH en la cadena pesada y CL en la cadena ligera) quo puede ser
responsable de la funcion efectora. Las funciones efectoras de anticuerpo a modo de ejemplo incluyen la activacion
del complemento y la estimulaciOn de opsonofagocitosis. Las cadenas ligeras humanas que se producen de manera natural se clasifican normalmente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas humanas que se producen de manera natural se clasifican normalmente como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el is6topo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varies subclases, que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgM1 e IgM2. IgA tiene subclases que incluyen, pero no se limitan a, IgA1 y IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas que se producen de manera natural, normalmente, las regiones variable y constante estan unidas normalmente por una regiOn "J" de aproximadamente 12 o mas aminoacidos, incluyendo la cadena pesada tambien normalmente una regiOn "D" de aproximadamente 10 mas aminoacidos. \lease, por ejemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed.
Raven Press, N.Y. (1989)).
En un anticuerpo que se produce de manera natural, las regiones variables presentan normalmente la misma estructura general de las regiones de entramado (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, tambien denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de cada par se alinean normalmente mediante las regiones de entramado, que pueden
permitir la uniOn a un epitopo especifico. Desde el extfemo N-terminal hasta el extremo C-terminal, las regiones variables de la cadena tanto pesada como ligera comprenden normalmente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignacion de aminoacidos a cada dominio es normalmente segtra las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Betesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia etal. Nature 342:878-883 (1989).
Tal como se trat6 anteriormente, existen varios tipos de fragmentos de anticuerpo. Un fragmento Fab se compone de una cadena ligera y el Chi y las regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molecule Fab no puede formar un enlace de disulfuro con otra molecule de cadena pesada. Un fragmento Fab' contiene una cadena ligere y una cadena pesada que contiene mas de la region constante, entre los dominios CH1 y CH2, de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molecule
F(ab')2. Un fragmento Facb es similar a una molecule F(ab')2, excepto porque la regi6n constante en las cadenas pesadas de la molecule se extiende hasta el extern° del domino CH2.
Un fragmento Fv comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras, pero carece de las regiones constantes. Un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) comprende regiones variables de cadena pesada y ligera conectadas por un ligador flexible para formar una cadena de polipeptido individual que forma una region de
uniOn a antigen°. Los anticuerpos de cadena sencilla a modo de ejemplo se tratan en detalle, por ejemplo, en el documento WO 88/01649 y las patentes estadounidenses n.c's 4.946.778 y 5.260.203.
Normalmente, se entiende que un anticuerpo bivalente tiene dos sitios de uniOn a antigen° identicos. Sin embargo, un anticuerpo "biespecifico" o "multiespecifico" o "bifuncional" o "multifuncional", en determinadas realizaciones, es un anticuerpo hibrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de union a
antigen° diferentes. Los anticuerpos biespecificos pueden producirse mediante una variedad de metodos que incluyen, pero no se limitan a, fusiOn de hibridomas o union de fragmentos Fab'. \tease, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny etal. J. Immunol. 148:1547-1553(1992).
El termino "cadena pesada" incluye cualquier polipeptido de cadena pesada que tiene suficiente secuencia de regi6n variable para conferir especificidad para un RANKL. En determinadas realizaciones, una cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 que incluye al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 2. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 que incluye al menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 2. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento
dela secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 que incluye al menos tres regiones determinantes de complementerieded (CDR) de SEQ ID NO: 2. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 que contiene la parte de cadena pesada de un sitio de uniOn a antigen°.
En determinadas realizaciones, una regi6n variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de
SEQ ID NO: 11. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 que incluye al menos una regi6n determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 11. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 que incluye al menos dos regiones determinantes de complementerieded (CDR) de SEQ ID NO: 11. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de
aminoacidos de SEQ ID NO: 11 que incluye al menos tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 11. En determinados casos, una cadena pesada comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 que contiene la parte de cadena pesada de un sitio de uniOn a antigen°.
El termino "cadena ligera" incluye cualquier polipeptido de cadena ligera que tiene suficiente secuencia de regi6n variable para conferir especificidad para un RANKL. En determinadas realizaciones, una cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento
de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 que incluye al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 4. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento de la secuencia de aminokidos de SEQ ID NO: 4 que incluye al menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 4. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento
de la secuencia de aminokidos de SEQ ID NO: 4 que incluye al menos tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 4. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 que contiene la parte de cadena ligera de un sitio de uni6n a antigen°.
En determinadas realizaciones, una region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de
SEQ ID NO: 12. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 que incluye al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 12. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 que incluye al menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 12. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento de la secuencia de
aminoacidos de SEQ ID NO: 12 que incluye al inenos tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 12. En determinados casos, una cadena ligera comprende un fragmento de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12 que contiene la parte de cadena ligera de un sitio de uni6n a antigen°.
Un anticuerpo inhibe sustancialmente la union de RANKL a RANK cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de RANKL unido a RANK en al menos aproximadamente el 20%, el 40%, el 60%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o mds (tal como se mide mediante un ensayo de uniOn competitive invitroconocido en la tecnica).
El termino "epftopo" se refiere a un determinante de polipeptido que puede unirse especificamente a un anticuerpo. En determinados casos, los determinantes epitOpicos incluyen agrupamientos superficiales quimicamente activos de molecules tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucares, fosforilo o sulfonilo, y, en determinadas realizaciones, pueden tener caracteristicas estructurales tridimensionales especificas y/o caracteristicas de carga especificas. Un epitopo es una region de un antigen° quo esta enlazada por un anticuerpo. En determinados casos, se dice quo un anticuerpo se une especificamente a un antigen° cuando reconoce preferentemente su antigen° diana en una mezcla compleja de polipeptidos y/o macromolecules. En determinados casos, se dice que un anticuerpo se une especificamente a un antigen° cuando la constante de disociaciOn es 5 1 RM, en determinados casos, cuando la constante de disociaciOn es 5 100 nM, y en determinados casos, cuando la constante de
disociaciOn es 5 10 nM.
El termino "polinucleOtido" se refiere a una forma polimerica de nucleOtidos de al menos 3 bases de longitud. En determinados casos, un polinucleotido comprende desoxirribonucleotidos. En determinados casos, un polinucleOtido comprende ribonucleOtidos. En determinados casos, un polinucleotido comprende uno o mds desoxirribonucleotidos y uno o mds ribonucleOtidos. En determinados casos, un polinucleotido comprende uno o mds
desoxirribonucleOtidos modificados y/o ribonucleOtidos modificados. El termino "polinucleotido" incluye formas mono y bicatenarias de acidos nucleicos. En determinados casos, un polinucleotido comprende al menos un marcador para la detecciOn.
El termino "polinucleOtido aislado" se refiere a un polinucleOtido de origen genornico, ADNc o sintetico o alguna combinaciOn de los mismos. Un "polinucleotido aislado" esta o bien (1) no asociado con todo o una parte de un
polinucleotido en el que el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza, o bien (2) unido a un polinucleckido al quo no esta unido en la naturaleza o bien (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia mas grande.
A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de secuencias monocatenarias de polinucleOtido es el extremo 5'. A menos quo se especifique lo contrario, el extremo derecho de secuencias monocatenarias de polinucleOtido es el extremo 3'. A menos que se especifique lo contrario, la direccion izquierda de secuencias bicatenarias de polinucledtido se denomina la direcciOn 5'. A menos que se especifique lo contrario, la direccion derecha de secuencias bicatenarias de polinucleotido se denomina la direccien 3'. La direcci6n de adicien de 5' a 3' de transcritos de ARN en formaci6n se denomina la direcciOn de transcripcion. En determinados casos, "secuencias en el sentido de 5'" en una cadena de ADN se refieren a secuencias que estan 5' de la regiOn codificante de
polipeptido de la cadena de ADN. En determinados casos, "secuencias en el sentido de 3' en una cadena de ADN se refieren a secuencias quo estdn 3' de la regi6n codificante de polipeptido de la cadena de ADN.
En determinados casos, un polinucledtido comprende uno o mas nucledtidos que se producen de manera natural. En determinados casos, un polinucleetido comprende uno o mas nucleOtidos quo no se producen de manera natural. En determinados casos, un polinucleotido comprende uno o mas nucleotidos quo se producen de manera natural y
unoo rids nucleOtidos que no se producen de manera natural.
El tannin° "nucleotidos que se producen de manera natural" se refiere a nucleotidos que pueden encontrarse libres y/o on polinucleotidos on la naturaleza. Los nucleotidos quo se producen de manera natural incluyen, pero no se limitan a, desoxirribonucleOtidos y ribonucledtidos. Los desoxirribonucleOtidos incluyen, pero no se limitan a, adenosina, guanina, citosina y timidina. Los ribonucleOtidos incluyen, pero no se limitan a, adenosina, citosina,
timidina y uracilo. El termino "nucleotidos que no se producen de manera natural" o "nucleOtidos modificados" se refiere a nucleOtidos que no se encuentran libres o en polinucleOtidos en la naturaleza. Los nucle6tidos que no se producen de manera natural y nucleotidos modificados incluyen, pero no se limitan a, nucleOtidos con grupos azikar modificados o sustituidos y nucle6tidos con grupos de base de nucleOtido modificados o sustituidos.
Los tOrminos "enlace polinucleotidico" y "enlace oligonucleotidico" se usan de manera intercambiable y se refieren a un resto quimico que une un primer nucleotido con un segundo nuclei:Mid°. Los enlaces polinucleotidicos incluyen, pero no se limitan a, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato fosforaniladato y fosforoamidato. Vdanse, por ejemplo, LaPlanche et aL Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et aL
J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et aL Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug
Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pags. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec etaL patente estadounidense n.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543(1990).
En determinados casos, se produce un polinucleOtido de manera sintetica. En determinados casos, se produce un polinucleOtido enzimaticamente. Tal produccion enzimdtica de polinucleOtidos puede producirse in vivo, tal como, por
ejemplo, en una calula; o puede producirse in vitro, tal como, por ejemplo, en una reacciOn en cadena de la polimerasa (PCR). En la tecnica se conocen metodos a modo de ejemplo de producciOn de polinucleOtidos de manera sintetica y enzimaticamente. Tambion se conocen en la tecnica metodos a modo de ejemplo de union de dos o mds polinucleOtidos quimica o enzimaticamente (por ejemplo, usando una ligasa).
En determinados casos, los polinucleOtidos pueden mutarse de tal manera que la secuencia del peptido codificado
nocambia. Como ejemplo no limitativo, la secuencia de polinucleOtido puede cambiarse a codones mas compatibles con la celula hudsped elegida. Para determinadas cdlulas huesped bacterianas, de mamifero y de insecto, en determinadas realizaciones, se conocen en la tecnica codones optimizados. Adicionalmente, como ejemplo no limitativo, pueden sustituirse codones para eliminar sitios de restricciOn o para incluir sitios de restricciOn silenciosos, que pueden ayudar en la estabilidad, la expresi6n o el procesamiento del polinucleotido en la celula huesped
seleccionada.
El termino "agente" se refiere a un compuesto quimico, a una mezcla de compuestos quimicos, a una molecula biologica o a un extract° hecho de materiales biolOgicos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "marcador" se refiere a cualquier molecula que puede detectarse. En determinados casos, un polipeptido puede marcarse mediante la incorporaciOn de un aminodcido radiomarcado. En determinadas realizaciones, pueden unirse al polipOptido restos de biotina que pueden detectarse mediante avidina o estreptavidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede detectarse mediante metodos 6pticos o colorimetricos). En determinados casos, puede incorporarse un marcador en o unirse a otro reactivo que a su vez se une al polipdptido de interes. Por ejemplo, puede incorporarse un marcador en o unirse a un anticuerpo que a su vez se une especificamente al polipeptido de interes. En determinados casos, la etiqueta o el marcador tambien puede ser terapeutico. En la tecnica se conocen y pueden usarse diversos metodos de marcaje de polipeptidos y glicoproteinas. Determinadas clases generales de marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores enzimaticos, fluorescentes, quimioluminiscentes y radiactivos. Los ejemplos de marcadores para polipdptidos incluyen, pero no se limitan a, los
14C, 15N, 35s, 90y, 99-rc, 111 in, 1251,
3111),
siguientes: radioisOtopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, marcadores
fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceina (FITC), rodamina, fosforos lantdnidos, ficoeritrina (PE)), marcadores enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa del rabano, f3-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, penicilinasa, luciferasa), grupos biotinilo, quimioluminiscentes, epitopos polipeptidicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de uniOn para anticuerpos
secundarios, dominios de uniOn a metal, etiquetas de epftopo). En determinadas realizaciones, los marcadores estan unidos mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento esterico.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "vehiculo" se refiere a una molecula que tiene una o mas propiedades seleccionadas de: reduce la degradacion de otra moldcula; aumenta la semivida de otra molecula; reduce la toxicidad de otra molecula; reduce la inmunogenicidad de otra molecula; y aumenta la actividad biolOgica deotra moldcula. Los vehiculos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un dominio Fc, un polimero lineal (incluyendo, pero sin limitarse a, polietilenglicol (PEG), polilisina y dextrano), un polimero de cadena ramificada (vdanse por ejemplo, las patentes estadounidenses n.°s 4.289.872; 5.229.490; y la publicaciOn PCT n.° WO 93/21259), un lipid°, un grupo colesterol (tal como un esteroide), un hidrato de carbono u oligosacdrido, albtlmina serica humana (HSA) y moleculas relacionadas, transtiretina (TTR) y moldculas relacionadas y cualquier proteina,
polipeptido o peptido natural o sintetico que se une a un receptor salvaje. En la tecnica se conocen determinados vehiculos a modo de ejemplo y/o se tratan en el presente documento.
El termino "muestra biolOgica" incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o ser anteriormente vivo. Tales seres vivos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, colulas, Organos, tejidos,
hueso, modula Osea, ganglios linfaticos y piel.
El termini) "trastorno osteopenico" se refiere a un estado que esta caracterizado al menos en parte por un aumento de la resorcion esea y/o una perdida de masa Osea o densidad Osea. El termino "trastorno osteopenico" incluye, pero no se limita a, osteoporosis, osteopenia, enfermedad de Paget, osteomielitis, hipercalcemia, osteonecrosis, hiperparatiroidismo, metastasis esea Rica, periodontitis, artritis reumatoide, caquexia y anorexia, alopecia y perdida 5 Osea debida a inmovilizacien. El termino "trastorno osteopenico" tambien incluye, pero no se limita a, canceres que aumentan la actividad de los osteoclastos, inducen resorcien Osea y/o dan como resultado una perdida de masa Osea o densidad Osea, incluyendo, pero sin limitarse a, cancer de mama, de prostate y mieloma multiple, incluyendo determinados canceres que se sabe que producen factores que dan como resultado sobreexpresien de RANKL en el hueso, y determinados canceres que conducen a un aumento del numero y la actividad de los osteoclastos. El
termino "trastorno osteopenico" tambien incluye trastornos inflamatorios o autoinmunitarios que estan caracterizados al menos en parte por un aumento de la resorci6n esea y/o una perdida de masa esea o densidad esea e incluye, pero no se limita a, artritis reumatoide, artritis psoridsica, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino.
Los terminos "agente farmaceutico", "farmaco" o "agente terapeutico" tal como se usan en el presente documento se refieren a un compuesto quirnico o composici6n que puede inducir un efecto terapeutico deseado cuando se 15 administra apropiadamente a un paciente.
El termino "modulador" se refiere a un compuesto que cambia o altera la actividad o funciOn de una molecule. Por ejemplo, un modulador puede provocar un aumento o una disminuci6n en la magnitud de una actividad o funciOn determinada de una molecule en compared& con la magnitud de la actividad o fund& observada en ausencia del modulador. En determinadas realizaciones, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos
una actividad o funcien de una molecule. Determinadas actividades y funciones a modo de ejemplo de una molecule incluyen, pero no se limitan a, afinidad de unien, actividad enzimatica y transducciOn de seriales. Determinados inhibidores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos, peptidos, anticuerpos, pepticuerpos, hidratos de carbono y molecules organicas pequerias. Se describen pepticuerpos, por ejemplo, en el documento W001/83525.
25 Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es mas abundante que cualquier otra especie individual en la composiciOn). En determinadas realizaciones, una fracciOn sustancialmente purificada es una composiciOn en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En determinadas realizaciones, una composicion sustancialmente pura comprenderd mds de aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composiciOn. En determinadas realizaciones, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composicien mediante metodos de deteccion convencionales) en la que la composici6n consiste esencialmente en una Unica especie macromolecular.
El termino "paciente" incluye sujetos humanos y no humanos. En determinadas realizaciones, un paciente es un
35 sujeto humano o no humano que tiene una baja masa Osea y/o come el riesgo de desarrollar baja masa 6sea y/o esta experimentando uno o mas estados medicos que pueden aumentar el riesgo de perdida de masa Osea (por ejemplo, cancer, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmunitaria). En determinadas realizaciones, un paciente con baja masa Osea tendra una puntuacien T de menos de -1. Una puntuacion T es una medida de la densidad mineral Osea (BMD) de un paciente en cuanto a desviaciones estandar (DE) desde la media de un adulto joven sano. Por tanto, en determinadas realizaciones, un paciente con baja masa ()sea tiene una BMD que es de mds de 1 DE por debajo de la media. En determinadas realizaciones, un paciente es un sujeto humano o no humano que tiene huesos debilitados o estructuralmente comprometidos, y/o que corre el riesgo de desarrollar huesos debilitados o estructuralmente comprometidos. En determinadas realizaciones, un paciente es un sujeto humano o no humano que ha sufrido una fractura y/o que se identifica que corm un riesgo de fracturas mayor del normal.
45 DescripciOn detallada de determinadas realizaciones
Anticuerpos frente a RANKL
Se describen determinados anticuerpos frente al activador del receptor de ligando de NF-K13 (RANKL; tambien denominado ligando de osteoprotegerina, u OPGL), por ejemplo, en la publicaciOn de patente estadounidense n.°
U.S. 2004/0033535 Al y en la publicacien PCT n.° WO 2003/002713 A3.
En determinadas realizaciones, se usan anticuerpos contra RANKL humano monoclonales completamente humanos. En determinados casos, se describen secuencias de polinucleOtido que codifican para molecules de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera, particularmente secuencias que codifican para regiones variables de cadena pesada y/o ligera. En determinados casos, se describen secuencias de polinucleOtido que codifican para una
o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y/o ligera, particularmente desde
55 CDR1 hasta CDR3. En determinados casos, se describen secuencias de polipeptido que corresponden a molecules de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera, particularmente secuencias de polipeptido que corresponden a las regiones variables de cadena pesada y/o ligera. En determinados casos, se describen secuencias de polipeptido que corresponden a una o mds regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y/o ligera, particularmente desde CDR1 hasta CDR3. Tambien se describe una Ilnea celular de hibridoma que expresa un
anticuerpo monoclonal completamente humano contra RANKL humano. Ademas, se describe un anticuerpo monoclonal humano completamente purificado contra RANKL humano.
En determinados casos, un anticuerpo comprende una o mas regiones constantes de especies distintas de ser humano y una o mas regiones variables humanas. En determinados casos, un anticuerpo comprende una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) humanas y una o mas regiones de entramado y/o regiones constantes de especies distintas de ser humano. Tales anticuerpos se denonninan anticuerpos "quimericosn. En determinados casos, un anticuerpo frente a RANKL es un anticuerpo quimerico. En determinadas realizaciones, un
anticuerpo frente a RANKL es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(a1202, un fragmento Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla.
Preoaracion de anticuerpos frente a RANKL
Segun determinadas realizaciones, se usan anticuerpos que se unen especificamente a RANKL. En determinados casos, pueden producirse anticuerpos mediante inmunizaciOn con RANKL de longitud completa, formas solubles de RANKL o un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y/o pueden ser anticuerpos recombinantes. En determinadas realizaciones, los anticuerpos son
anticuerpos humanos preparados, por ejemplo, mediante inmunizaciOn de animates transgenicos que pueden producir anticuerpos humanos (vease, por ejemplo, la solicitud publicada PCT n.° WO 93/12227.).
En determinados casos, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo frente a RANKL pueden injertarse en regiones de entramado (FR) de la misma u otra especie. En determinados casos, pueden injertarse CDR de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo frente a RANKL en FR humanas consenso. Para crear FR humanas consenso, en determinados casos, se alinean FR de varias secuencias de aminoacidos de cadena pesada o cadena ligera humana para identificar una secuencia de aminoacidos consenso. En determinados casos, las FR de una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo frente a RANKL se reemplazan por las FR de una cadena pesada y/o cadena ligera diferente. En determinados casos, los aminoacidos poco comunes on las FR de las cadenas pesadas yligeras de un anticuerpo frente a RANKL no se reemplazan, mientras quo el resto de los aminoacidos de FR se reemplazan. Aminoacidos poco comunes son aminoacidos especificos quo estan on posiciones en las quo no se encuentran habitualmente en FR. En determinados casos, las regiones variables injertadas de un anticuerpo frente a RANKL pueden usarse con una regi6n constante quo es diferente de la region constante del anticuerpo frente a RANKL. En determinados casos, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla.
Sedescribe el injerto de CDR a modo de ejemplo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.c's 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089 y 5.530.101.
Segiin determinados casos, se prepara un anticuerpo frente a RANKL mediante la utilizacion de un ratan transgenico que tiene una parte sustancial del genoma quo produce anticuerpos humanos insertado pero que se ha vuelto deficiente en la producciOn de anticuerpos endOgenos, murinos. Tales ratones, entonces, pueden producir
anticuerpos y moleculas de inmunoglobulina humanos y son deficientes on la producciOn de anticuerpos y moleculas de inmunoglobulina murinos. Determinadas tecnologias a modo de ejemplo utilizadas para lograr este resultado se dan a conocer en patentes, solicitudes y documentos dados a conocer en la memoria descriptiva, en el presente documento. En determinados casos, pueden emplearse metodos tales como los dados a conocer en la solicitud publicada PCT n.° WO 98/24893. Vease tambien Mendez etal. Nature Genetics 15:146-156 (1997).
Segun determinados casos, se producen anticuerpos frente a RANKL monoclonales completamente humanos tal como sigue. Se inmunizan ratones transgenicos que contienen genes de inmunoglobulina humana con el antigen° de interes (en este caso, RANKL o una parte del mismo). Se obtienen calulas linfaticas (tales como celulas B) a partir de los ratones quo expresan anticuerpos. Tales celulas recuperadas se fusionan con una linea celular de tipo mieloide para preparar limas celulares de hibridoma inmortales, y tales limas celulares de hibridoma se examinan y
seleccionan para identificar lineas celulares de hibridoma quo producen anticuerpos especificos frente at antigen° de interes. En determinados casos, se describe la producci6n de una lima celular de hibridoma que produce anticuerpos frente a RANKL.
Se producen anticuerpos frente a RANKL a modo de ejemplo mediante determinadas lineas de hibridoma, quo incluyen pero no se limitan a, AMG 6.1, AMG 6.4, AMG 6.5, AMG 7.1 y AMG 7.2, quo se describen, por ejemplo, en la publicacion de patente estadounidense n.° U.S. 2004/0033535 Al y en la publicaciOn PCT n.° WO 2003/002713 A3. En determinados casos, se producen anticuerpos frente a RANKL mediante al menos una linea de hibridoma seleccionada de AMG 6.1, AMG 6.4 y AMG 6.5. En determinados casos, los anticuerpos frente a RANKL se unen a
RANKL con una constante de disociacion (Kd) de entre aproximadamente 0,23 y 0,29 nM, incluyendo todos los puntos entre esos extremos. En determinados casos, los anticuerpos frente a RANKL se unen a RANKL con una Kd de menos de 0,23 nM.
En determinados casos, un anticuerpo frente a RANKL es del isotipo IgG2. En determinados casos, un anticuerpo frente a RANKL comprende una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG2 humana. En determinados casos, un anticuerpo frente a RANKL se ha clonado para su expresi6n en celulas de mamifero. En determinados casos, se liga una regi6n variable de un anticuerpo frente a RANKL a una region constante distinta de
la regi6n constante para el isotipo IgG2. En la tecnica se conocen determinados metodos a modo de ejemplo de cloned& de secuencias de anticuerpo. Se describen determinados metodos a modo de ejemplo de clonaciOn de un anticuerpo frente a RANKL, por ejemplo, en la publicaciOn de patente estadounidense n.° U.S. 2004/0033535 Al y
en la publicaciOn PCT n.° WO 2003/002713 A3.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo frente a RANKL es aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1; vaanse por ejemplo, la publicaciOn de patente estadounidense n.° U.S. 2004/0033535 Al y la publicaciOn PCT n.° WO 2003/002713 A3). La cadena pesada de aRANKL-1 tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) y puede estar codificada por la secuencia de nucleados de la figura 1 (SEQ ID NO: 1). La region variable de cadena pesada de aRANKL-1 tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 28 (SEQ ID NO:
11). La cadena ligera de aRANKL-1 tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 4 (SEQ ID NO: 4) y puede estar codificada por la secuencia de nucleOtidos de la figura 3 (SEQ ID NO: 3). La regi6n variable de cadena ligera de aRANKL-1 tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 29 (SEQ ID NO: 12).
En determinados casos, una o mas modificaciones conservatives en las cadenas pesadas y ligeras de aRANKL-1 (y modificaciones correspondientes en los nucleotidos codificantes) produciran anticuerpos frente a RANKL que tienen caracteristicas funcionales y quimicas similares a las de aRANKL-1. En determinadas realizaciones, si se desea la
alteraciOn de las caracteristicas funcionales y/o quirnicas de aRANKL-1, pueden realizarse sustituciones no conservatives en la secuencia de cadena pesada y/o ligera. En determinados casos, pueden realizarse tales sustituciones no conservatives seleccionando, por ejemplo, uno o mas aminoacidos de reemplazo que difieren de los
aminoacidos reemplazados en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto peptidico en el area dela sustituci6n, por ejemplo, como una conformaci6n de lamina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecule en el sitio de sustituciOn y/o (c) el tamario de la molecule en el sitio de sustituciOn.
En determinados casos, pueden determinarse sustituciones de aminoacidos deseadas (ya sean conservatives o no conservatives) por los expertos en la tecnica en el momento en el que se deseen tales sustituciones. En determinados casos, pueden usarse sustituciones de aminoacidos para identificar residuos importantes de aRANKL
1. En determinados casos, pueden usarse sustituciones de aminoacidos para aumentar o disminuir la afinidad de los anticuerpos frente a RANKL.
En determinados casos, los anticuerpos se expresan en limas celulares distintas de lineas celulares de hibridoma. En determinados casos, pueden usarse secuencias que codifican para anticuerpos particulares para la transformaciOn de una celula huesped de mamffero adecuada. Segun determinados casos, la transformaci6n puede
ser mediante cualquier metodo conocido para introducir polinucleOtidos en una celula huesped. La transformaciOn a modo de ejemplo incluye, pero no se limita a, empaquetar el polinucleotido en un virus (o un vector viral) y transducir una celula huesped con el virus (o el vector); y procedimientos de transfecciOn conocidos en la tecnica, tal como se muestra a modo de ejemplo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.m 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461; y
4.959.455. En determinados casos, el procedimiento de transformaciOn usado depende del huesped que va a transformarse. En la tecnica se conocen determinados metodos a modo de ejemplo para la introduccion de
polinucleOtidos heterologos en celulas de mamffero e incluyen, pero no se limitan a, transfecciOn mediada por dextrano, precipitaciOn mediante fosfato de calcio, transfecciOn mediada por Polybrene, fusi6n de protoplastos, electroporaciOn, encapsulacion del/de los polinucleOtido(s) en liposomas y microinyecciOn directa del ADN en nucleos.
Enla tecnica se conocen determinadas limas celulares de mamifero a modo de ejemplo disponibles como huespedes para la expresiOn e incluyen, pero no se limitan a, muchas lineas celulares inmortalizadas disponibles de la ColecciOn Americana de Cultivos Tipo ("American Type Culture Co ection') (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de Mon de cria de hamster (BHK), celulas de rifiOn de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varies limas celulares distintas. En determinados casos, pueden seleccionarse limas celulares determinando que lineas celulares muestran altos niveles de expresiOn y producen anticuerpos con propiedades de union a RANKL aceptables.
Peptidos de PTH/PTHrP
Un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP y un dominio pre-pro. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP y un dominio pre-pro, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS 188 a 207.
En determinados casos, un dominio de modulacion de PTH/PTHrP puede interaccionar con un receptor PTH-1. En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP puede interaccionar con un receptor PTH-2. En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP puede interaccionar tanto con un receptor PTH-1
como un receptor PTH-2. Se describen determinados dominios de modulacion de PTH/PTHrP a modo de ejemplo, por ejemplo, en la publicacion de patente estadounidense n.° 2003/0039654 y en la publicaciOn PCT n.° WO 01/81415. Se muestran determinados dominios de modulaciOn de PTH y PTHrP a modo de ejemplo en las tablas 1A, 1B y 2. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP y no comprende un dominio pre-pro funcional.
5
15
25
35
45
En determinadas realizaciones, cuando se expresa un peptido de PTH/PTHrP que comprende un dominio pre-pro en una celula, el dominio pre-pro se escinde del peptido de PTH/PTHrP durante el procesamiento para formar un peptido de PTH/PTHrP maduro. En determinados casos, cuando se expresa un peptido de PTH/PTHrP que comprende una parte de un dominio pre-pro en una celula, la parte de un dominio pre-pro se escinde del peptido de
PTH/PTHrP durante el procesamiento para formar un peptido de PTH/PTHrP maduro. En determinados casos, se escinde una parte del dominio pre-pro del peptido de PTH/PTHrP durante el procesamiento, para formar un producto intermedio de peptido de pro PTH/PTHrP. En determinados casos, el producto intermedio de peptido de pro PTH/PTHrP se procesa adicionalmente para formar un peptido de PTH/PTHrP maduro.
En determinados casos, pueden crearse peptidos de PTH/PTHrP adicionales a modo de ejemplo aleatorizando un
peptido de PTH/PTHrP de referenda y seleccionando peptidos de PTH/PTHrP que tienen la actividad deseada. Puede encontrarse determinada informaciOn sobre PTH y PTHrP, por ejemplo, en Mannstadt of al. (1999), Am. J. Physiol. 277. 5Pt 2: F665-75; y GardeIla (1996), J. Biol. Chem. 271 (33): 19888-93.
En diversos casos, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP puede comprender uno o mas de los siguientes peptidos de PTH/PTHrP unidos a uno o mas anticuerpos frente a RANKL. En diversos casos, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP puede comprender cualquier otro peptido quo tenga actividad de PTH y/o PTHrP unido a uno o mas anticuerpos frente a RANKL. En determinados casos, un peptido de PTH/PTHrP puede comprender parte de la secuencia de una PTH o PTHrP quo se produce de manera natural. En determinados casos, un peptido puede comprender una o mas secuencias aleatorizadas. En determinados casos, puede seleccionarse un peptido de PTH/PTHrP quo tiene una actividad deseada de un
conjunto de peptidos quo tienen una o mas secuencias aleatorizadas usando presentacion en fago y/o seleccion de ARN-peptido. En determinados casos, un expert° on la tecnica puede Ilevar a cabo la presentaciOn en fago y/o selecciOn de ARN-peptido para seleccionar un peptido quo tiene una actividad deseada.
Determinados dominios de modulaciOn de PTH/PTHrP a modo de eiemplo
Se seleccionan determinados dominios de modulacion de PTH/PTHrP a modo de ejemplo de polipeptidos de fOrmula
I:
. 12 14X15)06)(17)(18 x19Rx21x22x23x24x25x28x27x28xC
xNx8Hx1 0.11
A X --KX
(FOrmula I; SEQ ID NO: 13)
en la quo: X" esta ausente o es X3X4X6X6X7, X2X3X4X6X6X7, X1X2X3X4X6X6X7 o YX1X2X3X4X6X6X7;
X1 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X1 es un residuo no funcional, un residuo hidrOfilo o un residuo aromatic°. En determinados casos, X1 es A, S o Y;
X2 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X2 es un residuo no funcional. En determinados casos, X2 es V;
X3 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X3 es un residuo hidrofilo. En determinados casos, X3 es S;
X4 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X4 es un residuo acido. En determinados casos, X4 es E;
X6 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X6 es un residuo no funcional o un residuo basic°. En determinados casos, Xs es H o I;
X6 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X6 es un residuo acid° o un residuo hidrofilo. En determinados casos, X6 es Q o E;
X7 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X7 es un residuo no funcional o un residuo aromatic°. En determinados casos, X7 es L o F;
X(' es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X8 es un residuo no funcional. En determinados casos, X6 es M o Nle;
X1° es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X1° es un residuo acid° o un residuo hidrofilo. En determinados casos, X1° es N o D;
X" es un residuo de aminoacido. En determinados casos X" es un residuo no funcional o un residuo basic°. En determinados casos, X" es L, R o K;
X12 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X12 es un residuo no funcional o un residuo aromatic°. En determinados casos, X12 es G, F o W;
X14 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X14 es un residuo basic° o un residuo hidrofilo. En determinados casos, X14 es H o S;
X15 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X15 es un residuo no funcional. En determinados casos, X15 es L o I;
X16 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, )(16 es un residuo no funcional o un residuo hidrOfilo. En determinados casos, X16 es Q, N, S o A;
X17 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X17 es un residuo acid°, un residuo hidrOfilo o un residuo X17
no funcional. En determinados casos, es S, D o L;
X18 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X18 es un residuo no funcional. En determinados casos, ..,
X18 esm L, V o Nle;
X19 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X19 es un residuo acid° o un residuo basic°. En determinados casos, X19 es E o R;
X21 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, x21 es un residuo no funcional o residuo basic°. En determinados casos, X21 es V, M, R o Nle;
X22 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X22 es un residuo hidrofilo, un residuo dcido o un residuo aromatic°. En determinados casos, X22 es E o F;
X23 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X23 es un residuo aromatic° o residuo lip6filo. En determinados casos, X23 es W o F;
X24 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X24 es un residuo lipOfilo. En determinados casos, X24 es L;
X25 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X25 es un residuo hidrofilo o un residuo basic°. En X25
determinados casos, es R o H;
X26 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X26 es un residuo hidrofilo o un residuo basic°. En determinados casos, X26 es K o H; X27 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X27 es un residuo lipOfilo, un residuo basic° o un residuo
no funcional. En determinados casos, )(27 es K o L;
X28 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X28 es un residuo lipOfilo o un residuo no funcional. En determinados casos, X28 es L o I; Xc es un residuo de aminoacido. En determinados casos, Xc esta ausente. En determinados casos, Xc es X28,
x29x30, x29x30x31 x29x30x31x32, x29x30x31x32x33 x29x30x31x32x33x34, x29x30x31x32x33x34x35
X28X36X31X32X33X34X35X36;
X28 es un residuo de aminoacido. En determinados casos X29 es un residuo hidrOfilo o un residuo no funcional. En determinados casos, X28 es Q o A;
X3° es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X3° es un residuo hidrOfilo o un residuo acid°. En X30
determinados casos, es D o E;
X31 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X31 es un residuo lipOfilo o un residuo no funcional. En determinados casos, X31 es V o I;
X32 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X32 es un residuo basic°. En determinados casos, X32 es H;
X33 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X33 es un residuo hidrOfilo. En determinados casos, X33 es N o T; X34 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X un residuo no funcional o un residuo aromatic°. En determinados casos, X34 es A, F o Y;
X35 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, X35 es un residuo acido. En determinados casos, X35 es E; X36 es un residuo de aminoacido, En determinados casos, X36 es un residuo aromatic°. En determinados casos, X36 es Y;
En determinados casos, uno o mas de X14 a X36 es un residuo de cistefna.
Se muestran determinados dominios de modulaciOn de PTH/PTHrP a modo de ejemplo seleccionados de polipdptidos de formula I (SEQ ID NO: 13) en las tablas 1A y 1B.
Se seleccionan determinados dominios de modulacion de PTH/PTHrP a modo de ejemplo de polipeptidos de fOrmula
II:
JNJ7J8HNLJ12KHLPSJ18 .21
j19.-.
NJ EWLRKKLJc
(FOrmula II; SEQ ID NO: 14)
enla que:
Ji j2 J3 ja j5 j6, j2 j3 ja j6 j6, J3 ja j5 j6;
En determinados casos, J" esta ausente. En determinados casos, J" es
J1 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J1 es un residuo no funcional, un residuo hidrOfilo o un
residuo aromatic°. En determinados casos, J1 es A, S o Y;
J2 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J2 es un residuo no funcional. En determinados casos, J2 esV;
J3 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J3 es un residuo hidnifilo. En determinados casos, J3 es S;
J4 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J4 es un residuo acid°. En determinados casos, J4 es E;
J5 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J5 es un residuo no funcional. En determinados casos, J5 es I;
J6 es tin residuo de aminoacido. En determinados casos, J6 es un residuo basic°. En determinados casos, J6 es Q;
J7 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J7 es un residuo no funcional o un residuo aromatic°. En determinados casos, J7 es L o F;
J8 es tin residuo de aminoacido. En determinados casos, J8 es un residuo no funcional. En determinados casos, J8 es M o Nle;
J12 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J12 es un residuo no funcional o un residuo aromatic°. En determinados casos, J12 es G o W;
J16 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J16 es un residuo no funcional o tin residuo hidrofilo. En determinados casos, J16 es N, S o A;
J18 es tin residuo de aminoacido. En determinados casos, J18 es un residuo no funcional. En determinados casos, J18 esM, Nle, L o V;
J19 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J19 es un residuo acido o tin residuo basic°. En determinados casos, J19 es E o R;
J21 es tin residuo de aminoacido. En determinados casos, J21 es un residuo no funcional. En determinados casos, J21
es V, M o Nle;
j29 J30 J31, J29202122,
En determinados casos, Jc esta ausente. En determinados casos, Jc es J29, J29 j30,
j29 j3op j3223 0 j2920 J31,132 j33 13.4. Jo
J29 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J29 es un residuo hidrofilo o un residuo no funcional. En determinados casos, J29 es Q o A;
J3° es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J3° es un residuo hidrOfilo o tin residuo dcido. En determinados casos, J3° es D o E;
J31 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J31 es un residuo lipOfilo o tin residuo no funcional. En
determinados casos, J31 es V o I;
J32 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, J32 es tin residuo basic°. En determinados casos, J32 es H;
J33 es tin residuo de aminoacido. En determinados casos, J33 es un residuo acido. En determinados casos, J33 es N;
J un residuo de aminoacido. En determinados casos, J34 es un residuo aromatic°. En determinados casos, J34
es F o Y;
En determinados casos, uno o mas de J14 al residuo del extremo C-terminal de un polipeptido de fOrmula II
es un residuo de cisteina.
Se muestran determinados dominios de modulaciOn de PTH/PTHrP a modo de ejemplo seleccionados de
polipeptidos de fOrmula II (SEQ ID NO: 14) en las tablas 1A y 1B a continuaciOn.
Se seleccionan determinados dominios de modulacion de PTH/PTHrP a modo de ejemplo de polipeptidos de formula
ONLH010011012KS1015016LRRRF023LHHLIOc (FOrmulaIII; SEQ ID NO: 15) en la que: Nes y01020304050607, 01020304050607,
determinados casos, ON esta ausente. En determinados casos, 0 En
020304050607, 0304050607, 04050607, 050607, 06-7 0 U 07;
01 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 01 es un residuo no funcional. En determinados casos, 01
esA; 02 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 02 es un residuo no funcional. En determinados casos, 02 es V;
03 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 03 es un residuo hidrofilo. En determinados casos, 03 es S;
04es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 04 es un residuo acido. En determinados casos, 04 es E; 05 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 05 es un residuo basic° o un residuo no funcional. En determinados casos, 05 es H o I;
06 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 06 es un residuo hidrofilo. En determinados casos, 06 es Q; 07es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 07 es un residuo no funcional. En determinados casos, 07 es L; 010 010
es un residuo de aminoacido. En determinados casos, es un residuo acido o un residuo hidrofilo. En determinados casos, 01° es N o D;
011 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 011 es un residuo basics° o un residuo no funcional. En determinados casos, 011 es K o L;
012 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 012 es un residuo aromatic° o un residuo no funcional. En determinados casos, 012 es G, F o W;
015 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 015 es un residuo hidrOfilo o un residuo no funcional. En determinados casos, 015 es I o S;
016 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 016 es un residuo hidrOfilo. En determinados casos, 016 es Q o N;
017 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 017 es un residuo acid° o un residuo no funcional. En determinados casos, 017 es D o L;
023 es un residuo de aminoacido. En determinados casos, 023 es un residuo aromatic°. En determinados casos, 023 esF o W;
ces 029, 029030, 029030031, 029030031032
En determinados casos, OC esta ausente. En determinados casos, 0
029030031032033, 029030031032033034, 029030031032033034035 u 029030031032033034035-36;
0 en los que 023 a 036 son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente.
En determinados casos, uno o mas de 014 al residuo del extremo C-terminal de un polipeptido de fOrmula III es un residuo de cisteina.
Se muestran determinados dominios de modulaciOn de PTH/PTHrP a modo de ejemplo seleccionados de polipeptidos de formula III (SEQ ID NO: 15) en la tabla 2 a continuaciOn.
Se muestran determinadas secuencias de dominio de modulacion de PTH/PTHrP a modo de ejemplo en las tablas 1A, 1B y 2 a continuacion.
Tabla 1A -Dominios de modulaciOn de PTH/PTHrP a modo de ejemplo basados en polipeptidos de PTH que se producen de manera natural
DescripciOn PTH(1-84)1 humana
PTH(1-84)2de rata
PTH 3(7-84) humana
PTH(1 -44)4 humana
PTH(1 -38)3humana
PTH(2-38)d humana
PTH(1 -34)4 humana [Argi l ]PTH(1 -34) humana [Lys1 1 ] PTH(1 -34) humana [Arg19]PTH(1 -34) humana [Tyr1 ]PTH(1-34)3humana
[Leu(8, 18),Tyr34]PTH(134)4 humana
PTH(1 -34)'bovina
[Leu(8, 18),Tyr34]PTH(134)* bovina
PTH(1 -34)3porcina
PTH(1-34)3de rata
[Leu (8,21),Tyr34] PTH(1-34)"de rata
PTH(1 -31 )/humana
[Leu27]PTH(1 -31 )S humana
[Leu(8, 18)Tyr34]PTH(334)9
PTH(3-34)1° bovina
[Leu(8, 18),..Tyr34]PTH(334)1 1bovina
Secuencia SEQ ID NO:
16 SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV
ALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEA DKADVNVLTKAKSQ
17 AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNFV SLGVQMAAREGSYQRPTKKEDNVINDGNSKSLGEG DICADVDVLVKAKSQ
18 LMHNLGICHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPL
APRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKPiDVN VLTKAKSQ
19 SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRIGCLQDVI-INFV ALGAPLAPR
20 SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV ALG
21 VSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVA LG SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 22
SVSEIQLMHNRGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 23
SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 24
SVSEIQLMHNLGKHLNSMRRVEWLRKKLQDVHNF 25
YVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF 26
SVSEIQLLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 27
AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNF 28
AVSEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 29
SVSEIQLMHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNF 30
AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQDVHNF 31
AVSEIQLLHNLGKHLASVERLQWLRKKLQDVHNY 32
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV 33
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKLLQDV
34
SEIQLLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY
35
SEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNF
36
SEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 37
PTH(7-34)12 humana LMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF
38
[Leu(8, 18)Tyr34]PTH(734) humana
PTH(7-34)" bovina
[Tyr34] PTH(7-34)'4 bovina
[Leu(8, 18) ,Tyr34]PTH(734) 15bovina
[Leu(8, 18),Trp12,Tyr34] PTH(7-34)" bovina
[D-Trp12,Tyr34]PTH(734)17 bovina
PTH(1 -30) humana
[Argi l ]PTH(1-30) humana
[Lys1 1 ]PTH(1-30) humana
[Arg19]PTH(1 -30) humana
[Tyr1 ] PTH(1 -30) humana
[Leu(8, 18)]PTH(1-30) humana
PTH(1 -30)bovina
[Leu(8, 18)]PTH(1-30) bovina
PTH(1 -30) porcina
PTH(1-30)de rata
[Leu(8,21 ),Tyr34]PTH(1 30) de rata
[Leu27] PTH(1 -30) humana
PTH(1 -29) humana
PTH(1 -28) humana [Leu(8, 18)]PTH(3-30) PTH(3-30) bovina [Leu(8, 18)]PTH(3-30) bovina PTH(7-30) humana [Leu(8, 18)]PTH(7-30) humana PTH(7-30) bovina [Leu(8, 18)]PTH(7-30) bovina [Leu(8, 18),Trp12]PTH(730) bovina [D-Trp12] PTH(7-30) bovina
LLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQDVHNY 39
FMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNF 40 FMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQDVHNY 41 FLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 42
FLHNLWKHLSSLERVEWLRKKLQDVHNY 43
FMHNL-D-Trp-KHLSSMERVEWLRKKLQDVHNY 44
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 45 SVSEIQLMHNRGKHLNSMERVEWLRKKLQD 46
SVSEIQLMHNKGKHLNSMERVEWLRKKLQD 47
SVSEIQLMHNLGKHLNSMRRVEWLRKKLQD 48 YVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 49 SVSEIQLLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQD 50 AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQD 51 AVSEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQD 52 SVSEIQLMHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQD 53 AVSEIQLMHNLGKHLASVERMQWLRKKLQD 54 AVSEIQLLHNLGKHLASVERLQWLRKKLQD 55
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKLLQD 56
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ 57 SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL 58 SEIQLLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQD 59 SEIQFMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQD 60 SEIQFLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQD 61 LMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD 62 LLHNLGKHLNSLERVEWLRKKLQD 63 FMHNLGKHLSSMERVEWLRKKLQD 64 FLHNLGKHLSSLERVEWLRKKLQD 65 FLHNLWKHLSSLERVEWLRKKLQD 66
FMHNL-D-Trp-KHLSSMERVEWLRKKLQD 67
Hendy et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 7365; Kimura et aL (1983), Biochem. Blophys. Res. Commun. 114: 493; Zanelli et aL (1985), Endocrinology 117:1962; Wingender et al. (1985), J. Biol. Chem.
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Tabla 1B -Dominios de modulaciOn de PTH/PTHrP a modo de ejemplo basados en modificaciones de Cys de polipeptidos de PTH que se producen de manera natural
Descri pci on
Secuenci a SEQ I D NO:
Cys33 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGICHL NSMER VEWLR 68
(i nserci On de Cys-33)
tactom VHCNF ,
Cys27, 33 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NEMER VEWLR 69
(reempl azo de Cys-27,
KCLQD VHCNF
i nserciOn de Cys33)
Reempl azo de Cys-33
SVSEI . QL110IHN LGIGIL NSMER VEWLR 70
KICLQD. VHCF
CGPTH 4 reempl azo de
SVSEI QLMHN LGKIII, NSMER VEWLR 71
Cys-34
KKL D VHNC
Cys1 4 PTH( 1 -34)
SVS I QLMHN LGKCI, NSMER VEWLR 72
KKLQD VHNF
Cys1 5 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHC NSMER VEWLR 73
KICLQD VHNF
Cys1 6 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL CSMER VEWLR 74
KKLQD VHNF
Cys1 7 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NCMER VEWLR 75
KKL D VHNF
Cys1 8 PTH( 1 -34)
SVS I QLMHN LGKHL NSCER VEWLR 76
KKLQD VHNF
Cys1 9 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NSMCR VEWLR 77
KKLQD VHNF
Cys20 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NSMEC VEWLR 78
KKLQD. VHNF
Cys21 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGICHL NSMER CEWLR 79
ICKLQD VHNF
Cys22 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NSMER VCWLR 80
KKLQD VHNF
Cys24 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NSMER VEWCR 81
KKLQD VHNF
Cys25 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKHL NSMER VEWLC 82
KKLQD VH F
Cys26 PTH( 1 -34)
SVSEI• QLMHN LGKHL. . NSMER VEWLR 83
CKLQD VHNF
Cys27 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKRL NSMER VEWLR 84
KCLQD VHNF
• • -
Cys28 PTH( 1 -34)
SVSEI • QLMHN LdKHL . NSMER VEWLR 85
KKCQD' VHNF .
Cys29 PTH( 1 -34)
SVSEI-QLMHN LGKHL NSMER VEWLR 86
KKLCD VHNF
Cys3OPTH( 1 -34)
SVSEI OLMUN LGKHL NdMER VEWLR 87
Cys31
PTH( 1 -34) KKLQC VHNF SVSEI QLMHM LGKHL NSMER VEWLR 88
KKLQD CHNF
Cys32 PTH( 1 -34)
SVSEI QLMHN LGKNL psmER VEWLR 89
IUCLQD VCNF
Tabla 2 -Dominios de modulachin de PTH/PTHrP a modo de ejemplo basados en polipeptidos de PTHrP que se producen de manera natural
DescripciOn Secuencia SEQ IDNO: PTHrP(1-86)"humana AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEI
90 HTAEIRATSEVSPNSKPSPNTICNHPVRFGSD DEGRYLTQETNKVETYKEQPLKTP PTHrP(1-34)1Shumana AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEI 91
HTA [Tyr36]PTHrP(1-36)3humana AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEI 92 HTAEY [1Ie5,Trp23,Tyr36]PTHrP(1-36)d AVSEIQLLHDKGKSIODLRRRFWLHHLIAEI 93 humana
HTAEY Tyr-PTHrP(1-34)''humana YAVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAE 94
IHTA [Asn10,Leu11 D-Phe12]PTHrP(1-AVSEHQLLHNL-D-Phe-• 95 34)1'9 humana
KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA PTHrP(7-34)2u LLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA 96 [Asn10,Leu1 1 ]PTHrP(7-34)
LLHNLGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA 97
humana [Asn16,Leu17]PTHrP(7-34) 1 LLHDKGKSINLLRFIRFFLHHLIAEIHTA 98 [Leu1 1 ,D-Trp12]PTHrP(7-34)22 LLHDL-D-Trp-99 humana
KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA [Asn10,Leu11 ,D-Trp12]PTHrP(7-LLIINL-D-Trp-100 34)23
KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA [D-Trp12]PTHrP(8-34) LHINTL-D-Trp--101
KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA [D-Phe12]PTHrP(8-34) LHNLD
--Phe-102 KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA [Asn10,Leu11,D-Trp12]PTHrP(7-LLHNL-D-Trp
103
0
34)2 humana
KSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTA PTHrP(1-30)humana AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAE 104 [1 Ie5,Trp23]PTHrP(1-30)humana
AVSEIQLLHDKGKSIQDLRRRFWLHHLIAE 105 Tyr-PTHrP(1-30)humana YAVSEFIQUADKGKSIQDLRRRFFLHHLIAE 106 [Asn10,Leu11 ,D-Phe12]PTHrP(1-AVSEHQLLHNL-D-Phe-107 30) humana
KSIQDLRRRFFLHHLIAE PTHrP(7-30)
LLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAE 108 [Asn10, Leu1 1 ]PTHrP(7-30)
LLHNLGKSIQDLRRRFFLHHLIAE 109
humana [Asn16,Leu17]PTHrP(7-30) LLHDKGKSINLLRRRFFLHHLIAE 11 0 [Leu11 ,D-Trp12]PTHrP(7-30) LLHDL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAE 111 humana [Asn10,Leu11 ,D-Trp12]PTHrP(7-LLHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAE 11 2 30)
[D-Trp12]PTHrP(8-30) LHNL-D-Trp-KSIQDLRRRFFLHHLIAE 11 3
[D-Phe12] PTHrP(8-30) [Asn10,Leu11 ,D-Trp12]PTHrP(730) humana [Haa(LaaLaa HaaHaa)2Laa 22-31 ] PTH(1 -34)24 humana
[Haa(LaaLaaHaaHaa)2 Laa 22-31 ] PTH(1 -34)24humana
[Haa(LaaLaa Haa Haa)2Laa 22-31 ] PTH(1 -34)25 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-31 ] PTH(1 -34)26 humana
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-31 ] PTH(1 -34)27humana [Haa(LaaLaaHaa Haa)2Laa 22-31 ] PTH(7-34)24 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa22-31 ] PTH(7-34)24 humana [Haa(LaaLaa Haa Haa)2Laa22-31 ] PTH(7-34)25 humana [Haa(Laa LaaHaa Haa)2Laa 22-31 ] PTH(7-34)26 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-31 ]
PTH(7-34)27 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(1 -34)24 humana
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(1 -34)24 humana
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(1 -34)25 humana
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa
PTHrP(1 -34)26 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(1 -34)27humana
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(7-34)28 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(7-34)24 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(7-34)25 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(7-34)26 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa PTHrP(7-34)27 humana
22-31 ]
22-31 ]
22-31 ]
22-31 ] 22-31 ] 22-31 ] 22-31 ] 22-31 ] 22-31 ] 22-31 ]
[Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (Laa Laa HaaHaapLaa 22-31 1 PTHrP(1-34)2 humana
[Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (LaaLaa HaaHaapLaa 22-31 ] PTHrP(1 -34)3uhumana
[Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (Laa LaaHaa Haa)2Laa 22-31 ] PTHrP(1-34)3 Ihumana
[Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (Laa Laa HaaNaaifLaa 22-31 ] PTHrP(1 -34)3` humana [Lys11 ,Lys13,A1a19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)33 humana
LHNL-D-Phe-KSI QDLRRRFFLHHLI AE LLHNL-D-Trp-KSI QDLRRRFFLHHLI AE
1 1 4 1 1 5
.SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVELLEKLLEKL HNF SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVELLEKLLKKL HNF
1 1 6 1 1 7
SVSEIQLMHNLGKUNSMERVALAEALAEAL HNF . SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVSLLSSLLSSL HNF . SVSEIQLMEINLGKHLNSMERVAFYDKVAEKL HNF LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLEKLHNF •
1 1 8 1 1 9 1 20 1 21
LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLKKLHNF
1 22
LMHNLGKHLNSMERVALAEALAEALHNF
1 23
LMHNLGKHLNSMERVSLLSSLLSSLHNF
1 24
LMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEKLHNF
1 25
AVSEHQLLHDKGKSIODLRIZRELLEKLLEKL HTA • AVSEHQLLHDKGKSIQDIARRELLE1a,LKKL HTA AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEAL HTA AV-SEHQLLHDKGKSIQDLIIRRSLLSSLLSSL HTA AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKL HTA. LLHDKGKSI QDLRRRELLEKLLEKLHTA
1 26 1 27 1 28 1 29 1 30 1 31
LLHDKGKSI QDLRRRELLEKLLKKLHTA
1 32
LLHDKGKSI QDLRRRALAEALAEALHTA
1 33
LLHDKGKSI QDLRRRSLLSSLLSSLHTA
1 34
LLHDKGKSI QDLRRRAFYDKVAEKLHTA
1 35
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKL HTA S .
1 36
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKL HTS
1 37
, • AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKL HTAGRR
1 38
. AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKL KEL
1 39
AVSEHQLLHDKGkSIQDLARRELLEKLLEKL HTA• . .
1 40
[Lys11 ,Lys13,Arg19,A1a21 ,Haa (LaaLaaHaa Haa)2Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)34 humana
[Leu11 ,Lys13,Arg19,Arg21 ,Haa (LaaLaa Haa Haa)2Laa22-31 ] PTHrP(1 -34)35 humana
[Lys11 ,Lys13,Arg19,Arg21 ,Haa (LaaLaaHaa Haes)2Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)3°humana [Argi l ,Arg13,Arg19,Arg21 ,Haa (LaaLaa HaaHaa)2 Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)31 humana
[Arg11 ,Lys13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa LaaHaa Haa)2 Laa22-31 ] PTHrP(1 -34)38humana
[Argil ,Arg13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)39 humana
Haa(LaaLaa Haa Haa)2Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)49 humana
Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa22-31 ] PTHrP(1-34)41 humana
Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa22-31 ] PTHrP(1 -34)42 humana
Haa(Laa Laa HaaHaa)2Laa22-31 ] PTHrP(1 -34)43 humana
Haa(Laa Laa HaaHaa)2 Laa 22-31 ] PTHrP(1 -34)" humana [Haa(LaaLaa HaaHaa)2 Laa 22-30] PTH(1 -30) humana [Haa(LaaLaa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(1 -30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(1 -30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa22-30] PTH(1 -30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(1 -34)27 humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTH(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Ha)2 Laa 22-30] PTH(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30)humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKL
1 41
IITA
AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKL
1 42
I-113,1a
AVSEHQLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERL
1 43
HTA
AVSEHQLLHDRGRSIQDRRRELLERLLERLH
1 44
TA
AVSEHQLLHDRGKS1QDLRRRELLERLLKRL
1 45
STA
AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRL
1 46
HTA .
,
•
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEAL
1 47
HTA
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSL
1 48
HTA
AVSEHQLLHDICGKSIQDLRRRAFYDKVAEICL
1 49
HTA
AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVELLEKLLEKL
1 50
HNY -
AVSEIQFMHNLGKHLSSMRRRELLEICLLEKL
1 51
HNY '
SVSEI QLMHNLGKHLNSMERVELLEKLLEK
1 52
SVSEI QLMHNLGKHLNSMERVELLEKLLKK
1 53
SVSEI QLMHNLGKHLNSMERVALAEALAEA
1 54
SVSEI QLMHNLGKHLNSMERVSLLSSLLSS
1 55
SVSEI QLMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEKLHNF
1 56
LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLEK
1 57
LMHNLGKHLNSMERVELLEKLLKK
1 58
LMHNLGKHLNSMERVALAEALAEA
1 59
LMHNLGKHLNSMERVSLLSSLLSS
1 60
LMHNLGKHLNSMERVAFYDKVAEK
1 61
AVSEHQLLHDKGKSI QDLRRRELLEKLLEK
1 62
AVSEHQLLHDKGKSI QDLRRRELLEKLLKK
1 63
AVSEHQLLHDKGKSI QDLRRRALAEALAEA
1 64
AVSEHQLLHDKGKSI QDLRRRSLLSSLLSS
1 65
AVSEHQLLHDKGKSI QDLRRRAFYDKVAEK
1 66
[Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(7-30) humana [Haa(LaaLaa Haa Haa)2 Laa22-30] PTHrP(7-30) humana [Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(7-30) humana [Haa(Laa LaaHaa Haa)2 Laa22-30] PTHrP(7-30) humana [Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (Laa LaaHaa Haa)2Laa22-30] PTHrP(1 -30) humana [Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (LaaLaa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Lys11 ,Lys13;Arg19,Arg21 ;Haa (Laa LaaHaa Haa)2Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Lys11 ,Lys13,Ala19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Lys11 ,Lys13,Arg19,A1a21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Leu11 ,Lys13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Lys11 ,Lys13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Argi l ,Arg13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa LaaHaa Haa)2Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Argil ,Lys13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana [Argil ,Arg13,Arg19,Arg21 ,Haa (Laa Laa Haa Haa)2Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana Haa(LaaLaa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana Haa(Laa LaaHaaHaa)2 Laa22-30] PTHrP(1 -30) humana Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP( 1 -30) humana Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 22-30] PTHrP(1 -30) humana
LLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEK 167
LLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLKK 168 LLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEA 169
LLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSS 170 LLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEK 171 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRK 172
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEK 173 .
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHT 174
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEK 175
AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEK 176
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEK 177
AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEK 178
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLER 179
AVSEHQLLHDRGRSIQDRRRELLERLLER 180
AVSEHQLLHDRGKSIQDLRRRELLERLLKR 181
AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKR 182
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEA 183 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSS 184
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEK 185 AVSEIQFMHNLGKHLSSMERVELLEKLLEK 186 AVSEIQFMHNLGKHLSSMRRRELLEKLLEK 187
15 Moseley etal. , (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5048; Suva etaL (1987), Science 237: 893; Kemp etal. (1987), Science 238: 1568; Paspaliaris et al. (1995), Bone 16: 141 S (resumen 225, conferencia, Melbourne 1995). 19 Basada en el documento JP 07316195, 25 de mayo de 1994 (Nippon Kayaku). 20 Nagasaki et aL (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun. 158: 1036; Nutt et aL ; Endocrinology 127, 491 (1990).
'Williams etal. (1998), J. Reproduction & Fertility 112: 59-67. 22 Gardella etaL (1996), Endocrinol. 137:3936-41; Fukayama etaL (1998), Am. J. Physiol. 274:E297-E303. 23 Li etal. (1996), Endocrinology. 24 Incorporando la SEQ ID NO: 26 de la patente estadounidense n.° 6.051.686. 26 Incorporando la SEQ ID NO: 28 de la patente estadounidense n.° 6.051.686. 26 lncorporando la SEQ ID NO: 29 de la patente estadounidense n.° 6.051.686. 27 Incorporando la SEQ ID NO: 30 de la patente estadounidense n.° 6.051.686. 28 lncorporando la SEQ ID NO: 26 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 29 lncorporando la SEQ ID NO: 5 de la patente estadounidense n.° 6.051.686.
Basada en SEQ ID NOS: 8, 9 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 31 lncorporando la SEQ ID NO: 10 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 32 Incorporando la SEQ ID NO: 11 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 33 Incorporando la SEQ ID NO: 12 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 34 lncorporando la SEQ ID NO: 12 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 36 lncorporando la SEQ ID NO: 14 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 36 lncorporando la SEQ ID NO: 15 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 37 Incorporando la SEQ ID NO: 16 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 38 lncorporando la SEQ ID NO: 17 y 18 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 39 lncorporando la SEQ ID NO: 19 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 40 lncorporando la SEQ ID NO: 20 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 41 lncorporando la SEQ ID NO: 21 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 42 lncorporando la SEQ ID NO: 22 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 43 Modificada de la SEQ ID NO: 23 de la patente estadounidense n.° 6.051.686 " Modificada de la SEQ ID NO: 24 de la patente estadounidense n.° 6.051.686
En determinados casos, un domino de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende la secuencia del peptido conocido como TI P39:
SLALADDAAFRERARLLAALERRHWLNSYMHKLLVLDAP
(SEQ ID NO: 160)
5 TIP39 se describe en Usdin etal. (1999), Nature Neurosci. 2(11): 941-3; Usdin etal.(1996), Endocrinology 137(10): 4285-97; Usdin etaL (1995), J. Biol. Chem. 270(26): 15455-8; Usdin etaL (1999), Endocrinol. 140(7): 3363-71.
En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de los polipOptidos de formula I (SEQ ID NO: 13). En determinados casos, un dominio de modulacion de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de los polipeptidos de formula II (SEQ ID NO: 14). En determinados casos, 10 un domino de modulacion de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de los polipeptidos de fOrmula III (SEQ ID NO: 15). En determinados casos, un dominio de modulacion de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de los polipeptidos de fOrmula I (SEQ ID NO: 13), excepto el polipeptido que comprende una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mas sustituciones no conservativas. En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de los polipeptidos de formula II 15 (SEQ ID NO: 14), excepto el polipeptido quo comprende una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mas sustituciones no conservativas. En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de los polipeptidos de fOrmula III (SEQ ID NO: 15), excepto el polipeptido quo comprende una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mas sustituciones no conservativas. En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende un polipeptido 20 seleccionado de polipeptidos de formula I (SEQ ID NO: 13), en el que uno o mas residuos entre la posiciOn 14 y el aminoacido del extern° C-terminal del polipeptido estan sustituidos por un residuo de cisteina. En determinados casos, un dominio de modulaci6n de PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de polipeptidos de fOrmula II (SEQ ID NO: 14), en el quo uno o mas residuos entre la posicion 14 y el aminoacido del extremo C-terminal del polipeptido estan sustituidos por un residuo de cisteina. En determinados casos, un dominio de modulacion de
25 PTH/PTHrP comprende un polipeptido seleccionado de polipeptidos de fOrmula III (SEQ ID NO: 15), on el que uno o mas residuos entre la posiciOn 14 y el aminoacido del extremo C-terminal del polipeptido estan sustituidos por un residuo de cisteina.
En determinados casos, un dominio de modulacion de PTH/PTHrP comprende un polipeptido (i) quo tiene la secuencia de aminoacidos de TIP39 (SEQ ID NO: 160), o (ii) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 1A, o (iii)
30 seleccionado de los polipeptidos de la tabla 1B, o (iv) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 2. En determinadas realizaciones, un dominio de modulacion de PTH/PTHrP comprende un polipeptido (i) que tiene la
secuencia de aminoacidos de TIP39 (SEQ ID NO: 160), excepto el polipeptido que comprende una o mds sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mas sustituciones no conservativas, o (ii) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 1A, excepto el polipeptido que comprende una o mds sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mds sustituciones no conservativas, o (iii) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 1B, 5 excepto el polipeptido que comprende una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mas sustituciones no conservativas, o (iv) seleccionado de los polipOptidos de la tabla 2, excepto el polipeptido que comprende una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas y/o una o mds sustituciones no conservativas. En determinados casos, un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende un polipOptido (i) que tiene la secuencia de aminoacidos de TIP39 (SEQ ID NO: 160), excepto uno o mas residuos entre la posiciOn 14 y el aminoacido del 10 extremo C-terminal del polipeptido que estan sustituidos por un residuo de cisteina, o (ii) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 1A, excepto uno o mas residuos entre la posiciOn 14 y el aminoacido del extremo C-terminal del polipeptido que estan sustituidos por un residuo de cisteina, o (iii) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 1B, excepto uno o mas residuos entre la posici6n 14 y el aminodcido del extremo C-terminal del polipeptido que estan sustituidos por un residuo de cisterna, o (iv) seleccionado de los polipeptidos de la tabla 2, excepto uno o mds
15 residuos entre la posiciOn 14 y el amihoacido del extremo C-terminal del polipeptido que estan sustituidos por un residuo de cisterna.
En determinados casos, uno o mas residuos entre la posiciOn 27 y el extremo C-terminal del dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP es un residuo de cisteina.
Determinados dominios pre-pro a modo de eiemplo
20 En determinados casos, un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulaciOn. En determinados casos, el dominio pre-pro es el extremo N-terminal con respecto al dominio de modulaciOn. En determinadas realizaciones, el dominio pre-pro y el dominio de modulaciOn estan separados por de 0 a 30 aminoacidos. En determinados casos, el dominio pre-pro y el dominio de modulaciOn estan separados por de 0 a 10 aminoacidos. En determinados casos, el dominio pre-pro y el dominio de modulaciOn estan separados por 0, 1, 2, 3,
25 46 5 aminodcidos. Se muestran determinados dominios pre-pro a modo de ejemplo en las tablas 3y 4.
Tabla 3 -Dominios pre-pro a modo de ejemplo basados en polipeptidos de PTH que se producen de manera natural
Descri pci 6n
Secuencia N. ° de reg. SEQ I D NO:
Ser humano
MI PAKDMAKVMI VMLAI CFLTKSDGKSVKKR NP_000306 1 88
Rattus
egicusnorv
MMSASTMAKVMI LMLAVCLLTQADGKPVKKR NP_058740 1 89
Sus scrofa
MMSAKDTVKVMVVMLAI CFLARSDGKPI KKR P01 269 1 90
Gallus gal/us
MTSTKNLAKAI VI LYAI CFFTNSDGRPMMKR P1 5743 1 91
Bos taurus
MMSAKDMVKVMI VMLAI CFLARSDGKSVKKR P01 268 1 92
Fe/is cattus
MMSAKDMVKVMVVMFAI CFLAKSDGKPVKKR AAG30545 1 93
Canis familiaris
MMSAKDMVKVMI VMFAI CFLAKSDGKPVKKR NP_001 003302 1 94
Mus muscu/us
MMSANTVAKVMI I MLAVCLLTQTDGKPVRKR NP_065648 1 95
Tabla 4 -Dominios pre-pro a modo de ejemplo basados en polipeptidos de PTHrP que se producen de manera natural
DescripciOn Secuencia N.°de req. SEQ IDNO: Serhumano MQRRLVQQWSVAVFLLSYAVPSCGRSVEGL NP_945317 196 SRRLKR Rattus norvegicus MLRRLVQQWSVLVFLLSYSVPSRGRSVEGL NP_036768 197
GRRLKR
Susscrofa MLWRLVQQTrISVAVFLLSYSVPSCGRSVEEL NP_999081 198 GRRLKR
Gallusgal/us MMFTKLFQQWSFAVFLLSYSVPSYGRSVEG NP_990669 199 ISRRLKR Bos taurus MLWRLVQQWSVAVFLLSYSVPSCGRSVEEL P58073 200 GRRLKR Fells cattus
LLSYSVPSCGRSVEELGRRLKR AAL13054
201
(parcial) Canisfamiliaris MLRRLVQQWGVAVFLLSYSVPSCGRSIMEL NP_0010033 202
03
GRRLKR
Musmuscu/us MLRRLVQQWSVLVFLLSYSVPSRGRSVEGL CAC39218 203 GRRLKR Oryctolagus MLRRLVQQWSVAVFLLSYSVPSCGRSVEGP AAG13414
204 cuniculus
GRRLKR
Phoca vftulina
MLRRLVQQWSVAVFLLSYSVPSCGRSVBEL CAH39862 205
GRRLKR
Cervus elaphus (parcial )
QWSVXVFLXSYSVPSCGRSVEELGRRLKR AAP93209 206
Ovis aries (parci al )
VGVFLLSYSVPSCGRSVEELGRRLKR AAG48348 207
Determinados peptidos de PTH/PTHrP a modo de eiernolo
En determinados casos, pueden prepararse peptidos de PTH/PTHrP mediante metodos conocidos en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, metodos descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.°s 4.423.037; 4.968.669; 5.001.223; o 6.051.686. En determinadas realizaciones, dos o mas peptidos de PTH/PTHrP pueden 5 unirse en tandem (es decir, multiples peptidos unidos secuencialmente), con o sin ligadores. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP que contiene un residuo de cisteinilo puede reticularse con otro polipeptido que contiene cisteina. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP que tiene mas de un residuo de cisteina puede formar un enlace disulfuro intrapeptidico. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP
puede derivatizarse, tal como se trat6 anteriormente.
10 En determinados casos, sustituciones de aminoacidos conservatives produciran peptidos que tienen caracteristicas funcionales y quimicas similares a las del peptido de PTH/PTHrP antes de realizar las sustituciones. En determinados casos, si se desea la alteraci6n de las caracteristicas funcionales y/o quimicas de un peptido de PTH/PTHrP, pueden realizarse sustituciones no conservatives en la secuencia peptidica. En determinados casos, pueden realizarse tales sustituciones no conservatives seleccionando, por ejemplo, uno o mas aminoacidos de
15 reemplazo que difieren de los aminoacidos reemplazados en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura
del esqueleto peptidico en la zona de la sustituci6n, por ejemplo, como una conformed& de lamina o helicoidal, (b)
la carga o hidrofobicidad de la molecule en el sitio de sustituci6n, y/o (c) el tame() de la molecule en el sitio de
sustituciOn.
Los expertos en la tecnica pueden determinar determinadas sustituciones de aminoacidos deseadas a modo (ya
20 sean conservatives o no conservatives) en el momento en el que tales sustituciones se deseen. En determinados casos, pueden usarse sustituciones de aminoacidos para identificar residuos importantes de un peptido de PTH/PTHrP, o para aumentar o disminuir la afinidad del peptido de PTH/PTHrP por el receptor PTH-1 y/o el receptor PTH-2.
Determinados metodos a modo de elemplo de prepared& de Deotidos de PTH/PTHrP
25 En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP puede prepararse en celulas huesped transformadas usando tecnicas de ADN recombinante. Por tanto, en determinadas realizaciones, se prepara una molecule de ADN recombinante que codifica para el peptido. En la tecnica se conocen determinados metodos a modo de ejemplo de
preparaci6n de tales molecules de ADN. En determinadas realizaciones, puede cortarse una secuencia que codifica para un peptido a partir de ADN usando una enzima o enzimas de restricciOn adecuadas. En determinadas 30 realizaciones, puede sintetizarse una molecule de ADN usando tecnicas de sintesis quimica, incluyendo, pero sin limitarse a, el metodo de fosforoamidita. En determinadas realizaciones, puede usarse una combined& de estas tecnicas y otras tecnicas conocidas en la tecnica.
En determinadas realizaciones, se proporciona un vector que puede expresar un p6ptido de PTH/PTHrP en una celula huesped apropiada. En determinadas realizaciones, el vector comprende la molecule de ADN que codifica 35 para el peptido operativamente unido a una o mas secuencias de control de la expresiOn apropiadas. En la tecnica se conocen determinados metodos a modo de ejemplo para unir operativamente un ADN codificante a una o mas secuencias de control de la expresiOn. Determinadas secuencias de control de la expresiOn a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de union a ribosomas, seriales de iniciaciOn, seriales de terminaciOn, seriales de caperuza, serrates de poliadenilacion y otras seliales
40 implicadas en el control de la transcripciOn y/o traducciOn. En determinadas realizaciones, el vector resultante que tiene el ADN codificante se usa para transformar un huesped apropiado. En diversas realizaciones, un expert° en la tecnica puede seleccionar un metodo de transformaci& apropiado segun la celula huesped seleccionada.
En diversas realizaciones, puede usarse una del gran numero de celulas huesped disponibles y bien conocidas para expresar un peptido de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, se selecciona una celula huesped particular 45 basandose en varios factores conocidos en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a, compatibilidad con el vector de expresion elegido, toxicidad del peptido codificado por la molecule de ADN en ese tipo de celula particular, tasa de transformacion, facilidad de recuperaci6n del peptido expresado, caracteristicas de expresion, bioseguridad y costes. En determinadas realizaciones, la consideraci6n de estos factores se realize comprendiendo que no todas las celulas huesped pueden ser igualmente eficaces para la expresion de una secuencia de ADN particular. Los
50 huespedes Utiles a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, bacterias (tales como E. colisp.), levadures (tales como Saccharomyces sp. y Pichia pastoris) y otros hongos, celulas de insecto, plantas y celulas vegetales, celulas de marnifero (incluyendo ser humano) en cultivo, determinados mamfferos (incluyendo ovejas, cabras, vacas y cerdos) y otras celulas huesped y organismos conocidos en la tecnica. Las Knees celulares de mamffero
disponibles como huespedes para la expresion incluyen, pero no se limitan a, determinadas lineas celulares
inmortalizadas disponibles de la ColecciOn Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de ririOn de cria de hamster (BHK), celulas de ritiOn de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2) y similares, que pueden adaptarse opcionalmente para su crecimiento en medio de cultivo libre de suero. Determinadas celulas huesped a
5 modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, colulas 293T y colulas CHO AM-1/D.
En determinadas realizaciones, se cultiva el huesped transformado y se purifica el peptido. En determinadas realizaciones, se cultivan las celulas huesped segun metodos conocidos en la tecnica, que incluyen condiciones de fermentaciOn convencionales, para expresar el peptido deseado. En determinadas realizaciones, el peptido se purifica del cultivo segun metodos conocidos en la tecnica.
10 En determinados casos, puede prepararse un peptido de PTH/PTHrP mediante metodos sinteticos. Por ejemplo, en determinados casos, pueden usarse tecnicas de sintesis en fase sOlida. En la tecnica se conocen determinadas tecnicas de sintesis en fase Wide a modo de ejemplo, que incluyen pero no se limitan a, las descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pegs. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:
2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis;
15 patente estadounidense n.° 3.941.763; Finn et aL (1976), The Proteins (33 ed.) 2: 105-253; y Erickson et aL (1976), The Proteins (31 ed.) 2: 257-527. En determinados casos, la sintesis en fase solida puede ser el metodo mas rentable de preparacion de deternninados peptidos pequeflos.
En determinados casos, pueden prepararse peptidos derivatizados usando tecnicas de quirnica organica conocidas. En determinados casos, en primer lugar se prepara el peptido no derivatizado usando metodos o bien bioquirnicos o 20 bien sinteticos, y entonces se derivatiza usando tecnicas de quirnica organica.
Determinados liqadores a modo de eiemplo
Si se describe que un polipeptido este "unido" a otro polipeptido, la molecule unida puede incluir o no un ligador. En determinados casos, si un ligador sirve principalmente como espaciador entre dos molecules, su estructura quimica precisa no es critic& En determinados casos, un ligador comprende residuos de aminoacido unidos entre si por 25 enlaces peptidicos, es decir, un ligador comprende un peptido. Por tanto, en determinados casos, un ligador es un peptido que tiene entre 1 y 20 residuos de aminoacidos, incluyendo todos los numeros entre los extremos. Los residuos de aminoacido usados en ligadores pueden ser residuos de aminoacidos convencionales o no convencionales. En determinados casos, los residuos de aminoacido en un ligador pueden estar glicosilados y/o derivatizados de otra manera. En determinados casos, los residuos de aminoacido en un ligador se seleccionan de
30 glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamine y lisina. En determinados casos, un ligador comprende una mayoria de residuos de aminoacido que no ester' impedidos estericamente, tales como glicina y/o alanina. Por tanto, en determinados casos, se selecciona un ligador de una poliglicina (por ejemplo, (Gly)4, (Gly)5), una poli(Gly-Ala) y una polialanina. Determinados ligadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a:
(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 208);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 209);
(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 210);
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 211); y
GlyGlyGlyAlaPro (SEQ ID NO: 212).
Para explicar la nomenclature anterior, por ejemplo, (Gly)3Lys(Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. En
35 determinados casos, un ligador comprende una combinaci6n de residuos de Gly y Ala. En determinados casos, un ligador comprende 10 o menos residuos de aminoacido. En determinados casos, un ligador comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 6 10 residuos de aminoacido. En determinados casos, un ligador comprende 11-30 residuos de aminoacido, incluyendo todos los numeros entre esos extremos.
En determinados casos, un ligador peptidico puede resultar de los sitios de enzimas de restriccion usados para
40 clonar dos polipeptidos en una (mica secuencia codificante. En determinados casos, los sitios de enzimas de restricciOn se &laden a la secuencia codificante de uno o de ambos de los polipeptidos. En determinados casos, la secuencia de aminoacidos de tales ligadores este dictada, al menos en parte, por los sitios de enzimas de restricci6n seleccionados para los procedimientos de clonaciOn.
En determinados casos, se proporcionan ligadores no peptidicos. Determinados ligadores no peptidicos a nnodo de
45 ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ligadores de alquilo tales como -NH-(CH2)3-C(0)-, en el que s = 2-20. Tales ligadores de alquilo pueden comprender adicionalmente, en determinados casos, sustituciones que incluyen, pero no se limitan a, grupo que no produce impedimento esterico tal como alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6), acilo inferior, halogeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc. Un ligador no peptidico a modo de ejemplo no limitativo es un
ligador de PEG,
en el que n es un numero tal que el ligador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD. En determinados casos, n es un numero tal que el ligador tiene un peso molecular de 100 a 500 kD, incluyendo todos los puntos entre los extremos.
En determinados casos, un ligador puede resultar de un procedimiento quimico y/o enzimatico usado para conectar dos polipdptidos entre Si. Se describen determinados procedimientos quirnicos y/o enzimaticos a modo de ejemplo para conectar polipdptidos, por ejemplo, en Pierce Applications Handbook and Catalog (2003/2004) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL).
Determinadas moloculas ouimericas de anticueroo frente a RANKL-PTH/PTHrP a modo de elernolo
En determinadas realizaciones, una moldcula quimdrica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos un anticuerpo frente a RANKL, al menos un ligador y al menos un peptido de PTH/PTHrP. Los ligadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un ligador peptidico, un ligador de alquilo, un ligador de PEG y un ligador que resulta de un procedimiento quimico o enzimatico usado para conectar dos polipdptidos. En determinadas realizaciones, al menos un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio de modulaci6n de
PTH/PTHrP y un dominio pre-pro. En determinadas realizaciones, al menos un peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP pero no un dominio pre-pro. En determinadas realizaciones, al menos un anticuerpo frente a RANKL comprende dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa. En determinadas realizaciones, al menos un anticuerpo frente a RANKL comprende al menos una cadena pesada truncada y/o al menos una cadena ligera truncada. En determinadas realizaciones, al menos un anticuerpo
frente a RANKL es un fragmento de anticuerpo. Determinados fragmentos de anticuerpo a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un Fab, un Fab', un F(ab12, un Fv y un Fv de cadena sencilla (scFv).
En determinadas realizaciones, al menos un peptido de PTH/PTHrP puede estar unido a otra moldcula a traves del extern° C-terminal del peptido de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP puede estar unido a otra moldcula a traves del extremo N-terminal del peptido de PTH/PTHrP. En determinadas
realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP esta unido al extremo C-terminal de otra moldcula. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP esta unido a un extern° N-terminal de otra moldcula.
En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP esta unido a o bien el extremo N-terminal o bien el extern° C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP esta unido a o bien el extremo N-terminal o bien el extremo C-terminal de la cadena ligera de
un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, un primer peptido de PTH/PTHrP esta unido a la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL y un segundo peptido de PTH/PTHrP que tiene secuencias de aminoacido iguales o diferentes que el primer peptido de PTH/PTHrP esta unido a la cadena ligera del anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende un ligador entre dos componentes de la molecula quimerica.
En determinadas realizaciones, al menos un peptido de PTH/PTHrP esta fusionado a la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, al menos un peptido de PTH/PTHrP esta fusionado a la cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, un primer peptido de PTH/PTHrP esta fusionado a la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL y un segundo peptido de PTH/PTHrP que tiene secuencias de aminoacido iguales o diferentes que el primer peptido de PTH/PTHrP estd fusionado a la cadena
ligera del anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL esta fusionada a al menos dos peptidos de PTH/PTHrP que tienen secuencias iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, la cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL esta fusionada a al menos dos pdptidos de PTH/PTHrP que tienen secuencias iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL esta fusionada a al menos dos primeros peptidos de PTH/PTHrP que
tienen secuencias iguales o diferentes y la cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL esta fusionada a al menos dos segundos peptidos de PTH/PTHrP que tienen secuencias iguales o diferentes.
En determinadas realizaciones, una moldcula quimerica comprende una razOn de dos peptidos de PTH/PTHrP por un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP unido a una primera cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL y un segundo peptido de PTH/PTHrP unido a una segunda cadena pesada del anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, una moldcula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP unido a una primera cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL y un segundo peptido de PTH/PTHrP unido a una segunda cadena ligera del anticuerpo frente a RANKL. El expert() en la tecnica puede diseriar moldculas quimericas adicionales que
comprendan una razOn de dos peptidos de PTH/PTHrP por un anticuerpo frente a RANKL.
En determinadas realizaciones, una molecula quimerica comprende cuatro peptidos de PTH/PTHrP por un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP unido a una primera cadena pesada de RANKL, un segundo pOptido de PTH/PTHrP unido a una segunda cadena pesada de RANKL, un tercer peptido de PTH/PTHrP unido a una primera cadena ligera de RANKL, un cuarto peptido de PTH/PTHrP unido a una segunda cadena ligera de RANKL. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP unido al extremo Nterminal de una primera cadena pesada de RANKL, un segundo peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de la primera cadena pesada de RANKL, un tercer *tido de PTH/PTHrP unido al extremo N-terminal de una segunda cadena pesada de RANKL y un cuarto peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de la segunda cadena pesada de RANKL. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP unido al extremo N-terminal de una primera cadena ligera de RANKL, un segundo peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de la primera cadena ligera de RANKL, un tercer peptido de PTH/PTHrP unido al extremo N-terminal de una segunda cadena ligera de RANKL y un cuarto peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de la segunda cadena ligera de RANKL. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer pOptido de PTH/PTHrP y un segundo peptido de PTH/PTHrP unidos al extremo N-terminal de una primera cadena pesada de RANKL y un tercer peptido de PTH/PTHrP y un cuarto pOptido de PTH/PTHrP unidos al extremo N-terminal de una segunda cadena pesada de RANKL. El expert° en la tecnica puede disefiar moleculas quimericas adicionales que comprendan una razOn de
cuatro *tidos de PTH/PTHrP por un anticuerpo frente a RANKL.
En determinadas realizaciones, una molOcula quimerica comprende ocho peptidos de PTH/PTHrP por un anticuerpo frente a RANKL. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP unido al extremo N-terminal de una primera cadena pesada de RANKL, un segundo peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de la primera cadena pesada de RANKL, un tercer peptido de PTH/PTHrP unido al extremo N-terminal de una segunda cadena pesada de RANKL, un cuarto peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de la segunda cadena pesada de RANKL, un quinto peptido de PTH/PTHrP unido al extremo Nterminal de una primera cadena ligera, un sexto pOptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de una primera cadena ligera, un septimo peptido de PTH/PTHrP unido al extremo N-terminal de una segunda cadena ligera y un octavo peptido de PTH/PTHrP unido al extremo C-terminal de una segunda cadena ligera. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de este tipo comprende un primer peptido de PTH/PTHrP y un segundo peptido de PTH/PTHrP unidos al extremo N-terminal de una primera cadena pesada de RANKL, un tercer peptido de PTH/PTHrP y un cuarto peptido de PTH/PTHrP unidos al extremo N-terminal de una segunda cadena pesada de RANKL, un quinto peptido de PTH/PTHrP y un sexto peptido de PTH/PTHrP unidos al extremo N-terminal de una primera cadena ligera de RANKL y un septimo peptido de PTH/PTHrP y un octavo peptido de PTH/PTHrP unidos al
extremo N-terminal de una segunda cadena ligera de RANKL. Un experto en la tOcnica puede diseilar moleculas quimericas adicionales quo comprendan una raz6n de ocho peptidos de PTH/PTHrP por un anticuerpo frente a RANKL.
En determinadas realizaciones, al menos un anticuerpo frente a RANKL en una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP se selecciona de un Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende un ligador peptidico entre al menos dos de los componentes.
En diversas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP seleccionado de las secuencias de aminoacidos de las tablas 1A, 1B y 2 (SEQ ID NO: 16 a 187). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL
PTH/PTHrP comprende al menos un dominio pre-pro de PTH/PTHrP seleccionado de las secuencias de aminoacidos de las tablas 3 y4 (SEQ ID NO: 188 a 207). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos un peptido de PTH/PTHrP quo tiene la secuencia mostrada en la figura 8 (SEQ ID NO: 6).
En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al
menos una cadena pesada quo tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos una cadena pesada que comprende una region variable que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 28 (SEQ ID NO: 11). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos una cadena pesada quo comprende una region variable quo es al menos
aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 99% identica a la secuencia de aminoacidos mostrada on la figura 28 (SEQ ID NO: 11). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 4 (SEQ ID NO: 4). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos una cadena ligera quo comprende una region variable
quo tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 29 (SEQ ID NO: 12). En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende al menos una cadena ligera quo comprende una regiOn variable que es al menos aproximadamente el 90%, at menos aproximadamente el 95% o al
menos aproximadamente el 99% identica a la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 29 (SEQ ID NO: 12).
En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende un anticuerpo frente a RANKL y un peptido de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende un anticuerpo frente a RANKL y dos peptidos de PTH/PTHrP. En
determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende un anticuerpo frente a RANKL y mas de dos peptidos de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende mas de un anticuerpo frente a RANKL y un p6ptido de PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP comprende mas de un anticuerpo frente a RANKL y mas de un peptido de PTH/PTHrP.
En determinadas realizaciones, un polipeptido que comprende una cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL y un peptido de PTH/PTHrP fusionado a una cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL se denomina "fusiOn de PTH/PTHrP-cadena pesada de aRANKL". En determinadas realizaciones, un polipeptido que comprende una cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL y un peptido de PTH/PTHrP fusionado a una cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL se denomina "fusion de PTH/PTHrP-cadena ligera de aRANKL". En determinadas
realizaciones, un polipOptido que comprende un primer peptido de PTH/PTHrP fusionado a una cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL y un segundo peptido de PTH/PTHrP fusionado a una cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL, en el que el primer peptido de PTH/PTHrP y el segundo peptido de PTH/PTHrP son iguales o diferentes, se denomina "fusiOn de PTH/PTHrP-cadena pesada + ligera de aRANKL".
En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP fusionado a la cadena pesada de un anticuerpo frente a
RANKL tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 12 (SEQ ID NO: 10, denominado synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 o synPTH-aRANKL-1 IgG2). Ese polipeptido, junto con una cadena ligera que tiene la secuencia mostrada en la figura 4 (SEQ ID NO: 4), se denomina "fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1" o "synPTH-aRANKL-1 HCF". En determinadas realizaciones, un peptido de PTH/PTHrP fusionado a la cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 10 (SEQ ID NO: 8,
denominado synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 o synPTH-aRANKL-1 kappa). Ese polipeptido, junto con una cadena pesada que tiene la secuencia mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), se denomina "fusiOn de synPTHcadena ligera de aRANKL-1" o "synPTH-aRANKL-1 LCF'. Un polipeptido que comprende un peptido de PTH/PTHrP fusionado a la cadena pesada de un anticuerpo frente a RANKL que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 12 (SEQ ID NO: 10, denominado synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 o synPTH-aRANKL-1 IgG2) y un
peptido de PTH/PTHrP fusionado a la cadena ligera de un anticuerpo frente a RANKL que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 10 (SEQ ID NO: 8, denominado synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 o synPTH- aRANKL-1 kappa) se denomina "fusiOn de synPTH-cadena pesada + ligera de aRANKL-1" o "synPTH-aRANKL-1 HC+LCF".
Determinados derivados a modo de eiemplo
En determinados casos, se derivatiza una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP. En determinados casos, la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP se derivatiza tras producirse la molecula unida. En determinados casos, se derivatizan uno o mas componentes de la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP antes de la formaci6n de la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP. Por ejemplo, en determinados casos, pueden derivatizarse un anticuerpo frente a RANKL y/o
unligador y/o un peptido de PTH/PTHrP antes de formar la molecula quimerica.
En determinados casos, derivatizando un polipeptido de referencia, se mejora la solubilidad, absorcion, estabilidad y/o semivida biolOgica del polipeptido de referencia. En determinados casos, la derivatizaciOn de un polipeptido de referencia puede reducir o eliminar uno o mas efectos secundarios no deseados del polipeptido de referenda in vivo.
Un derivado de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP de referencia tiene una o mas
modificaciones de uno o mas residuos de aminoacido de la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP de referencia. Determinadas moclificaciones a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, acetilaciOn, acilaciOn, ADP-ribosilacion, amidaciOn, biotinilaciOn, uniOn covalente de flavina, uniOn covalente de un resto hemo, uniOn covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un Ilpido o derivado lipidico, uniOn covalente de fosfatidilinositol, reticulaciOn, ciclizacion, formaciOn de enlaces disulfuro, desmetilaciOn, formaci6n de reticulaciones covalentes, formaci6n de cistina, formaciOn de piroglutamato, formilacion, gammacarboxilacion, glicosilacion, formaci6n de anclaje de GPI, hidroxilaciOn, yodaciOn, metilacidn, miristoilaciOn, oxidacion, procesamiento proteolitico, fosforilaciOn, prenilaciOn, racemizacion, selenoilaciOn, sulfaciOn, adiciOn de aminoacidos mediada por ARN de transferencia a proteinas tales como arginilacion y ubiquitinacion.
En determinados casos, pueden derivatizarse residuos de lisinilo y/o grupos amina N-terminales mediante reacci6n
con, por ejemplo, anhidrido succinico y/u otros anhidridos de acido carboxilico, que pueden invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros determinados reactivos que pueden derivatizar grupos de amina primaria incluyen, pero no se limitan a, imidoesteres, incluyendo picolinimidato de metilo; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroborohidruro; acido trinitrobencenosulfonico; 0-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacciOn con glioxilato catalizada por transaminasas.
En determinados casos, puede derivatizarse un residuo de arginilo mediante reacci6n con, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y/o ninhidrina. En determinados casos, la derivatizacion de residuos de arginilo se Ileva a cabo en condiciones alcalinas. En determinados casos, los reactivos que pueden derivatizar residuos de arginilo tambien pueden derivatizar lisina, un grupo amina N-terminal y/o el grupo epsilon-amino de la
arginina.
En determinados casos, pueden derivatizarse residuos de tirosilo mediante reacciOn con, por ejemplo, compuestos de diazonio aromaticos y/o tetranitrometano. En determinados casos, pueden derivatizase residuos de tirosilo para introducir uno o mds marcadores espectrales. En determinados casos, pueden usarse N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de 0-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente.
En determinados casos, pueden modificarse selectivamente grupos de cadena lateral de carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) mediante reacci6n con carbodilmidas (R'-N=C=N-R') tales como 1-ciclohexi1-3-(2-morfolinil-(4etil)carbodiimida y/o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. En determinados casos, pueden convertirse residuos de aspartilo y/o glutamilo en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacciOn con iones amonio.
En determinados casos, pueden desamidarse residuos de glutaminilo para dar residuos de glutamilo. En
determinados casos, pueden desamidarse residuos de asparaginilo para dar residuos de aspartilo. En determinados casos, alternativamente, pueden desamidarse residuos de glutaminilo y/o asparaginilo, por ejemplo, en condiciones levemente &ides.
En determinados casos, puede reemplazarse un residuo de cisteinilo por otro resto o bien para eliminar la formaciOn de enlaces disulfuro con esa ubicaci6n en el polipeptido y/o bien para estabilizar la reticulaciOn con otra ubicaci6n en el polipeptido. \tease, por ejemplo, Bhatnagar etal. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.
En determinados casos, puede usarse la derivatizacion con agentes bifuncionales para reticular un polipeptido con otro polipeptido, y/o con otra molecule, resto, superficie, matriz de soporte y/o molecule. Determinados agentes de reticulaciOn a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano; glutaraldehido; esteres de N-hidroxisuccinimida, incluyendo esteres con acid° 4-azidosalicilico; imidoesteres homobifuncionales, incluyendo esteres disuccinimidilicos tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato); y maleimidas bifuncionales, incluyendo bis-N-maleimido-1,8-octano. En determinadas realizaciones, un agente de derivatizaciOn puede producir productos intermedios fotoactivables que pueden formar reticulaciones en presencia de luz. Determinados agentes de derivatizaciOn de este tipo incluyen, pero no se limitan a, 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de nnetilo. En determinados casos, se emplean materiales para la inmovilizacion de polipeptidos. Determinados materiales de este
tipo incluyen, pero no se limitan a, matrices insolubles en agua reactivas, incluyendo hidratos de carbono activados por bromuro de cianogeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes estadounidenses n.°8 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y4.330.440.
En determinados casos, puede unirse un grupo hidrato de carbono (oligosacarido) a determinados sitios en polipeptidos de referenda. En determinados casos, se sabe que esos sitios son sitios de glicosilaciOn. En determinados casos, se unen oligosacdridos con union a 0 a residuos de serina (Ser) y/o treonina (Thr). En determinados casos, se unen oligosacdridos con uniOn a N a residuos de asparagina (Asn). En determinados casos, se unen oligosecaridos con union a N a residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X- SerfThr, en la que X es cualquier aminoacido excepto prolina. En diversos casos, las estructuras de oligosacdridos con uni6n a N y/o con union a 0 y los residuos de azilcar encontrados en cada tipo pueden ser iguales o diferentes. En determinados casos, puede encontrarse acido N-acetilneuraminico (tambien denominado acid° sidlico) en oligosacdridos tanto con uni6n a N como con union a 0. En determinados casos, el acid° sidlico es el residuo terminal de un oligosacdrido con uniOn a N y/o con union a 0 y, en virtud de su carga negative, puede conferir propiedades acidas al polipeptido glicosilado. En determinados casos, se glicosila un polipeptido en una o Inds ubicaciones durante la producciOn recombinante (por ejemplo, en celulas de marnifero tales como CHO, BHK, COS).
En determinados casos, se glicosila un polipeptido en una o mds ubicaciones mediante procedimientos sinteticos o semisinteticos conocidos en la tecnica.
Determinadas modificaciones a modo de ejemplo de un polipeptido de referencia incluyen, pero no se limitan a, hidroxilaciOn de prolina y/o lisina, fosforilaciOn de un grupo hidroxilo de serina y/o treonina, oxidaci6n del atom° de azufre de cisteina, metilacion del grupo alfa-amino de las cadenas laterales de lisine, arginina y/o histidina. \tease,
por ejemplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pdgs. 79-86 (1983).
En determinados casos, se preparan derivados de polipeptidos de referencia para uso farmaceutico. En determinados casos, derivados de polipeptidos de referencia conservan determinadas propiedades andlogas a las del polipeptido de particle. En determinados casos, se derivatizan polipeptidos de referencia usando "mimeticos pepticlicos" o "peptidomimeticos". \tease, por ejemplo, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392 1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). En determinados casos, tales derivados de polipeptidos de referenda se desarrollan con la ayuda de modelado molecular informatizado. Pueden usarse mimeticos peptidicos que son estructuralmente similares a peptidos terapeuticamente Citiles, en determinados casos, para producir un efecto profildctico o terapeutico similar. En determinados casos, un derivado de un polipeptido de
referenda preparado usando peptidomimeticos es estructuralmente similar al polipeptido de referenda, pero tiene uno o mds enlaces peptidicos reemplazados por al menos un enlace seleccionado de: --CH2NH--, --CH2S--, -- CH2-CH2--, --CH=CH-(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- y --CH2S0--, mediante metodos conocidos en la tecnica. Puede usarse la sustituciOn de uno o mds aminodcidos por un D-aminoacido del mismo tipo (por ejemplo, 0
lisina en lugar de L-lisina) en determinados casos para generar polipeptidos mas estables. En determinados casos, puede generarse un derivado constrenido de un polipOptido de referencia mediante metodos conocidos en la tecnica (vdase por ejemplo, Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, afiadiendo residuos de cisteina internos que pueden formar enlaces disulfuro intramoleculares y/o reticulando el polipeptido de referenda mediante otros motodos, lo que cicla el polipeptido.
Determinados derivados a modo de ejemplo de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP de referencia incluyen, pero no se limitan a:
1. Una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que es cfclica. Como ejemplo no limitativo,
puede ciclarse una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP reticulando dos residuos de cisteina para formar un enlace disulfuro intra-molecular.
2.
Una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que esta reticulada con al menos otra molecula, que es igual o diferente. Como ejemplo no limitativo, la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP puede reticularse con al menos otra molocula a traves de uno o mas residuos de cisteina. Como otro ejemplo no limitativo, la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP puede reticularse con al menos otra moldcula a traves de al menos un extremo C-terminal.
3.
Una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que tiene uno o mds enlaces peptidilo
[-C(0)NR-] reemplazados por uno o mas enlaces distintos de peptidilo. Los enlaces distintos de peptidilo a modo de ejemplo no limitativos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-carbamato [-CH2-0C(0)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-], urea [-NHC(0)NH-], -CH2-amina secundaria y peptido alquilado [-C(0)NR6-en el que R6 es alquilo inferior].
4.
Una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que tiene al menos un extremo N-terminal derivatizado. En determinadas realizaciones, un extremo N-terminal puede acilarse o modificarse para dar una amina sustituida. Los grupos de derivados N-terminales a modo de ejemplo no limitativos incluyen, pero no se limitan a, -NRR1 (distinto de -NH2), -NRC(0)R1, -NRC(0)0R1, -NRS(0)2R1, -NHC(0)NHR1, succinimida y benciloxicarbonil- NH-(CBZ-NH-), en los que R y R1 son cada uno independientemente hidrOgeno o alquilo inferior y en los que el anillo
defenilo puede estar sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-C4, alcoxilo cloro y bromo.
5. Una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que tiene al menos un extremo C-terminal derivatizado. En determinadas realizaciones, un extremo C-terminal puede esterificarse o amidarse. Los grupos de derivados C-terminales a modo de ejemplo no limitativos incluyen, pero no se limitan a, -C(0)R2 en el que R2 es
alcoxilo inferior o -NR3R4 en el que R3 y R4 son independientemente hidr6geno o alquilo C1-C8 (preferiblemente alquilo C1-C4).
6. Una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP en la que al menos un enlace disulfuro se ha reemplazado por al menos un resto de reticulaciOn que no es un enlace disulfuro (por ejemplo, un alquileno). \lease, por ejemplo, Bhatnagar et aL (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et aL (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp.,
357-9. En determinadas realizaciones, el resto de reticulaciOn es mds estable que el enlace disulfuro.
7. Una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP en la que uno o mds residuos de aminoacido se han modificado quirnica o enzimaticamente. En determinadas realizaciones, un agente de derivatizaciOn modifica una o aids cadenas laterales de aminoacidos particulares.
Determinados vehiculos a modo de eiemolo
En determinados casos, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP se une, o bien covalente
o bien no covalentemente, a al menos un vehiculo. En determinados casos, uno o mds vehiculos se unen, o bien covalente o bien no covalentemente, a una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP tras haberse producido la molecula quimerica. En determinados casos, uno o mas vehiculos se unen, o bien covalente o bien no covalentemente, a uno o mds componentes de una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL
PTH/PTHrP antes de ensamblar la moldcula quimerica. Como ejemplo no limitativo, pueden unirse uno o mds vehiculos a un peptido de PTH/PTHrP y luego pueden unirse uno o mds vehiculo-peptidos de PTH/PTHrP a un anticuerpo frente a RANKL para formar una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHR que tiene uno o mds vehiculos unidos. En determinados casos, pueden unirse entonces vehiculos adicionales a la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP (que ya tiene uno o mds vehiculos unidos).
Determinados vehiculos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos y moleculas pequerias (incluyendo, pero sin limitarse a, compuestos peptidomimeticos). En determinados casos, un vehiculo de polipeptido
o molecula pequena puede unirse a un receptor salvaje. Se describen determinados vehiculos de este tipo, por
ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.739.277. Podrian seleccionarse determinados vehiculos de polipeptido, por ejemplo, mediante presentacion en fago o selecciOn de ARN-peptido para determinar la capacidad para unirse a un receptor salvaje (tal como el receptor salvaje FcRn). Tales vehiculos de uniOn a receptor salvaje, en determinadas realizaciones, pueden seleccionarse para lograr semividas mds largas (por ejemplo, evitando
secuencias reconocidas por proteasas) y/o inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, favoreciendo secuencias no inmunogenicas).
Determinados vehiculos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, vehiculos de polimero. Se describen determinados metodos de uniOn de vehiculos de polimero a polipeptidos, por ejemplo, en la publicaciOn PCT n.° WO 96/11953. Los vehiculos de polimero a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG). En
determinados casos, la modificaciOn de un polipeptido terapeutico con PEG mejora la eficacia in vivo del polipeptido. En determinados casos, la modificacion de un polipeptido terapOutico con PEG extiende la semivida en circulaciOn del polipeptido. En determinados casos, la modificaciOn de un polipeptido terapeutico con PEG aumenta la solubilidad del polipOptido. En determinados casos, la modificaciOn de un polipeptido terapeutico con PEG reduce la toxicidad y/o inmunogenicidad del polipeptido.
En determinados casos, puede unirse PEG a mas de una molecula terapeutica, por ejemplo, en una configuraciOn de polipdptido-PEG-polipeptido. En determinados casos, se unen dos moleculas de PEG a una molecula terapeutica. Cuando se unen dos moleculas de PEG a una molecula terapeutica, en determinados casos, la primera molecula de PEG puede unirse a la segunda molecula de PEG, que entonces se une a la molecula terapeutica, o tanto la primera como la segunda molecula de PEG pueden unirse a ubicaciones separadas en la molecula
terap6utica. En determinados casos, se une un PEG a una cadena lateral de cisteina de un polipeptido.
En la tecnica se conocen determinadas quimicas de conjugaciOn para unir un vehiculo de PEG a un polipeptido. Se describen determinadas quimicas de conjugacion a modo de ejemplo, por ejemplo, en Zalipsky, Advanced Drug Delivery Reviews 16:157-182 (1995). En determinados casos, puede unirse un PEG a una molecula mediante acilacion o alquilacion reductora a tray& de un grupo reactivo en el resto de PEG (por ejemplo, un grupo aldehido,
amino, tiol o Oster) con un grupo reactivo en la molecula (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o ester).
En determinados casos, un metodo de union de un PEG a un polipeptido comprende combinar un polipeptido y una molecula de PEG, en el que cada uno Ileva una funcionalidad que es reactiva hacia la otra. En determinados casos, puede prepararse un polipeptido mediante sintesis en fase sOlida y "preactivarse" con un grupo funcional apropiado en un sitio particular. En determinados casos, puede purificarse y/o caracterizarse un polipeptido que Ileva un primer grupo funcional antes de hacer reaccionar el polipeptido con una molecula de PEG que Ileva un segundo grupo funcional que puede reaccionar con el primer grupo funcional. En determinados casos, la reacciOn de los grupos funcionales primero y segundo se produce en una disoluciOn acuosa. En determinados casos, la reacci6n se monitoriza mediante HPLC analitica de fase inversa. En determinados casos, la molecula de polipeptido-PEG reaccionada puede purificarse, por ejemplo, mediante HPLC preparativa, y/o caracterizarse, por ejemplo, mediante
HPLCanalitica, andlisis de aminoacidos y/o espectrometria de masas de desorciOn laser.
En determinados casos, puede prepararse un polipeptido mediante sintesis en fase sOlida en la que se usa una estrategia de protecciOn ortogonal para permitir la uniOn de uno o mds vehiculos de PEG a uno o mds grupos amino particulares. En determinados casos, se sintetiza un polipeptido con grupos protectores eliminables en grupos amino y otros grupos reactivos que no se seleccionan para la uniOn de PEG. Entonces se unen moleculas de PEG al
polipeptido protegido a traves de los grupos amino no protegidos y/u otros grupos reactivos. Tras la uniOn de PEG, en determinadas realizaciones, los grupos protectores pueden eliminarse. En determinados casos, el metodo mencionado anteriormente de uniOn selectiva de PEG es CAD para unir PEG a sOlo uno de los residuos de lisina presentes en un peptido de PTH/PTHrP. Por tanto, como ejemplo no limitativo, para PTH(1-34), puede dejarse sin proteger la cadena lateral de uno de los residuos de lisina en las posiciones 13, 26 0 27 mientras que los otros residuos de lisina se protegen con, por ejemplo, un grupo protector Ode. Tras la uniOn de PEG, los grupos Dde, en determinadas realizaciones, pueden eliminarse selectivamente usando hidrazina al 2% en agua durante de 5 a 30 minutos a temperatura ambiente. En determinados casos, se selecciona la lisina en la posicion 27 para la uniOn de PEG.
En determinados casos, puede usarse sintesis en fase sOlida para preparar un polipeptido que tiene PEG en su
extremo C-terminal. En determinados casos de este tipo, PEG puede unir el polipeptido a la resina de sintesis en fase solida. Tras la sintesis del polipeptido, el polipeptido y PEG pueden escindirse de la resina de manera que el PEG se retiene con el polipeptido.
En determinados casos, la uni6n dirigida al sitio de PEG maximiza la retenciOn de la actividad biologica mientras que se minimiza la heterogeneidad del conjugado. En determinados casos, se logra la uniOn dirigida al sitio de PEG a tray& de tecnicas de proteinas recombinantes y/o quimicas de conjugaciOn selectiva. Como ejemplo no limitativo, puede usarse mutag6nesis dirigida al sitio para incorporar uno o mds aminoacidos que tienen grupos funcionales reactivos en un polipeptido en una o mds posiciones que se predice que tienen un impacto minim° sobre la actividad de la proteina. Se describen determinadas mutagenesis dirigidas al sitio de este tipo, por ejemplo, en Goodson, et aL, Bioffechnology 8:343-346 (1990) y Tsutsumi, et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:8548-8553 (2000). Los
aminoacidos a modo de ejemplo que tienen grupos funcionales reactivos incluyen, pero no se limitan a, cisterna. En
determinados casos, puede prepararse y/u obtenerse comercialmente un polimero de PEG monofuncional activado. Determinados polimeros de PEG activados a modo de ejemplo que reaccionan con tioles de cisternas incluyen, pero no se limitan a, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-yodoacetamida, PEG-ortopiridil-disulfuro y PEG-epOxidos. En determinados casos, se selecciona una PEG-maleimida para la conjugaciOn con el polipeptido mutagenizado. El
polipdptido mutagenizado puede combinarse entonces con el PEG activado en condiciones de reacci6n apropiadas para promover la formaci6n de un conjugado de PEG-polipeptido. En determinadas realizaciones, el PEGpolipeptido se purifica y/o caracteriza.
En diversos casos, el vehiculo de PEG puede ser de cualquier peso molecular y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG, en determinadas realizaciones, oscila entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa. En determinados casos, el peso molecular promedio del PEG es de entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa. En determinados casos, el peso molecular promedio del PEG es de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 30 kDa. En determinados casos, el peso molecular promedio de monometoxi-PEG-maleimidas lineales es de entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 30 kDa, o entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 30 kDa. En determinados casos, el peso molecular promedio de una PEG-maleimida ramificada es de aproximadamente 40 kDa. En determinados casos, una PEG-maleimida ramificada de 40 kDa puede comprender dos "brazos" de polimero de 20 kDa unidos a traves de un ligador, que tambien sirve como sitio de uniOn al polipdptido. En determinados casos, se usa una PEG
(maleimida)2 bis-funcional de 8 kDa para un conjugado de polipeptido-PEG-polipeptido.
Los vehiculos de polimero a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polimeros de polisacaridos. Los
dextranos son polimeros de polisacdridos compuestos por subunidades individuales de glucosa unidas predominantemente mediante enlaces a1-6. El dextrano esta disponible en muchos pesos moleculares, incluyendo, pero sin limitarse a pesos moleculares de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 70 kDa. En determinadas realizaciones, el dextrano tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 20 kDa. En determinados casos, puede usarse dextrano como vehiculo por si mismo o en combinaciOn con otro vehiculo.
Vdanse, por ejemplo, las publicaciones PCT n.°$ WO 96/11953 y WO 96/05309. Se describe el uso a modo de ejemplo de dextrano conjugado con moleculas terapeuticas, por ejemplo, en la solicitud de patente europea n.° 0 315
456.
Determinados usos a modo de eiemplo para una moldcula auirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP
En determinadas realizaciones, se proporcionan composiciones para su uso en metodos de tratamiento de un trastorno oseo que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y al menos un agente terapeutico adicional. En determinadas realizaciones de este tipo, uno o mas del al menos un agente terapeutico adicional esta presente en una cantidad terapeuticamente eficaz. En determinadas realizaciones, el trastomo Oseo es un trastorno caracterizado al menos en parte por un aumento en la resorciOn Osea y/o una perdida Osea neta. En determinadas realizaciones, se usa una composicion con una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP para suprimir la tasa de resorciOn Osea. En determinadas realizaciones, pueden usarse composiciones para reducir la tasa de resorcion Osea en pacientes en los que la tasa de resorciOn esta por encima de la normal. En determinadas realizaciones, pueden usarse composiciones para reducir la tasa de resorciOn Osea hasta por debajo de niveles normales con el fin de compensar niveles por debajo de los normales de formaci6n 6sea en un paciente. En determinadas realizaciones, se usa una composici6n con una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP para aumentar la tasa de formaciOn Osea. En determinadas realizaciones, la composicion puede usarse para aumentar la tasa de formacion Osea en pacientes en los que la tasa de formacion esta por debajo de la normal. En determinadas realizaciones, la composicion puede usarse para aumentar la tasa de
formaciOn Osea hasta por encima de niveles normales con el fin de compensar niveles por encima de los normales de resorci6n 6sea en un paciente.
Determinados estados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:
hiperparatiroidismo primario y secundario;
metastasis tumorales, incluyendo metastasis en hueso (incluyendo metastasis en hueso que estan relacionadas con cancer de mama y prOstata);
caquexia y anorexia, incluyendo caquexia y anorexia asociadas con cancer;
osteopenia, incluyendo osteopenia tras cirugia, osteopenia inducida por administracion de esteroides, osteopenia asociada con trastornos del intestino grueso y delgado, osteopenia asociada con enfermedades renales y hepaticas cronicas y osteopenia relacionada con o agravada por serializacion del receptor de PTH aberrante, incluyendo
determinadas formas de osteoporosis;
osteoporosis, incluyendo osteoporosis primaria, osteoporosis posmenopausica y relacionada con la edad, osteoporosis endocrina (incluyendo hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, sindrome de Cushing y acromegalia), formas hereditarias y congenicas de osteoporosis (incluyendo osteogenesis imperfecta, homocistinuria, sindrome de
Menkes, sindrome de Riley-Day) y osteoporosis debida a inmovilizaciOn de las extremidades;
osteoporosis que es secundaria a otros trastornos, incluyendo hemocromatosis, hiperprolactinemia, anorexia nerviosa, tirotoxicosis, diabetes mellitus, enfermedad celfaca, enfermedad inflamatoria del intestino, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, mieloma multiple, enfermedades linfoproliferativas y
mastocitosis sistemica;
osteoporosis secundaria a cirugla (por ejemplo, gastrectomia) o a terapia farmacolOgica, incluyendo quimioterapia, terapia anticonvulsiva, terapia inmunosupresora y terapia anticoagulante;
osteoporosis secundaria a tratamiento con glucocorticosteroides para determinadas enfermedades, incluyendo artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistemico (LES), asma, artritis temporal, vasculitis, enfermedad pulmonar obstructiva crOnica, polimialgia reumatica, polimiositis y enfermedad pulmonar intersticial crOnica;
osteoporosis secundaria a tratamiento con glucocorticosteroides y/o inmunomodulador para prevenir el rechazo de Organos tras trasplante de Organos tales como trasplantes de ririOn, higado, pulmon y corazon;
osteoporosis debida a sometimiento a microgravedad, tal como se observa durante un viaje espacial;
osteoporosis asociada con enfermedad maligna, tal como cancer de mama, cancer de prOstata;
enfermedad de Paget del hueso (osteitis deformante) en adultos y menores;
osteomielitis, en otras palabras, una lesion infecciosa en el hueso, que conduce a perdida Osea;
hipercalcemia, incluyendo hipercalcemia que resulta de tumores sOlidos (incluyendo mama, pulmOn y ririOn) y tumores malignos hematolOgicos (incluyendo mieloma multiple, linfoma y leucemia), hipercalcemia idiopatica e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y trastornos de la funciOn renal;
Osteonecrosis, en otras palabras, muerte de celulas oseas, incluyendo osteonecrosis asociada con lesion traurnatica, osteonecrosis asociada con enfermedad e Gaucher, osteonecrosis asociada con anemia falciforme, osteonecrosis asociada con lupus eritematoso sistemico, osteonecrosis asociada con artritis reumatoide, osteonecrosis asociada con enfermedad periodontal, osteonecrosis asociada con metastasis osteolitica y osteonecrosis asociada con otros estados; y
perdida de cartilago y erosiOn articular asociada con artritis reumatoide.
Determinados usos a modo de eiemplo de una molecula ouirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP
En determinadas realizaciones, una molOcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para su uso sola o con al menos un agente terapeutico adicional para el tratamiento de trastornos oseos. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para su uso conjuntamente con una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente terapeutico adicional. Determinados agentes terapeuticos a modo de ejemplo que son para su uso con una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-resorciOn Osea, agentes anabOlicos 6seos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores y agentes de terapia contra el cancer. Determinados agentes terapeuticos a modo de ejemplo tambien incluyen, pero no se limitan a, factores morfogenicos 6seos, incluyendo pero sin limitarse a BMP-1 aBMP-12; factor de crecimiento transformante 6 (TGF-I3) y miembros de la familia de TGF-13; inhibidores de interleucina-1 (IL-1), incluyendo pero sin limitarse a, IL-1ra y derivados de la misma, KineretTM y anakinra; inhibidores de TNFa, incluyendo pero sin limitarse a, receptores de TNFa solubles, EnbreITM, etanercept, anticuerpos anti- TNFa, RemicadeTM, infliximab, Humira, adalimumab, hormona paratiroidea y andlogos de los mismos; proteina relacionada con la hormona paratiroidea y andlogos de la misma; prostaglandinas de la serie E; bisfosfonato, incluyendo pero sin limitarse a alendronato y otros; minerales potenciadores del hueso, incluyendo pero sin limitarse a fluoruro y calcio; moduladores de esclerostina; farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluyendo pero sin limitarse a, inhibidores de COX-2, incluyendo pero sin limitarse a CelebrexTM, celecoxib, VioxxTM y rofecoxib; inmunosupresores, incluyendo pero sin limitarse a metotrexato y leflunomida; inhibidores de serina proteasa, incluyendo pero sin limitarse a, inhibidores de proteasa leucocitaria secretora (SLPI); inhibidores de IL-6 (incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos frente a IL-6), inhibidores de IL-8 (incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos frente a IL-8); inhibidores de IL-18 (incluyendo pero sin limitarse a, protelnas de uniOn a IL-18 y anticuerpos frente a IL-18); moduladores de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE); factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo pero sin limitarse a, FGF-1 a FGF-10, y moduladores de FGF; antagonistas de PAF; factores de crecimiento de queratinocitos (KGF), moleculas relacionadas con KGF y moduladores de KGF; moduladores de metaloproteinasas
dela matriz (MMP); moduladores de Oxido nitrico sintasa (NOS), incluyendo pero sin limitarse a, moduladores de NOS inducible; moduladores del receptor de glucocorticoides; moduladores de receptores de glutamato; moduladores de los niveles de lipopolisacarido (LPS); y noradrenalina y moduladores y mimeticos de la misma.
En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y agentes terapeuticos particulares son para su uso para tratar diversos estados inflamatorios, estado autoinmunitarios, cancer,
trastornos metabOlicos y/u otros estados con pardida Osea concomitante. En determinadas realizaciones, en vista del estado y el nivel deseado de tratamiento, pueden contemplarse dos, tres o mas agentes. En determinadas realizaciones, tales agentes pueden proporcionarse juntos mediante inclusion en la misma formulaciOn. En determinadas realizaciones, tales agentes y una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP pueden proporcionarse juntos mediante inclusion en la misma formulaciOn. En determinadas realizaciones, tales agentes pueden proporcionarse juntos mediante inclusiOn en un kit de tratamiento. En determinadas realizaciones, tales agentes y una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP pueden proporcionarse juntos mediante inclusion en un kit de tratamiento. En determinadas realizaciones, tales agentes pueden proporcionarse por separado. En determinadas realizaciones, cuando se usan para terapia ganica, los genes que codifican para los
agentes polipeptidicos y/o una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP pueden incluirse en el mismo vector. En determinadas realizaciones, los genes que codifican para los agentes polipeptidicos y/o una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP pueden estar bajo el control de la misma region promotora. En determinadas realizaciones, los genes que codifican para agentes polipeptidicos y/o una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP pueden estar en vectores separados.
En determinadas realizaciones, composiciones para tratar la pardida osea asociada con una enferenedad mediada por IL-1 comprenden una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y al menos un inhibidor de interleucina-1 (IL-1). En determinadas realizaciones, una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP puede ser para su administraci6n antes de, simultaneamente con y/o posteriormente a la administraciOn de at menos un inhibidor de IL-1. En determinadas realizaciones, una composicion comprende una molacula
quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, al menos un inhibidor de IL-1 y at menos una molacula adicional descrita en el presente documento. En determinadas realizaciones, las composiciones comprenden at menos un inhibidor de IL-1 y/o al menos un inhibidor de TNF-a conjuntamente con una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, puede usarse una molacula quimarica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP en combinaciOn con at menos un inhibidor de IL-1 y/o al menos un inhibidor
de TNFa para el tratamiento de pardida 6sea asociada con una enfermedad mediada por TNFa y/o IL-1.
Las enfermedades mediadas por interleucina-1 (IL-1) agudas y crOnicas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: pancreatitis aguda; esclerosis lateral amiotrOfica (ELA o enfermedad de Lou Gehrig); enfermedad de Alzheimer; caquexia/anorexia, incluyendo caquexia inducida por SIDA; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoinmunitaria; sindrome de fatiga cronica; enfermedades asociadas con Clostridium, incluyendo diarrea asociada con Clostridium; indicaciones y estados coronarios, incluyendo insuficiencia cardiaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunciOn del miocardio (por ejemplo, relacionada con septicemia) e injerto de derivacion de arterias coronarias; cancer, incluyendo, pero sin limitarse a, leucemias, incluyendo mieloma multiple y leucemia mielogena (por ejemplo, LMA y LMC) y metastasis tumoral; diabetes (incluyendo diabetes insulinodependiente); endometriosis; fiebre; fibromialgia; glomerulonefritis; enfermedad de
injerto contra huasped y/o rechazo de trasplante; choque hemorragico; hiperalgesia; enfermedad inflamatoria del intestino; estados inflamatorios de una articulaciOn, incluyendo osteoartritis, artritis psoriasica y artritis reumatoide; enfermedad ocular inflamatoria, incluyendo las asociadas con, por ejemplo, trasplante de cornea; isquemia, incluyendo isquemia cerebral (incluyendo lesiOn cerebral como resultado de, por ejemplo, traumatismo, epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneraciOn); enfermedad de Kawasaki; deterioro del aprendizaje; enfermedades pulmonares (incluyendo sindrome de dificultad respiratoria aguda, o SDRA); esclerosis multiples; miopatias (por ejemplo, metabolismo de proteinas musculares, incluyendo metabolismo de proteinas musculares en septicemia); neurotoxicidad (incluyendo tat estado inducido por VIH); osteoporosis; dolor, incluyendo dolor relacionado con cancer; enfermedad de Parkinson; enfermedad periodontal; part° prematuro; psoriasis; lesion por reperfusiOn; choque septicarnico; efectos secundarios de la radioterapia; enfermedad de la articulaciOn temporomandibular; alteraciOn del suerio; uveitis; y un estado inflamatorio que resulta de, por ejemplo, torcedura, esguince, dem al cartilago, cirugia ortopedica traumatolOgica, infecciOn u otros procesos patologicos.
En diversas realizaciones, un inhibidor de IL-1 puede ser cualquier polipaptido o molacula que pueda prevenir especificamente la activaciOn de receptores celulares para IL-1, lo que puede resultar de cualquiera de varios
mecanismos. Los mecanismos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, regulaciOn por disminucion de la produccion de IL-1, union a IL-1 libre, interferencia con la union de IL-1 a su receptor; interferencia con la formaciOn del complejo de receptor de IL-1 (es decir, asociacion del receptor de IL-1 con la proteina auxiliar del receptor de IL-1) e interferencia con la modulacion de la serializaciOn de IL-1 tras la union a su receptor.
Determinados inhibidores de interleucina-1 incluyen, pero no se limitan a, antagonistas del receptor de IL-1, incluyendo KineretTM y anakinra, IL-1ra, variantes de IL-1ra y derivados de IL-1ra, que se denominan conjuntamente "proteinas IL-1ra;" anticuerpos monoclonales anti-receptor de IL-1 (\tease por ejemplo, el documento EP 623674); proteinas de union a IL-1, incluyendo receptores de IL-1 solubles (vaanse por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.492.888, patente estadounidense n.° 5.488.032 y patente estadounidense n.° 5.464.937, patente estadounidense n.° 5.319.071 y patente estadounidense n.° 5.180.812); anticuerpos monoclonales anti-IL-1 (vaanse por ejemplo, los documentos WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, la patente estadounidense n.° 4.935.343, los documentos EP 364778, EP 267611 y EP 220063); proteinas auxiliares del receptor de IL-1 y anticuerpos frente a las mismas (vaanse por ejemplo, los documentos WO 96/23067 y WO 99/37773); inhibidores de la enzima convertidora de
interleucina-1 beta (ICE) o caspasa I (vdanse por ejemplo, los documentos WO 99/46248, WO 99/47545 y WO 99/47154), que pueden usarse para inhibir la producciOn y secreciOn de IL-1 beta; inhibidores de interleucina-1 beta proteasa; y otros compuestos y polipdptidos que bloquean la sintesis invivoo la liberaciOn extracelular de IL-1.
El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) es un polipeptido human° que actua como inhibidor natural de
interleucina-1 y es un miembro de la familia de IL-1, que incluye IL-1a e IL-113. Se describen determinados antagonistas del receptor a modo de ejemplo, incluyendo IL-1ra y variantes y derivados del mismo, asi como metodos de preparacion y uso de los mismos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.075.222; los documentos WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 97/28828; y WO 99/36541. En determinadas realizaciones, un antagonista del receptor de IL-1 puede estar glicosilado. En determinadas realizaciones, un antagonista del receptor de IL-1 puede estar no glicosilado.
En determinadas realizaciones, composiciones para tratar la perdida Osea asociada con una enfermedad mediada por TNFa comprenden una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y al menos un inhibidor de TNFa. En determinadas realizaciones, una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es
para la administraciOn antes de, simultdneamente con y/o posteriormente a al menos un inhibidor de TNFa. En determinadas realizaciones, una composici6n puede comprender una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, al menos un inhibidor de TNFa y al menos una molecula adicional descrita en el presente documento.
Determinadas enfermedades mediadas por TNF agudas y crOnicas incluyen, pero no se limitan a: caquexia y
anorexia; cancer, incluyendo, pero sin limitarse a, leucemia; sindrome de fatiga cr6nica; indicaciones y/o estados coronarios, incluyendo, pero sin limitarse a, insuficiencia cardiaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunciOn del miocardio (incluyendo pero sin limitarse a, tal estado relacionado con septicemia) e injerto de derivaciOn de arterias coronarias; depresidn; diabetes, incluyendo, pero sin limitarse a, diabetes tipo 1 de aparicion juvenil, diabetes mellitus y resistencia a la insulina (incluyendo, pero sin limitarse a, resistencia a la insulina
asociada con obesidad); endometriosis, endometritis y estados relacionados; fibromialgia y analgesia; rechazo de injerto contra huesped; hiperalgesia; enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de Crohn y diarrea asociada con Clostridium difficile; isquemia, incluyendo, pero sin limitarse a, isquemia cerebral, incluyendo, pero sin limitarse a, lesiOn cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia y/o accidente cerebrovascular; enfermedad pulmonar, incluyendo, pero sin limitarse a, sindrome de
dificultad respiratoria del adulto, asma y fibrosis pulmonar; esclerosis multiple; enfermedades neuroinflamatorias; estados y enfermedades oculares, incluyendo, pero sin limitarse a, trasplante de cornea, degeneracion ocular y uveitis; dolor, incluyendo, pero sin limitarse a, dolor relacionado con cancer; pancreatitis; enfermedades periodontales; pitiriasis rubra pilaris (PRP); prostatitis, incluyendo prostatitis bacteriana y no bacteriana, y estados relacionados; psoriasis y estados relacionados; fibrosis pulmonar; lesion por reperfusiOn; enfermedades reumaticas, incluyendo, pero sin limitarse a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil (incluyendo, pero sin limitarse a, artritis reumatoide juvenil), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, sindrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoridsica, artritis enteropthica, polimiositis, dermatomiositis, esclerodermia, esclerosis sistemica, vasculitis (por ejemplo, enfermedad de Kawasaki), vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos ("septicemica"), sindrome de Sjogren, fiebre reumatica, policondritis y polimialgia reumatica y arteritis de celulas gigantes); choque septicemico; efectos secundarios de la radioterapia; lupus eritematoso sistomico (LES); enfermedad de la articulaciOn temporomandibular; tiroiditis; y trasplante de tejido y/o un estado inflamatorio, por ejemplo, que resulta de torcedura, esguince, daft al cartilago, traumatismo, cirugia ortopedica, infecci6n (por ejemplo, VIH, Clostridiumdifificile y especies relacionadas) u otros procesos patolOgicos.
Determinadas actividades a modo de ejemplo de inhibidores de TNF incluyen, pero no se limitan a, regulaciOn por
disminuci6n o inhibici6n de la producciOn de TNF, uniOn a TNF libre, interferencia con la union de TNF a su receptor e interferencia con la modulaciOn de la sefializaciOn de TNF tras la uni6n a su receptor. El termino "inhibidor de TNF" incluye, pero no se limita a, receptores de TNF solubilizados, incluyendo receptor de factor de necrosis tumoral soluble tipo I (sTNF-RI; tambien denominado el receptor p55), receptor de factor de necrosis tumoral soluble tipo II (tambion denominado el receptor p75), EnbrelTM, etanercept; anticuerpos frente a TNF, incluyendo Remicaderm,
infliximab, HumiraTM, adalimumab (vdanse por ejemplo, las patentes estadounidenses n.°s 6.090.382 y 6.258.562); anticuerpos frente a receptor de TNF; sTNF-RI (vdase por ejemplo, el documento WO 98/24463), AvakineTM; inhibidores de la enzima convertidora de TNF-a (TACE); y otras moleculas que afectan a la actividad de TNF.
Los documentos EP 393 438 y EP 422 339 describen las secuencias de aminoacidos y acid° nucleico de un receptor de TNF soluble tipo I (tambien conocido como sTNFR-I o inhibidor de TNF de 30 kDa) y un receptor de TNF soluble tipo II (tambion conocido como sTNFR-II o inhibidor de TNF de 40 kDa), que se denominan conjuntamente "sTNFR". Los documentos EP 393 438 y EP 422 339 tambien describen formas modificadas de sTNFR-I y sTNFR-II, incluyendo, pero sin limitarse a fragmentos, derivados funcionales y variantes. Ademds, los documentos EP 393 438 y EP 422 339 describen metodos para aislar genes que codifican para los inhibidores, clonando los genes en vectores adecuados, transformando o transfectando los genes en determinados tipos de cdlulas y expresando los
genes para producir los inhibidores.
La solicitud PCT publicada n.° WO 98/01555 describe formas truncadas de sTNFR-I y sTNFR-II. Determinados
sTNFR-I truncados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-1 2.3D/d18, sTNFR-I 2.3D/d15, o bien metionilados o bien no metionilados, y variantes y derivados de los mismos.
En determinadas realizaciones, composiciones para tratar la perdida 6sea asociada con enfermedades inflamatorias
y/o autoinmunitarias comprenden una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y al menos un inhibidor de serina proteasa. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP es para la administraciOn antes de, simultdneamente con y/o posteriormente a al menos un inhibidor de serina proteasa. En determinadas realizaciones, una composicion comprende una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, al menos un inhibidor de serina proteasa y al menos una molecula adicional descrita
enel presente documento.
Un inhibidor de serina proteasa a modo de ejemplo es un inhibidor de proteasa leucocitaria secretora (SLPI) y fragmentos y andlogos del mismo. Los inhibidores de serina proteasa a modo de ejemplo tambion incluyen, pero no se limitan a, anti-leucoproteasa (ALP), inhibidor de proteasa de la mucosa (MP1), inhibidor de plasma seminal humano-I (HUSI-I), inhibidor del moco bronquial (BMI) e inhibidor del moo° cervical (CUSI). En determinadas
realizaciones, un inhibidor de serina proteasa tambien puede ser un modulador de LPS. Vease, por ejemplo, Jin et al. (1997), Cell 88(3): 417-26. En determinadas realizaciones, estas moleculas son muy adecuadas para su uso en condiciones quo conducen a perdida 6sea porque se dirigen preferentemente al cartilago.
Se describen determinados inhibidores de serina proteasa a modo de ejemplo, par ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.760.130; la patente estadounidense n.° 5.900.400; y la patente estadounidense n.° 5.633.227. Las moleculas dadas a conocer on las referencias anteriores asi coma cualquier variante u andlogo de las mismas se denominan colectivamente "inhibidores de serina proteasa".
En determinadas realizaciones, una composiciOn para tratar la perdida 6sea comprende una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y al menos un inhibidor de IL-18. En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para la administraciOn antes de, simultdneamente
con y/o posteriormente a la administraciOn de al menos un inhibidor de IL-18. En determinadas realizaciones, una composiciOn comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, al menos un inhibidor de IL-lay al menos una moldcula adicional descrita en el presente documento.
Determinados estados a modo de ejemplo que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, inflamacion,
enfermedades autoinmunitarias, enfermedades mediadas par IL-1 y enfermedades mediadas par TNF.
Determinados estados a modo de ejemplo quo pueden tratarse con una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y al menos un inhibidor de IL-18 incluyen, pero no se limitan a, artritis, incluyendo artritis reumatoide; lupus eritematoso sistemico (LES); enfermedad de injerto contra huesped (GvHD); hepatitis; septicemia; y la perdida de hueso y cartilago quo acomparia a estas enfermedades.
Determinados inhibidores de IL-18 a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos quo se unen a
IL-18; anticuerpos quo se unen a IL-18R; anticuerpos quo se unen a IL-18RAcP; IL-18bp; fragmentos de IL-18R (por ejemplo, un dominio extracelular solubilizado del receptor de IL-18); peptidos quo se unen a IL-18 y reducen o impiden su interacciOn con IL-18R; peptidos quo se unen a IL-18R y reducen o impiden su interacciOn con IL-18 o con IL-18RAcP; peptidos que se unen a IL-18RAcP y reducen o impiden su interacciOn con IL-18R; y moldculas pequerias que reducen o impiden la producciOn de IL-18 o la interaccion entre cualquiera de IL-18, IL-18R e
IL-18RAcP.
En determinadas realizaciones, puede usarse una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP con al menos un agente terapeutico para tratar la perdida 6sea asociada con inflamaciOn. En determinadas realizaciones, puede usarse una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP con al menos un agente terapeutico para tratar la perdida Osea asociada con un trastorno inmunitario. Determinados agentes terapeuticos a modo de ejemplo para la inflamaciOn y trastomos inmunitarios incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, incluyendo, pero sin limitarse a, prednisolona; farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluyendo, pero sin limitarse a, inhibidores de ciclooxigenasa tipo 1 (COX-1) y ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2); farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (FARME), incluyendo, pero sin limitarse a, metotrexato, hidroxicloroquina, cloroquina, ciclosporina, compuestos de oro (incluyendo auranofina, aurotiomalato y aurotioglucosa) y leflunomida; inhibidores de fosfodiesterasa tipo IV, incluyendo, pero sin limitarse a, rolipram y pentoxifilina; tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); acid° micofendico; inhibidores de 5-lipooxigenasa, incluyendo, pero sin limitarse a, Zileuton; moduladores de interleucina-6 (IL-6); moduladores de molecula pequeria de proteina cinasa activada par mit6geno de 38 kDa (p38-MAPK); moduladores de molocula pequeria de moleculas intracelulares implicadas en rutas de inflamaci6n, en las quo tales moleculas intracelulares incluyen, pero no se limitan a, jnk, IKK, NF-icB, ZAP70 y lck. Se describen determinados agentes terapeuticos a modo de ejemplo para la inflamaciOn, par ejemplo, on C.A. Dinarello y L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians tercera edici6n (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA. Determinados agentes terapeuticos a modo de ejemplo para la inflamaciOn y enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, moduladores de interfer6n gamma (IFN-y); moduladores de OX40/0X4OL (incluyendo formas solubles de 0X40); moduladores de ligando 4-1 BB/4-1 BB (incluyendo formas solubles de 4-1 BB); y moduladores de rutas
coestimuladoras de celulas B-celulas T, incluyendo, pero sin limitarse a, moduladores de las parejas de receptorligando CD28/B7, CD40/CD4OL, ICOS/B7RP1 y AGP-3/TACl/BAFFR (AGP-3 se une a receptores tanto TACI como BAFFR). Determinados moduladores a modo de ejemplo de rutas coestimuladoras de celulas B-celulas T incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de CD28, B7.1 y B7.2 (incluyendo formas solubles de B7.1 o B7.2 y formas solubles de CTLA4, ambas de las cuales pueden fusionarse a un peptido o polipeptido heterOlogo que reduce o previene la degradaciOn y/o aumenta la semivida, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad o aumenta la actividad biologica de un polipeptido terapeutico aumentando la solubilidad o semivida en circulaciOn); inhibidores de CD40 y CD4OL (incluyendo formas solubles de CD40 que pueden fusionarse a un peptido o polipoptido heterologo); inhibidores de ICOS y B7RP1 (incluyendo formas solubles de ICOS que pueden fusionarse a un peptido o
polipeptido heterOlogo) e inhibidores de AGP-3, TACI y BAFFR (incluyendo formas solubles de TACI y BAFFR). Se describen ICOS, B7RP1 e inhibidores de los mismos, por ejemplo, en el documento W000/46240. Se describen AGP-3, TACI y BAFFR e inhibidores de los mismos, por ejemplo, en los documentos W000/47740, W001/85872, W002/15273 W098/39361, y von Bulow y Bram (1997) Science 278:138-140.
En determinadas realizaciones, puede usarse una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP
para tratar la perdida 6sea asociada con cancer. En determinadas realizaciones, puede usarse una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP para tratar la perdida ()sea asociada con cancer en el que tumores malignos y /o metastasicos han promovido la diseminaciOn del cancer at hueso. Determinados canceres a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, canceres de mama, prostate, tiroides, riñón, pulmOn, es6fago, rectales, de vejiga, cuello uterino, ovario e higado, asi como cancer del tracto gastrointestinal. En determinadas
realizaciones, puede usarse una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP para tratar la perdida 6sea asociada con, por ejemplo, determinados tumores malignos hematologicos. Determinados tumores malignos hematolOgicos incluyen, pero no se limitan a, mieloma multiple y linfoma, incluyendo enfermedad de Hodgkin. En determinadas realizaciones, puede usarse una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP para tratar la perdida osea asociada con terapia hormonal ablative. Por ejemplo, tal terapia puede emplearse en el tratamiento de cancer sensible a hormonas, tal como cancer de mama y prOstata.
En determinadas realizaciones, una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para la administracion sola. En determinadas realizaciones, una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL- PTH/PTHrP es para la administracion con al menos otro agente terapeutico, incluyendo, pero sin limitarse a, at menos otro agente de terapia contra el cancer. Determinados agentes de terapia contra el cancer a modo de
ejemplo incluyen, pero no se limitan a, radioterapia y quimioterapia. Determinada quimioterapia a modo de ejemplo puede implicar tratamiento con uno o mas de los siguientes: antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorubicina, 5fluorouracilo y otros farmacos conocidos en la tecnica. En determinadas realizaciones, un agente de terapia contra el cancer es un antagonista de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH). En determinadas realizaciones, un antagonista de LHRH es un antagonista peptidico.
En determinadas realizaciones, el agente de terapia contra el cancer es un inhibidor de uno o mas de un receptor de factor de crecimiento epidermic° (EGFR), HER2, vegF, un receptor de vegF, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), c-Met, angiopoyetina, Tie2, un receptor de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR), un receptor de factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR), glicoproterna similar a mucina, CDC20 y CDC33. Un inhibidor puede ser un polipeptido, anticuerpo, peptido, molecule quimerica de peptido-Fc,
hidrato de carbono, lIpido o molecule pequetia.
En determinadas realizaciones, el agente de terapia contra el cancer es un anticuerpo. Determinados anticuerpos terapeuticos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de ratOn, quimericos de raton-ser humano, injertados con CDR, humanizados y completamente humanos, y anticuerpos sinteticos, incluyendo los seleccionados examinando bibliotecas de anticuerpos. Determinados anticuerpos a modo de ejemplo incluyen, pero nose limitan a, los que se unen a Her2, CDC20, CDC33, glicoproteinas similares a mucina, receptores de factor de crecimiento epidermic° (EGFR), vegF, receptores de vegF, factores de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factores de dispersion (SF), receptores de factor de crecimiento similar a la insulina (IFGR) y opcionalmente inducen un efecto cistostatico y/o citotOxico sobre celulas tumorales. Determinados anticuerpos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, HERCEPTINTm, trastuzumab, RITUXAN TM rituximab, AVASTINTm, bevacizumab, ZEVALINTM,
ibritumomab tiuxetan, LYMPHOCIDETm, epratuzumab ERBITUXTm, cetuximab, IMC-C225, BEXXAR TM tositumomab, yodo 131 tositumomab, panitumumab y Campath.
En determinadas realizaciones, agentes de terapia contra el cancer son polipeptidos que inducen selectivamente apoptosis en celulas tumorales, incluyendo, pero sin limitarse a, el polipeptido relacionado con TNF TRAIL y agonistas de un receptor de TRAIL. En determinadas realizaciones, una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para la administraciOn al menos uno de antes de, simultaneamente con y posteriormente al tratamiento con un agente de terapia contra el cancer. En determinadas realizaciones, una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para la administraci6n de manera profilactica para prevenir o mitigar la aparici6n de perdida Osea por cancer metastasico. En determinadas realizaciones, una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para la administraciOn para el tratamiento de un estado existente de
perdida Osea debida a metastasis.
En determinadas realizaciones, puede usarse una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP
para prevenir y/o tratar la perdida 6sea asociada con mieloma multiple y/o para prevenir y/o tratar la propia enfermedad. El mieloma multiple es un tumor derivado de celulas B que puede dar como resultado morbilidad y/o mortalidad significativas. En determinados casos, una manifestaciOn clinica del mieloma mUltiple es perdida osea focal, que puede deberse a un aumento de la activaciOn de osteoclastos en regiones localizadas. Muchos pacientes con mieloma presentan lesiones Oseas visibles mediante andlisis radiolOgico y padecen dolor esqueletico. En determinados casos, los pacientes con mieloma son susceptibles a fracturas patolOgicas de huesos implicados, lo que puede producirse o bien espontaneamente o bien debido a lesion. En determinados casos, las lesiones esqueleticas que se producen durante el mieloma no solo conducen a fracturas oseas, sino tambien a deformidad y ocasionalmente compresiOn de nervios, particularmente en la columna vertebral. En algunos pacientes, se produce
un aumento patologico en el calcio serico (hipercalcemia), y puede provocar problemas significativos durante el tratamiento de la enfermedad. En determinadas realizaciones, una molecula quirndrica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP es para la administraciOn a pacientes para reducir o bloquear la resorci6n Osea y liberaciOn de calcio, lo que puede reducir reduce el riesgo de fracturas y deformidad de la columna vertebral.
En determinados casos, las celulas de mieloma no participan directamente en la destrucciOn 6sea, sino que en su
lugar producen seliales extracelulares que conducan a la diferenciaciOn y activaciOn de osteoclastos. En determinados casos, los osteoclastos producen altos niveles de la citocina IL-6, particularmente cuando se activan. IL-6 es un factor de crecimiento de celulas B, y contribuye al crecimiento de celulas de mieloma tanto murinas como humanas in vitro. En determinados casos, las celulas de mieloma pueden producir tambien o bien directa o bien indirectamente RANKL, lo que puede dar como resultado lisis osea local rodeando las celulas de mieloma
incrustadas en espacios de medula Osea. En determinados casos, los osteoclastos normales adyacentes a la celula de mieloma producen a su vez IL-6, lo que puede conducir a expansion local de las celulas tumorales. En determinados casos, las celulas de mieloma se expanden de un modo clonal y pueden ocupar espacios Oseos que se crean por una resorciOn 6sea inapropiada.
Se ha observado que la administraciOn de OPG en roedores induce una muerte rapida de la poblacion de
osteoclastos. Vease, por ejemplo, Lacey et al. (2000) Am. J. Pathol. 157:435-448. En determinados casos, una reducci6n en el numero de osteoclastos puede contrarrestar el efecto del aumento de la produccion de IL-6 por esas celulas y por tanto puede afectar al crecimiento y la supervivencia de cOlulas de mieloma dentro del hueso trabecular. Por tanto, en determinadas realizaciones, el uso de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP para tratar a un paciente con mieloma puede no sOlo reducir la resorcion 6sea, sino quo tambien puede afectar a la expansiOn y supervivencia del propio tumor.
Las celulas B expresan el receptor para RANKL, RANK. Las celulas de mieloma tambien expresan RANK, y ademds pueden producir RANKL. En determinados casos, la expresi6n de tanto RANKL como RANK on la misma poblaciOn celular puede crear un estImulo autocrino quo afecta a fa supervivencia de la celula de mieloma. Por tanto, en determinadas realizaciones, el uso de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP puede
reducir la supervivencia de celulas tumorales, disminuyendo o eliminando de ese modo la carga tumoral observada en pacientes con mieloma.
Determinadas composiciones farmaceuticas a modo de eiemplo que comprenden una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP.
En determinadas realizaciones, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP y un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
En determinadas realizaciones, se proporcionan composiciones farmaceuticas quo comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP; una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente terapeutico adicional; y un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable. Los agentes terapeuticos adicionales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, factores morfogenicos 6seos, incluyendo pero sin limitarse a BMP-1 a BMP-12; factor de crecimiento transformante b(TGF-13) y miembros de la familia de TGF-p; inhibidores de interleucina-1 (IL-1), incluyendo pero sin limitarse a IL-1ra y derivados del mismo, KineretTm y anakinra; inhibidores de TNFa, Incluyendo pero sin limitarse a un receptor de TNFa soluble, EnbreITM, etanercept, anticuerpos anti-TNFa, RemicadeTM, infliximab, HumiraTM y adalimumab; hormona paratiroidea y andlogos de la misma, proteina relacionada con la hormona paratiroidea y andlogos de la misma; prostaglandinas de la serie E; bisfosfonatos (incluyendo alendronato y otros); minerales potenciadores del hueso, incluyendo pero sin limitarse a fluoruro y calcio; moduladores de esclerostina; farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluyendo pero sin limitarse a inhibidores de COX-2 tales como CelebrexTM, celecoxib, VioxxTM y rofecoxib; inmunosupresores, incluyendo pero sin limitarse a metotrexato o leflunomida; inhibidores de serina proteasa, incluyendo pero sin limitarse a, inhibidor de proteasa leucocitaria secretora (SLPI); inhibidores de IL-6 (por ejemplo, anticuerpos frente a IL-6), inhibidores de IL-8 (por ejemplo, anticuerpos frente a IL-8); inhibidores de IL-18 (por ejemplo, proteina de uniOn a IL-18 o anticuerpos frente a IL-18); moduladores de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE); factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo pero sin limitarse a FGF-1 a FGF-10 y moduladores de FGF; antagonistas de PAF; un factor decrecimiento de queratinocitos (KGF), moleculas relacionadas con KGF o moduladores de KGF; moduladores de metaloproteinasa de la matriz (MMP); moduladores de &id° nitrico sintasa (NOS), incluyendo moduladores de NOS
inducible; moduladores del receptor de glucocorticoides; moduladores del receptor de glutamato; moduladores de los niveles de lipopolisacarido (LPS); y noradrenalina y moduladores y mimeticos de la misma.
Determinadas composiciones farmaceuticas a modo de ejemplo pueden ser para la administraciOn mediante inyecciOn, administraciOn oral, administraciOn pulmonar, administraciOn nasal, administraciOn transdermica y/u otras formas de administraciOn. En determinadas realizaciones, los materiales de formulaciOn aceptables no son toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.
En determinadas realizaciones, la composicion farmaceutica puede contener uno o mas materiales de formulaciOn para modificar, mantener y/o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disoluciOn o liberaciOn, la velocidad de aclaramiento de un compuesto y/o sus derivados, la adsorcion y/o la penetraciOn de la composici6n. Determinados materiales de formulaciOn adecuados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos (incluyendo glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina); antimicrobianos; antioxidantes (incluyendo acid° ascorbico, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio e hidrogenosulfito de sodio); tampones (incluyendo borato, bicarbonato, acetato, Tris-HCI, citratos, fosfatos y otros acidos organicos); agentes de carga (incluyendo manitol, lactosa y glicina); agentes quelantes (incluyendo acido etilendiaminatetraacetico (EDTA)); agentes complejantes (incluyendo cafeina, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina e hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacaridos; disacaridos; y otros hidratos de carbono (incluyendo glucosa, manosa y dextrinas); polipeptidos (incluyendo albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polimeros hidrOfilos (incluyendo polivinilpirrolidona); polipeptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (incluyendo sodio); conservantes (incluyendo cloruro de benzalconio, acido benzoico, alcohol bencilico, acid° salicilico, timerosal, alcohol fenetilico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, acido sorbico y peroxido de hidrogeno); disolventes (incluyendo glicerina, propilenglicol y polietilenglicol); alcoholes de azucar (incluyendo manitol y sorbitol); agentes de suspensi6n; aditivos, incluyendo tensioactivos, agentes humectantes, detergentes, y agentes de solubilizaciOn (incluyendo Pluronic, PEG, esteres de sorbitano, Tween 20, Tween 80, polisorbatos tales como
polisorbato 20, polisorbato 80, Triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (incluyendo sacarosa y sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (incluyendo haluros de metales alcalinos, cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehiculos de administraciOn; diluyentes de diversos contenidos en tampon, pH y fuerza iOnica; compuestos polimericos (incluyendo poli(acido lactico) y poli(acido glicOlico)); excipientes y/o adyuvantes farmaceuticos. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18° edicion, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990).
En determinadas realizaciones, se proporcionan sales fisiolOgicamente aceptables de determinadas moleculas. Las sales fisiologicamente aceptables incluyen cualquier sal que se sepa o se descubra posteriormente que es apropiada para una o mas aplicaciones farmaceuticas. Determinadas sales fisiolOgicamente aceptables a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, acetato, trifluoroacetato, hidracido halogenado (incluyendo clorhidrato y
bromhidrato), sulfato, citrato, tartrato, glicolato y oxilato.
En diversas realizaciones, las composiciones pueden prepararse en forma liquida, o pueden estar en forma secada (incluyendo un polvo o comprimido). En determinadas realizaciones, las composiciones pueden estar en una formulaciOn transdermica. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden disenarse para liberacion sostenida.
En determinadas realizaciones, los agentes terapeuticos pueden diluirse usando un material inerte. -iambi& puede usarse un material inerte, en determinadas realizaciones, para aumentar el volumen de una composiciOn farmaceutica. Tales materiales inertes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, hidratos de carbono (incluyendo, por ejemplo, manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidon). Tales materiales inertes a modo de ejemplo tambien incluyen, pero no se limitan a, determinadas sales inorganicas
(incluyendo, por ejemplo, trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio). Tales materiales inertes a modo de ejemplo tambien incluyen, pero no se limitan a, determinados diluyentes disponibles comercialmente, incluyendo Fast-Flo, Emdex, STARx 1500, Emcompress y Avicell.
En determinadas realizaciones, se une una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP a un vehiculo que extiende la semivida conocido en la tecnica. En determinadas realizaciones, se une otro agente
terapeutico a un vehiculo que extiende la semivida conocido en la tecnica. Tales vehiculos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el dominio de Fc, polietilenglicol y dextrano. Tales vehiculos se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT publicada n.° WO 99/25044.
En determinadas realizaciones, un experto en la tecnica determinara una composici6n farmaceutica Optima dependiendo de, por ejemplo, la via de administraciOn prevista, el formato de administraciOn y/o la dosificaci6n
deseada. \tease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente. En determinadas realizaciones, tales composiciones pueden incluir en el estado fisico, la estabilidad, la velocidad de liberaciOn in vivo y/o la velocidad de aclaramiento in vivode una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP.
En determinadas realizaciones, el portador o vehiculo primario en una composiciOn farmaceutica puede ser de naturaleza o bien acuosa o bien no acuosa. Determinados vehiculos o portadores a modo de ejemplo incluyen, pero
no se limitan a, agua para inyecciOn, solucion sauna fisiolOgica o liquid° cefalorraquideo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administraci6n parenteral. Determinados vehiculos o portadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, soluciOn sauna tamponada neutra y solucion sauna mezclada con albumina serica. En deterrninadas realizaciones, las composiciones farmaceuticas comprenden tampon Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, que puede incluir ademas sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En determinadas realizaciones, las composiciones farmaceuticas comprenden tampon acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir ademas sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En determinadas realizaciones, puede prepararse una composiciOn que comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin at menos un agente terapeutico adicional, para su
almacenamiento mezclando la composiciOn seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulaciOn opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una disolucion acuosa. En determinadas realizaciones, una composiciOn que comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados, incluyendo sacarosa.
En determinadas realizaciones, puede seleccionarse una composiciOn farmaceutica para administraciOn parenteral. En determinadas realizaciones, la composiciOn puede seleccionarse para inhalaciOn o para administraciOn a traves del tracto digestivo, tat como por via oral. La preparaci6n de determinadas composiciones farmaceuticamente aceptables de este tipo esta dentro de la experiencia de la tecnica.
En determinadas realizaciones, los componentes de la formulaciOn estan presentes en concentraciones que son
aceptables para el sitio de administraciOn. En determinadas realizaciones, se usan tampones para mantener la composici6n a pH fisiologico o a un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un interval° de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8, incluyendo todos los puntos entre los extremos.
En determinadas realizaciones, cuando se contempla la administraciOn parenteral, una composici6n terapeutica puede estar en forma de una disoluciOn acuosa libre de piragenos, aceptable por via parenteral que comprende la molacula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP deseada, con o sin agentes terapeuticos adicionales, en un vehiculo farmaceuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, un vehiculo para inyecciOn parenteral es agua destilada esteril en la que la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapautico adicional, se formula como una disolucion esteril, isotonica, apropiadamente conservada. En determinadas realizaciones, la preparacion puede implicar la formulaciOn de la molecula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, particulas bioerosionables, compuestos polimericos (tales como poli(acido lactico) o poli(acido glicOlico)), perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberaciOn controlada o sostenida del producto que entonces puede administrarse mediante una inyecci6n de dep6sito. En determinadas realizaciones, puede usarse acid° hialuronico, y puede tener el efecto de promover una duraciOn sostenida en la circulaciOn. En determinadas realizaciones, pueden usarse dispositivos de administraciOn de farmacos implantables
para introducir la molecula deseada.
En determinadas realizaciones, puede formularse una composiciOn farmaceutica para inhalaciOn. En determinadas realizaciones, puede formularse una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, como un polvo seco para inhalaciOn. En deternninadas realizaciones, puede formularse una disolucion de inhalacion que comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKLPTH/PTHrP, con o sin at menos un agente terapeutico adicional, con un propelente para su administracion en aerosol. En determinadas realizaciones, las disoluciones pueden nebulizarse. Se describen determinados ejemplos de administraciOn pulmonar de diversos polipaptidos, por ejemplo, en Adjei at al. , Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (acetato de leuprolida); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (supl. 5): s.143-146 (endotelina-1); Hubbard etaL (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (al
antitripsina); Smith at aL (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (al -proteinasa); Oswein et aL (marzo de 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (hormona de crecimiento humana recombinante); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferOn-y y factor de necrosis tumoral a); y Platz etal. , patente estadounidense n.° 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos).
En determinadas realizaciones, se usa un dispositivo mecanico para administraciOn pulmonar de una composiciOn
farmaceutica. Determinados dispositivos mecanicos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, determinados de los cuales los conocen los expertos en la tecnica. Determinados dispositivos mecanicos disponibles comercialmente a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolin, fabricado por
Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts. En determinadas realizaciones, se usa un dispositivo mecanico con una formulacion de composiciOn farmaceutica particularmente adecuada para su dispensacion con ese dispositivo. En determinadas realizaciones, tales formulaciones incluyen un material propelente apropiado para su uso en ese dispositivo.
En determinadas realizaciones, el agente o agentes terapeuticos se preparan en una forma particulada para la administraciOn mas eficaz al pulmOn distal. En determinadas realizaciones, una forma particulada de este tipo tiene un tamaiio de particula promedio de menos de 10 gm. En determinadas realizaciones, una forma particulada de este
tipo tiene un tamatio de particula promedio de aproximadamente 0,5 a 5 gm, incluyendo todos los puntos entre los extremos.
En determinadas realizaciones, una composici6n farmaceutica para administraciOn pulmonar comprende un portador farmaceuticamente aceptable. Determinados portadores de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hidratos de
carbono, incluyendo trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Determinados portadores a modo de ejemplo que pueden incluirse en una composiciOn farmacoutica para administracion pulmonar incluyen, pero no se limitan a, DPPC, DOPE, DSPC y DOPC; tensioactivos naturales y sinteticos; PEG; dextranos, incluyendo ciclodextrano; sales biliares y otros potenciadores relacionados; celulosa y derivados de celulosa; aminoacidos; liposomas; microcdpsulas y microesferas; y complejos de inclusion.
En determinadas realizaciones, una formulaciOn para su uso con un nebulizador (o bien de chorro o bien ultrasOnico) comprende el agente o agentes terapeuticos disueltos en agua. En determinadas realizaciones, el agente o agentes terapeuticos se disuelven a una concentraciOn de aproximadamente 0,1 a 25 mg/ml, incluyendo todos los puntos entre los extremos. Determinadas formulaciones de este tipo incluyen, pero no se limitan a, uno o mas tampones y/o uno o mds azucares sencillos. En determinadas realizaciones, la adiciOn de tampones y/o azucares sencillos
potencia la estabilizaciOn del polipeptido y la regulaciOn de la presiOn osmOtica. En determinadas realizaciones, una formulaciOn de nebulizador contiene uno o mds tensioactivos. En determinadas realizaciones, un tensioactivo puede reducir o impedir la agregaciOn inducida por la superficie del agente o agentes terapeuticos provocada por la atomizaciOn de la disoluciOn para formar el aerosol.
En determinadas realizaciones, una formulaciOn para su uso con un dispositivo de inhalador de dosis medida
comprende un polvo finamente dividido que contiene el agente o agentes terapeuticos suspendidos en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. En determinadas realizaciones, el propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin. Determinados materiales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, clorofluorocarbonos, hidroclorofluorocarbonos, hidrofluorocarbonos e hidrocarburos, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, y combinaciones de los mismos.
Determinados tensioactivos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, trioleato de sorbitano, acido oleico y lecitina de soja. En determinadas realizaciones, una formulaciOn para su uso con un dispositivo de inhalador comprenderd uno o mds agentes de carga. Los agentes de carga incluyen, pero no se limitan a, lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa y xilitol. Determinados agentes de carga de este tipo, en determinadas realizaciones, pueden comprender del 50 al 90% en peso (incluyendo todos los puntos entre los extremos) de la formulacion y, en
determinadas realizaciones, pueden facilitar la dispersion del polvo desde el dispositivo.
En determinadas realizaciones, puede formularse una composicion farmaceutica para administraciOn nasal. En determinadas realizaciones, tales formulaciones incluyen dextrano y/o ciclodextrano. En determinadas realizaciones, tambien se contempla la administracion mediante transporte a twos de otras membranas mucosas.
En determinadas realizaciones, se contempla que las formulaciones puedan administrase por via oral. En
determinadas realizaciones, una molOcula quimdrica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, que se administra de esta forma puede formularse con o sin portadores habitualmente usados en la composiciOn de formas farmaceuticas solidas, incluyendo comprimidos, cdpsulas, pildoras, trociscos y pastillas para chupar, cachets o grageas. En determinadas realizaciones, puede usarse encapsulaciOn liposomal o proteinoide para formular las composiciones (como, por ejemplo, microesferas
proteinoides, descritas, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.925.673). En determinadas realizaciones, puede diseriarse una cdpsula para liberar la parte activa de la formulaciOn en el punto en el tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y/o se minimiza la degradaci6n presistemica. En determinadas realizaciones, puede incluirse al menos un agente adicional para facilitar la absorciOn de una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP. En determinadas realizaciones, puede incluirse al menos un agente adicional para
facilitar la absorciOn de uno o mds agentes terapeuticos adicionales. En determinadas realizaciones, pueden usarse componentes adicionales. Determinados componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusiOn, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspension, agentes de disgregaci6n de comprimidos y aglutinantes. En determinadas realizaciones, puede usarse encapsulaciOn liposomal. En determinadas realizaciones, los liposomas pueden derivatizarse con diversos polimeros (vease por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.013.556). Puede encontrarse una descripciOn de determinadas formas famaceuticas sOlidas a modo de ejemplo para la administraciOn terapeutica, por ejemplo, en el capitulo 10 de Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes.
En determinadas realizaciones, una composiciOn farmaceutica puede comprender una cantidad eficaz de una moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, en una nnezcla con excipientes no tOxicos que son adecuados para la fabricaci6n de comprimidos. En determinadas realizaciones, disolviendo los comprimidos en agua esteril, u otro vehiculo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Determinados excipientes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, incluyendo carbonato de calcio, carbonato y bicarbonato de sodio, lactosa y fosfato de calcio; y agentes de uniOn, incluyendo almidon, gelatina y goma ardbiga; y agentes lubricantes, incluyendo estearato de
magnesio, acid° estedrico, talco.
Determinadas composiciones farmaceuticas adicionales a modo de ejemplo resultardn evidentes para los expertos en la tecnica, incluyendo formulaciones que implican una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-peptido de PTH/PTHrP, con o sin at menos un agente terapeutico adicional, en formulaciones de administraci6n sostenida o controlada. Determinadas tecnicas a modo de ejemplo para formular vehiculos de administraciOn sostenida o controlada incluyen, pero no se limitan a, portadores de liposomas, microparticulas bioerosionables y perlas porosas, e inyecciones de depOsito. En la tecnica se conocen determinadas tecnicas para formular tales vehiculos de administraci6n sostenida o controlada. En determinadas realizaciones, puede incorporarse una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, en una matriz inerte que permite la liberaciOn mediante mecanismos de difusiOn y/o lixiviaciOn. En determinadas realizaciones, tambien pueden incorporarse matrices que se degradan lentamente en la formulacion, por ejemplo, alginatos y/o polisacdridos. Determinados recubrimientos entericos pueden tener un efecto de liberacion retardada. En determinadas realizaciones, preparaciones de liberaciOn sostenida pueden incluir matrices de polimero semipermeables. En determinadas realizaciones, tales matrices de polimero semipermeables permiten que entre agua y empuje el tarmac° a traves de una (mica abertura pequeria debido a efectos osmOticos. \lease, por ejemplo, el sistema terapeutico Oros (Alza Corp.). En determinadas realizaciones, tales matrices de polimero semipermeables estan en forma de articulos conformados, por ejemplo peliculas, o microcdpsulas. Determinadas matrices de liberacion sostenida a modo de ejemplo pueden incluir, pero no se limitan a, polidsteres, hidrogeles, polilactidas (documentos U.S. 3.773.919 y EP 058.481), copolimeros de acid° L-glutdmico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al. , Biopolimers, 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer etaL, J. Biomed. Mater. Res., 15:167
277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer etal. , citado anteriormente), y acids° poli-D(+3-hidroxibutirico (documento EP 133.988). En determinadas realizaciones, las composiciones de liberacion sostenida pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios mdtodos conocidos en la tecnica. \tease por ejemplo, Eppstein et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); documentos EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.
En determinadas realizaciones, puede modificarse quimicamente una molOcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP para hacer que la administraci6n oral sea eficaz. En determinadas realizaciones, pueden modificarse quimicamente uno o mds agentes terapeuticos adicionales para hacer que la administracion oral sea eficaz. En determinadas realizaciones, la modificaciOn quirnica implica la uniOn de un vehiculo at agente terapeutico que permite (a) la inhibici6n de la proteOlisis; y/o (b) la captaciOn en el torrente sanguine° a partir del estOmago o
intestino; y/o (c) un aumento en la estabilidad del agente; y/o (d) un aumento en el tiempo de circulaciOn del agente en el cuerpo. Determinados vehiculos de este tipo incluyen, pero no se limitan a, PEG, copolimeros de etilenglicol y propilenglicol, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-tioxocano, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinilico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Vease, por ejemplo, Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, pdgs. 367-83; y Newmark, etal. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9.
En determinadas realizaciones, puede usarse una sal de un aminodcido alifatico modificado, tat coma N-(842hidroxibenzoil]amino)caprilato de sodio (SNAC), como portador para potenciar la absorciOn de un agente terapdutico. Vease, par ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.792.451.
En determinadas realizaciones, los agentes terapeuticos pueden formularse coma materiales multiparticulados finos,
tales coma grdnulos o aglomerados. En determinadas realizaciones, tales grdnulos o aglomerados tienen un tamano de particula de aproximadamente 1 mm. En determinadas realizaciones, para la administracion de cdpsulas, pueden formularse agentes terapeuticos como un polvo, un tapOn ligeramente comprimido o un comprimido. En determinadas realizaciones, puede usarse compresion para crear una formulaciOn.
En determinadas realizaciones, una composici6n farmaceutica puede contener uno o mds agentes colorantes y/o
saborizantes. En determinadas realizaciones, la composiciOn farmaceutica puede tomar la forma de una bebida que contiene el agente o agentes terapeuticos. En determinadas realizaciones, el agente o agentes terapOuticos pueden formularse, par ejemplo, mediante encapsulaciOn en liposomas o microesferas, y luego incluirse en la bebida.
En determinadas realizaciones, pueden incluirse uno o mds disgregantes en una composicion farmaceutica. Determinados disgregantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, almidon, incluyendo disgregantes comerciales que se basan en almidOn, incluyendo Explotab. Determinados disgregantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, glicolato sOdico de almidOn, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, piel de naranja, carboximetilcelulosa acida, esponja natural, acid° alginico y su sal de sodio, y bentonita. Determinados disgregantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, resinas de intercambio cati6nico insolubles. Tambien pueden usarse gomas en polvo, incluyendo agar, goma karaya y/o
tragacanto como disgregantes y/o aglutinantes (comentados a continuacion) en determinadas realizaciones.
En determinadas realizaciones, pueden usarse uno o mds aglutinantes para mantener el agente o agentes terapeuticos juntos en, par ejemplo, una forma de comprimido. En determinadas realizaciones, los aglutinantes incluyen materiales de productos naturales, incluyendo, par ejemplo, goma ardbiga, tragacanto, almidon y/o gelatina. Determinados aglutinantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y
carboximetilcelulosa (CMC). En determinadas realizaciones, pueden usarse polivinilpirrolidona (PVP) y/o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en disoluciones alcohOlicas para granular el agente o agentes terapeuticos.
En determinadas realizaciones, puede incluirse un agente antifricci6n en una formulacion del agente o agentes terapeuticos para impedir que se peguen durante el proceso de formulacion. Determinados agentes antifricci6n a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, lubricantes, que incluyen, pero no se limitan a, acido estearico (incluyendo sus sales de magnesio y calcio), politetrafluoroetileno (PTFE), parafina liquida, aceites vegetales y
ceras. Determinados agentes antifricciOn a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, lubricantes solubles, incluyendo laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares y Carbowax 4000 y 6000.
En determinadas realizaciones, un deslizante puede mejorar las propiedades de flujo del agente o agentes terapeuticos y/o de la composiciOn farmaceutica durante la formulaciOn. Los deslizantes tambien pueden ayudar a la redisposiciOn durante la compresion en determinadas realizaciones. Determinados deslizantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, almid6n, talco, ace pirogenica y silicoaluminato hidratado.
En determinadas realizaciones, una composiciOn farmaceutica comprende uno o mas tensioactivos. En determinadas realizaciones, un tensioactivo puede actuar como agente humectante y ayudar a la disoluciOn de la composicion farmaceutica en un entomb acuoso. Determinados tensioactivos a modo de ejemplo incluyen, pero no selimitan a, detergentes aniOnicos, que incluyen laurilsulfato de sodio, dioctilsulfosuccinato de sodio y dioctilsulfonato de sodio; detergentes cationicos, que incluyen cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio; detergentes no ionicos, incluyendo lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, ester de acido graso de sacarosa,
metilcelulosa y carboximetilcelulosa.
En determinadas realizaciones, tambien se incluyen uno o mas aditivos en las composiciones para potenciar la recaptacion del compuesto. Determinados aditivos de este tipo incluyen, pero no se limitan a, acidos grasos, incluyendo acid° oleico, acid° linoleico y acid° linolenico.
En determinadas realizaciones, pueden incluirse uno o mas recubrimientos en la composiciOn farmaceutica. Determinados recubrimientos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, azucares, materiales no entericos,
incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxi-etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboxi-metilcelulosa de sodio, providona y los polietilenglicoles; y materiales entericos, incluyendo esteres de acido ftalico. En determinadas realizaciones, una mezcla de materiales puede proporcionar un recubrimiento de pelicula Optimo. En diversas realizaciones, el recubrimiento de pelicula puede llevarse a cabo en una recubridora de cubeta, en un lecho fluidizado y/o mediante recubrimiento por compresion.
En determinadas realizaciones, una composiciOn farmaceutica quo va a usarse para administraciOn in vivo es esteril. En determinadas realizaciones, esto puede lograrse mediante filtraciOn a traves de membranas de filtracion esteriles. En determinadas realizaciones, cuando la composiciOn este liofilizada, la esterilizaciOn usando este metodo puede realizarse o bien antes o bien tras la liofilizaciOn y reconstituciOn. En determinadas realizaciones, una composici6n para administraci6n parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolucion. En determinadas
realizaciones, se colocan composiciones parenterales generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolucion intravenosa quo tiene un tap& perforable mediante una aguja de inyecciOn hipodermica.
En determinadas realizaciones, una vez quo se ha formulado una composiciOn farmaceutica, puede almacenarse en viales esteriles como una disoluciOn, una suspension, un gel, una emulsion, un sOlido o como un polvo deshidratado
oliofilizado. En determinadas realizaciones, tales formulaciones pueden almacenarse o bien en una forma lista para usar o bien en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de su administracion.
En determinadas realizaciones, se proporcionan kits para producir una unidad de administracion de dosis Crnica. En determinadas realizaciones, los kits pueden contener cada uno tanto un primer envase quo tiene un polipeptido secado como un segundo envase quo tiene una formulaciOn acuosa. En determinadas realizaciones, se proporcionan kits quo contienen jeringuillas precargadas de milltiples camaras o de una (mica camara (por ejemplo, jeringuillas de liquids° y jeringuillas de liofilizado).
En determinadas realizaciones, la cantidad eficaz de una composici6n farmaceutica quo comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, quo va a emplearse terapeuticamente dependera, por ejemplo, del context° terapeutico y los objetivos. Un expert° en la tecnica apreciard quo los niveles de dosificaciOn apropiados para el tratamiento, segirn determinadas realizaciones, variaran por tanto dependiendo, en parte, de la molecula administrada; la indicaciOn para la que la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, este usandose; la via de administraci6n; y/o el tamaiio (peso corporal, superficie corporal o tamario de organo) del paciente; y/o el estado (la edad y la salud general) del paciente. En determinadas realizaciones, el medico puede
considerar el sexo y/o la dieta del paciente y/o la gravedad de cualquier infecciOn. En determinadas realizaciones, el medico puede ajustar la dosis y modificar la via de administraciOn para obtener el efecto terapeutico Optimo.
En determinadas realizaciones, la frecuencia de dosificaciOn tendra en cuenta los parametros farmacocineticos de la molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP en la formulaci6n usada. En determinadas
realizaciones, la frecuencia de dosificaciOn tendra en cuenta los parametros farmacocineticos de uno o mas agentes terapeuticos adicionales en la formulaciOn usada. En determinadas realizaciones, un medico administrard la composicion hasta que se alcance una dosificacion que logra el efecto deseado. En determinadas realizaciones, la
composicion puede administrarse por tanto como una unica dosis, o como dos o mas dosis (que pueden contener o
nola misma cantidad de la molecula deseada) a lo largo del tiempo, o como una infusiOn continua mediante un dispositivo de implantaciOn, un cateter o de otro modo. En determinadas realizaciones, los expertos en la tecnica realizan un refinamiento adicional de la dosificaciOn apropiada y esta dentro del ambito de las tareas realizadas rutinariamente por los mismos. En determinadas realizaciones, pueden establecerse dosificaciones apropiadas a
traves del uso de datos de dosis-respuesta apropiados.
En determinadas realizaciones, la terapia con molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP permite una dosificaci6n menos frecuente que la administraciOn de PTH sola. Forteo® (teraparatida) comprende PTH[1-34] y se administra como una dosis de 20 j.tg una vez al dia. Preos® comprende PTH[1-84] y se administra como una dosis de 100 jig una vez al dia. En determinadas realizaciones, se administra una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP una vez a la semana para lograr un efecto similar a PTH[1-34] o PTH[1-84] administrada una vez al dia. En determinadas realizaciones, se administra una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas para lograr un efecto similar a PTH[1-341 o PTH[1-84] administrada una vez al dia. En determinadas realizaciones, se administra una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o una vez al an° para lograr un efecto
similar a PTH[1-34] o PTH[1-84] administrada una vez al dia.
En determinadas realizaciones, una dosificacion tipica puede oscilar entre aproximadamente 0,1 jig/kg y hasta
aproximadamente 100 mg/kg (incluyendo todos los puntos entre los extremos) o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En determinadas realizaciones, la dosificaciOn puede oscilar entre aproximadamente 0,1 jig/kg y hasta aproximadamente 100 mg/kg; o entre aproximadamente 1 14/kg y hasta aproximadamente 100
mg/kg; o entre aproximadamente 514/kg y hasta aproximadamente 100 mg/kg; o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y hasta aproximadamente 20 mg/kg; o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y hasta aproximadamente 10 mg/kg; o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y hasta aproximadamente 5 mg/kg.
En determinadas realizaciones, la via de administraciOn de la composicion farmaceutica esta de acuerdo con determinados metodos conocidos. Determinadas Was de administraciOn a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, oral, a traves de inyecci6n por las vies intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatoso), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal y/o intralesional; mediante sistemas de liberaciOn sostenida y/o mediante dispositivos de implantacion. En determinadas realizaciones, las composiciones
pueden administrarse mediante inyecciOn en bolo, de manera continua mediante infusion, y/o mediante dispositivo de implantacion.
En determinadas realizaciones, la composiciOn puede administrare localmente mediante la implantacion de una
membrana, una esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molecula deseada. En determinadas realizaciones, cuando se usa un dispositivo de implantaciOn, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u 6rgano adecuado, y la administraciOn de la molecula deseada puede ser mediante difusiOn, bolo
de liberacion temporal y/o administraci6n continua.
En determinadas realizaciones, puede ser deseable usar una composiciOn farmaceutica que comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, de una manera ex vivo. En tales casos, se exponen celulas, tejidos y/u Organos que se han extraido del paciente a una composiciOn farmaceutica que comprende una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP, con o sin al menos un agente terapeutico adicional, tras lo cual las colulas, los tejidos y/o los organos se implantan
posteriormente de nuevo en el paciente.
En determinadas realizaciones, una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP puede administrarse implantando determinadas colulas que se han modificado por ingenieria genetica. En determinadas realizaciones, pueden administrarse uno mas agentes terapeuticos adicionales implantando determinadas celulas que se han modificado por ingenieria genetica. Los metodos de implantaciOn incluyen, pero no se limitan a, metodos descritos en el presente documento y otros metodos conocidos en la tecnica. En determinadas realizaciones, las celulas modificadas por ingenieria genetica implantadas expresan y secretan una molecula particular. En determinadas realizaciones, tales celulas pueden ser celulas animales o humanas, y pueden ser autologas, heterOlogas o xenogenicas. En determinadas realizaciones, las colulas pueden inmortalizarse. En determinadas realizaciones, con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunolOgica, las colulas pueden encapsularse
para evitar la infiltraciOn de tejidos circundantes. En determinadas realizaciones, los materiales de encapsulaciOn son normalmente membranas o recintos polimericos semipermeables, biocompatibles que permiten la liberacion del/de los producto(s) polipeptidico(s) pero que impiden la destrucci6n de las celulas por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados logrados, se proporcionan para fines ilustrativos sOlo y no debe interpretarse que limitan la presente invencion.
Ejemplo 1
Preparaci6n de un pldsmido de expresiOn de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1
5 Se obtuvo un oligonucleotido sintetico que tiene la secuencia mostrada en la figura 7 (SEQ ID NO: 5) de Picoscript (Houston, TX). Esa secuencia de oligonucledtido contiene un sitio de restriccidn Xbal en 5' (TCTAGA) seguido por una secuencia Kozak (CCACC), que se muestran en negrita en la figura 7. La secuencia de oligonucleOtido tamblen contiene una secuencia codificante sintOtica para los primeros 65 aminoacidos de la proteina preproparatiroidea humana (preproPTH). \lease, por ejemplo, el n.° de registro de Genbank CAA23843. Los primeros 65 aminoacidos
10 de preproPTH humana contienen un dominio pre-pro y los aminoacidos 1-34 del dominio de modulacidn de PTH humana. La secuencia de oligonucledtido tambien contiene una secuencia codificante para una secuencia de ligador helicoidal, GGGAP. Esa secuencia que codifica para el ligador tambion contiene un sitio de restricciOn BSSHII (GCGCGC). Se clone) el oligonucleotido sintetico en el pldsmido pCR4.0-TOPO por Picoscript antes de la administracion (oligo-pCR4.0 TOPO). Se digirid oligo-pCR4.0 TOPO con las endonucleasas de restricci6n Xbal y
15 BssHII para liberar la secuencia que codifica para synPTH. Se separ6 la secuencia que codifica para synPTH mediante electroforesis en gel de agarosa y se purified usando un kit de extracciOn de gel QIAquick® (Qiagen).
Se amplified la cadena ligera de aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1) a partir del pldsmido aRANKL-1- kappa/pDSRa19 (tambien denominado a0PGL-1-kappa/pDSRa19, descrito en la publicacidn PCT n.° WO 03/002713), tal como sigue. Se usaron diez ng de ADN de pldsmido aRANKL-1-kappa/pDSRa19 en una reacci6n
20 PCR usando Pfu polimerasa (Stratagene). Se incluyeron los siguientes cebadores en la reaccion:
Cebador de BssH1 1 de aRANKL-1 kappa en 5' (SEQ ID NO: 214):
. BssHII •
GAPE IIT'L T
5 ' -AA CTT. GGC GCG CCC GA A ATT GTG TTG ACG CAG -3' ;
Cebador de regi6n constante kappa humana en 3' (SEQ ID NO: 215):
5 ' -CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA ,GCT C -'
Sail C E G• R N
25 La reacciOn PCR gener6 un producto de PCR de 671 pares de bases, que codifica para la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de aRANKL-1 con 3 aminoacidos (GAP) de la secuencia de ligador en el extremo N-terminal. Se separd el producto de PCR de 671 pares de bases mediante electroforesis en gel de agarosa y se
purified usando un kit de extraccion de gel Q1Aquicke (Qiagen). Tras la purificacidn, se digirid el producto de PCR de 671 pares de bases con BssHII y Sall, se separ6 mediante electroforesis en gel de agarosa y entonces se purific6 30 usando un kit de extraccion de gel QIAquicke (Qiagen). El fragmento purificado se denomina en el presente documento secuencia que codifica para aRANKL-1 kappa + ligador.
Se ligaron la secuencia que codifica para synPTH purificada y la secuencia que codifica para aRANKL-1 kappa + ligador purificada durante la noche a 4°C usando ligasa de T4 (New England Biolabs) en el tampon recomendado por el fabricante en el pldsmido pDSRa20 que se habia digerido previamente con Xbal y Sall. Se produjo pDSRa20 35 apartir de pDSRa19 (vease la publicacion PCT n.° WO 90/14363) mutando una guanosina en la posicion 2563 a una adenosina mediante mutagenesis dirigida al sitio. Se transformaron los productos de ligamiento en colulas TOP10 competentes (Invitrogen) y se seleccionaron las celulas por su resistencia a ampicilina. Se ais16 el pldsmido de clones positivos y se verified el insert° mediante secuenciaciOn de ADN. Se muestra la secuencia del insert() en la figura 9 (SEQ ID NO: 7). Esa secuencia codifica para un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos
40 mostrada en la figura 10 (SEQ ID NO: 8), que se denomina "synPTH-aRANKL-1 kappa" o "synPTH-cadena ligera de aRANKL-1". Ese polipeptido con un polipOptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 2 (SEQ ID NO: 2) se denominan juntos "fusion de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1" o "synPTH-aRANKL-1 LCF".
Se muestra en la figura 13 un diagrama esquematico del vector de expresiOn synPTH-aRANKL-1-kappa pDSRa20. El vector de expresi6n tiene 5326 pares de bases y contiene las regiones funcionales mostradas en la tabla 5.
45 Tabla5: Caracteristicas de synPTH-aRANKL-1-kappa/pDSRa20
Ubicaci6n en el pldsmido
DescripciOn de la regiOn
(pares de bases)
2 a 886 Una
sefial de poliadenilaciOn/terminacion de la transcripci6n de la subunidad a de la hormona de glicoproteina hipofisaria bovina (a-FSH) (Goodwin, etal. , 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; ndmero de registro de Genbank X00004) 887 a 2027 Unminigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de raton que contiene el promotor
de DHFR de ratOn endOgeno, las secuencias codificantes de ADNc y las sefiales de poliadenilaciOn/terminaciOn de la transcripciOn de DHFR (Gasser etal. , 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg etal. , 1980, Cell 19:355-64; Setzer etal. , 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan etal. , 1985, J. Biol.
Chem. 260:2307-14) 2036 a 3952 Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen para la replicaciOn del pldsmido en E. coil(numero de registro de Genbank J01749) 3954 a 4297 Unpromotor temprano, potenciador y origen de replicaciOn de SV40 (Takebe et al. , 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, ndmero de registro de Genbank J02400) 4305 a 4570 Unelemento potenciador de la traducciOn del dominio LTR de VLTH-1 (Seiki et aL, 1983, Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, nOmero de registro de Genbank J02029) 4579 a 4735 UnintrOn de las sefiales donadoras/aceptoras de corte y empalme 16S, 19S de SV40 (Okayama y Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:280-9, numero de registro de Genbank J02400) 4750 a 5619 ElADNc de synPTH-aRANKL-1-kappa entre los sitios XbalySall
E emplo 2
Preparacion de un pldsmido de expresiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1
Se prepar6 la secuencia que codifica para synPTH tal como se describiO anteriormente en el ejemplo 1.
Se amplific6 la cadena pesada de aRANKL-1 (tambien denominado a0PGL-1) a partir del pldsmido aRANKL-15 IgG2/pDSRa19 (tambien denominado a0PGL-1-IgG2/pDSRa19, descrito en la publicaciOn PCT n.° WO 03/002713) tal como sigue. Se usaron diez ng de ADN de pldsmido aRANKL-1-IgG2/pDSRa19 en una reacciOn PCR usando Pfu polimerasa (Stratagene). Se incluyeron los siguientes cebadores en la reaccion:
Cebador de BssHI I de aRANKL-1 IgG2 en 5' (SEQ ID NO: 216):
Bssh71'
G A E V Q L • L E
5 -AA CTT pGc, GCG CCC 'GAG .GTG CAG CTG TTG GAG 7 3'
10 Cebador de region constante de IgG2 humana en 3' (SEQ ID NO: 217):
5'-G CAT GTC GAC TA TTT ACC'CGG AGA CAG GGA GAG -3'
* K
Sall GP S L SL
La reacciOn PCR gener6 un producto de PCR de 1372 pares de bases, que codifica para la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de aRANKL-1 con 3 aminoacidos (GAP) de la secuencia de ligador en el extremo N-terminal. Se separo el producto de PCR de 1372 pares de bases mediante electroforesis en gel de agarosa y se
15 purific6 usando un kit de extracciOn de gel QIAquicke (Qiagen). Tras la purificaci6n, se digiri6 el producto de PCR de 1372 pares de bases con BssHII y Sall, se separd mediante electroforesis en gel de agarosa y entonces se purific6 usando un kit de extraccion del gel Q1Aquicke (Qiagen). El fragmento purificado se denomina en el presente documento secuencia que codifica para aRANKL-1 IgG2 + ligador.
Se ligaron la secuencia quo codifica para synPTH purificada y la secuencia que codifica para aRANKL-1 IgG2 + 20 ligador purificada durante la noche a 4°C usando ligasa de T4 (New England Biolabs) en el tampon recomendado por el fabricante en el pldsmido pDSRa20 que se habla digerido previamente con Xbal y Sall. Se transformaron los productos de ligamiento en celulas TOP10 competentes (Invitrogen) y se seleccionaron las cdlulas para detectar resistencia a ampicilina. Se aisIO el pldsmido de clones positivos y se verific6 el insert° mediante secuenciaci6n de ADN. Se muestra la secuencia de ADN del insert() en la figura 11 (SEQ ID NO: 9) y el polipeptido codificado por la 25 secuencia de ADN de la figura 11 tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 12 (SEQ ID NO: 10). El polipdptido se denomina "synPTH-aRANKL-1 IgG2" o "synPTH-cadena pesada de aRANKL-1". Ese polipeptido, junto con un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 4 (SEQ ID NO: 4) se denominan juntos
"fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1" o "synPf H-aRANKL-1 HCF." Se muestra en la figura 14 un diagrama del vector de expresiOn synPTH-aRANKL-1-IgG2 pDSRa20. El vector de expresiOn tiene 6323 pares de bases y contiene las regiones funcionales mostradas en la tabla 6. Tabla 6: Caracterfsticas de synPTH-aRANKL-1-IgG2/pDSRa20
UbicaciOn en el plasmido (pares de bases)
Descripcion de la region
2 a 886
Una sefial de poliadenilaciOn/terminacion de la transcripcion de la subunidad a de
la hormona de glicoproteina hipofisaria bovina (a-FSH) (Goodwin, et al. , 1983,
Nucleic Acids Res. 11:6873-82; numero de registro de Genbank X00004)
887 a 2027
Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ration que contiene el promotor
de DHFR de rat6n end6geno, las secuencias codificantes de ADNc y las sefiales
de poliadenilaciOn/terminacion de la transcripciOn de DHFR (Gasser et al. , 1982,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et aL, 1980, Cell 19:355-64;
Setzer et al. , 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et aL, 1985, J. Biol.
Chem. 260:2307-14)
2036 a 3952
Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina
y el origen para la replicaciOn del plasmido en E. coil (nurnero de registro de
Genbank J01749)
3954 a 4297
Un promotor temprano, potenciador y origen de replicacion de SV40 (Takebe et
aL, 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, numero de registro de Genbank J02400)
4305 a 4570
Un elemento potenciador de la traducciOn del dominio LTR de VLTH-1 (Seiki et
al. , 1983, Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, numero de registro de
Genbank J02029)
4579 a 4735
Un intr.& de las seriales donadoras/aceptoras de corte y empalme 16S, 19S de
SV40 (Okayama y Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:280-9, numero de registro de
Gen bank J02400)
4750 a 6318
El ADNc de synPTH-aRANKL-1-IgG2 entre los sitios Xbal y Sall
5 E'emplo 3
Expresion de synPTH-aRANKL-1
ExpresiOn en celulas de ovario de hamster chino (CHO)
Para la expresiOn de la fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1, se transfectaron conjuntamente celulas CHO AM-1/D (descritas on la patente estadounidense n.° 6.210.924) adaptadas a cultivo libre de suero deficientes 10 endihidrofolato reductasa (DHFR-) con synPTH-aRANKL-1-IgG2 pDSRa20 y aRANKL-1-kappa/pDSRa19 (tambien denominado a0PGL-1-kappa/pDSRa19; vease la publicaciOn PCT n.° WO 03/002713) usando el metodo del fosfato de calcio. Para la expresiOn de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1, se transfectaron conjuntamente celulas CHO AM-1/D adaptadas a cultivo libre de suero deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR-) con synPTH-aRANKL-1kappa pDSRa20 y aRANKL-1-IgG2/pDSRa19 (tambion denominado a0PGL-1-IgG2/pDSRa19; vease la publicaciOn
15 PCTn.° WO 031002713) usando el metodo del fosfato de calcio.
Se IlevO a cabo la expresiOn de cada una de la fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 y la fusion de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 tal como sigue. Se sembraron en placa colulas transfectadas en placas de 10 cm y se seleccionaron en medio DMEM complementado con 1X aminoacidos no esenciales, lx penicilina, estreptomicina, glutamina y 1X piruvato de sodio (Invitrogen) y quo contenia suero bovino fetal dializado (Invitrogen) 20 yquo carecla de hipoxantina-timidina para seleccionar celulas quo expresan la enzima DHFR. Tras dos semanas de selecciOn con cambios de medio cada de tres a cuatro dias, se combinaron las colonias supervivientes on un conjunto madre de clones transfectados. Se examin6 una allcuota de los medios condicionados del conjunto madre de celulas transfectadas mediante inmunotransferencia de tipo Western para confirmar la expresion de la molecula quimorica de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 secretada y/o la molecula quimerica de synPTH-cadena pesada 25 de aRANKL-1 secretada. Se hizo crecer el conjunto madre de celulas transfectadas durante de dos a tres semanas, con divisiOn y cambios de medio, en frascos T175 y se us6 para sembrar frascos giratorios de 800 cm2 a 2 x 107 celulas por frasco giratorio. Tras dos dfas, se lavaron las colulas con 1 x PBS y se transfirieron a medio libre de suero. Se hicieron crecer las celulas durante una semana para condicionar el medio. Se combinaron de dos a tres cosechas del medio libre de suero condicionado durante siete dias y se usaron para la purificaci6n de proterna
30 recombinante.
ExpresiOn en celulas 2931
Para la expresion de la fusiOn de synPTH-cadena pesada + ligera de aRANKL-1 (tambien denominado synPTH- aRANKL-1 HC+LCF), se transfectaron conjuntamente celulas 293T quo se hablan adaptado al crecimiento en medio
libre de suero con synPTH-aRANKL-1-IgG2 pDSRa20 y aRANKL-1-kappa/pDSRa20. Se Ilevaron a cabo las transfecciones en cultivos de 500 ml o 1 I tal como sigue. Se centrifug6 el inoculo celular (5 x105 celulas/m1 x volumen de cultivo) a 2500 rpm durante 10 minutos a 4°C para eliminar el medio condicionado. Se resuspendieron las celulas en DMEM libre de suero (lnvitrogen) y se centrifugaron de nuevo a 2500 rpm durante 10 minutos a 4°C.
Tras aspirar la disoluciOn de lavado, se resuspendieron las celulas en medio de crecimiento (DMEM/F12 a una razOn de 3:1, complementado con lx complemento de insulina-transferrina-selenio, 1X penicilina, estreptomicina, glutamina, L-glutamina 2 mM, HEPES 20 mM, Pluronic F68 al 0,01%) en un frasco centrifugador de 1 I o 3 I. Se mantuvo el cultivo del frasco centrifugador con agitaciOn a 125 rpm en un incubador humidificado a 37°C y un 5% de CO2.
Se complejo el ADN de plasmido con el reactivo de transfecci6n (X-TremeGene RO-1539; Roche) en un tubo cOnico de 50 ml tal como sigue. Se anadiO un j.tg de ADN de plasmido por ml de cultivo a un 5% del volumen de cultivo final de DMEM libre de suero, seguido por 1 gl de X-TremeGene RO-1539 (Roche) por ml de cultivo. Se incub6 el complejo de ADN/reactivo de transfecci6n a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos y entonces
se afiadi6 a las celulas en el frasco centrifugador. Se realizo la transfeccion/expresion a lo largo de siete dias, tras lo cual se recogio el medio condicionado mediante centrifugaciOn a 4000 rpm durante 60 minutos a 4°C.
Ejemplo 4
PurificaciOn de synPTH-aRANKL-1
Se purificaron la fusion de SynPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (quo comprende synPTH fusionada a una cadena pesada de aRANKL-1 (SEQ ID NO: 10) y una cadena ligera de aRANKL-1 (SEQ ID NO: 4)), la fusiOn de synPTHcadena ligera de aRANKL-1 (que comprende synPTH fusionada a una cadena ligera de aRANKL-1 (SEQ ID NO: 8) y una cadena pesada de aRANKL-1 (SEQ ID NO: 2)) o la fusiOn de synPTH-cadena pesada + ligera de aRANKL-1 (que comprende synPTH fusionada a una cadena pesada de aRANKL-1 (SEQ ID NO: 10) y synPTH fusionada a una cadena ligera de aRANKL-1 (SEQ ID NO: 8)) de las celulas huesped tal como sigue. Se Ilevaron a cabo todos los
procedimientos de purificaciOn a temperatura ambiente.
Purificacion de la fusion de svnPTH-cadena pesada de aRANKL-1 v la fusiOn de svnPTH-cadena liaera de aRANKL-
Se centrifugaron por separado el fluido de cultivo de celulas huesped (CCF) de la expresiOn en celulas CHO de la fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 y la fusiOn de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1 en un rotor Beckman JS-4.2 a 3500 rpm durante 1 hora a 4°C para eliminar los residuos celulares. Se filtrO entonces el sobrenadante de CCF a tray& de un filtro de 0,2 gm esteril. En algunos casos, se concentrO entonces el sobrenadante de CCF filtrado mediante ultrafiltracion de flub o tangencial usando una membrana de punto de cone de peso molecular de 10 kD o 30 kD. Entonces se cargo el sobrenadante de CCF sobre una columna de proteina A (Amersham/Pharmacia) equilibrada en PBS. Tras cargar, se lavO la columna con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm de la fracciOn no retenida regres6 al nivel inicial. Se eluy6 la synPTH-aRANKL-1 de la columna usando acid°
acetico 20 mM, cloruro de sodio 10 mM, pH 3,2. Se monitorizO la absorbancia a 280 nm del eluato y se recogieron las fracciones quo contenian proteina. Los tubos de fraccionamiento conten fan 20 gl de base Tris 1 M, pH 11 por 1 ml de eluato.
Se ajust6 la synPTH-aRANKL-1 eluida de la columna de proterna A a pH 5,0 con acid° acetic° al 50% y entonces se carg6 directamente sobre una columna de intercambio cati6nico (resina de cromatograffa SPHP, Amersham/Pharmacia) quo se equilibrO con acetato 20 mM, pH 5,0. Tras cargar, se lavO la columna con acetato 20 mM, pH 5,0. Entonces se eluyO la synPTH-aRANKL-1 usando un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 M a cloruro de sodio 0,5 M en acetato 20 mM, pH 5,0. Se monitorizO la absorbancia a 280 nm del eluato y se recogiO la synPTH-aRANKL-1 eluida en fracciones. Se sometieron a ensayo las fracciones mediante SDS-PAGE tefiida con Coomassie para identificar fracciones que contenian un polipeptido que migraba al tamafio predicho de la synPTH
aRANKL-1.
Se agruparon por separado las fracciones quo contenian la fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 o la fusion de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1, se filtraron a traves de un filtro Posidyne de 0,2 g, se alicuotaron y entonces se almacenaron a 4°C en acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 350 mM, pH 5,0.
Purificaci6n de la fusion de svnPTH-cadena pesada + liaera de aRANKL-1
Secentrifuge) el fluido de cultivo de celulas huesped (CCF) de la expresiOn en cOlulas 293T de la fusi6n de synPTHcadena pesada + ligera de aRANKL-1 on un rotor Beckman JS-4.2 a 3500 rpm durante 1 hora a 4°C para eliminar los residuos celulares. Entonces se filtr6 el sobrenadante de CCF a traves de un filtro de 0,2 gm esteril. En algunos casos, se concentrO el sobrenadante de CCF filtrado mediante ultrafiltraciOn de flujo tangencial usando una membrana de punto de corte de peso molecular de 10 kD o 30 kD. Entonces se cargo el sobrenadante de CCF sobre una columna de proteina A (Amersham/Pharmacia) equilibrada en PBS. Tras cargar, se lav6 la columna con PBS hasta quo la absorbancia a 280 nm de la fracci6n no retenida regreso al nivel inicial. Se eluy6 la fusi6n de
synPTH-cadena pesada + ligera de aRANKL-1 de la columna usando acido acetic() 20 mM, cloruro de sodio 10 mM, pH 3,2. Se monitoriz6 la absorbancia a 280 nm del eluato y se recogieron las fracciones que contenian proteina.
Se agruparon las fracciones que contenian la fusion de synPTH-cadena pesada + ligera de aRANKL-1, se ajustaron a pH 5,0 con base Tris 1 M pH 11, se filtraron a traves de un filtro Posidyne de 0,2 jt, se alicuotaron y se 5 almacenaron a 4°C en acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 10 mM, pH 5,0.
Ejemplo 5
Actividad de la fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1
Se generaron ratones "con insercion" de RANKL humano (ratones con huRANKL) tal como se describe a continuaciOn.
10 Identificacion de don de BAG murino aue contiene RANKL
Se use) el software Oligo Primer Analyses, version 5.0 (Wojciech & Piotr Rychlik, Plymouth, MN) para generar 2 conjuntos de pares de cebadores para el exOn 5 de RANKL murino (conjuntos de cebadores A y B) ash como un conjunto de cebadores que abarca los exones 3 y 4 de RANKL murino (conjunto de cebadores C). El conjunto de cebadores A (2699-81 y 2699-82) genera un producto de PCR de 259 pares de bases. El conjunto de cebadores B
15 (2699-83 y 2699-84) genera un producto de PCR de 326 pares de bases mientras que el conjunto de cebadores C (2699-86 y 2699-87) genera un producto de 273 pares de bases.
Conjunto de cebadores A:
2699-81: GCA TCA TGA AAC ATC GGG AAG C (SEQ ID NO: 218)
2699-82: CCC AAA GTA CGT CGC ATC TG A (SEQ ID NO: 219)
20 Conjunto de cebadores B:
2699-83: GTT AAG CAA CGG AAA ACT AAG G (SEQ ID NO: 220)
2699-84: CAA AGT ACG TCG CAT CU GAT (SEQ ID NO: 221)
Conjunto de cebadores C:
2699-86: GCA AGG TAG GGT TCA ACT GA (SEQ ID NO: 222)
25 2699-87: GTC CTG TAT GGG TGG TAG TCT T (SEQ ID NO: 223)
Se sometieron a prueba los cebadores usando ADN de celulas ES para confirmar que cada par de cebadores amplificaba una banda del tame° predicho. Se us6 el conjunto de cebadores A para examinar la Down-to-the-Well Mouse ES BAG DNA Pools-Release I (Genome Systems, Inc., St. Louis, MO), una biblioteca que representa tres equivalentes genornicos. Esta biblioteca esta contenida en 240 placas de microtitulaciOn y los clones en estas placas 30 se han agrupado para permitir la identificaciOn de un clon individual realizando tres rondas secuenciales de PCR. Inicialmente, se amplificaron los 24 "conjuntos superiores", que consisten cada uno en ADN de 10 placas de microtitulacion, ash como controles negativos (agua y ADN irrelevante) usando los conjuntos de cebadores A, B y C. Se realiz6 PCR y termociclado usando tecnologia de ADN recombinante convencional. Se ejecut6 una alicuota de cada reaccion de PCR sobre un gel de agarosa al 2% /TM. Se identific6 que el conjunto 18, que corresponde a las 35 placas de microtitulacion 171-180, era fuertemente positivo con los 3 conjuntos de cebadores. Entonces se amplificaron conjuntos de placas individuales para las placas de microtitulaciOn 171-180, identificando el conjunto de la placa 172 como la placa positiva. Los conjuntos Down-to-the-Well amplificados usando el conjunto de cebadores A identificaron el pocillo G10 como la ubicacion en la placa 172 para el don de BAC deseado. Se obtuvo el don de ADN de BAG Mu ES 172G10 de Genome Systems. Las reacciones de PCR con los conjuntos de cebadores A, By C
40 dieron bandas distintas confirmando que este clon contenia la regi6n deseada del RANKL murino.
Vector de inserci6n de RANKL
Se genera un fragmento de ADN de 1,4 kb con homologia por la regi6n en 3' del ex6n 5 del locus genomico de RANKL de ratan mediante amplificaciOn por PCR usando Pfu Turbo Hotstart DNA polimerasa (Stratagene), el ADN de BAG Mu ES 172G10 y los siguientes cebadores:
45 2796-94: ATTGCGATCGCGTTACTGGGAGAAGTGCAGATTT (SEQ ID NO: 224)
2796-95: AATGGCGCGCCCATAGCGTAGCGTTCATTATCCT (SEQ ID NO: 225)
El fragmento de PCR resultante contenia un sitio de enzima de restricciOn Sgfl en el extremo 5' y un sitio de enzima de restricciOn Ascl en el extremo 3'. Se digiri6 el fragmento de PCR con Sgfl y Ascl. Se digiriO tambien el vector
pAMGENK03 (vector propiedad de Amgen) con Sgfl y Ascl. Se purificaron en gel el fragmento de PCR digerido y el fragmento grande del vector pAMGENK03 digerido usando el kit de purificaciOn en gel (Qiagen). Se ligo el fragmento de PCR purificado en el fragmento grande purificado de pAMGENK03 y se transform6 en celulas de E. coil competentes Electro Max DH1OB (Invitrogen). Se recogieron diez colonias y se hicieron crecer durante 4 horas 5 en placas LB que contenian ampicilina. Se examinaron directamente las bacterias mediante andlisis por PCR para detectar colonias positivas de brazo corto usando los cebadores 2796-94 y 2796-95 y Taq polimerasa (PerkinElmer). Se prepar6 ADN de pldsmido de colonias positivas de brazo corto usando un kit Spin Miniprep (Qiagen). Se realizO andlisis con enzimas de restricciOn de diagn6stico en ADN de pldsmido preparado usando las enzimas Sgfl y Ascl. Se seleccion6 un pldsmido que era positivo en tanto el andlisis de PCR de brazo corto como el andlisis con enzimas
derestricciOn de diagnOstico y se marc6 como pAMGENK03-0PGL-SA.
Se gener6 un fragmento de ADN de 4,9 kb con homologra por el intrOn entre el ex6n 4 y el exOn 5 del locus genOmico de RANKL de rat6n mediante amplificaciOn por PCR usando el kit de PCR Advantage HF 2 (BD Biosciences Clontech), ADN de clon de BAG Mu ES 172G10 y los cebadores:
2802-13: ATTGCGGCCGCAGTGGACTTACTCAAACCTTCT
15 2802-12: ACCCGCTCGAGGATACTAGTGATGGAGCAACATG
El fragmento de PCR resultante contenia un sitio de enzima de restriccion Notl en el extremo 5' y un sitio de enzima de restricciOn Xhol en el extremo 3'. Se digirieron por separado el fragmento de PCR y pAMGENK03-0PGL-SA con Notl y Xhol. Entonces se purificaron en gel por separado el fragmento de PCR digerido y el fragmento grande del pAMGENK03-0PGL-SA digerido usando el kit de purificaciOn en gel de Qiagen. Se lig6 el fragmento de PCR
purificado en el fragmento grande purificado de pAMGENK03-0PGL-SA y se transformo en celulas de E. coil competentes Electro Max DH10B. Se recogieron sesenta y cuatro colonias y se hicieron crecer durante 4 horas en placas LB que contenian ampicilina. Se examinaron directamente las bacterias para determinar la presencia del brazo largo mediante andlisis de PCR usando Taq polimerasa con los cebadores:
2797-56: TGCAATCTGCGCCTCAGTCTTC (SEQ ID NO: 226)
25 2797-57: ATTTCTCACCGTCGGCATCTCC (SEQ ID NO: 227)
Se prepar6 ADN de pldsmido a partir de colonias positivas de brazo largo usando un kit Spin Miniprep (Qiagen). Entonces se realizO andlisis con enzimas de diagnOstico en el ADN de pldsmido preparado usando las enzimas Notl y Xhol. Se seleccion6 un pldsmido que era positivo tanto en el andlisis de PCR de brazo largo como en el andlisis con enzimas de restricciOn de diagnOstico y se marc6 como pAMGENK03-0PGL-SA-LA.
Se gener6 el fragmento de RANKL de ratOn 0,25 kb con un sitio de restricciOn BstZ171 (modificado por ingenieria gendtica en el extremo 5' para el examen de brazo largo) mediante amplificaciOn por PCR usando Pfu Turbo Hotstart ADN polimerasa, ADN de don de BAG Mu ES 172G10 y los cebadores:
2796-88: ATTCTCGAGGTATACCTATAGCTTAAGGGCAGGATAGA (SEQ ID NO: 228)
2796-89: CTTTATGGGAACCTAGAGAGAAAC (SEQ ID NO: 229)
35 Segenera la region codificante de 0,41 kb del exon 5 de RANKL humano mediante amplificaciOn por PCR a partir de ADNc humano usando Pfu Turbo Hotstart ADN polimerasa y los cebadores:
2796-90: TCTAGGTTCCCATAAAGTGAGTCTGT (SEQ ID NO: 230)
2796-91: TTCCACGAAATGAGTCTCAATCTATATCTCGAACTTTAAAA (SEQ ID NO: 231)
Puesto que el fragmento de RANKL de rat6n de 0,25 kb se solapa con el fragmento del exOn 5 de RANKL humano
de0,41 kb, se gener6 un fragmento de 0,66 kb mds grande usando los cebadores (2796-88 y 2796-91) y Pfu Turbo Hotstart ADN polimerasa. Se gener6 una regi6n no traducida en 3' de rat6n de 1,24 kb del ex6n 5 de RANKL mediante amplificacion por PCR usando Pfu Turbo Hotstart ADN polimerasa, ADN de clon de BAG Mu ES 172G10 y los cebadores:
2796-92: GTTCGAGATATAGATTGAGACTCATTTCGTGGAACATTA (SEQ ID NO: 232)
45 2796-93: ATTGGCCGGCCCTTTGGAGAAAGATAGAAGCCAC (SEQ ID NO: 233)
Puesto que el fragmento de PCR de 1,24 kb se solapa con el fragmento de PCR de 0,66 kb, se genero un fragmento de insercion quimerico de 1,9 kb mds grande mediante PCR con Pfu Turbo Hotstart ADN polimerasa y los cebadores 2796-88 y 2796-93. El fragmento de PCR amplificado contenia un sitio de enzima de restricciOn Xhol en el extremo 5' y un sitio de enzima de restricciOn Fsel en el extremo 3'. Se digirieron por separado el fragmento de PCR y pAMGENK03-0PGL-SA-LA con Notl y Xhol. Se purificaron en gel por separado el fragmento de PCR digerido y fragmento grande del pAMGENK03-0PGL-SA-LA digerido usando el kit de purificaciOn en gel de Qiagen. Se lige) el fragmento de PCR purificado con el fragmento grande purificado y se transform6 en celulas de E. coilcompetentes
Electro Max DH1OB (Invitrogen). Se recogieron veinte colonias de la reaccion de ligamiento y se hicieron crecer durante 4 horas en placas LB que contenian ampicilina. Se examinaron directamente las bacterias mediante PCR con los cebadores.
2817-87: CCAACATGACTTTTAGCAATG (SEQ ID NO: 234)
2797-55: TCCTCTCCAGACCGTAACTTA (SEQ ID NO: 235)
Se prepararon plasmidos a partir de colonias positivas para PCR usando el kit Miniprep (Qiagen). Se us6 digesti6n con enzimas de restricci6n con Xhol y Fsel seguida por electroforesis en un gel de agarosa al 1% para confirmar la presencia del inserto. Se confirmaron ADN positivos mediante secuenciaci6n. El vector de direccionamiento de
inserci6n se denomin6 pAMGENK03-0PGL-KI.
Seprepar6 una preparaciOn de plasmido grande del constructo de direccionamiento pAMGENK03-0PGL-KI usando el kit Mega de plasmidos de Qiagen. Se linealizaron doscientos microgramos de pAMGENK03-0PGL-KI con Notl y entonces se purificaron ariadiendo la mitad del volumen de acetato de amonio 7,5 M y un volumen de fenoVcloroformo (GIBCO BRL), agitando con vortex para mezclar y centrifugando durante 5 minutos a 10.000 rpm. Se transfiri6 la fase acuosa a un tubo limpio y se atiadi6 un volumen de cloroformo (GIBCO BRL). Entonces se agito
con vortex la mezcla para mezclar y se centrifug6 durante 2 minutos a 10.000 rpm. Se transfiri6 la fase acuosa a un tubo limpio y se afiadieron 2,5 volumenes de etanol al 100%. Entonces se mezcl6 la disolucion invirtiendo el tubo varias veces y centrifugando durante 10 minutos a 10.000 rpm. Se elimin6 el sobrenadante y se lave) el ADN sedimentado en el fondo del tubo con etanol al 70% y se resuspendi6 en tampOn Tris-HCI 10 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0.
Direccionamiento a colulas madre embrionarias v deneraciOn de ratones con insercion
Se hicieron crecer celulas madre embrionarias GS-1 (ES) (129SvJ; Genome Systems) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (lnvitrogen) complementado con suero bovino fetal al 15% (FBS) (Hyclone), penicilina/estreptomicina 100 hg/m1 (Invitrogen), glutamina 2 mM (Invitrogen), factor inhibidor de leucemia 103 unidades/ml (LIF) (Chemicon), NEAA 0,1 mM (Life Technologies) y 2-mercaptoetanol 0,1RM (Life Technologies). Sehicieron crecer celulas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratOn (MEF) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Hyclone), penicilina/estreptomicina 100 j.i.g/m1 (Invitrogen) y glutamina 2 mM (Invitrogen). Se derivaron los MEF de fetos explantados en el dia 13-14 de ratones resistentes a neomicina. Antes de usarlos como capas alimentadoras para celulas ES, se inactivaron los MEF mediante tratamiento con mitomicina C 10 jig/m1 (Roche) durante 2-3 horas. Se
hicieron crecer tanto los MEF como las celulas ES a 37°C, el 5% de CO2.
Para el direccionamiento, se mezclaron 107 celulas GS-1 ES (129SvJ; Genome Systems) con 25 1.ig de pAMGENK03-0PGL-KI linealizado y se sometieron a electroporaciOn a 250 V, 500 1.1F con un instrumento Gene Pulser de Bio-Rad. Se seleccionaron clones transfectados en G418 (principio activo 210 p.g/m1) (Invitrogen) y FIAU (concentraci6n final de 0,2 p,M) (Moravek) en celulas alimentadoras de MEF resistentes a neomicina. Tras 7 dias de selecciOn, se recogieron los clones, se tripsinizaron y se sembraron en placa en 96 pocillos por triplicado. Se congelaron dos conjuntos de placas en medio de congelaciOn que consistia en DMS0 al 10% (Sigma), FBS al 10% y DMEM. Entonces se cubrieron los pocillos con una capa de aceite mineral esteril (Sigma) y se colocaron las placas selladas en cajas Styrofoam para su congelaciOn a -80°C. Se us6 el tercer conjunto de placas para analisis de PCR y de tipo Southern. Se enjuagaron las celulas con PBS y se incubaron a 60°C durante la noche en tampOn de lisis (Tris 10 mM, EDTA 10 mM, NaCI 10 mM, sarcosilo al 0,5% y proteinasa K 1 mg/ml). Se precipit6 el ADN de las placas usando NH40Ac 7,5 M, seguido por lavados con etanol al 70%, y se resuspendi6 finalmente en TE pH 8,0.
Para examinar la recombinacion hornologa en el lado de brazo corto, se examinaron ADN de clones de celulas ES usando el kit de PCR Expand High Fidelity (Roche) apareandose un cebador de PCR en el casete de resistencia a neomicina y apareandose un cebador de PCR en la region genomica fuera del brazo corto:
2818-35: GATCTCTCGTGGGATCATTGTT (SEQ ID NO: 236)
2818-36: AACCCACTTAGAAGATGCTGCT (SEQ ID NO: 237)
Adernas, se evaluO la presencia del exOn 5 de RANKL humano mediante PCR usando los cebadores 2817-87 y 2797-55. Para ADN positivos para PCR, se us6 analisis de transferencia de tipo Southern para confirmar la recombinaciOn homOloga en el lado de brazo largo tal como sigue. Se digirieron ADN genOmicos con BstZ17I (New
England Biolabs) durante la noche y se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,9% en tamp6n 1xTAE durante la noche (el alelo silvestre produce un fragmento de 16 kb frente a un fragmento de 12 kb para el alelo seleccionado como diana). Se desnaturalizo el gel dos veces mediante tratamiento con NaOH 0,5 M/NaCI 1,5 M durante 15 minutos y entonces se neutralize) dos veces mediante tratamiento con Tris-HCI 0,5 M pH 7,0/NaCI 1,5 M durante 15 minutos. Entonces se transfirieron los ADN digeridos a una membrana de nailon Nytran
SuperCharge (Schleicher & Schuell) en 20xSSC durante la noche usando un sistema de transferencia Rapid Downward (Schleicher & Schuell) y entonces se reticularon usando un instrumento UV Stratalinker 2400
(Stratagene). Se hibrid6 previamente la membrana con disoluciOn de hibridaci6n Express (Clontech) a 60°C durante 3 horas y se transfirio a tamp6n de hibridacion Express que contenia sonda de brazo largo radiomarcada 1,5x106 cpm/ml a 60°C durante 3 horas. Se marc6 la sonda con a32P dCTP (3000 Ci/mmol, Amersham) usando un kit de marcaje de cebadores al azar (Amersham) y se purific6 con una columna Sephadex G-50 Quick Spin (n.° de
5 cat. 1273965, Roche). Se lave) la membrana de hibridacion una vez con 2xSSC y SDS al 0,1%, a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se lav6 una vez con 0,1xSSC y SOS al 0,1% a 60°C durante 20 minutos. Entonces se expuso la membrana de hibridaci6n a una pelicula de obtenciOn de imagenes durante varios dias (dependiendo de la fuerza de la serial). El alelo silvestre estaba representado como una banda de 16 kb en una transferencia de tipo Southern, mientras que el alelo seleccionado como diana era una banda de 12 kb.
Despues de que los clones de ES que habian experimentado recombinaciOn homOloga se identificaran mediante andlisis de PCR y transferencia de tipo Southern, se descongelaron las disoluciones de reserva congeladas anteriormente (descrito anteriormente) y se inyectaron en blastocistos C57BI/6 (Taconic) de 2,5 dias. Entonces se introdujeron los blastocistos inyectados en hembras pseudoprefiadas y se identificaron quimeras que se transmitian a la linea germinal. Se genotip6 la descendencia de estas quimeras mediante PCR para identificar ratones que eran
15 heterocigotos para el acontecimiento de direccionamiento y posteriormente se cruzaron estos ratones heterocigotos entre si para obtener ratones con insercion homocigotos.
Examen de ratones con insercion heterociootos v homociootos
Se aislaron ADN de la cola de los ratones usando el kit DNeasy (Qiagen) y se examinaron mediante PCR usando perlas de PCR puRetaq Ready-to-Go (Amersham) usando los siguientes cebadores:
3151-52: CATGGAACTTGGGAGTGACTTT (SEQ ID NO: 238)
3151-53: TCAAGGTTCTCAGTGGCACAT (SEQ ID NO: 239)
Se purific6 el producto de PCR usando el kit de purificaciOn de PCR Qiaquick (Qiagen) y se cork) con BstZ17I. Se resolvieron los fragmentos resultantes en un gel de agarosa al 1% con el alelo silvestre representado como la banda de 1,5 kb y los alelos seleccionados como diana representados como las bandas de 0,9 kb y 0,6 kb. Por tanto, una
25 banda de 1,5 kb representa sOlo un ratOn silvestre, una mezcla de bandas de 0,9 kb y 0,6 kb representa un ratOn con insercion homocigoto y una mezcla de bandas de 1,5 kb, 0,9 kb y 0,6 kb representa un rat& heterocigoto.
Actividad biolooica de la fusion de svnPTH-cadena gesada de aRANKL-1
Se determin6 la actividad de la fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 en ratones tal como sigue.
Protocolo
Seusaron ratones silvestres y ratones con inserciOn de RANKL humano (ratones huRANKL) hembra de diez meses de edad para el estudio (n = 6 por grupo). Se les inyectO a los ratones huRANKL por via subcutanea (s.c.) en el cuello vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana (100 fig/kg, 5 dias/semana), aRANKL-1 (2 6 10 mg/kg, una vez/semana; aRANKL-1 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4; tambien denominado a0PGL-1, \tease la publicacion
35 PCTn.° WO 03/002713) o la fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (2 0 10 mg/kg, una vez/semana). Se trataron ratones silvestres con vehiculo (PBS) o con fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 (2 mg/kg, una vez/semana). Se diluy6 PTH(1-34) en HCI 0,001 N, NaCI 0,15 M y albumina serica bovina al 2%, y se diluyeron aRANKL-1 y synPTH-aRANKL-1 en PBS.
Se analizO la densidad mineral 6sea en el nivel inicial (antes del inicio del tratamiento) y luego a las semanas 1, 2 y 3
tras el tratamiento. Tambien se recogieron muestras de sangre en el nivel inicial y a las 2, 6, 24, 48 y 72 horas, y luego semanalmente despues de eso. Se usaron las muestras de sangre para andlisis de calcio ionizado en sangre completa, andlisis de osteocalcina y andlisis de TRAP-5b. Al final del estudio, se recogieron las tibias para histomorfometria dindmica y estatica. Se alojaron todos los animales en jaulas con filtro superior con alimento y agua
a voluntad en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas.
45 Marcadores bioquimicos del recambio oseo
Se determino el calcio ionizado en sangre en el nivel inicial, y a las 2 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas tras el tratamiento tal como sigue. Se anestesiaron los ratones con isoflurano (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) y se recogieron muestras de sangre por via retroorbital en tubos capilares heparinizados (Fisher Scientific). Se determinaron los niveles de calcio ionizado en sangre completa usando un analizador de Ca++/pH modelo 634
(Chiron Diagnostics, Norwood, MA) antes del tratamiento (nivel inicial) y en los dias 3 y 5. Se ajustaron los niveles de calcio medidos para explicar las variaciones en pH desde pH 7.1.
La figura 15 muestra los niveles de calcio ionizado (mmo1/1) en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 gig/kg 5x por semana, aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente, fusi6n de synPTH-cadena pesada de RANKL-1 2 mg/kg semanalmente o fusiOn de synPTH-cadena
pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente. En ese experimento, los niveles de calcio ionizado en sangre en ratones huRANKL aumentaron significativamente en respuesta a inyecciones de PTH(1-34) 5x por semana. Inyecciones semanales de aRANKL-1 o bien 2 mg/kg o bien 10 mg/kg provocaron una ligera reducci6n en los niveles de calcio ionizado en sangre en ratones huRANKL, lo que concuerda con un efecto antirresorciOn de
aRANKL-1. Inyecciones semanales de fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg provocaron hipercalcemia modesta. Inyecciones semanales de fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg provocaron una hipercalcemia ligeramente mayor, pero no mayor que la hipercalcemia observada con inyecciones de PTH(1-34) humana 5x por semana.
La figura 15 tambi6n muestra los niveles de calcio ionizado en ratones silvestres tratados con vehiculo o con fusi6n
de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente. El anticuerpo aRANKL-1 no neutraliza RANKL murino, de modo que se espera que la fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 se comporte como PTH sola. De hecho, en ese experimento, la fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg provoc6 una
hipercalcemia significativamente mayor en ratones silvestres en comparacion con una dosis similar en ratones huRANKL. Esos resultados sugieren que los efectos neutralizantes de RANKL de aRANKL-1 eran importantes para controlar el catabolismo Oseo y reducir la hipercalcemia en ratones tratados con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1.
Se midieron los niveles de TRAP-5b en suero en el nivel inicial, 1 semana, 2 semanas y 3 semanas para evaluar el efecto de los diversos tratamientos sobre la resorciOn osea, tal como sigue. Se recogio sangre a cada punto de tiempo a partir de ratones anestesiados con isoflurano por via retroorbital en tubos separadores de suero Microtainea (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se dejO que la sangre se asentara a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos y luego se centrifug6 a 14.000 rpm a 4°C durante 10 minutos en una microcentrifuga de alta velocidad TOMY MRX-152 con un rotor de 24 pocillos TOMY TMA-6. Entonces se transfiriO el suero a un tubo eppendorf separado y se almaceno en un congelador a -80°C hasta que se analizO. Se midieron los niveles de TRAP-5b en suero usando un ensayo de actividad enzimatica inmunofijada en fase sOlida para
TRAP5b de ratan (SBA Sciences, Turku, Finlandia). Se sometieron a ensayo muestras de suero por duplicado, segtIn el protocolo del fabricante.
La figura 16 muestra los niveles de TRAP-5b en suero en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 jig/kg 5x por semana, aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente, fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL1 10 mg/kg semanalmente. La figura 16 tambien muestra-los niveles de TRAP-5b en suero en ratones silvestres tratados con vehiculo (PBS) o con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente. Ese experimento muestra que inyecciones 5x por semana de PTH(1-34) humana provocaron un aumento significativo en los niveles de TRAP-5b en ratones huRANKL. De manera similar, la inyecciOn semanal de fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg provoco un aumento significativo en los niveles de TRAP-5b en ratones silvestres
que tenian solo RANKL murino, que no se neutraliza mediante el anticuerpo aRANKL-1, tal como se comentO anteriormente.
Por el contrario, tal como se muestra en la figura 16, inyecciones semanales de aRANKL-1 provocaron una disminuciOn rapida y significativa en los niveles de TRAP-5b en ratones huRANKL. De manera similar, inyecciones semanales de fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 tambien provocaron una disminuci6n rapida y
significativa en los niveles de TRAP-5b en suero, lo que sugiere que la parte de aRANKL-1 de la molecula quimerica puede contrarrestar los efectos de synPTH sobre los niveles de TRAP-5b.
Se midieron los niveles de osteocalcina en suero en el nivel inicial, 1 semana, 2 semanas y 3 semanas para evaluar el efecto de cada tratamiento sobre la formaci6n 6sea, tal como sigue. Se recogi6 sangre y se aisle) el suero tal como se comentO anteriormente para la medici6n de los niveles de TRAP-5b. Se determinaron los niveles de osteocalcina
en suero usando un ensayo inmunorradiometrico (IRMA) especifico para osteocalcina intacta de ratOn (Immunotopics, Inc. San Clemente, CA). Se realizaron los analisis segiin el protocolo del fabricante.
La figura 17 muestra los niveles de osteocalcina en suero en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(134) humana 100 jig/kg 5x por semana, aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente; aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente, fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente o fusi6n de synPTH-cadena pesada de
aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente. La figura 17 tambien muestra los niveles de osteocalcina en suero en ratones silvestres tratados con vehiculo (PBS) o con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente.
En ese experimento, inyecciones 5x por semana de PTH(1-34) humana 100 j.tg/kg provocaron un aumento modesto pero significativo en la osteocalcina en ratones huRANKL. Inyecciones de aRANKL-1 semanales provocaron una
disminucion modesta pero significativa en la osteocalcina en suero en ratones huRANKL, lo que se debe probablemente a la supresion de la retroalimentaciOn secundaria a la inhibici6n de la resorcion &ea. lnyecciones semanales de fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg provocaron poco o ningun aumento en los niveles de osteocalcina en suero en ratones huRANKL, mientras que inyecciones semanales de fusiOn de synPTH
cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg provocaron el mayor aumento en la osteocalcina en suero en ratones huRANKL. Ese aumento era mayor que el aumento resultante de la inyecciOn de PTH(1-34) humana 100 p.g/kg en ratones huRANKL.
Densidad mineral 6sea
Semidi6 la densidad mineral Osea (BMD) de las vertebras lumbares (L1-L5), el femur/la tibia (femur completo y la mitad proximal de la tibia) y la tibia proximal en los ratones huRANKL y silvestres en el nivel inicial y a las semanas 1, 2 y 3 tras el tratamiento. Se midi6 la BMD en ratones anestesiados con isoflurano usando absortiometria de rayos
X de energia dual (DXA) (GE Lunar Piximusll, GE Lunar, Madison, WI).
Se presentan los datos del experimento como media ± error estandar (EEM). Se us6 analisis de la varianza de una via seguido por comparaciOn de Dunnett para determinar el efecto del tratamiento comparando ratones tratados con
PBS con ratones tratados con synPTH-aRANKL-1. Se calcularon los cambios en tanto por ciento en BMD desde el nivel inicial para los ratones tanto tratados con PBS como tratados con synPTH-aRANKL-1, y se compararon los cambios en tanto por ciento en los ratones tratados con sytiPTH-aRANKL-1 con los cambios en tanto por ciento en los ratones tratados con PBS. Valores de probabilidad < 0,05 se consideraron significativos.
Lafigura 18 muestra el cambio de BMD en tanto por ciento de las vertebras lumbares en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 tg/kg 5x por semana, aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente, fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente. La figura 18 tambien muestra el cambio de BMD en tanto por ciento de las vertebras lumbares en ratones silvestres tratados con vehiculo (PBS) o con fusion de
synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente. Se expresan los datos como cambio en tanto por
ciento en BMD a las 3 semanas con respecto a BMD en el nivel inicial (antes del tratamiento). No hubo cambio estadisticamente significativo en BMD en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS) o PTH(1-34) humana 5x por semana o cualquier dosis semanal de aRANKL-1. Por el contrario, el aumento en BMD encontrado en ratones huRANKL tratados con fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 semanalmente era
estadisticamente significativo. Tal como se esperaba, ratones silvestres tratados con fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 semanalmente no mostraron aumento en BMD en ese experimento, debido probablemente a que el RANKL murino no se neutraliza por aRANKL-1.
La figura 19 muestra la BMD de pata completa en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 tg/kg 5x por semana, aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente, fusi6n
de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente o fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL1 10 mg/kg semanalmente. La figura 18 tambien muestra el cambio de BMD en tanto por ciento de pata completa en ratones silvestres tratados con vehiculo (PBS) o con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg
semanalmente. Se expresan los datos como un cambio en tanto por ciento en BMD a las 3 semanas con respecto a la BMD en el nivel inicial (antes del tratamiento). No hubo ningim cambio estadisticamente significativo en BMD en ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS) o PTH(1-34) humana 5x por semana o cualquier dosis semanal de aRANKL-1. El aumento mostrado para la administraci6n semanal de fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL1 2 mg/kg no era estadisticamente significativo en ese experimento. Por el contrario, el aumento en BMD encontrado en ratones huRANKL tratados con fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente era
estadisticamente significativo. Tal como se esperaba, los ratones silvestres tratados con fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 semanalmente no mostraron aumento en BMD en ese experimento, debido probablemente a que el RANKL murino no se neutraliza por aRANKL-1.
Los datos mostrados en las figuras 18 y 19 sugieren que la BMD en ratones envejecidos no muestra un aumento estadisticamente significativo en respuesta a o bien la administraciOn diaria de PTH(1-34) 100 gg/kg o bien la administraciOn semanal de aRANKL-1 2 6 10 mg/kg solo. Sin embargo, la administraciOn semanal de fusi6n de
synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg da como resultado un aumento estadisticamente significativo en BMD de tanto vertebras lumbares como pata completa. La administraciOn semanal de fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg tambien puede aumentar la BMD.
Histomorfometria osea
Al final del estudio de tres semanas, se sacrificaron los ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34)
humana 100 ig/kg 5x por semana, aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente, fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL1 10 mg/kg semanalmente; y ratones silvestres tratados con vehiculo (PBS) o con fusiOn de synPTH-cadena pesada
de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente y se recogieron las tibias para histomorrometria estatica y dinamica.
Se fijaron las tibias en etanol al 70% y se limpiaron de miisculo y tejido blando. Se recorto longitudinalmente la parte
frontal de cada tibia, y se deshidrataron las tibias en concentraciones de etanol crecientes y luego se incrustaron en metacrilato de metilo. Se cortaron secciones frontales (4 p.m y 81.1m) usando un microtomo Leica modelo 2065 (Leica Instruments GmbH). Se realizaron analisis histomorfornetricos usando el software de analisis Oseo OsteoMeasureTm
(Osteometrics, Inc., Decatur, GA). Se analizaron metafisis proximales de las tibias. Se analizaron cuatro campos de cada tibia con 20X aumentos, usando un tamatio de campo de 350x350 jim (0,1225 mm2/campo). El area total de analisis era por tanto de 0,49 mm2 en cada secci6n.
Se usaron secciones teriidas con tricromo de Masson para el analisis estatico. Se midi6 el volumen de hueso
trabecular y entonces se normalizO con respecto al volumen tisular total mediante el metodo descrito en Kostenuik et aL Bone 34: 656 (2004). Se contaron el numero de osteoclastos y el numero de osteoblastos bajo el microscopio y se normalizaron con respecto a la superficie de hueso trabecular mediante el metodo descrito en Kostenuik et aL Bone 34: 656 (2004).
La figura 20 muestra las mediciones de volumen de hueso trabecular de la metafisis proximal de la tibia en ratones huRANKL. Los ratones huRANKL tratados con fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente mostraron un aumento estadfsticamente significativo en el volumen de hueso trabecular en ese experimento.
La figura 21 muestra las mediciones de la superficie de osteoclastos de la metafisis proximal de la tibia en ratones huRANKL. Los ratones huRANKL tratados con PTH(1-34) humana 100 jig/kg 5x por semana mostraron un aumento estadfsticamente significativo en el porcentaje de superficie de osteoclastos con respecto a ratones huRANKL tratados con vehlculo (PBS). Los ratones huRANKL tratados con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 mostraron una disminucion estadfsticamente significativa en el porcentaje de superficie de osteoclastos con respecto a ratones tratados con PTH(1-34), lo que sugiere que aRANKL-1 puede contrarrestar los efectos estimuladores de osteoclastos PTH(1-34). Los ratones huRANKL tratados con o bien aRANKL-1 10 mg/kg o bien fusi6n de synPTH
cadena pesada de aRANKL-1 no mostraron una disminuciOn estadfsticamente significativa en el porcentaje de superficie de osteoclastos con respecto a vehlculo (PBS) solo tal como se determine) mediante la prueba de Tukey Kramer o Dunnett.
La figura 22 muestra las mediciones de la superficie de osteoblastos de la metafisis proximal de la tibia en ratones huRANKL. Los ratones huRANKL tratados con PTH(1-34) humana 100 p.g/kg 5x por semana mostraron un aumento estadfsticamente significativo en el porcentaje de superficie de osteoblastos con respecto a ratones huRANKL tratados con vehlculo (PBS), aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1.
Se usaron secciones de tibias no tetiidas para el analisis dinamico. Se midieron la longitud y el intervalo del marcador de tetraciclina y calcina. Se calcule) la tasa de formaciOn Osea a partir de las mediciones de longitud e intervalo del marcador de tetraciclina y calcina usando el metodo descrito en Parfitt et al. J. Bone Mineral Res. 2:
595-610 (1987).
La figura 23 muestra la tasa de formacion Osea de ratones huRANKL. Los ratones huRANKL tratados con o bien PTH(1-34) humana 100 p.g/kg 5x por semana o bien fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente mostraron un aumento estadfsticamente significativo en la tasa de formaci6n Osea con respecto a ratones huRANKL tratados sOlo con vehfculo (PBS). Los ratones huRANKL tratados con aRANKL-1 2 mg/kg o 10 mg/kg semanalmente mostraron una disminucion en la tasa de formaciOn Osea con respecto a vehfculo, mientras que los ratones tratados con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente no mostraron ni un aumento estadfsticamente significativo ni una disminuciOn en la tasa de formaci6n 6sea con respecto a vehfculo. Estos resultados sugieren que el tratamiento semanal con fusion de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg da como resultado un aumento comparable en la formaciOn osea que el tratamiento con PTH(1-34)
humana 100 jag/kg 5x por semana. Sin embargo, el tratamiento con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg no aumenta significativamente el porcentaje de superficie de osteoclastos u osteoblastos, a diferencia del tratamiento con PTH(1-34) humana 100 rig/kg 5x por semana. \Manse las figuras 21 y 22.
Tomooraffa microcomputarizada (microCT)
Se analizO la porosidad cortical en secciones transversales de la diafisis media femoral en ratones huRANKL y
silvestres. La figura 24 muestra la microCT de la diafisis femoral de ratones huRANKL tratados con vehlculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 p.g/kg 5x por semana, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente; y ratones silvestres tratados con vehfculo (PBS) o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 2 mg/kg semanalmente. La administraci6n de PTH(1-34) humana dio como resultado la apariciOn de porosidad endocortical en ratones huRANKL (indicado por una flecha en el panel izquierdo dela figura 24), mientras que ni la administracion semanal de aRANKL-1 o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 dio como resultado porosidad endocortical en ratones huRANKL. Por el contrario, la administracion semanal de fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 en ratones silvestres dio como resultado porosidad endocortical (indicado por una flecha en el panel derecho de la figura 24). Ese resultado se debe probablemente a la incapacidad de aRANKL-1 para neutralizar RANKL murino, de modo que la fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 actefa como PTH(1-34) humana sola. Estos resultados sugieren que PTH sola da como resultado porosidad cortical, que puede estar asociada con una reducciOn de la resistencia del hueso. Estos resultados tambien sugieren que aRANKL-1 reduce o previene la porosidad cortical provocada por PTH.
Se examinaron vertebras L6, tibias izquierdas y fernures izquierdos con un sistema de micro-CT eXplore MS (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin, EE.UU.). Se colocaron los huesos en criotubos de 2 ml con un fantasma de densidad (SB3; proporcionado con el sistema de micro-CT eXplore MS), se Ilenaron los tubos con PBS y se estabilizaron los huesos en los tubos con una gasa. Se exploraron los huesos con un sistema de micro-CT eXplore
MS, que usa la tecnologia Conebeam volumetrica, a rotaciones de 0,5° durante 200° a 80 kVp y 80 gA, calibrado con el fantasma de densidad. Se reconstruyeron los datos para producir imagenes con un tamafio de voxel de 18 gm x 18 gm x 18 gm.
Se analizaron regiones de interes para determinar los parametros de densidad y morfornetricos corticales y trabeculares usando software de andlisis (GEMS MicroView). Se analizO el 10% central (en longitud) de la didfisis
del femur para determinar la densidad mineral de la matriz osea cortical (BMMD) y el area cortical promedio. Se generaron perimetros de endostio y periostio en la secci6n media usando Image-J (NIH). Se aislaron regiones de hueso trabecular de las vertebras L6, tibia proximal y femur distal y se analizaron para determinar la BMD y parametros de estereologia, incluyendo la fracciOn de volumen 6seo (BV/TV).
Se generaron las imagenes para todas las exploraciones usando representacion tridimensional de superficie con un
umbral basado en el fantasma de densidad para cada exploraciOn (30% de la densidad mimetica del hueso para hueso trabecular (320 mg/ml), 60% de la densidad mimetica del hueso para hueso cortical (640 mg/mI)). Se determinaron estos niveles de umbral usando tecnicas histomorfometricas dentro del software (GEMS MicroView), y eliminaron el sesgo de las exploraciones individuales.
La figura 25 muestra los resultados de microCT para las vertebras L6 de ratones huRANKL tratados con vehiculo
(PBS), PTH(1-34) humana 100 gg/kg 5x por semana, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente o fusiOn de synPTHcadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente. Los ratones huRANKL tratados con o bien aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente o bien fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente muestran un aumento en la masa de hueso trabecular en comparaciOn con ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS).
La figura 26 muestra los resultados de microCT para las tibias proximales izquierdas de ratones huRANKL tratados
con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 gg/kg 5x por semana, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente o fusi6n de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente. Los ratones huRANKL tratados con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente mostraron un aumento significativo en la densidad Osea en comparaciOn con ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS). Los ratones huRANKL tratados con PTH(1-34) humana 100 gg/kg 5x por semana o aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente mostraron un aumento moderado en
la masa de hueso trabecular en comparaciOn con ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS).
La figura 27 muestra los resultados de microCT para los femures distales izquierdos de ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS), PTH(1-34) humana 100 gg/kg 5x por semana, aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente o fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente. Los ratones huRANKL tratados con fusiOn de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente mostraron un aumento significativo en la densidad
osea en comparaciOn con ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS). Los ratones huRANKL tratados con aRANKL-1 10 mg/kg semanalmente mostraron un aumento moderado en la masa de hueso trabecular en comparaciOn con ratones huRANKL tratados con vehiculo (PBS).

Claims (74)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Molecule quimerica del anticuerpo frente al activador del receptor de ligando de NF-KB (RANKL)-hormona paratiroidea/proteina relacionada con la hormona paratiroidea (PTH/PTHrP), que comprende:
    (a) un anticuerpo que se une a RANKL; y
    (b)un primer peptido de PTH/PTHrP;
    en la que el peptido de PTH/PTHrP este unido covalentemente al anticuerpo, y en la que la molecule
    quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP (i) inhibe la uni6n de RANKL a un activador del
    receptor de NF-KB (RANK) y (ii) se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2.
  2. 2. Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 1, en la que el
    anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 92% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 11.
  3. 3. Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn la reivindicacien 1 o la reivindicaciOn 2, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la
    quela cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 90% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 12.
  4. 4. Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la
    que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 95%con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 11.
  5. 5.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seg6n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 95% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 12.
  6. 6.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicacionesi a 5, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 99% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 11.
  7. 7.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seg6n cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    6,en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 99% con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 12.
  8. 8.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    7, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la quela cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 11.
  9. 9.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seg6n cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    8, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 12.
  10. 10.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 1, en la que el
    anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y en la que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 2 desde el residuo 20 hasta el residuo 467, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 4 desde el residuo 21 hasta el residuo 235.
  11. 11. Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    10,en la que el primer peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP que se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2.
  12. 12.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el primer peptido de PTH/PTHrP este unido covalentemente a una cadena pesada.
  13. 13.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,en la que el primer peptido de PTH/PTHrP este unido covalentemente a una cadena ligera.
  14. 14.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    9, en la que el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo Fab, 79
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    un anticuerpo Fab', un anticuerpo F(ab')2, un anticuerpo frente a dominio, un nanocuerpo, un minicuerpo, un maxicuerpo y un diacuerpo.
  15. 15.
    Moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademds un segundo peptido de PTH/PTHrP, en la que los peptidos de PTH/PTHrP primero y segundo son iguales o diferentes.
  16. 16.
    Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 15, en la que el segundo peptido de PTH/PTHrP comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP que se une a un receptor PTH-1 y/o a un receptor PTH-2.
  17. 17.
    Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 15, en la que el anticuerpo que se une a RANKL comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y en la que el primer peptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente a la cadena ligera y el segundo peptido de PTH/PTHrP esta unido covalentemente a la cadena pesada.
  18. 18.
    Moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el anticuerpo es completamente humano.
  19. 19.
    Moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP seleccionado de los polipdptidos de fOrmula I:
    11x12Kx14x15x16x17x18x19R x21x22x23x24x25x26x27x28xC
    XNHX19X
    (FOrmula I; SEQ ID NO: 13)
    en la que:
    X3x4x5x6x7, x2x3x4x5x6x7, x1x2x3x4x5x6x7 yxi x2 x3x4x5x6x7;
    X" esta ausente o es
    x10, x11, x12, x14 a
    X1 a X7, X28son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
    x29x30, x29x30x31 x29x30x31x32, x29x30x31x32x33, x29x30x31x32x33x34,
    Xc esta ausente o es X29
    x29x30x31x32x33x34x35 x29x30x31 x32 x33x34x36x36;
    o X29 a X36 son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
    siempre que uno o mds de x14 a X36 sean un residuo de cisteina; y en la que el peptido de PTH/PTHrP se une a un receptor PTH-1 o a un receptor PTH-2.
  20. 20. Moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 19, en la que:
    XNes X1X2X3X4X5X6X7; X1 es un residuo hidrofilo o no funcional; X2 es V; X3 es S; X4 es E;
    X5 es un residuo no funcional o bdsico; X6 es Q; X7 es L; X113 es un residuo acido o hidnifilo; X11 es un residuo no funcional o basico;
    X12 es un residuo no funcional; X14 es un residuo basico o hidrOfilo; X15 es un residuo no funcional;
    X16 es un residuo no funcional o hidrOfilo;
    X17 es un residuo acido, hidrOfilo o no funcional; X18 es un residuo no funcional; X19 es un residuo acid° o basico;
    5 X21es un residuo no funcional o basico; X22 es un residuo hidrofilo, dcido o aromdtico; X23 es un residuo aromatic° o lip6filo; X24 es un residuo lip6filo; X25 es un residuo hidrOfilo o basico;
    10 X26es un residuo hidrOfilo o basico; X27 es un residuo lip6filo, basic° o no funcional; y X28 es un residuo lip6filo o no funcional, en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos,
    basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son 15 igualeso diferentes.
  21. 21. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 19 6 20, en la que:
    x30x31 x32 x33x34,
    Xc es X29 X29 es un residuo hidrOfilo o no funcional; X3° es un residuo hidrOfilo o dcido;
    20 X3'es un residuo lipofilo o no funcional;
    X32 es H;
    X33 es una cisteina o un residuo hidrOfilo; y
    X34 es un residuo no funcional o aromatic°,
    en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, 25 basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
  22. 22. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 19 6 20, en la que: Xc es X29X30X31; X29 es un residuo hidrofilo o no funcional;
    30 X3°es un residuo hidrOfilo o acido; y X31 es un residuo lipofilo o no funcional, en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos,
    basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes. 35 23. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 19 6 20, en la que: Xc es X29X30; X29 es un residuo hidrOfilo o no funcional; y
    X3° es un residuo hidrofilo o acid°,
    en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, 40 basicosy aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son
    iguales o diferentes.
  23. 24. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 19 6 20, en la que: Xc es X29; y X29 es un residuo hidrofilo o no funcional,
    5 enla que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
  24. 25. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en la que al menos uno de X27 y X33 es cistelna.
    10 26. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segim la reivindicaciOn 19 6 20, en la que Xc esta ausente.
  25. 27. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn la reivindicaciOn 19, en la que: X1 es A, S o Y; X5 es H 01;
    15 X16es N o D; X11 es L, R o K; X12 es G, F o W; X14 es H o S; X15 es L o I;
    x16es Q,
    20N, S o A; X17 es S, D o L; X18 es M, L, V o Nle;
    X19 es E o R; X21 es V, M, R o Nle;
    25 X22es E o F; X" es W o F; X25 es R o H; X26 es K o H; X27 es C; y
    30 X28es L o I.
  26. 28. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segim la reivindicaciOn 27, en la que: Xc es X28X38X31X32X33X34;
    X28 es Q o A; X3° es D o E;
    35 X31 es V o I; X33 es C; X34 es N o T; y X35 es A, F o Y.
  27. 29. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 27, en la que:
    Xc es X29X35X31;
    X29 es Q o A;
    X35 es D o E; y
    5 X31es V o I;
  28. 30. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 27, en la que: Xc es X29X30; X29 es Q o A; y X3° es D o E.
    10 31. Moldcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn la reivindicaciOn 27, en la que:
    Xc es X29; y
    X29 es Q o A.
  29. 32. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 27, en la que Xc estd ausente.
    15 33. Molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP seleccionado de polipeptidos de fOrmula II:
    jNy JEIHN jil j12KHul6s j18 j19,21
    ..
    11J EWLRKKLJc
    (FOrmula II; SEQ ID NO: 14)
    20 enla que: Ji j2 J3 ja j5 j2j3 j4 j5j6 0 j3 j4j5 j6;
    J" esta ausente o es J1 a J8, J12, J16, j18 .21
    y J son cada uno residuos de aminodcido seleccionados independientemente; es un residuo no funcional o basico; J19 es un residuo acid° o basico;
    29, j29 j30, J29 J30 j31, j29 j30 J31 j32, j29 J30 J31 j32 J33 j29 J30 J31 j32 j33 J34;
    25 Jcesta ausente o es J J29 a 24 son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente; siempre que uno o mas de J14 al residuo del extremo C-terminal del dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP
    sean un residuo de cisterna; en la quo el peptido de PTH/PTHrP se une a un receptor PTH-1 o a un receptor PTH-2, 30 enla quo el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
  30. 34. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 33, en la que: J" es J1J2J3J4J5J6,
    35 J1es un residuo no funcional o aromatico; J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrOfilo; J4 es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional;
    J6 es un residuo basico;
    J7 es un residuo no funcional o arornatico;
    J8 es un residuo no funcional;
    J12 es un residuo no funcional o arornatico;
    J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo;
    J18 es un residuo no funcional;
    J21 es un residuo no funcional;
    J2920212223,134;
    Jc es J29 es un residuo hidrOfilo o no funcional;
    10 J39es un residuo hidrOfilo o acido; J31 es un residuo lipotho o no funcional; J32 es un residuo basico; J33 es un residuo acido; y J34 es un residuo arornatico.
    15 35. Molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segCin la reivindicackin 34, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V; J3 es S; J4 es E;
    20 J5es I; J6 es Q; J7 es L o F; J8 es M o Nle; J11 es L, R o K;
    25 J12es G o W; J16 es N, So A; J18 es M, Me, L o V; J19 es E o R;
    s
    e V, M o Nle;
    30 J29es Q o A; J39 es D o E; J31 es V o I; J32 es H; J33 es N; y
    35 J34es F o Y.
  31. 36. Molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 33, en la que:
    J" es J1J2J3J4J5J6; 84
    J1 es un residuo no funcional o arornatico;
    J2 es un residuo no funcional;
    J3 es un residuo hidrofilo;
    J4 es un residuo acido;
    5 J5es un residuo no funcional; J6 es un residuo basico; J7 es un residuo no funcional o arornatico; J8 es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o arornatico;
    10 J16es un residuo no funcional o hidrOfilo; J18 es un residuo no funcional; J21 es tin residuo no funcional; Jc es J29J39J31; J29 es un residuo hidrofilo o no funcional;
    15 J39es un residuo hidrOfilo o acido; y J31 es un residuo lipotho o no funcional.
  32. 37. MolOcula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 36, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V;
    20 J3es S; J4 es E; J5 es I; J6 es Q; J7 es L o F;
    25 J8es M o Nle; J11 es L, R o K; J12 es G o W; J16 es N, S o A;
    esrtii,
    Nle, L o V;
    30 J19es E o R; J21 es V, M o Nle; J29 es Q o A; J39 es D o E; y J31 es V o I.
    35 38. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 33, en la que: SI es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o arornatico;
    85
    J2 es un residuo no funcional;
    J3 es un residuo hidrOfilo;
    J4 es un residuo acido;
    J5 es un residuo no funcional;
    5 J6es un residuo basico; J7 es un residuo no funcional o arornatico; J8 es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o arornatico; J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo;
    10 J18es un residuo no funcional; J21 es un residuo no funcional; Jc es J29J3°; J29 es un residuo hidrofilo o no funcional; y J3° es un residuo hidrofilo o acido. 15 39. Molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 38, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V; J3 es S; J4 es E;
    20 J5es I;
    J6 es Q;
    J7 es L o F; J8 es M o Nle; J11 es L, R o K;
    25 J12es G o W; J16 es N, S o A; J18 es M, Nle, L o V; J19 es E o R; J21 es V, M o Nle;
    30 J29es Q o A; y J3° es D o E.
  33. 40. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 33, en la que: J" es J1J2J3J4J5J6; J1 es un residuo no funcional o aromatico;
    35 J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrOfilo; J4 es un residuo acido;
    86
    10
    15
    20
    25
    30
    J5 es un residuo no funcional;
    J6 es un residuo bdsico;
    J7 es un residuo no funcional o arornatico; J8 es un residuo no funcional;
    J12 es un residuo no funcional o arornatico; J16 es un residuo no funcional o hidrOfilo; J18 es un residuo no funcional; J21 es un residuo no funcional; Jc es J29; y
    J29es un residuo hidrofilo o no funcional.
  34. 41. Molecula quirnerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtin la reivindicacion 40, en la que:
    J1 es A, S o Y; J2 es V; J3 es S;
    J4es E; J5 es I; J6 es 0; J7 es La F; J8 es M o Nle;
    J11es L, R o K; J12 es G o W; J16 es N, S o A; J18 es M, Nle, L o V; J19 es E o R;
    J21es
    V, M o Nle; y J29 es Q o A.
  35. 42. Molecula quirndrica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 33, en la que:
    1 j2 j3 j4 J5 j6;
    J" es J
    J1 es un residuo no funcional o arornatico;
    J2 es un residuo no funcional; J3 es un residuo hidrOfilo; J4 es un residuo acido; J5 es un residuo no funcional; J6 es un residuo basico;
    J7es un residuo no funcional o arornatico; J8 es un residuo no funcional; J12 es un residuo no funcional o arornatico;
    J16 es un residuo no funcional o hidrofilo;
    J18 es un residuo no funcional;
    J21 es un residuo no funcional; y
    Jc esta ausente.
    5 43. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicackin 42, en la que: J1 es A, S o Y; J2 es V; J3 es S;
    J4 es E; 10 J5es I;
    J6 es Q;
    J7 es L o F;
    J8 es M o Nle;
    J11 es L, R o K;
    15 J12es G o W;
    J16 es N, S o A;
    J18 es m Nle, L o V;
    J19 es E o R; y
    J21 es V, M o Nle.
    20 44. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP seleccionado de polipeptidos de formula III: oNLHo10011012Ksi015016017LFIRRF023LHHLI0c (Formula III; SEQ ID NO: 15)
    25 enla que:
    04050607,
    01 020304050607, 020304050607, 0304050607,
    ON esta ausente o es Y01020304050607,
    050607, 05_7
    U 07;
    01 a 07, o'° a o12, 015 a 017 y 023 son cada uno residuos de aminoacido seleccionados independientemente;
    029030, 029030031 029030031032, 029030031032033, 029030031032033034,
    30 Ocesta ausente o es 029
    029030031032033034036 U 026030031032033034036036;
    029 a 036 son cada uno independientemente residuos de aminoacido; 014
    siempre que uno o mas de al residuo del extremo C-terminal del dominio de modulacion de PTH/PTHrP sean un residuo de cisteina; y
    35 enla que el peptido de PTH/PTHrP se une a un receptor PTH-1 o a un receptor PTH-2.
  36. 45. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 44, en la que: ON es 07; 07 es un residuo no funcional;
    010
    es un residuo acid° o hidrofilo;
    011 es un residuo basic° o no funcional;
    012 es un residuo aromatic° o no funcional; 015 es un residuo hidrOfilo o no funcional; 016 es un residuo hidrofilo;
    017es un residuo acid° o no funcional;
    023 es un residuo aromatico; y
    Oc esta ausente,
    en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son
    igualeso diferentes.
  37. 46. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 44, en la que: ON es 01020304050607; 01 es un residuo de aminoacido no funcional; 02 es un residuo de aminoacido no funcional;
    03es un residuo de aminoacido hidrOfilo; 04 es un residuo de aminoacido acido; 05 es un residuo de aminoacido basic° o no funcional; 06 es un residuo de aminoacido hidrOfilo; 07 es un residuo no funcional;
    010
    es un residuo acid° o hidnifilo;
    011 es un residuo basic° o no funcional;
    012 es un residuo aromatic° o no funcional;
    015 es un residuo hidrOfilo o no funcional;
    016 es un residuo hidrOfilo;
    017es un residuo acid° o no funcional; y
    023 es un residuo aromatic°,
    en la que el residuo no funcional es un residuo de aminoacido en forma D o L que carece de grupos acidos, basicos y aromaticos cuando se incorpora en un polipeptido entre dos residuos de aminoacido que son iguales o diferentes.
  38. 47. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segiln la reivindicaciOn 44, en la que: 01 es A; 02 es V; 03 es S; 04 es E;
    05es H o I;
    06 es Q;
    07 es L;
    010
    es N o D;
    011 es K o L;
    012 es G, F o W;
    015 es I o S;
    016 es Q o N;
    017 es D o L;
    023 es F o W.
  39. 48. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segOn cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio de modulacion de PTH/PTHrP, en la que el dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP comprende:
    a)una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 16 a 89; o
    b) una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 90 a 107 excepto porque uno o mas residuos en la posicion 14 al extremo C terminal del dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP estan sustituidos por un residuo de cisteina.
  40. 49. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtin cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    48,en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende un dominio pre-pro y un dominio de modulaciOn de PTH/PTHrP, en la que el dominio pre-pro comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 188 a 207.
  41. 50.
    Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicaciOn 49, en la que el
    dominio pre-pro comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 188 y el dominio de modulaciOn dePTH/PTHrP comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 22.
  42. 51.
    Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segtIn cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    18, en la que el peptido de PTH/PTHrP primero y/o segundo comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285.
  43. 52.
    Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP seleccionada de:
    (a)una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 desde el residuo 20 hasta el residuo 467 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285;
    (b) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer
    polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 desde el residuo 32 hasta el residuo 518 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 desde el residuo 21 hasta el residuo 235; y
    (c) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 desde el residuo 32 hasta el
    residuo518 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285.
  44. 53. Molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun la reivindicacion 1, seleccionada de:
    (a) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de
    SEQID NO: 11 y un segundo polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 desde el residuo 32 hasta el residuo 285; y
    (b) una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que comprende un primer polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 desde el residuo 32 hasta el residuo 518 y un segundo polipeptido que tiene una cadena ligera de anticuerpo que comprende una
    secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12.
  45. 54.
    PolinucleOtido que codifica para una molecula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53.
  46. 55.
    Vector que comprende un polinucleOtido que codifica para una molocula quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP sew:in cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53.
  47. 56.
    Celula huesped que comprende el vector segun la reivindicaciOn 55.
  48. 57.
    Metodo de producciOn de una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP que
    comprende cultivar la celula huesped segun la reivindicaciOn 56.
  49. 58.
    ComposiciOn farmaceutica que comprende una molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL
    5
    PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53.
  50. 59.
    Uso de la composicion farmaceutica segun la reivindicaciOn 58 para la preparaciOn de un medicamento
    para tratar la perdida Osea en un paciente.
  51. 60.
    Uso segun la reivindicaciOn 59, en el que el medicamento comprende edemas at menos un agente
    terapeutico seleccionado de anakinra, etanercept, infliximab, adalimumab y metotrexato.
  52. 61 .
    Uso segun la reivindicaciOn 59, en el que el medicamento comprende edemas al menos un anticuerpo
    terapeutico seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un apticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo
    frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente at receptor de vegF, un anticuerpo frente
    al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un anticuerpo frente al receptor del
    factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a CDC33.
    1 5
    62. Uso segun la reivindicaciOn 59, en el que el medicamento comprende edemas al menos un agente
    seleccionado de un agente contra la resorci6n 6sea, un agente anabOlico 6seo, un agente antiinflamatorio,
    un agente inmunosupresor y un agente de terapia contra el cancer.
  53. 63.
    Uso segun la reivindicacion 62, en el que at menos un agente de terapia contra el cancer se selecciona de
    un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de
    vegF, un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor
    de dispersion (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor
    del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor
    de crecimiento similar a insulina (IGFR), un inhibidor de glicoproteinas similares a mucina, un inhibidor de
    CDC20 y un inhibidor de CDC33.
    25
    64. Uso segtin la reivindicaciOn 59, en el que el medicamento comprende edemas at menos un agente
    terapeutico seleccionado de un factor morfogenetico oseo, factor de crecimiento transformante 13 (TGF-I3),
    un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1ra, anakinra, un inhibidor de INFa, un receptor de TNFa soluble,
    etanercept, un anticuerpo anti-TNFa, infliximab, adalimumab, una prostaglandina, un bisfosfonato,
    alendronato, fluoruro, calcio, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un inhibidor de COX-2,
    celecoxib, rofecoxib, un inmunosupresor, metotrexato, leflunomida, un inhibidor de serina proteasa, un
    inhibidor de la proteasa de leucocitos secretores (SLPI), un inhibidor de IL-6, un anticuerpo frente a IL-6, un
    inhibidor de IL-8, un anticuerpo frente a IL-8, un inhibidor de IL-18, una proteina de uniOn a IL-18, un
    anticuerpo frente a IL-18, un modulador de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE), un factor de
    crecimiento de fibroblastos (FGF), un modulador de FGF, un antagonista de PAF, un factor de crecimiento
    35
    de queratinocitos (KGF), una molecule relacionada con KGF, un modulador de KGF; un modulador de
    metaloproteinasa de matriz (MMP), un modulador de la &cid° nitric° sintasa (NOS), un modulador del
    receptor de glucocorticoides, un modulador del receptor de glutamato, un modulador de los niveles de
    lipopolisacdridos (LPS), una noradrenalina, un mimetic° de noradrenalina y un modulador de noradrenalina.
  54. 65.
    Uso segun la reivindicacion 59, en el que la perdida Osea esta asociada con al menos un estado
    seleccionado de un estado inflamatorio, un estado autoinmunitario, artritis reumatoide y cancer.
  55. 66.
    Uso segtin la reivindicaciOn 59, en el que la perdida osea este asociada con cancer, y en el que el
    medicamento comprende edemas al menos un agente terapeutico seleccionado de un inhibidor del receptor
    del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de vegF, un inhibidor del
    receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un
    45
    inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor del receptor del factor de
    crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a
    insulina (IGFR), un inhibidor de glicoproteinas similares a mucina, un inhibidor de CDC20 y un inhibidor de
    CDC33.
  56. 67.
    Uso segtin la reivindicacion 59, en el que la perdida Osea esta asociada con cancer, y en el que el
    medicamento comprende edemas at menos un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un
    anticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente
    al receptor de vegF, un anticuerpo frente at factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion
    (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo
    frente a CDC33.
    55
    68. Uso segun la reivindicaciOn 59, en el que la perdida 6sea esta asociada con cancer, y en el que el
    medicamento es para la administracien con al menos un agente de terapia contra el cancer seleccionado de
    radioterapia y quimioterapia.
  57. 69.
    Molecule quimerica de anticuerpo frente a RANKL-PTH/PTHrP segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 o la composiciOn farmaceutica segiin la reivindicaciOn 54 para su uso en el tratamiento de pOrdida 6sea en un paciente.
  58. 70.
    ComposiciOn farmacOutica para su uso segun la reivindicacion 69, en la que la composici6n comprende edemas al menos un agente terapeutico seleccionado de anakinra, etanercept, infliximab, adalimumab y metotrexato.
  59. 71.
    Composici6n farmaceutica para su uso segtIn la reivindicaciOn 69, en la que la composici6n comprende edemas al menos un anticuerpo terapeutico seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un anticuerpo frentea CDC20, un anticuerpo frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente al receptor de vegF, un anticuerpo frente al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a
    CDC33.
  60. 72. ComposiciOn farmaceutica para su uso segun la reivindicaciOn 69, en la que la composici6n comprende
    edemasal menos un agente seleccionado de un agente contra la resorci6n Osea, un agente anabOlico dose°, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor y un agente de terapia contra el cancer.
  61. 73. ComposiciOn farmaceutica para su uso segun la reivindicaciOn 72, en la que el al menos un agente de terapia contra el cancer se selecciona de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de vegF, un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factorde crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersion (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), un inhibidor
    de glicoproteinas similares a mucina, un inhibidor de CDC20 y un inhibidor de CDC33.
  62. 74. Composici6n farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 69, en la que la composici6n comprende
    edemasal menos un agente terap6utico seleccionado de un factor morfogenetico 6seo, factor de crecimiento transformante f (TGF-13), un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1ra, anakinra, un inhibidor de TNFa, un receptor de INFa soluble, etanercept, un anticuerpo anti-TNFa, infliximab, adalimumab, una prostaglandina, un bisfosfonato, alendronato, fluoruro, calcio, un tarmac° antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un inhibidor de COX-2, celecoxib, rofecoxib, un inmunosupresor, metotrexato, leflunomida, un
    inhibidor de serina proteasa, un inhibidor de la proteasa de leucocitos secretores (SLPI), un inhibidor de IL6, un anticuerpo frente a IL-6, un inhibidor de IL-8, un anticuerpo frente a IL-8, un inhibidor de IL-18, una proteina de uniOn a IL-18, un anticuerpo frente a IL-18, un modulador de la enzima convertidora de
    interleucina-1 (ICE), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un modulador de FGF, un antagonista de PAF, un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), una molecule relacionada con KGF, un
    modulador de KGF; un modulador de metaloproteinasa de matriz (MMP), un modulador de la Oxido nitric° sintasa (NOS), un modulador del receptor de glucocorticoides, un modulador del receptor de glutamato, un modulador de los niveles de lipopolisacdridos (LPS), una noradrenalina, un mimetic° de noradrenalina y un modulador de noradrenalina.
  63. 75. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicaciOn 69, en la quo la perdida ()sea esta asociada
    conal menos un estado seleccionado de un estado inflamatorio, un estado autoinmunitario, artritis reumatoide y cancer.
  64. 76. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 69, en la quo la perdida osea esta asociada con cancer y la composicion comprende edemas al menos un agente terapeutico seleccionado de un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermic° (EGFR), un inhibidor de HER2, un inhibidor de
    vegF,un inhibidor del receptor de vegF, un inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersi6n (SF), un inhibidor de c-Met, un inhibidor de angiopoyetina, un inhibidor de Tie2, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGFR), un inhibidor de glicoproteinas similares a mucina, un inhibidor de CDC20 y un inhibidor de CDC33.
  65. 77. Composici6n farmaceutica para su uso segun la reivindicaciOn 69, en la quo la perdida Osea esta asociada con cancer y en la que la composici6n comprende edemas al menos un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo frente a Her2, un anticuerpo frente a CDC20, un anticuerpo frente a EGFR, un anticuerpo frente a vegF, un anticuerpo frente al receptor de vegF, un anticuerpo frente al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersiOn (SF), un anticuerpo frente al receptor del factor de crecimiento
    similara insulina (IFGR) y un anticuerpo frente a CDC33.
  66. 78. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 69, en la quo la perdida 6sea esta asociada con cancer y en la quo la composicion es para la administracion con al menos un agente de terapia contra el cancer seleccionado de radioterapia y quimioterapia.
    FIGURA 1
    ADNc de la cadena pesada de aRANKL-1 blen denominado a0PGL-1)
  67. 3. TOGAGT TTGGGACTGG CTGGCTTTTT CTA AAAAGG
    61 TGT GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC GGGGGTC
    121 CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCirdTGGATT CACCTTTAGC AGCTATGCCA TGAGCTGOGT
    181 CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCTCAGGT ATTACTGGGA GTGGTGGTAG
    241 TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC .TCCAGAGACA ATTCCAAGAA
    301 CACGCTOTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTAT ATTACTGTGC
    361 GAAAGATCCA GGGACTACGG TGATTATGAG TTOGTTCGAC cccTcopocc AGGGAACCCT
    421 GGTCACCGTC TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCGOTC TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC
    481 CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGOCCCT'GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA
    541 ACCGOTOACG GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GOCOTOCACA CCTTCCCAGC
    601 TGTCCTACAG TCCTCAGGAC TCTACTCCCT ,CAGCASCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA
    661 CTTOGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGI: AGATCA.CAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA
    721 CAAGACAGTT GAGCGCAAAT'GTTGTGTCGA.GTGCCCACCG TGCCCAGCAC CACCTGTGGC
    781 AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGOIAC
    841 CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACC6CGAGG TCCAGTTCAA
    901 CTGOTACGTG GACOGCGTGG AGGT3CATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT
    961 CAACAGCACG TTCCUTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT GGCTGAACGG
    1021 CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT 1081 CTCCAAAACC'AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCOGGA 2141 GGAGATGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAOCGA 1201 CATCGCCGTG .GAGTGGGA, GA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AAcTACAAOA CCACACCTCC 1261 CATGCTGGAC TCCGACl2GCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAOCAO 1321 GaGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA 1381 CACGCAGAAGAacercricce TGTCTCCOGG TAAATGATAA OTCGAC (SEQ ID NO 1)
    FIGURA 2
    Secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de aRANKL-1 (tamblen denominado a0PGL-1)
    •
    I MEFdliSWIAFL VAILROVQOE WALESGGGI, VOGGSLNI, CAASGFTFSS YAMSWVKAP , 61 GXGLE78GI TOSOGSTWA DsvioRms NDNSICNTINI, QNNSLRAEDT AVYYCAXDPG 121 TTVIMSWFDP NGOGTINTvs Sestkgpsvi plipcsrsts, estaalgclv kdyfpepvtv 181 zwnsgaltsg vhtfpavlqa sglys?:ssvv tvyssnfgtq tytcnvdhkp sntkvdktve
    241 rkocvecypo papvagpsv 'flfppkpkdt lmiertpevt cvvvdvshed pevqfnwyvd 301 gvevhnaktkpreeqfnatf rVvevltvVh cadvangkeyk ckvsnkglpa.piektisktk,
    ,361 gqprepqvyt,ippereemtk nvqsltclvk gfypsdiave wesngqpenn ykttppmIds 421 dgsfflyskl tvdkerwqqg nvfsCsvmhe 'alhnhytqks: lielspgk (MQ ID NO: 2)
    ■
    • F16\URA 3
    ADNc de la cadena ligera kappa de aRANKL-(tambien denominado a0PGL-1)
    1 TCTAGACCAC CATGGAAACC
    61 ATACCACOGG AGAAATTGTG 221 AAAAGGCCAC.CCTCTCCTGT 181 ACCAGCAGAA ACCTGGCCAG 241 CTGGCATCCCAGACAGGTTC 301 GCAGACTGGA GCCTGAAGAT 361 GGACGTTCGG CCAAGGGACC 421 TCATCTTCCC GCCATCTGAT 481 TGAATAACTT CTATCCCAGA, 541 CGGGTAACTC CCAGGAGAGT 601 GCAGCACCCT GACGCTGAGC
    1 TCACCCATCA aGGCCTGAGC 721 AAGTCGAC
    CCAGCGCAGC TTGACGCAGT AGGaCCAGTC GCTCCCAGGC AGTGGCAGTG TTTGCAGTGt AAGGTGGAAA GAGCAGTTGA GAGGCCAAAG GTCACAGAGC AAAGCAGACT TCGCCCGTCA
    TTCTCTTCCT CTCCAGGCAC AGAGTGTT66 TCCTCATCTA GGTCTaGGAC TTTACTGTCA TCAAACGAAC AATCTGGAAC TACAGTGGAA' AGGACAGCAA ACGAGAAACA CkAAGAGCTT
    CCT3CTAC7C TGGCTCCCAG CCTGTCTTTG TCTCCAGGGG CGGCAGGTAC TTAGCCTGGT TGGTGCATCC AGCAGGGCCA AGACTTCACT CTCACCATCA GCAGTATGGT AOTTCACCTC TGTGGCTGCA CCATCTGTCT TGCCTCTGTT GTGTGCCTGC, GGTGGATAAC GCCCTCCAAT GGACAGCACC TACAGCCTCA 'CAAAGTCTAC GCCTGCGAAG CAACAGOGGA GAGTGTTGAT
    (SE IDIkl(:0 '
    FIGURA 4
    Secuencia de aminoacidos de la cadena ligera kappa
    de aRANKL-1 (tamblen denominado a0PGL-1)
    1 METPAQLLFL LLIALPDTTG EIVLTQSPGT LSIaSiGERAT LSCRASQSVR
    51 GRYLAWYQQK PGQAPRLL/Y GASSRATGIF DRFSGSGSGT DFTLTISRLE 101 PEDFAVFYCQ (AGSSPRTFG QGTKVEIKrt vaapsvfifp padeqlksgt 151 asvvclinnf ypreak;mwk vdnalqsgns gesvtegdsk dstyslsstl 201 tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec (SEQ ID NO: 4)
    F GU
    Mapa de plasmido circular de aRANKL-1-kappatpDSRal9 (tambien denominado a0PGL-1-kappa/pDSRa19)
    'a0PGL-1
    Xbal (4750
    .
    Hirai (474
    . -
    Aceptor de 16s de SV40
    EccR1 (351)
    —PoliA de aFSH
    • SV40
    IVS
    Banal (464
    Ndd (883)
    Dona or 16s, 19s de SV40 .-
    Promotor de
    DHFR
    F1
    -
    Scat (119i)
    pro/on de SV40
    DHFR
    Ecdt1 (3948)
    Scal (3a35
    Pv‘i(3325 NM(2028) ,
    • Amp. pElF1322
    FIGURA 6
    apa de plasmido circular de aRANKL-1-IgG2/pDSRal9 (tambien denominado a0PGL-1-IgG2/pDSRa19)
    Hindi (6167)
    Sall (616 5) __Eat!(351) ctOpGL-1 1g02 —.PoHA de aFDH
    lik1111 (474 ) .Promotor de Aceptor 16s de
    DHFR
    SV40 SV40 IVS Seal (1 195)
    Barn (4641 DHFR -1-IgG2/pDSRari9 Donador 16s, 19s 6169 pb
    de SV40 ° Belt (1739:
    Hindi (4595),,-- PoliA de DHFR
    proton de SV40'
    &cll.! 0948) Hinal (3496)_, Seal0435c" Pvtd (3325)/ pf3R322 Amp
    FIGURA 7 Secuencia de ADNc de synPTH
    1 TCTAGACCAC CATGATCCCC GCCAAGGACA TGGCCAAGGT GATGATCGTG
    51 ATGCTGGCCA TTTGTTTCCT GACCAAGAGC GATGGCAAGT CCGTGAAGAA 101 GAGATCCGTG AGCGAGATCC AGCTGATGCA CAACCTGGGC AAGCACCTGA 151 ACTCCATGGA GAGAGTGGAG TGGCTGCGCA AGAAGCTGCA GGACGTGCAC 201 AACTTCGGCG GCGC7CGCGCC C (S Q ID NO: 5)
    r
    FIGURA 8
    Secuencla. de amlnoicidos de synPTH
    1 M/PAKDMAKV M1VMLAICFL TKS .K RSVSEIQIMH NLGICHLNSME 51 RVEWLRKKLQ DVIINFGGGAP (SEQID NO: 6)
    FIGURA 9
    Secuencia de ADNc de synPTH-cadena ligera de aRANKL-1
    1
    GATGATCGTG• TCTAGACCAO CATGATCCCC GCC.AAGGACA TGGCCAAGGT
    51
    ATGCTGGCCA TTTGTTTCCT GACCAAGAGC GATGGCAAGT CCGTGAAGAA
    101
    GAGATCCGTG AGCGAGATCC AGCTGATGCA CAACCTGGGC AAGCACCTGA
    151
    ACTCCATGGA GAGAGTGGAG TGGCTGCGCA AGAAGCTGCA GGA.CGTGCAC
    201
    AACTTC GGCG GCGOCGCGCC CGAAATTGIV TTGACGCAGT CTCCAGGCAC
    251
    CCTGTCTTTG TCTCCAGGGG AAAGAGCCAC CCTCTCCTGT AGGGCCAGTC
    301
    AGAGTGTTCG CGGCAGGTAC TTAGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCTGGCCAG
    351
    GCTCCCAGGC TCCTCATCTA TGGTGCATCC AGCAGGGCCA CTGGCATCCC
    401
    AGACAGGTTC AGTGGCAGTG GGTCTGGGAC AGACTTCACT CTCACCATCA
    451
    GCAGACTGGA GCCTGAAGAT TTTGCAGTGT TTTACTGTCA GCAGTATGGT
  68. 503.
    AGTTCACCTC GGACGTTCGG 'CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCMACGAAC
  69. 553.
    TGTGGCTGCA CCATCTGTCT TCATCTTCC6 GCCATCTGAT GAGCAGTTGA
    601,
    AATCTGGAAC TGCCTCTGTT GTGTGCCTGC TGAATAACTT CTATCCCAGA
    651
    GAGGCCAAAG TACAGTGGAA GGTGGATAAC GCCCTCCAAT CGGGTAACTC
    701
    CCAGGAGAGT GTCACAGA. GC AGGACAGCAA GGACAGCACC TACAGCCTCA
  70. 753.
    GCAGCACCCT GACGCTGAGC AAAGCAGACT ACGAGAAACA CAAAGTCTAC
  71. 803.
    GCCTGCGAAG TCACCCATCA GGGCCTGAGC TCGCCCGTCA CAAAGAGCTT
    851
    CAACAGGGGA GAGTGTTGAG TCGAC SE() ID• NO: 7)
    -FIGURA10 Secuencia de aminoacidos de synPTH-cadena Nora de aRANKLA
    MIPAKDMAKV MIVMLA CFI; TKSDGKSVKK RSVSEIQLMH NLGKHLNSME Si. DVIINFGGGAPRVEWLRKKLQ EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVR .101 PGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE
    GRYLAWYWK 151 QYGSSPRTFGPEDFAVPYCO QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 201 YPREAKVQWKASVVCLLNNF VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 251 KVYACEVTHQTLSKADYEKH GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 8)
    •
    •,
    FIGURA 11 Secuencla de A Nc de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1
    101 GAGATCCGTG
    151, ACTCCATGGA
    201 AACTTCGGCG
    251, CTTGGTACAG
    301 TCACCTTTAG
    51 GGGCTGGAGT
    401 CGCAGACTCC'
    451 ACACGCTGTA
    501 TATTACTOTO
    551 CCCCTGGOGC
    601 GCCCATCGOT
    651 ACAGCGGCCC
    701 GGTGTCGTGG
    751 CTGTCCTACA
    001 CCCTCCAGCA
    851 GCCCAGCAAC
    901 AGTGCCCACC
    954 TTCCCCCCAA
    1001 CACGTGCGTG
    1051 ACTGGTACGT
    1101 GAGGAGCAGT
    1151 GCACCAGGAC 1201 AAGGCCTCCC 1251 CCCCGAGAAC 1301 CAAGAACCAG 1351 ACATCOCCOT
  72. 1401. ACCACACCTC
    1451 GCTCACCGTG
    1501 CCGTGATGCA
    1551 CTGTCTCCGG
    AOCGAGATCC GAGARTGGAG GCOCCGC'OCC CCTGGGGGGT CAGCTATGCC GGGTCTCAGG OTGAAGGGCC TCTGCAAATG CGAAAGATCC CAGGGAACCC CTTCCCCCTO TGGGCTGCCT AACTCAGGCG GTCCTCAGGA ACTTCGGC4C ACCAAGGTGG GTGCCCAGCA AACCCAAGGA GTGGTGGACG GOACGGCGTO TCAACAGCAC TGGCTGAACG AaCCCCCATC CACAGOTGTA GTCAGCCTGA OGAGTGGGAG CCATOCTGGA GACAAGACGA TGAGGCTCTG
    AAATGAGT
    AGCTGATGCA TGGCTGCGCA CGAGGTGCAG CCCTGAGACT ATGAGCTGGG TATTACTGGG OGTTCACCAT
    AACAGCCTGA AGGGACTACG TGGTCACCGT
    GCGCCCTGCT GGTCAAGGAC- CTCTGACCAG CTCTACTCCC CCAGACCTAC AdmGACAGT CCACCTGTGG CACCCTCATG TGAGCCACGA GAGGTGCATA GTTCCGTGTG GCAAGGAGTA GAGAAAACCA CACCCTGCCC CCTGCCTGGT AGCAATGGGC CTCCGACGGC GOTOGCAOCA CACAACCACT CGAC
    CAACCTGGGC AGAAGCTGCA CTOTTOGAGT CTCCTGTGCA TCCOCCACA3C AGTGGTGGTA CTCCAGAGAC GAGCCGAGGA GTGATTATGA CTCCTCAGCC CCAGGAGCAC TACTTCCCCG CGGCGTGCAC TCAGCAGCGT ACCTGCAACG TGAGCGCAAA CAGGACCGTC ATCTCCCGGA AGACCCCGAG ATGCCAAGAC GTCAGCGTCC CAAGTGCAAG TCTCCAAAAC CCATCCCGCG CAAAGGC, TTC AGCCGGAGAA TCCITCTTCC GOGGAACGTC ACACGCAGAA
    AAGCACCTGA
    GGACGTGCAC
    CTOCOGGAG9
    GCCTCTGGAT
    TCCAGGGAAG
    GTACATACTA
    AATTCCAAGA
    CACGGCCGTA GTTGGTTCGA ,TCCACCAAGG CTCCGAGAGC AACCGGTGAC ACCTTCCCAG GGTGACCGTG
    TAGATCACAA
    TerTGTOTCG
    AGTCTTCCTC
    CCCCTGAGGT
    GTCCAGTTCA
    AAAGCCACGO
    TCACCGTTOT
    GTCTCCAACA
    CANAGGOCAG
    AGGAGATGAC
    TACCCCAGCG
    CAACTACAAG
    TCTACAGCAA
    tIrTexirce?
    GAGCCTCTCC
    .84) ID NO: 9)
    FIGURAl2 Secuencia de aminoacidos de synPTH-cadena pesada de aRANKL-1
    MIPAKDMAKV 51 RVEWLRKKLQ 01 EYAMSWVRQA 151 LQMNSLRAED
  73. 201. ,FPLApCSRST 251 SSGLYSLSSV 301 CPAPPVAGPS 351 DVEVHNAXT 401 APIEKTISKT1 451 EWESNGQPEN, 501 EALHNHYTQK
    MIVELAICFL DVHNFGGGAP PGKGLEWVSG "TAVYYCAKDP SESTAGALCL VTVPSSNFGT VFLFPPKPKD KPREEQFNST KGQPREPQVY VYKTTPPMLD
    SLSLSP6K'
    TKSDGKSVKK EVQLLESGGG ITGSGGSTYY GTTVIMSWFD' VKDYFPEPVT QTYTCNVDHK TLNISRTPEV FRVVSVLTVV TLPPSREEMT SDGSFFLYSK
    •
    RSVSEIOLMH NLGICHLNSME LVQPGGSLRL SCAASGFTFS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY PWGQGTLVTV SSASTKGPSV VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ PSNTKVDK VT'ERKCCVECPP TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
    LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH. (SEQ ID NO 10)
    FIGURA 13 Mapa de plasmido circular de synPTH-ccRANKL-1-kappa/pDSRa20
    Sal 69 anti RANKL-1 ka &still (4963
    PoIIAdeaFSH
    synPTH Xbat4750
    Ace deSV40 40 WS motor de DHFR
    Donador 168, 1 V40
    synPTH-anti RANKL-1 kappa pro/onl de SV40 5623 pb
    FIGURA14
    Mapa de plasmido circular de synPTH-allANKL-1-IgG2/pDSRa20
    So, I (6318
    PollA de aFSH
    anti FIANKIel IgG2
    Er4)5((53 de DHFR
    BUM(4
    0-4
    synPTH Xbal (.4750
    synPTH-anti RANKL-1 IgG2
    ArAptor les de Sv40
    6323Pb
    SV40 IVS Donador les, 191 de SV40 PoflAds DHFR
    toiatsso>
    Putt! (3325) peR322 Amp
    0 NO CO u)a to a to CD get 10 itt 'V' CI C'si (NI
    v: qe: 41:
    ( mum) opezpo! oppo
    1111/111111M1111111111111 flhlIIlHllllflhiHJAIJ 11111111111 I.
    11111111111111111111111111I11111111111111
    Min 11111111M1M111111111111.11HIMI
    111111H11111111117.11111111 1111111111111111111,11
    0
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    es1 I— 0 o ap aplliadns
    CI WI 0 WI 0 N mr•
    (yo)soiselqoalso op eptpedns
    FIGURA28
    • Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de aRANKL-1 (tambien denominado ccOPGL-1)
    1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA 41 PGKGLEWVSG ITGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY 81 LQMNSLRAED TAVYYCAKDP GTTVIMSWFD PWGQGTLVTV
    121 SS (SEQID NO: 11)
    FIGURA 29
    Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de aRANKL-1 (tamblen denominado a0PGL-1)
    1 EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVR GRYLAWY-QQK 41 PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE 81 PEDFAVFYCQ QYGSSPRTFG QGTKVEIK .(SEQ ID NO 12)
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