ES2406359T5

ES2406359T5 - Ligandos de cromatografía estables en medio cáustico

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Publication number: ES2406359T5
Application number: ES09180615.8T
Authority: ES
Inventors: Nanying Bian; Neil Soice; Shari Spector; Kara Levine
Original assignee: EMD Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2016-03-15
Anticipated expiration: 2029-12-23
Also published as: US12486307B2; EP2518151B9; JP2012229212A; JP2014015464A; JP2022084822A; CN108864262A; CN103601794A; EP2799550B1; EP2202310B2; CN108864263A; CN105111289B; EP2518151B1; US20180362595A1; CN108912216A; CN101775069A; EP2799550A1; SG195555A1; ES2464019T3; JP2010156687A; US20100221844A1

Description

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tres o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En algunas otras realizaciones, el ligando comprende cuatro o más dominios B o cuatro o más dominios Z de SpA, en el que los cuatro o más dominios B o los cuatro o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En otras realizaciones más, el ligando comprende cinco o más dominios B o cinco o más

5 dominios Z de SpA; o seis o más dominios B o seis o más dominios Z de SpA; o siete o más dominios B o siete o más dominios Z de SpA, en el que los cinco o más dominios B o los cinco o más dominios Z, o los seis o más dominios B, o los seis o más dominios Z, o los siete o más dominios B o los siete o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina.

10 En otro aspecto de acuerdo con la presente invención, un ligando de cromatografía estable en medio alcalino comprende uno o más dominios aislados E, D, A, B, C o Z de la proteína A de Staphyloccocus, en el que el uno o más dominios aislados comprenden uno o más restos de aminoácidos mutados en la posición n+1 por cualquier aminoácido de origen natural excepto cisteína (C), serina (S), alanina (A), glicina (G), asparagina (N) o glutamina (Q). En algunas realizaciones, n representa el resto de asparagina en la posición 23 de un dominio de SpA aislado.

15 En la Tabla I se muestran ligandos ejemplares que tienen una mutación en la posición 24 de un dominio de SpA aislado en el que n representa una asparagina.

Tabla I

Dominios SpA que incluyen modificaciones: Denominación

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24M

aspártico en la posición 24 sustituidos por metionina: D-E24M

A-E24M

B-E24M

C-E24M

Z-E24M

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24I

aspártico en la posición 24 sustituidos por isoleucina: D-E24I

A-E24I

B-E24I

C-E24I

Z-E24I

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24F

aspártico en la posición 24 sustituidos por fenilalanina: D-E24F

A-E24F

B-E24F

C-E24F

Z-E24F

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24T

aspártico en la posición 24 sustituidos por treonina: D-E24T

A-E24T

B-E24T

C-E24T

Z-E24T

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24P

aspártico en la posición 24 sustituidos por prolina: D-E24P

A-E24P

B-E24P

C-E24P

Z-E24P

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24W

aspártico en la posición 24 sustituidos por triptófano: D-E24W

A-E24W

B-E24W

C-E24W

Z-E24W

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24R

aspártico en la posición 24 sustituidos por arginina: D-E24R

A-E24R

B -E24R

C-E24R

Z-E24R

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24V

aspártico en la posición 24 sustituidos por valina: D-E24V

A-E24V

B-E24V

C-E24V

Z-E24V

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24L

aspártico en la posición 24 sustituidos por leucina: D-E24L

A-E24L

B-E24L

C-E24L

Z-E24L

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24Y

aspártico en la posición 24 sustituidos por tirosina: D-E24Y

A-E24Y

B-E24Y

C-E24Y

Z-E24Y

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24H

aspártico en la posición 24 sustituidos por histidina: D-E24H

A-E24H

B-E24H

C-E24H

Z-E24H

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: E-D24K

aspártico en la posición 24 sustituidos por lisina: D-E24K

A-E24K

B-E24K

C-E24K

Z-E24K

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido: D-E24D

aspártico en la posición 24 sustituidos por ácido glutámico: A-E24D

B-E24D

C-E24D

Z-E24D

En la Tabla II se representan los códigos de una sola letra de los aminoácidos de origen natural así como los correspondientes codones de tres letras que codifican cada aminoácido. En general, debido a la degeneración de codones, más de un codón de tres letras puede codificar al mismo aminoácido.

Tabla II

T: C A G

T: TTT Phe (F) TTC “ TTA Leu (L) TTG “ TCT Ser (S) TCC “ TCA “ TCG “ TAT Tyr (Y) TAC TAA Terminación TAG Terminación TGT Cys (C) TGC TGA Terminación TGG Trp (W)

C: CTT Leu (L) CTC “ CTA “ CTG “ CCT Pro (P) CCC “ CCA “ CCG “ CAT His (H) CAC “ CAA Gln (Q) CAG “ CGT Arg (R) CGC “ CGA “ CGG “

A: ATT Ile (I) ATC “ ATA “ ATG Met (M) ACT Thr (T) ACC “ ACA “ ACG “ TAT Asn (N) AAC “ AAA Lys (K) AAG “ AGT Ser (S) AGC “ AGA Arg (R) AGG “

G: GTT Val (V) GTC “ GTA “ GTG “ GCT Ala (A) GCC “ GCA “ GCG “ GAT Asp (D) GAC “ GAA Glu (E) GAG “ GGT Gly (G) GGC “ GGA “ GGG “

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Protein engineering, Vol. 1, No. 2, 107-113, 1987). Cada uno de los dominios E, D, A, B y C de la SpA posee distintos sitios de unión a Ig. Un sitio es para Fcγ (la región constante de la clase IgG o de Ig) y el otro es para la parte Fab de determinadas moléculas de Ig (la parte de la Ig que es responsable del reconocimiento del antígeno). Se ha descrito que cada uno de los dominios contiene un sitio de unión a Fab. La parte de unión no-Ig de la SpA se localiza en el extremo C y se denomina región X o dominio X.

En la Patente de Estados Unidos Nº 5.151.350 se describe la clonación del gen que codifica a la SpA.

La presente invención proporciona ligandos de cromatografía estables en medio alcalino basados en SpA. En algunos aspectos de acuerdo con la presente invención, un ligando de cromatografía estable en medio alcalino comprende dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o seis o más, o siete o más dominios B o Z naturales aislados de SpA. En otros aspectos de acuerdo con la presente invención, un ligando de cromatografía estable medio alcalino comprende uno o más dominios E, D, A, B, C o Z de SpA, en el que el uno o más dominios aislados comprenden uno o más restos de aminoácidos en la posición mutada n+1 de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, arginina, treonina, isoleucina, valina y metionina, en el que n representa una asparagina.

En una realización particular, la presente invención proporciona un ligando de cromatografía que comprende dos o más dominios B de SpA, unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En otra realización, la presente invención proporciona un ligando de cromatografía que comprende dos o más dominios Z de SpA, unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En otra realización más, un ligando de cromatografía comprende dos o más dominios C de SpA, unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina.

La presente invención también incluye variantes de aminoácidos de SpA, que pueden diferenciarse de la secuencia de aminoácidos parental de la cual derivan, en la sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos en cualquier lugar dentro de la secuencia de aminoácidos parental y son estables en medio alcalino. El algunas realizaciones, las variantes de la secuencia de aminoácidos poseerá una identidad de al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 85 %, o al menos aproximadamente 90 %,

o al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 96 %, o al menos aproximadamente 97 %, o al menos aproximadamente 98 % con la secuencia parental (es decir, los dominios SpA o dominio Z naturales), en el que dichas variantes son estables en medio alcalino. En una realización particular, las variantes de SpA incluyen adicionalmente el resto de aminoácido glicina en la posición 29 sustituido por un resto de aminoácido distinto de alanina o triptófano, conservando al mismo tiempo su estabilidad alcalina.

En el presente documento, la expresión “variante funcional” de una proteína significa una variante de una proteína, en el que la función, en relación con la invención, definida como estabilidad alcalina, se conserva esencialmente. Las variantes funcionales incluyen, sin limitación, variantes de SpA que incluyen más que dominios de SpA, por ejemplo, dímeros, trímeros, multímeros de diversos dominios de SpA y variantes de SpA que tienen una deleción, sustitución y/o adición de uno o más aminoácidos en uno o más dominios naturales de SpA, conservando al mismo tiempo la estabilidad alcalina, como se define en el presente documento.

En el presente documento, la expresión “molécula parental” se usa para la correspondiente proteína en la forma antes de modificarse de acuerdo con la invención o en la que se ha introducido una mutación de acuerdo con la invención.

La expresión “identidad de secuencia” significa que, cuando dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos están alineadas óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 70 %, o al menos una identidad de secuencia del 80 %, o al menos una identidad de secuencia del 85 %, o al menos una identidad de secuencial del 90 %, o al menos una identidad de secuencia del 95 % o más. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia (por ejemplo, secuencia parental) con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen secuencias de referencia y de ensayo en un ordenador, posteriormente se diseñan las coordenadas, y si fuera necesario, se diseñan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Después, basándose en los parámetros del programa diseñados, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia (o secuencias) de ensayo con respecto a la secuencia de referencia.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda por el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, PASTA y TFASTA en el paquete de Programas Informáticos de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase en líneas generales Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia es el algoritmo

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“dominios variables de cadena pesada”, regiones “VH” o dominios “VH”.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica

: o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. El término “fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo

: o cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoácidos que un anticuerpo completo o intacto o cadena de anticuerpo. Los fragmentos pueden obtenerse mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o cadena de anticuerpo. Los fragmentos también pueden obtenerse por medios recombinantes. Los fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fc y/o Fv.

La expresión “fragmento de unión a antígeno” se refiere a una parte polipeptídica de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une a un antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que deriva) por la unión al antígeno (es decir, unión específica). Los fragmentos de unión pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, cadenas sencillas y anticuerpos monocatenarios.

También se incluyen proteínas de fusión que incluyen un anticuerpo o un fragmento del mismo como una parte de la proteína de fusión.

Las expresiones “polinucleótido” y “molécula de ácido nucleico”, se usan indistintamente en el presente documento, para referirse a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Estas expresiones incluyen un ADN monocatenario, bicatenario o tricatenario, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos derivatizadas o no naturales, modificadas química o bioquímicamente. La estructura básica del polinucleótido puede comprender grupos glucídicos y fosfato (como puede encontrarse normalmente en el ARN o ADN) o grupos glucídicos o fosfato modificados o sustituidos. Además, puede obtenerse un polinucleótido bicatenario a partir del polinucleótido monocatenario producto de la síntesis química bien sintetizando la cadena complementaria e hibridando las cadenas en condiciones apropiadas, o bien sintetizando la cadena complementaria de novo usando una ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molécula de ácido nucleico puede tener muchas formas diferentes, por ejemplo, un gen o fragmento génico, uno o más exones, uno o más intrones, ARNm, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácido nucleico. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos y análogos de nucleótidos metilados, uracilo, otros grupos glucídicos y de unión tales como fluororribosa y tioato y ramificaciones de nucleótidos. Como se usa en el presente documento, “ADN” o “secuencia de nucleótidos” incluye no solo las bases A, T, C y G, sino que también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones internucleótido tales como engarces sin carga y tioatos, el uso de análogos glucídicos y estructuras básicas modificadas y/o alternativas, tales como poliamidas. En una realización particular, una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que decodifica una variante de SpA.

La expresión “unión a Fc”, “se une a una parte Fc” o “unión a una parte Fc” se refiere a la capacidad de un ligando de cromatografía estable en medio alcalino descrito en el presente documento, de unirse a la parte cristalizable (Fc) de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el ligando de acuerdo con la presente invención se une a una parte Fc de un anticuerpo (por ejemplo IgG1, IgG2 o IgG4 humana) con una afinidad de al menos 10-7 M, o al menos 10-8 M,

o al menos 10-9 M.

Como se usa en el presente documento, la expresión “unión a Fab” o “unión a una parte Fab” se refiere a la capacidad de un ligando de cromatografía estable en medio alcalino descrito en el presente documento, de unirse a una región Fab de un anticuerpo o una molécula de inmunoglobulina. La expresión “unión reducida a una parte Fab” se refiere a cualquier disminución en la unión a una parte Fab (o F(ab)2) de una molécula de inmunoglobulina por un ligando basado en SpA de la presente invención con respecto a la SpA natural, en el que el ligando incluye adicionalmente una mutación en uno o más aminoácidos. En una realización ejemplar, un ligando de acuerdo con la presente invención incluye adicionalmente el resto de glicina en la posición 29 sustituido por una alanina. En otra realización, un ligando de acuerdo con la presente invención incluye adicionalmente la glicina en la posición 29 sustituida por un resto de aminoácido distinto de alanina o triptófano. En una realización, la unión a una parte Fab de una molécula de inmunoglobulina no puede detectarse usando técnicas convencionales en la materia y las descritas en el presente documento. La unión a una molécula de inmunoglobulina puede detectarse usando técnicas bien conocidas incluyendo las descritas en el presente documento e incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo, cromatografía de afinidad y análisis de resonancia de plasmón superficial. En algunas realizaciones, una proteína de unión a inmunoglobulina incluida en la presente invención se une a una molécula de inmunoglobulina con una afinidad de al menos 10-10M.

II. Generación de moléculas basadas en SpA para su uso como ligandos de cromatografía

Los ligandos de cromatografía basados en SpA incluidos en la presente invención pueden fabricarse usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica.

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adecuada para la separación de biomoléculas tales como, por ejemplo, inmunoglobulinas.

En algunas realizaciones, un ligando de acuerdo con la presente invención está unido a un soporte sólido. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se considera que puede usarse cualquier soporte sólido adecuado para la unión de un ligando de acuerdo con la invención. Por ejemplo, las matrices de soporte sólido incluyen, pero sin limitación, vidrio de poros controlados, sílice, óxido de circonio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida y poliestireno.

Se considera que, como soporte sólido, puede usarse cualquier material poroso que contribuya a un cambio menor del 5 % en cuanto a la estabilidad alcalina del ligando unido después de inmersión durante aproximadamente 30 horas en NaOH 0,5 M.

Un material poroso usado como un soporte sólido puede comprender un compuesto hidrófilo, un compuesto hidrófobo, un compuesto oleófobo, un compuesto oleófilo o cualquier combinación de los mismos. El material poroso puede comprender un polímero o un copolímero. Como ejemplos de materiales porosos adecuados se incluyen, pero sin limitación, poli(éter sulfonas), poliamida, por ejemplo, nylon, polisacáridos tales como, por ejemplo, agarosa y celulosa, poliacrilato, polimetacrilato, poliacrilamida, polimetacrilamida, politetrafluoroetileno, polisulfona, poliéster, fluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, policarbonato, un fluorocarbono, por ejemplo poli(tetrafluoroetilenco-perfluoro(alquil vinil éter)), vidrio, sílice, circonio, titanio, cerámica y metal.

El material poroso puede comprender moléculas orgánicas o inorgánicas o una combinación de moléculas orgánicas e inorgánicas y puede comprender uno o más grupos funcionales, por ejemplo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo carbonilo, o un grupo de ácido carboxílico adecuado para relacionar, por ejemplo, formando enlaces covalentes para modificación química adicional para unirse covalentemente a una proteína. En otra realización, el material poroso puede no poseer un grupo funcional pero puede revestirse con una capa de material que lleve grupos funcionales tales como, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo aminoácido, un grupo carbonilo o un grupo de ácido carboxílico.

En algunas realizaciones, se usa una matriz de separación por afinidad convencional, por ejemplo, de naturaleza orgánica y basada en polímeros que exponen una superficie hidrófila al medio acuoso usado, es decir, expone grupos hidroxi (--OH), carboxi (--COOH), carbonilo (--CHO, o RCO-R’), carboxamido (--CONH2, posiblemente en formas sustituidas en N), amino (--NH2, posiblemente en forma sustituida), oligo-o polietilenoxi en sus superficies externas y, si están presentes, también en sus superficies internas. En una realización, los polímeros pueden estar basados, por ejemplo, en polisacáridos, tales como dextrano, almidón, celulosa, pululano, agarosa etc. que han sido ventajosamente reticulados, por ejemplo con bis-epóxidos, epihalohidrinas, hidrocarburos inferiores 1,2,3 trihalo sustituidos, para proporcionar una porosidad y rigidez adecuadas. En otra realización, el soporte sólido comprende perlas de agarosa porosas. Los diversos soportes usados en la presente invención pueden prepararse fácilmente de acuerdo con procedimientos convencionales conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, gelatinización de suspensión inversa descritos, por ejemplo, en Hjerten, Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Como alternativa, las matrices base pueden ser productos disponibles en el mercado, tales como Sepharose™ FastFlow (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). En algunas realizaciones, especialmente ventajosas para separaciones a gran escala, el soporte se adapta para aumentar su rigidez, y por tanto hace que la matriz sea más adecuada para caudales altos.

Como alternativa, el soporte sólido puede basarse en polímeros sintéticos, tales como poli(alcohol vinílico), poli(acrilatos de hidroxialquilo), poli(metacrilatos de hidroxialquilo), poliacrilamidas, polimetacrilamidas etc. En el caso de polímeros hidrófobos, tales como matrices basadas en bencenos sustituidos con divinilo y monovinilo, la superficie de la matriz a menudo se hidrofiliza para exponer grupos hidrófilos como se los definidos anteriormente a un líquido acuoso circundante. Dichos polímeros pueden producirse fácilmente de acuerdo con procedimientos convencionales, véase por ejemplo Arshady, Chimica e L’Industria 70(9), 70-75 (1988). Como alternativa, puede usarse un producto disponible en el comercio, tal como Source™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y Poros (Applied BioSystems, Foster City, CA).

Aún en otras realizaciones, el soporte sólido comprende un soporte de naturaleza inorgánica, por ejemplo, sílice, óxido de circonio etc. Con frecuencia, la superficie de las matrices inorgánicas se modifica para incluir grupos reactivos adecuados para reaccionar después con SpA y sus variantes. Los ejemplos incluyen CM Circonia (Ciphergen-BioSepra (CergyPontoise, Francia) y CPG® (Millipore).

En algunas realizaciones, los polímeros pueden estar basados, por ejemplo, en circona o sílice o vidrio de poros controlados que pueden modificarse para contener grupos reactivos y/o sustentar la inmersión cáustica, para acoplarse a ligandos.

Los formatos de soporte sólido ejemplares incluyen, pero sin limitación, una perla, un gel, una membrana, un casete, una columna, una microplaca, un portaobjetos, una placa o un monolito.

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En algunas realizaciones, cuando se usa química asociativa, la reacción se realiza a una temperatura que varía de 0 ºC a 99 ºC. En determinadas realizaciones el procedimiento de reacción se realiza a una temperatura menor de 60 ºC, menor de 40 ºC, menor de 20 ºC o menor de 10 ºC. En algunas realizaciones el procedimiento de la invención se realiza a una temperatura de aproximadamente 4 ºC. En otras realizaciones, el procedimiento de la invención se realiza a una temperatura de 20 ºC.

VI. Procedimientos para ensayar la estabilidad alcalina de los ligandos unidos

El aumento de la estabilidad alcalina de los ligandos después de su unión a un soporte puede someterse a ensayo usando técnicas bien conocidas en la materia y las descritas en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la estabilidad alcalina de los multímeros de los dominios de SpA unidos una resina, por ejemplo, los dominios B y Z de SpA unidos a una resina de cromatografía, como se describe en el presente documento, puede confirmarse por tratamiento de la resina con NaOH 0,5 M. Debe entenderse que un aumento de la estabilidad significa que la capacidad de unión a IgG inicial se conserva durante un periodo de tiempo prolongado en comparación con el que puede conseguirse con la molécula de SpA natural. Por ejemplo, en el caso de la presente invención, después de 100 ciclos, cada uno incluyendo un tratamiento de 15 minutos con NaOH 0,5 N, el porcentaje de capacidad conservada de los ligandos de SpA, por ejemplo, los que comprenden dominios B o Z múltiples, es al menos 1,5 veces más, 2,0 veces más, 2,5 veces más o 3 veces más que el de la SpA natural. En una realización, la estabilidad alcalina del ligando unido, según se ensaya mediante la conservación de la capacidad de unión a IgG a lo largo del tiempo, se mide de la siguiente manera. La capacidad de unión, denominada Qd 50 %, se mide obteniendo el volumen de IgG cargada a una UV280nm del 50 % de la concentración de IgG inicial. Primero se mide la Qd 50 % de la resina virgen inicial cargada en una columna.. Después la resina se expone a aproximadamente 10 ciclos de 15 minutos de exposición a NaOH 0,5 N a 0,8 ml/min. De nuevo se mide la Qd 50 %. Este proceso se repite hasta que la resina se exponga a un total de aproximadamente 100 ciclos de NaOH 0,5 N, La Qd 50 % se mide una última vez y los resultados de las resinas fabricadas a partir de diferentes ligandos se comparan con la SpA natural.

En otro ensayo, la estabilidad cáustica o alcalina de las resinas se mide por inmersión estática de las resinas de interés. Sumergiendo una cantidad media de resina en NaOH 0,5 N durante 25 h con una suave rotación y midiendo la capacidad de unión a IgG antes y después de la inmersión en NaOH, puede determinarse la estabilidad alcalina mediante la conservación de la capacidad de unión de la resina.

VII. Procedimientos de purificación de una molécula diana usando un ligando de cromatografía de la invención

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un procedimiento de purificación de una molécula diana a partir de una mezcla usando los ligandos de cromatografía estables en medio alcalino descritos en el presente documento. La molécula diana puede ser cualquier molécula que reconozca un ligando de cromatografía estable en medio alcalino proporcionado en el presente documento, en el que el ligando esté acoplado a un soporte sólido. Los ejemplos de moléculas diana incluyen inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos policlonales

o un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen cualquier fragmento de una inmunoglobulina que comprenda una región variable que aún se una específicamente a su antígeno conservando al mismo tiempo su capacidad de unirse específicamente a un ligando de proteína acoplado a un soporte sólido.

En algunas realizaciones, un procedimiento de aislamiento de una molécula diana de interés usando un ligando de cromatografía estable en medio alcalino descrito en el presente documento incluyen las etapas de: (a) poner en contacto un soporte sólido que incluya un ligando de cromatografía estable en medio alcalino basado en SpA unido con una mezcla que comprenda una molécula de interés en condiciones tales que la molécula diana se una específicamente al ligando; y (b) modificar las condiciones de tal manera que la molécula diana ya no se una al ligando, aislando de esta manera la molécula diana.

En algunas realizaciones, la etapa de modificación incluye modificar el pH, de tal manera que la molécula diana ya no se una al ligando. En una realización particular, el pH se modifica de tal manera que sea un pH más ácido que el de las condiciones de pH en la etapa (a). Por ejemplo, en una realización, la etapa (a) puede realizarse a un pH neutro, o a un pH que varíe de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 y la etapa (b) puede realizarse a un pH ácido, por ejemplo, un pH que varíe de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.

En otra realización, la etapa (b) comprende modificar la concentración salina del tampón en uso, de tal manera que la molécula diana ya no se una al ligando. Por ejemplo, en una realización, en la etapa (a) puede usarse una concentración salina elevada, por ejemplo, >0,1 M y en la etapa (b) puede usarse una concentración salina inferior, por ejemplo, <0,1 M. A la inversa, en algunas realizaciones, en la etapa (a) puede usarse una concentración salina baja, por ejemplo, <0,1 M y en la etapa (b) puede usarse una concentración salina elevada. En otras realizaciones más tanto el pH como la concentración salina del tampón pueden modificarse entre la etapa (a) y etapa (b).

Un experto en la materia puede determinar fácilmente las condiciones adecuadas para la unión de una molécula

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En las Figuras 6 y 7 se representan las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos del dominio B natural marcado con his y los diversos mutantes n+1.

Ejemplo 2: Ensayo de las proteínas expresadas con respecto a la estabilidad alcalina

Las construcciones marcadas con his de la SpA mutante y natural purificadas por afinidad descritas en el Ejemplo 1 se diluyen con agua MilliQ o con NaOH a una concentración final de 1 N y se incuban durante seis horas a temperatura ambiente. Se usan 6 columnas de filtración en gel de Biorad Micro Biospin para neutralizar y cambiar el tampón 50 µl de cada muestra en PBS. La cuantificación de proteína total se consigue usando el ensayo MicroBCA de Pierce y las muestras se diluyen a 10 µg/ml en PBS para cargar sobre la placa ELISA. Aproximadamente 200 µl (2 µg) de PrA tratada se absorben a los pocillos de una placa ELISA durante 2-24 horas a 37 ºC. Las placas se bloquean en Tampón de Bloqueo Superblock de Pierce en PBS (Superblock-PBS) durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. A cada pocillo de la placa se le añade aproximadamente 200 µl de gamma globulina humana de Sigma diluida a 0,05 mg/ml en Superblock-PBS (10 µg) y se deja que proceda la unión durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS que contiene aproximadamente Tween20 al 0,05 % (PBS-T), las placas se incuban con 200 µl de una dilución 1:10.000 de IgY de pollo conjugado con HRP suscitado contra IgG humana durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados finales con PBS-T, las placas se revelan con 100 µl de ELISA TMB Pierce 1-Step Slow durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene añadiendo 100 µl de HCL 1 N y la unión a IgG primaria se cuantifica como la lectura de absorbancia a 450 nm. Todas las muestras se ensayan por triplicado y los datos se analizan como el cambio en la unión a IgG primaria antes y después del tratamiento cáustico.

El resultado de un ensayo de experimento ejemplar con respecto a la estabilidad alcalina de los diversos mutantes del dominio B n+1 se resume en el gráfico de barras de la Figura 8. Las diversas construcciones se representan en el eje X y el porcentaje correspondiente de unión a IgG que se conserva después de seis horas de exposición a NaOH 1M se representa en el eje Y. Como se representa en el gráfico de barras de la Figura 8, diversos de los mutantes n+1 que tienen un aminoácido voluminoso en la posición 24 del dominio B presentan una estabilidad cáustica potenciada.

En otro experimento, los ligandos SpA que tienen dos o más dominios B o dos o más dominios Z de SpA se ensayan con respecto a la estabilidad alcalina usando el ensayo descrito anteriormente. En otro experimento más, los ligandos SpA que tienen tres dominios B (B3), cuatro dominios B (B4), cinco dominios B (B5), seis dominios B (B6) o siete dominios B (B7) se ensayan con respecto a la estabilidad alcalina usando el ensayo descrito anteriormente.

En un experimento ejemplar, el porcentaje de capacidad de unión a IgG residual de los ligandos B3, B4 y B5, ensayado usando el procedimiento basado en ELISA descrito en el presente documento es el siguiente. El ligando B3 conserva aproximadamente el 79 % de su capacidad de unión a IgG residual después de una exposición de seis horas a NaOH 1 M; el ligando B4 conserva aproximadamente el 86 % de su capacidad de unión a IgG residual después de una exposición de seis horas a NaOH 1 M; y el ligando B5 conserva aproximadamente el 83 % de su capacidad de unión a IgG residual después de una exposición de seis horas a NaOH 1 M. El ligando SpA natural (nPrA) solo conserva aproximadamente el 49 % de su capacidad de unión a IgG residual después de una exposición de seis horas a NaOH 1 M.

Ejemplo 3: Unión de SpA natural y variantes de SpA a un soporte sólido

Después de la generación de las diversas variantes de SpA e identificación de las que son estables en medio cáustico usando uno o más ensayos conocidos en la técnica y como se describe en el Ejemplo 2, las variantes de SpA se unen a un soporte, por ejemplo, a un soporte sólido. En un experimento ejemplar, usando epiclorohidrina se reticulan perlas de agarosa (Sepharose 4B) (GE Healthcare, Piscataway NJ) de acuerdo con un procedimiento previamente descrito (Porath y Fornstedt, J. Chromatography, 51: 479 (1979)). Las perlas de agarosa reaccionan con grupos asociativos cargados positivamente, por ejemplo, cationes, de acuerdo con el siguiente procedimiento: se añaden 50 ml de perlas a 40 g de cloruro de glicidil trimetilamonio (GTMAC) al 75 % en peso, 10 ml de agua Milli-Q® (Millipore Corp., Billerica, MA) y 1,67 g de hidróxido de sodio al 50 % en peso. La reacción se agita vigorosamente (> 100 rpm) en un agitador rotatorio durante una noche a temperatura ambiente. Después, las perlas se filtran y se lavan con tres volúmenes de 100 ml de agua Milli-Q® (Millipore Corp, Billerica, MA).

Las perlas (50 ml, de torta filtrada) se añaden a agar que contiene 15 ml de NaOH 4,6 M. Se forma una suspensión con la mezcla y después se añaden 19,5 ml de diglicidil éter butanodiol (BUDGE). Esta mezcla se agita a 35 ºC durante aproximadamente 2 horas. Después, las perlas se lavan con 750 ml de agua Milli-Q® (Millipore Corp, Billerica, MA) y se equilibran con 250 ml de NaHCO3 10 mM.

Inmediatamente después de la etapa de activación con BUDGE, se añaden 10 ml de la torta de perlas filtrada a 10 ml de una solución de NaHCO3 10 mM que contiene una concentración de 15 g/l de ligando SpA natural o ligando SpA de acuerdo con la presente invención. La mezcla se protege en un vial de vidrio y el vial gira en un hibridizador

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Claims

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