ES2401657T3 - Método para mejorar la resistencia al estrés en plantas y materiales para el mismo - Google Patents

Abstract

Un método para obtener una planta con una mayor resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, donde dicha resistencia al estés se selecciona entre resistencia a la sequía y resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies de oxígeno reactivo, comprendiendo dicho método: (a) introducir al menos una mutación o un ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales, lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales; (b) regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y (c)seleccionar una o más plantas que tienen una mayor resistencia a la sequía y/o resistencia asociada a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas de oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje.

Description

Método para mejorar la resistencia al estrés en plantas y materiales para el mismo.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional Australiana Núm. 2007903309, presentada el 20 de Junio de 2007, y la solicitud de patente provisional Australiana Núm. 2008901466, presentada el 26 de Marzo de 2008.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a la resistencia al estrés en plantas, tales como la resistencia a la sequía, la resistencia a la sal, la resistencia al calor o al frío, la resistencia a la luz y la resistencia al pH, y a los métodos y materiales para incrementar la resistencia al estrés en plantas, y para escrutar en las plantas mutaciones que están asociadas con un incremento en la resistencia al estrés. La invención también se refiere a los métodos y materiales para retrasar el comienzo de la floración en las plantas y para alterar la forma de las hojas de las plantas.

Antecedentes de la invención

El mayor efecto limitante en los rendimientos de cultivos en todo el mundo es el estrés abiótico, que causa una pérdida media de más de 50% del rendimiento potencial (Boyer, J. S. (1982), "Plant Productivity and Environment" Science 218(4571): 443-448). Los estreses abióticos incluyen temperaturas extremas, salinidad, suelos ácidos, altas intensidades de luz, sequía y combinaciones de los mismos.

Puesto que las plantas son sésiles y no pueden escapar de estas condiciones, responden cambiando su compostura, morfología y fisiología de proteínas y metabolitos. Estos cambios permiten a la planta limitar el daño adaptándose a las condiciones de estrés y también reparar el daño causado por el estrés.

Estos cambios están mediados por procedimientos que detectan el estrés y/o sus efectos sobre la planta y activan múltiples rutas de señalización complejas. Las diferentes rutas son activadas dependiendo del tipo de condiciones de estrés experimentadas por la planta pero a menudo hay un solapamiento y una interacción entre las rutas. Este solapamiento puede conducir a una tolerancia cruzada, que es la tolerancia a múltiples tipos de estrés a pesar de la exposición a un estrés solamente. Esto es importante ya que los estreses raramente se producen de manera aislada. Por ejemplo el estrés por frío ocasionará también un estrés por exceso de luz ya que el frío hace que el metabolismo de la planta se ralentice y aún así todavía es capaz de recoger tanta energía lumínica como antes. Del mismo modo la sequía puede ocasionar estrés por calor ya que los estomas se cierran para conservar el agua pero como resultado pierden el efecto refrigerante de la transpiración, dando como resultado estrés por calor. Además en la naturaleza raramente existen condiciones de estrés aisladas. En Australia sería posible que un cultivo experimentara estés por sequía y exceso de luz al mismo tiempo.

Aunque algunos componentes de las rutas de señalización de estrés han sido estudiadas, debido a la complejidad de las rutas de respuesta al estrés, la posición de estos componentes en las rutas y sus interacciones con otros componentes son escasamente comprendidas y por consiguiente los métodos existentes para mejorar la resistencia al estrés de las plantas son limitados.

De este modo, existe la necesidad de nuevos métodos para producir plantas con un incremento en la tolerancia al estrés.

Compendio de la invención

Las presentes investigaciones han mostrado sorprendentemente que las mutaciones en el gen SAL1 que dan como resultado una actividad reducida o nula asociada con la proteína SAL1, producen una resistencia al estrés de las plantas mutantes.

De este modo, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para obtener una planta con un incremento en la resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, en donde dicha resistencia al estrés se selecciona entre la resistencia a la sequía y la resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas del oxígeno, comprendiendo dicho método:

(a)

introducir al menos una mutación o ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o un homólogo de la misma en dichas una o más células vegetales;

(b)

regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

(c)

seleccionar una o más plantas que tienen un incremento en la resistencia a la sequía y/o resistencia a estreses asociados con las rutas mediadas por especies reactivas del oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje.

Se puede introducir al menos una mutación o ácido nucleico exógeno por medio de cualquier método apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones mediante técnicas mutagénicas químicas o físicas, o utilizando métodos de mutación insercional tales como transposones o ADN-T, y se puede introducir ácido nucleico exógeno mediante métodos recombinantes empleando, por ejemplo, penetración celular ayudada por agentes químicos (utilizando, por ejemplo, calcio, litio, PEG), electroporación, microinyección, transfección mediada por liposomas, bombardeo con micropartículas (biolística), transformación mediada por Agrobacterium, infección con virus, fusión de protoplastos o cualquier otro método apropiado conocido en la técnica.

De acuerdo con una realización de la invención, el método comprende la introducción de al menos una mutación en el gen SAL1 o un homólogo del mismo, o la inhibición o supresión de la expresión del gen SAL1 o un homólogo del mismo.

Se puede introducir al menos una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o un homólogo de la misma en dichas una o más células vegetales, y puede comprender una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en la región de los nucleótidos 731 a 745, 1226, 1518, 1519, y 1690 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalentes en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de guanina a adenina en la en la posición 1226 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1. La mutación resultante puede dar como resultado un cambio de aminoácido de glicina a ácido aspártico en la posición 217 del SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de citosina a timina en la posición 731 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1. La mutación resultante puede dar como resultado un cambio de aminoácido de alanina a valina en la posición 124 del SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de guanina a adenina en la posición 736 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1. La mutación resultante puede dar como resultado un cambio de aminoácido de ácido glutámico a lisina en la posición 126 del SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de guanina a adenina en la posición 1690 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender la inserción de uno o más nucleótidos entre las posiciones 734 y 735 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1, o la mutación puede comprender la sustitución de los nucleótidos 735-745 del SEQ ID NO: 1, o nucleótidos equivalentes en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1 con uno

o más nucleótidos.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender la inserción de uno o más nucleótidos entre o incluyendo las posiciones 1518 y 1519 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con una realización, la mutación puede ser una mutación nula de SAL1.

De acuerdo con otra realización más, un método de la invención puede comprender la introducción en dichas una o más células vegetales de un ácido nucleico que inhibe la expresión de SAL1 endógena o un homólogo de la misma,

o que remplaza la expresión de SAL1 endógena o un homólogo de la misma por la expresión de una proteína exógena. La proteína exógena puede ser una SAL1 mutante exógena o un homólogo de la misma, o cualquier otra proteína adecuada, tal como una proteína que proporciona un fenotipo escrutable.

Las plantas resultantes de los métodos de acuerdo con la invención pueden tener un incremento en la resistencia a numerosos estreses abióticos incluyendo, pero sin limitarse a, sequía, salinidad, estrés por temperatura, estrés por luz, pH y toxicidad mineral del suelo, con respecto a una planta de tipo salvaje, o cualquier combinación de los mismos, con la condición de que dicha planta no sea un mutante alx8, fry1-1, fry1-2, fry1-3, salk_02882, o hos2 de Arabidopsis thaliana. Las plantas pueden tener un incremento en la resistencia a estreses abióticos, con respecto a una planta de tipo salvaje, inducido por, pero sin limitarse a, animales (incluyendo animales que pastan y plagas u organismos parásitos), bacterias, hongos, y virus o cualquier combinación de los mismos.

De acuerdo con una realización, la planta resultante tiene un incremento en la resistencia a la sequía con respecto a una planta de tipo salvaje.

De acuerdo con otra realización de un método de la invención, la planta resultante puede tener un retraso en el momento de la floración.

De acuerdo con otra realización de un método de la invención, la planta resultante puede tener un fenotipo foliar alterado.

Asimismo se describe un método para obtener una planta con un momento de floración alterado con respecto a una planta de tipo salvaje, que comprende:

(a)

introducir al menos una mutación o ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o un homólogo de la misma en dichas una o más células vegetales;

(b)

regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

(c)

seleccionar una o más plantas que tienen un momento de floración alterado con respecto a una planta de tipo salvaje.

Asimismo se describe un método para obtener una planta con un fenotipo foliar alterado con respecto a una planta de tipo salvaje, que comprende:

(a)

introducir al menos una mutación o ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o un homólogo de la misma en dichas una o más células vegetales;

(b)

regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

(c)

seleccionar una o más plantas que tienen un fenotipo foliar alterado con respecto a una planta de tipo salvaje.

Asimismo se proporcionan las plantas obtenidas mediante los métodos de la invención, y las partes de plantas (incluyendo hojas, tallos, raíces, tubérculos, flores, frutos y porciones de los mismos) y semillas mutantes/transgénicas de las plantas, con la condición de que dicha planta no sea un mutante alx8, fry1-1, fry1-2, fry1-3, salk_02882, o hos2 de Arabidopsis thaliana.

También se describe un método para escrutar en una planta la presencia de al menos un alelo mutante de un secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o un homólogo de la misma, comprendiendo dicho método el análisis de ADN de la planta utilizando al menos una molécula de ácido nucleico adecuada como una sonda o cebador que sea capaz de hibridar con un gen SAL1 o su homólogo en condiciones restrictivas.

Este método de escrutinio puede comprender el uso de al menos un par de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación de una región del gen SAL1 o un homólogo del mismo, que comprende un cebador directo y un cebador inverso para detectar la presencia o ausencia de una mutación en dicha región. La región puede comprender el gen SAL1 completo o un homólogo del mismo, o puede comprender solamente una porción del mismo, tal como, por ejemplo (y en referencia a la Figura 10), la región de nucleótidos que comprende el exón 3, el intrón entre los exones 3 y 4, el exón 5, el intrón entre los exones 5 y 6, el exón 6, y el intrón entre los exones 6 y 7,

o cualquier combinación de los mismos.

La molécula de ácido nucleico, o miembro de un par de cebadores oligonucleotídicos, puede tener cualquier tamaño adecuado para la hibridación específica a una secuencia de nucleótidos diana en condiciones restrictivas, y puede comprender de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, pero puede tener más típicamente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Identificación de la mutación puntual en el gen SAL1 en alx8

A. Perfiles cromatográficos que muestran la secuencia de la región de una mutación puntual en Col-0 de tipo salvaje y múltiples individuos alx8 de las generaciones retrocruzadas y Col-0 de tipo salvaje que contiene un constructo APX2-LUC. La línea inferior indica la secuencia consenso calculada por medio de Contig Express (Invitrogen, Carslbad, CA, USA). La segunda línea inferior es la secuencia del gen SAL1 de Arabidopsis Information Resource (TAIR; www.arabidopsis.org). Los recuadros de contorno discontinuo indican el sitio de la mutación puntual y los recuadros continuos una mutación introducida para los cebadores dCAPS. Todas las secuencias excepto APX2-LUC están en orientación inversa, es decir 3 ' a 5'.

B. Alineamiento de todas las secuencias de individuos alx8 y el gen SAL1 + promotor de 3kb de TAIR. La flecha indica la orientación de la secuencia del gen 5 ' a 3'.

Figura 2 - Confirmación de la mutación puntual en el gen SAL1 en alx8 El gen SAL1 y aproximadamente 1,07 kb del promotor se digirieron a partir de BAC T8H11 de Arabidopsis Information Resource (TAIR) y se ligaron en el vector binario pCAM2300 (CAMBIA, Canberra, Australia). Las plantas tanto Col-0 de tipo salvaje como alx8 se tranformaron mediante transformación mediada por Agrobacterium. Se aislaron dos líneas de alx8 complementadas con la copia de tipo salvaje del gen. También se aislaron siete líneas de Col-0 de tipo salvaje que contenían el constructo y no mostraron un fenotipo visible.

Figura 3 - Secuencia genómica de SAL1 alx8 (Secuencia de Acceso TAIR: 4010730406; Nombre: AT5G63980.1; longitud de secuencia (pb): 2122; Fecha de la última modificación: 17/04/2007). Esta secuencia se identifica en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 1. Esta secuencia genómica es una versión actualizada del Núm. de Acceso TAIR 2160829 anterior, y que localiza el codón de inicio 162 nucleótidos aguas arriba del presunto codón de inicio en el Núm. de acceso TAIR 2160829.

Se destacan la mutación puntual en alx8 (G1226a), el codón de inicio (ATG) y el codón de parada (TGA).

Figura 4 - Secuencia de Aminoácidos de alx8 (Núm. de acceso TAIR: Secuencia AA: 4010745380; Nombre: AT5G63980.1, longitud: 407aa; Fecha de la última modificación: 16/08/2007). Esta secuencia se identifica en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 2.

Se destaca el cambio de aminoácido en alx8 (G217D).

Figura 5 - Alineamiento de proteínas con homología con SAL1

Las proteínas con homología con SAL1 se identificaron utilizando la herramienta blastp en el sitio de la red del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI; www.ncbi.nlm.nih.gov). Estas fueron alineadas después utilizando ClustalW en el Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI; www.ebi.ac.uk). Los números de acceso son los siguientes: SAL1, AY034894/Q42546 (SEQ ID NO: 46); Oryza sativa, NP_001066326/NM_001072858 (SEQ ID NO: 44); Zea mays, AAK57915/AF288075 (SEQ ID NO: 45). "*" Significa que los residuos de esa columna son idénticos en todas las secuencias, ":" significa que se han observado sustituciones conservadas, y "." significa que se observan sustituciones semi-conservadas.

Figura 6 - Homología de EST con el ARNm de SAL1

A. Se encontró que las EST tienen homología con el ARNm de SAL1 utilizando blastn en el sitio de la red del Gene Index Program (TGI; www.compbio.dfci.harvard.edu). El porcentaje de identidad se calculado por medio del mismo programa.

B. Alineamiento de secuencias de las EST enumeradas en A, Las secuencias se alinearon utilizando ClustalW en el sitio de la red EMBL-EBI. "*" Significa que los nucleótidos en esa columna son idénticos en todas las secuencias en el alineamiento. Las siguientes secuencias se identifican en la lista de secuencias: Abeto (SEQ ID NO: 47); Pino (SEQ ID NO: 48); Medicago (SEQ ID NO: 49); Lotus (SEQ ID NO: 50); soja (SEQ ID NO: 51); SAL1 (SEQ ID NO: 52); Oleaginosas (colza) (SEQ ID NO: 53); Chopo (SEQ ID NO: 54); Algodón (SEQ ID NO: 55); Tomate (SEQ ID NO: 56); Patata (SEQ ID NO: 57); Cebolla (SEQ ID NO: 58); Trigo (SEQ ID NO: 59); Cebada (SEQ ID NO: 60); Arroz (SEQ ID NO: 61), y Maíz (SEQ ID NO: 62).

C. Cladograma que muestra una estimación de la ascendencia común basándose en el alineamiento en B. Calculado por el sitio de la red EMBL-EBI.

Figura 7 - Efecto de las condiciones de sequía sobre Col-0 de tipo salvaje, fry1-1 y alx8.

Hubo privación de agua durante 13 días a 21°C, 150 μmol fotones.m-2. S-1, día 16 horas/noche 8 horas. Las plantas son representativas de 5 réplicas biológicas de cada ecotipo. Todas las plantas tenían la misma edad aproximada de desarrollo y todavía no estaban floreciendo al comienzo del período de sequía: las plantas de tipo salvaje tenían 4 semanas de edad, mientras las plantas alx8 y fry1-1 tenían 8 semanas de edad.

Figura 8 - fry1-1 y alx8 son tolerantes a la sequía.

Plantas de 4 semanas de edad se expusieron a condiciones de sequía durante 25 días, a 21°C y 150 μmol

fotones.m-2. S-1, día 12 horas/noche 12 horas.

A) Fotografías de plantas fry1-1, C24 de tipo salvaje, alx8 y Col-0 de tipo salvaje después de 0, 10, 17, 21 y 25 días de exposición a condiciones de sequía. Las plantas son representativas de cinco plantas de cada genotipo en dos experimentos separados.

B) La pérdida de agua del suelo se aproximó por el peso del maceta en el transcurso del tiempo. Se proporcionan tanto el peso del maceta para las plantas en A) como los pesos medios de los macetas. Las barras de error son las desviaciones típicas entre las cinco réplicas biológicas.

Figura 9 - Secuencia genómica de SAL1 del mutante SALK_020882 de A. thaliana tolerante a la sequía (se destacan el codón de inicio (ATG) y el codón de terminación (TGA)). Una línea de inserción de ADN-T en el ecotipo Col-0 obtenido del Arabidopsis Biological Resource Centre (ABRC). La mutación es alélica para alx8.

A) Sitio de inserción dado por TAIR. Éste fue establecido mediante secuenciación de una sola pasada a partir del LB del inserto de ADN-T. Esto proporcionó una secuencia complementaria, es decir hacia el extremo 5' del gen. (SEQ ID NO: 3)

B) Para confirmar la localización de la inserción se realizó la PCR de la cola desde el borde izquierdo del inserto en el ADN de una planta. Se obtuvo la secuencia de ambos lados indicando la posibilidad de un doble inserto. La secuencia obtenida indicó también la deleción de 11 pb alrededor del sitio de inserción. (SEQ ID NO: 4)

Figura 10 - Representación a escala del gen SAL1. Los exones se representan mediante recuadros, los intrones mediante líneas, las flechas representan cebadores diseñados para la amplificación (véase la Tabla 1), la localización de las inserciones salk y fry1-3, y de fry1-1, fry1-2, hos2 y también se muestran las mutaciones puntuales alx8 identificadas.

Figura 11 - Transferencia Western de SAL1. Se comparó la abundancia de la proteína SAL1 en extractos de proteínas foliares solubles totales in vivo de Col-0, C24, alx8 y fry1-1 con 5 ng de la proteína SAL1 recombinante utilizando anticuerpos anti-SAL1 (Fig. 11A) y la proteína foliar total de Col-0 y alx8 (Fig. 11B). Se utilizó la subunidad grande de rubisco detectada mediante tinción de Ponceau como control de carga. Se analizaron dos plantas para cada genotipo y se indican las masas moleculares de los marcadores de proteínas.

Figura 12 - Fotografías, de izquierda a derecha de: plantas Arabidopsis thaliana mutante alx8, mutante fry1-1, Col-0 de tipo salvaje, C24 de tipo salvaje y mutante salk_020882, que muestran la morfología foliar alterada similar del mutante salk_020882 y los mutantes alx8 y la morfología foliar alterada del mutante fry1-1 en comparación con el correspondiente C24 de tipo salvaje.

Figura 13 – Diagrama de barras que muestra el número medio de días de supervivencia de las plantas sin agua. El mutante salk_020882 muestra la mayor tolerancia a la sequía, sobreviviendo durante 18,4 días de media, en comparación con los 16,3 días para el mutante alx8 y los 12,0 días para el tipo salvaje (tamaño de la muestra: tres plantas WT y alx8 y seis plantas salk_020882)

Figura 14 -Fotografías que muestran: Fila inferior -Prueba de sequía; fila superior – controles; de izquierda a derecha: plantas WT (11 días, poco antes de la muerte de la planta para la planta sometida a estrés por sequía), mutantes salk_020882 y mutantes alx8 (ambos mutantes todavía parecen viables después de un tratamiento de sequía de 14 días).

Figuras 15A y 15B - La Figura 15A muestra fotografías, de izquierda a derecha, de plantas Col-0 de tipo salvaje, alx8, salk_020882, fry1-1 y C24 de tipo salvaje después de, de arriba a abajo, 0, 14, 16, y 18 días de exposición a condiciones de sequía, y tres días después de volver a regar. Tres días después de volver a regar, las plantas mutantes alx8 y fly1-1 muestran una fuerte recuperación, incluyendo hojas verdes, turgentes, mientras que las plantas de tipo salvaje muestran poco o ningún signo de recuperación, estando la mayoría de las hojas cloróticas y marchitas. Las plantas mostradas son representativas experimentos por triplicado que implican cinco plantas de cada genotipo. La figura 15B muestra el contenido de agua del suelo (SWC) durante los tratamientos de sequía.

Figuras 16A y 16B - La figura 16A muestra el contenido relativo de agua de la hoja (RWC) y la figura 16B el potencial hídrico foliar de las hojas de Col-0 y alx8 en condiciones sin estrés y después de 12 días de sequía. Las columnas son la media ± desviación típica (DT) de al menos cuatro plantas.

Figura 17 - muestra fotografías para, parte superior, plantas Col-0 de tipo salvaje y, parte inferior, plantas alx8 a las 2, 3, 5 y 8 semanas de edad, que muestran el retraso del desarrollo en las plantas alx8. También resulta evidente que la planta Col-0 de tipo salvaje de 8-semanas de edad está floreciendo (siendo evidentes los primordios florales), mientras la planta alx8 no lo está.

Figura 18 - A muestra un diagrama de barras del grosor de la hoja de las hojas de Col-0 y de hojas de alx8;

B muestra secciones transversales de hojas de Col-0 de tipo salvaje y de hojas de alx8 típicas.

Figura 19 - fotografías que muestran los resultados de la tinción con yodo de hojas de plantas fry1-1, C24 de tipo salvaje, alx8 y Col-0 de tipo salvaje por la mañana (parte superior) y por la noche (parte inferior), demostrando que estos mutantes SAL1 han reducido significativamente los niveles de almidón en sus cloroplastos.

Figura 20 - Análisis de los componentes principales (ACP) de perfiles de metabolitos de mutantes SAL1 y sus respectivos tipos salvajes. La abundancia de más de 150 metabolitos en al menos cuatro réplicas biológicas de cada ecotipo se utilizó para calcular el ACP. Se traza el porcentaje de la varianza total representado por los componentes principales 1 y 2 (PC1 y PC2).

Figura 21 - Muestra el impacto del tamaño, el desarrollo y la morfología sobre la tolerancia a la sequía. (A) Tolerancia a la sequía de Col-0, alx8 y salk_020882 en la misma fase de desarrollo (comienzo de la floración); se muestran imágenes representativas de 27 plantas alx8 y 5 fry1-1 el Día 0 y el Día 9 de sequía. Las plantas se cultivaron en días de 12 horas. (B) Tolerancia a la sequía de las plantas en la misma fase de desarrollo vegetativo (verde maduro), alx8 y fry1-1 de cuatro semanas de edad, Col-0 de ocho semanas de edad. Las plantas son representativas de cinco réplicas biológicas de cada ecotipo, las condiciones de crecimiento fueron días de 16 horas.

(C) Se midieron los pesos de los macetas para (A) y se trazaron como un porcentaje del peso original; se traza la

5 media + DT de cinco de cada línea. (D) Se trazaron las zonas de rosetas de una gama de plantas Col-0 de 30 días de edad cultivadas en dos experimentos separados frente a la viabilidad en sequía. Las condiciones de cultivo fueron días de 8 horas. (E) Deshidratación de las rosetas desprendidas. Los datos son la media ± DT de cuatro réplicas biológicas. El experimento se repitió tres veces. (F) Col-0 (una planta por maceta) y alx8 (dos plantas por maceta) a la misma edad se sometieron a 9 días de privación de agua. Las condiciones de crecimiento fueron días

10 de 16 horas.

Abreviaturas

ABA - ácido abscísico

IP3- 1,4,5-trifosfato de Inositol

I (1,4) P2 - 1,4-bifosfato de inositol

15 I (4,5) P2 - 4,5-bifosfato de inositol

PAP - 3' poliadenosina 5' fosfato

ROS - especies reactivas de oxígeno

WT - de tipo salvaje

Definiciones

20 Según se utiliza en la presente memoria, el término "que comprende" significa "que incluye principalmente, pero no necesariamente exclusivamente ". Las variaciones de la palabra "que comprende", tales como "comprenden" y "comprende", tienen significados correspondientemente similares.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "gen", se refiere a una región definida que está situada dentro de un genoma y que puede comprender secuencias de ácido nucleico reguladoras, responsables de control de la

25 expresión, es decir, de la transcripción y la traducción de la porción codificante. Un gen también puede comprender otras secuencias no traducidas 5' y 3' y secuencias de terminación. Otros elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, los intrones.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "homólogo" en el contexto de las proteínas significa proteínas que tienen sustancialmente las mismas funciones y propiedades similares en diferentes especies, y que, al menos 30 dentro de las regiones, comparten al menos 50% de identidad de aminoácidos. Tales proteínas homólogas pueden compartir, a lo largo de sus secuencias completas de aminoácidos, al menos aproximadamente 30% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 40% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 50% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 60% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 70% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 80% de identidad de aminoácidos, 35 al menos aproximadamente 90% de identidad de aminoácidos o al menos aproximadamente 95% de identidad. Del mismo modo, los homólogos de moléculas de ácidos nucleicos son moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen sustancialmente las mismas funciones y propiedades similares en diferentes especies, en donde las proteínas codificadas comparten, al menos dentro de las regiones, al menos 50% de identidad de aminoácidos (tales homólogos de ácido nucleico pueden compartir significativamente menos de 50% de identidad, 40 debido a la degeneración del código genético, y las diferencias en el uso de codones preferido entre los diferentes géneros y especies de plantas), y pueden compartir al menos aproximadamente 30% de identidad de ácido aminos, al menos aproximadamente 40% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 50% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 60% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 70% de identidad de aminoácidos, al menos aproximadamente 80% de identidad de aminoácidos, al menos

45 aproximadamente 90% de identidad de aminoácidos o% al menos aproximadamente 95 de identidad a lo largo de la totalidad de las secuencias de aminoácidos codificadas.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "mutación" significa cualquier cambio en una molécula de polipéptido o ácido nucleico con respecto a una molécula de polipéptido o ácido nucleico de tipo salvaje a partir de la cual deriva el "mutante" y puede comprender, por ejemplo, cambios de un único o múltiples aminoácidos o

50 nucleótidos, o cambios tanto de nucleótidos como de aminoácidos, incluyendo mutaciones puntuales, mutaciones nulas, mutaciones de desplazamiento del marco, y pueden comprender deleciones o inserciones, o sustituciones de uno o más ácidos nucleicos o aminoácidos, que pueden comprender nucleótidos o aminoácidos de origen natural o no natural o análogos de los mismos.

Un "ácido nucleico", según se menciona en la presente memoria, se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla, doble o en tríplex. El término puede incluir ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. Una secuencia de ácido nucleico concreta también puede incluir implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias. Los términos "ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico" o "polinucleótido" también se pueden usar indistintamente con gen, ADNc, y ARNm codificado por un gen.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se pueden utilizar indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Están incluidos dentro del alcance de estos términos los polímeros en los que uno o más residuos de aminoácidos pueden comprender uno o varios análogos químicos artificiales del correspondiente o los correspondientes aminoácidos de origen natural, así como, o en lugar de, polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también puede incluir polímeros que incluyen modificaciones tales como, pero no limitadas a, glicosilación, anclaje de lípidos, sulfatación, carboxilación gamma de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP.

Los términos SAL1 y FRY1 según se utilizan en la presente memoria, son intercambiables, al igual que los términos SAL1 y FRY1, y estos términos hacen referencia a la misma proteína y la secuencia de nucleótidos codificante.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que las plantas con mutaciones en el gen que codifica SAL1 han incrementado su tolerancia al estrés, incluyendo aumento de la resistencia a la sequía.

La proteína SAL1 es bifuncional, con actividad inositol polifosfato 1-fosfatasa y actividad 3'(2'),5'-bisfosfato nucleotidasa, y está involucrada en el catabolismo de IP3, una molécula pequeña implicada en la señalización del estrés. Existe una variedad de inositol fosfatasas o PTasas, que escinden todos los fosfatos de varias posiciones de las moléculas de IP3. Estas diferentes actividades, a pesar dar todas como resultado una disminución de IP3, a menudo producen diferentes fenotipos, posiblemente debido a diferentes funciones de los productos de la hidrólisis (tales como, I(1,4)P2 e I(4,5)P2. Las diferencias fenotípicas también pueden ser debidas a las actividades secundarias de estas enzimas que han recibido menos atención, tales como la actividad nucleotidasa de SAL1. Además, la localización y las diferencias en los niveles de expresión de las enzimas pueden afectar a los fenotipos. Sorprendentemente, SAL1 tiene una actividad relativamente baja in vitro frente a IP3 (concretamente en comparación con su actividad nucleotidasa).

Se han aislado numerosos mutantes en SAL1 y se denominan mutantes fry1(fiery1; Ishitani, M., LM Xiong, et al. (1997), "Genetic analysis of osmotic and cold stress signal transduction in Arabidopsis: Interactions and convergence of abscisic acid-dependent and abscisic acid-independent pathways", Plant Cell 9(11): 1935-1949; Xiong, L.M., B. H. Lee, et al. (2001), "FIERY1 encoding an inositol polyphosphate 1-phosphatase is a negative regulator of abscisic acid and stress signaling in Arabidopsis", Genes & Development 15(15): 1971-1984) o mutantes hos2 (high expression of osmotic stress regulated gene expresssion2; Lee, H., L. Xiong, et al. (1999), "Cold-regulated gene expression and freezing tolerance in an Arabidopsis thaliana mutant", The Plant Journal 17(3): 301-308; Xiong, L., H. Lee, et al. (2004), "A single amino acid substitution in the Arabidopsis FIERY1/HOS2 protein confers cold signaling specificity and lithium tolerance", The Plant Journal 40: 536-545). Como se ha informado anteriormente, estos mutantes fueron aislados en un escrutinio para determinar el cambio de expresión de la respuesta del gen RD29A al estrés. El mutante fry1-1 tiene un incremento de la expresión de RD29A en condiciones normales y también después del tratamiento de estrés por frío, sal y osmótico y con ABA. Se informó que esto se debía a una mutación puntual que daba como resultado un codón de terminación en el sexto exón de la proteína SAL1 (At5g63980), dando como resultado una proteína truncada que no contiene una hélice α conservadas que contiene un motivo WD-X11-GG, necesario para la coordinación de los iones metálicos, y el fosfato y también para la activación nucleofílica del agua. Como resultado, la proteína no tiene actividad contra IP3 o PAP. Se informó de que el mutante fry1-1, tenía un incremento de la sensibilidad al estrés, para el estrés por sal, frío y osmótico (Xiong et al, 2001). La expresión del gen en respuesta al estrés, tal como HSP70 (At1g16030), COR15A (At2g42540), KIN1 (At5g15960) y ADH (At1g77120), también se había incrementado en el mutante en comparación con el de tipo salvaje en respuesta al estrés (Xiong et al, 2001) conduciendo a la creencia de que Sal1 actúa como un regulador negativo de las rutas de respuesta al estrés. También se informó de que otros mutantes fry1, fry1-2 y fry1-3, eran mutantes nulos de características similares (Xiong et al, 2001). El mutante hos2-1 es un mutante sensible a la temperatura cuya expresión génica en respuesta al estrés es alterada a baja temperatura y es sensible a estrés por frío (Xiong et al, 2004). Este expresión génica del mutante no está alterada en condiciones normales o por estrés osmótico o por ABA, en comparación con las plantas de tipo salvaje (Lee et al, 1999). No se ha informado de tolerancia a la sequía, salinidad, luz, frío o calor en los mutantes fry1 ni hos2.

Los autores de la presente invención han aislado previamente el mutante de Arabidopsis thaliana, alx8, en un escrutinio de mutantes para determinar la inducción alterada de la enzima antioxidante ascorbato peroxidasa 2 (APX2) en condiciones normales y después de estrés por exceso de luz. El mutante alx8 tenía un incremento de la expresión de APX2 en ambas condiciones, así como una alteración de la morfología foliar y un incremento de la tolerancia a la sequía (Rossel, J. B., P. B. Walter, et al. (2006), "A mutation affecting ASCORBATE PEROXIDASE 2 gene expression reveals a link between responses to high light and drought tolerance", Plant, Cell and Environment 29(2): 269-281). Se encontró que estas características eran co-segregantes, lo que indica que eran el resultado de una única mutación puntual. También se encontró que alx8 tenía alterada la expresión de varios genes en respuesta al estrés indicando la regulación diferencial de las múltiples rutas implicadas en la señalización de la respuesta al estrés por sequía en Arabidopsis. Sin embargo, la naturaleza de este mutante no ha sido determinada hasta ahora. Después de la clonación posicional del mutante, se ha descubierto que la mutación se encuentra en el gen SAL1 caracterizado anteriormente. Las investigaciones en el mutante nulo de este gen, fry1-1, indican ahora que éste también ha tenía incrementada la tolerancia a la sequía. También se ha estudiado ahora otro mutante de Arabidopsis thaliana, denominado salk_020882, que comprende un inserto de ADN-T de aproximadamente 10kb en el gen SAL1 y se ha encontrado que presenta un incremento de tolerancia a la sequía con respecto a las plantas de tipo salvaje. Por lo tanto, existe el potencial de mejorar la tolerancia a la sequía de las especies de plantas importantes desde el punto de vista agrícola, mediante la modificación de la expresión de este gen.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para obtener una planta con aumento de resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, en donde dicha resistencia al estrés se selecciona entre la resistencia a la sequía y la resistencia a las estreses asociados con las rutas mediadas por especies reactivas de oxígeno, comprendiendo dicho método: (a) la introducción de al menos una mutación o un ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales, (b) la generación de una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales, y (c) la selección de una o más plantas que tienen una resistencia incrementada a la sequía y/o la resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas de oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje. De acuerdo con una realización, el método comprende introducir al menos una mutación en el gen SAL1 o un homólogo del mismo, o inhibir o suprimir la expresión del gen SAL1 o un homólogo del mismo.

Se puede introducir una mutación que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales en las una o más células vegetales mediante cualquiera de los métodos adecuados que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos adecuados pueden comprender la exposición de las una o más células vegetales (que pueden ser células de semillas vegetales, o células de una parte de una planta, así como células vegetales aisladas) a medios mutagénicos químicos o físicos, o medios mutagénicos insercionales tales como transposones, retrotransposones, retrovirus, o ADN-T. Los materiales y métodos adecuados para la introducción de mutaciones en un genoma de la planta también se describen, por ejemplo, en la Publicación de patente internacional WO 98/26082, "Arabidopsis Protocols" (2a Edición, Salinas, J. y Sanchez-Serrano, J., eds, Methods in Molecular Biology 323 (2006), Humana Press), y "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al. (eds), John Wiley & Sons (2000)).

La mutación también puede ser introducida en las una o más células vegetales cruzando una planta de tipo salvaje con una planta que comprende la mutación (como se determinó previamente mediante escrutinio y/o análisis genético -las plantas que comprenden una mutación deseada pueden ya existir en germoplasma/cultivos/colecciones de semillas/variedades vegetales disponibles), y las plantas se pueden generar a partir de la semilla resultante y después escrutarlas para determinar la herencia de la mutación.

De acuerdo con una realización de la invención, se introduce una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales, y puede comprender una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia nucleotídica que codifica SAL1 o uno de sus homólogos. En una realización, la mutación es una mutación nula de SAL1. Alternativamente, la mutación puede dar como resultado un producto expresado que, sin embargo, tiene al menos una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos. Las mutaciones de SAL1 identificadas en el curso de los presentes estudios que dan como resultado al menos un aumento de la resistencia a la sequía de las plantas de Arabidopsis thaliana, con respecto a las plantas de tipo salvaje incluyen el mutante fry1-1, alx8 y salk_02882. La mutación fry1-1 da como resultado un cambio del aminoácido 341o de triptófano a un codón de terminación, lo que da como resultado una

proteína truncada que pierde una hélice α5 que se requiere para la actividad de la enzima (At5g63980). El mutante

alx8 tiene una mutación puntual que comprende un cambio de guanina a adenina en el par de bases 1226o de la secuencia genómica At5g63980.1 (Secuencia TAIR: 4010730406 (17 de abril de 2007), Núm. de acceso: NM_125794.4: posición 1226 del SEQ ID NO: 1). El mutante alx8 expresa una proteína SAL1 mutante, que comprende un cambio de aminoácido de glicina a ácido aspártico en el aminoácido 217o de la secuencia de aminoácidos (Secuencia TAIR 4010745380 (16 de agosto de 2007); Núm. de Acceso: NP_201203.2; SEQ ID NO: 2), y el mutante salk_02882 comprende una inserción de ADN-T de aproximadamente 10kb o bien entre las posiciones 734 y 735 del SEQ ID NO: 1 o bien remplazando los nucleótidos 735 a 745 del SEQ ID NO: 1. Los mutantes adicionales que se espera que tengan una mayor resistencia al estrés, incluyendo un incremento de la resistencia a la sequía son los mutantes fry1-2, fry1-3 y hos2. El mutante fry1-2 comprende una mutación de guanina a adenina en el par de bases 736o de la secuencia genómica At5g63980.1 (Secuencia TAIR: 4010730406, Núm. de acceso: NM_125794.4: posición 736 del SEQ ID NO: 1) que da como resultado el remplazo del residuo de ácido glutámico de la posición 126 (SEQ ID NO: 2) por una lisina que da como resultado una proteína inactiva. El mutante fry1-3 comprende una inserción de ADN-T de 6,7kb entre los exones quinto y sexto en el par de bases 1518o de la secuencia genómica At5g63980.1 (Secuencia TAIR: 4010730406, Núm. de acceso: NM_125794.4: posición 1518 del SEQ ID NO: 1) que no da como resultado un transcrito de ARN. El mutante hos2-1 comprende una mutación de citosina a timina en el par de bases 731o de la secuencia genómica At5g63980.1 (Secuencia TAIR: 4010730406, Núm. de acceso: NM_125794.4: posición 731 del SEQ ID NO: 1) que da como resultado el remplazo del residuo de alanina de la posición 124 (SEQ ID NO: 2) por una valina que da como resultado una proteína expresada con actividad sensible a la temperatura.

Otros mutantes de SAL1, u homólogos del mismo, pueden ser obtenidos o generados por medio de una experimentación rutinaria sencilla basándose en las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria y, por ejemplo, el alto grado de conservación que esta secuencia de nucleótidos (y proteína codificada) muestra - véanse, por ejemplo, las Figuras 5 y 6 .

Los métodos de la presente invención puede emplear cualquier agente mutagénico conocido en la técnica (empleando métodos también conocidos en la técnica), incluyendo, pero no limitados a luz ultravioleta, radiación de rayos X, radiación gamma o mutagénesis por neutrones rápidos, N-etil-N-nitrosourea (ENU), metilnitrosourea (MNU), procarbazina (PRC), trietilenmelamina (TEM), monómero de acrilamida (AA), clorambucilo (CHL), melfalán (MLP), ciclofosfamida (CPP), sulfato de dietilo (DES), metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), 6mercaptopurina (6-MP), mitomicina C (MMC), N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), 3H2O, y uretano (UR).

La frecuencia de la modificación genética tras la exposición a uno o más agentes mutagénicos se puede modular variando la dosis y/o la repetición del tratamiento, y se puede ajustar a una aplicación concreta. En una realización, la dosis el régimen de tratamiento y no inducen citotoxicidad sustancial a las una o más células.

Las mutaciones en SAL1 o uno de sus homólogos pueden ser detectadas y seguidas (a través de las generaciones) sondeando con secuencias de ADN de SAL1 conocidas utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica y sondas o cebadores adecuados basados en el gen o la secuencia de nucleótidos que codifican SAL1 o uno de sus homólogos. Si la mutación es en un gen distinto de SAL1, puede no ser necesario identificar, localizar y/o caracterizar la mutación antes de que pueda ser rastreada/seguida a través de generaciones de plantas. Los métodos adecuados para identificar, localizar y caracterizar mutaciones desconocidas son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en una serie de textos convencionales bien conocidos, tales como Sambrook,

J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. y Russell, DW (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y referencias allí citadas y Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000). Véase también Rossel, JB, Cuttriss, A. y Pogson, BJ "Identifying Photoprotection Mutants in Arabidopsis thaliana" in Methods in Molecular Biology 274: 287-299 (Carpentier, R. ed, Humana Press). Los métodos más recientes para identificar los alelos mutantes incluyen 'Tilling' y fusión de alta resolución (HRM).

El TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes, "Detección de lesiones locales inducidas en genomas") es un método de la biología molecular que permite la identificación dirigida de mutaciones en un gen específico. El método combina una técnica convencional (por ejemplo, mutagénesis con un mutágeno químico tal como Metanosulfonato de etilo (EMS)) con una técnica de escrutinio de ADN sensible que identifica mutaciones de una sola base (también denominadas mutaciones puntuales) en un gen diana. La primera publicación que describió el TILLING en Arabidopsis (McCallum CM, L Comai, Greene EA, Henikoff S "Targeted screening for induced mutations", Nat Biotechnol. (2000) Apr;18(4):455-7) utilizó dHPLC HPLC para identificar las mutaciones. Se consiguió que el método tuviera un rendimiento más alto mediante el uso de la enzima de restricción Cel-I combinada con un sistema basado en gel para identificar las mutaciones (Colbert T, Till BJ, Tompa R, Reynolds S, Steine MN, Yeung AT, McCallum CM, Comai L, Henikoff S, "High-throughput screening for induced point mutations", Plant Physiol. (2001) Jun;126(2):480-4). Se han combinado para TILLING otros métodos de detección de mutaciones, tales como resecuenciación de ADN. Desde entonces se ha utilizado TILLING como un método de genética inversa en otros organismos, tales como el pez cebra, maíz, trigo, arroz, soja, tomate y lechuga. Véanse también: McCallum CM, Comai L, Greene EA, Henikoff S. "Targeting induced local lesions in genomes (TILLING) for plant functional genomics" Plant Physiol. (2000) Jun;123(2):439-42;Colbert T, Till BJ, Tompa R, Reynolds S, Steine MN, Yeung AT, McCallum CM, Comai L, Henikoff S. High-throughput screening for induced point mutations", Plant Physiol. (2001) Jun;126(2):480-4; Draper BW, McCallum CM, Stout JL, Slade AJ, Moens CB, "A high-throughput method for identifying N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)-induced point mutations in zebrafish", Methods Cell Biol. (2004);77:91-112; y Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeffler D, Steine MN, Facciotti D, "A reverse genetic, nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING", Nat Biotechnol. (2005) Jan;23(1):75-81.

La HRM (Fusión de Alta Resolución) es un progreso reciente que puede ampliar considerablemente la utilidad del análisis tradicional de fusión del ADN mediante el aprovechamiento de las mejoras recientes en el instrumental de la fusión de alta resolución y el progreso de los colorantes que se unen a ADN específico de doble cadena (ADNdh) que se pueden utilizar a concentraciones suficientemente elevadas como para saturar todos los sitios de doble cadena se producen durante las amplificaciones por PCR (véase http://www.corbettlifescience.com/control.cfm?page = Introduction_4 and bhcp = 1), así como: Dufresne SD, Belloni DR, Wells WA, Tsongalis GJ, "BRCA1 and BRCA2 Mutation Screening using SmartCyclerII high-resolution melt curve analysis", Arch Pathol Lab Med (2006) 130: 185187; Graham R, Liew M, Meadows C, Lyon E, Wittwer CT, "Distinguishing different DNA heterozygotes by high resolution melting", Clinical Chemistry (2005) 51: 1295-1298; Hermann MG, Durtschl JD, Bromley K, Wittwer CT, Voelkerding KV, "Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes", Clinical Chemistry (2006) 52: 494-503; Liew M, Pryor R, Palais R, Meadows C, Erali M, Lyon E, Wittwer C, "Genotyping of single nucleotide polymorphisms by high resolution melting of small amplicons", Clinical Chemistry (2004) 50: 1156-1164; Margraf RL, Mao R, Highsmith WE, Holtegaard LM, Wittwer CT, "Mutation Scanning of the RET protooncogene using high resolution melting analysis", Clinical Chemistry (2006) 52: 138-141; NGRL (Wessex) Reference Reagent Report January 2006, "Plasmid based generic mutation detection reference reagents; production and performance indicator field trial" (www.ngrl.org.uk/Wessex/downloads.htm); NGRL (Wessex) Reference Reagent Report January 2006. "Production and field trial evaluation of reference reagents for mutation screening of BRCA1, BRCA2, hMLH1 and MHS2" (www.ngrl.org.uk/Wessex/downloads.htm); NGRL (Wessex) Reference Reagent Report June 2006, "Mutation Scanning by High Resolution Melts: Evaluation of Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Life Science), HR-1™ and 384 well LightScanner™ (Idaho Technology)" (www.ngrl.org.uk/Wessex/downloads.htm); Reed GH, Wittwer CT, "Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high resolution melting analysis", Clinical Chemistry (2004) 50: 1748-1754; Willmore-Payne C, Holden JA, Tripp S, Layfield LJ, "Human malignant melanoma: detection of BRAF- and c-kit-activating mutations by high-resolution amplicon melting analysis", Human Pathology (2005) 36: 486-493; Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Pryor RJ, "High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen" Clinical Chemistry (2003) 49: 853-860; Worm J, Aggerholm A, Guldberg P, "In-tube DNA methylation profiling by fluorescence melting curve analysis" Clinical Chemistry (2001) 47: 1183-1189; Zhou L, Myers AN, Vandersteen JG, Wang L, Wittwer CT, "Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye", Clinical Chemistry (2004) 50: 1328-1335; and Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT, "High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution", Clinical Chemistry (2005) 51: 1770-1777.

Se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos o se pueden aplicar otras técnicas para escrutar líneas para determinar mutaciones/inserciones en el gen SAL1 o uno de sus homólogos. A través de la reproducción, se puede desarrollar a continuación una línea de plantas que sea homocigótica para la copia mutada del gen SAL1 o uno de sus homólogos. Los cebadores de PCR para este propósito se pueden diseñar de modo que una gran parte de la secuencia codificante del gen SAL1 (o uno de sus homólogos) sea amplificado específicamente utilizando la secuencia del gen SAL1 u homólogo procedente de la especie que vaya a sondear (véase, por ejemplo, Baumann,

E. et al. (1998), "Successful PCR-based reverse genetic screens using an En-1-mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descent", Theor. Appl. Genet. 97:729 734).

Se pueden aislar otros mutantes de tipo SAL1 a partir de poblaciones mutantes o germoplasma existente utilizando los fenotipos distintivos caracterizados de acuerdo con la presente invención (tales como, tolerancia a la sequía, reducción de la actividad asociada a SAL1, o cambios en la expresión génica en comparación con las plantas de tipo salvaje). Después de un período de crecimiento adecuado y de la aplicación de un estrés abiótico adecuado, tal como privación de agua, las plantas se pueden escrutar para determinar el fenotipo del mutante SAL1. Se puede establecer después que el fenotipo está causado por una mutación en SAL1 o uno de sus homólogos por medio de métodos moleculares bien conocidos en la técnica.

Los mutantes de tipo SAL1, incluyendo los mutantes heterocigóticos para el alelo, y que no pueden expresar el fenotipo resistente al estrés, se pueden escrutar también, como se describe más adelante, y utilizar los mutantes para programas de reproducción para la introgresión de la mutación en la línea homocigótica, o aislar y utilizar el gen mutante en técnicas recombinantes para la generación de plantas mutantes.

Si bien los mutantes de la presente invención se pueden generar por mutagénesis al azar (o puede existir ya), se puede diseñar recombinantemente cualquier planta para que presente un fenotipo similar, por ejemplo una vez que la base genética de la mutación, tal como un gen SAL1 mutado, se ha determinado. Para una descripción general de la transformación y la regeneración de plantas véanse, por ejemplo, Walbot et al. (1983) in "Genetic Engineering of Plants", Kosuge et al. (eds.) Plenum Publishing Corporation, 1983 y "Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods", Gamborg and Phillips (Eds.), Springer-Verlag, Berlin (1995). Véase también Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y referencias allí citadas y Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000).

Por ejemplo, un método de la invención puede comprender la inserción en dichas una o más células vegetales de un ácido nucleico exógeno que inhibe la expresión de la actividad de SAL1 endógena o uno de sus homólogos (por ejemplo, a través de regiones reguladoras que controlan la expresión de SAL1 o uno de sus homólogos, la secuencia codificante de SAL1 o uno de sus homólogos, o el ARNm traducido de la secuencia codificante de SAL1 o uno de sus homólogos), o que sustituye la expresión de SAL1 endógena o uno de sus homólogos, por la expresión de una proteína exógena. La proteína exógena puede ser una SAL1 mutante exógena o uno de sus homólogos, o cualquier otra proteína adecuada, tal como una proteína que proporciona un fenotipo escrutable.

En una realización, el ácido nucleico exógeno puede comprender un oligonucleótido o polinucleótido que introduce una mutación que comprende inserciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos simples o múltiples, en la secuencia de nucleótidos endógena que codifica SAL1 o uno de sus homólogos a través de la recombinación homóloga.

Se pueden introducir inserciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos simples o múltiples a través de la recombinación del sitio de la mutación diana con una secuencia nucleótidos dirigida introducida. Tal secuencia de nucleótidos introducida puede comprender, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que se va a introducir en el genoma flanqueada a ambos lados por secuencias de nucleótidos homólogas a secuencias diana contiguas en o situadas a cada lado de un punto de inserción de la mutación deseada. De acuerdo con los métodos de la presente invención, una secuencia de nucleótidos que se va a introducir en el genoma también puede incluir un marcador seleccionable conectado operativamente a las regiones reguladoras deseadas (que pueden incluir, por ejemplo, un promotor inducible por estrés).

Las secuencias de nucleótidos homólogas a las secuencias diana pueden ser isogénicas a las secuencias diana para favorecer de este modo la frecuencia de recombinación homóloga.

También se pueden utilizar secuencias de nucleótidos homólogas que no son estrictamente isogénicas a las secuencias diana. Aunque los emparejamientos erróneos entre las secuencias de nucleótidos homólogas y las secuencias diana pueden afectar negativamente a la frecuencia de recombinación homóloga, la isogenicidad no es estrictamente necesaria y puede ser suficiente una homología sustancial. Para los fines de la presente invención, el nivel de homología entre las secuencias homólogas y las secuencias diana puede ser de al menos aproximadamente 90% de identidad, al menos aproximadamente 95% de identidad, al menos aproximadamente 99% de identidad o 100% de identidad.

Una secuencia diana de nucleótidos puede estar comprendida en un vector. Los vectores representativos incluyen plásmidos, cósmidos, y vectores virales. Los vectores también pueden comprender ácidos nucleicos que incluyen elementos de control de la expresión, tales como señales de control de la transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación, sitios internos de entrada al ribosoma, promotores, intensificadores, etc., en donde los elementos de control están asociados operativamente con un ácido nucleico que codifica un producto génico. La selección de estos y otros elementos vectores comunes es convencional y muchas de tales secuencias pueden derivar de vectores disponibles en el mercado. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. y Russell, DW (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y las referencias allí citadas y Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000).

Se puede introducir un vector dirigido en células diana utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica para introducir ADN en las células, incluyendo pero sin estar limitado a microinyección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, liberación mediada por liposomas, infección viral, fusión de protoplastos y absorción mediada por partículas.

Opcionalmente, se administra simultáneamente un ADN dirigido con una recombinasa, por ejemplo recA, a una célula diana para aumentar de ese modo la tasa de recombinación homóloga. La célula o células diana puede comprender ya, o haber sido transformadas para que comprendan, secuencias diana de recombinasa adecuadas, si fuera necesario. Por ejemplo, se pueden cargar una o varias proteínas recombinasa en un ADN dirigido como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.255.113. Para mejorar el proceso de carga, el ADN dirigido puede contener una o más secuencias de nucleación recombinogénicas. El ADN dirigido también puede estar recubierto con una proteína recombinasa preincubando el polinucleótido dirigido con un recombinasa, por medio de lo cual la recombinasa se une de forma no covalente al polinucleótido. Véanse, por ejemplo, A. Vergunst et al (1998), Nucleic Acids Res. 26:2729 y A. Vergunst y P. Hooykaas (1998), Plant Molec. Biol. 38:393 406, Publicaciones de patente internacional WO 99/25821, WO 99/25840, WO 99/25855, y WO 99/25854 y Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.780.296, 6.255.113, y 6.686.515.

De acuerdo con una realización alternativa para llevar a cabo un método de la invención, se puede crear una planta con un incremento de resistencia al estrés, con respecto a una planta de tipo salvaje, mediante la inhibición de la traducción del ARNm de SAL1 (o uno de sus homólogos) por medio de ARN de interferencia (ARNi), técnicas de silenciamiento génico antisentido o post-transcripcionales. Se puede utilizar El gen SAL1 o uno de sus homólogos, de la especie elegida como diana para la regulación a la baja, o uno de sus fragmentos, para controlar la producción de la proteína codificada. Se pueden utilizar para este propósito moléculas antisentido completas. Alternativamente, se pueden utilizar oligonucleótidos de doble cadena, oligonucleótidos efectores y/o antisentido, o una combinación de los mismos dirigidos a regiones específicas del ARN codificado por SAL1. El uso de moléculas de oligonucleótidos para disminuir los niveles de expresión de un gen predeterminado es conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Hamilton, A.J. and Baulcombe, D.C. (1999), "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants", Science 286:950-952; Waterhouse P.M. et al (1998), "Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964; y solicitudes de patente intenacional and International patent publications WO 99/53050, WO 99/49029, WO 99/32619). Se pueden proporcionar moléculas de oligonucleótido in situ transformando células vegetales con un constructo de ADN que, tras la transcripción, produce secuencias de ARN de doble cadena y/o antisentido, que pueden ser secuencias de completas o parciales. El efecto de silenciamiento génico se puede intensificar produciendo en exceso secuencias efectoras y/o antisentido (que pueden ser de completas o parciales) de manera que se produzca una alta cantidad de ARNdh.

Las plantas transgénicas con uno de los transgenes mencionados anteriormente se pueden generar utilizando métodos de transformación vegetal convencionales conocidos por los expertos en la técnica que incluyen, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, tratamiento de protoplastos con cationes o polietilenglicol, electroporación, bombardeo de micropartículas, agitación de suspensiones celulares en disolución con microcuentas

o micropartículas recubiertas con el ADN transformante, absorción directa de ADN, absorción de ADN mediada por liposomas, y similares, como se describe también en una amplia variedad de textos disponibles públicamente, tales como: "Methods for Plant Molecular Biology" (Weissbach & Weissbach, eds., 1988); Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana" Plant J. 16, 735-743; "Methods in Plant Molecular Biology" (Schuler & Zielinski, eds., 1989); "Plant Molecular Biology Manual" (Gelvin, Schilperoort, Verma, eds., 1993); y "Methods in Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual" (Maliga, Klessig, Cashmore, Gruissem & Varner, eds., 1994). Véanse también Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y referencias allí citadas y Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000).

El método preferido de transformación puede depender de la planta que se vaya a transformar. A menudo se utilizan vectores de Agrobacterium para transformar especies dicotiledóneas. Para la transformación de especies monocotiledóneas, con frecuencia son útiles el bombardeo biolístico con partículas recubiertas con ADN transformante y fibras de silicio recubiertas con ADN transformante para la transformación nuclear. Sin embargo, en la actualidad se conoce la transformación de especies monocotiledóneas mediada por Agrobacterium, incluyendo el trigo (véanse, por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 97/48814, véanse también Hiei, Y. et al (1994), Plant J. 6 (2):271-282 y la publicación de patente internacional WO 92/06205).

Los constructos de ADN para la transformación de una planta seleccionada pueden comprender una secuencia codificante de interés conectada operablemente a secuencias reguladoras 5' adecuadas (por ejemplo, promotores y secuencias reguladoras de la traducción) y secuencias reguladoras 3' (por ejemplo, terminadores). En una realización preferida, la región codificante está colocada bajo un promotor constitutivo potente, tal como el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) o el promotor 35S del virus mosaico de la escrofularia. Otros promotores constitutivos contemplados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a: promotores de ADN-T de manopina sintetasa, nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS).

También se contempla que las plantas transgénicas que expresan una secuencia codificante de SAL1 efectora o antisentido bajo un promotor inducible están dentro del alcance de la presente invención. Los promotores inducibles por estrés, tales como los promotores inducidas por exceso de luz, sequía, salinidad o temperatura están especialmente contemplados por la presente invención. Los promotores que se pueden utilizar de acuerdo con la invención pueden incluir, por ejemplo, los promotores del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (Rubisco) o los promotores del gen de la proteína de unión a clorofila a/b (CAB) para la expresión en tejido fotosintético; los diferentes promotores del gen de la proteína de almacenamiento de las semillas para la expresión en semillas; o los promotores del gen de la glutamina sintetasa específica de la raíz para la expresión en el sistema radicular de la planta transformada.

La región codificante también puede estar conectada operablemente a una secuencia reguladora 3' apropiada. Por ejemplo, se puede utilizar la región de poliadenilación de la nopalina sintetasa (NOS) o la región de poliadenilación de la octopina sintetasa (OCS).

Utilizando un sistema vector binario de Agrobacterium para la transformación, se puede conectar la región codificante seleccionada, bajo el control de un promotor constitutivo o inducible como se ha descrito anteriormente, a un marcador nuclear de resistencia a fármacos, tal como resistencia a kanamicina. Otros sistemas marcadores seleccionables útiles incluyen, pero no se limitan a: otros genes que confieren resistencias a antibióticos (p. ej., resistencia a higromicina o bialafos) o resistencia a herbicidas (p. ej., resistencia a la sulfonilurea, fosfinotricina, o glifosato).

Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para transformar cualquier célula vegetal. De esta manera, se pueden obtener plantas, células vegetales, tejido vegetal, semillas, y similares modificados genéticamente. De acuerdo con una realización, la célula o las células vegetales que se van a transformar se pueden seleccionar entre familias de plantas importantes desde el punto de vista económico y/o agrícola, incluyendo Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae/Amaranthaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Gramineae, Leguminosae, Poaceae , Rosaceae o Solanaceae.

Las células que han sido transformadas se pueden desarrollar hasta plantas de acuerdo con los métodos convencionales conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, McCormick, S. et al (1986), Plant Cell Reports 5:81-84). Las plantas resultantes se pueden auto-polinizar, polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes o hibridar, e identificar la planta o plantas resultantes que tienen actividad reducida o inactivada asociada con SAL1 o uno de sus homólogos. Dos o más generaciones se pueden desarrollar para asegurar que esta característica fenotípica se mantiene establemente. Alternativamente, en cultivos propagados vegetativamente, se pueden propagar plantas mutantes/transgénicas maduras mediante esquejes o mediante técnicas de cultivo de tejidos para producir plantas idénticas. Se puede llevar a cabo la selección de plantas mutantes/transgénicas y se pueden obtener nuevas variedades y propagarlas vegetativamente para su uso comercial.

Las plantas transformadas/mutadas mediante los métodos de la invención se pueden escrutar basándose en la carencia de la proteína SAL1, o uno de sus homólogos, o de su actividad o mediante un aumento de la resistencia al estrés (tal como sequía), análisis molecular utilizando sondas de oligonucleótidos específicas y/o amplificación del gen diana.

De acuerdo con una realización de la invención, la planta resultante tiene una resistencia incrementada a la sequía,

o al estrés por luz o una resistencia la sequía y a la luz con respecto a una planta de tipo salvaje, o cualquier combinación de las mismas. De acuerdo con una realización específica de la invención, la planta resultante tiene una resistencia incrementada a la sequía con respecto a una planta de tipo salvaje.

En el curso de los presentes estudios, también se encontró que las mutaciones que afectaban a la actividad de SAL1 en las plantas afectaban al momento de la floración, así como a la forma de hoja, de una manera característica, y afectaba espectacularmente al metabolismo de las plantas mutantes, en comparación con el tipo salvaje.

En particular, el momento de la floración se retrasó significativamente en todos los mutantes para Sal1 estudiados, en aproximadamente 4-5 semanas para las plantas estudiadas (proporcionando de ese modo un retraso en la floración de aproximadamente 100%). Dependiendo de la mutación o el ácido nucleico exógeno que causaba el retraso del momento de la floración, y de la planta en la que se introducía la mutación o el ácido nucleico exógeno, se podía esperar que el momento de la floración se retrasara en diferentes cantidades de tiempo, por ejemplo el momento de la floración se podía retrasar de aproximadamente 7 días a aproximadamente 100 días, por ejemplo de aproximadamente 14 días a aproximadamente 80 días, de aproximadamente 21 días a aproximadamente 60 días, de aproximadamente 25 días a aproximadamente 50 días, de aproximadamente 30 días a aproximadamente 40 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 35 días, aproximadamente 40 días, aproximadamente 45 días, aproximadamente 50 días, aproximadamente 60 días, aproximadamente 80 días o aproximadamente 100 días. La actividad alterada de SAL1, incluyendo, pero no limitada a la expresión en exceso, también puede adelantar el comienzo del momento de floración en márgenes de tiempo similares.

La forma de la hoja también se vio afectada de manera significativa, dando como resultado hojas con mayor espesor que las de las plantas de tipo salvaje, y que también eran más cortas y más redondas con bordes más lobulados. La superficie de las hojas observadas a menudo fue ondulada y la longitud del pecíolo reducida, proporcionando a la roseta de hojas una apariencia de tipo lechuga. El aumento de la ondulación de la superficie de la hoja podría aumentar el efecto de capa límite, disminuyendo la transpiración.

El análisis metabolómico reveló que ambos mutantes exhiben una reprogramación similar, espectacular del metabolismo, incluyendo el aumento de los niveles de poliamina implicada en la tolerancia al estrés, putrescina, y la acumulación de diversos derivados de carbohidratos osmoprotectores potenciales desconocidos.

También se proporcionan porciones de plantas, que incluyen pero no se restringen a hojas, tallos, raíces, tubérculos, flores, frutos y semillas obtenidos de plantas obtenidas mediante los métodos de la presente invención.

Métodos para detectar mutaciones en SAL1 o sus homólogos

El escrutinio en una planta de la presencia de al menos un alelo mutante de una secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o uno de sus homólogos, puede comprender el análisis de ADN de la planta utilizando al menos una molécula de ácido nucleico adecuada como sonda o cebador que es capaz de hibridar con un gen de SAL1 o uno de sus homólogos, en condiciones restrictivas. En un método más específico, el método de escrutinio puede comprender el uso de al menos un par de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación de una región del gen SAL1 o uno de sus homólogos, que comprende un cebador directo y un cebador inverso para detectar la presencia o ausencia de una mutación en dicha región. La región puede comprender el gen SAL1 completo o uno de sus homólogos, o puede comprender solamente una porción del mismo, tal como, por ejemplo (y en referencia a la Figura 10), la región de nucleótidos que comprende el exón 3, el intrón entre los exones 3 y 4, el exón 5, el intrón entre los exones 5 y 6, el exón 6, y el intrón entre los exones 6 y 7, o cualquier combinación de los mismos.

El ADN del sujeto que se va a evaluar se puede extraer mediante diversos métodos adecuados conocidos por los expertos en la técnica, tales como los descritos en una amplia variedad de textos bien conocidos, incluyendo (pero no limitados a) Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. y Russell, DW (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y referencias allí citadas y Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000). Véanse también los métodos descritos por Lukowitz, W., Gillmor, CS y Scheble, WR. (2000) en "Positional Cloning in Arabidopsis: Why It Feels Good to Have a Genome Initiative Working for You" Plant Physiology 123, 795805, y referencias allí citadas.

Una vez que se ha aislado el ADN adecuado, éste puede ser analizado para determinar la presencia o ausencia de una mutación mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, y cuyo método/estrategia empleada puede depender de la especificidad deseada, y de la disponibilidad de secuencias y/o enzimas adecuadas para el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Los métodos adecuados pueden implicar la detección de uno o varios productos de hibridación marcadas entre una sonda específica de la mutación y al menos una porción del gen SAL1 o uno de sus homólogos o, más típicamente, mediante la amplificación de al menos una porción del gen SAL1 o uno de sus homólogos, utilizando un cebador y una sonda adecuada, o utilizando un par de cebadores (cebadores directo e inverso) para la amplificación de una porción específica del gen SAL1 o uno de sus homólogos, seguido o bien de secuenciación parcial y/o completa directa del ADN amplificado, o bien del análisis RFLP de los mismos. Los pares de cebadores adecuados para la amplificación de porciones del gen SAL1 se proporcionan en la Tabla 1 (véase también la Figura 10) - se pueden diseñar otros cebadores o pares de cebadores adecuados para el análisis del gen SAL1 o uno de sus homólogos basándose en el SEC ID NO: 1, la secuencia proporcionada At5g63980 (Secuencia TAIR: 4010730406, Número de acceso: NM_125794.4) u homólogos de los mismos (véase, por ejemplo, la Fig. 6B).

Los métodos y reactivos para su uso en una reacción de amplificación por PCR son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los protocolos y reactivos adecuados dependerán en gran medida de las circunstancias individuales. Se puede obtener orientación de una variedad de fuentes, tales como por ejemplo Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. y Russell, DW (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y referencias allí citadas y Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000).

Un experto en la técnica apreciaría fácilmente que los diversos parámetros de la reacción de PCR pueden ser alterados sin afectar a la capacidad para amplificar el producto deseado. Por ejemplo, se pueden variar la concentración de Mg2+ y las temperaturas empleadas. De un modo similar, también se puede variar la cantidad de ADN genómico utilizado como molde dependiendo de la cantidad de ADN disponible.

Otros métodos de análisis del ADN amplificado para determinar la presencia o ausencia de una mutación son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, después de la digestión del ADN amplificado con una enzima de restricción adecuada para detectar una mutación en el gen SAL1 o uno de sus homólogos, se puede analizar el ADN mediante una serie de métodos adecuados, incluyendo electroforesis. Tiene un uso particular la electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, un mecanismo comúnmente utilizado por los expertos en la técnica para la separación de fragmentos de ADN basándose en el tamaño. La concentración de agarosa o poliacrilamida en el gel determina en gran parte la capacidad de resolución del gel y la concentración apropiada de agarosa o poliacrilamida por lo tanto, dependerá del tamaño de los fragmentos de ADN que se van a distinguir.

La detección y/o determinación de la existencia de una mutación en el gen SAL1 o uno de sus homólogos, puede estar asistida mediante un análisis por ordenador utilizando cualquier soporte lógico. Los paquetes de soporte lógico adecuados para la comparación de determinadas secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica y son fácilmente asequibles.

A continuación se describirán las formas preferidas de la presente invención, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los siguientes ejemplos, incluyendo datos comparativos, y que no se deben considerar limitantes del alcance de la invención en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Materiales y Métodos

Plantas y condiciones de crecimiento

Se mutagenizó una semilla de Arabidopsis ya transformada con el constructo de promotor de APX2-gen informador de luciferasa (APX2: LUC) (Karpinski, S. et al (1999), Science 284: 654-657) con metanosulfonato de etilo (EMS) y la plantas M2 se escrutaron en reservas derivadas de 500 parentales M1 (véase Ball, L. et al (2004), Plant Cell 16: 2448-2462). El escrutinio de mutantes se llevó a cabo utilizando un contador de luminiscencia para el recuento de fotones emitidos por las plántulas en placas de microtitulación de 96 pocillos como describen Rossel, JB et al (2004), en Methods in Molecular Biology 274: 287-300. Para confirmar la reproducibilidad de la expresión de APX2 alterada, se obtuvieron imágenes de plantas de Arabidopsis de cuatro semanas de edad que contenían APX2: LUC utilizando una cámara CCD enfriada (modelo DV 435, Andor Technology, Tokio, Japón). Antes de la formación de imágenes, las plantas se pulverizaron con una disolución de D-luciferina 1 mM (Biosynth, Staad, Suiza) que contenía unas pocas gotas de Tween 80 y se dejó en condiciones de luz para crecimiento durante 5 min. Las imágenes obtenidas utilizando la cámara CCD se analizaron utilizando el soporte lógico ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA, USA). Se identificaron varios mutantes con alteraciones de la expresión de APX2: LUC, incluyendo el mutante alx8 que tenía un incremento de la expresión de APX2: LUC, y que también mostró un aumento de la tolerancia a la sequía, así como una forma alterada de las hojas.

La provisión de partida de semillas para el mutante nulo fry1-1, el mutante por inserción salk 020882 y las plantas Columbia de tipo salvaje (WT) se obtuvieron de Arabidopsis Biological Resource Centre (Columbus, Ohio). Todas las referencias a WT en la presente memoria hacen referencia al ecotipo Columbia; salk1 y salk2 hacen referencia a dos plantas idénticas de la generación T3 de la provisión de partida de semillas de la línea salk_020882. El mutante fry1-1 se encuentra en el fondo C24 de tipo salvaje y es el tercer retrocruzamiento.

Para el crecimiento en suelo, en los primeros experimentos se esparcieron una pocas semillas de Arabidopsis sobre suelo esterilizado (1 parte de vermiculita por 4 partes de suelo) en macetas (4 cm x 4 cm x 6 cm), y en experimentos posteriores las plantas se cultivaron en suelo MetroMix (turba canadiense al 35%, perlita 500 al 19%, vermiculita al 40%, 1,5 g.L-1 de cal). Las semillas se vernalizaron a 4ºC en la oscuridad durante 72 a 96 horas. A continuación las plántulas se transfirieron a una cámara de crecimiento con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas oscuridad a 100-160 µmol fotones.m-2.S-1 a aproximadamente 21+/-2°C. Se selección un ciclo de día corto para promover el crecimiento vegetativo. Para promover la floración las plantas se cultivaron en las mismas condiciones pero con días de 16 horas. Se utilizó película plástica transparente para mantener el ambiente húmedo hasta que se establecieron las plántulas. Las plántulas se entresacaron a una por maceta, excepto para las poblaciones para el mapeo, que se hicieron crecer a dos por maceta. Las plantas se fertilizaron con 0,5x medio Hoaglands una vez cada quince días (Hoaglands y Arnon, 1950). Las bandejas se rotaron también desde los bordes hacia el centro del banco de luz para mantener condiciones de crecimiento similares para todas las plantas. Además, cuando fue posible, las plantas para el mismo experimento se cultivaron una al lado de la otra en la misma bandeja, de manera que experimentan las mismas condiciones de crecimiento.

Para las semillas germinadas en medios de cultivo de tejidos, se realizó la esterilización de la superficie en un flujo laminar. Las semillas se colocaron en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se lavaron con 1 ml de etanol al 70% durante 3 minutos. Las semillas se centrifugaron en una centrífuga de sobremesa (14.000 rpm) durante 30 segundos y se eliminó el etanol. Las semillas se resuspendieron y se lavaron en 1 ml de disolución de blanqueo (hipoclorito de sodio al 3%, H2O al 75% + 1 gota de detergente Tween-20) durante 5 minutos. Las semillas se centrifugaron como antes. Se llevaron a cabo cinco lavados y etapas de centrifugación utilizando 1 ml de agua estéril cada lavado, desechando el agua después de cada centrifugado. Las semillas se resuspendieron en agua estéril antes de cultivarlas en placa sobre agar nutriente para plantas de Murashige y Skoog (MS) (Gibco BRL, USA). El agar MS estaba compuesto por lo siguiente: 4,3 g/L de sales MS, 20 g/l de sacarosa, 1 ml/L vitaminas, 7 g/l de Phytagar, pH ajustado a 5,8 con KOH, en agua tratada MilliQ. Cuando se requirió selección, los antibióticos se incorporaron al agar: 30 – 50 μg/mL de kanamicina (MP Biomedical, Solon, OH, USA), o 30 μg/mL de higromicina (Gibco BRL). Las placas se envolvieron en papel de aluminio y se colocaron a 4°C durante 72 horas para la vernalización, a continuación, se colocaron en la cabina de crecimiento a 21°C bajo luz 24 horas a 100 μmol fotones.m-2.S-1 o se cultivaron en las mismas condiciones que las plantas en suelo.

Condiciones de estrés

Para los experimentos de estrés por sequía las bandejas se colocaron en condiciones normales de crecimiento y se distribuyeron aleatoriamente las replicas biológicas entre las bandejas y se rotaron cada dos días para controlar la variabilidad de la intensidad de la luz, la temperatura y la exposición al aire a través de bancos de luz. Las plantas se regaron al día antes del tratamiento y a t = 0 se vertió el exceso de agua fuera de las bandejas, es decir, significando que las plantas comenzaban el experimento de sequía a un contenido de agua del suelo relativo del 100%. Las macetas individuales se pesaron cada día para conseguir un % de perdida de agua relativa calculado como:

(peso inicial (g) – peso actual (g)) x 100

------------------------------------------------------

= (%) de pérdida de agua relativa del suelo

peso inicial (g)

Para el estrés por frío, las plantas cultivadas en el suelo se expusieron a 24 horas de estrés por frío (4°C) con 1 μmol

fotones.m-2.S-1 de luz.

Para el estrés salino, las plantas cultivadas en el suelo se regaron desde abajo con una disolución de NaCl una vez cada dos días.

Tratamientos de estrés de las plantas cultivadas en medios

Las semillas se esterilizaron de forma normal antes de ser cultivadas sobre medios que contenían concentraciones apropiadas de sacarosa, manitol, LiCl, NaCl o metilviológeno. Las placas se vernalizaron a continuación y se cultivaron de manera normal. Se observaron los efectos sobre la germinación y el crecimiento de las plántulas.

Manipulaciones del ADN

Extracciones de ADN de Arabidopsis

Extracción grosera de ADN

Para una pequeña cantidad de tejido vegetal, se añadieron 40 μL de NaOH 0,25 M. La muestra se trituró utilizando una punta amarilla P20 hasta que se disolvió el pigmento. Las muestras se calentaron a 100°C durante 30 segundos antes de añadir 40 μL de HCl 0,25 M y 20 μL de Tris-HCl 0,5 M, pH 8 con Triton X-100 al 0,25%. Las muestras se mezclaron por inversión, después se calentaron a 100°C durante 2 minutos.

Método de extracción de ADN

Esta extracción se adaptó de Weigel y Glazebrook, Arabidopsis: a laboratory manual, (Cold Spring Harbor Press, 2002). El tejido y tampón de extracción (Tris-HCl 200 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, EDTA 25 mM, SDS al 0,5%) se agitaron en tubos de 2 ml utilizando un agitador de pintura y dos cuentas de vidrio. Esto trituró y lisó el tejido. A continuación se centrifugó a velocidad máxima durante 5 minutos en una microcentrífuga, y se transfirieron 300 μl de sobrenadante a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Se añadieron 300 μl de isopropanol para precipitar el ADN y después

se sedimentó el ADN mediante centrifugación a velocidad máxima (centrífuga Eppendorf) durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se lavó con etanol al 70%. El ADN se disolvió después en 100 μl de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM).

Extracción de ADN con CTAB

Una pequeña cantidad de tejido vegetal, ya sea de hoja o inflorescencia, se recogió de cada planta. Se añadieron 300 μl de tampón CTAB (bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB) al 2% (p/v), en NaCl 1,4 M, Tris HCl 100 mM, pH 8,0, EDTA 20 mM) a cada muestra junto con cojinete de bolas de acero de 0,317 cm (1/8"). Las muestras fueron lisadas a continuación en un TissueLyser® (Qiagen, Hilden, Alemania) durante 2 minutos a una frecuencia de 30/sec. Las muestras se incubaron a continuación a 65ºC entre 30 minutos y varias horas. Las muestras se dejaron enfriar antes de añadir 300 μl de cloroformo y someter a vórtice cuidadosamente. Las muestras se centrifugaron a

14.000 rpm durante 1 minuto y la capa acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf. Se añadieron 300 μl

de isopropanol a cada muestra y se mezclaron por inversión varias veces. Las muestras se centrifugaron a 14.000

rpm durante 5 minutos para formar un sedimento. El sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó con 500 μl de etanol al 70%. Las muestras se secaron al aire y después se disolvieron en 100 μl de tampón TE (Tris HCl 10 mM,

pH 8,0, EDTA 1 mM).

Adaptaciones para formato de 96 pocillos

El método de extracción con CTAB se adaptó para su uso en placas de 96 pocillos mediante centrifugación del ADN precipitado por medio de una centrífuga de sobremesa a 4-15°C con los soportes de placa (Qiagen, Hilden, Alemania) y el uso de pipetas multidispensadoras de múltiples canales.

Amplificación por PCR y electroforesis en gel

Diseño de cebadores

Exceptuando los remitidos a un documento, los cebadores se diseñaron utilizando las secuencias publicadas en el sitio de la red TAIR (www.arabidopsis.org) y el programa Primer3 (www.frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi). Los cebadores se diseñaron utilizando las siguientes condiciones: concentración de sal 50 mM; contenido de GC de aproximadamente 50%, auto-complementariedad máxima de 8, y autocomplementariedad máximo 3' de 3. Generalmente los cebadores tenían una Tm de 55-60°C y una longitud de alrededor de 20 pb. La posibilidad de que los cebadores se unieran y amplificaran otros productos se sometió a ensayo utilizando BLASTn para 'emparejamientos casi exactos, cortos' en el sitio de la red NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Ejemplos de cebadores (directo - F - e inverso - R) utilizados para la amplificación y secuenciación se proporcionan en la Tabla 1 y en la Figura 10 se proporciona una representación a escala del gen SAL1, que muestra intrones, exones, localizaciones de hibridación de cebadores, así como la localización de las inserciones de ADN-T de fry1-3 y salk_020882, las mutaciones fry1-1, fry1-2 y alx8.

Tabla 1 - cebadores para la amplificación de porciones del gen SAL1

Nombre del cebador

Secuencia 5'-3 ' Tm (°C)

1F (SEQ ID NO: 5)

CGGACGCAAGTCTTCTTCTC 60,13

IR (SEQ ID NO: 6)

CCACCAATGAAAAGGGTTCA 60,72

2F (SEQ ID NO: 7)

CCAGTGACCGTTGCTGATTA 59,72

2R (SEQ ID NO: 8)

TGAAAATGCTCAGTGTCAGGA 59,43

3F (SEQ ID NO: 9)

ACACTTTGGCTACCGAGGAA 59,73

3R (SEQ ID NO: 10)

GTGGAGCTTTGACACCGAGT 50,31

Nombre del cebador

Secuencia 5'-3 ' Tm (°C)

4F (SEQ ID NO: 11)

TTCTCCTGTAAAAGTGCAAGTCTC 59,13

4R (SEQ ID NO: 12)

TGGTGAAATTCGGTGAAAGA 59,10

5F (SEQ ID NO: 13)

TGGCTTACGAGAAAGAGCTTG 59,78

5R (SEQ ID NO: 14)

AGCAAAGAAGAGGCATCCAA 59,96

6F (SEC ID N º: 15)

CTGAGGGGAGATCAATACGC 59,65

6R (SEQ ID NO: 16)

TGCTCAGCTATGGAGTCACG 60,16

Prof (SEQ ID NO: 17)

ACACGCCATCATCAATCTA 54,85

1-2R (SEQ ID NO: 18)

CCCTTTATACTTAGCCCAAA 54

FRY1exon1F (SEQ ID NO: 19)

ACTCGCTGCTCGTCTCTGTC 60,00

realtimeFRY1R (SEQ ID NO: 20)

AGAACGATGCCTCTTCAGGA 59,95

Para la cartografía SSLP, los cebadores se diseñaron en torno a InDels, publicado en el Monsanto SNP y Ler Collections en el sitio de la red TAIR. También se encontraron algunos polimorfismos en la base de datos de polimorfismos TAIR. Los cebadores se diseñaron para producir un producto de 200-300 pb y para que tuvieran una 5 Tm de 57°C. La secuencia de la región se tomó del BAC apropiado. Para SNP se diseñaron cebadores dCAPS utilizando el programa en línea dCAPS Finder 2.0 (www.helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html; Neff et al, 2002), la secuencia BAC adecuada y el Cebador 3. Los cebadores dCAPS específicos para el mutante alx8 (que crean un sitio de restricción en el producto mutante alx8 pero no en el de tipo salvaje, y que es reconocido por la enzima de restricción XbaI) fueron los siguientes: F: 5'-GAGGAAGGGAAAGTAGTTCTAG-3' (SEQ ID NO: 21); R: 5'

10 TGCACTTTTACAGGAGAAGA-3' (SEQ ID NO: 22). Los productos digeridos se sometieron a ensayo a continuación 'in silico' en NEBcutter V2.0www.tools.neb.com/NEBcutter2/index.php; Vinzce et al, 2003).

Para la construcción de vectores recombinantes e diseñaron cebadores como antes, pero el se añadieron el espaciador y el sitio de recombinación apropiados al extremo 5' del cebador.

Los cebadores se obtuvieron de Proligo (Lismore, Australia) o Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.).

15 Condiciones convencionales de PCR

Las condiciones convencionales de PCR se utilizaron para el mapeo, la confirmación de constructos y el escrutinio de las poblaciones segregantes. Todas las reacciones de PCR se realizaron en un Peltier Thermal Cycler (MJ Research, BIORAD, Waltham, MA, EE.UU.) o un Palm-Cycler (Corbett Research, Sydney, Australia). En el caso en el que la PCR de un control positivo no produjo ningún producto o productos múltiples, se optimizaron las 20 condiciones de amplificación. Se organizó un gradiente de temperatura con 12 temperaturas diferentes en el Palm-Cycler, el contenido de MgCl2 varíó entre 1-2,5 mm y se sometió a ensayo la preferencia para las diferentes polimerasas Taq. Las reacciones generalmente tuvieron los siguientes componentes: dNTP 0,2 mM, 1X tampón Taq (según sea apropiado), cada cebador 0,5 μM, MgCl2 2 mM (FisherBiotech, WA, Australia), 1-2 μl de ADN muestra y

0.25 U de Taq (según sea apropiado). Las condiciones del ciclo típicas fueron 2 min a 94°C; 40 ciclos de 30 seg a 25 94°C, 30 seg a Tm-2°C y 30 seg a 72°C; 2 min a 72ºC.

Condiciones de PCR de alta fidelidad

Para la secuenciación y la producción del constructo se requirió un producto de PCR muy preciso y/o largo. En estoscasos, se utilizaron polimerasas de prueba de lectura de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Éstas fueron ADN polimerasa Pfu (Promega, Madison, WI), polimerasa Platinum Pfx Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) y ADN

30 polimerasa High Fidelity (Finnzyme, Espoo, Finlandia).

Electroforesis

Para la separación y cuantificación de ácido nucleico, las muestras se hicieron correr en geles de agarosa con una Precission Molecular Mass Standard Ladder (BioRad, USA) y una DNA Ladder de 1 kb (Promega, USA). También se utilizó una escalera casera de ADN lambda digerido con HindIII y EcoRI. Para la PCR convencional, se realizó la electroforesis en geles de agarosa al 0,5-2% (p/v) (Fisher Biotech, WA, Australia) con 0,5 ng/mL de Bromuro de Etidio (Biorad) incorporados al gel para la visualización. Cuando se requirió una alta resolución, tal como la separación dCAPS, se elaboraron geles al 3-4% (p/v) con agarosa-1000 (Gibco BRL, Invitrogen, Rockville, MD, USA). Los geles se elaboraron con y se hicieron correr en 1X tampón TBE (base Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0) o 1X tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, Na2EDTA 20 mM, pH 8,5). Los geles se hicieron correr en un entorno de electroforesis tradicional o en el Super 120 High Performance Gel System (6mgel, Biokeystone, El Monte, CA, USA), que se puede hacer correr hasta 300V. Para la separación del producto digerido plasmídico, se hicieron correr geles al 0,7-1,0% durante 6 horas a 4°C a 100V.

Se añadió tampón de carga (glicerol al 70%, H2O al 30%, azul de bromofenol) al producto de PCR antes de cargarlo. Los geles fueron visualizados a través de una fuente de luz UV.

Purificación y extracción en gel de fragmentos de ADN

Antes de su uso en la ligación o secuenciación, los fragmentos de ADN se purificaron del gel de agarosa o de la mezcla de PCR. Este procedimiento elimina los cebadores, nucleótidos, enzimas, aceites minerales, sales, agarosa, bromuro de etidio y otras impurezas.

Para los fragmentos pequeños de 70-10 kp se utilizó Wizard® SV Gel y PCR Clean-Up System o el QIAquick Gel Extraction Kit o PCR Clean-Up Kits (Qiagen) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. En resumen, se cortaron las bandas apropiadas del gel y se disolvieron en tampón que contenía isotiocianato de guanidina. El gel disuelto o el producto de la PCR se hicieron pasar después a través de una columna que contenía una membrana de sílice en presencia de sales caotrópicas. La membrana, que estaba unida al ADN, se lavó a continuación antes de que el ADN se hiciera eluir en dH2O estéril.

Para la extracción del gel de los fragmentos de ADN de 100 pb -10kbp, también se utilizó Ultrafree-DA Centrifugal Filter Unit (Millipore) siguiendo las indicaciones del fabricante. Este kit se diferencia en un nebulizador de gel utiliza la compresión del gel para extraer el ADN de la agarosa. El ADN se purificó a continuación añadiendo 1/10 del volumen de acetato de Na 3M, mezclando, añadiendo 2,5 volúmenes de etanol al 100% y precipitando el ADN a 20ºC durante 3 horas. ADN se sedimentó mediante centrifugación a velocidad máxima durante 15 minutos en una centrífuga de sobremesa. El sedimento se lavó con etanol al 70%. El ADN se disolvió después en estéril dH2O.

El QIAEX II Kit se utilizó para la extracción del gel de bandas que se sabía que eran mayores de 10 kb y se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit utiliza cuentas de sílice para unir el ADN en lugar de una membrana de sílice, evitando la cizalladura de fragmentos de ADN más grandes a medida que pasa a través de la membrana.

A continuación se cuantificaron los rendimientos utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (Genomic Solutions, Melbourne, Australia).

Clonación posicional y complementación

Se extrajo ADN genómico de la población F2 de un cruzamiento entre alx8 (fondo Col-0) y Landsberg erecta de tipo salvaje. Se utilizó el fenotipo foliar de la F2, o su progenie para la F2 de tipo salvaje, para determinar su genotipo en el sitio de mutación alx8. Se realizó un escrutinio inicial con los marcadores descritos por Lukowitz et al (Lukowitz, W., CS Gillmor, et al (2000), "Positional cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you", Plant Physiology 123(3):795-805). Los marcadores fueron diseñados en torno a SSLP y SNP encontrados en la base de datos Cereon (www.arabidopsis.org). Se diseñaron los cebadores dCAPS con la ayuda de dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html; Neff et al, 2002). La PCR, la digestión y la electroforesis en gel se realizaron utilizando métodos convencionales.

Manipulaciones del vector

Digestión de restricción

Todas las enzimas fueron de Promega y se utilizaron siguiendo las instrucciones de los fabricantes excepto por unas pocas modificaciones. Las digestiones de restricción se llevaron a cabo para el mapeo fino utilizando marcadores dCAPS. En este caso se digirieron 10 μl del producto de PCR con 1 unidad de la enzima apropiada a 37ºC durante 1 hora hasta toda la noche. Se llevaron a cabo las digestiones de restricción de los plásmidos, tales como BACS, en 1 µg de ADN y 5 unidades de enzima. Las digestiones se detuvieron calentando a 65°C durante 15 minutos o congelando a -20°C.

Desfosforilación

Los fragmentos digeridos se desfosforilaron utilizando Fosfatasa Alcalina de Intestino de Ternera (CIAP; Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción se repitió dos veces antes de detenerla utilizando el tampón de terminación suministrado. Después se limpió la disolución mediante extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y una precipitación de acetato de sodio y etanol al 100%. El sedimento se lavó en etanol al 70% antes de ser secado al aire y resuspendido en agua estéril.

Ligación del Vector

Se ligaron los insertos preparados y los plásmidos utilizando la ligasa de T4 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó la proporción de 3:1 de ADN de inserto:vector predominantemente sobre las razones 1:1 o

1:3 y la ligación tuvo lugar a 4ºC durante la noche.

Recombinaciones de vectores

Para los vectores que requirieron recombinación, se amplificó el inserto utilizando condiciones de alta fidelidad y cebadores que contenían la secuencia de recombinación attB. Las reacciones de recombinación se realizaron utilizando el sistema Gateway® (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se recombinaron 50 fmoles de un inserto apropiado con 50 fmoles del vector pDONR/Zeo (Invitrogen), que contiene las secuencias de recombinación attP correspondientes, utilizando 2 μl de la enzima clonasa BP en una reacción de 10 μl. Esto se conoce como reacción BP y da como resultados una secuencia de recombinación attL. La reacción se dejó a 25°C durante la noche, luego se detuvo mediante incubación con 1-2 μg de proteinasa K a 37°C durante 10 minutos. Tras la transformación en E. coli competente y la incubación con selección, el plásmido se purificó y se confirmó el inserto. El plásmido aislado se recombinó a continuación con el vector de destino en la reacción LR. Los vectores de destino, tales como pHellsGate 8 (pHG8, donado por Peter Waterhouse y Chris Helliwell, PI, CSIRO), contienen lassecuencias de recombinación attr. Éstas se recombinan a continuación con los sitios attL en el plásmido donador que contiene el inserto para obtener de nuevo secuencias attB. La reacción LR es la misma que la reacción BP, pero requiere la clonasa LR. Una vez más se recombinaron los mismos moles del pDONR-inserto y pHG8 durante la noche para obtener el pHG8-inserto. Este plásmido se utilizó después para transformar E.coli, se amplificó en condiciones de selección, se aisló y se confirmó.

E.coli competente

Para elaborar E. coli competente, a 5 ml de LB se les inocularon 5 μL de células DH5a y se incubaron durante la noche a 37°C con sacudimiento moderado (200 rpm). Este cultivo iniciador se usó para inocular 200 ml de LB que se habían incubado a 37°C con sacudimiento moderado durante 3-4 horas, hasta que el cultivo tuvo una DO600 de 0,6. Después el cultivo se incubó sobre hielo durante 30 minutos antes de ser sedimentado a ~3.000 g a 4°C durante 20 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en 200 ml de agua enfriada con hielo antes de sedimentarlos de nuevo en las mismas condiciones. Este ciclo se repitió dos veces más siendo la última resuspensión en 20 ml de glicerol al 10% enfriado con hielo. Las células se sedimentaron de nuevo a 4ºC, pero a ~2.000 g durante 10 minutos, y se resuspendieron en 1 ml de glicerol al 10% enfriado con hielo. Esta resuspensión se distribuyó a continuación en alícuotas de 50 μL que se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.

Transformación de E. coli

Para las transformaciones difíciles, se utilizaron células competentes comerciales, One Shot® OmniMAXTM -T1R

Chemically Competent E.coli (Invitrogen). Se descongelaron en hielo 100 μl de las células y se añadieron ~100 ng

de mezcla de ligación. A continuación las células se dejaron sobre hielo durante 30 minutos antes de ser sometidas a choque térmico a 42°C durante 30 segundos. Después las células se volvieron a poner sobre hielo durante 2

minutos antes de añadir 250 μl del medio SOC suministrado. Después se dejó que las células se recuperaran a 37ºC

con sacudimiento durante 1-2 horas.

Para la mayor parte de las transformaciones, se utilizaron células competentes caseras. Una alícuota de 100 μL de

células competentes se descongeló sobre hielo y se añadieron ~100 ng de ADN plasmídico y mezclaron con la punta de la pipeta. A continuación las células se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes de ser incubadas en un baño de agua a 37°C durante cinco minutos. A continuación, se añadió 1 ml de LB a las células y éstas se incubaron a 37°C con sacudimiento durante 1-2 horas. Después se cultivaron en placa dos volúmenes diferentes de células sobre medios selectivos apropiados y se incubaron a 37°C durante la noche.

Crecimiento bacteriano y provisiones de partida en glicerol

Todos los cultivos líquidos de bacterias se desarrollaron en medios de Luria-Bertani (LB), compuestos de lo siguiente: 10 g/L de triptona Bacto (BactoLaboratories, Australia), 5 g/L de extracto de levadura (BactoLaboratories) y 5 g/l de NaCl en agua MilliQ tratada. Si se necesitó agar LB, se añadieron al caldo 15 g/l de agar (Lener Davis Gelatin, Australia). Todos los medios se esterilizaron en autoclave antes de su uso. Se utilizaron antibióticos a las siguientes concentraciones: 100 μg/mL de espectinomicina (Sigma), 100 μg/mL de ampicilina (Sigma) y 150 μg/mL de rifampicina (Sigma), 30-50 μg/ml de kanamicina (MP Biomedical, Cleveland, OH, USA), 50 g/mL zeomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Para la selección con zeomicina, se utilizó LB con bajo contenido de sal: 10 g/L de triptona Bacto (BactoLaboratories, Australia), 5 g/L de extracto de levadura (BactoLaboratories) y 5 g/L de NaCl en agua MilliQ tratada. Para la selección azul-blanco, las placas también contenían IPTG (isopropil-bD-tiogalactósido; Fisher Biotech) 0,5 mM y 80 μg/mL de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido; Progen Bioscience, QLD, Australia).

Los cultivos líquidos de E.coli se incubaron durante la noche a 37°C con sacudimiento, las placas de E.coli se incubaron a 37°C durante la noche, las placas de Agrobacterium se incubaron a 28°C durante varios días y los cultivos líquidos de Agrobacterium se incubaron con sacudimiento a 28°C durante 16-20 horas.

Las provisiones de partida en glicerol de los cultivos bacterianos se elaboraron combinando 700 μL de cultivo con 700 μL de disolución de glicerol (glicerol al 65% v/v, MgSO4 0,1 M, Tris-Cl 0,025 M, pH 8). Las provisiones de partida se almacenaron después a -80°C.

PCR de colonias

La PCR de las colonias se llevó a cabo para escrutar en las colonias la presencia del plásmido y del inserto. Las

condiciones de PCR fueron las habituales pero los volúmenes se llevaron hasta 20 μl por reacción y se transfirió una

pequeña cantidad de células de la colonia a la PCR utilizando una punta de pipeta.

Aislamiento del plásmido

Para la mayoría de las aplicaciones los plásmidos se aislaron a partir de 3-5 ml de cultivo líquido, se desarrollaron durante la noche a partir de una sola colonia o una provisión de partida en glicerol, utilizando el GeneEluteTM Plasmid Miniprep Kit (Sigma). En resumen, las células se sedimentaron y lisaron utilizando un método de lisis alcalina-SDS modificado. El ADN plasmídico se adsorbió después sobre una membrana de sílice en presencia de niveles altos de sales. A continuación la membrana se lava antes de que el ADN plasmídico se hiciera eluir con dH2O estéril.

Para las aplicaciones en las que se requirió una gran cantidad de plásmido, tal como la preparación de ADN BAC, se utilizó un protocolo de lisis alcalina a gran escala. Este protocolo se basó en uno obtenido a partir del Lab of Cellular and Molecular Regulation, NIH (Bethesda, MA, USA). Se hizo crecer durante la noche a 37°C y 200 rpm un cultivo de 500 ml con selección. Después se sedimentaron 250 ml de células a 6000 g durante 15 minutos a 4°C, el sobrenadante se desechó y la botella se colocó en hielo. A continuación las células se resuspendieron en 20 ml de EDTA 10 mM a temperatura ambiente, pH 8,0, y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se añadieron 40 ml de disolución de lisis (NaOH 0,2 M, SDS al 1%) y la botella se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron a continuación 30 ml de disolución de neutralización enfriada con hielo (ácido acético al 11,5% (v/v), acetato de K 1,9 M) y la botella se dejó sobre hielo durante 15 minutos. Los desechos celulares se sedimentaron después a 30.000 g durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se trasladó a una nueva botella y se repitió el proceso. A continuación se hizo precipitar el ADN del sobrenadante mediante la adición de 45 ml de isopropanol y se sedimentó a 6.500 g durante 15 minutos. El sedimento se disolvió después en 9 ml de tris 10 mM/EDTA 50 mM y se añadieron 4,5 ml de acetato de K 7,5 M. La disolución se congeló después a -70°C durante 30 minutos, se descongeló y se centrifugó a 4.000 g durante 10 minutos. El ADN se precipitó a continuación mediante la adición de 27 ml de etanol al 100% y el ADN se sedimentó a 4.000 g durante 10 minutos. El sedimento

se disolvió después en 700 μL de Tris 50 mM/EDTA 50 mM, pH 8,0 y se añadieron 10 μL de RNAsa de 10 ng/μL. La

muestra se incubó a continuación a 37°C durante 1 hora para permitir la descomposición de ARN. La muestra se limpió después añadiendo 700 μl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), mezclando y centrifugando a

14.000 rpm durante 5 minutos en una microcentrífuga. La capa superior se limpió después de nuevo en 700 μl de

cloroformo:alcohol isoamílico. A continuación el ADN se precipitó desde la capa superior mediante la adición de 700 μl isopropanol y se sedimentó mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se lavó con 500 μl de etanol al 70% y se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se retiró de nuevo y el sedimento se secó al aire antes de ser resuspendido en 100 μl de H2O estéril.

Digestiones de diagnóstico

Para confirmar la identidad de un plásmido y la presencia del inserto, se digirió el plásmido aislado durante la noche y se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1%. El patrón de bandas esperado se identificó utilizando NEBcutter V2.0 (www.tools.neb.com/NEBcutter2/index.php; New England Biolabs).

Agrobacterium competente

Se elaboraron Agrobacterium tumefaciens competentes a partir de un cultivo de 500 ml, desarrollado durante la noche a 28°C. Después se enfriaron 250 ml de cultivo sobre hielo y se sedimentaron durante 5 minutos a 4°C a

3.000 g. Los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de CaCl2 20 mM enfriado con hielo y se dispensaron en alícuotas de 0,1 ml antes de ser congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80°C.

Transformación de Agrobacterium

Se transformaron células de Agrobacterium tumefaciens competentes caseras con el plásmido aislado. Se descongelaron sobre hielo 100 μl de células competentes y se añadió ~1 µg de plásmido. A continuación las células se sometieron a choque térmico a 37°C durante 5 minutos antes de añadir 1 ml de LB líquido. Se dejó que las células se recuperaran a 28°C con sacudimiento durante 2-4 horas. Se incluyó un control negativo de células de Agrobacterium competentes sin ningún plásmido. Después las células se diseminaron sobre placas de agar LB con selección de kanamicina para el plásmido (50 μg/mL); y selección de rifampicina (100 μg/mL) y gentamicina (25 μg/mL) para Agrobacterium. Después las placas se incubaron a 28°C durante 2-3 días o hasta que aparecieron las colonias. Las colonias se escrutaron para determinar el inserto mediante PCR de colonias utilizando cebadores específicos para el inserto. Estas colonias también se utilizaron para inocular un cultivo iniciador de 5 ml de LB líquido con selección (50 μg/mL de kanamicina, 100 μg/mL de rifampicina, 25 μg/mL de gentamicina). Los cultivos se hicieron crecer a 28°C durante la noche con sacudimiento.

Transformación de Arabidopsis

Se cultivo en suelo Arabidopsis que se iba a transformar y se recortaron los primeros primordios florales para fomentar múltiples primordios secundarios. Las plantas se sumergieron cuando hubo muchas agrupaciones florales y se cortaron las silicuas desarrolladas. A continuación se transformó Arabidopsis utilizando un protocolo modificado de Clough y Bent (1998). Se utilizó un cultivo iniciador de 5 ml con selección para inocular 500 ml de LB líquido. Esto se hizo crecer a continuación durante la noche a 28°C con sacudimiento.

El cultivo de 500 ml se sedimentó en una centrífuga RC 5C Plus (Sorvall) utilizando un rotor SLA-3000 a 4.000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sedimento se resuspendió a continuación en 500 ml de de una disolución de sacarosa al 5% (p/v). Después se añadió detergente Silwet L-77 (Lehle Seeds, Round Rock, TX, USA) a una concentración final de 0,05% (v/v). Las flores se sumergieron en la disolución durante 5-10 segundos con agitación suave antes de extenderlas sobre una superficie plana en una bandeja bajo una película plástica transparente para mantener la humedad. Las plantas se dejaron estar hasta el día siguiente y se repitió el proceso una semana más tarde. Después de dejar estar las semillas durante dos semanas las plantas se transfirieron a un armario seco, oscuro para el secado de las semillas.

Las semillas se sembraron en placas de selección para aislar los transformantes, que después se transfirieron a suelo.

Secuenciación

Los fragmentos de ADN o plásmidos se enviaron con los cebadores adecuados al Biomolecular Resource Facility (JCSMR, ANU, Canberra) o a la Australian Genomic Resource Facility (UQ, Queensland) para secuenciarlos.

Alternativamente, se preparó ADN en una reacción de secuenciación de 20 μL compuesta de lo siguientes: cebador 0,5 μM, 1x tampón, 2 μL de ADN y 1,5 μL de Big Dye. La reacción procedió de la siguiente manera: 96°C durante 2

minutos y 40 ciclos de: 96°C durante 5 segundos, 50°C durante 15 segundos, 60°C durante 3 minutos y medio. El

producto de PCR se purificó después utilizando una purificación con EDTA. A los 20μL, se les añadieron 5 μL de EDTA 0,125 M y 60 μL de etanol al 100% a temperatura ambiente. La muestra se mezcló y se dejó que precipitara a

temperatura ambiente durante 40 minutos bajo papel de aluminio. El ADN marcado se sedimentó después a velocidad máxima durante 20 minutos y se lavó con etanol al 70% antes de ser centrifugado de nuevo durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se secó utilizando un Speedi-Vac. La muestra se suministró después a Yang para su secuenciación.

PCR Térmica de entrelazado asimétrico (Tail)

El protocolo se adaptó de (Liu YG, Mitsukawa N, T Oosumi y Whittler, RF (1995) "Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR", The Plant Journal 8: 457-463). Como describen Liu et al. 1995, se realizó un uso secuencial de tres cebadores (LBa1 -5'-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3 '(SEQ ID NO: 23); LBb1 - 5'-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3' (SEQ ID NO: 24), y LBc1 - 5'-GGACTCTTGTTCCAAACTGG -3' (SEQ ID NO: 25)) específicos para el borde izquierdo del inserto de ADN-T con un cebador degenerado arbitrario, AD2 (5'-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T) GAA-3 ', con degeneración de 128 veces, que se uniría a las secuencias de Arabidopsis en una serie de tres reacciones PCR. La reacción

principal fue de 20 μL y contenía 1x tampón de PCR, cada dNTP 200 μM, de MgCl2 2 mM, LBa1 0,2 μM, AD2 3 μM,

0,8 U de Taq F1 y aproximadamente 20 ng de ADN genómico. Se realizaron dos reacciones para cada muestra, una se diluyó 50 veces para la siguiente PCR y la otra se mantuvo para hacerla correr sobre el gel final.

La reacción secundaria fue de 20μL. Contenía 1x tampón de PCR, cada dNTP 200 μM, MgCl2 2 mM, LBc1 0,2 μM, AD2 2 μM, 0,6 U de Taq F1 y 1 μL de producto de PCR diluido de la reacción principal. Se realizaron dos reacciones para cada muestra, una se diluyó 10 veces para la siguiente PCR y la otra se mantuvo para hacerla correr sobre el gel final. La reacción terciaria fue de 100 μL y se utilizaron las mismas condiciones que en la reacción secundaria, excepto se utilizó el tercero de los cebadores específicos de LB, junto con AD2.

Todos los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos específicos de inserción se identificaron por la diferencia de tamaño entre las bandas en las reacciones secundaria y terciaria. Las bandas apropiadas se escindieron de gel utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen,) y se secuenciaron (AGRF, Brisbane, Australia).

Análisis de la proteína SAL1 Para producir proteína SAL1 recombinante, se extrajo el ARN total de hojas Col-0 y alx8 utilizando Plant RNeasy Kit con la etapa de digestión con ADNasa en la columna (Qiagen, www.qiagen.org) y se utilizó para la síntesis de ADNc de la primera cadena (Superscript II, Invitrogen, www.invitrogen.com) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. La secuencia codificante de SAL1 completa se amplificó a partir de los ADNc de SAL1 Col-0 y alx8 clonados con los cebadores SacII-SAL1 F1 (5'-ctccgcggtggtatggcttacgagaaagagc-3') (SEQ ID NO: 26) y EcoRI-SAL1 (5'gctcgaattctcagagagctgaagctttctc-3') (SEQ ID NO: 27), después se clonó en el vector Phue (Baker et al., 2005). Las proteínas recombinantes se expresaron en la cepa BL21 (DE3) de E. coli (Novagen, www.emdbiosciences.com) después de la inducción con IPTG 1 mM y se purificaron por cromatografía de afinidad utilizando resina His-Bind de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Novagen). La proteína SAL1 auténtica sin la etiqueta se recuperó mediante escisión enzimática y se analizó para determinar la actividad fosfatasa frete a 3'-fosfoadenosina 5'-fosfato (PAP) (Murguía et al., (1995), Science 267, 232-234) y los anticuerpos policlonales anti-Sal1 (IMV, Adelaide) se aislaron de la fracción de IgG de suero de conejo inoculado mediante purificación por inmunoafinidad.

Para las transferencias de western, se resolvieron 20 µg de extracto de proteína de la hoja sobre un gel en gradiente, se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondearon con una dilución 1:1.000 de anticuerpos policlonales purificados contra la proteína recombinante SAL1. Después de los lavados con Tween-PBS al 0,05% (v/v), las transferencias se incubaron con una dilución 1:10.000 de anti-IgG de conejo de cabra conjugada con HRP y se desarrollaron utilizando el kit de detección Super Signal West Femto Chemilumiscent (Pierce).

Análisis de expresión del gen

Precauciones tomadas cuando se manipula el ARN

Debido a la abundancia de enzimas ARNasa en el entorno se tomaron numerosas precauciones para evitar que se produjera la degradación del ARN. Siempre se usaron guantes cuando se manipuló el ARN y se tuvo cuidado de trabajar en un ambiente limpio cuando fuera posible. Las muestras se mantuvieron sobre hielo, se almacenaron a 80°C y el se limitó el número de ciclos de congelación-descongelación. El agua libre de ARNasa se obtuvo comercialmente o se elaboró mediante tratamiento de H2O MilliQ con dietilpirocarbonato al 0,2% (v/v) (DEPC, Sigma). El agua tratada con DEPC se agitó durante la noche antes de la esterilización en el autoclave para destruir cualquier DEPC restante antes de su uso. El material de vidrio se coció a 180°C durante la noche y el material de plástico se empapó en H2O2 diluida durante la noche antes de ser enjuagado con agua tratada con DEPC varias veces.

Extracción de ARN

El ARN se extrajo utilizando el Plant RNeasy Kit (Qiagen, Alemania). En resumen, se trituraron no más de 100 mg de tejido congelado hasta polvo utilizando micromorteros estériles. La muestra se lisó y se desnaturalizó en el tampón que contenía isotiocianato de guanidina (GITC) suministrado, que también inactiva cualquier RNAsa. La muestra se aplicó a continuación a un QIAshredder, que elimina el material insoluble y somete a cizalla el ADN genómico. El eluato se mezcló con etanol al 100% para precipitar el ARN y la mezcla se hizo pasar a través de una minicolumna RNeasy, donde el ARN se une a una membrana de gel de sílice. La membrana se lavó y se trató con AADNasa I libre de ARNasa (Qiagen) durante aproximadamente 20 minutos y se lavó de nuevo antes de que el ARN se hiciera eluir en H2O libre de ARNasa.

Precipitación de ARN

Para concentrar y limpiar el ARN se utilizó un protocolo de Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, 1998). En resumen, se añadió 1/10 del volumen de acetato de Na, pH 5,2 al ARN. La muestra se sometió a vórtice brevemente para mezclarla antes de añadir 2,5 volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo. De nuevo la muestra se mezcló mediante vórtice y se colocó a -20ºC durante 30 minutos para facilitar la precipitación del ARN. El ARN se sedimentó después a velocidad máxima en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó con etanol al 70% antes de ser centrifugado de nuevo. El sobrenadante se separó y el ARN se secó en un Speedi-Vac durante 5 minutos a temperatura media antes de ser disuelto en H2O libre de ARNasa.

Síntesis de ADNc

La síntesis de ADNc se llevó a cabo de acuerdo con un protocolo adquirido de Christian Delessert (Plant Industry, CSIRO, Canberra, Australia). Se añadió 1 µg de cebador T23V a 1 µg de ARN y se incubó a 70°C durante 10 minutos para permitir la unión del cebador. A continuación la reacción se llevó hasta 30 μL que contenían: 1X el tampón apropiado, ditiotreitol 10 mM, dNTP libres de ARNasa (Invitrogen) 0,17 mM, 100 unidades de Superscript II

(Invitrogen) y H2O libre de ARNasa hasta 30 μL. La reacción se incubó a 45°C durante 2 horas y se diluyó a 200 μL

en H2O milliQ estéril. El ADNc estuvo entonces listo para el análisis de RT-PCR en tiempo real.

RT-PCR en tiempo real

Se utilizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa con transcripción reversa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real) para medir la abundancia del transcrito.

Diseño de cebadores Los cebadores adecuados para RT-PCR en tiempo real se diseñaron utilizando el programa Primer3 (www

genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) con las siguientes condiciones:

tamaño del producto aproximadamente 250 pb

temperatura de fusión (Tm) aprox. 60°C

contenido de GC aproximadamente 50%

auto-complementariedad máxima de 4

auto-complementariedad 3' máxima de 3 Las secuencias génicas utilizadas fueron las secuencias de ADNc empalmadas, obtenidas de TAIR (www.arabidopsis.org). Cuando fue posible los cebadores se diseñaron a cualquier lado de un intrón para permitir la detección de la contaminación del ADN. La especificidad de los cebadores se comprobó mediante una búsqueda "Blastn" en el sitio de la red del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología "National Center of Biotechnology Information" (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Todos los cebadores se encargaron a Proligo (Australia). Los ejemplos de algunos de los cebadores utilizados se dan en (Rossel, JB, PB Walter, et al. (2006), Plant, Cell and Environment 29 (2): 269-281). Los ejemplos de los otros cebadores usados incluyen:

APX2 (At3g09640), 5'-GGCTGGGACATTTGATGTG-3' (SEQ ID NO: 28) y 5'-AGGGAACAGCTCCTTGATAGG-3' (SEQ ID NO: 29); APX1 (At1g07890), 5'-CCACTCGCATTTCTCCAGAT-3' (SEQ ID NO: 30) y 5'-TCGAAAGTTCCAGCAGAGTG-3'

(SEQ ID NO: 31);

sHsp (At2g29500), 5'-CCTGGATTGAAGAAGGAGGAAG-3' TAGGCACCGTAACAGTCAACAC-3' (SEQ ID NO: 33);

(SEQ ID NO: 32) y 5'-

ZAT10 (At1g27730), 5'-AGGCTCTTACATCACCAAGATTAG-3'TACACTTGTAGCTCAACTTCTCCA-3' (SEQ ID NO: 35);

(SEQ ID NO: 34) y 5'

ciclofilina (At2g29960), 5'-TCTTCCTCTTCGGAGCCATA-3' (SEQ ID NO: 36) y 5'-AAGCTGGGAATGATTCGATG-3' (SEQ ID NO: 37);

DREB2A (At5g05410), 5'-AGACTATGGTTGGCCCAATG-3' (SEQ ID NO: 38) y 5'-TCGAGCTGAAACGGAGGTAT-3' (SEQ ID NO: 39);

HSP70 (At3g09440), 5'-GCTGCTATTGCTTACGGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 40) y 5'-CTCTCGGGTTTCCACTAATGTC-3' (SEQ ID NO: 41).

Para comprobar la precisión y la eficacia de los cebadores, se realizó una curva patrón con 100, 25, 5 y 1 ng de ADNc. Cada concentración se realizó por duplicado. El valor de R2-, la eficicacia de la reacción y las curvas de fusión son formulados automáticamente por el Programa Rotorgene®5. Para los cebadores exactos el valor R2debe ser >0,99, la eficacia de la reacción debe >95% y la curva de fusión debe indicar que solamente se ha amplificado un producto. Solo si se cumplen estas condiciones se utilizan los cebadores para la RT-PCR en tiempo real.

Establecimiento de la RT-PCR en tiempo real

Las reacciones de RT-PCR en tiempo real se realizaron en el Rotor-Gene®2000 o Rotor Gene-®3000 (Corbett Research, Australia). En algunos casos, se realizaron triplicados de cada muestra de ADNc. Alternativamente, se realizaron transcripciones inversas por duplicado y dos réplicas técnicas de cada transcripción inversa dieron como resultado cuatro repeticiones por muestra de ARN.

Cada muestra se sometió a ensayo tanto con los cebadores para el gen de interés como con aquellos para el gen constitutivo. La RT-PCR en tiempo real permite la cuantificación de la abundancia de ARNm en un tejido concreto después de varios tratamientos con respecto a un gen constitutivo, cuya expresión no cambia. Esto se realiza mediante la medición de la tasa de amplificación de los transcritos a lo largo de ciclos repetidos midiendo la incorporación de un colorante fluorescente, SYBR Green, a los transcritos. Este colorante se une todas las moléculas de ADNdh y solo emite una señal fluorescente cuando se ha unido.

Para llevar a cabo la reacción se utilizó SYBR® Green JumpStartTM Taq ReadyMixTM (Sigma Aldrich) o Roche LightCycler 4800 SYBR Master (Roche, Basilea, Suiza) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para Sigma la mezcla maestra contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 3,5 mM, cada dNTP 0,2 mM, 0,25 unidades de ADN polimerasa Taq, anticuerpos JumpStart Taq, y SYBR Green I. Para Roche no se describió el contenido de la mezcla maestra. Una reacción de 10μL típica contenía 25 ng de ADNc, cada cebador 0,2 μM y 0,9X mezcla Maestra. Las condiciones del ciclo típico fueron las siguientes: 95°C durante 2 min (activación inicial de la ADN polimerasa Taq)

Ciclo repetido 45 veces: 95°C durante 15 s (desnaturalización), 55°C durante 30 segundos (unión a cebador), 72°C durante 30 segundos (elongación y lectura de fluorescencia) y 80°C durante 15 segundos (lectura de fluorescencia)

60°C durante 2 min (etapa de elongación final)

Análisis de Curva de Fusión aumentando gradualmente a 99°C, incrementando 1°C con cada etapa de 5s.

Análisis

Los resultados de la RT-PCR en tiempo real se analizaron utilizando el programa Rotor-Gene® 5 (Corbett Research). Para cada reacción se comprobó la curva de fusión para asegurarse de que se había formado un solo producto con cada conjunto de cebadores y que había una amplificación eficaz del producto. Los métodos de análisis utilizados para la RT-PCR en tiempo real fueron los descritos previamente (Rossel, JB, PB Walter, et al. (2006), Plant, Cell y Environment 29 (2): 269-281; Pfaffl, MW (2001), "A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR", Nucleic Acids Research 29(9)).

Para el método Ct comparativo se ajustó el valor umbral para la reacción de amplificación en un punto en el que todas las muestras son sometidas a una tasa exponencial de amplificación. Los valores del ciclo umbral (Ct) son el número de ciclos adoptados para que una muestra particular alcance el valor umbral, donde la cantidad de fluorescencia, y por lo tanto la cantidad de ARNdh, es la misma para cada muestra. Estos valores de Ct son transferidos después a Excel (Microsoft, USA). Se eliminaron los valores atípicos, con valores de Ct que diferían en más de 0,5, en cada conjunto de triplicados. El conjunto de datos resultante se normaliza después mediante la comparación de la expresión del gen de interés, en un cierto momento y en unas ciertas condiciones, con la expresión del gen constitutivo, en el mismo momento y las mismas condiciones. Esto se realiza mediante la deducción del valor de Ct medio constitutivo en esa muestra a partir de cada réplica del valor de Ct del gen de interés:

ΔCt = Ct (gen de interés) – Ct medio (constitutivo)

Estos valores se comparan a continuación con la muestra de control, normalmente t = 0. Esto se realiza restando el valor de control del valor de cada muestra para obtener ΔΔCt.

ΔΔCt = ΔCt (gen de interés) – ΔCt (Control)

Estos valores se utilizan después para calcular los valores absolutos utilizando la fórmula: 2-ΔΔCt. Como resultado, el valor de control se convierte en 1 y a todas las otras muestras se les da un valor relativo con respecto al valor de control.

Para el método de cuantificación comparativa las muestras de análisis del programa se comparan con una muestra de control definida por el usuario, normalmente t = 0. A continuación, se calcula la concentración comparativa mediante la fórmula:

Concentración comparativa = Amplificación (Punto de Partida de Control – Punto de Partida de Esta Muestra)

El valor de partida se calcula utilizando la tasa de incremento de la fluorescencia a lo largo de los ciclos. La tasa máxima se denomina tasa pico y se considera que la tasa de partida es un 80% inferior a la tasa pico. El valor de partida es el número de ciclos que se han producido cuando la reacción alcanza la tasa de partida.

La amplificación es la eficacia de amplificación media de todas las muestras para un conjunto de cebadoresparticular. Ésta se calcula como la media de las veces que aumenta la fluorescencia durante los cuatro ciclos que siguen al punto de partida. Idealmente, este valor sería de 2 durante la fase exponencial de la reacción. También se proporcionan una eficacia de amplificación media y un intervalo de confianza para cada conjunto de cebadores indicando el aumento de los valores del intervalo de confianza una mayor variabilidad entre las muestras.

Las concentraciones comparativas obtenidas con ordenador para cada muestra se exportados después a Excel y se normalizaron frente a las del gen constitutivo. Esto da como resultado el cambio de la expresión como un porcentaje

o multiplicidad del cambio con respecto al control. La desviación típica para cada conjunto de réplicas también se calculó utilizando la función Excel. Los resultados se trazaron a continuación en forma de un gráfico de columnas utilizando Excel. Cuando fue necesario, se promediaron los resultados para múltiples réplicas biológicas y se calculó la desviación típica entre los experimentos utilizando la función STDEVPA, que mide la desviación típica basándose en toda la población proporcionada como argumento.

Transferencia Northern

Se utilizaron Transferencias Northern para investigar en qué medida eran expresados los genes y si se producían variantes de empalme.

Las extracciones de ARN se realizaron como antes utilizando el RNeasy Kit, solo se utilizaron tres columnas QIAshredder por réplica biológica y el eluato se introdujo en una Columna RNeasy para maximizar la concentración del eluyente resultante. A continuación se precipitaron 20 µg de ARN de cada muestra como antes y se

resuspendieron en 5 μL de agua libre de ARNasa.

Se llevó a cabo la electroforesis en gel con el ARN concentrado en condiciones libres de ARNasa. Se elaboró un gel fundiendo 2,25 g de agarosa en 125 ml H2O tratada con DEPC. La mezcla se enfrió antes de la adición de 15 mL de

10X MOPS (MOPS 0,4 M, acetato de sodio 0,1 M, EDTA 0,01 M), 7,5 ml de formaldehído y 2 μL de Bromuro de

Etidio (EtBr). El gel se fijó en un tanque para electroforesis en gel normal antes de ser equilibrado en 1X MOPS con 1 μL/100mL EtBr añadido.

Para cada 20 μg de ARN, se añadieron 9 μL de formaldehído, 25 μl de formamida y 4,2 μL de 10X MOPS. Después

las muestras se sometieron a vórtice para mezclarlas y se calentaron a 55°C para desnaturalizar el ARN. Se añadieron 0,5 μL de EtBr y 2 μL de tampón de carga (EDTA 1 mM pH 8,0, glicerol al 50%, azul de bromofenol de 2,5 mg/ml, xileno cianol de 2,5 mg/ml) a cada muestra antes de cargarlos en el gel. El gel se hizo correr a 100 V durante varias horas hasta que se movió el colorante 2/3 del recorrido del gel. Después el ARN se fotografió rápidamente bajo iluminación UV para comprobar la calidad y la cantidad del ARN.

El ARN se hizo pasar a una membrana de nailon (Hybond-N, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) mediante transferencia por gravedad con 20X SCC durante la noche. A continuación la membrana de nylon se envolvió en película plástica transparente y el ARN se fijó a la membrana mediante iluminación UV a 1200V. La membrana se almacenó después en la oscuridad hasta su uso.

Se elaboró una sonda mediante amplificación de SAL1 a partir de ADNc Col-0WT utilizando los cebadores Fry1-1F (5'-AACCCATTTTGTAAATCTTCC-3') (SEQ ID NO: 42) y Fry1-rt2R (5'-CAGAGAAACAAAGAACGTACGAGA-3') (SEQ ID NO: 43) y una reacción de 40 μL. El producto de la PCR se hizo correr en un gel y se purificó utilizando un kit de extracción de gel. A continuación la sonda se marcó con α32P-dCTP radiactivo utilizando Prime-a-Gene Labeling System (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. El procedimiento se llevó a cabo como se describe en (Rossel J.B., Wilson I.W. y Pogson B.J. (2002), "Global changes in gene expression in response to high light in Arabidopsis", Plant Physiol. 130: 1109-1120).

Micromatrices

El ARN para las micromatrices se extrajo como antes utilizando el RNeasy Kit. Después se midieron la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. La calidad del ARN se verificó también mediante electroforesis en gel de 3 μg de ARN. En resumen, se elaboró un gel al 1% fundiendo agarosa-1000 de alta calidad en 1X tampón MOPS. Las mezclas se enfriaron a 55°C antes de la adición de formaldehído caliente a una concentración final de 18% (v/v) y verterlo en el molde para el gel. Una vez dispuesto el gel se equilibró con 1X

tampón de migración MOPS. El ARN, en 10 μL, se combinó con 20 μL de tampón de carga (formamida al 52%, 1 x

MOPS, formaldehído al 17%, glicerol al 7%, EtBr de 0,02 mg/mL, toque de azul de bromofenol), se calentó durante 5 min a 70°C y después se enfrió sobre hielo durante 2 minutos. Las muestras se hicieron correr después en el gel durante varias horas a 90 V, hasta que el colorante hubo recorrido 2/3 de la longitud del gel.

Si el ARN debía ser más concentrado el volumen se redujo en un Speedi-Vac a temperatura media durante un corto período de tiempo. Asimismo se sometieron a ensayo la calidad y la cantidad del ARN en un RNA 6000 Nano LabChip® utilizando el sistema Agilent 2100 Bioanalyser (Santa Clara, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema separa las moléculas de ARN basándose en su tamaño mediante electroforesis de una matriz de gel en tubos capilares. Cada muestra y una escalera se desnaturalizan por calor antes de hacerlas correr en diferentes tubos. Un colorante intercalante en la matriz de gel marca el ARN y se leen la cantidad y el peso a medida que sale a través del capilar.

Una vez que se hubo confirmado la calidad del ARN, se preparó el ARN para su utilización en el Affymetrix GeneChip Expression Analysis System (Santa Clara, CA, USA), utilizando los kits y las instrucciones de los fabricantes. En resumen, se sometieron a transcripción inversa 5 μg de ARN utilizando un cebador T7-oligo (dT) y Superscript II, denominada síntesis de la primera hebra. Esto da como resultado que el ARN se vaya uniendo a una hebra de ADN complementaria. Después se sintetizó una segunda hebra de ADNc para remplazar el ARN en la síntesis de la segunda hebra. Esta síntesis utiliza ARNasa H para eliminar el ARN antes de la reconstrucción de la segunda hebra de ADN utilizando ADN polimerasa de T4. Los componentes de reacción se retiran a continuación del ADNc mediante el uso de una columna de unión de ADNc que se lavó, se secó y de la que eluyó el ADNc.

A continuación el ARNc marcado con biotina se amplificó a partir del ADNc utilizando un proceso de transcripción in vitro (IVT). Este proceso utiliza una mezcla de análogos de nucleótidos/ribonucleótidos biotinilados y ARN polimerasa de T7. El ARNc se purificó a continuación utilizando una columna que une el ARNc y se hizo pasar una pequeña alícuota a través del Bioanalyser para confirmar la calidad y la cantidad del producto.

El ARNc marcado con biotina también se cuantificó mediante espectrofotometría NanoDrop y se confirmó la pureza.

El rendimiento se ajustó para el ARN no marcado presentes debido al ARN total que se estaba utilizando en la muestra original. Esto se realizó utilizando la fórmula:

Rendimiento de ARNc ajustado = ARNm – ARNi total

donde RNAm es la cantidad de ARNc medido después de la reacción de IVT y la limpieza (µg) y el ARNi total es la cantidad de ARN de partida original (µg).

Después se fragmentaron 20 µg del ARNc en fragmentos 35-200 pb mediante hidrólisis inducida por metal Mg2+. Se hizo pasar una pequeña alícuota al Bioanalyser para confirmar que se había producido la fragmentación.

Para confirmar la calidad del ARN, se hibridó después una pequeña cantidad del ARNc fragmentado de una muestra con un TestArray3. El proceso fue el mismo que para los chips de ATH1.

Para los GeneChips de ATH1, se hibridaron 15 μg de cada muestra de ARNc fragmentado durante la noche (16 h) a 45°C con rotación. A continuación los GeneChips se lavaron en un lavado no restrictivo utilizando una Fluidics Station 400. Los GeneChips se tiñeron después con estreptavidina ficoeritrina (SAPE), que se une al ARNc marcado con biotina. La señal se amplificó a continuación mediante la adición de un anticuerpo primario que se une a SAPE. Después se añadió un anticuerpo secundario biotinilado que se une al anticuerpo primario y finalmente SAPE que se une al anticuerpo secundario. El GeneChip se lavó a continuación para deshacerse del exceso de SAPE antes de ser escaneado. La ficoeritrina emite fluorescencia a 570 nm, de manera que el GeneChip se escaneó a esta longitud de onda. Los resultados se analizaron a continuación.

Se añadieron numerosos controles a lo largo de las etapas anteriores. Se añadieron cuatro ARN polyA de control durante la síntesis de la primera hebra para asegurar que es eficaz la producción de ARNc marcado. Estos controles son de cuatro genes de B.subtilis que no están presentes en células eucariotas. Estos también se añaden a concentraciones variables para asegurar que el proceso es eficaz para transcritos de baja, media y alta abundancia. En el análisis final de la matriz las lecturas de la intensidad de estos genes deben tener una relación lineal con sus concentraciones originales.

Se añadió un conjunto de controles de hibridación al ARNc fragmentado antes de la hibridación. Éstos a su vez tienen un intervalo de concentración para asegurar que la relación entre la hibridación y la intensidad de la señal es lineal. Tres de los controles son de E.coli y uno es del bacteriófago P1.

Finalmente, también se añadieron oligonucleótidos B2 biotinilados a la mezcla de hibridación. Estos se unen en forma de damero alrededor de la parte externa de la matriz, para permitir un alineamiento automático de la cuadrícula para identificar los conjuntos de sondas.

El análisis, incluyendo la normalización MAS5, el análisis estadístico y la tasa de corrección de falsos descubrimientos, se llevó a cabo como se ha descrito previamente (Rossel et al (2007), The Plant Cell, 10.1105/tpc.1106.045898).

Mediciones morfológicas y fisiológicas

Mediciones foliares

Se midió el potencial hídrico total utilizando un psicrómetro con termopar fabricado expresamente (Morgan, (1991), Australian Journal of Plant Physiology, 18, 249 a 257). Se colocaron discos foliares en las cámaras de equilibrado durante 4 horas a 22°C. Se hizo pasar una corriente de refrigeración Peltier a través del termopar y se leyó la fuerza electromotriz (fem) como una desviación de la aguja en un microvoltímetro (HR 33 Dew Point, Wescor, www.wescor.com/environmental). El potencial hídrico de la hoja (MPa) se calculó mediante interpolación de la fem con una curva patrón. Se midió el potencial hídrico del suelo utilizando un aparato de placa de presión (Klute (1986), Methods of Soil Analysis, Part 1. Physical and Mineralogical Methods - Agronomy Monograph no. 9 (Klute, A., ed. Madison, WI, USA: American Society of Agronomy - Soil Science Society of America, págs. 635-662).

También se realizaron numerosas mediciones fisiológicas de las muestras foliares. Se registraron el grosor y el área de superficie de las hojas. En los primeros experimentos, se midió el contenido relativo de agua de las muestras foliares registrando de su peso fresco, secándola en una bolsa de papel durante 3 días a 60°C y registrando después su peso seco. A continuación se calculó su contenido relativo de agua (RWC) utilizando la siguiente fórmula:

RWC (%) = (FW – DW)/FW

En experimentos posteriores, se separaron hojas en roseta de las mismas plantas, se registró el peso fresco (Fw) y se incubaron en agua durante al menos 4 horas a 4°C en la oscuridad. Las hojas se secaron y se midió el peso turgente (Tw). Por último, las hojas se secaron a 80°C durante la noche y se pesaron para determinar el peso seco (Dw). El contenido relativo de agua (RWC) de calculó como (Jones, (2007), Journal of Experimental Botany, 58, 119130):

Fw - Dw

RWC = -----------

Tw - Dw

Intercambio de gases

Las mediciones de intercambio de gases se realizaron en las plantas cultivadas en días de 12 horas para promover el crecimiento vegetativo y por lo tanto las hojas grandes. Siendo la única excepción aquellas plantas de los experimentos de cronología de sequía que se hicieron crecer en días de 16 horas. El intercambio de gases se realizó con un Li-6400 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este aparato permite que una hoja se adjunte a la planta que se sujeta en una cámara y se mide una serie de parámetros. Dentro de la cámara se pueden controlar la intensidad de la luz, el espectro, la temperatura, la humedad y la concentración de CO2. Mediante la comparación de la cantidad de CO2 y de vapor de agua que entra en la cámara y sal de la cámara, pueden deducirse la cantidad de fotosíntesis y la conductancia de los estomas. Cambiando condiciones tales como la intensidad de la luz y la concentración de CO2 los autores de la presente invención pueden observar cómo responden los estomas trazando la conductancia media de la hoja. La cámara tiene 2 cm2 de manera que si la hoja de Arabidopsis no cubre por completo esta área la conductancia se ajusta para el área de la hoja dentro de la cámara.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Se analizó el perfil de carotenoides de material foliar mediante HPLC. En resumen, el material foliar se trituró en 500

μL de una mezcla 60/40 (v/v) de acetona/acetato de etilo. Esto se diluyó con 400 μL de dH2O y se centrifugó a

velocidad máxima en una centrífuga de sobremesa durante 3 minutos. Los carotenoides se fraccionaron y se analizaron utilizando un Agilent HPLC y un detector de matriz de fotodiodos como describen (Pogson, B.J., Niyogi, K.K., Bjorkman, O., y DellaPenna, D. (1998), "Altered xanthophyll compositions adversely affect chlorophyll accumulation and nonphotochemical quenching in Arabidopsis mutants", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1332413329). Los carotenoides se identificaron por comparación de sus espectros y tiempos de retención con los patrones y se registraron las áreas de los picos para la cuantificación utilizando los coeficientes de extinción molar.

Mediciones con carbono-13

La cantidad de 13C en tejido foliar proporciona una indicación de la apertura media de los estomas durante la vida de una planta ya que cuando los estomas estén abiertos ésta discriminará a favor de 12C sobre 13C. Las muestras foliares se pesaron para obtener su peso fresco y se secaron durante 3 días a 60°C en una bolsa de papel. Las muestras secas se trituraron después un mortero y una mano de mortero y el polvo se utilizó para determinar la razón de 12C con respecto a 13C en la muestra.

Contenido de clorofila

El contenido de clorofila total se midió mediante absorbancia a 647 nm para la clorofila a y a 663nm para la clorofila

b. Para extraer la clorofila se trituraron 10-20 μg de tejido foliar con un cojinete de bolas y 700 μL de tampón de extracción (acetona al 80%, tampón fosfato de sodio 2,5 mM de pH 7,8) en el Tissue-Lyser. Las muestras se centrifugaron a continuación a velocidad máxima en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos. Después se midió la absorción del extracto a 647 nm, 663 nm y 750 nm. La absorbancia a 750 nm es la absorbancia de fondo y por lo tanto se restó de la absorbancia a 647nm y 663 nm. Para calcular el contenido total de clorofila se utilizó la siguiente ecuación:

Clorofila total (µg/mg FW) = 17,76(A647 – A750) + 7,34(A663 – A750)

Contenido de antocianina

El contenido total de antocianina se midió mediante absorbancia a 530 nm. Se trituraron aproximadamente 30 mg de tejido en 300 μL de metanol acidulado (HCl al 1%) en el Tissue-Lyser utilizando un cojinete de bolas. Para extraer las antocianinas, se añadieron 250 μL de cloroformo y 200 μL de H2O MilliQ. A continuación la mezcla se centrifugó a velocidad máxima en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos. Después se retiraron 200 μL de la fase

acuosa y se midió la absorbancia a 530 nm y 657 nm. La absorción se midió utilizando o bien placas de 96 pocillos en un lector de placas o bien en cubetas individuales. Luego se calculó la absorbancia debida a las antocianinas restando la absorbancia debida a la turbidez de la muestra (a 657nm) de la absorbancia a 530 nm. La concentración de antocianinas se midió por la ecuación:

C = A/εL x vol/1000 x MW x 1/peso x D 106

donde C es la concentración (µg/g), A es la absorbancia, s es 26 9000, la constante de la antocianina más abundante, cianidina-3-glucósido, L es la longitud de la ruta de la cubeta; vol es el volumen total de extracto ( ml); MW es 449, el peso molecular de la cianidina-3-glucósido; el peso es el peso de la muestra original (g), y D es el factor de dilución (si se utiliza).

Análisis de ascorbato

Se añalizó el tejido foliar congelado para determinar el contenido de ascorbato y el estado rédox de la reserva de ascorbato. El tejido se trituró en nitrógeno líquido utilizando un mortero y una mano de mortero antes de pesar aproximadamente 50 mg de polvo en un tubo Eppendorf de 1,55 ml congelado. Se añadieron cuatro volúmenes de tampón de extracción (ácido metafosfórico al 2% p/v en H2O MilliQ; SigmaUltra, SigmaAldrich, St. Louis, MT, USA) y la muestra se sometió a vórtice para mezclarlos completamente. Las muestras se centrifugaron a continuación a velocidad máxima (16,1xg) en una centrífuga de sobremesa a 4ºC durante 4 minutos. Luego se añadieron 50 μL del extracto a 485μL de tampón de análisis (KH2PO4 67,5 mM, K2HPO4 32,9 mM, EDTA 1,27 mm) y se golpearon

ligeramente para mezclarlas. A continuación se midió el contenido de ascorbato reducido mediante la absorbancia a 265 nm y 415 nm. La reserva de ascorbato se oxidó después mediante la adición de 33,3 U de ascorbato oxidasa en

tampón de análisis (5 μL en 6,67 U/μL, Calzyme Laboratories, San Luis Obispo, CA, USA) y se midió la absorbancia. Otra muestra se redujo con 5 μL de ditiotreitol 0,2 M en tampón de análisis durante 20 minutos y se midió la absorbancia. Se utilizaron blancos apropiados. También se calculó el volumen total del extracto.

Para determinar la cantidad de ascorbato presente, se normalizó la absorbancia a 265 nm contra la absorbancia del fondo y la absorbancia a 415 nm. Esto proporciona una concentración de ascorbato, que se puede utilizar después para calcular mg/100 g FW de tejido. La cantidad de la reserva de ascorbato que se reduce se puede calcular como la concentración de la muestra original menos la concentración de la muestra oxidada. La cantidad total de ascorbato presente se puede medir como la concentración de la muestra reducida menos la concentración de la muestra oxidada.

Análisis de la Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC)

El análisis ORAC es una medida de la capacidad antioxidante de una sustancia y se utiliza ampliamente para determinar la capacidad antioxidante de los alimentos. Para Arabidopsis se sometió a ensayo un extracto del material vegetal. Este extracto puede o bien estar unido a la membrana; de la membrana plasmática, tilacoides del cloroplasto y otras endomembranas; o bien ser soluble; del citosol, de las vacuolas, de los estromas de los cloroplastos, etcétera. El análisis midió la fluorescencia de una molécula fluorescente sensible a la oxidación, ficoeritrina (R-PE, Sigma). Se añade un generador de radicales libres, AAPH (Sapphire BioScience), a la R-PE y como resultado la fluorescencia disminuye lentamente. Después se añade el extracto vegetal y, o bien reduce la tasa de disminución o bien la aumenta, dependiendo de si tiene más capacidad antioxidante o capacidad de oxidación, respectivamente. Como norma, se utiliza un antioxidante, Trolox (Fluka), en lugar del extracto vegetal. Trolox es un derivado de la vitamina E. La capacidad antioxidante del extracto se puede cuantificar a continuación en forma de equivalentes en µmoles de Trolox/g de peso fresco de tejido comparando el área de cada curva.

Para elaborar el extracto, se congelaron 20-100 mg de hojas maduras pero no senescentes en nitrógeno líquido y su peso fresco se determinó en un tubo Eppendorf previamente pesado. El tejido congelado se trituró a continuación hasta un polvo fino y se resuspendió en 400 μL de H2O milliQ estéril. El material insoluble en agua se sedimentó en una centrífuga de sobremesa a la velocidad máxima a 4ºC durante 30 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se diluyó con PBS (tampón fosfato salino; 75 mM, pH 7,0) a una concentración de 10 mg de peso fresco original/ml. Para el extracto soluble en lípidos se lavó el sedimento anterior dos veces en dH2O antes de ser re-suspendido en 400 μL de acetona. Los materiales sólidos se sedimentaron a continuación en una centrífuga de sobremesa a velocidad máxima durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se diluyó con PBS a una concentración de 10 mg de peso fresco/mL.

Para el propio análisis se utilizó un espectrofotómetro Eclipse (Cary) que puede mezclar las muestras en la cubeta utilizando una varilla agitadora pequeña y puede medir la fluorescencia de cuatro muestras a la vez. Por lo tanto se pueden hacer correr simultáneamente un blanco, el patrón y dos muestras. Estas están constituidas como sigue:

1.Blanco – 2738 μL 3,38 mg/L R-PE +150 μL 1X PBS + 150 μl AAPH 320 mm

2.

Patrón – 2738 μL 3,38 mg/L R-PE + 150 μL Trolox 20μM + 150μL AAPH 320MM

3.

Muestra – 2738 μL 3,38 mg/L R-PE PBS + 150 μL Muestra + 150 μL AAPH 320MM

En primer lugar, se añaden R-PE y muestra/Trolox/PBS a la cubeta agitada y la fluorescencia se estabiliza en ~800, a lo largo de aproximadamente 20 minutos. Después se añade AAPH rápidamente a todas las cubetas y se mide la disminución de la intensidad de fluorescencia hasta llegar a cero. El área bajo cada curva se integra, se ajusta para el factor de dilución y se calculó la capacidad antioxidante.

Medidas de ABA

El contenido de AAB en las hojas se midió utilizando el análisis basado en Phytodetek Eliza (Agdia, Elkhart, Indiana, USA). Para la extracción de ABA, se recogieron ~100 mg de tejido foliar y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El tejido se trituró utilizando el Qiagen TissueLyser y un cojinete de bolas hasta un polvo fino. El polvo congelado se suspendió en 1 ml de disolución de extracción (metanol de grado HPLC al 80%, 100 mg/L de hidroxitolueno butilado, 500 mg/L de monohidrato ácido cítrico) y después se hicieron girar durante 24 horas en la oscuridad a 4°C. Las muestras se centrifugaron a continuación a 1000xg durante 20 minutos, antes de que el

sobrenadante se transfiriera a un nuevo tubo. El sobrenadante se secó hasta ~50 μL en la oscuridad utilizando un

Speedivac a temperatura media para eliminar el metanol. El líquido restante se diluyó a 1 ml con tampón TBS (3,03 g/L de base Tris, 5,84 g/l de cloruro sódico, 0,2 g/L de hexahidrato de cloruro de magnesio, 0,2 g/L de azida de sodio, pH 7,5). Se utilizó una dilución 1:100 en tampón TBS de cada muestra para el análisis. El análisis se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron a 405 nm en un lector de placas.

Se probaron numerosas variaciones del protocolo de extracción, incluyendo el secado de las muestras completamente antes de la resuspensión, el filtrado del extracto y la centrifugación del extracto. También se probaron pesos de tejidos de 20, 100 y 200 mg, y diluciones de 1:10 y 1:100.

Formación de imágenes

Microscopía Electrónica de Barrido

Los procedimientos se llevaron a cabo con la ayuda del Dr. Cheng Huang, ANU Electron Microscopy Unit.

Se utilizó microscopía electrónica criogénica de barrido para la formar imágenes de la superficie abaxial de las hojas. En resumen, se pegaron pequeños trozos de hoja madura a un soporte con una mezcla de medio de congelación del tejido y pasta de carbón, para ayudar a la conductancia. Las muestras se congelaron después en nitrógeno líquido a vacío para permitir la congelación rápida y evitar la formación cristales de agua. Las muestras se calentaron después a vacío a -90°C para el decapado, que es deshacerse de los cristales de agua de la superficie de la muestra. La muestra se devuelve después a -160°C antes de su recubrimiento con partículas de oro. A continuación la muestra se visualizó en un Cambridge S360 (SEM; 1987; Leica/Cambridge, Wetzlar, Alemania).

El mismo proceso se utilizó para buscar en la sección transversal de los primordios florales y las hojas maduras. Sin embargo, estas muestras se fracturaron al congelarlas. En resumen, una vez montadas y congeladas a vacío, se eliminó la parte superior de las muestras, de manera que la muestra se rompió y se expuso una sección transversal.

Microscopía electrónica de transmisión

Fijación de muestras foliares

Pequeños trozos de hoja madura se embebieron en resina para permitir la microscopía electrónica de la sección transversal de la hoja. En primer lugar las muestras, ~3 mm x 3 mm, se lavaron en un tampón de cacolidehído 0,1 M, formaldehído al 4% y glutaraldehído al 2,5% durante 2 horas bajo un vacío débil. Esto se retiró después y las muestras se lavaron en cacolidehído 0,1 M tres veces durante 15 minutos. La muestra se fijó a continuación con ácido oácico 0,1 M y tampón de cacolidehído 0,05 M durante 90 minutos. Las muestras se lavaron después en H2O tres veces durante 15 minutos. Las muestras se pusieron luego a través de un gradiente de etanol a partir de etanol al 70% y se desplazaba a través de 80%, 90%, 95% y tres lotes de etanol al 100%. Cada lavado se dejó durante al menos 15 minutos. Las muestras se lavaron a continuación en acetona al 100% durante 15 minutos para reemplazar el etanol. Las muestras se expusieron después a niveles crecientes de resina (EPON aldehído) diluida con acetona. La primera era 1/3 de resina: 2/3 acetona, luego 1/2 resina: 1/2 acetona, luego 2/3 de resina: 1/3 acetona. Cada una estuvo durante al menos 30 minutos y se hizo girar para mezclar. Las muestras se expusieron entonces a la resina pura tres veces durante más de 2 horas para deshacerse de cualquier acetona. La muestra se cargó a continuación en moldes de muestra con resina nueva y se coció durante la noche a 60°C.

Seccionamiento y tinción

Se cortaron secciones finas de material foliar embebido para TEM y microscopía óptica utilizando un ultramicrotomo Ultracuts (Reichert, Depew, NY, USA). Se elaboró un cuchillo de vidrio para cortar las rebanadas en agua. Las secciones se aplanaron utilizando calor antes de recogerlas en una rejilla de soporte para especímenes. Las muestras se dejaron secar a continuación durante la noche antes de teñirlas en acetato de uranilo al 6% (v/v) en agua durante 20 minutos en la oscuridad. Las muestras se enjuagaron en dH2O varias veces antes de la tinción en un tinte de citrato de plomo durante 10 minutos. El tinte se eliminó enjuagando en dH2O antes del secado.

Formación de imágenes

Se tomaron imágenes utilizando Hitachi H7100FA (125kV TEM, 1995, Tokio, Japón) unido a una cámara SIS Megaview III Widefield CCD (1300 x 1024 píxeles, 12 bits; Soft Imaging Systems Corprations, Lakewood, CO, USA).

Microscopía óptica

Los procedimientos se realizaron con la ayuda de Lily Shen, ANU Electron Microscopy Unit.

Las secciones transversales de la hoja se secaron, se cortadas con el ultramicrotomo, sobre un portaobjetos de vidrio y se tiñeron con azul de toluidina, antes de enjuagarse con dH2O. Se tomaron imágenes del portaobjetos montado iluminado desde abajo utilizando un Zeiss Axioskop (Carl Zeiss Inc, Oberkochen, Alemania) con una cámara SPOT CCD (1300 x 1240, 36 bits de color, (Spot Images Corporation, Chantilly, VA, USA). Las imágenes fueron procesadas a continuación con el programa SPOT Advanced.

Imágenes con luciferasa

La actividad de luciferasa en plantas transgénicas se detectó in vivo utilizando una cámara CCD enfriada. Las plantas se pulverizaron abundamentemente con luciferina 0,5 mM (Biosynth, Suiza), en agua y que contenía unas pocas gotas de Tween-80 (Laboratory Supply, Australia), tanto 15 minutos como inmediatamente antes de formación de imágenes. Las plantas se dejaron en la oscuridad durante varios minutos hasta que cesó la fluorescencia de laclorofila antes de tomar exposiciones que varíaban de 2 a 10 segundos. Éstas se integraron después para aumentar la intensidad de la imagen. Se utilizó una cámara CCD enfriada (Andor Technology, Japón) y las imágenes se procesaron utilizando ImagePro Plus® 4.5.1 (Media Cybernetics, USA).

Extracción y análisis de metabolitos/solutos

Se extrajeron aproximadamente 50 mg de peso fresco de tejido foliar y analizaron mediante GC-MS esencialmente como describen Roessner-Tunali et al. (2003), Plant Physiology, 133:84-99). En resumen, el tejido se congeló en N2 líquido, después se trituró en un molino de bolas Retsch durante 3 min a 15 oscilaciones/s. El polvo de tejido (~50 mg) se extrajo después a 70ºC durante 15 min con 0,5 ml de MeOH/H2O al 85% (v/v) que contenía 0,2 mg/mL de ribitol como patrón interno. El material insoluble se sedimentó después mediante centrifugación a 20.000 g durante

10 min. Una alícuota de 100 μL del sobrenadante se secó a continuación a vacío y el extracto metabolito seco se derivatizó mediante metoximación con 20 μL de metoxiamina.HCl de 20 mg/ml en piridina anhidra (30°C, 90 min). Para convertir los grupos funcionales reactivos que contenían hidrógenos reactivos en sus derivados trimetilsililados (TMS), se añadieron 30 μL de MSTFA a la mezcla de reacción y se dejó que reaccionaran durante 30 min a 37°C. A continuación la reacción se dejó equilibrar durante al menos 4 horas antes de su análisis GC-MS. Se inyectó 1 μL en el GC-MS y se utilizó un programa de temperatura de 45 min para separar los analitos en una columna Varian Factor Four 5ms GC de 30m con una columna de guardia de 10m integrada. Los datos de cuadrupolo-MS se adquirieron en el modo de barrido completo con un intervalo de barrido de 0 a 600 m/z.

El análisis de datos se llevó a cabo mediante el uso del programa AMDIS disponible libremente para la desconvolución automática y la integración de los picos y el emparejamiento contra una base de datos interna de espectros de masa e índices de retención auténticos. El análisis estadístico se realizó utilizando scripts de PHP para procesar automáticamente los informes de los lotes AMDIS y la visualización en Microsoft Excel.

Ejemplo 2 – Resultados

Después de la mutación EMS de las semillas de Arabidopsis thaliana, se identificaron varios mutantes con alteraciones de la expresión de APX2: LUC, incluyendo el mutante alx8 que mostraba un incremento en la expresión de APX2: LUC. Estas plantas mostraron una incremento en la tolerancia a la sequía - después de 9 días de privación de agua, las hojas del mutante alx8 permanecieron turgentes, verdes y viables, mientras que las hojas de tipo salvaje se marchitaron y se secaron (véase la Fig. 7). Se ha descubierto que los niveles de ABA son superiores en alx8, aunque, al mismo tiempo, los componentes de las rutas tanto dependientes de ABA como independiente ABA están regulados al alza ((Rossel, J.B., P. B. Walter, et al. (2006), Plant, Cell and Environment 29 (2): 269-281). Por ejemplo, los genes de respuesta al exceso de luz, ZAT10 y APX2, están ambos regulados al alza en alx8. Sin embargo, se considera que ZAT10 está en la ruta independiente de ABA (Zhang, J.Z., et al (2004), "From Laboratory to Field. Using Information from Arabidopsis to Engineer Salt, Cold, and Drought Tolerance in Crops", Plant Physiol. 135(2): 615-621), mientras APX2 es dependiente de ABA (Rossel et al, 2006). La regulación al alza de los genes de respuesta al estrés es coherente con anteriores los mutantes fry1 previos, aunque los genes de respuesta al estrés que están regulados al alza en cada mutante no son idéntico, por ejemplo RD29A está regulado al alza en fry1-1 (Xiong, L.M. et al. (2001), "FIERY1 encoding an inositol polyphosphate 1-phosphatase is a negative regulator of abscisic acid and stress signaling in Arabidopsis" Genes & Development 15(15): 1971-1984) pero no en alx8 (Rossel et al, 2006). Del mismo modo, el aumento de la tolerancia al estrés observado en alx8 es un rasgo novedoso. alx8 también tiene una morfología foliar similar a la col inusual. Los estudios de plantas F1 y F2 demostraron que el aumento de la expresión de APX2: LUC y la regulación al alza de otros genes de estrés, tolerancia a la sequía y forma foliar alterada mostraron cosegregación. Esto es coherente con una lesión en una etapa temprana de redes de señalización por sequía o exceso de luz que está asociada con un único locus genético.

alx8 es una mutación puntual en SAL1

La localización de la mutación puntual alx8 se identificó mediante clonación posicional y secuenciación. Se creo una población para el mapeo cruzando alx8, en el fondo Col-0, con Landsberg erecta de tipo salvaje. La F1 fue de tipo salvaje en el fenotipo foliar, el desarrollo y la expresión de APX2 (datos no mostrados), confirmando una mutación recesiva. Se permitió que los individuos F1 se autofertilizaran y la generación F2 segregante fue se sembró en el suelo. Los individuos de la generación F2 homocigota para la mutación alx8 se identificaron mediante la morfología foliar, que se ha demostrado que se segrega con la tolerancia a la sequía y el aumento de la expresión de APX2 (Rossel et al, 2006). El mapeo del primer momento con 22 cebadores distribuidos en todo el genoma de Arabidopsis se realizó con 400 individuos F2 mutantes. Esto indicó que la mutación estaba vinculada a la mitad inferior del cromosoma 5. Un análisis de vinculación adicional con más marcadores en esta región dio una región de interés de 617kb. El mapeo fino de aproximadamente 4000 individuos F2 se llevó a cabo con dos marcadores que flanqueaban la región de 617 kb, MUB3 y MMI9.

Para confirmar la localización de la mutación alx8 se utilizó una copia de tipo salvaje del gen SAL1 y el promotor para complementar el fenotipo mutante. Los dos transformantes alx8 individuales confirmados tuvieron una morfología y un desarrollo foliar de tipo salvaje. La progenie de alx8 complementado se segregó para el fenotipo mutante alx8 y mostró morfología foliar de tipo salvaje normal (véase la Figura 2). Esto confirmó que la mutación en SAL1 era de hecho responsable del fenotipo mutante. Las plantas de tipo salvaje también se transformaron con este constructo, pero no mostraron ningún cambio en la morfología foliar, la expresión de APX2 o el desarrollo.

La secuenciación del gen alx8 y 2kb del promotor reveló un polimorfismo de un solo nucleótido de una guanina a adenina en el par de bases 1226o de la secuencia genómica At5g63980.1 (Secuencia TAIR: 4010730406 (17 de abril de 2007), Núm. de acceso: NM_125794.4; SEQ ID NO: 1; Fig. 3). Esto da como resultado un cambio de aminoácido de glicina a ácido aspártico en el aminoácidos 217o de la secuencia codificante (acceso TAIR: 4010745380 (16 de agosto de 2007); SEQ ID NO: 2; Fig. 4). Se confirmó que esta mutación era la única mutación en SAL1 mediante secuenciación adicional del promotor y la secuencia genómica de múltiples plantas mutantes. También se escrutaron cuatro generaciones retrocruzadas para determinar la mutación, mediante el uso de marcadores de secuencias polimórficas escindidas derivadas (dCAPS), para confirmar que el fenotipo foliar se heredaba con la mutación (véase la Figura 1A). Es decir, que ninguna otra mutación en la planta estaba causando el fenotipo mutante.

Se han identificado previamente numerosos mutantes en SAL1, incluyendo la mutación sensible a la temperatura, la alta expresión de la expresión génica regulada por estrés osmótico 2 (hos2; Xiong et al, 2004) y los mutantes firey 1 (fry1: Xiong et al, 2001). La mutación fry1-1 da como resultado un cambio en el aminoácido 341o de triptófano a un codón de parada, lo que da como resultado una proteína truncada que pierde una hélice α5 que se requiere para la actividad enzimática (Xiong et al, 2001). Utilizando el modelado de proteínas in silico frente a la estructura conocida de la homología de levadura, HAL2, se localizó la mutación alx8 en una lámina β conservada interna con respecto a la proteína. Este dominio no tiene función conocida.

Mutantes Salk_020882

En el transcurso de la genotipificación del mutante alx8, la genotipificación y la fenotipificación adicionales de los recombinantes permitieron estrechar el área de interés al clon BAC MBM17 y siete genes. Se ordenaron numerosas líneas de inserción de ADN-T para estos genes, con la esperanza de fenocopiar el fenotipo alx8. Una línea, SALK_020882, fenocopió el fenotipo alx8 o una morfología foliar alterada y un retraso en el desarrollo (véase la Fig. 10). Esta línea contiene una inserción en el gen At5g63980, conocido como SAL1 (FRY1/HOS2). Para confirmar alelismo se llevó a cabo un cruce entre alx8 y SALK_020882. Toda la progenie tuvo la misma morfología foliar alterada y retraso en el desarrollo de los dos parentales indicando que los dos mutantes son alélicos. También se encontró que las plantas SALK_020882 (aquí se estudiaron dos líneas concretas, referidas como salk1 y salk2) eran más tolerantes a la sequía que las plantas Col-0 de tipo salvaje (Figuras 12 y 15). Estos mutantes comprenden una línea de inserción de ADN-T en el ecotipo Col-0 obtenido del Arabidopsis Biological Resource Centre (ABRC). Las plantas homocigotas tienen una morfología foliar de tipo col alterada, como alx8 (véase la Fig. 10), y son resistentes a la kanamicina. La mutación es alélica para alx8 y estos mutantes muestran tolerancia a la sequía (véanse las Figs. 11, 12 y 15). Las transferencias Northern indican que en ARNm de SAL1 todavía está presente en la línea SALK_020882 pero se encuentran presentes múltiples variantes de empalme, en comparación con Col-0 de tipo salvaje y el mutante alx8 que tienen sólo una.

El sitio de inserción propuesto por The Arabidopsis Information Resource (TAIR) se proporciona en la Fig. 9A. Esto se estableció mediante secuenciación de un solo pase a partir del LB del inserto de ADN-T. Esto proporcionó la secuencia complementaria, es decir hacia el extremo 5' del gen.

Para confirmar la localización de la inserción se llevó a cabo un PCR de Cola desde el LB del inserto sobre el ADN de una planta. Esto dio como resultado el sitio de inserción mostrado en la Fig. 9B. La secuencia se obtuvo desde ambos lados indicando la posibilidad de un doble inserto. La secuencia obtenida indicó también la deleción de 11 pb alrededor del sitio de inserción (véase la Fig. 9B en comparación con la Fig. 9A).

La proteína SAL1 está ausente en alx8 y fry1-1

La proteína recombinante para SAL1 de tipo salvaje y ALX8 mutada fueron producidas como fusiones a ubicuitina etiquetada con poli-histidina. Ambas proteínas de fusión se produjeron con éxito en E. coli y sus masas calculadas (~52 kD) se correspondieron con los tamaños esperados, basándose en la secuencia de aminoácidos más la etiqueta de 14 kD (datos no mostrados). Aunque se intentaron muchas condiciones de inducción diferentes, solo el gen de fusión de SAL1 (de tipo salvaje) se purificó con éxito en la fracción soluble. Esta proteína también mostró una actividad enzimática fosfatasa PAP similar (16,6 ± ET 3,65 µmoles PAP.h-1. mg de proteína, n = 3) a la referida previamente (Xiong et al., 2001).

Se realizó el análisis de transferencia Western para determinar la abundancia de la proteína SAL1 en plantas de tipo salvaje y mutantes. La proteína recombinante SAL1 auténtica se recuperó después de la escisión de la etiqueta dejando el polipéptido con la masa molecular esperada basada en la secuencia de aminoácidos (37 kD) (Figura 11A, calle 10). Esta proteína se utilizó para originar anticuerpos policlonales, que se purificaron por inmunoafinidad frente a SAL1. Se detectó una única banda de 37 kD, cuyo tamaño correspondía al de la proteína recombinante, en el extracto de proteína soluble total de ambas plantas de tipo salvaje pero no en los mutantes (Figura 11A). Asimismo, la proteína SAL1 no estuvo presente en el extracto de proteína total de alx8 pero estuvo presente en Col-0 de tipo salvaje (Figura 11B).

alx8, salk_020882 y fryl-1 son tolerantes a la sequía

El mutante fryl-1 es una línea de Arabidopsis thaliana mutante que presenta un incremento en la expresión del gen de respuesta estrés RD29A en condiciones normales y también después de de estrés por frío, sal y osmótico y con tratamiento ABA. Se encontró que esto era debido a una mutación puntual que daba como resultado un codón de terminación en el sexto exón de la proteína SAL1 (At5g63980). Esto da lugar a una proteína truncada que no contiene una hélice α conservadas que contiene un motivo WD-X11-GG necesario para la coordinación de iones metálicos, y fosfato y también para la activación nucleofílica del agua. Como resultado, la proteína no tiene actividad contra IP3 o PAP. Se informó de que el mutante fry1-1 presentaba un incremento de la sensibilidad al estrés para el estrés por sal, frío y osmótico (Xiong, LM et al. (2001), Genes & Development 15 (15): 1971-1984). Este mutante también muestra morfología foliar alterada similar presentada por los mutantes alx8 y salk_020882. En los presentes estudios, se encontró que las plantas fry1-1 eran resistentes a la sequía de un modo similar al igual que los mutantes alx8 y salk_020882 en comparación con plantas de tipo salvaje cuando se sometían a un tratamiento de sequía a una edad de desarrollo (véase la Fig. 7) o la edad cronológica (Fig. 8A) similares. Véase también la Figura 15A. La Figura 8A demuestra que, mientras que las plantas Col-0 y C24 de tipo salvajes presentan hojas cloróticas y marchitas después de 21 días de privación de agua, las plantas alx8 y fry1-1 solo muestran signos de marchitamiento después de 25 días, y la Figura 15A demuestra que las plantas alx8, salk_020882 y fry1-1 no muestran signos de marchitamiento o cloróticos después de 18 días, mientras que las plantas de tipo salvaje (plantas Col-0 y Col-24) mostraron marchitamiento y clorosis después de 18 días. Como se muestra en la Figura 15A, que ilustra los resultados de la privación de agua durante 18 días, seguida de re-hidratación durante 3 días, las plantas alx8, salk_020882 y fry1 recuperaron el vigor en 3 días, mientras que los tipos salvajes Col-0 y C24 mostraron poco o ningún signo de recuperación, estando la mayoría de las hojas blanqueadas y marchitas. Este patrón se reprodujo en más de 10 experimentos diferentes, con al menos cuatro plantas por experimento.

alx8, salk_020882 y fryl-1 y tolerancia a la sequía

A pesar de tanto alx8 como fry1-1 son alelos de pérdida de función (y se presume que salk-020882 es un alelo de pérdida de función), se ha descrito previamente que la fase de plántula de fry1-1 es sensible a la sequía (Xiong et al, 2001), mientras que las plantas alx8 maduras desarrolladas en suelo son tolerantes a la sequía (Rossel et al, 2006), al igual que lo son las plantas salk-020882. La descripción de fry1-1 (por Xiong et al., 2001) se basa en el aumento de la fuga de iones de plántulas de 1 semana de edad en la inmersión en disolución que contiene PEG. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia en las tasas de transpiración de los brotes desprendidos de fry1-1 y C24 de tipo salvaje, indicando que no había cambios en el control estomático. Para investigar la diferencia entre fry1-1 y alx8 en este sentido, se controló la transpiración de rosetas desprendidas de alx8, fry1-1, Col-0 tipo salvaje y C24 de tipo salvaje por la pérdida de agua. No se observaron diferencias significativas entre los cuatro tipos ya sea en la fase inicial o de la fase secundaria, lo que indica que la pérdida de agua por transpiración y a partir de la cutícula son similares.

Después se sometieron a ensayo los mutantes fry1-1 para determinar la tolerancia a la sequía basada en el suelo privando de agua las plantas vegetativas maduras durante 28 días. En múltiples experimentos fry1-1 fue más tolerante a la sequía que C24 de tipo salvaje (Véanse, por ejemplo, las Figuras 7, 8A y 15A). Para asegurarse de que ambos conjuntos de plantas estaban siendo expuestos al mismo estrés, el contenido relativo de agua del suelo se aproximó por el peso de la maceta calculado como el porcentaje del peso de la maceta original. No hubo una diferencia significativa en el contenido de agua del suelo entre las plantas fry1-1 y C24 de tipo salvaje a lo largo de todo el experimento (Fig. 8b). Esto se convirtió en potencial hídrico del suelo y de nuevo no hubo diferencia significativa entre el potencial hídrico del suelo.

De manera similar, no se ha observado una diferencias significativas en el contenido de agua del suelo de las plantas alx8 o salk-020882 y las plantas Col-0 de tipo salvaje en múltiples experimentos (Figs. 8B, 15B y 21C). Para asegurar que la tolerancia de alx8 no es sólo una consecuencia de su retraso en el desarrollo o su menor tamaño, se sometió a ensayo la tolerancia a la sequía de alx8 en numerosas fases de desarrollo. alx8 fue más tolerante a la sequía que Col-0 de tipo salvaje a las 2, 4, 6 y 8 semanas de edad. alx8 también fue más tolerante a la sequía que Col-0 de tipo salvaje cuando ambos tipos de plantas tenían seis hojas; ambas eran maduras y vegetativas, y cuando ambas se encontraban en la misma etapa de desarrollo, apenas comenzaban a brotar los primordios florales (Figura 21). Cuando las plantas estaban comenzando a florecer (Figura 21A) las plantas tenían aproximadamente igual área y de roseta y tamaño, incluso después de 9 días de privación de agua, alx8 y salk_020882 estaban ambas más turgentes y verdes que Col-0 de tipo salvaje, aunque las macetas perdieron agua en proporciones similares (Figura 21C). De manera similar, las plantas alx8 y fry1-1 desarrolladas hasta la misma fase verde madura de desarrollo, a la cual las plantas de tipo salvaje tenían 8 semanas de edad y las plantas alx8 4 semanas de edad, fueron más tolerantes a la sequía (Figura 21B). Se midió la pérdida de agua de las rosetas desprendidas para los cuatro genotipos para determinar si la forma de la hoja y de la roseta altera la tasa de pérdida de agua, o si regula diferencialmente el flujo de agua a través de control estomático (la fase inicial de pérdida de agua) o la evapotranspiración cuticular (la segunda fase de pérdida de agua). No se observaron diferencias significativas entre las cuatro líneas en cualquiera de las fases (Figura 21E). Por lo tanto, los cambios en la morfología de la hoja y forma de roseta no afectan a la tasa de pérdida de agua de las plantas desprendidas. Finalmente, se evaluó la tolerancia a la sequía de las plantas de la misma edad para las cuales había 1 planta Col-0 por maceta en comparación con 2 plantas alx8 por maceta para equiparar la diferencia de tamaño de la planta y de nuevo alx8 fue más tolerante que Col-0 a la privación de agua. Esto indica que no hay un retraso en el desarrollo de alx8 ni una diferencia en el contenido de agua del suelo que de como resultado la tolerancia a la sequía de alx8. Además, la transpiración de las rosetas cortadas no siempre se correlaciona con la tolerancia a la sequía de las plantas desarrolladas en suelo.

Para cuantificar la extensión de la tolerancia a la sequía de las plantas alx8, se llevó a cabo una medición de la viabilidad de la planta utilizando la fluorescencia de la clorofila. Se demostró que las plantas alx8 sobreviven a la sequía durante 40-50% más que Col-0 (datos no mostrados).

En un experimento diferente, se midió el contenido de agua relativo de la hoja (RWC) bajo condiciones sin estrés y después de 12 días de sequía (Figura 16A). Como era de esperar el RWC de la hoja de alx8 no cambió significativamente durante la sequía, mientras que el RWC de la hoja de tipo salvaje se redujo significativamente. Se calculó el potencial hídrico de la hoja, o el potencial químico del agua dividido por el volumen molar parcial, para las mismas plantas utilizando un psicrómetro con termopar (Figura 16B). El mayor potencial hídrico de las plantas alx8 desarrolladas bajo condiciones de sequía se correlacionaron con la turgencia mantenida mientras las plantas de tipo salvaje sometidas a estrés hídrico tuvieron un potencial hídrico de la hoja significativamente menor.

Por último, se midió la pérdida de agua de rosetas desprendidas para los mutantes fry1-1 y alx8, y sus respectivos tipos salvajes (C24 y Col-0) para determinar si regulaban diferencialmente el flujo de agua a través del control estomático, la fase inicial de la pérdida de agua, o la evapotranspiración cuticular, la segunda fase de la pérdida de agua. No se observaron diferencias significativas en ninguna de las fases (datos no mostrados).

SAL1 es una proteína altamente conservada

La proteína SAL1 está altamente conservada en todas las criaturas vivientes. Por lo tanto están presentes homólogos en todas las especies de cultivo para las cuales se encuentra disponible una información de secuencia sustancial. Se espera que SAL1 y sus homólogos estén presentes en todas las especies vegetales. Esto se indica en el alineamiento de la Figura 5 de proteínas homólogas de plantas que han sido secuenciadas. Se investigaron las Etiquetas de Secuencia Expresada (EST) de otras especies vegetales para determinar el ARNm de SAL1 y se encontraron muchas secuencias homólogas (Figuras 6A-6C).

También hay varios genes homólogos a SAL1 en el genoma de Arabidopsis.

Efectos moleculares de la mutación alx8

Se midió la expresión de 13 genes de respuesta al estrés en fry1-1 y alx8. Solamente un número limitado de estos genes presentaba un aumento de la expresión en los mutantes en condiciones normales: COR47 en fry1-1; y APX2, RAP2.6, ZAT10, ZAT12 y DREB2A en alx8. La expresión de RD29A se incrementó en fry1-1 pero no se incrementó en alx8. Los genes de respuesta al estrés HSP70, KIN1, COR15A y ADH no estaban sustancialmente regulados al alza en condiciones normales en fry1-1 (Xiong et al, 2001). De un modo similar, sHsp, GST6 y APX1 no estaban sustancialmente regulados al alza en alx8 en condiciones normales. Esto resulta sorprendente dados los niveles constitutivos más altos de IP3 en estos mutantes e indica que la señalización de IP3 puede estar implicada en algunas rutas de respuesta al estrés. Para investigar adicionalmente la regulación al alaza de las rutas de respuesta al estrés, así como otras rutas no relacionadas con el estrés, se midió la expresión global por medio de micromatrices.

De los aproximadamente 24.000 productos génicos cuantificados en el GeneChip ATH1 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), 1414 genes estaban significativamente regulados al alza más de 2 veces en tejido foliar de alx8 con respecto a su expresión en Col-0 de tipo salvaje. Mil treinta y tres genes estaban significativamente regulados a la baja más de 2 veces. En fry1-1 en condiciones de crecimiento normales 1099 genes estaban significativamente regulados al alza y 745 regulados a la baja, más de 2 veces con respecto a C24 de tipo salvaje. Esta tendencia a la regulación al alza encaja con la función propuesta de SAL1 como un regulador negativo de las rutas de señalización. El solapamiento entre los cambios en la expresión en alx8 y fry1-1 estaba sorprendente limitado - de los genes regulados al alza, solamente 727 fueron compartidos en común entre los dos mutantes y, de los genes regulados a la baja, solamente 395 fueron compartidos en común. Estas diferencias de regulación no son las mismas que las diferencias entre los tipos salvajes C24 y Col-0. Por lo tanto, esto demuestra el grado en el que una mutación similar puede causar diferentes patrones de expresión en diferentes ecotipos.

Numerosos genes de respuesta al estrés estaban regulados al alza en alx8, incluyendo aquellos implicados en ambas rutas dependientes de ABA, por ejemplo:

-

regulación al alza de la acuaporina de tonoplasto (Tip5; 1) que normalmente está regulada a la baja por sacarosa, sal y H2O2, pero regulada al alza por ABA, y

-

el regulador negativo de la floración, CONSTANS-LIKE 9 (COL9), estaba altamente regulado al alza en alx8. La expresión en exceso de COL9 da como resultado la regulación a la baja de CO y FTP y un retraso de la floración, mientras que una desactivación del ADN-T conlleva una floración temprana (Xiao Fei-Cheng, Zeng-Yu Wang (2005), "Overexpression of COL9, a CONSTANS-LIKE gene, delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana" The Plant Journal 43 (5): 758-768). Este resultado se corresponde con las observaciones realizadas a lo largo de estos estudios, que demuestran que la floración en los mutantes SAL1 estudiados se retrasa de cuatro a cinco semanas en comparación con plantas de tipo salvaje. La Figura 15 muestra plantas alx8 y las correspondientes Col-0 de tipo salvaje a las 2, 3, 5 y 8 semanas de edad.

Hubo un incremento en la expresión de APX2 (multiplicidad de cambio = 9,3, valor p = 0,003); ZAT10 (multiplicidad de cambio = 5,00, valor p = 0,028) y RAP2.6 (multiplicidad de cambio = 3,1, pero gran desviación típica) en alx8. De manera interesante la expresión tanto de COR47 como de RD29A no aumentó significativamente ni en alx8 ni en fry1-1. La falta de inducción de RD29A fue confirmada mediante RT-PCR en tiempo real. Por lo tanto, puede haber diferencias en el crecimiento o perturbaciones en el entorno durante las manipulaciones experimentales que dan como resultado la inducción de estos dos genes en fry1-1. La ausencia de cualquier cambio en las matrices para NCED3, GST6, APX1, RD29A y DREB2A en alx8 en condiciones de buena irrigación también coincidió con los resultados publicados (Rossel et al., 2006).

Numerosos genes de respuesta al estrés fueron regulados al alza en alx8 incluyendo factores de transcripción tales como ZAT10, ZAT12, MYC2 y HB6. Otros genes de respuesta al estrés regulados al alza incluyeron: varias proteínas inducibles tempranamente por luz, ELIPS; acuaporina Tip5; 1; quinasa de señalización de estrés SnRK2.2; proteínas inducibles por estrés, VSP1 y VSP2; y enzimas antioxidantes CSD1 y CSD2.

Para investigar adicionalmente el tipo de rutas que están reguladas al alza constitutivamente en genes alx8 cuya expresión estaba regulada al alza más de 25-veces se compararon para comparar su expresión en otras matrices almacenadas en bases de datos públicas utilizando Genevestigator. A pesar del aumento de contenido de ABA de alx8 no hubo una correlación fuerte entre los patrones de expresión de alx8 con aquellos en respuesta a ABA. Sólo 10% de los genes también estaban regulados al alza por ABA, un número similar a los que normalmente están regulados a la baja por ABA.

No hubo una correlación fuerte con ningún otro tratamiento hormonal. Hubo cierta correlación entre los patrones de expresión de alx8 y la respuesta a estreses abióticos tales como osmótico, por herida, por calor, oxidativo, por frío y por sal, pero no ésta no fue fuerte. Doce por ciento de los genes regulados al alza en alx8 fueron inducibles por ABA, pero un número similar fue regulado a la baja por ABA. De un modo similar, no hubo una correlación fuerte con otros tratamientos hormonales, excepto una ligera correlación con el tratamiento con ácido jasmónico.

Efecto de SAL1 sobre los estomas

Previamente, se había demostrado que alx8 tenía una conductancia estomática inferior con respecto a Col-0 de tipo salvaje en un intervalo de intensidades de luz diferentes (Rossel et al, 2006). Esta disminución podría estar causada por una serie de factores, incluyendo cambios en la morfología, la fisiología y el perfil molecular de la planta.

La conductancia reducida podría estar debida a la alteración de la densidad, el tamaño y/o la morfología de los estomas de alx8. Por lo tanto se llevó a cabo la microscopía electrónica de barrido criogénico (SEM) para examinar los estomas. Los estomas fueron normales en apariencia, y no estaban agrupados como se observaba en otros mutantes con mutaciones de desarrollo de estomas. Ni los estomas estaban situados en una fosa, lo que disminuiría la conductancia incrementando la resistencia debida al efecto de capa límite. Los estomas de alx8 también tuvieron un tamaño similar al los Col-0 de tipo salvaje. Utilizando SEM se calculó densidad estomática sobre la superficieabaxial de las hojas y se encontró que era ligeramente superior en plantas alx8 que en Col-0 de tipo salvaje. Éste es un incremento mucho menor en comparación con los mutantes tales como la densidad estomática y la distribución 1 (SSD1; AT1G04110), que tiene una densidad estomática 2,5 veces mayor en el lado abaxial (Schlüter et al, 2003). Además también hubo un aumento en el número de células de la epidermis que dio como resultado un índice estomático similar tanto en alx8 como en Col-0 de tipo salvaje. Esto fue confirmado adicionalmente por las exfoliaciones epidérmicas de estomas en las plantas alx8 y Col-0 de tipo salvaje desarrolladas en un experimento diferente. Esta vez no hubo ninguna diferencia significativa en la densidad estomática entre Col-0 de tipo salvaje y alx8. Una vez más el índice estomático fue comparativo entre los dos tipos de plantas. Esto pone de relieve la importancia del índice estomático como una medida del número de estomas en la comparación de tejidos de plantas con un desarrollo alterado. A pesar de las hojas tienen una edad similar pueden diferir en su fase de expansión, lo que da como resultado una mayor densidad celular. Si el número de estomas fue un factor en la tolerancia a la sequía de alx8, cabría esperar que alx8 tuviera un menor índice estomático inferior que Col-0 de tipo salvaje. Este no es el caso y por lo tanto puede haber una alteración en la función de los estomas.

También puede disminuir la conductancia por una reducción de la apertura estomática. Se utilizó la discriminación de Carbono-13 para ver si había una diferencia en la apertura estomática media a lo largo de la vida de la planta.

Cuando los estomas están abiertos y los gases se intercambian libremente dentro y fuera del poro estomático la planta fijará preferentemente 12CO2 sobre 13CO2 debido a la discriminación por RUBISCO. Sin embargo, cuando los estomas están cerrados, el acceso a los gases es limitado y la planta se ve obligada a utilizar 13CO2. Por lo tanto la proporción de 13C a 12C en la planta se puede utilizar para indicar la conductancia estomática media de la planta. En condiciones de crecimiento normales se encontró que no había diferencia en la discriminación de 13CO2 entre el tipo salvaje y alx8. Esto indica que la apertura estomática media es comparable entre el tipo salvaje y alx8 en condiciones de crecimiento normales. Esto fue confirmado mediante la medición de la apertura de los estomas mediante exfoliaciones foliares epidérmicas a lo largo de un período de nueve horas. De nuevo, no se observó ninguna diferencia significativa en la apertura entre alx8 y Col-0 de tipo salvaje en el curso del tiempo.

Para ver si había alguna diferencia significativa en la apertura de estomas en respuesta a la sequía se realizó la discriminación de 13CO2 en las plantas que habían estado bajo estrés por sequía durante 20 días. Solamente se

cosecharon los tejidos desarrollados durante el tratamiento de sequía. El δ13C de las plantas afectadas por la

sequía fue más alto que el de las plantas control, tanto para Col-0 de tipo salvaje como para alx8, lo que indica que se había reducido la apertura estomática. El δ13C de alx8 afectados por sequía no fue superior que el de Col-0 de tipo salvaje afectado, lo que indica que alx8 no tiene una apertura estomática más pequeña durante la sequía. Por lo tanto, parece que la disminución de la conductancia observada para alx8 se debe a factores distintos de la apertura estomática.

Morfología de la Hoja

Está bien establecido que cambios morfológicos, tales como suculencia, el aumento de pelos de la hoja pueden alterar la tolerancia a la sequía. La morfología de las hojas de alx8 resulta considerablemente alterada con respecto a la de las plantas Col-0 de tipo salvaje. Las hojas son más cortas y más redondas con los bordes más lobulados. La superficie de la hoja es a menudo ondulada y se reduce la longitud del pecíolo, dando a la roseta una apariencia similar a la lechuga. El mutante SALK_020882 mutante muestra un morfología foliar similar (véase, por ejemplo, la Figura 12) como lo hace el mutante fry1-1 (véanse, por ejemplo, las Figuras 7 y 8A). El aumento de la ondulación de la superficie de la hoja podría aumentar el efecto de la capa límite, disminuyendo la transpiración.

Se midió el grosor de la hoja y se encontró que era significativamente mayor en plantas alx8 que en plantas Col-0 de tipo salvaje (Figuras 18A y B). Este grosor significa que el vapor de agua tiene que recorrer una distancia más grande hacia la apertura de los estomas y puede inhibir la pérdida de agua de la hoja. El aumento del grosor de la hoja también da como resultado una disminución de la proporción del área de superficie con respecto al volumen, lo que podría reducir la pérdida de agua a través de la cutícula. Las secciones transversales de la hoja examinadas mediante microscopía óptica también indicaron numerosos cambios en la estructura interna de la hoja incluyendo un haz vascular desorganizado, una forma celular alterada y cloroplastos más pequeños en alx8 (Fig. 18B). La cutícula es otra posible fuente de pérdida de agua de las hojas. Sin embargo no hay ninguna diferencia visible en el grosor o la estructura de la cutícula en alx8 en comparación con Col-0 de tipo salvaje. Además no hay ningún cambio significativo en la regulación de los genes de síntesis de la cutícula, tales como WAX2 (At5g57800), CUT1/CER6 (At1g68530) y CER1 (At1g02205) en alx8 con respecto a Col-0 de tipo salvaje.

Aunque con retraso en el desarrollo y una apariencia más pequeña debida a los cambios en la forma de las hojas y la roseta, las plantas alx8 habían acumulado una masa fresca y seca en roseta similar a la de tipo salvaje durante ocho semanas de crecimiento (datos no mostrados).

Morfología celular y potencial osmótico

Los cloroplastos tanto de Col-0 de tipo salvaje como de alx8 fueron examinados más estrechamente mediante microscopía electrónica de transmisión y se encontró que los cloroplastos de alx8 carecían de gránulos de almidón. Esta inhibición en la acumulación de almidón se confirmó adicionalmente para alx8, así como también para fry1-1 mediante tinción con yodo (Figura 19). Las plantas suelen acumular almidón transitorio en sus hojas durante el día y lo degradan por la noche. Como era de esperar, las hojas de tipo salvaje mostraron un aumento del almidón por la tarde en comparación con la mañana. Del mismo modo, las hojas de alx8 y fry1-1 habían acumulado más almidón por la tarde que por la mañana. Sin embargo, la cantidad presente era sustancialmente menor que en las plantas de tipo salvaje bajo condiciones de buena irrigación.

Esta disminución en el almidón se corresponde con un aumento en la expresión de las β-amilasas, BMY1 y BMY8, en alx8. Estas enzimas hidrolizan el almidón transitorio a maltosa y dextrina límite β, lo que puede aumentar el

potencial osmótico intracelular de las células de la planta. Los perfiles metabólicos de alx8, fry1-1 y sus respectivos tipos salvajes en condiciones de crecimiento de buena irrigación se analizaron mediante GC-MS.

Las cuatro líneas tuvieron diferentes perfiles como se indica en el análisis de componentes principales (ACP), con un grado de solapamiento entre C24 y Col-0 (Figura 20). Ambos mutantes estaban claramente separados de sus respectivos tipos salvajes por el primer componente principal (CP 1, que representa 47,2% de la varianza total) que representa la separación de clase más grande observable mediante ACP. De manera interesante, alx8 y fry1-1 estuvieron claramente separados por el segundo componente principal (CP 2, que representa 25,1% de la varianza total), mientras que los dos tipos salvajes no. En los mutantes SAL1 hubo aumentos significativos en los niveles de

la poliamina, putrescina en alx8 y fry1-1 (Tabla 2). Esto se correspondía con un aumento de la expresión del gen de biosíntesis de poliaminas limitante de la velocidad arginina carboxilasa, ADC2 (6,43 veces) y una disminución en la expresión de la enzima que convierte espermidina en espermina, ACL5 (-3,90 veces). No hubo una diferencia significativa en la abundancia de prolina en alx8 con respecto a Col-0 a pesar de un aumento en el gen de 5 biosíntesis de prolina, pirrolina-5-carboxilato reductasa (3,61 veces). Tanto en alx8 como en fry1-1 hubo cambios en la abundancia de un gran número de azúcares, incluyendo una fuerte reducción de los niveles de fructosa, galactosa, glucosa y celobiosa y un gran número de azúcares y derivados de azúcares desconocidos, y una acumulación espectacular de una serie de azúcares/derivados de azúcares desconocidos que no estaban a niveles no detectables o casi indetectables en plantas de tipo salvaje (Tabla 2). También llaman la atención los fuertes

10 descensos en los ácidos orgánicos, citrato, isocitrato, fumarato y malato y los fuertes incrementos en diversos metabolitos de clase desconocida, algunas con homología espectral con compuestos relacionados con indol (Tabla 2).

Tabla 2 - Perfiles metabólicos característicos de mutantes SAL1 La multiplicidad de las diferencias y los valores p (n = 5) se muestran para las mayores (más intensas) diferencias de metabolitos que fueron comunes tanto a alx8 como a fry1-1. Los metabolitos desconocidos (entre corchetes) se anotaron basándose en la similitud de sus espectros de masas con respecto a los espectros de referencia en la biblioteca de espectros de masas NIST05. Los índices de retención se proporcionan para metabolitos desconocidos. RI = "Índice de Retención".

Clase de metabolito

Nombre de metabolito alx8 vs Col-0 fry1-1 vs C24

Multiplicidad de Diferencia

valor p Multiplicidad de Diferencia valor p

Ácidos orgánicos

Citrato <0,01 <0,001 0,09 0,009

Fumarato

0,03 0,003 0,08 0,001

Isocitrato

0,05 0,014 0,03 0,004

Malato

0,08 <0,001 0,21 0,021

Poliaminas

Putrescina 15,2 0,008 5,23 0,001

Hidratoscarbono

de [Disacárido Desconocido] IR = 2869 0,01 <0,001 0,01 <0,001

Glucosa

0,03 <0,001 0,09 <0,001

[Disacárido Desconocido] IR = 1946,9

0,04 0,001 0,11 <0,001

[Azúcar Desconocido] IR = 2116,9

0,05 <0,001 0,19 0,001

[Azúcar Desconocido] IR = 2122,6

0,05 <0,001 0,16 0,001

Celobiosa

0,06 0,047 0,06 0,007

Galactosa

0,11 0,001 0,09 <0,001

Fructosa

0,16 <0,001 0,29 0,002

[Disacárido Desconocido] IR = 2730,9

0,16 0,044 0,3 0,035

[Monosacárido Desconocido] IR = 1777,7

0,32 0,002 0,14 0,001

[Desconocido similar a galactinol] IR = 2963

0,41 0,007 0,07 0,003

[Azúcar Desconocido] IR = 2094,1

0,45 0,012 0,66 0,041

Clase de metabolito

Nombre de metabolito alx8 vs Col-0 fry1-1 vs C24

Multiplicidad de Diferencia

valor p Multiplicidad de Diferencia valor p

[Supuesto Disacárido Desconocido] IR = 2836,1

0,45 0,009 0,22 <0,001

[Disacárido Desconocido] IR = 2534,4

5,63 <0,001 5,97 0,001

[Disacárido Desconocido] IR = 2544,4

13,92 <0,001 5,39 0,002

[Supuesto Disacárido Desconocido] IR = 2808,4

50,86 <0,001 22,62 0,002

[Supuesto Disacárido Desconocido] IR = 2923,4

75,11 0,001 26,13 0,018

[Supuesto Disacárido Desconocido] IR = 2898,4

155,75 <0,001 227,13 0,001

[Azúcar Desconocido] IR = 2149,9

168,5 <0,001 60,67 0,001

[Probable Disacárido Desconocido] IR = 2748,9

313,1 <0,001 136,59 <0,001

[Supuesto Disacárido Desconocido] IR = 2997,5

2767.48 <0,001 5684.57 <0,001

[Supuesto Disacárido Desconocido] IR = 2915,4

4624.26 <0,001 456,97 0,001

Clase desconocida

[Desconocido] IR = 2656,2 13,33 <0,001 34,94 0,026

[Desconocido] IR = 3116,0

778,55 <0,001 92,18 <0,001

[Desconocido] IR = 2656,2

1027.05 <0,001 1100.47 0,006

[Desconocido Posiblemente Relacionado con Indol] IR = 1404,6

99,82 0,002 26,54 0,005

[Desconocido Relacionado con Triptamina] IR = 1505,1

16,38 0,003 32,48 0,001

[Desconocido Posiblemente Relacionado con Indol] IR = 1389,1

200,04 <0,001 104,69 0,002

Discusión

La Tolerancia a la sequía de los mutantes alx8 parece estar debida a una reducción de la transpiración en condiciones de estrés, lo que da como resultado mayores contenidos de agua relativos en hojas y el suelo. Sin embargo, la reducción de la transpiración no parece estar debida a un aumento del cierre estomático inducido por sequía. Los experimentos tanto de discriminación de carbono como de deshidratación de la roseta cortada indicaron menos cierre estomático en alx8 en comparación con el de Col-0 de tipo salvaje en condiciones de sequía. Por lo tanto la reducción de la pérdida de agua es debida a otros cambios morfológicos, fisiológicos o moleculares en alx8

o a una combinación de los mismos.

Los cambios en la morfología estructural del alx8 pudieron causar una reducción de la pérdida de agua bajo estrés por sequía. El incremento del grosor de la hoja y la desorganización de los un haces vasculares pueden ralentizar el movimiento de agua a través de la planta y la difusión de vapor de agua a través de las cámaras subestomáticas. Del mismo modo, puede haber cambios en la morfología de la raíz de alx8 que alteren la absorción y la translocación de agua en condiciones de estrés hídrico.

A pesar de la falta de inducción de los genes de respuesta al estrés conocidos todavía existen numerosos cambios en el perfil metabólico de alx8 que están relacionados con las respuestas al estrés, incluyendo un aumento de poliaminas, trehalosa, azúcares y glicerol.

Es probable que la acumulación de osmoprotectores en alx8 y fry1-1 sea un factor que contribuye a su tolerancia a la sequía. El nivel de la poliamina, putrescina, fue 15,2 veces (valor p = 0,008) mayor en alx8 que en su respectivo tipo salvaje, Col-0. Correspondientemente, alx8 tiene una mayor expresión de la enzima biosintética de poliaminas ADC2, que normalmente está regulada al alza en respuesta al estrés osmótico (Pérez-Amador, M.A., et al (2002, Plant Physiology, 130, 1454-1463). Se ha informado sobre niveles de putrescina constitutivamente altos en una variedad de trigo tolerante a la sequía y en una variedad de mala hierba, Conyza bonariensis tolerante al estrés oxidativo (Ye et al., (1997), Plant Physiology, 15, 1443-1451). Se ha demostrado previamente que el aumento de los niveles de poliaminas por expresión en exceso de enzimas biosintéticas induce tolerancia a una variedad de tipos de estreses abióticos, incluyendo la sequía (Kurepa et al., (1998), Plant Cell Physiology, 39, 987-992; Kasukabe et al., (2004), Plant and Cell Physiology, 45, 712-722). Aunque el papel exacto de la putrescina en la tolerancia sigue siendo incierto, se ha informado sobre sus papeles potenciales como defensa antioxidante directa o indirecta (Ye et al.,1997) y como regulador de la síntesis de espermina y espermidina durante la sequía que proporcionan un efecto antisenescencia a nivel de toda la planta, dando como resultado plantas fenotípicamente normales (Capell et al, (2004), Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 101, 9909 - 9914).

Los niveles de una serie de azúcares también están alterados en tejido foliar de alx8, incluyendo grandes aumentos en diversos azúcares no identificados (Tabla 2). Estos cambios están inversamente correlacionados con una disminución de la acumulación de almidón transitorio en los cloroplastos de alx8 (Figura 19). Los azúcares pueden jugar un papel importante en la respuesta al estrés osmótico como osmoprotectores, protegiendo las macromoléculas y evitando la fusión membranas (Bartels y Sunkar, (2005), Critical Reviews in Plant Sciences, 24, 23-58). Por lo tanto, la alteración de la composición de azúcares en tejido foliar de alx8 puede estar implicada en su tolerancia a la sequía.

La pre-aclimatación a condiciones de sequía y el desarrollo alterado de alx8 no afectan al equilibrio hídrico de la planta en condiciones irrigadas. Sin embargo, esto puede explicar el retraso temporal del crecimiento de alx8 ya que los recursos se asignan a mecanismos de tolerancia al estrés y no al crecimiento. Este efecto es temporal puesto que en últimas fases de desarrollo los pesos secos de las rosetas de alx8 y fry1-1 son similares a sus respectivos tipos salvajes.

Las diferencias observadas en los metabolitos para los mutantes alx8 y fry1-1 ya están presentes en condiciones de crecimiento normales, lo que indica una pre-aclimatación a la sequía. Esta pre-aclimatación de los mutantes no afecta al equilibrio hídrico de las plantas bajo condiciones de buena irrigación. No se observaron diferencias en el potencial hídrico o el contenido de agua relativo de la hoja. También estuvieron presentes aperturas estomáticas similares entre alx8 y Col-0 de tipo salvaje, en estas condiciones, como se muestra mediante la discriminación de carbono y la exfoliaciones epidérmicas de las hojas.

Puesto que la tasa de fotosíntesis es similar entre alx8 y Col-0 de tipo salvaje en estas condiciones, el retraso en el desarrollo de alx8 se debe probablemente a una reasignación de los recursos y a una activación de las rutas supresoras del crecimiento en lugar de a una falta de recursos.

Las mutaciones por pérdida de función en SAL1 dieron como resultado una regulación al alza >1000 genes y una regulación a la baja de 500-1000 genes en condiciones de crecimiento sin estrés en comparación con las plantas de tipo salvajes. El papel de SAL1 como un regulador de la expresión génica tanto en el estrés como en el desarrollo se ve reforzado por su papel negativo en el silenciamiento génico post-transcripcional (Gy et al., (2007), Plant Cell, tpc.107.055319) y la alteración de la morfología y el momento de la floración de los mutantes SAL1. De hecho, sólo 7,6% de los 2447 genes regulados diferencialmente en alx8 se clasifican como genes de respuesta al estrés (datos no mostrados) y la mayoría de ellos no son inducibles por ABA. Esto sugiere que no todas las rutas de respuesta al estrés son activadas constitutivamente en alx8 en condiciones de crecimiento sin estrés. Por ejemplo, APX2, RAP2.6, sHsp y DREB2A están inducidos entre 2 - y 20 en hojas sin estrés, pero el estrés por exceso de luz (HL) da como resultado una inducción de 25 a 700 veces de los mismos genes, demostrando que otras rutas que regulan estos genes son inducible por estrés (Rossel et al., 2006). En segundo lugar, la expresión de rd22 sensible a la deshidratación está regulada al alza por ABA (Yamaguchi-Shinozaki et al., (1992), Plant and Cell Physiology, 33, 217-224) y esta inducción es parcialmente dependiente del factor de transcripción MYC2, que cuando es expresado en exceso da como resultado una inducción constitutiva de rd22 (Abe et al., (1997), Plant Cell, 9, 1859-1868; Abe et al., (2003), Plant Cell, 15, 63-78). Sin embargo, en alx8 a pesar de un aumento de 8,2 veces en la expresión de MYC2, la expresión de rd22 está regulada a la baja -3,7 veces. Del mismo modo, no existe una inducción significativa de ADH1 o KIN2/COR6.6, que se ha demostrado que son sensibles a ABA y están regulados por MYC2 (Abe et al., 2003). Esto indica la necesidad de la interacción de múltiples rutas, además de las rutas independiente de ABA activadas constitutivamente en alx8 y fry1 para la activación completa de la respuesta al estrés.

De los factores de transcripción sensibles al estrés conocidos, un pequeño subgrupo es significativamente regulado al alza en alx8 en condiciones sin estrés, incluyendo dos factores de transcripción en dedos de zinc, ZAT10 y ZAT12. Tanto ZAT10 como ZAT12 están involucrados en las rutas de respuesta de estrés abiótico tales como la sequía y el exceso de luz (Sakamoto et al., (2004), Plant Physiology, 136, 2734-2746; Davletova et al., (2005), Plant Physiology, 139, 847-856; Rossel et al., (2007), The Plant Cell, 10.1105/tpc. 1106.045898). La expresión en exceso de ZAT10 induce la expresión de APX2 y 18% de los genes regulados al alza en HL (Rossel et al., 2007). En consecuencia, 24,6% de los genes regulados al alza por HL también están regulados al alza en alx8 haciendo hincapié además en el solapamiento entre las redes de respuesta a la sequía y a HL. Los altos niveles de expresión de SAL1 en el tejido vascular (Xiong et al., 2001), sugieren un papel en la transducción de señales durante el estrés por sequía. Esta localización se corresponde con el aumento de la producción de H2O2 y la expresión de enzimas antioxidantes en la vaina del haz observados en respuesta a otros estreses abióticos, tales como HL (Karpinski y col., (1999), Science, 284, 654-657; Rossel et al., 2007). Además, la expresión de APEX2 y ZAT10 se localiza en gran medida a la vasculatura, lo que puede indicar un papel para SAL1 en el control de respuestas mediada por ROS similares.

La sequía induce un aumento de ABA y típicamente hay un aumento correspondiente en la expresión de las enzimas biosintéticos ABA limitantes de la velocidad, NCED3 y NCED1 (Iuchi et al., (2001), Plant Journal, 27, 325333). Sin embargo, estos genes no están regulados al alza en alx8 ni existe regulación a la baja de los genes implicados en el catabolismo de ABA, de hecho, la enzima catabólica CYP707A1-4 está reguladas al alza (datos no mostrados). Por lo tanto, el aumento del contenido de ABA en alx8 (Rossel et al. 2006) no parece estar regulado transcripcionalmente.

La mayoría de los genes regulados al alza (66%) y regulados a la baja (53%) en fry1-1 eran expresados simultáneamente en alx8 en comparación con el tipo salvaje. Sin embargo, hubo diferencias en la expresión génica y el perfil metabólico entre alx8 y fry1-1, lo cual resulta interesante, dado que ambos son mutaciones por pérdida de función del mismo gen. C24 y Col-0 tenían perfiles metabólicos únicos, aunque similares y por lo tanto es posible que las diferencias en el ecotipo alteren sutilmente el papel de SAL1 y los efectos de su pérdida en cada ecotipo.

Una observación adicional interesante en estos estudios es que los mutantes SAL1 estudiados tuvieron un retraso en los tiempos de floración con respecto a las plantas de tipo salvaje, y que esto se correspondía con una fuerte regulación al alza del regulador negativo de la floración, CONSTANS-LIKE 9 (COL9). Esto puede tener aplicación en muchos aspectos de la agricultura, incluyendo el retraso de la floración (y por lo tanto, típicamente, la senescencia) en plantas forrajeras, produciendo plantas con períodos de crecimiento prolongados que pueden permitir mayores rendimientos o partes más grandes (tales como flores, tallos, hojas, tubérculos, etc.). El aumento de la expresión de SAL1 en plantas puede tener un efecto inverso.

Conclusión

Los mutantes SAL1 sobreviven a una sequía prolongada 40-50% más tiempo que las plantas de tipo salvaje y si bien su desarrollo resulta alterado, la biomasa de hojas y tallos en plantas completamente maduras permanece inalterada. Sin desear vincularse a ninguna teoría, los autores de la presente invención formulan la hipótesis de que la proteína SAL1 tiene un papel en la regulación negativa de las rutas que controlan los cambios morfológicos, fisiológicos y moleculares cuya activación da como resultado una intensificación de la inducción de las redes de estrés. El resultado es una mayor tolerancia a la sequía en lugar de una respuesta de evitación. Esto está indicado por un grado de pre-aclimatación, que es la regulación al alza constitutiva de los genes de respuesta al estrés tales como el antioxidante APX2, la acumulación de osmoprotectores tales como poliamina y azúcares, y la acumulación de ácido abcísico en condiciones sin estrés. De este modo, SAL1 parece regular negativamente la tolerancia a la sequía y como consecuencia, los mutantes mantienen toda la turgencia y el potencial hídrico bajo estrés hídrico.

Se apreciará que, aunque las realizaciones específicas de la invención se han descrito en la presente memoria con fines ilustrativos, se pueden realizar diferentes modificaciones sin apartarse del alcance de la invención definido en las siguientes reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> The Australian National University

5 <120> Método para mejorar la resistencia al estrés en plantas y materiales para el mismo

<130> 805290C

<150> 2007903309 10 <151>

<150> 2008901466

<151>

15 <160> 62

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1 20 <211> 2122

<212> ADN

<213> Arabidopsis sp.

<220>

25 <221> característica miscelánea

<222> (29)..(31)

<223> Codón de iniciación

<220>

30 <221> característica miscelánea

<222> (1226)..(1226)

<223> mutación puntual en alx8 (g1226a)

<220>

35 <221> característica miscelánea

<222> (1989)..(1991)

<223> Codón de terminación

<400> 1 <210> 2

<211> 407 5 <212> PRT

<213> Arabidopsis sp.

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA 10 <222> (217)..(217)

<223> mutación puntual en alx8 (G217D)

<400> 2

<210> 3

<211> 2122 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis sp.

<220>

<221> característica miscelánea 10 <222> (734)..(735)

<223> sitio de inserción de SALK_020882 T-ADN

<210> 4 5 <211> 2111

<212> ADN

<213> Arabidopsis sp.

<220> 10 <221> característica miscelánea

<222> (734)..(735)

<223> sitio de inserción de SALK_020882 T-ADN

<400> 4

<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 5 cggacgcaag tcttcttctc

20

<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 6 ccaccaatga aaagggttca

20

<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 7 ccagtgaccg ttgctgatta 20

<210> 8

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 8 tgaaaatgct cagtgtcagg a 21

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 9 20 acactttggc taccgaggaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 10 gtggagcttt gacaccgagt 20

<210> 11

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 11 ttctcctgta aaagtgcaag tctc 24

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 12 tggtgaaatt cggtgaaaga 20

<210> 13

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 13 tggcttacga gaaagagctt g 21

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 14 agcaaagaag aggcatccaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 15 ctgaggggag atcaatacgc 20

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 16 tgctcagcta tggagtcacg 20

<210> 17

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 17 acacgccatc atcaatcta 19

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 18 ccctttatac ttagcccaaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 19 actcgctgct cgtctctgtc 20

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador para la amplificación del gen SAL1

<400> 20 agaacgatgc ctcttcagga 20

<210> 21

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador dCAPS para el mutante alx8

<400> 21 gaggaaggga aagtagttct ag 22

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador dCAPS específico para el mutante alx8

<400> 22 tgcactttta caggagaaga 20

<210> 23

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador específico para el inserto T-ADN

<400> 23 tggttcacgt agtgggccat cg 22

<210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador específico para el inserto T-ADN

<400> 24 gcgtggaccg cttgctgcaa ct 22

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador específico para el inserto T-ADN

<400> 25 ggactcttgt tccaaactgg

20

<210> 26 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador SacII-SAL1 F1

<400> 26 ctccgcggtg gtatggctta cgagaaagag c

31

<210> 27 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador EcoRI-SAL1

<400> 27 gctcgaattc tcagagagct gaagctttct c

31

<210> 28 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador APX2 (At3g09640)

<400> 28 ggctgggaca tttgatgtg

19

<210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador APX2 (At3g09640)

<400> 29 agggaacagc tccttgatag g

21

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador APX1 (At1g07890)

<400> 30 ccactcgcat ttctccagat

20

<210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador APX1 (At1g07890)

<400> 31 tcgaaagttc cagcagagtg

20

<210> 32 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador sHSP (At2g29500)

<400> 32 cctggattga agaaggagga ag

22

<210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador sHSP (At2g29500)

<400> 33 taggcaccgt aacagtcaac ac

22

<210> 34 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador ZAT10 (At1g27730)

<400> 34 aggctcttac atcaccaaga ttag

24

<210> 35 . <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador ZAT10 (At1g27730)

<400> 35 tacacttgta gctcaacttc tcca

24

<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador ciclofilina (At2g29960)

<400> 36 20 tcttcctctt cggagccata

<210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador ciclofilina (At2g29960)

<400> 37 aagctgggaa tgattcgatg

20

<210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador DREB2A (At5g05410)

<400> 38 agactatggt tggcccaatg

20

<210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador DREB2A (At5g05410)

<400> 39 tcgagctgaa acggaggtat

20

<210> 40 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador HSP70 (At3g09440)

<400> 40 gctgctattg cttacggtct tg

22

<210> 41 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador HSP70 (At3g09440)

<400> 41 ctctcgggtt tccactaatg tc

22

<210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador Fry1-1F

<400> 42 aacccatttt gtaaatcttc c

21

<210> 43 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador Fry1-rt2R

<400> 43

cagagaaaca aagaacgtac gaga

24

5

<210> 44

<211> 358

<212> PRT

<213> Oryza sp.

10

<400> 44

<210> 45

<211> 355

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 45

<210> 46

<211> 353

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 46

<210> 47

<211> 1417

<212> ADN

<213> Picea sp.

<400> 47

<210> 48

<211> 1070

<212> ADN

<213> Pinus sp.

<400> 48

<210> 49

<211> 1544

<212> ADN 10 <213> Medicago sp.

<400> 49 <210> 50

<211> 892 5 <212> ADN

<213> Lotus japonicus

<220>

<221> característica miscelánea 10 <222> (25)..(25)

<223> n es a, c, g o t

<400> 50

<210> 51

<211> 1514

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 51

<210> 52

<211> 1252

<212> ADN

<213> Arabidopsis sp.

<400> 52

<210> 53

<211> 764

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 53

<210> 54

<211> 1340

<212> ADN

<213> Populus sp. 15

<400> 54

<210> 55

<211> 1588

<212> ADN

<213> Gossypium sp.

<400> 55

<210> 56

<211> 1355

<212> ADN

<213> Lycopersicon sp.

<400> 56

<212> ADN

<213> Solanum sp.

<220> 10 <221> característica miscelánea

<222> (970)..(970)

<223> n es a, c, g o t

<400> 57

<210> 58

<211> 1196

<212> ADN

<213> Allium sp.

<400> 58

<210> 59

<211> 2000

<212> ADN

<213> Triticum sp.

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1723)..(1723)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1793)..(1793)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1798)..(1798)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1812)..(1812)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1825)..(1825)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1864)..(1864)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1885)..(1885)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1891)..(1891)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1893)..(1893)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1946)..(1946)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1973)..(1973)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1975)..(1975)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1982)..(1982)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1985)..(1985)

<223> n es a, c, g o t

<400> 59

<210> 60

<211> 1339 5 <212> ADN

<213> Hordeum vulgare

<220>

<221>

característica miscelánea 10 <222> (5)..(5)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>

característica miscelánea 15 <222> (1143)..(1143)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>

característica miscelánea 20 <222> (1152)..(1152)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>

característica miscelánea 25 <222> (1220)..(1220)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>

característica miscelánea 30 <222> (1270)..(1270)

<223> n es a, c, g o t

<400> 60

<210> 61

<211> 1498

<212> ADN

<213> Oryza sp.

<400> 61 <210> 62

<211> 1544

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 62

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para obtener una planta con una mayor resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, donde dicha resistencia al estés se selecciona entre resistencia a la sequía y resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies de oxígeno reactivo, comprendiendo dicho método:

   (a)

   introducir al menos una mutación o un ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales, lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales;

   (b)

   regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

   (c)seleccionar una o más plantas que tienen una mayor resistencia a la sequía y/o resistencia asociada a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas de oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende introducir una mutación en el gen SAL1 o uno de sus homólogos, o inhibir o suprimir la expresión del gen SAL1 o uno de sus homólogos.

3. 3.

   El método de la reivindicación 2, que comprende introducir una mutación en el gen SAL1 que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en la región de nucleótidos 731 a 745, 1226, 1518, 1519, y 1690 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

4. 4.

   El método de la reivindicación 3, en donde dicha mutación:

   i)comprende una mutación de guanina a adenina en la posición 1226 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEC ID NO: 1;

   ii)da como resultado un cambio de aminoácido de glicina a ácido aspártico en la posición 217 del SEQ ID NO: 2;

   iii)comprende una mutación de citosina a timina en la posición 731 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEC ID NO: 1;

   iv)comprende una mutación de guanina a adenina en la posición 736 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente de un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEC ID NO: 1;

   v)comprende una mutación de guanina a adenina en la posición 1690 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEC ID NO: 1;

   vi)comprende la inserción de uno o más nucleótidos entre las posiciones 734 y 735 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEC ID NO: 1;

   vii)comprende la sustitución de los nucleótidos 735-745 del SEC ID NO: 1, o nucleótidos equivalentes en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 de SEQ ID NO: 1 por uno o más nucleótidos, o

   viii)comprende la inserción de uno o más nucleótidos entre o incluyendo las posiciones 1518 y 1519 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEC ID NO: 1.

5. 5.

   El método de la reivindicación 4, en donde dichos uno o más nucleótidos insertados o sustituidos comprenden una inserción de ADN-T.

6. 6.

   El método de la reivindicación 2 o 3, en el que dicha mutación es una mutación nula para SAL1.

7. 7.

   El método de la reivindicación 2, que comprende introducir en dichas una o más células vegetales ácido nucleico exógeno que suprime la expresión de la proteína SAL1 endógena o uno de sus homólogos.

8. 8.

   El método de la reivindicación 7, en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico homóloga a, o complementaria a al menos una porción de la secuencia codificante de SAL1 endógena o uno de sus homólogos.

9. 9.

   El método de la reivindicación 7 u 8, en donde dicho ácido nucleico exógeno está conectado operablemente a un promotor inducible por estrés.

10. 10.

    El método de la reivindicación 2, que comprende introducir en dichas una o más células vegetales ácido nucleico exógeno que remplaza la expresión de la proteína SAL1 endógena o uno de sus homólogos por la expresión de una proteína exógena.

11. 11.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la planta resultante tiene un incremento de la resistencia a la sequía, o al estrés por luz, o resistencia a la sequía y a la luz, con respecto a una planta de tipo salvaje.

12. 12.

    El método de la reivindicación 11, en donde la planta resultante tiene un incremento de resistencia a la sequía con respecto a una planta de tipo salvaje.

13. 13.

    El método de la reivindicación 12, en donde dicha planta es un miembro de la familia Brassicaceae.

14. 14.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la planta resultante tiene un tiempo de floración retardado.

15. 15.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la planta resultante tiene un fenotipo foliar alterado, y en donde dicho fenotipo foliar alterado comprende una hoja más gruesa, una hoja más corta, un peciolo más corto, una hoja más redonda, una hoja con bordes más lobulados , o una hoja con dos o más de las alteraciones fenotípicas alteradas seleccionadas entre hoja más gruesa, hoja más corta, pecíolo más corto, hoja más redondeada, y bordes lobulados.

16. 16.

    Un método para escrutar una planta para determinar el aumento de su resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo silvestre, comprendiendo dicho método analizar el ADN de la planta para determinar la presencia de al menos un alelo mutante de una secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o uno de sus homólogos utilizando al menos una molécula de ácido nucleico adecuada como sonda o cebador que es capaz de hibridar con un gen SAL1

    o uno de sus homólogos en condiciones restrictivas.

17. 17.

    El método de la reivindicación 16, que comprende el uso de al menos un par de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación de una región del gen SAL1 o uno de sus homólogos, comprendiendo dicho par de cebadores un cebador directo y un cebador inverso para detectar la presencia o ausencia de una mutación en dicha región.

18. 18.

    Una planta con un incremento de resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, obtenida mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, con la condición de que dicha planta no sea un mutante alx8, fry1-1, fry1-2, fry1-3, salk_02882, o hos2 de Arabidopsis thaliana.

19. 19.

    Una planta con un incremento de resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, obtenida mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicha planta se selecciona entre Apiaceae, Asteraceae, ChenopodiaceaelAmaranthaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Gramineae, Leguminosae, Poaceae, Rosaceae o Solanaceae.