CN115152456A

CN115152456A - 提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法

Info

Publication number: CN115152456A
Application number: CN202210893757.2A
Authority: CN
Inventors: 张广欣; 黄桂云; 杨兰芳; 禹云超; 吴锦华
Original assignee: China Three Gorges Corp
Current assignee: China Three Gorges Corp
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2022-10-11

Abstract

本发明提供了一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法，通过向处于盐胁迫环境中的南方红豆杉种苗施加抗盐复合溶液，所述抗盐复合溶液成分为氯化钙、三十烷醇、硝酸钾、水杨酸、去离子水。本发明采用外源喷施一定浓度的试剂来提高植物的抗盐碱能力，可以有效缓解南方红豆杉遭遇盐胁迫后对植物所造成的伤害，提高南方红豆杉种苗的盐胁迫能力。本发明还证实向叶片喷施适量的抗盐复合溶液，可增加植物体内SOD、POD、CAT活性，以此来提高南方红豆杉盐胁迫能力。是一种更加简单有效可行的技术方法。提高南方红豆杉的盐胁迫能力可为长江流域盐碱地的利用开发提供更多植物选择。

Description

提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法

技术领域

本发明属于红豆杉栽培技术领域，具体涉及一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法。

背景技术

土壤盐渍化是一个日趋严重的全球性问题，制约着植物的生长发育和应用推广。盐胁迫已经成为影响植物正常生长最严重的非生物胁迫之一，土壤中的盐分会破坏植物的细胞质膜结构，导致植物体内产生过量的活性氧，造成植物生理代谢紊乱。植物自身具有抗氧化防御系统，在遭遇盐胁迫的情况下，可通过改变SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性清除盐胁迫下产生的大量活性氧，适应环境的变化，避免活性氧伤害植物细胞。

南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)为红豆杉科红豆杉属常绿大乔木，是国家一级重点保护野生植物，集药用、材用和观赏为一体的珍贵树种，具有较大的开发利用价值，分布于长江流域。中国作为盐碱地大国，长江流域部分区域也是盐碱地比较严重的地区，筛选具有耐盐性植物对长江流域盐碱地的利用十分重要。

目前没有关于提高南方红豆杉抵抗盐胁迫能力的技术研究，通过基因等手段开发耐盐碱植物存在技术门槛高、周期过长等问题。发明人通过前期对1年生、3年生、5年生三个年龄阶段的南方红豆杉苗木盐胁迫预实验发现，在100mmol·L^-1NaCl溶液盐胁迫环境下，1年生南方红豆杉的盐胁迫抵抗能力最弱，呈现出叶片完全脱落、茎干枝条褐色、植株死亡等不可逆现象。预实验表明，此年龄段的南方红豆杉苗木更需要进行盐胁迫的缓解，以帮助种苗度过抗盐性差这个时期。

发明内容

本发明提供一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法，采用外源喷施一定浓度的试剂来提高植物的抗盐碱能力，是一种更加简单有效可行的技术方法。提高南方红豆杉的盐胁迫能力可为长江流域盐碱地的利用开发提供更多植物选择。

本发明的技术方案是，一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法，向处于盐胁迫环境中的南方红豆杉种苗施加抗盐复合溶液，该抗盐复合溶液含有氯化钙、三十烷醇、硝酸钾、水杨酸和去离子水。

进一步地，所述抗盐复合溶液按质量份计，包括氯化钙6-12份，三十烷醇3-7份，硝酸钾6-8份，水杨酸1份；上述原料配制成溶液并采用去离子水定容至1000份。

更进一步地，制备抗盐复合溶液时，将三十烷醇及水杨酸用乙醇加热进行溶解后，再与其他原料混合并用去离子水定容。

进一步地，抗盐复合溶液采用喷施的方法加入，每次每株喷施10～20mL，每日喷施一次，连续喷施5日以上。

进一步地，所述南方红豆杉种苗为1年生南方红豆杉实生苗。

进一步地，实验室需要模拟盐胁迫环境时，通过向培养基质中浇灌100mmol·L^- ¹NaCl溶液实现。

本发明还涉及抗盐复合溶液在提高南方红豆杉种苗盐胁迫能力方面的用途。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法，采用盆栽实验对南方红豆杉进行盐胁迫处理，模拟盐胁迫场景，通过喷施抗盐复合溶液，可以有效缓解南方红豆杉遭遇盐胁迫后对植物所造成的伤害，提高南方红豆杉种苗的盐胁迫能力。

本发明还证实向叶片喷施抗盐复合溶液，可增加植物体内SOD、POD、CAT活性，以此来提高南方红豆杉盐胁迫能力。

本发明提供的方法操作简单，安全可靠，效果显著，为盐碱地的植被恢复提供理论技术依据，为长江流域盐碱地的利用开发提供更多植物选择。

本发明提供的抗盐复合溶液中，氯化钙的Ca²⁺作为植物中主要的第二信使，在细胞信号转导中起重要作用，能够激活并调节细胞内代谢系统的酶活性，帮助植物适应盐胁迫环境；三十烷醇是一种高效的广谱植物生长调节剂，可促进植物光合产物的积累，储存更多营养物质，便于植物消耗能量抵抗盐胁迫；硝酸钾中的K⁺能改变细胞的渗透式、减少植物蒸腾、调节水分平衡、调节气孔关闭，从而增强植物的抗逆性；通过向植物叶片表面喷施水杨酸，可以减少细胞膜发生膜脂过氧化，增加细胞膜的稳定性，上述成分组合使用，可以起到较好的缓解逆境胁迫的生理功能。

附图说明

图1为实施例1～3及对比例1-1中各处理下南方红豆杉种苗SOD活性变化。

图2为实施例1～3及对比例1-1中各处理下南方红豆杉种苗POD活性变化。

图3为实施例1～3及对比例1-1中各处理下南方红豆杉种苗CAT活性变化。

图4为实施例及对比例处理后第15d南方红豆杉种苗表型变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

1、实施例1：提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法

1)试验材料来源：2020年11月采集饱满的南方红豆杉种子，变温层积催芽处理后，于2021年3月播种于育苗穴盘中。2021年7月选择长势一致无病虫害的1年生南方红豆杉实生苗，于温室大棚中进行盆栽管理，每盆1株。盆栽基质体积比为泥炭∶珍珠岩＝2∶1。

2)盐胁迫设置：2021年8月开展试验。当盆栽基质干燥时，每盆浇灌100mmol·L^- ¹NaCl溶液1L，保证浇透基质，为保证各处理的盐分浓度，在每个育苗容器下放置一个托盘，试验过程中及时将渗入托盘中的溶液倒回育苗基质中。

3)抗盐复合溶液配置：溶液各成分按以下重量计算比例配置：称取氯化钙10g，三十烷醇5g，硝酸钾6g，水杨酸1g。三十烷醇及水杨酸首先用适量乙醇加热进行溶解，最后用去离子水将以上成分定容到1000ml容量瓶中。

4)喷施：对南方红豆杉种苗叶片定量喷洒10ml抗盐复合溶液，喷施时间为每天上午8-10点，每24h喷洒一次,连续喷施5d。

5)采集记录：从处理开始采集叶片，每隔2d采集一次，共取样6次，检测各种酶类活性。第15d拍照记录植株长势表型情况。

实施例2：

参照实施案例1，其他处理条件不变，将第4)步骤的“定量喷洒10ml抗盐复合溶液”，设置为“定量喷洒15ml抗盐复合溶液，”、“定量喷洒20ml抗盐复合溶液，”进行试验，观测记录植株变化情况。

编号	抗盐复合溶液喷施量	成活长势	叶片评价	枝干评价
					实施例2-1	15ml	未出现异常	未出现异常	未出现异常
实施例2-2	20ml	未出现异常	未出现异常	未出现异常

实施例3：

参照实施案例1，其他处理条件不变，将第3)步骤的“称取氯化钙10g，三十烷醇5g，硝酸钾6g，水杨酸1g。”分别设置为“称取氯化钙6g，三十烷醇7g，硝酸钾7g，水杨酸1g。”、“称取氯化钙8g，三十烷醇3g，硝酸钾8g，水杨酸1g。”、“称取氯化钙12g，三十烷醇4g，硝酸钾7g，水杨酸1g。”进行试验，观测记录植株变化情况。

对比例1：

参照实施案例1，其他处理条件不变，将第3)步骤的“抗盐复合溶液”分别设置为“去离子水”、“质量分数为1％的氯化钙溶液”、“质量分数为0.1％的水杨酸溶液”进行对比试验，观测记录植株变化情况。

对比例2：

参照实施案例1，其他处理条件不变，将第4)步骤的“喷施时间为每天上午8-10点”，设置为“喷施时间为每天中午12-14点”、“每天下午18-20点”进行对比试验，观测记录植株变化情况。

对比例3：

参照实施案例1，其他处理条件不变，将第4)步骤的“定量喷洒10ml抗盐复合溶液”，设置为“定量喷洒5ml抗盐复合溶液，”、“定量喷洒25ml抗盐复合溶液，”进行试验，观测记录植株变化情况。

2、生理指标测定

1)SOD酶的测定

将样本用液氮磨成粉末后，称取约0.2g试样，加入2mL PBS溶液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测；取10μL上清液，加入160μL1mg/mLWST-8、20μL1mmol/L二乙基二硫代氨基甲酸钠、10μL 0.01mg/mL SOD酶，充分混匀，室温静置30min后，450nm处测定各管吸光值。对照管用蒸馏水替换上清液，其他条件不变。

2)POD酶的测定

将样本用液氮磨成粉末后，称取约0.2g试样，加入2mL PBS液体进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测；取5μL上清液，加入120μL 100mmol/L磷酸缓冲液溶液、30μL愈创木酚、30μL 30％过氧化氢以及60μL蒸馏水。立即混匀并计时，立即取200μL转移至96孔板中，记录470nm下30s时的吸光值A1和90s后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

3)CAT酶的测定

将样本用液氮磨成粉末后，称取约0.2g试样，加入2mL PBS液体进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测；在96孔板中加入10μL样本和190μL30％H₂O₂，立即混匀并计时，记录240nm下0s吸光值A1和60s时的吸光值A2。计算ΔA＝A1-A2。

4)数据处理

采用excel 2016整理计算数据和绘图，采用三次重复取样的平均值作为实测值进行绘图，采用SPSS 20.0进行统计分析。

3、结果分析

1)南方红豆杉幼苗表型变化

南方红豆杉幼苗在遭遇盐胁迫的第4d时，对比例的南方红豆杉幼苗呈现出不同程度的叶片萎蔫等盐害症状；第8d时，对比例开始出现叶片异常现象，尤其是对比例1-1的叶片出现严重卷曲萎蔫，部分叶片开始凋落；第15d时，部分对比例的叶片尖端呈现黄化焦枯的症状，对比例1-1植株已经死亡，叶片最终完全脱落，茎干枝条已经出现干枯褐色，见图4。实施例的南方红豆杉长势一直未出现异常，并未表现出可见的盐害症状。

2)SOD活性变化

SOD是重要的自由基清除剂之一，是抵御活性氧伤害的“第一道防线”，是防护氧自由基对细胞膜系统伤害的保护酶，它的活性与植物抗氧化能力成正相关性，是植物抗逆性的重要标志。当植物受到盐胁迫产生有害的超氧自由基时，SOD可发挥作用将其清除，保证植物的代谢平衡。但当盐胁迫过大时，植物体内代谢紊乱，SOD活性随之下降。

外源喷施适量抗盐复合溶液能够显著提升SOD活性，实施例的南方红豆杉幼苗叶片SOD活性始终高于喷施等量去离子水的对比例1-1，促进了盐胁迫下保护酶活性的上调，且均达到了显著水平，表明幼苗本身清除活性氧的能力得到显著提升。

由图1可知，在盐胁迫下，南方红豆杉幼苗的叶片SOD活性呈现出先升高后下降的趋势，外源喷施适量抗盐复合⁺溶液能将SOD活性维持在较高的水平，延缓SOD活性的下降。

3)POD活性变化

POD是植物体内的一种保护酶类，是与衰老有关的一种酶，可以清除细胞体产生较少的O^2-，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它的活性与植物的抗逆能力密切相关。

外源喷施适量抗盐复合溶液能够显著提升POD活性，将POD活性维持在较高的水平，延缓POD活性的下降。由图2可知，盐胁迫可导致南方红豆杉幼苗叶片POD活性呈现出先上升后下降的趋势，随着盐胁迫时间的推进，喷施适量抗盐复合溶液可保证POD活性始终高于喷施等量去离子水的对比例1-1，且维持在相对稳定的水平，促进了盐胁迫下保护酶活性的上调，幼苗本身清除活性氧的能力得到显著提升，POD活性相比对比例1-1均达到了显著水平。

外源喷施适量抗盐复合溶液能有效提升盐胁迫下POD活性的增长速率。对比例1-1在遭遇盐胁迫时，POD活性增长速率较缓慢，而喷施适量抗盐复合溶液的实施例，增长速率显著提升。

4)CAT活性变化

CAT作为植物体内的一种保护酶，在植物遭遇胁迫时，可以协助SOD清除自由基所产生的高浓度H₂0₂，将活性氧控制在植物可承受的范围内，减弱膜脂过氧化作用对细胞膜的伤害。

外源喷施适量抗盐复合溶液能够显著提升CAT活性，将CAT活性维持在较高且相对稳定的水平，保证CAT活性始终高于喷施等量去离子水的对比例1-1，并且均达到显著水平。由图3可知，盐胁迫可导致南方红豆杉幼苗叶片CAT活性呈现出先上升后下降的趋势，随着盐胁迫时间的推进，喷施适量抗盐复合溶液可提升CAT活性增长速率，同时还可减缓CAT活性的下降速率，促进盐胁迫下保护酶活性的上调，幼苗本身清除活性氧的能力得到显著提升。

综上所述，结合南方红豆杉表型和相关抗氧化酶的活性综合判定，结果显示，通过向南方红豆杉叶片喷施特制的抗盐复合溶液，可显著提高植物体内SOD、POD、CAT活性，有效缓解南方红豆杉遭遇盐胁迫后对植物所造成的伤害，提高南方红豆杉抗击盐胁迫的能力。

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高南方红豆杉种苗盐胁迫抗性的方法，其特征在于：向处于盐胁迫环境中的南方红豆杉种苗施加抗盐复合溶液，该抗盐复合溶液含有氯化钙、三十烷醇、硝酸钾、水杨酸和去离子水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗盐复合溶液按质量份计，包括氯化钙6-12份，三十烷醇3-7份，硝酸钾6-8份，水杨酸1份；上述原料配制成溶液并采用去离子水定容至1000份。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：制备抗盐复合溶液时，将三十烷醇及水杨酸用乙醇加热进行溶解后，再与其他原料混合并用去离子水定容。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于：抗盐复合溶液采用喷施的方法加入，每次每株喷施10~20mL，每日喷施一次，连续喷施5日以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述南方红豆杉种苗为1年生南方红豆杉实生苗。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：实验室需要模拟盐胁迫环境时，通过向培养基质中浇灌100 mmol•L^-1NaCl溶液实现。

7.抗盐复合溶液在提高南方红豆杉种苗盐胁迫能力方面的用途。