ES2349678T3

ES2349678T3 - Procedimiento de purificación de proteínas.

Info

Publication number: ES2349678T3
Application number: ES00944505T
Authority: ES
Inventors: Stefan Winge
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1999-06-23
Filing date: 2000-06-08
Publication date: 2011-01-10
Anticipated expiration: 2020-06-08
Also published as: AU776861B2; NO324627B1; CA2376986A1; EP1185551A1; CA2376986C; PT1185551E; EP1185551B1; JP4521143B2; DK1185551T3; SE9902388D0; ATE477267T1; NZ516235A; JP2003502438A; AU5859400A; NO20016174D0; NO20016174L; WO2000078792A1; DE60044812D1

Abstract

Un procedimiento de la purificación de antitrombina-III, que comprende las etapas de: (a) añadir, a una solución que comprende antitrombina-III, un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v) y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, para precipitar las impurezas; (b) dejar que las impurezas precipiten; y (c) retirar las impurezas precipitadas obteniendo, de esta manera, una solución que comprende antitrombina-III purificada.

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a procedimientos para la purificación de antitrombina-III (AT-III) por precipitación de impurezas.

TÉCNICA ANTERIOR

La antitrombina III (AT-III) es una glicoproteína del plasma que inhibe las serina proteasas en la cascada de coagulación y, de esta manera, desempeña un papel fundamental en la regulación de la coagulación sanguínea. Una pequeña disminución en el contenido de AT-III en la sangre está asociada con un mayor riesgo de tromboembolia. Los concentrados de AT-III se usan en la profilaxis y tratamiento de trastornos tromboembólicos en pacientes con deficiencia de antitrombina, adquirida o hereditaria.

Generalmente, la AT-III se aísla del plasma humano y se administra al torrente circulatorio del paciente. En consecuencia, es deseable la inactivación con virus de los concentrados de AT-III. La precipitación con polietilenglicol (PEG) se ha usado ampliamente en la purificación de AT-III, para concentrar la proteína y para precipitar los virus (véase, por ejemplo Wickerhauser et al. (1979) Vox Sanguinis 36, 281). Además de PEG, también se han usado sulfato de bario, etanol, ácido tricloroacético, dextrano y sulfato amónico, como agentes de precipitación durante la purificación de AT-III. Muchos de estos agentes de precipitación serían dañinos si estuvieran presentes en la formulación de AT-III final. En consecuencia, es necesaria la retirada posterior de estos agentes, y la recuperación de AT-III, por lo tanto, se reduce.

La precipitación con PEG solo no es suficiente para asegurar la retirada completa del virus de la hepatitis. Los concentrados de AT-III para uso terapéutico, por lo tanto, normalmente se pasteurizan, normalmente a +60ºC, durante 10 h. En general, las proteínas del plasma pierden su actividad durante el tratamiento térmico. Por esta razón, se usan agentes estabilizadores durante la pasteurización.

El citrato y los carbohidratos, tales como sacarosa, se han usado como agentes estabilizadores para AT-III durante la pasteurización (Mitra et al. (1982) Biotechnology and Bioengineering vol. XXIV, 97-107; Tengborn et al. (1987) Thrombosis Research 48, 701-711; Einarsson et al. (1989) Transfusion 29, 148-152). Sin embargo, en estos documentos, no se indica que el citrato y los sacáridos puedan usarse como agentes de precipitación en la purificación de AT-III.

Como una etapa final en la purificación de AT-III, la formulación a menudo se liofiliza. Se han hecho muchos intentos para prolongar el periodo de validez de la ATIII liofilizada.

El documento US 4.340.589 (Uemura et al.) desvela una preparación liofilizada de AT-III, estabilizada con al menos una sustancia seleccionada entre aminoácidos, sacáridos, polisacáridos, etc., más específicamente albúmina, urocinasa, gelatina, manitol, heparina, glicina y lisina.

Ashizawa et al. (Solicitud de Patente Japonesa Nº 1994-199566) dan a conocer preparaciones liofilizadas de AT-III estabilizada, modificada con uno o más elementos seleccionados entre sales de ácido orgánico, sacáridos, aminoácidos y cloruro sódico. Dichas sales orgánicas podrían ser succinato sódico o citrato sódico. Dichos sacáridos podrían ser D-manitol, lactosa, glucosa y D-sorbitol. No hay indicación en este documento de preparaciones de AT-III liofilizadas que comprendan citrato junto con sacarosa.

El documento WO 94/26287 dan a conocer un procedimiento para reducir la concentración de compuestos químicos inactivantes de virus y/o detergentes en una composición acuosa que contiene una proteína del plasma soluble en agua, caracterizados por formar vesículas que contienen el compuesto químico inactivante de virus y/o detergente, seleccionando una combinación adecuada de temperatura y concentración, por encima de 0,5 M, de una sal con un alto efecto de salificación de acuerdo con la serie Hofmeister, y retirando posteriormente básicamente todas las vesículas de la fase acuosa, y aislando posteriormente la proteína de la fase acuosa.

Un problema más o menos conocido con las preparaciones farmacéuticas líquidas, es la formación de partículas (aproximadamente 2-75 µm) después de llenar el producto en viales o después de la reconstitución de productos secados por congelación con una solución. Especialmente cuando se trabaja con moléculas más grandes, tales como proteínas, este es un fenómeno que ocurre relativamente a menudo y el mecanismo que hay detrás del mismo no se entiende claramente. Probablemente, es una combinación de factores que se ve afectada por la cantidad y el tamaño en el que se presentan las partículas, incluyendo el tamaño molecular del producto, excipientes del producto, material del recipiente para el producto y solución en la que se reconstituye el producto. Ahora se ha demostrado que podría ser peligroso tener estas cantidades relativamente pequeñas de partículas en los productos. Sin embargo, obviamente, cada productor farmacéutico pretende reducir la cantidad de partículas en los productos tanto como sea posible, especialmente las partículas visibles.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado, sorprendentemente, que una combinación de un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v), tal como sacarosa, y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, puede usarse ventajosamente para precipitar las impurezas, incluyendo virus y proteínas distintas de AT-III, en la purificación de AT-III. Este procedimiento implica diversas ventajas:

•: La etapa de precipitación de acuerdo con la invención asegura una alta inactivación viral, alta pureza y desactivación de AT-III mínima.

•: La solución de AT-III obtenida puede someterse directamente a pasteurización, sin añadir más compuestos estabilizadores. De esta manera, la combinación de citrato y sacárido sirve para el doble propósito como agentes de precipitación y agentes estabilizadores durante la pasteurización.

•: No hay necesidad de retirar la combinación farmacéuticamente aceptable de sacárido y citrato durante la purificación adicional de AT-III. En lugar de ello, los agentes de precipitación también son útiles como estabilizadores de una preparación liofilizada de AT-III.

Por consiguiente, en un primer aspecto, esta invención proporciona un procedimiento para la purificación de antitrombina-III que comprende las etapas de:

(a): añadir una solución que comprende antitrombina-III, un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v) y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, para precipitar las impurezas;

(b): permitir que las impurezas precipiten; y

(c): retirar las impurezas precipitadas obteniendo, de esta manera, una solución que comprende antitrombina-III purificada.

En el presente contexto, el término "impurezas" pretende indicar sustancias no deseadas, incluyendo sustancias usadas durante la purificación de AT-III (cf. Ejemplo 1, más adelante). Las impurezas incluyen, por ejemplo, glicoproteínas ricas en histidina, hemopexina, lipoproteínas, gammaglobulinas, Triton-X-100, tri-n-butil-fosfato, virus, y priones.

La AT-III para su uso en el procedimiento de acuerdo con la invención puede obtenerse por cualquier procedimiento adecuado, y puede ser de mamífero, por ejemplo bovina, porcina o, preferentemente, de origen humano. La AT-III puede obtenerse también por ingeniería genética, tal como por técnicas de ADN recombinante, a partir de animales transgénicos, por ejemplo a partir de leche de oveja, que produce AT-III en su leche.

Independientemente del origen, la AT-III puede ser de cualquier isoforma, por ejemplo α-AT-III o β-AT-lll, o cualquier derivado de AT-III. La diferencia entre α-AT-lll o β-AT-lll se describe, por ejemplo, por Brennan et al. (FEBS Letters 219(2), 431-436, 1987). La expresión "derivado de AT-III" se refiere, por ejemplo a polipéptidos con modificaciones tales como sustituciones, pequeñas deleciones, inserciones o inversiones, polipéptidos que, independientemente de ello, tienen sustancialmente las actividades biológicas de AT-III.

Dicho sacárido es preferentemente un disacárido, tal como sacarosa o trehalosa, o un monosacárido, tal como glucosa, sorbitol, manitol, ácido glucónico, o maltosa. Se prefiere la sacarosa debido a su biodisponibilidad ventajosa en el cuerpo.

Para la precipitación de impurezas, la concentración de sacárido varía de aproximadamente el 10% (p/v) a aproximadamente el 30% (p/v). Preferentemente, la concentración de sacárido es entre el 15% y el 25% (p/v), más preferentemente de aproximadamente el 20% (p/v).

La fuente de citrato puede ser ácido cítrico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo citratos de metal alcalino y citratos de metal alcalinotérreo. Los ejemplos de citratos de metal alcalino son citrato sódico y potásico, mientras que los ejemplos de citratos de metal alcalinotérreo son citratos de magnesio y calcio. Por razones de biodisponibilidad, bajo coste y fácil manipulación, se prefiere el citrato sódico.

Para la precipitación de impurezas, la concentración de citrato varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 M. Preferentemente, la concentración de citrato es entre 0,5 y 1,5 M, más preferentemente entre 1 M y 1,25 M.

Durante la precipitación de impurezas, el pH puede variar de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Preferentemente, el pH es entre 7 y 8, y más preferentemente neutro (aproximadamente 7,5). La precipitación se realiza adecuadamente a una temperatura entre +10ºC y +40ºC, preferentemente a temperatura ambiente, tal como entre +15ºC y +25ºC.

Preferentemente, se añaden citrato en una concentración de 0,1 a 3 M y sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v), continuamente, a la solución, con agitación, durante aproximadamente 30 minutos. Este procedimiento da lugar a un gradiente de concentración de sacárido y citrato. Puesto que las impurezas pueden tener una tendencia a precipitar a diferentes concentraciones de los agentes de precipitación, dicho gradiente optimizará la precipitación de impurezas. Una adición lenta de los agentes de precipitación minimizará el riesgo de altas concentraciones locales de citrato y sacárido y, de esta manera, el riesgo de precipitación de AT-III.

En la producción a gran escala, la solución se agita adecuadamente durante aproximadamente 15 minutos más, después de haber alcanzado las concentraciones finales de sacárido y citrato.

Las impurezas precipitadas se retiran, adecuadamente por filtración o centrifugación de la solución. Una etapa de filtración típica comprenderá prefiltración a través de un filtro de 1-20 µm, seguido de filtración en condiciones estériles a través de un filtro de 0,2 µm. Si se elige la centrifugación, la persona especialista podrá determinar las condiciones adecuadas con ayuda de un libro de texto ordinario sobre purificación de proteínas. El filtrado o sobrenadante líquido que comprende la antitrombina-III se recupera después en una forma adecuada para su procesamiento adicional.

En un aspecto adicional, la invención comprende un procedimiento para la purificación de AT-III, en el que la etapa de precipitación, como se ha descrito anteriormente, va seguida de pasteurización de la solución obtenida, que comprende antitrombina-III purificada, en presencia de un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v), en particular sacarosa, y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M como agentes estabilizadores. En una forma particularmente preferida de la invención, las cantidades ya añadidas de sacárido y citrato serán suficientes como agentes estabilizadores durante la pasteurización y, en consecuencia, no tendrán que añadirse agentes estabilizadores adicionales.

En otro aspecto adicional más, la invención comprende un procedimiento para la purificación de AT-III como se ha descrito anteriormente, que comprende además la liofilización de antitrombina-III en presencia de un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v), en particular sacarosa, y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M como estabilizadores. Los mismos agentes que los usados anteriormente para la precipitación y estabilización durante la pasteurización pueden usarse, convenientemente, como estabilizadores durante la liofilización.

Los especialistas en la técnica entenderán que pueden ser deseables etapas de purificación adicionales, después de la etapa de pasteurización, para obtener AT-III en una forma adecuada para su uso o para liofilización. Dichas etapas pueden incluir, por ejemplo, en cualquier orden deseado:

•: Cromatografía de afinidad, en un medio adecuado, tal como Heparin-Sepharose®, para retirar la AT-III inactivada;

•: Ultrafiltración, para concentrar y desalar la AT-III;

•: Filtración, para retirar adicionalmente los virus.

La persona especialista podrá realizar las etapas de purificación adicional necesarias por procedimientos bien conocidos en la técnica. Se da un ejemplo de purificación de AT-III en el Ejemplo 1, a continuación.

En otro aspecto, se da a conocer una composición farmacéutica que puede obtenerse por los procedimientos como se ha descrito anteriormente. La composición puede usarse como una preparación líquida sin procesamiento adicional. Sin embargo, antes de la administración, la preparación líquida se procesa adicionalmente, adecuadamente, secando la AT-III en presencia de estabilizadores. Un procedimiento de secado adecuado es liofilización. Otros posibles procedimientos de secado incluyen, por ejemplo, concentración al vacío.

Por consiguiente, la composición es una composición de AT-III liofilizada, que tiene una mayor estabilidad (periodo de validez prolongado), comparada con composiciones de AT-III conocidas. Dicha composición comprende (i) antitrombina-III; y (ii) sacarosa y citrato como agentes estabilizadores. La persona especialista entenderá que la composición podría comprender, opcionalmente, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptable adicionales, tales como sales, por ejemplo cloruro sódico; aminoácidos, por ejemplo lisina, alanina, glicina o histidina; tensioactivos, por ejemplo polisorbato 80, conocido también con la marca comercial Tween-80®; y otros excipientes, tales como polietilenglicol (PEG 4000) o ácido glucónico.

Para la preparación de una composición de AT-III liofilizada de acuerdo con la invención, una cantidad deseada de los estabilizadores se disuelve o preferentemente se diafiltra en una solución acuosa de AT-III que tiene una concentración apropiada (de 50 a 1000 UI/ml, o de 5 a 200 mg/ml). El pH de la solución debería ajustarse a entre 6 y 9, preferentemente entre 7 y 8. La solución se filtra después en condiciones estériles, se llena en viales, tales como frascos de vidrio tubulares y se liofiliza.

La cantidad relativa de sacarosa en la composición es preferentemente de 0,5 a 2,5, más preferentemente de 1,0 a 1,5, partes por parte de antitrombina-III, en peso. La cantidad relativa de citrato, preferentemente citrato sódico, es preferentemente de 1 a 4, más preferentemente de 2,5 a 3,0, partes por parte de antitrombina-III, en peso.

La composición de AT-III se caracteriza adicionalmente porque es estable sin la adición de proteínas derivadas del plasma, tales como albúmina. La ausencia de proteínas derivadas del plasma adicionales aumenta la pureza y seguridad viral en la composición de la invención.

Cuando la composición farmacéutica se usa para tratar a pacientes que sufren trastornos tromboembólicos, la preparación liofilizada puede disolverse en una solución salina fisiológicamente isotónica o en agua estéril, por ejemplo, a una concentración del 0,5 al 20% (p/v) de AT-III. La solución puede administrarse por vía intravenosa para obtener un efecto sistémico. Sin embargo, también es posible administrar la solución para obtener un efecto local, por ejemplo durante la cirugía con balón de las arterias coronarias.

El inventor de la presente solicitud ha descubierto ahora, sorprendentemente, que añadir un tensioactivo no iónico al producto reconstituido en una cantidad de al menos el 0,01% (p/p), proporciona un producto de AT-III reconstituido, básicamente libre de partículas visibles e indeseadas, durante un periodo de tiempo tan largo como 3 meses. El tensioactivo no iónico se selecciona preferentemente entre co-polímeros de bloque, tales como poloxámeros, o ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitano, preferentemente polisorbato 80 (monooleato de polioxietilen 20 sorbitano) que se conoce también con la marca comercial Tween 80®, como el medio de reconstitución. Puede usase cualquier tipo de éster de ácido graso de polioxietilen sorbitano como el medio de reconstitución de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando sea farmacéuticamente y farmacológicamente aceptable. Otros ejemplos de dichos ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitano adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención son polisorbato 20 (monolaurato de polioxietilen 20 sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 20®; polisorbato 21 (monolaurato de polioxietilen (4) sorbitano, conocido también con la marca comercial Tween 21®; polisorbato 40 (monopalmitato de polioxietilen 20 sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 40®; polisorbato 60 (monoestearato de polioxietilen 20 sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 60®; polisorbato 61 (monoestearato de polioxietilen (4) sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 61®; polisorbato 65 (triestearato de polioxietilen 20 sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 65®; polisorbato 81 (monooleato de polioxietilen (5) sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 81®; polisorbato 85 (trioleato de polioxietilen 20 sorbitano), conocido también con la marca comercial Tween 85®; y polisorbato 120 (monoisoestearato de polioxietilen 20 sorbitano), conocido también con la marca comercial Crillet 6®. Dichos ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitano se describen en Handbook of pharmaceutical excipients, 3ª edición, pág. 416-419, editado por Arthur H Kibble, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Otro tipo más de tensioactivos adecuados, útiles de acuerdo con la presente invención son ésteres de ácido graso de sorbitano. Puede usarse cualquier tipo de ésteres de ácido graso de sorbitano como el medio de reconstitución, siempre y cuando sea farmacéuticamente y farmacológicamente aceptable. Los ésteres de ácido graso de sorbitano adecuados, útiles como el medio de reconstitución de acuerdo con la presente invención, se describen en Handbook of pharmaceutical excipients, 3ª edición, pág. 511-514, editado por Arthur H Kibble.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

La actividad biológica (UI/ml) de AT-III se determinó como la actividad del cofactor de la heparina, controlando la escisión del sustrato cromogénico H-D-Phe-PipArg-pNA-2 HCI (Chromogenix, Suecia) con trombina en presencia de heparina y AT-III. Véase Frantzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983) y van Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984).

La concentración de proteína total se determinó mediante mediciones de absorción a 280 nm (A280). La concentración (mg/ml) para las soluciones de AT-III se calculó usando el coeficiente de extinción de 6,4 UI/mg de la AT-III.

La actividad específica de AT-III se definió como la proporción entre la actividad del cofactor de la heparina calculada como UI/ml y A280.

El contenido de dímero y polímero de AT-III se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), por filtración en gel, en una columna TSK G 3000 SW (Toyosoda) con partículas de 10 µm y una pre-columna (Toyosoda).

La cantidad de proteínas contaminantes se determinó por inmuno-electroforesis cruzada contra suero humano anti-total, usando condiciones normales.

Para determinar que el producto farmacéutico líquido reconstituido está básicamente libre de partículas visibles, se hace pasar una muestra por un detector, en el que una fuente de láser transmite luz y un fotodetector detecta si una partícula pasa o no. El principio se denomina "principio de bloque de luz". El impulso amplificado desde el fotodetector se recoge en el contador de partículas (Hiac Royco) y posteriormente se convierte en tamaño y cantidad de partículas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Preparación de AT-III liofilizada de plasma humano

Etapa 1. Precipitación del plasma. El plasma humano crioprecipitado y centrifugado 1 se obtiene precipitando el eluido resultante con etanol al 8%, a pH 7,2 y recuperando el eluido como se describe en Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc. 72, 465, 1950).

Etapa 2. Cromatografía de afinidad. El centrifugado 1 se procesa a través de gel de heparina-Sepharose® (HS) equilibrado con Na2PO3 0,001 M, NaCl 0,15 M, a pH neutro. El gel de HS une aproximadamente 10-15 UI de AT-III por ml. El gel se lava con NaCl 0,4 M, Na2PO3 0,01 M, pH 7,8 y la AT-lll se eluye después con NaCl 2 M, Na2PO3 0,01 M, pH 7,8.

Etapa 3. Ultra-filtración. La AT-III eluida se concentra y se desala por ultra-filtración con Na2PO3 0,05 M, pH 7,5.

Etapa 4. Tratamiento S/D. El filtrado de AT-III se inactiva para virus por tratamiento con Triton X-100 al 1% (p/p) y tri-n-butil-fosfato (TNBP) al 0,3% (p/p) de acuerdo con la tecnología de disolvente/detergente (S/D) desarrollada por el New York Blood Center (véase la Solicitud de Patente Europea Nº EP-A-0239859). El disolvente y detergente se retiran parcialmente por extracción con aceite de semilla de soja al 5% (p/p).

Etapa 5. Precipitación. Un tampón de precipitación que contiene sacarosa al 40%, citrato sódico 2,2 M, Na2PO3 0,05 M, pH 7,5, se añade a temperatura ambiente a la solución, continuamente durante 30 minutos, hasta una concentración final del 20% (p/v) de sacarosa y citrato sódico 1,1 M. La solución se agita durante 15 minutos más y el precipitado se retira por decantación y el sobrenadante recogido se filtra con los siguiente filtros conectados en serie: 20-2 µm (Pall) + 0,45/0,22 µm (Sartorius). Esta etapa tiene como fin retirar los virus; proteínas no deseadas; y los compuestos disolvente y detergente restantes (cf. documento WO 94/26287).

Etapa 6. Pasteurización. Para inactivar los virus, la preparación de AT-III se pasteuriza durante 10 horas a 60ºC. La pasteurización se realiza a una presión de nitrógeno gaseoso y con agitación continua. Durante la pasteurización, tanto sacarosa al 20% (p/v) como citrato sódico 1,1 M actúan para estabilizar la AT-III frente a la inactivación térmica.

Etapa 7. Cromatografía de afinidad. El filtrado se diluye 1/11 con agua. La cromatografía de afinidad sobre heparina-Sepharose se repite para separar la AT-III que se inactivó durante la pasteurización. La cromatografía con heparina-Sepharose se realiza como se ha descrito en la etapa 2.

Etapa 8. Ultrafiltración. La AT-III eluida se concentra y desala por ultrafiltración con NaCl 0,12 M, Na2PO3 0,001 M, a pH 7,4.

Etapa 9. Filtración de virus. La filtración de virus se realiza añadiendo NaCl a

una concentración de 1 M en la solución de AT-III, antes de filtrarla a través de Viresolve™/70 (Millipore), usando una técnica de "punto final", como se describe en el documento WO 96/00237.

Etapa 10. Ultrafiltración y liofilización. La solución purificada se concentra y desala por ultrafiltración con 0,22 mol/kg de citrato sódico, 0,07 mol/kg de sacarosa, 1,5 mmol/kg de ácido cítrico, pH 7,0, se llena en viales y se liofiliza. La composición secada por congelación obtenida contiene 2,8 mg de citrato sódico y 1,3 mg de sacarosa por mg de AT-III.

La recuperación total de AT-III a partir de plasma es aproximadamente del 60%. Más del 95% del contenido de proteína del concentrado de AT-III liofilizada resultante es AT-III. Adicionalmente, la presente proteína AT-III contiene más del 95% de AT-III activa, es decir, menos del 5% de AT-III inactivada. El concentrado de AT-III es, adicionalmente, seguro frente a virus, debido a las etapas 4, 6 y 9, que se refieren a la retirada y/o inactivación de virus. Además, las etapas 1, 2, 5 y 7 ocasionan algún grado de inactivación o retirada de virus. EJEMPLO 2: Inactivación de virus en la etapa de precipitación

El efecto de retirada de virus de la etapa de precipitación se determinó mediante un estudio de virus. El estudio se realizó en parvovirus, que es de los virus más difíciles de eliminar, debido a su pequeño tamaño (20-25 nm).

Una solución de AT-III se contaminó con parvovirus y se realizó la etapa de precipitación de acuerdo con el Ejemplo 1, Etapa 5. La solución se analizó con respecto al contenido de parvovirus antes y después de la etapa de precipitación de acuerdo con el Ejemplo 1. Los resultados indicaron que la etapa de precipitación reduce el contenido de parvovirus en al menos un factor de 102. EJEMPLO 3: Purificación y rendimiento en la etapa de precipitación

Una solución de AT-III que contenía impurezas se dividió en dos alícuotas. Una se sometió a cromatografía de intercambio de iones (CM-Sepharose®, Amersham Pharmacia Biotech) y una a la etapa de precipitación de acuerdo con el Ejemplo 1, etapa 5. Antes y después de la etapa de purificación, las alícuotas se analizaron con respecto a la actividad del cofactor de la heparina y la concentración de AT-III. Los resultados, mostrados en la Tabla I, indican que ambos procedimientos tenían un efecto purificador sobre la solución de AT-III. El rendimiento, determinado como actividad del cofactor de la heparina restante, fue algo mayor con la etapa de precipitación.

TABLA I

Muestra: Actividad Específica UI / (mI x A280) Rendimiento (% UI)

Material de partida: 7 100

Después CM-gel: 11 85

Después precipitación: 11 90

EJEMPLO 4: Efecto de los diversos agentes de precipitación

5 Se determinó la capacidad de las diversas sales para precipitar impurezas en una solución de AT-III. A una solución de AT-III, obtenida de acuerdo con el Ejemplo 1, etapa 4, se le añadieron diversas sales a pH neutro y a temperatura ambiente (+23ºC). El precipitado (si lo hubiera) se retiró y se determinó la actividad específica de la solución sobrenadante.

10 La "purificación" se calculó usando la concentración de proteína obtenida con citrato sódico 1,25 M y sacarosa al 20% ("A280inv") como un patrón. El "factor de purificación" se obtuvo determinando A280 para cada muestra antes y después de la adición de sal ("A280ref" y "A280muestra” respectivamente) y usando la fórmula

15 A280ref(muestra) -A280muestra x 100 / A280ref(inv) -A280inv

Por consiguiente, un factor de purificación cero indica que no había precipitación de impurezas. Los factores de purificación obtenidos con diversas sales se dan en la Tabla II.

20 La recuperación se determinó como actividad porcentual residual (% UI). La recuperación estaba por encima del 90% para todas las muestras. Los resultados indican, por lo tanto, que se obtiene una purificación eficaz y una alta recuperación usando citrato sódico y sacarosa.

25 TABLA II EJEMPLO 5: Estabilidad de AT-III liofilizada

Agente de precipitación: Factor de purificación

citrato sódico 1,25 M y sacarosa al 20%: 100

citrato sódico 1,25 M: 75

cloruro sódico 1,25 M: 0

cloruro sódico 2 M: 0

cloruro sódico 4 M: 0

sulfato sódico 1,25 M: 48

sulfato amónico 1,25 M: 0

sulfato amónico 2 M: 67

acetato sódico 1,25 M: 0

cloruro de bario 1,25 M: 0

fosfato potásico 1,25 M: 30

Se ensayaron diversos agentes estabilizadores para su efecto sobre la estabilidad de AT-III durante el almacenamiento a +25ºC o +37ºC, durante 3 o 12 5 meses. Los resultados, mostrados en las Tablas III a VI, indican que el citrato sódico y

la sacarosa, en combinación, tienen efectos ventajosos sobre la estabilidad de AT-III.

Una combinación ventajosa de citrato sódico y sacarosa, como estabilizadores de AT-III liofilizada, es 2,8 partes de citrato sódico y 1,2 partes de sacarosa, por parte de AT-III en peso.

10 TABLA III

3 meses de almacenamiento a +25ºC

Estabilizador: mg estabilizador / UI de AT-III Actividad residual (%) Monómero (%) Dímero (%) Polímero (%)

albúmina: 0,20 96 97,0 1,7 1,2

glicina: 0,20 98 99,4 0,6 0,0

lisina: 0,20 101 99,2 0,6 0,2

citrato: 0,44 100 98,8 1,2 0,0

0,88: 99 99,0 1,0 0,0

sorbitol + citrato: 0,20 0,44 100 99,3 0,7 0,0

trehalosa + citrato: 0,20 0,44 100 99,2 0,8 0,0

sacarosa + citrato: 0,20 0,44 99 99,2 0,8 0,0

TABLA IV

3 meses de almacenamiento a +37ºC

alanina: 0,20 94 98,6 1,3 0,2

albúmina: 0,20 93 96,1 2,8 1,1

glicina: 0,20 95 99,0 1,0 0,0

lisina: 0,20 101 99,0 0,7 0,3

citrato: 0,04 93 98,0 1,3 0,7

0,44: 99 98,6 1,4 0,0

0,88: 98 99,2 0,8 0,0

sorbitol + citrato: 0,20 0,44 100 99,2 0,8 0,0

trehalosa + citrato: 0,20 0,44 100 99,1 0,9 0,0

sacarosa + citrato: 0,20 0,44 99 99,2 0,8 0,0

TABLA V

12 meses de almacenamiento a +25ºC

albúmina: 0,20 94 94,8 3,8 1,4

glicina: 0,20 96 99,1 0,9 0,0

lisina: 0,20 99 98,0 1,5 0,5

citrato: 0,44 102 98,6 1,4 0,0

0,88: 98 98,8 1,2 0,0

sorbitol + citrato: 0,20 0,44 100 98,9 1,1 0,0

trehalosa + citrato: 0,20 0,44 100 98,7 1,3 0,0

sacarosa + citrato: 0,20 0,44 99 98,8 1,2 0,0

TABLA VI

12 meses de almacenamiento a +37ºC

albúmina: 0,20 91 91,7 6,6 1,7

glicina: 0,20 94 98,5 1,5 0,0

lisina: 0,20 98 98,7 0,6 0,7

citrato: 0,44 99 96,9 2,8 0,4

0,88: 96 98,1 1,9 0,0

sorbitol + citrato: 0,20 0,44 97 98,9 1,1 0,0

trehalosa + citrato: 0,20 0,44 100 98,8 1,2 0,0

sacarosa + citrato: 0,20 0,44 97 98,9 1,1 0,0

5 EJEMPLO 6: Preparación de una composición liofilizada de AT-III

Se añadieron citrato sódico al 2,8% (p/v) y sacarosa al 1,2% (p/v) a una solución acuosa al 1% (p/v) de AT-III. El pH se ajustó a 7,0 y la solución se filtró en condiciones estériles (Millipore), se llenó en viales y se liofilizó. EJEMPLO 7: Comparación entre una formulación de acuerdo con la invención y una

10 formulación de AT-III que comprende albúmina La antitrombina-lll se purificó de acuerdo con el Ejemplo 1. Se prepararon dos

formulaciones de la siguiente manera: Formulación A: 125 UI/ml de antitrombina; 0,4 mg de citrato sódico/UI de antitrombina; 1 µg de

15 ácido cítrico/UI de antitrombina; 0,2 mg de sacarosa/UI de antitrombina; pH 7,0.

Formulación B: 125 UI/ml de antitrombina; 0,2 mg de cloruro sódico/UI de antitrombina; 0,2 mg de albúmina/UI de antitrombina; 1 µg de fosfato sódico/UI de antitrombina; 4 µg de acetiltriptófano/UI de antitrombina; 3 µg caprilato sódico/UI de antitrombina; pH

5 7,0.

Las muestras se filtraron en condiciones estériles y se llenaron en frascos de vidrio tubulares en condiciones asépticas y se liofilizaron. Los frascos se sellaron al vacío y se analizaron poco después.

Los resultados, mostrados en las Tablas VII y VIII, indican que la Formulación 10 A, de acuerdo con la invención, tenía un efecto ventajoso sobre la estabilidad de la ATIII, cuando se comparó con la Formulación B.

TABLA VII

Formulación A

Muestra Nº: UI/vial Residuo en agua % Actividad, % cofactor heparina Agregación, % monómero Actividad específica, UI / mg proteína

1: 500 4,4 92 99 6,5

2: 500 4,3 99 99 7,0

3: 500 3,1 98 99 6,6

4: 1000 3,1 98 99 6,6

5: 1500 4,9 97 99 6,8

TABLA VIII

Formulación B

1: 500 0,7 n.d. 97 3,1

2: 500 0,7 n.d. 98 3,2

3: 500 0,7 n.d. 97 3,0

4: 1000 0,6 n.d. 98 3,1

5: 1000 0,2 94 n.d. n.d.

6: 1000 0,2 96 n.d. n.d.

7: 1000 0,2 96 n.d. n.d.

8: 1500 0,3 n.d. 98 3,2

9: 1500 0,1 94 n.d. n.d.

10: 1500 0,2 94 n.d. n.d.

11: 1500 0,2 94 n.d. n.d.

12: 1500 0,3 92 n.d. n.d.

13: 1500 0,2 98 n.d. n.d.

n.d. = no determinado

EJEMPLO 8: Comparación de la capacidad de diferentes medios de reconstitución para inhibir la formación de partículas, después de la reconstitución de la formulación A de AT-III en el ejemplo 7, de acuerdo con la invención.

5 Los frascos de antitrombina (500 UI) secada por congelación, de acuerdo con la formulación A del ejemplo 7, se reconstituyeron a 50 UI/ml con los siguientes medios de reconstitución (todos los medios se filtraron en condiciones estériles (Millipore) antes de su uso): a) Agua para inyección

10 b) cloruro sódico 0,15 M c) fosfato sódico 0,025 M, pH 7,4 d) polisorbato 80 al 0,01% (Tween 80®) e) lisina 0,15 M, pH 7,4 f) glicina 0,15 M

15 g) alanina 0,15 M

Los frascos se dejaron reposar a 22ºC durante 24 horas y después se inspeccionaron visualmente respecto a la formación de partículas. El único medio de reconstitución en el que no pudieron detectarse partículas fue polisorbato 80 al 0,01% (Tween 80®), en todos los demás hubo una cantidad similar de generación de

20 partículas. EJEMPLO 9: Comparación de la capacidad de diferentes concentraciones de polisorbato 80 (Tween 80®) para inhibir la formación de partículas, después de la reconstitución de la formulación A de AT-III en el ejemplo 7, de acuerdo con la invención.

Los frascos de antitrombina (500 UI) secada por congelación, de acuerdo con la formulación A del ejemplo 7, se reconstituyeron a 50 UI/ml con las siguientes concentraciones diferentes de polisorbato 80 (Tween 80®) (todos los medios se filtraron en condiciones estériles (Millipore) antes de su uso):

5 a) polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,0100% (p/p) b) polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,0050% (p/p) c) polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,0010% (p/p) d) polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,0001% (p/p) e) Agua para inyección

10 Los frascos se dejaron reposar a 22ºC y se inspeccionaron visualmente respecto a la formación de partículas después de 0 h, 2 h, 16 h, 42 h, 5 días, 11 días, 1 mes, 2 meses y 3 meses

Muestra: 0 h 2 h 16 h 42 h 5 días 11 días 1 mes 2 meses 3 meses

0,01%: - - - - - - - - -

0,005%: - - - - - + + +

0,001%: - + + + + + +++ +++ +++

0,0001%: - ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

0%: - ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

-No pudieron detectarse partículas + Pudieron detectarse algunas partículas ++ Pudieron detectarse partículas +++ Pudieron detectarse muchas partículas

El único medio de reconstitución en el que no pudieron detectarse partículas

15 después de 3 meses fue polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,01%, en todos los demás, pudieron detectarse algunas o muchas partículas. EJEMPLO 10: Comparación de la capacidad de polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,01% y agua para inhibir la formación de partículas, después de la reconstitución de la formulación A de AT-III en el ejemplo 7, de acuerdo con la invención.

20 Los frascos de antitrombina (500 UI) secada por congelación, de acuerdo con la formulación A del ejemplo 7 se reconstituyeron a 50 UI/ml con polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,01% y agua para inyección (todos los medios se filtraron en condiciones estériles (Millipore) antes de su uso). Los frascos se almacenaron a 22ºC durante 24 h y después las partículas se contaron y se definió su tamaño, usando un

25 contador de partículas (Hiac Royco):

Tamaño de partícula [um]: Rec. con agua, [partículas/ml] Rec. con Tween 80® al 0,01%, [partículas/ml]

2: 12013 1264

5: 3956 253

10: 1029 37

15: 376 6

20: 180 1

25: 94 0

30: 55 0

35: 33 0

40: 18 0

45: 10 0

50: 5 0

55: 3 0

60: 2 0

65: 1 0

70: 1 0

75: 1 0

Como se muestra en la tabla anterior, las partículas visuales (por encima de 20 um), que es el objeto inhibitorio principal, se inhiben totalmente cuando el producto, de acuerdo con la invención, se reconstituye con polisorbato 80 (Tween 80®) al 0,01% (p/p).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de la purificación de antitrombina-III, que comprende las etapas de:

(a)

añadir, a una solución que comprende antitrombina-III, un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v) y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, para precipitar las impurezas;

(b)

dejar que las impurezas precipiten; y

(c)

retirar las impurezas precipitadas obteniendo, de esta manera, una solución que comprende antitrombina-III purificada.
2.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sacárido se selecciona entre el grupo que consiste en por monosacáridos y disacáridos.
3.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el sacárido es un monosacárido.
4.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la concentración de sacárido es del 15 al 25%.
5.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sacárido es sacarosa.
6.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la concentración de citrato es de 0,5 a 1,5 M.
7.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de citrato es citrato sódico.
8.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, seguido de una etapa de pasteurización de la solución obtenida, que comprende antitrombina-III purificada, en presencia de dicho sacárido y citrato como agentes estabilizadores.
9.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

que comprende adicionalmente una etapa de liofilización.
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende adicionalmente una etapa de reconstitución, en la que el medio de reconstitución es un 5 tensioactivo no iónico en una concentración de al menos el 0,01% (p/p).
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medio de reconstitución es un éster de ácido graso de polioxietilen sorbitano.

10 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el medio de reconstitución esta seleccionado entre uno cualquiera de polisorbato 20, polisorbato 21, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85 y polisorbato 120.

15 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el medio de reconstitución es polisorbato 80.
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medio de reconstitución es un éster de ácido graso de sorbitano. 20