ES2349244T3

ES2349244T3 - Procedimientos para reducir la angiogénesis.

Info

Publication number: ES2349244T3
Application number: ES03710841T
Authority: ES
Inventors: Christopher Heeschen; Michael Weis; John Cooke
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-02-04
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2023-02-04
Also published as: EP1480627B1; CA2472920A1; JP2005521683A; EP1480627A1; US7045534B2; US7652038B2; JP2010143935A; US20060148675A1; CA2472920C; AU2003214991B2; WO2003068208A1; ATE478661T1; US20030216314A1; DE60333901D1; JP4494793B2; DK1480627T3; EP1480627A4; US7390821B2; AU2003214991A1; US20080242591A1

Abstract

Mecamilamina o una sal correspondiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un procedimiento de reducción de la angiogénesis patológica en un

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La invención se refiere, en general, al campo de la regulación de la angiogénesis y de la vasculogénesis, especialmente a la reducción de la angiogénesis patológica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] La angiogénesis y la vasculogénesis son procesos implicados en el crecimiento de los vasos sanguíneos. La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de capilares existentes, mientras que la vasculogénesis supone el crecimiento de vasos derivados de células progenitoras endoteliales. La angiogénesis es un proceso complejo combinatorial que está regulado por un balance entre moléculas pro y antiangiogénicas. Los estímulos angiogénicos

(p. ej., hipoxia o citocinas inflamatorias) dan lugar a la expresión inducida y a la liberación de factores de crecimiento angiogénicos, como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Estos factores de crecimiento estimulan a las células endoteliales (CE) en la vasculatura existente para proliferar y migrar a través de los tejidos y formar nuevos canales recubiertos de endotelio. [0003] La angiogénesis y la vasculogénesis, y los factores que regulan estos procesos, son importantes en el desarrollo embrionario, en la inflamación y en la curación de heridas y también contribuye a afecciones patológicas como crecimiento tumoral, retinopatía diabética, artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias crónicas (véase, p. ej., USPN 5.318.957; Yancopoulos y col. (1998) Cell 93:661-4; Folkman y col. (1996) Cell 87; 1153-5 y Hanahan y col. (1996) Cell 86:353-64). [0004] Tanto la angiogénesis como la vasculogénesis afectan a la proliferación de células endoteliales. Las células endoteliales recubren las paredes de los vasos sanguíneos; los capilares están compuestos prácticamente por completo de células endoteliales. El proceso angiogénico supone no sólo el aumento de la proliferación de las células endoteliales, sino también comprende una cascada de acontecimientos adicionales, como secreción de proteasas por las células endoteliales, degradación de la membrana basal, migración a través de la matriz circundante, proliferación, alineamiento, diferenciación en estructuras tubulares y síntesis de nueva membrana basal. La vasculogénesis implica el reclutamiento y la diferenciación de las células mesenquimales en angioblastos que, a continuación, se diferencian en células endoteliales que después forman vasos de novo (véase, p. ej., Folkman y col. (1996) Cell 87:1153-5). [0005] La angiogénesis inapropiada, o patológica, está implicada en el crecimiento de la placa aterosclerótica, retinopatía diabética, maculopatía degenerativa, fibroplasia retrolental, fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria aguda y asma. Además, la progresión de un tumor se asocia con neovascularización, la cual proporciona un mecanismo por el cual se administran nutrientes al tejido tumoral en crecimiento progresivo. [0006] Existe la necesidad en la técnica de procedimientos para reducir la angiogénesis patológica. La presente invención aborda esta necesidad.

Bibliografía [0007] Schuller y col. (1989) Carcinogenesis 10: 1753-1755; Maneckjee y col. (1994) Cell Growth Differ. 5:1033-1040; Hong y col. (1995) J. Pharm. Sci. 84:65-70; Schuller y col. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:3439-3442; patente de EE.UU. Nº. 5.318.957; Yancopoulos y col. (1998) Cell 93:661-4; Folkman y col. (1996) Cell 87; 1153-5 y Hanahan y col. (1996) Cell 86:353-64). Carmeliet y col. (2000) Nature 407:249-257; Folkman (1995) Nat Med 1:27-31; Heeschen y col. (2001) Nat Med 7:833-837; Grando y col. (1995) J Invest Dermatol 105:774-781; Macklin y col. (1998) Pharmacol Exp Ther 287:435-439; Wessler y col. (1999) Clin Exp Pharmacol Physiol 26:198-205; Kawashima y col. (1989) Neurosci Lett 104: 336-339; Kawashima y col. (1990) Neurosci Lett 119:156-158; Kureishi y col. (2000) Nat Med 6:1004-1010; Jang y col. (2000) Circulation 102:1414-1419; Couffinhal y col. (1998) Am J Pathol 152:1667-1679; Lagasse y Weissman (1996) J Immunol Methods 197:139-150 y Villablanca (1998 J Appl Physiol 84:2089-2098. [0008] Entre los documentos adicionales que se refieren a la nicotina y/o a sus receptores se incluyen Heeschen y col. Journal of Clinical Investigation, vol. 110, nº. 4, agosto 2002 (2002-08), páginas 527-536; documento WO 01/08684Al; Hawkins y col, Trends In Pharmacological Sciences, vol. 23, nº. 2, 1 de febrero de 2002, páginas 78-82; Chavez-Noriega y col. Neuropharmacology, vol. 39, 2000, páginas 2543-2560; documentos US-A-4.749.686, US-A-6.121.289 y WO 00/35279 A1; Maneckjee y col. Analgesia, (1995), 1 (4-6) 548-52; Jacobi y col. The American Journal Of Pathology julio 2002, vol. 161, nº. 1, páginas 97-104 y Takamura y col, J. Kanazawa Med. Univ. 14; 241-245, 1989.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0009] La presente invención proporciona mecamilamina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para su uso en un procedimiento de reducción de la angiogénesis patológica en un mamífero que tiene una enfermedad ocular, en la que la reducción de la angiogénesis patológica permite tratar dicha enfermedad. En las reivindicaciones adjuntas se establecen características adicionales de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0010]

En la Figura 1 se representan los resultados obtenidos con un sistema de angiogénesis de disco que muestran como la mecamilamina inhibe la angiogénesis in vivo. En la Figura 2 se presentan los resultados que demuestran que la respuesta angiogénica en ratones deficientes en α-7 del nAChR se reducía significativamente. En la Figura 3 se representan los resultados obtenidos con un modelo murino de isquemia de las patas traseras, que muestra que, en comparación con el control, la mecamilamina disminuía la densidad capilar de manera dependiente de dosis. En la Figura 4 se representa el análisis por transferencia Western que muestra la regulación por incremento de la subunidad α-7 durante las 6 horas posteriores al inicio de la isquemia y un efecto máximo a los 7 días. En la Figura 5 se representan los resultados obtenidos con el modelo de carcinoma pulmonar de Lewis: la mecamilamina inhibe el avance del crecimiento del tumor, mostrando que los animales tratados con mecamilamina mostraban un crecimiento tumoral significativamente menor.

[0011] En la presente descripción también se presentan procedimientos para tratar un trastorno asociado con la angiogénesis patológica. En algunas partes de la descripción se presenta un procedimiento de inhibición del crecimiento fibrovascular anómalo en un mamífero. En algunas partes de la descripción, el crecimiento fibrovascular anómalo se asocia con artritis inflamatoria. En algunas partes de la descripción se presenta un procedimiento de inhibición de la retinopatía proliferativa en un mamífero. En algunas de estas partes de la descripción, la retinopatía proliferativa tiene lugar como resultado de la diabetes en el mamífero. Generalmente, los procedimientos implican la administración a un mamífero de un antagonista de nAChR en una cantidad eficaz para reducir la angiogénesis patológica. En algunas partes de la descripción se presenta un procedimiento que además comprende la administración de un según inhibidor de la angiogénesis.

[0012] En la presente descripción también se presenta un procedimiento para tratar el trastorno asociado con la angiogénesis patológica. En algunas partes de la descripción se ilustra un procedimiento de inhibición del crecimiento fibrovascular anómalo en un mamífero. En algunas partes de la descripción, el crecimiento fibrovascular anómalo se asocia con artritis inflamatoria. La presente descripción además presente un procedimiento para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero. En algunas partes de la descripción se presenta un procedimiento de inhibición de la neovascularización patológica asociada con un tumor. [0013] La presente descripción establece que otros antagonistas de nAChR conocidos son, pero sin limitaciones, hexametonio, dihidro-beta-eritroidina, dtubocurarina, pempidina, clorisondamina, erisodina, camsilato de trimetafán, pentolinio, bungarotoxina, succinilcolina, tetraetilamonio, trimetafán, clorisondamina y trimetidinio. La presente descripción aprecia que los términos “antagonista del receptor nicotínico de acetilcolina”, “antagonista nicotínico” y “antagonista del receptor nicotinérgico” se usan indistintamente en este documento para referirse a compuestos que se unen específicamente de forma sustancial a un receptor nicotínico de acetil colina (nAChR) y proporciona un efecto farmacológico, p. ej., reducción de la angiogénesis. La expresión “receptor nicotínico de la acetilcolina” abarca a compuestos de origen natural (incluyendo, pero sin limitaciones, pequeñas moléculas, polipéptidos, péptidos, etc., especialmente alcaloides de origen natural, y similares), ligando endógenos (p. ej., purificados a partir de una fuente natural, producidos por tecnología recombinante o sintéticos y, además, incluyendo derivados y variantes de estos ligandos endógenos) y compuestos producidos mediante síntesis (p. ej., moléculas pequeñas, péptidos, etc.) y sales farmacéuticamente aceptables de los anteriores. [0014] Los términos “tratamiento”, “tratando” y similares se usan generalmente en este documento con el significado de obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, es decir, reducir la angiogénesis patológica en un mamífero que padece una enfermedad ocular. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad debido a la activación endógena del nAChR. El término “tratamiento” según se utiliza en este documento cubre cualquier tratamiento de, especialmente, un humano e incluye: (a) evitar que aparezca una enfermedad o afección en un sujeto que puede estar predispuesto a dicha enfermedad, pero aún no ha sido diagnosticado como afectado por la misma; (b) inhibir la enfermedad, p. ej., detener su desarrollo o (c) aliviar la enfermedad. En el contexto de la presente invención, la reducción de la angiogénesis se emplea en un sujeto que tiene una enfermedad ocular, en la que la reducción de la angiogénesis patológica es un tratamiento para dicha enfermedad [0015] Por “cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del receptor nicotínico de la acetilcolina” se entiende una cantidad de mecamilamina eficaz para facilitar un efecto terapéutico deseado, es decir, reducir la angiogénesis patológica en un mamífero que tiene una enfermedad ocular en la que la reducción de la angiogénesis patológica es un tratamiento para dicha enfermedad. [0016] Por “aislado” se entiende que el compuesto se separa de todos o algunos de los componentes que lo acompañan en la naturaleza. [0017] Por “antagonista del receptor nicotínico de la acetilcolina sustancialmente puro” se entiende que el antagonista del nAChR se ha separado de los componentes que lo acompañan en la naturaleza. Típicamente, un antagonista del nAChR está sustancialmente puro cuando está al menos al 60% en peso, libre de las moléculas orgánicas naturales con las que se asocia de forma natural. Preferiblemente, la preparación es al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 90% y, lo más preferible, al menos el 99% en peso el antagonista del nAChR. Puede obtenerse un antagonista sustancialmente puro de nAChR, por ejemplo, mediante la extracción de una fuente natural, mediante la síntesis química del compuesto o mediante la combinación de purificación y modificación química. La pureza puede determinarse mediante cualquier procedimiento apropiado, p. ej., cromatografía, espectroscopía de masas, análisis por HPLC, etc. [0018] Un antagonista del nAChR esta sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural cuando se separa de aquellos contaminantes que lo acompañan en su estado natural. De este modo, p. ej., un antagonista del nAChR que se sintetiza químicamente o se produce en un sistema acelular diferente de la célula de la que se origina de forma natural, estará sustancialmente libre de sus componentes asociados naturalmente. En muchas realizaciones, p. ej., cuando un antagonista del nAChR se sintetiza químicamente, el antagonista del nAChR está, en general, sustancialmente puro, p. ej., al menos aproximadamente el 90% puro, al menos aproximadamente el 95% puro o, al menos aproximadamente el 99% puro. También se entenderá que la terminología utilizada en este documento sólo tiene la intención de describir realizaciones especiales y no pretende limitar el alcance de la presente invención que sólo estará limitado por las reivindicaciones adjuntas. [0019] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, desde la décima parte de la unidad del límite inferior, a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa, entre los límites superior e inferior de dicho intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, se incluye dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están incluidos dentro de la invención, sometidos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de dichos límites establecidos. [0020] Siempre que no se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que normalmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse en la práctica o ensayo de la presente invención cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, aquí se describen los procedimientos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en este documento son para descubrir y describir los procedimientos y/o materiales en conexión con las publicaciones que se citan. [0021] Debería apreciarse que, según se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "a", "y" y "el" incluyen los referentes plurales siempre que el contexto no dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un antagonista del receptor nicotínico de la acetilcolina" incluye una diversidad de estos antagonistas y la referencia "al procedimiento" incluye la referencia a uno o más procedimientos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [0022] La presente invención se basa en la observación de que existe una ruta endógena de la angiogénesis que es dependiente de los receptores colinérgicos de las células endoteliales. En ausencia de nicotina, esta ruta contribuye sustancialmente a la angiogénesis. Se hicieron las siguientes observaciones: 1) la inhibición del nAChR reducía significativa y reversiblemente la formación de la red capilar in vitro; 2) la inhibición del nAChR reducía la respuesta angiogénica a la inflamación (modelo de angiogénesis de disco), isquemia (modelo de ligamiento de la arteria femoral) y neoplasia (modelo de carcinoma pulmonar de Lewis) y 3) la isquemia daba lugar a un

aumento en la expresión del nAChR. Estos datos muestran por primera vez que el nAChR está implicado en la respuesta angiogénica nativa. Se encontró que los antagonistas del nAChR bloquean la angiogénesis en tumores y reducen el crecimiento tumoral en aproximadamente el 50%. [0023] Los resultados presentados en este documento indican que los antagonistas del nAChR son útiles para tratar las afecciones y trastornos asociados y/o que dan lugar a angiogénesis patológica, incluso, p. ej., cáncer, aterosclerosis, retinopatías proliferativas, proliferación fibrovascular excesiva, como la observada en la artritis crónica, soriasis y malformaciones vasculares, tal como hemangiomas.

PROCEDIMIENTOS PARA REDUCIR LA ANGIOGÉNESIS [0024] La presente invención se basa en la reducción de la angiogénesis inhibiendo una ruta endógena de la angiogénesis que depende, o está mediada, por la mecamilamina, antagonista del receptor nAChR. La ruta endógena se activa en ausencia de nicotina. Antagonistas de los receptores nicotínicos de la acetilcolina [0025] En la técnica se conoce cualquiera de los diversos antagonistas del nAChR. Ejemplos son mecamilamina, hexametonio (Wotring y col., 1995 Neuroscience 67: 293-300); dihidro-beta-eritroidina (Stolerman y col., 1997 Psychopharmacology 129: 390-397); d-tubocurarina (Wotring y col., 1995); pempidina (Rapier y col., 1990 J. Neurochem. 54: 937-945); clorisondamina (Caggiula y col., 1995 Psychopharmacology 122:301-306); erisodina (Decker y col., 1995 Eur. J. Pharmacol.

280: 79-80); camsilato de trimetafán (Hisayama y col., 1988 Br. J. Pharmacol. 95:465472); pentolinio; bungarotoxina; succinilcolina; tetraetilamonio; trimetafán; clorisondamina y trimetidinio. [0026] Entre los antagonistas de nAChR conocidos también se incluyen moduladores del nAChR como, pero sin limitaciones, agentes que reducen el nivel de un nAChR en una célula y agentes que reducen la actividad de un nAChR. Análogos de nicotina, como las piridinas 2-etilpiridina y 3-etilpiridina sustituidas, también pueden tener efectos antiangiogénicos. [0027] Los antagonistas nicotínicos pueden ser una fase libre o estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Entre las sales farmacéuticamente aceptables de un grupo ácido o un grupo amino se incluyen, pero sin limitaciones, sales de ácidos carboxílicos orgánicos como ácidos acético, láctico, tartárico, málico, isotiónico, lactobiónico y succínico; ácido sulfónicos orgánicos como ácidos metanosulfónicos, etanosulfónico, bencenosulfónico y p-tolilsulfónico y ácido inorgánicos, como ácido clorhídrico, sulfúrico, fosfórico y sulfámico. [0028] Los antagonistas del receptor nicotínico de la acetilcolina pueden identificarse usando procedimientos fácilmente disponibles, como los descritos en el Ejemplo. La capacidad de un agente candidato para reducir la angiogénesis puede evaluarse in vitro o in vivo usando cualquier procedimiento conocido, incluyendo, pero sin limitaciones, un ensayo Matrigel in vitro, un sistema de angiogénesis de disco, un modelo murino de isquemia de las extremidades traseras, un modelo murino de carcinoma pulmonar y similares. Composiciones farmacéuticas [0029] Tras leer la presente memoria descriptiva, el experto en la materia apreciará que las composiciones farmacéuticas que contienen mecamilamina descritas en este documento pueden proporcionarse en una amplia variedad de formulaciones. Más especialmente, la mecamilamina puede formularse en composiciones farmacéuticas mediante combinación con vehículos o diluyente apropiados farmacéuticamente aceptables y puede formularse en preparaciones en forma sólida, semisólida (p. ej., gel), líquida o gaseosa, como comprimidos, cápsulas, polvos, granulados, cremas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores y aerosoles. Cuando el antagonista del nAChR es un compuesto de origen natural, la composición farmacéutica también puede proporcionarse como una preparación de herbolario. [0030] La formulación de mecamilamina utilizada variará según la afección o enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, la cantidad de antagonista del nAChR que se va a administrar y otras variables que un experto en la materia apreciará fácilmente. En general, y como se discute en más detalle a continuación, la administración de mecamilamina puede ser sistémica o local y puede lograrse de diversas formas incluyendo, pero sin limitaciones, la administración por vía oral, parenteral, intravenosa, intraarterial, interpericárdica, intramuscular, intraperitoneal, intraarticular, intraocular, tópica, transdérmica, transcutánea, subdérmica, intradérmica, intrapulmonar, etc. [0031] En las formas de administración farmacéutica, la mecamilamina puede administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables o también puede usarse sola o en asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los procedimientos y excipientes siguientes son simplemente ejemplos y no son limitantes. [0032] La mecamilamina puede formularse en preparaciones para inyección disolviendo, suspendiendo o preparando una emulsión de los mismos en un solvente acuoso o no acuoso, como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol y, si se desea, con aditivos convencionales, como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes [0033] De forma similar, pueden prepararse formulaciones adecuadas para administración tópica, transcutánea y transdérmica mediante el uso de agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes apropiados. Las formulaciones tópicas también pueden utilizarse con un sistema que proporcione la administración continua de mecamilamina mediante, por ejemplo, la incorporación en pellas de liberación lenta o parches de liberación controlada. [0034] La mecamilamina también puede formularse en un gel biocompatible, el cual puede aplicarse por vía tópica o implantarse (por ejemplo, proporcionado mediante la liberación mantenida del antagonista del nAChR en un lugar de tratamiento interno). Los geles y procedimientos adecuados para formular un compuesto deseado para su administración usando el gel son bien conocidos en la materia (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº. 5.801.033; 5.827.937;

5.700.848 y MATRIGELTM). [0035] Para las preparaciones orales, la mecamilamina puede usarse sola o en combinación con aditivos apropiados para hacer comprimidos, polvos, granulados o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma de acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegrantes, como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, como lacto o estearato de magnesio y, si se desea, con diluyentes, agentes tamponadores, agentes humectantes, conservantes y agentes aromatizantes. [0036] El antagonista del nAChR mecamilamina, puede utilizarse en formulación de aerosol para su administración mediante inhalación. Los componentes de la presente invención pueden formularse dentro de propulsores presurizados aceptables, como diclorodiflurometano, propano, nitrógeno o similares. [0037] Adicionalmente, el antagonista del nAChR mecamilamina puede prepararse en supositorios mediante su mezcla con diversas bases, como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía rectal mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos como manteca de cacao, caboceras y polietilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal, aunque se solidifican a temperatura ambiente.

[0038] Pueden proporcionarse formas de unidad de dosificación para la administración oral o rectal, como jarabes, elixires y suspensiones, en las que cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más inhibidores. De forma similar, las formas de unidad de dosificación para inyección o administración intravenosa pueden comprende los inhibidores en una composición como solución en agua estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente aceptable. [0039] La expresión forma de unidad de dosificación, como se utiliza en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y/o animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de mecamilamina calculada en una cantidad suficiente para producir la reducción deseada de la angiogénesis en asociación con un diluyente, transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de unidad de dosis de la presente invención dependen del compuesto en particular utilizado, del efecto que se quiere obtener y de los parámetros farmacodinámicos asociados con cada compuesto en el hospedador. [0040] Los excipientes farmacéuticamente aceptables, como vehículos, adyuvantes, transportadores o diluyentes pueden ser obtenidos fácilmente por el público. Adicionalmente, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como agentes para ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares, pueden ser fácilmente obtenidos por el público. [0041] En algunas realizaciones, la mecamilamina se administra en politerapia con uno o más agentes terapéuticos. Entre los ejemplos de agentes terapéuticos se incluyen agentes terapéuticos utilizados para el tratamiento del cáncer, aterosclerosis, retinopatías proliferativas, artritis crónica, soriasis, hemangiomas, etc. Dosis [0042] La dosis de antagonista del nAChR administrado a un sujeto, especialmente un ser humano, en el contexto de la presente invención debería ser suficiente para lograr una reducción terapéutica en la angiogénesis del sujeto durante un periodo de tiempo razonable. La dosis se determinará en función de, entre otras consideraciones, la potencia del antagonista del nAChR en particular mecamilamina empleado y el estado del sujeto, así como del peso corporal del sujeto en tratamiento. Por ejemplo, el nivel, la afinidad, o ambos, del antagonista del nAChR mecamilamina por el receptor nicotínico de la acetilcolina, pueden estar implicados en la regulación de la actividad del compuesto antiangiogénico. El tamaño de la dosis también se determinará por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pudiera acompañar a la administración de un compuesto en particular. [0043] A la hora de determinar la cantidad eficaz de mecamilamina en la reducción de la angiogénesis se consideran la vía de administración, las cinéticas del sistema de liberación (p. ej., pastillas, gel u otra matriz) y la potencia del agonista de nicotina para lograr el efecto antiangiogénico deseado con efectos secundarios adversos mínimos. Típicamente, el antagonista del nAChR mecamilamina se administrará al sujeto en tratamiento durante un periodo de tiempo que oscila de un día a varias semanas, de acuerdo con el estado clínico del sujeto tratado. [0044] Como será fácilmente aparente para el experto en la materia, se ajusta la dosis de mecamilamina. La dosis puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg a 10 mg, administrados de 1 a 20 veces al día y puede ser hasta una dosis diaria total de aproximadamente 0,1 mg a 100 mg. Si se aplica por vía tópica, con el objetivo de obtener un efecto sistémico, el parche o la crema debería diseñarse para proporcionar la administración sistémica de una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg a 10 mg. Si la finalidad de la formulación tópica (p. ej., crema) es proporcionar un efecto antiangiogénico local, probablemente la dosis debería estar en el intervalo de aproximadamente 0,001 mg a 1 mg. Si se inyecta con la finalidad de obtener un efecto sistémico, la matriz en la que se administra el antagonista del nAChR mecamilamina se diseña para proporcionar una administración sistémica de una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,001 mg a 1 mg. Si se inyecta con la finalidad de obtener un efecto local, la matriz se diseña para la administración a nivel local de una cantidad del antagonista del nAChR en el intervalo de aproximadamente 0,003 mg a 1 mg. [0045] A continuación se recogen ejemplos no limitantes de dosificación. En el caso de clorhidrato de mecamilamina, la dosis oral normalmente es de 25 mg diarios, aunque puede ser de tan sólo 2,5 mg diarios. [0046] Independientemente de la vía de administración, la dosis del antagonista del nAChR puede administrar durante cualquier periodo de tiempo apropiado, p. ej., durante el transcurso de 1 a 24 horas, durante uno a varias días, etc. Adicionalmente, pueden administrarse durante un periodo de tiempo seleccionado. Puede administrarse una dosis adecuada en subdosis adecuadas por día, especialmente en un régimen profiláctico. El nivel de tratamiento preciso dependerá de la respuesta del sujeto en tratamiento. Politerapia [0047] En algunas realizaciones, la mecamilamina se administra en politerapia con uno o más agentes terapéuticos, incluyendo un inhibidor de la angiogénesis y un agente quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer. [0048] Entre los agentes quimioterapéuticos adecuados se incluyen, pero sin limitaciones, los agentes alquilantes, p. ej. cisplatino, ciclofosfamida, altretamina; los agentes que cortan la cadena de ADN, como la bleomicina; inhibidores de la ADN topoisomerasa II incluyendo intercalantes, como amsacrina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina y mioxantrona; los inhibidores de la topoisomerasa II no intercalantes como etopósido y tenipósido; el ligando del surco menor del ADN plicamicina; agentes alquilantes, como las mostazas nitrogenadas como clorambucil, ciclofosfamida, isofamida, mecloretamina, melfalán, mostaza de uracilo; aziridinas como tiotepa; ésteres de metanosulfonato como busulfán; nitrosoureas como carmustina, lomustina, estreptozocina; complejos de platino, como cisplatino, carboplatino; alquilantes biorreductores como mitomicina y procarbazina, dacarbazina y altretamina; antimetabolitos, incluyendo antagonistas de folato como metotrexato y trimetrexato; antagonistas de pirimidina, como fluorouracilo, fluorodeoxiuridina, CB3717, azacitidina, citarabina,; antagonistas de purina floxuridina como mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, pentostatina; análogos de azúcares modificados como cictrabina, fludarabina; inhibidores de la ribonucleótido reductasa como hidroxiurea; agentes que interaccionan con la tubulina como vincristina, vinblastina y paclitaxel; corticosteroides adrenales como prednisona, dexametasona, metilprednisolona y prednisolona; agentes bloqueantes hormonales como estrógenos, estrógenos conjugados y etinilestradiol y dietilestilbesterol, clorotrianiseno e idenestrol; progestinas como caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona y megestrol; andrógenos como testosterona, propionato de testosterona; fluoximesterona, metiltestosterona con estrógenos, estrógenos conjugados y etitnilestradiol y diesilstilbesterol, clorotrianiseno e idenestrol; progestinas como caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona y megestrol; andrógenos como testosterona, propionato de testosterona; fluoximesterona, metiltestosterona y similares. [0049] El antagonista del nAChR mecamilamina puede administrarse con otros agentes antiangiogénicos. Entre los agentes antiangiogénicos se incluyen, pero sin limitaciones, esteroides angiostáticos como derivados de heparina y glucocorticosteroides, trombospondina, citocinas como IL-12, fumagilina y derivados sintéticos de la misma, como AGM 12470, interferón-α, endostatina, receptores solubles de factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales neutralizantes dirigidos frente a factores de crecimiento y similares. Reducción de la angiogénesis in vivo [0050] Una cantidad eficaz de un antagonista del nAChR reduce la angiogénesis al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, o más cuando se comparan con un control sin tratar (p. ej., tratado con placebo). [0051] La reducción de la angiogénesis puede determinarse usando cualquier procedimiento conocido. En la técnica se conocen procedimientos para determinar el efecto de un agente sobre la angiogénesis e incluyen, pero sin limitaciones, inhibición de la neovascularización en implantes impregnados con un factor angiogénico; inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos en la córnea o en la cámara anterior del ojo; inhibición de la proliferación de células endoteliales, migración o formación del tubo in vitro; el ensayo en membrana corioalantoide de pollo, el ensayo en el buche de hámster y ensayo en discos de esponja con alcohol polivinílico. Estos ensayos son bien conocidos en la técnica y se han descrito en numerosas publicaciones como, por ejemplo, Auerbach y col. ((1991) Pharmac. Ther. 51:1-11) y las referencias citadas en dicho documento. Afecciones susceptibles al tratamiento [0052] Entre las afecciones y trastornos susceptibles al tratamiento se incluyen retinopatías proliferativas, como retinopatía diabética, maculopatía relacionada con la edad y fibroplasia retrolental. [0053] Los compuestos son útiles en el tratamiento de tumores oculares sólidos tanto primarios como metastáticos, incluyendo retinoblastomas. Además, los compuestos en cuestión son útiles para reducir las metástasis de los tumores descritos anteriormente cuando se usan solos o en combinación con radioterapia y/o con otros agentes quimioterapéuticos. [0054] La presente invención puede usarse en el tratamiento de diversas enfermedades oculares como la retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo de trasplante de cornea, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, rubeosis, neovascularización retinal debida a degeneración macular, hipoxia, angiogénesis ocular asociada con infección o intervención quirúrgica y otras afecciones oculares de neovascularización anómala.

SUJETOS ADECUADOS PARA EL TRATAMIENTO [0055] Entre los sujetos adecuados para el tratamiento usando la invención actual se incluyen aquellos que tienen una de las enfermedades oculares descritas anteriormente, por ejemplo, una enfermedad susceptible de ser tratada reduciendo la angiogénesis. En algunas realizaciones, el individuo no tiene el nivel de nicotina en su organismo que pudiera estimular la angiogénesis. En algunas realizaciones, el individuo no está usando un producto que contenga nicotina, por lo que el uso de dicho producto podría dar lugar a la introducción de nicotina en el organismo del sujeto en una cantidad suficiente como para estimular la angiogénesis, conjuntamente con la administración del antagonista del nAChR. Entre los productos que contienen nicotina se incluyen, pero sin limitaciones, productos derivados del tabaco, como cigarrillos, tabaco de pipa, puros, tabaco de mascar, rape, chiles y pastillas que contienen tabaco o parches o chicle con nicotina.

EJEMPLOS [0056] Los ejemplos siguientes se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una completa divulgación y descripción de cómo hacer y usar la presente invención y no pretenden representar que los experimentos que aparecen a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para comprobar la exactitud de los valores utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero ha de tenerse en cuenta que podrían darse algunos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique lo contrario, partes indican partes en peso, peso molecular es la media del peso molecular, la temperatura se indica en grados centígrados y la presión es la atmosférica o próxima. Ejemplo 1: los antagonistas del receptor de nicotina inhiben la angiogénesis

Procedimientos [0057] Ensayo de Matrigel in vitro. Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y células de endotelio microvascular humano (HMVEC; hasta el 5ª pase; BioWhittaker, Walkersville, Maryland) se crecieron en medio EGM-MV suplementado con FBS al 5%, 0,5 ml de hEGF, 0,2 moles de hidrocortisona, 2 ml de BBE y 0,5 ml de GA-100 (BioWhittaker). Se recubrieron portaobjetos de cuatro cámaras con Matrigel potenciada con factor de crecimiento (Becton Dickinson, Bedford, Massachusetts) y se equilibraron con medio basal. Kureishi y col. (2000) Nat Med 6:1004-1010. Las células se sembraron sobre el gel a una densidad de 103 células/pocillo en medio basal reciente que contenía FBS al 5%. Dos horas después, se añadieron al medio concentraciones crecientes de mecamilamina (10-12 a 10-14 M; Sigma, St. Louis, Montana) o vehículo. El desarrollo de la formación de tubo en el centro de cada pocillo se estudió a las 24, 48 y 72 horas. [0058] Sistema de angiogénesis de disco. El disco de esponja con alcohol polivinílico (Rippey, E1 dorado Hills, California), recubierto de filtros de nitrocelulosa impermeables a células (Millipore, Burlington, Massachusetts), permite que los capilares crezcan solo a través del borde del disco. El tratamiento aleatorizado durante el periodo de 2 semanas del estudio se administró mediante minibombas osmóticas (0,25 μl/h, Durect, Cupertino, California). Estos discos se implantaron subcutáneamente en el lomo de ratones C57BL/6J de 10 semanas de edad o, en algunos experimentos, en el lomo de ratones deficientes en α7-nAChR (B6. 12957Chrna7tm1Bay) (n=6 por grupo; Jackson, Bar Harbor, Maine). Dos semanas después, los ratones se anestesiaron y se infundieron con microesferas fluorescentes de espacio relleno (0,2 μm, Molecular Probes, Eugene, Oregón) a través del ventrículo izquierdo del corazón. Ambas áreas del disco se cubrieron con vasos perfundidos y se cuantificó la densidad de vasos. Heeschen y col. (2001) Nat Med 7:833-837 y Jang y col. (2000) Circulation 102:1414-1419 (3,10). Los vasos en crecimiento con α7-nAChR se identificaron mediante inmunohistoquímica (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Para verificar la especificidad de la tinción, los discos extraídos de ratones α7-nAChR-/-homocigóticos se usaron como control negativo. [0059] Modelo murino de isquemia de las extremidades traseras. En ratones C57BL/6J de 10 semanas de edad, se ligaron el extremo distal de la arteria iliaca externa y la arteria femoral superficial y profunda (n=8 animales por grupo). Se administró mecamilamina durante tres semanas mediante inyección intramuscular diaria. Se determinaron los niveles séricos de VEGF con un kit de ELISA para VEGF de ratón (R&D System, Minneapolis, Minnesota). La densidad capilar se determinó en los músculos aductor y semimembranoso. En los cortes de criostato de 10 μm, cortes transversales de la musculatura del vientre, se identificaron los capilares mediante anticuerpos monoclonales frente a CD31 (BD PharMingen, San Diego, California) y los miocitos que contrastaron con eosina (Sigma). La densidad capilar para cada sección se determinó en diez campos seleccionados al azar y se expresó como relación entre capilares y miocitos. [0060] FACS. La clasificación de células activada por fluorescencia se utilizó para identificar la población celular movilizada por isquemia y por isquemia más mecamilamina, respectivamente. En cada punto temporal (inicio, 3, 7, 14 días), se extrajo sangre de la aurícula derecha. Se aisló médula ósea de los fémures y tibias bilaterales de cada animal que se incubó en HBSS (en FCS al 1%) en hielo. Las células de sangre periférica y de médula ósea se incubaron con anticuerpos marcados con fluorescencia y se analizaron en un citómetro de flujo FACS-Vantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El anticuerpo anti-CD34 de ratón conjugado con FITC y el anticuerpo anti-Flk-1 de ratón conjugado con PE (BD PharMingen, San Diego, CA) se usaron como marcadores de la línea endotelial. El análisis de células CD34+ y de Flk-1+ se realizó tras elegir el análisis restringido al tamaño de monocitos. Los anticuerpos biotinilados frente a MAC-1 (BD PharMingen) conjugados con Avidinarojo Texas (BD PharMingen) se usaron como marcadores de la línea monocito/macrófago tras el análisis restringido a subpoblaciones seleccionada por el tamaño de monocitos con la exclusión de granulocitos que se habían marcado con Ly6G GR-1 frente a ratón conjugado con APC (BD PharMingen). Lagasse y col. (1996) J Immunol Methods 197:139-150. La tinción se realizó en presencia de concentraciones saturantes de anticuerpos monoclonales de rata no conjugados frente a receptores Fc (anti-CD16/32, BD PharMingen) para reducir la unión no específica. Se excluyeron las células muertas mediante tinción con yoduro de propidio y los eritrocitos se excluyeron mediante análisis restringido a subpoblaciones seleccionada basado en la dispersión de la luz. Cada análisis incluyó 100.000 acontecimientos. Los datos se analizaron usando software FloJo (Becton Dickinson). [0061] Ejemplo de referencia: Modelo de carcinoma pulmonar de Lewis. Un total de 106 células de carcinoma pulmonar de Lewis (ATCC, Manassas, Virginia) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%. Las células cancerígenas se inyectaron por vía subcutánea en cada ijada o se introdujeron ortotópicamente en el parénquima pulmonar a través de una incisión cutánea limitada sin toracotomía de ratones de tipo silvestre C57BL/6J de 10 semanas de edad. Los animales recibieron mecamilamina (3 mg/kg) o vehículo mediante minibombas osmóticas. Los ratones inyectados por vía subcutánea con células tumorales fueron controlados diariamente para observar la presencia de un tumor palpable y el crecimiento tumoral se determinó con un calibrador. El tamaño del tumor se calculó el producto de la longitud x anchura X 0,5 cm3. Cuando los ratones de cualquier grupo presentaron tumores >1,5 cm3, se detuvo el experimento y se sacrificó a todos los animales para su evaluación histológica. Los vasos del tumor se identificaron mediante infusión de microesferas fluorescentes de espacio relleno (0,2 μm; Molecular Probes) a través del ventrículo del corazón. [0062] Análisis estadístico. Todos los resultados de las variables continuas se expresan como medianas con intervalos de confianza del 95% (Figuras: IC del 75 y 95%). Las comparaciones entre grupos se analizaron mediante una prueba t de Student (bilateral) o ANOVA en los experimentos con más de dos subgrupos. Se realizaron pruebas de rango retrospectivas y comparación múltiples por pares con la prueba t de Student (bilateral) con ajuste de Bonferroni. La comparación de variables categóricas se generó mediante la prueba χ2 de Pearson. Todos los análisis se realizaron con el software SPSS 10.0 (SPSS Inc.). Los valores de P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Ensayo de Matrigel in vitro [0063] Los inventores estudiaron las etapas críticas de la angiogénesis, como la migración y la diferenciación, usando un modelo de angiogénesis in vitro con CE que forman una red de estructuras similares a capilares. Tras poner en placas las células en Matrigel enriquecida con factor de crecimiento, las líneas HMVEC y HUVEC, respectivamente, mostraron la formación de tubo antes de 48 horas en respuesta al medio control. Sin embargo, cuando el medio se suplementó con concentraciones crecientes de mecamilamina (10-4 a 10-12 M), un inhibidor específico no competitivo del nAChR, se inhibió la formación de la red. Si se detenía el tratamiento con mecamilamina (10-6 M) después de 36 horas, las CE seguían siendo capaces de disponerse en estructuras similares a redes a las 72 horas, lo que indicaba que el efecto de la mecamilamina era reversible. Sistema de angiogénesis de disco. [0064] Para determinar si el nAChR está implicado en la respuesta de angiogénesis nativa in vivo, los inventores utilizaron el sistema de angiogénesis de disco. En el grupo control, el 54,9% (IC del 95% = 46,1-63,6) del área transversal del disco estaba recubierto de nuevos vasos cuando el disco se retiraba tres semanas después de la implantación subcutánea. Figura 1. El tratamiento sistémico con mecamilamina mediante minibombas osmóticas disminuía significativamente la neovascularización del disco [14,3% (IC del 95% = 9,0-19,5); P< 0,001] Figura 1. De forma similar, cuando añadimos hexametonio, un inhibidor no competitivo del nAChR que, al contrario que la mecamilamina, no atraviesa la barrera hematoencefálica, la neovascularización de los discos también se reducía significativamente [11,5% (IC del 95% = 6,5-16,5); P<0,001]. El estudio inmunohistoquímico para α7-nAChR mostró una tinción positiva de los vasos en crecimiento del disco. [0065] En ratones α7-nAChR-/-homocigóticos, la respuesta angiogénica nativa se redujo del 39,5 (IC del 95% = 28,7-44,8) para el tipo salvaje α7-nAChR+/+ a 28,7 mm2 (IC del 95% = 25,2-32,2) p =0,009) (Fig. 2). Modelo murino de isquemia de las extremidades traseras. [0066] Para determina si nAChR tiene una función importante en el establecimiento de la angiogénesis en respuesta a la isquemia, los inventores emplearon el modelo murino de isquemia de las extremidades traseras. Tras el ligamiento unilateral de la arteria femoral superficial y profunda, administraron mecamilamina o vehículo mediante inyecciones intramusculares en la extremidad trasera isquémica diariamente durante un periodo de tres semanas. Los animales (8 por cada grupo) recibieron 0, 0,05 ó 0,5 μg/kg de mecamilamina. Después de 3 semanas de tratamiento, la dosis de 0,5 μg/kg de mecamilamina reducía significativamente la respuesta angiogénica de 0,45 capilares/miocito (IC del 95% = 0,39-051) a 0,26 capilares/miocito (IC del 95% = 0,21-0,31) (P <0,001) (Fig. 3). Obtuvimos resultados similares cuando se administró mecamilamina por vía sistémica mediante minibombas osmóticas (5 μg/kg; 0,24 (IC del 95% = 0,19-0,28); P <0,001). [0067] Un aumento en la densidad capilar no cambia necesariamente el flujo de sangre local sin un aumento concomitante de los vasos colaterales. Por consiguiente, se identificaron vasos colaterales mediante tinción doble para CD31 (CE) y α-actina (CML) usando microscopia confocal. El número de vasos colaterales se cuantificó en cortes transversales mediante identificación de la luz vascular recubierta por endotelio positivo para CD31, que estaba recubierto por una pared de músculo liso vascular positivo par actina, con diámetros de vasos de al menos 0,02 mm. En comparación con la extremidad trasera no isquémica, el número de vasos colaterales en la extremidad isquémica de los animales control aumentaba significativamente de 2,6 (IC del 95% = 2,5-4,3) a 7,5 (IC del 95% = 5,2-9.5) (P <0,001) y la mediana del tamaño de los vasos colaterales aumentaba de 0,05 mm (IC del 95% = 0,02-0,11) a 0,12 mm (IC del 95% = 0,08-0,15); (P <0,001). El tratamiento con mecamilamina no disminuía significativamente el número de vasos colaterales (dosis alta: 6,2 (IC del 95% = 3,9 – 8,6); dosis baja: 7,1 (IC del 95% = 4,7-8,5); P= 0,08). Sin embargo, la mediana del diámetro de los vasos disminuía significativamente a 0,07 mm (IC del 95% = 0,04-010) y 0,09 mm (IC del 95% = 0,06-0,11), respectivamente (P =0,002). [0068] El análisis inmunohistoquímico del α7-nAChR mostró que esta subunidad del receptor no se expresaba a niveles detectables en las extremidades traseras

5 isquémicas. Por el contrario, 7 días después de la inducción de la isquemia, este subtipo de receptor se claramente de forma conjunta en algunas de las células endoteliales, como se identifica mediante el factor von Willebrand o CD31, respectivamente. La expresión regulada por incremento de la subunidad α7 en el tejido isquémico se confirmó mediante análisis por transferencia Western (Fig. 4). La

10 subunidad α7 no era detectable al inicio del experimento pero sólo 6 horas después de la inducción de isquemia de la extremidad posterior, este subtipo de receptor estaba significativamente regulado por incremento con una señal máxima a los 7 días. [0069] A los 7 y 14 días del ligamiento de la arteria femoral profunda y superficial, la isquemia sola daba lugar a un aumento significativo de células

15 CD34+/Flk-1+ en médula ósea en comparación con el valor inicial (Tabla 1). En la Tabla 1 se presentan los datos, expresados como porcentaje de células progenitoras endoteliales en médula ósea (MO) y sangre periférica (SP) antes y después del ligamento de la arteria femoral en el modelo murino de isquemia de la extremidad posterior.

20

Tabla 1

Isquemia: Isquemia + mecamilamina Valor de p

Valor inicial: M O 0,24 [0,21–0,27] 0,23 [0,20-0,27] 0,86

SP: 0,05 [0,03-0,07] 0,06 [0,03-0,08] 0,69

Día 3: M O 1,76 [1,58-1,94] 1,59 [1,39-1,80] 0,15

SP: 0,34 [0,26-0,43] 0,33 [0,25-0,41] 0,85

Día 7: M O 4,05 [3,46-4,64] 3,24 [2,68-3.81] 0,030

SP: 0,43 [0,31–0,54] 0,38 [0,27-0,49] 0,48

Día 14: M O 5,09 [4,52-5,55] 3,64 [3,15-4,12] 0,001

SP: 0,51 [0,43-0.59] 0,44 [0,37-0,50] 0,084

[0070] La movilización de las células CD4+/Flk-1+ a la sangre periférica se relacionó simultáneamente con la médula ósea con un aumento significativo a los 7 y

5 14 días. La administración sistémica de mecamilamina reducía el número de células CD34+/Flk-1+ en médula ósea. Modelo murino de carcinoma pulmonar (ejemplo de referencia) [0071] Los estudios previos indican que nAChR tiene una función importante en la angiogénesis en un amplio espectro de afecciones experimentales. Para determinar si

10 la mecamilamina podía influir sobre la angiogénesis tumoral, los inventores utilizaron un modelo de carcinoma pulmonar de Lewis in vivo. Hasta 12 días después de la implantación de células de cancerígenas y del tratamiento con vehículo o mecamilamina, todos los ratones mostraron un tamaño de tumor similar (0,46 cm2 (IC del 95% = 0,32-0,56) frente a 0,49 cm2 (IC del 95% = 0.35-0.62); P=0,54) (Fig. 5). Sin

15 embargo, a los 21 días de seguimiento, el crecimiento del tumor en el grupo control excedía significativamente del observado en el grupo de mecamilamina y fue necesario sacrificar a los animales [1,21 cm3 (IC del 95% = 0,82-1,36) frente a 0,85 cm3 (IC del 95% = 0,66-1,05); P<0,001]. Esta disminución tardía del crecimiento tumoral en el grupo de mecamilamina se correspondía con una vascularización reducida del

20 tejido tumoral. Se observó una densidad capilar significativamente menor en el grupo de mecamilamina (0,82 capilares/mm2 (IC del 95% = 0,67-1,22) frente a 0,56 capilares/mm2 (IC del 95% = 0,38-0,92); P <0,001). En otro experimento, se implantaron ortotópicamente células de carcinoma pulmonar de Lewis en el parénquima pulmonar. En el caso de tumores más grandes en el grupo control fue necesario interrumpir el experimento después de 17 días [volumen del tumor de 0,62 cm3 (IC del 95 = 0,37-0,85) frente a 0,45 cm3 (IC del 95% = 0,28-066); P <0,001). Una vez más, la vascularización del tumor era significativamente menor en el grupo de mecamilamina (1,56 capilares/mm2 (IC del 95% = 0,82-2,17) frente a 0,98 capilares/mm2 (IC del 95% = 0,69-1,31); P <0,001). Adicionalmente, los niveles sistémicos de VEGF eran significativamente altos en el grupo de control en comparación con el grupo de mecamilamina [152,2 pg/ml (IC del 95% = 98,5-187,2) frente a 78,7 pg/ml (IC del 95% = 45,3-99,4)); P <0,001]. [0072] En experimentos posteriores de cultivo celular, se estudió si esta reducción del crecimiento tumoral también podía estar relacionada con un efecto antiproliferativo directo de la mecamilamina sobre las células cancerígenas. Después de hasta 48 horas de tratamiento con mecamilamina, no se observó una variación significativa en el número de células de carcinoma pulmonar de Lewis. También se estudiaron los efectos del aumento de las concentraciones de mecamilamina sobre el porcentaje de células que sufren apoptosis durante la hipoxia usando citometría de flujo. De nuevo no se observaron diferencias entre el grupo de mecamilamina y el control. Las células que fueron tratadas con mecamilamina a una concentración de 10-6 M durante la hipoxia eran positivas para la Anexina V al 12% (IC del 95% = 8-15) en comparación con el 13% (IC del 95% = 10-17) de las células control (P =0,42). [0073] Los hallazgos principales de nuestros estudios son: 1) la inhibición del receptor nAChR reducía significativa y reversiblemente la formación de la red capilar in vitro; 2) la inhibición del receptor nAChR reducía la respuesta angiogénica a la inflamación (modelo de angiogénesis de disco), isquemia (modelo de ligamiento de la arteria femoral) y neoplasia (modelo de carcinoma pulmonar de Lewis) y 3) la isquemia daba lugar a un aumento en la expresión de nAChR. Estos datos muestran por primera vez que el nAChR está implicado en la respuesta angiogénica nativa.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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• Lagasse et al. J Immunol Methods, 1996, vol. 197, 139-150 [0060]

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Mecamilamina o una sal correspondiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un procedimiento de reducción de la angiogénesis patológica en un mamífero que tiene una enfermedad ocular, en la que la reducción de la angiogénesis patológica permite tratar dicha enfermedad.
2.

Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según la reivindicación 1, en la que el procedimiento además comprende administrar un segundo inhibidor de la angiogénesis.
3.

Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha mecamilamina, o la sal correspondiente, se administra por una vía seleccionada entre intravenosa, sistémica, intraarterial, intraocular y oral.
4.

Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la enfermedad ocular se selecciona entre retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo de trasplante de córnea, fibroplasia retrolental, glaucoma neurovascular, rubeosis y neovascularización retinal debido a degeneración macular.
5.

Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la enfermedad ocular se selecciona entre retinopatía proliferativa, maculopatía relacionada con la edad, fibroplasia retrolental y retinopatía diabética.
6.

Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la enfermedad ocular es neovascularización retinal debido a generación macular.
7.

Mecamilamina y una sal correspondiente farmacéuticamente aceptable para su uso en un procedimiento de inhibición de una retinopatía proliferativa en un mamífero.
8.

Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según la reivindicación 7, en la que la retinopatía proliferativa aparece como resultado de diabetes en el mamífero.

5 9. Mecamilamina y la sal correspondiente para su uso según la reivindicación 7, en la que la retinopatía proliferativa es una maculopatía relacionada con la edad.
10. Mecamilamina o la sal correspondiente para su uso según cualquier de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho mamífero es un ser humano.