JP2022542514A - 脳卒中の処置のためのｍｅｋ阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、脳卒中の処置、特にくも膜下出血（ＳＡＨ）の処置における使用のための、ＭＥＫ阻害剤およびその組成物に関する。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、ＭＥＫ阻害剤ならびに脳卒中およびくも膜下出血（ＳＡＨ）を含む関連する症状の処置のための薬剤としてのその使用に関する。

脳卒中は、死因の第２位であり、世界的に身体的障害の主要な原因である。その発症率は、高齢化の結果として増加している。さらに、脳卒中の発症率は、特に低中所得国において、若年層で増加している。虚血性脳卒中は、より頻繁に起こるタイプの脳卒中であるが、出血性脳卒中は、より多くの死亡および障害調整生存年数の喪失の要因である。脳卒中の発症率および死亡率は、国、地理的地域、および民族の間で異なる。主に高所得国において、予防、急性期処置、および神経リハビリテーションにおける改善は、過去３０年にわたり脳卒中の負荷の実質的な減少をもたらしている。

動脈瘤くも膜下出血（ＳＡＨ）は、すべての脳卒中の発症の約５％を引き起こす出血性脳卒中の一種であるが、死亡率は５０％と際立っている。生存者は、認知障害および生活の質の低下を有することが多く、非常に衰弱させる疾患である。ＳＡＨは通常、動脈瘤の破裂により引き起こされ、動脈血のくも膜下腔中への急速な漏出をもたらし、頭蓋内圧（ＩＣＰ）の劇的な上昇および脳血流（ＣＢＦ）の低下が続く。これは、脳の酸素およびグルコースの喪失をもたらし、その結果脳虚血および脳傷害をもたらし、初期の脳損傷と呼ばれることが多い。遅発性脳虚血（ＤＣＩ）は、二次的な遅延性脳損傷を伴い、炎症、浮腫、および血液脳関門破綻を含む種々の病態生理学的変化で構成される。ＤＣＩは、おそらく、大脳動脈のリモデリングおよび狭窄、特に、遅延性脳血管痙攣（ＣＶＳ）と呼ばれることが多い血管過敏症を伴い、現在、処置の選択肢がほとんどない。

血管の収縮性はそのため、後に続くＤＣＩを予防しようとする多くの臨床研究および臨床前研究の焦点となっている。これは、例えば、特定のエンドセリンＡ（ＥＴ_Ａ）、またエンドセリンＢ（ＥＴ_Ｂ）受容体アンタゴニストであるクラゾセンタンを含む、エンドセリン受容体アンタゴニストを用いて急性血管収縮性を調節する最近の試みを含む。これらの試みは、残念なことに、成功しているとは言えない。

したがって、当技術分野において、多くの形状での脳卒中により引き起こされる医療負荷に対処するための新規で優れた脳卒中処置の提供の必要性がある。

本発明者は、驚いたことに、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブおよびその類縁体が、他の強力なＭＥＫ阻害剤と比較してインビボ脳卒中モデルにおいて優れた効果を提示することを見出した。

第１態様において、対象における脳卒中の予防または処置における使用のための、式（Ｉ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
（式中；
Ｒ_１は、メチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ_２は、シクロプロピルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ａｒは、アリール、フェニル、およびヘテロアリールからなる群より選択される）
が提供される。

第２態様において、本開示の使用のためのＭＥＫ阻害剤は、式（ＩＩ）、

またはその医薬適合性のある塩である。

第３態様において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤の使用は：
ａ．エンドセリン－１誘導性収縮を低減すること；
ｂ．弛緩薬であるエンドセリンＢ受容体機能の収縮性表現型への表現型変化を低減すること；および／または
ｃ．誘導性くも膜下出血の後で、回転ポールを横断する対象の能力により評価できる、神経学的スコアを改善すること
のために提供される。

第４態様において、対象における脳卒中を処置するか、それを発症する危険性を低減する方法が提供され、方法は、それを必要とする対象に、式（Ｉ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
（式中；
Ｒ_１は、メチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ_２は、シクロプロピルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ａｒは、アリール、フェニル、およびヘテロアリールからなる群より選択される）
を投与し、それによって脳卒中を処置するか、それを発症する危険性を低減するステップを含む。

第５態様において、式（ＩＩ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩、およびさらなる薬剤を、別個にまたは一緒に含む、組成物が提供される。

脳底動脈の４８時間の臓器培養後の９個の異なるＭＥＫ１／２阻害剤（１μＭ）の阻害能力の比較。これは、血管平滑筋細胞における収縮性ＥＴ_Ｂ受容体のアップレギュレーションを伴う表現型の変化をもたらす。（Ａ）１μＭの異なるＭＥＫ１／２阻害剤とのインキュベーション後の、ＥＴ_Ｂ特異的アゴニストであるＳ６ｃに対する濃度－応答曲線。新鮮な血管において、Ｓ６ｃは、脳血管の弛緩をもたらすか、効果がないが、臓器培養後に、収縮性表現型が出現し、脳卒中の異なるモデルにおける類似の特徴を示す。（Ｂ）１μＭの異なるＭＥＫ１／２阻害剤とのインキュベーション後の、６０ｍＭ Ｋ^＋に対する最大収縮。媒体（ＤＭＳＯ）および任意のアンタゴニストの間に有意差はない。（Ｃ）媒体（ＤＭＳＯ）と比較して、ＴＡＫ－７３３、トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１をインキュベートした切片において有意な増加を有する内皮誘導性拡張。正常な臓器培養は、低下した内皮機能を示すが、これらの阻害剤は、この有害効果を保護した。データは、二元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定による統計付きの平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１ＤＭＳＯと比較した。ｎ＝４～１５。 選択された極めて強力なＭＥＫ１／２阻害剤の濃度－応答曲線。（Ａ）Ｓ６ｃのＥｍａｘ、（Ｂ）６０ｍＭ Ｋ^＋に対する最大収縮および（Ｃ）３・１０－７Ｍ ５ＨＴで事前収縮させた動脈に対する１０^－５Ｍカルバコールの添加により評価される内皮機能、に基づいて選択された阻害剤の濃度－応答曲線。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４として示される。 脳底動脈の４８時間の臓器培養後の血管運動を調整する経路に対する、トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１の効果。ＤＭＳＯ対照（ｎ＝５）、１μＭのトラメチニブ（ｎ＝６）またはＰＤ０３２５９０１（ｎ＝５）の存在下のＯＣからの動脈をＵ４６６１９（１～３・１０^－７Ｍ）またはＫ^＋（４１ｍＭ）で事前収縮させ、累積濃度－応答曲線を、（Ａ）カルバコール（１０^－１０～１０^－５Ｍ）、（Ｂ）ＳＮＰ（１０^－１１～１０^－４Ｍ）または（Ｃ）ＣＧＲＰ（１０^－１２～１０^－７Ｍ）を添加することにより実行した。（Ｄ）ＤＭＳＯ対照（ｎ＝１５）、１μＭのトラメチニブ（ｎ＝４）またはＰＤ０３２５９０１（ｎ＝４）との臓器培養に続くＥＴ－１事前収縮（１０^－７Ｍ）後の、Ｃａ^２＋（０．０１２５～３ｍＭ）を用いた累積濃度－応答曲線。データは、二元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定＊／＃ Ｐ＜０．０５、＊＊／＃＃ Ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃ Ｐ＜０．００１による統計付きの平均±ＳＥＭとして示される。正規化されたデータについて、球形度に対するゲイザー－グリーンハウス補正を適用した。 ラットにおけるＳＡＨおよびシャム外科手術後の、６０ｍＭ Ｋ^＋への収縮性応答に対するならびに内皮機能に対するトラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果。（Ａ）６０ｍＭ Ｋ^＋により誘導されたＥｍａｘ、Ｋ^＋（Ｎｍ^－１）。（Ｂ）内皮機能。データは、全動脈の比較のためにカットオフされた２．０ｍＮ未満の脳底動脈；シャム＋媒体（ｎ＝１０）、ＳＡＨ（ｎ＝１１）、ＳＡＨ＋媒体（ｎ＝２７）、トラメチニブ（ｎ＝１３）およびＰＤ０３２５９０１（ｎ＝１２）を含む。横の黒色破線は、すべてのｎ（ｎ＝７３）の全平均を示す。データは、平均値±ＳＥＭとして示され、この図において、「ｎ」は、個々の動脈切片に相当する。統計を、一元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定により行った。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１。 ラットにおけるＳＡＨまたはシャム外科手術後の、エンドセリン－１への収縮性応答に対するトラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果。脳底動脈のＥＴ－１（１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する累積濃度－応答曲線。シャム＋媒体（ｎ＝５）、ＳＡＨ（ｎ＝５）、ＳＡＨ＋媒体（ｎ＝１２）、ＳＡＨ＋トラメチニブ（ｎ＝６）およびＳＡＨ＋ＰＤ０３２５９０１（ｎ＝６）についての（Ａ）ＥＴ－１（Ｎｍ^－１）および（Ｂ）ＥＴ－１（ＥＴ－１ｍａｘの％）。データは、二元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定による統計付きの平均±ＳＥＭとして示される。＊ Ｐ＜０．０５。ＥＴ－１ｍａｘ正規化データは、球形度についてゲイザー－グリーンハウス補正を使用し、ＥＴ－１曲線は、二相非線形回帰曲線適合である。 ラットにおけるＳＡＨおよびシャム外科手術後の、ＶＤＣＣ非依存ＥＴ－１誘導収縮に対するトラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果。脳底動脈をＥＴ－１（１０^－７Ｍ）で事前収縮させ、Ｃａ^２＋を用いた累積濃度－応答曲線（Ｎｍ^－１）が続いた；シャム＋媒体（ｎ＝５）、ＳＡＨ（ｎ＝５）、ＳＡＨ＋媒体（ｎ＝１３）、ＳＡＨ＋トラメチニブ（ｎ＝７）およびＳＡＨ＋ＰＤ０３２５９０１（ｎ＝６）。データは、二元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定による統計付きの平均±ＳＥＭとして示される。＊／＃／＄ Ｐ＝＜０．０５。 神経学的機能に対するトラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果。（Ａ）ＳＡＨ前、（Ｂ）ＳＡＨ後２４時間および（Ｃ）ＳＡＨ後４８時間、についての、１０ｒｐｍでの回転ポールインビボ試験。１匹あたり４カウントでの採点、すなわち、それぞれ左回転および右回転について２つのスコアで採点；低＝１回の試行で横断不能；高＝１回の試行で横断可能。シャム＋媒体（ｎ＝５）、ＳＡＨ（ｎ＝９）、ＳＡＨ＋媒体（ｎ＝１４）、ＳＡＨ＋トラメチニブ（ｎ＝７）およびＳＡＨ＋ＰＤ０３２５９０１（ｎ＝６）。シャム＋媒体群を除くすべての動物を、実験的ＳＡＨに曝露した。統計を、フィッシャーの正確確率検定、両側、９５％ＣＩにより実行した。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１。 ラットにおけるＳＡＨ外科手術後のｉ．ｐ．トラメチニブ処置の効果。（Ａ）ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体（ｎ＝１０）、ｉ．ｐ．トラメチニブ（ｎ＝１２）について６０ｍＭ Ｋ^＋により誘導されたＫ^＋についてのＥｍａｘ（Ｎｍ^－１）。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。この図において、「ｎ」は、個々の動脈切片に相当する。（Ｂ）ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体（ｎ＝５）またはＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブ（ｎ＝６）を用いて処置された動物からの、６０ｍＭ Ｋ^＋で正規化した脳底動脈のＥＴ－１（１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する累積濃度－応答曲線。データは、二元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定による統計付きの平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊ Ｐ＝＜０．００１。ＥＴ－１曲線は、二相非線形回帰曲線適合である。右のパネルは、（Ｃ）ＳＡＨ後２４時間および（Ｄ）ＳＡＨ後４８時間での神経学的機能について、１０ｒｐｍでの回転ポール試験を示す。１匹あたり４カウントでの採点、すなわち、それぞれ左回転および右回転について２つのスコアで採点；低＝１回の試行で横断不能；高＝１回の試行で横断可能。統計を、フィッシャーの正確確率検定、両側、９５％ＣＩにより実行した。＊ Ｐ＜０．０５。 くも膜下腔内および腹腔内処置についてのレジメンを示した表。 曲線適合およびＥＣ_５０値の比較を示した表。 くも膜下腔内および腹腔内処置についての外科手術データを示した表。 回転ポール試験からのデータを示した表。 本研究において使用した阻害剤の概要。 生理学的パラメータ：メスラットにおける実験的誘導ＳＡＨ（３００μＬの自己血の大槽内注射）またはシャム手術（対照）に供された動物の体重、平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）、ｐＨ、ＣＯ_２圧（ｐＣＯ_２）およびＯ_２圧（ｐＯ_２）。値は、平均±ＳＥＭであり、各群ｎ＝１６～１８のラットである。 大脳動脈における５－ＣＴおよびＥＴ－１の収縮効果。メスラットにおける実験的誘導ＳＡＨ（２５０または３００μＬいずれかの自己血の注射）またはシャム手術（対照）後２日の５－ＣＴ（５ＨＴ_１Ｂ／Ｄアゴニスト）およびＥＴ－１（ＥＴ_Ａ／Ｂアゴニスト）に対する脳底動脈（ＢＡ）および中大脳動脈（ＭＣＡ）の収縮性応答についての薬理学的パラメータ。収縮性応答を、６０ｍＭ Ｋ^＋誘導収縮（Ｋ^＋応答）のパーセンテージとして表した最大収縮性応答（Ｅ_ｍａｘ）値、および半最大収縮を生じるモル濃度の負の対数の値（ｐＥＣ_５０）により特徴づけた。二相濃度－収縮曲線のため、２つの相のそれぞれについてのＥ_ｍａｘおよびｐＥＣ_５０値が提供される。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝ラットの数である。 外科手術前、外科手術中および外科手術後の頭蓋内圧および相対的脳血流。メスラットにおける実験的誘導ＳＡＨ（３００μＬの自己血注射）またはシャム手術（対照）の外科手術中の動物の頭蓋内圧（ＩＣＰ）および相対的脳血流（ｒＣＢＦ）の変化。値は、平均±ＳＥＭであり、各群ｎ＝１６～１８のラットである。 一過性中大脳動脈閉塞後の中大脳動脈の血管収縮性応答に対する卵巣摘出術の効果。（Ａ）サラフォトキシン（Ｓ６ｃ）、選択的エンドセリンＢ受容体アゴニストにより誘導された収縮。ａ：避妊処置されていない非閉塞と比較したＰ＜０．０１。ｂ：卵巣摘出済み（ＯＶＸ）非閉塞と比較したＰ＜０．０１。（Ｂ）５－カルボキサミドトリプタミン（５－ＣＴ）、非選択的５－ヒドロキシトリプタミン受容体アゴニストにより誘導された収縮。Ａ：閉塞と比較した避妊処置されていない非閉塞Ｐ＜０．０１。Ｂ：閉塞と比較したＯＶＸ非閉塞Ｐ＜０．０１。（Ｃ）アンギオテンシンＩＩ受容体１型媒介応答をもたらすアンギオテンシンＩＩ受容体２型ブロッカーの存在下でアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）により誘導された収縮。収縮は、最大カリウム－媒介収縮のパーセンテージ（平均±ＳＥＭ）として表される。実験を、一酸化窒素シンターゼおよびプロスタグランジンの生産をそれぞれ遮断するために、Ｎ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（１００μＭ）およびインドメタシン（１０μＭ）の存在下で実行した。＊Ｐ＜０．０５。ＭＣＡ：中大脳動脈 一過性中大脳動脈閉塞後の、中大脳動脈の血管収縮性応答に対する卵巣摘出済みのメスにおけるホルモン補充の効果。（Ａ）サラフォトキシン（Ｓ６ｃ）選択的エンドセリンＢ受容体アゴニストにより誘導された収縮。異なる群からの非閉塞動脈における応答の中で有意差がなかったので、データを組み合わせ、平均値をここに示す。（Ｂ）５－カルボキサミドトリプタミン（５－ＣＴ）、非選択的５－ヒドロキシトリプタミン受容体アゴニストにより誘導された収縮。（Ｃ）アンギオテンシンＩＩ受容体１型受容体－媒介応答をもたらすアンギオテンシンＩＩ受容体２型受容体ブロッカーの存在下でアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）により誘導された収縮。収縮は、最大カリウム－媒介収縮のパーセンテージ（平均±ＳＥＭ）として表される。実験を、一酸化窒素シンターゼおよびプロスタグランジンの生産をそれぞれ遮断するために、Ｎ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（１００μＭ）およびインドメタシン（１０μＭ）の存在下で実行した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊ ＜０．００１。ＯＶＸ：卵巣摘出済み、Ｅ：１７β－エストラジオール、Ｐ：プロゲステロン 卵巣摘出済みのメスからの培養された中大脳動脈のエンドセリンＢ受容体媒介収縮。２４時間の臓器培養に供された中大脳動脈における、サラフォトキシン（Ｓ６ｃ）、選択的エンドセリンＥＴＢ受容体アゴニストにより誘導された収縮。処置されていないメス、卵巣摘出済み（ＯＶＸ）または１７β－ストラジオールで処置されたＯＶＸ（ＯＶＸ＋Ｅ）からの中大脳動脈間の比較。収縮は、最大カリウム－媒介収縮のパーセンテージ（平均±ＳＥＭ）として表される。 表１。ｔＭＣＡＯ後の避妊処置されていないメス、卵巣摘出済みのメスおよびオスからの、ＭＣＡにおける収縮性応答についてのＥｍａｘ値の比較。一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）後の４８時間で分離された閉塞および非閉塞中大脳動脈において、サラフォトキシン（Ｓ６ｃ）、５－カルボキサミドトリプタミン（５－ＣＴ）およびアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）により誘導された最大収縮性応答（Ｅｍａｘ）。収縮は、最大カリウム－媒介収縮のパーセンテージ（平均±ＳＤ）として表される。処置されていない：完全な卵巣を有するメス、ＯＶＸ：卵巣摘出済みのメス。非閉塞と比較した＊Ｐ＜０．０５。非閉塞と比較した＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ－閉塞および非閉塞の間の有意差なし。ａ、ｂ－処置されていない閉塞よりも低い応答（Ｐ＜０．０５）。ｎｓ＝非閉塞と比較して統計的有意差なし。 インビトロ実験において、新たに分離されたＭＣＡ（対照）は、ＥＴ_Ｂ受容体アゴニストであるＳ６ｃに対し収縮性応答を示さなかった。（Ａ）ＯＣの４８時間後、Ｓ６ｃは、媒体とインキュベートしたＭＣＡにおいて強力な収縮性応答を生じた。しかし、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）との共インキュベーションは、Ｓ６ｃ－誘導収縮を、ＯＣ後４８時間で濃度依存的に有意に阻害した。（Ｂ）全群において、Ｓ６ｃにより誘導された最大収縮（Ｅ_ｍａｘ）。（Ｃ）０．１μＭのトラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）は、増加したＥＴ－１誘導性血管収縮に対する抑制効果を確証した。 インビボ実験において、ＳＡＨ誘導性の増加したＥＴ－１媒介血管収縮に対するトラメチニブ（ＧＳＫとして描かれている）処置の効果について、２つの異なる処置アプローチを使用した。（Ａ）１時間および２４時間での１ｍＭトラメチニブの腹腔内投与または（Ｂ）ＳＡＨ後６時間および２４時間での１ｍＭトラメチニブの腹腔内投与。（Ｃ）フローサイトメトリー：ＳＡＨ処置後の６時間後に観察された増強された収縮性応答を、フローサイトメトリーを使用するタンパク質分析で検証した。シャム（６１．４％±１０．２％；ｎ＝６）と比較してＳＡＨ（媒体）（７４．２％±１２．２％；ｎ＝７）後にＳＭＣ発現ＥＴ_Ｂ受容体の有意な増加があった。

用語および定義
本明細書において使用されるような用語「処置」および「処置すること」は、症状、疾患または障害に対抗する目的のための患者の管理およびケアを指す。この用語は、患者が悩まされている所与の症状に対する処置の全範囲を含むことを意図する。処置される患者は好ましくは、哺乳動物、特に、人間である。しかし、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびブタなどの動物の処置も、本文脈の範囲内である。処置される患者の年齢層は、様々であり得る。

本明細書において使用されるような用語「全虚血」は、脳のより多くの領域に影響する虚血を指し、通常、脳への血液供給が劇的に低下するか停止する際に生じる。これは典型的に、心停止により引き起こされる。

本明細書において使用されるような用語「局所的虚血」は、脳の特定の領域に限定された虚血を指す。それは通常、凝血塊が脳内の動脈を塞いだ際に生じる。局所的虚血は、血栓または塞栓の結果であり得る。

頭蓋内損傷としても既知である、用語「外傷性脳損傷」（ＴＢＩ）は、外力により引き起こされる脳への損傷である。ＴＢＩは、重症度、機序（閉鎖性または穿通性頭部損傷）または他の特徴（例えば、特定の位置または広範囲にわたる領域に生じること）に基づいて分類できる。ＴＢＩは、身体的、認知的、社会的、感情的および行動的症状をもたらす可能性があり、結果は、完全な回復～永続的な障害または死に及ぶ可能性がある。

ＭＥＫ阻害剤
一実施形態において、対象における脳卒中の予防または処置における使用のための、式（Ｉ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
（式中；
Ｒ_１は、メチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ_２は、シクロプロピルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ａｒは、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される）
が提供される。

本開示の一実施形態において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤が提供され、式中、Ｒ_１は、Ｃ１～Ｃ３アルキルである。好ましい実施形態において、Ｒ_１は、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである。さらに好ましい実施形態において、Ｒ_１は、メチルまたはエチルである。最も好ましい実施形態において、Ｒ_１は、メチルである。

本開示の一実施形態において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤が提供され、式中、Ｒ_２は、Ｃ２～Ｃ４アルキルである。さらなる実施形態において、Ｒ_２は、Ｃ３またはＣ４シクロアルキルである。好ましい実施形態において、Ｒ_２は、シクロプロピルである。

本開示の一実施形態において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤が提供され、式中、Ａｒは、フェニルまたは置換フェニルである。さらなる実施形態において、Ａｒは、置換フェニルである。好ましい実施形態において、Ａｒは、２－フルオロ－４－ヨードフェニルである。

本開示の一実施形態において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤が提供され、式中、Ｒ_１は、Ｃ１～Ｃ３アルキルであり、Ｒ_２は、Ｃ２～Ｃ４アルキルであり、Ａｒは、置換フェニルである。

本開示の好ましい実施形態において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤が提供され、式中、Ｒ_１は、メチルまたはエチルであり、Ｒ_２は、Ｃ３またはＣ４シクロアルキルであり、Ａｒは、置換フェニルである。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、本明細書において定義されるような使用のために提供され、ここで、ＭＥＫ阻害剤は、式（ＩＩ）、

またはその医薬適合性のある塩である。

一実施形態において、式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤の使用は；
ａ．エンドセリン－１誘導性収縮を低減すること；
ｂ．増加した収縮性エンドセリンＢ受容体機能を低下させること；および／または
ｃ．誘導性くも膜下出血の後で、回転ポールを横断する対象の能力により評価できる、神経学的スコアを改善すること
のために提供される。

一実施形態において、対象における脳卒中を処置するか、それを発症する危険性を低減する方法が提供され、方法は、それを必要とする対象に、式（Ｉ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
（式中；
Ｒ_１は、メチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ_２は、シクロプロピルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ａｒは、アリール、フェニル、およびヘテロアリールからなる群より選択される）
を投与し、それによって脳卒中を処置するか、それを発症の危険性を低減するステップを含む。

置換基
「アルキル」は、炭素および水素原子からなり、不飽和を含まない、直鎖、分岐、または環状の炭化水素鎖基を指し、直鎖または分岐であり、置換または非置換であり得る。いくらかの好ましい実施形態において、アルキル基は、１～１２個の炭素原子、例えば、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子、４個の炭素原子などの１２個以下の炭素原子からなり得る。代表的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルイソブチル、第３級ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、セプチル、オクチル、ノニルおよびデシルを含むが、これらに限定されない。アルキル部分は、単結合により分子の残りに結合されてよく、例えば、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ－プロピル（Ｐｒ）、１－メチルエチル（イソ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）および３－メチルヘキシル等である。本明細書において特段の記述がない限り、アルキル基は、１つまたは複数の任意の置換可能な置換基により、任意で置換される。アルキル基は、原子価の要件を満たすために、必要に応じて、一価、二価、三価または四価であり得る。

用語「アルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－により例示されるが、これに限定されない、アルキル部分から誘導される二価の基を意味する。

「シクロアルキル」は、具体的には環状部分を含むアルキル基を意味する。代表的なシクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルを含むが、これらに限定されない。

「置換された」は、親部分からの水素原子の置換および別の化学基による置換を意味する。考慮される置換基は、Ｃ１～Ｃ６アルキルなどのアルキル基；Ｃ１～Ｃ６アルコキシなどのアルコキシ基；－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、または－Ｉなどのハロゲン原子；－ＣＮ；－ＮＯ；－ＮＯ_２；－ＳＯ_２Ｈ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＣＯ_２Ｈ；ヒドロキシ；アミノ；チオール；アリール；ヘテロアリール；またはアシルであるが、これらに限定されない。

「アリール」は、非置換および置換アリール基の両方を意味する。

「ヘテロアリール」は、非置換および置換ヘテロアリール基の両方を意味する。

一般的な脳卒中
脳卒中は、少なくとも虚血性疾患および出血性疾患の２つの主要カテゴリに分類できる。虚血性脳卒中は、脳への血液供給の中断により引き起こされ、一方で、出血性脳卒中は、血管の破裂または異常な血管構造の結果である。脳卒中の約８７％は、虚血性であり、残りは、出血性である。本開示によれば、脳卒中は、一過性虚血発作（ＴＩＡ）も含んでよく、または、心停止もしくは他の手段、例えば、心臓の細動による全身血圧の劇的な低下の結果である可能性がある。

本開示の一実施形態において、脳卒中は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、および一過性虚血発作からなる群より選択される。

本開示の一実施形態において、脳卒中は、全虚血および局所虚血からなる群より選択される。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、対象が急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中に罹患しているかが決定される前に、対象に投与される。

虚血性脳卒中
虚血性脳卒中において、脳の一部への血液供給が減少し、その領域における脳組織の機能不全をもたらす。これが発生する主要な理由は、４つある：

１．血栓症（局所的に形成される凝血塊による血管の閉塞）
２．塞栓症（体内の他の場所からの塞栓による閉塞）
３．全身灌流低下（例えば、ショック時の血液供給の一般的な低下）
４．脳静脈洞血栓症。

しかし、脳卒中は、血圧の突然の低下もしくは心停止、大脳動脈もしくは細動脈の破裂、またはそれらの組み合わせの結果でもあり得る。

本開示の一実施形態において、虚血性脳卒中は、頭蓋内損傷としても既知である外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の結果である。

本開示の一実施形態において、虚血性脳卒中は、塞栓症、血栓症、全身灌流低下、脳静脈洞血栓症、血圧の突然の低下もしくは心停止、大脳動脈もしくは細動脈の破裂、またはそれらの組み合わせの結果である。

出血性脳卒中
出血性脳卒中には少なくとも２つの主要なタイプがある：
・「脳内出血、これは基本的に脳自体の中で出血しており（脳内の動脈が破裂し、周囲の組織に血液が溢れる場合）、実質内出血（脳組織内の出血）または脳室内出血（脳室系内の出血）のいずれかに起因する。
・くも膜下出血（ＳＡＨ）、これは基本的に、脳組織の外側であるが依然として頭蓋骨の内側、正確にはくも膜および軟膜（脳を囲む髄膜の３つの層の繊細な最内層）の間で生じる出血であり、通常は大脳動脈の破裂または動脈奇形に起因する。

出血性脳卒中の上記２つの主要なタイプはまた、頭蓋内出血の２つの異なる形状であり、それは頭蓋冠内のいずれかの場所での血液の蓄積である。

出血性脳卒中は、脳アミロイド血管症、脳動静脈奇形および頭蓋内動脈瘤などの、脳内の血管の変化を背景に生じる可能性があり、これは脳実質内またはくも膜下出血を引き起こす可能性がある。

神経学的傷害に加えて、出血性脳卒中は通常、特異的症状を引き起こす（例えば、くも膜下出血は古典的に、雷鳴頭痛として知られる重度の頭痛を引き起こす）か、以前の頭部損傷の証拠を明らかにする。

一実施形態において、本明細書において定義されるようなＭＥＫ阻害剤は、脳内出血、くも膜下出血、またはそれらの組み合わせの結果である出血性脳卒中である、脳卒中の予防または処置における使用のために提供される。

一実施形態において、脳内出血は、脳実質内、脳室内、またはそれらの組み合わせである。

一実施形態において、脳卒中は、くも膜下出血の結果である。

遅発性脳虚血（ＤＣＩ）
遅発性脳虚血は、くも膜下出血後の数日間に生じる可能性があり、最初の出血を生き延びた約１／３の人についての病的状態の潜在的に処置可能な原因である。血管痙攣は従来、くも膜下出血後の数日間の脳虚血の発症に関連しているが、新たに発生している証拠は、遅発性脳虚血がはるかに複雑なくも膜下出血症候群後の一部であることを明らかにしている。遅発性脳虚血の発症は、微小血栓症、灌流ミスマッチおよび神経血管脱共役、伝播性脱分極、および炎症応答を伴う初期細動脈血管痙攣を含み、それらは、出血時に始まり、経時的に進行し、皮質の梗塞に至る。

一実施形態において、本明細書において定義されるようなＭＥＫ阻害剤は、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）の処置または予防において使用される。

一実施形態において、ＤＣＩは、炎症、浮腫、遅発性脳血管痙攣（ＣＶＳ）、血液脳関門破綻、および／または、エンドセリン、アンギオテンシン、セロトニンおよびトロンボキサンまたはプロスタグランジンなどの収縮性受容体発現における増加を呈する。

外科手術および併用療法
一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、投与前に、投与と同時に、または投与に続いて、外科手術なしで対象に投与される。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、血栓切除の前に、血栓切除と同時に、または血栓切除に続いて、対象に投与される。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、血栓溶解の前に、血栓溶解と同時に、または血栓溶解に続いて、対象に投与される。

一実施形態において、本開示のＭＥＫ阻害剤は、コイリングおよびクリッピングからなる群より選択される外科手術手技の前に、外科手術手技と同時に、または外科手術手技に続いて、対象に投与される。

手技「コイリング」または「血管内コイリング」は、動脈瘤（動脈壁の弱くなった領域）からの血流を遮断するために実行される手技である。血管内コイリングは、低侵襲技術であり、それは脳動脈瘤を処置するために頭蓋骨の切開を必要としないことを意味する。むしろ、カテーテルが、脳の動脈瘤に到達するために使用される。血管内コイリング中に、カテーテルが、鼠径部を通って動脈瘤を含む動脈まで通される。プラチナコイルがその後、外される。コイルは、動脈瘤の凝固（塞栓）を誘導し、このようにして、血液が動脈瘤に入るのを防止する。

手技「クリッピング」または「顕微手術クリッピング」は、金属製のクリップを使用して動脈瘤への血液供給を遮断する技術である。その手技は、当業者に周知である。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、神経放射線学的手技の前に、神経放射線学的手技と同時に、または神経放射線学的手技に続いて、対象に投与される。

ほとんどの「神経放射線学的手技」または「インターベンショナル神経放射線学的手技」は、鼠径部に位置する大きな動脈である大腿動脈へのカテーテルの挿入で始まる。長く、可撓性のある中空のチューブであるカテーテルは、ガイドワイヤを超えて大動脈、体、その後、閉塞した脳動脈につながる首の血管に供給する主要な動脈に通される。動脈の画像（血管造影検査としても既知である）がその後、ＣＴ血管造影検査に使用されるものと同様のＸ線造影剤を使用して撮影される。これらの写真は、インターベンショナル神経放射線科医が閉塞部位を特定し、介入を計画することを可能にする。より小さいカテーテル（マイクロカテーテル）をその後、最初のカテーテルに通して配置し、閉塞性凝塊血を通過させる。

凝塊血の除去のための２つの主要なアプローチ：全凝塊血回収（または血栓摘出）および凝塊血吸引、がある。第１の技術において、凝塊血回収装置は、マイクロカテーテルに通して配置され、凝塊血を横切って開かれる。凝塊血を捕捉する装置はその後、除去される。第２の技術である凝塊血吸引は、凝塊血の切片化および吸引を含む。これは、向上した吸引力を与える、従来のマイクロカテーテルよりも大きいカテーテルを使用して実行される。血栓摘出および吸引技術は多くの場合、組み合わせて使用される。これらの機械的アプローチに加えて、多くのインターベンショナル神経放射線科医はまた、血栓を溶解するのを助けるために血栓への局所ＴＰＡ注入を使用する。

本開示の一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、神経放射線学的手技の結果である再灌流傷害を低減または防止する。

虚血再灌流損傷（ＩＲＩ）または再酸素化損傷と呼ばれることもある再灌流損傷は、虚血または酸素不足（無酸素または低酸素）の期間の後に血液供給が組織に戻る（再＋灌流）ときに引き起こされる組織傷害である。虚血期間中の血液からの酸素および栄養素の欠如は、循環の回復が正常な機能の回復よりもむしろ（またはそれに伴う）酸化ストレスの誘導を通じて炎症および酸化的傷害をもたらす、状態を作成する。

一実施形態において、組成物は、式（ＩＩ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩、およびさらなる薬剤を別個にまたは一緒に含んで提供される。

一実施形態において、さらなる薬剤は、ニモジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬、およびクラゾセンタンなどのエンドセリン受容体（ＥＴ）受容体遮断薬からなる群より選択される。

一実施形態において、さらなる薬剤は、カルシウムチャネル遮断薬群から選択される。

一実施形態において、さらなる薬剤は、カルシウムチャネル遮断薬のサブクラスのジヒドロピリジンから選択される。

一実施形態において、さらなる薬剤は、アムロジピン（ノルバスク）、アラニジピン（サプレスタ）、アゼルニジピン（カルブロック）、バルニジピン（ヒポカ）、ベニジピン（コニール）、シルニジピン（アテレック、シナロング、シスカード）、クレビジピン（クレビプレックス）、エホニジピン（ランデル）、フェロジピン（プレンディル）、イスラジピン（ダイナサーク、プレスカール）、ラシジピン（モテンズ、ラシピル）、レルカニジピン（ザニジップ）、マニジピン（カルスロット、マニジピン）、ニカルジピン（カルデン、カルデンＳＲ）、ニフェジピン（プロカルディア、アダラート）、ニルバジピン（ニバジール）、ニモジピン（ニモトップ）、ニソルジピン（バイミカード、スラー、シスコール）、ニトレンジピン（カーディフ、ニトレピン、バイロテンシン）、プラニジピン（アカラス）などのジヒドロピリジンから選択される。

一実施形態において、キットオブパーツが、
本明細書において定義されるようなＭＥＫ阻害剤；および
本明細書において定義されるようなさらなる薬剤；
および任意で使用説明書
を含んで提供され、
ＭＥＫ阻害剤およびさらなる薬剤は、同時または順次使用のために配合される。

組成物および投与
一実施形態において、本発明は、有効量のＭＥＫ阻害剤、さらなる薬剤を含む医薬組成物に関する。

本明細書において開示されるようなＭＥＫ阻害剤は、原料の化学化合物の形状で投与され得るが、有効成分を、任意で生理学的に許容される塩の形状で、１つまたは複数のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝液、希釈剤、および／または他の慣例的な調剤補助剤と一緒に医薬組成物に導入することが好ましい。

一実施形態において、本開示は、本明細書において定義されるようなＭＥＫ阻害剤、またはその医薬適合性のある塩もしくはその誘導体を、そのための１つまたは複数の医薬適合性のある担体、および、任意で、当技術分野において既知であり使用される他の治療剤および／または予防成分と一緒に含む組成物を提供する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合性があり、かつその受容者に対し有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。さらなる実施形態において、本発明は、医薬組成物または本開示による使用のための１つ以上の化合物もしくはプロドラッグ、例えば、本開示による使用のための２つの異なる化合物もしくはプロドラッグを含む組成物を提供する。

本開示の組成物は、経口、直腸、気管支、経鼻、肺内、局所（口腔内および舌下を含む）、経皮、膣内もしくは非経口（皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、脳内、眼内注射もしくは点滴を含む）投与に適したもの、または、粉末および液体エアロゾル投与を含む、吸入または吹送による、または徐放性システムによる投与に適した形状のものであり得る。徐放性システムの適切な例は、本開示の化合物を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、成形品の形状、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルであり得る。別の適切な例は、ナノ粒子である。

一実施形態において、本明細書において定義されるような使用のためのＭＥＫ阻害剤は、経口、くも膜下腔内、腹腔内、眼内、または静脈内で投与される。

一実施形態において、本明細書において定義されるような使用のためのＭＥＫ阻害剤は、経鼻で投与される。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、静脈内で投与される。一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、脳卒中の発症後６時間まで、脳卒中の発症後、例えば、１時間まで、例えば、２時間まで、例えば、３時間まで、例えば、４時間まで、例えば、５時間までに対象に投与される。一実施形態において、処置は、ＭＥＫ阻害剤の初回投与後、脳卒中の発症後最大３日間継続される。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、脳卒中の発症後最大３日間、毎日１回または複数回投与される。

一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、神経保護剤と組み合わせて対象に投与される。ＭＥＫ阻害剤による対象の処置は、脳卒中の発症後１日、２日または３日で中止される可能性があるが、神経保護剤を用いる処置は、継続される。一実施形態において、神経保護処置は、１ヶ月または複数ヶ月継続される。

対象
本開示による対象は、脳卒中に罹患している、または罹患しかかっている任意の対象であり得る。好ましくは、対象は、患者などの、ヒト対象である。一実施形態において、対象は、過去の脳卒中の病歴がないヒト対象である。一実施形態において、ヒト対象は、以前に脳卒中に罹患したことがある。

条項
１．対象における脳卒中の予防または処置における使用のための、式（Ｉ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
（式中；
Ｒ_１は、メチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ_２は、シクロプロピルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ａｒは、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される）。

２．Ｒ_１が、Ｃ１～Ｃ３アルキルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

３．Ｒ_１が、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

４．Ｒ_１が、メチルまたはエチルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

５．Ｒ_１が、メチルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

６．Ｒ_２が、Ｃ２～Ｃ４アルキルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

７．Ｒ_２が、Ｃ３～Ｃ４シクロアルキルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

８．Ｒ_２が、シクロプロピルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

９．Ａｒが、フェニルまたは置換フェニルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

１０．Ａｒが、置換フェニルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

１１．Ａｒが、２－フルオロ－４－ヨードフェニルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

１２．Ｒ_１が、Ｃ１～Ｃ３アルキルであり、Ｒ_２が、Ｃ２～Ｃ４アルキルであり、Ａｒが、置換フェニルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

１３．Ｒ_１が、メチルまたはエチルであり、Ｒ_２が、Ｃ３またはＣ４シクロアルキルであり、Ａｒが、置換フェニルである、上記条項のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。

１４．ＭＥＫ阻害剤が、式（ＩＩ）、

またはその医薬適合性のある塩である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

１５．脳卒中が、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、および一過性虚血発作からなる群より選択される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

１６．脳卒中が、全虚血および局所虚血からなる群より選択される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

１７．虚血性脳卒中が、塞栓症、血栓症、全身灌流低下、脳静脈洞血栓症、血圧の突然の低下もしくは心停止、大脳動脈もしくは細動脈の破裂、またはそれらの組み合わせの結果である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

１８．出血性脳卒中が、脳内出血、くも膜下出血、またはそれらの組み合わせの結果である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

１９．脳内出血が、脳実質内、脳室内、またはそれらの組み合わせである、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２０．脳卒中が、くも膜下出血の結果である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２１．脳卒中が、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２２．脳卒中が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の結果である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２３．ＤＣＩが、炎症、浮腫、遅発性脳血管痙攣（ＣＶＳ）、血液脳関門破綻、および／または、エンドセリン、アンギオテンシン、セロトニンおよびトロンボキサンまたはプロスタグランジンなどの収縮性受容体発現における増加を呈する、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２４．ＭＥＫ阻害剤が、投与前に、投与と同時に、または投与に続いて、外科手術なしで対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２５．ＭＥＫ阻害剤が、血栓切除の前に、血栓切除と同時に、または血栓切除に続いて、対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２６．ＭＥＫ阻害剤が、血栓溶解の前に、血栓溶解と同時に、または血栓溶解に続いて、対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２７．ＭＥＫ阻害剤が、コイリングおよびクリッピングからなる群より選択される外科手術手技の前に、外科手術手技と同時に、または外科手術手技に続いて、対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２８．ＭＥＫ阻害剤が、神経放射線学的手技の前に、神経放射線学的手技と同時に、または神経放射線学的手技に続いて、対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

２９．ＭＥＫ阻害剤が、神経放射線学的手技の結果である再灌流傷害を低減または防止する、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３０．ＭＥＫ阻害剤が、対象が急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中に罹患しているかが決定される前に対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３１．ＭＥＫ阻害剤が、経口、くも膜下腔内、腹腔内、眼内、または静脈内で投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３２．ＭＥＫ阻害剤が、静脈内で投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３３．ＭＥＫ阻害剤が、脳卒中の発症後６時間まで、脳卒中の発症後、例えば、１時間まで、例えば、２時間まで、例えば、３時間まで、例えば、４時間まで、例えば、５時間まで対象に投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３４．ＭＥＫ阻害剤が、脳卒中の発症後最大３日間、毎日１回または複数回投与される、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３５．対象が、ヒト対象である、上記条項のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。

３６．ａ．エンドセリン－１誘導性収縮を低減すること；
ｂ．エンドセリンＢ受容体機能を増加させること；および／または
ｃ．誘導性くも膜下出血の後に、回転ポールを横断する対象の能力により評価できる、神経学的スコアを改善すること
のための、上記条項のいずれか一項において定義されるような式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤の使用。

３７．対象における脳卒中を処置するか、それを発症する危険性を低減する方法であって、それを必要とする対象に式（Ｉ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
（式中；
Ｒ_１は、メチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ_２は、シクロプロピルなどのＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ａｒは、アリール、フェニル、およびヘテロアリールからなる群より選択される）
を投与し、それによって脳卒中を処置するか、それを発症する危険性を低減するステップを含む、方法。

３８．式（ＩＩ）

のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩、およびさらなる薬剤を別個にまたは一緒に含む、組成物。

３９．さらなる薬剤が、ニモジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬、およびクラゾセンタンなどのエンドセリン受容体（ＥＴ）受容体遮断薬からなる群より選択される、上記条項のいずれか一項に記載の組成物。

４０．上記条項のいずれか一項において定義されるようなＭＥＫ阻害剤；および
上記条項のいずれか一項において定義されるようなさらなる薬剤；
および任意で使用説明書
を含み、ＭＥＫ阻害剤およびさらなる薬剤は、同時または順次使用のために配合される、
キットオブパーツ。

実施例
実施例１：臓器培養およびＭＥＫ１／２阻害剤の選択に対する濃度－応答曲線
材料および方法
飼育、収容および倫理
タコニック（デンマーク）から得た１１０匹のスプラーグ－ドーリーラット（ＮＴａｃ：ＳＤ）を、１２／１２時間の明暗周期（照明の開始は午前７時）で維持し、一定温度（２２±２℃）および湿度（５５±１０％）で収容し、食物および水は自由に摂取させた。ラットは一般に、ユーロスタンダードケージ（１２３－蓋を備えたタイプＶＩ）に２～６匹一緒に収容され、外科手術手技後、１匹ずつ収容（１２３－蓋を備えたタイプＩＩＩ）された。５２匹のオススプラーグ－ドーリーラット（２９８～３７０ｇ）が外科手術手技に使用され、デンマークの動物実験検査官（ライセンス番号２０１６－１５－０２０１－００９４０）により承認された。動物の研究は、グロストルプリサーチパーク、リグショスピタレット－グロストルプ、デンマークで実行された。

大脳動脈の採取および臓器培養（エクスビボモデル）
ラットを、Ｏ_２／ＣＯ_２（３０／７０％）で鎮静させ、断頭により屠殺した。脳をゆっくりと取り出し、以下の組成：１１９ｍＭ ＮａＣｌ、４．６ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４，１５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３および５．５ ｍＭグルコース；ｐＨ７．４の冷酸素化緩衝溶液中で冷却した。脳低動脈（ＢＡ）を、生理学的緩衝溶液中の脳から注意深く切断し、続いて、ＯＣ（ナイーブ動物）またはワイヤミオグラフへの直接固定（外科手術手技を受けたラットからの動脈）のいずれかを行った。切片を、阻害剤または媒体（ＤＭＳＯ）と共に、ストレプトマイシンおよびペニシリンを加えたＤＭＥＭ中で、加湿５％Ｏ_２／ＣＯ_２で３７℃にて４８時間インキュベートした。培養培地を、２４時間後に交換した。

ミオグラフ－エクスビボ薬理学（ＯＣおよびインビボ）
収縮性測定のため、インキュベートしたＢＡ（エクスビボ）および外科手術手技後のＢＡ（インビボ）の両方を、切片に切断し、ミオグラフ浴中で一対の金属製ワイヤ（４０μｍ）上に固定した。ＯＣからの動脈を、培地中で４８時間後に同じ方法で固定した。１つのワイヤを、ワイヤ間の距離の微調整を可能にし、血管緊張を制御する、マイクロメータねじに取り付けた。第２のワイヤを、アナログ－デジタルコンバータ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オクスフォード、ＵＫ）と一緒に対にされた力変位変換器に接続した。

切片を、９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２で通気される、ｐＨ７．４、温度設定３７℃の生理学的緩衝液中で平衡化し、ワイヤを、２Ｎｍ^－１での等尺性予張力のために分離した。動脈切片を、緩衝液を６０ｍＭ Ｋ^＋緩衝溶液で交換することにより、６０ｍＭ Ｋ^＋に２回または３回曝露した。等浸透圧を維持するために、比例する量のＮａ^＋を、緩衝液から除去した。絶対カットオフを、外科手術手技を受けたラットからの動脈切片を含めるため、２．０ｍＮ Ｋ^＋ _ｍａｘで設定した。内皮機能を、５－ＨＴ（３・１０^－７Ｍ）、続いてカルバコール（１０^－５Ｍ）の添加で、評価した。ＯＣからの動脈について、プロトコルは以下の通りであった：最初に、サラフォトキシン６Ｃ（Ｓ６ｃ、１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する累積濃度－応答曲線、続いて、エンドセリン－１（ＥＴ－１、１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する濃度－応答曲線。ピークＥＴ－１（１０^－７Ｍ）で、緩衝液を、１０^－７Ｍ ＥＴ－１およびニモジピン（電位依存性Ｃａ^２＋チャネル流入阻害薬のＬ型、１０^－７Ｍ）を含む無Ｃａ^２＋緩衝液に変更した。Ｃａ^２＋（０．０１２５～３ｍＭ）に対する濃度－応答曲線をその後、実行した。血管拡張を調査した際、動脈を、Ｕ４６６１９（１・１０^－７～３・１０^－７Ｍ）またはＫ^＋（４１ｍＭ）で事前収縮させ、累積濃度－応答曲線を、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ、１０^－１２～１０^－７Ｍ）、カルバコール（１０^－１０～１０^－５Ｍ）またはＳＮＰ（１０^－１１～１０^－４Ｍ）を添加することにより実行した。

手術された動物それぞれからの２つの動脈切片を、ＥＴ－１（１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する累積濃度－応答曲線またはニモジピン（１０^－７Ｍ）の存在下でのＥＴ－１事前収縮（１０^－７Ｍ）Ｃａ^２＋濃度－応答曲線（０．０１２５～３ｍＭ）のいずれかのために選択した。カットオフを超える１つのみの曲線があった場合、ＥＴ－１に対する濃度－応答曲線を優先した。最も高いＫ^＋応答を有する切片を一般に、ＥＴ－１に対する濃度－応答曲線に割り当てた。Ｃａ^２＋に対する濃度－応答曲線を、１２５ｍＭの原液から無Ｃａ^２＋緩衝溶液へと、ＣａＣｌ_２の体積を増加させて添加することにより、実行した。無Ｃａ^２＋緩衝溶液は、上記のような類似の組成を有したが、１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２を、０．０３ｍＭ ＥＤＴＡと交換した。

統計およびデータ収集
各切片の収縮性応答を、動脈の長さにしたがって調節し、ｍＮ／ｍｍ（Ｎｍ^－１）として表す。６０ｍＭ Ｋ^＋に対する応答に有意差がなかった場合、収縮性データを、ベースラインからの各血管６０ｍＭ Ｋ^＋ _ｍａｘプラトー応答のパーセンテージとして示す。ＥＴ－１感受性を比較するため、動脈を、各血管ＥＴ－１_ｍａｘのパーセンテージで正規化した。動脈が、最後の濃度が添加された前に最大収縮に到達した場合、曲線を、最大収縮へと収縮した。相対ｌｏｇ ＩＣ_５０／ｌｏｇ ＥＣ_５０は、下側プラトーおよび上側プラトーの推定値間の応答の中間に相当する濃度である。Ｅ_ｍａｘは、濃度応答曲線における最大収縮であり、ＥＴ－１_ｍａｘは、ＥＴ－１に対する最大収縮である。特に明記しない限り、すべての定量的データを、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。

Ｋ^＋および内皮依存性応答を、一元配置分散分析、その後のＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定（全群を相互に比較）により統計的に比較した。濃度－応答曲線を、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いる二元配置反復測定分散分析により統計的に比較し、真球度のためのゲイザー－グリーンハウス補正を、正規化されたＥＴ－１_ｍａｘデータについて使用した。競合曲線適合を、二相ｖｓ．非線形回帰曲線適合、ｌｏｇ（アゴニスト）－可変勾配を比較することにより実行した。すべてのＥＴ－１曲線について、二相性回帰モデルが、最良の曲線適合として認められた。神経学的評価スコアの有意性を、両側フィッシャーの正確確率検定を用いて評価した。統計分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０２ソフトウエアを使用して行い、有意性ｐ値を、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１として定義した。

試薬
Ｓ６ｃは、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｕｐ（スウェーデン）から、ＥＴ－１は、Ｂａｃｈｅｍ（ドイツ）から、ＣＧＲＰは、Ｔｏｃｒｉｓ（ＵＫ）からであった。Ｕ０１２６を除くすべてのＭＥＫ１／２阻害剤を、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから得て、ＤＭＳＯに溶解した。Ｕ０１２６モノエタノレート（Ｕ１２０）、ＤＭＳＯ（シグマＤ２６５０）およびすべての他の化学物質を、シグマ・アルドリッチから得た。

結果
臓器培養（ＯＣ）を、５８８匹のラット（スプラーグ・ドーリーオスラット、約３２０ｇ）から分離されたラット脳底動脈（ＢＡ）に対し実行し、各ＢＡを、４つの切片に分割した。ＭＥＫ１／２阻害剤のパネルを、最初に、現在まで使用されるＵ０１２６の有効性の確立された閾値（１０μＭ）をわずかに下回る、１μＭの濃度で試験した。図１Ａは、６０ｍＭ Ｋ^＋により誘導された収縮に対し、高度に特異的なＥＴ_Ｂアゴニスト、Ｓ６ｃにより誘導された収縮を示す。阻害剤を、４群に分割し、続いて初期スクリーニングを行った。群は、以下の通りであった：Ｉ）１μＭ媒体（ＤＭＳＯ）およびＵ０１２６で効果なし。ＩＩ）いくらかの効果：ビニメチニブ、セルメチニブおよびＲＯ５１２６７６６。ＩＩＩ）境界上の効果：ラファメチニブ。ＩＶ）非常に効果的：コビメチニブ、ＴＡＫ－７３３、トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１。後者の群を、２つの下位群が１μＭで相互に識別できなかったので、無細胞ＩＣ_５０（図９）に基づき２群にさらに分割した。

ＤＭＳＯ（媒体）またはＭＥＫ１／２阻害剤とインキュベートした動脈切片間で脱分極誘導収縮において有意差はなかった（図１Ｂ）。動脈の内皮機能も、調査した。これは、３・１０－７Ｍの５－ＨＴで事前収縮させた動脈に、１０－５Ｍカルバコールを適用することにより試験した。ＤＭＳＯまたはＵ０１２６を用いるＯＣは両方とも、カルバコールに対する低下した内皮応答と関連した（図１Ｃ）。興味深いことに、いくらかの群間で有意差があり、それはＳ６ｃの阻害について観察されたのと同じ傾向にしたがうようである（図１Ａ）。ＭＥＫ１／２阻害剤の３つ、ＴＡＫ－７３３（Ｐ＝０．００６５）、トラメチニブ（Ｐ＝０．００２６）およびＰＤ０３２５９０１（Ｐ＝０．０４７４）は、ＤＭＳＯ媒体と比較して有意に良好な内皮機能を有した。

選択された阻害剤を、特徴づけた。ＩＣ_５０値を、Ｓ６ｃ－誘導収縮の阻害なし～ほぼ最大阻害の範囲の全対数濃度を使用して、６つの選択された候補（Ｓ６ｃに対するＥ_ｍａｘに基づく）について決定した（図２Ａ）。ビニメチニブ（ｐＩＣ_５０５．１７±０．４６）およびＲＯ５１２６７６６（ｐＩＣ_５０５．６８±０．２６）は、図１におけるデータと相関する、最も効力の弱い阻害剤であった。阻害剤に対する濃度－応答曲線を分析する場合、ＴＡＫ－７３３（ｐＩＣ_５０６．８９±０．３１）およびコビメチニブ（ｐＩＣ_５０７．２５±０．５１）は、トラメチニブ（ｐＩＣ_５０７．６８±０．３２）およびＰＤ０３２５９０１（ｐＩＣ_５０７．７１±０．２９）よりも効力が小さいことが明らかであり（図２Ａ）、これは、図１において観察されなかった。

さらに、動脈の脱分極（６０ｍＭ Ｋ^＋）誘導収縮性に対し何らかの影響があるかを調査した（図２Ｂ）。群間で有意差はなく、明らかな濃度依存効果は、観察されなかった。最初の画面（図１Ｃ）は、内皮機能に対するＭＥＫ１／２阻害剤の興味深い効果を示した。図２Ｃは、カルバコールに応答した内皮機能に対するＭＥＫ１／２阻害剤の濃度依存効果を示し、Ｓ６ｃのＥ_ｍａｘについての濃度－応答曲線において観察された阻害剤について同様の傾向を有する（図２Ａ）。

結論
４８時間ＯＣにおいて１０μＭ Ｕ０１２６で処置された脳底動脈が、ＥＴ_Ｂ特異的Ｓ６ｃ誘導収縮性に対し阻害効果を示すことは、既知である。本開示において、１μＭ Ｕ０１２６は、有意な効果を示さなかったが、トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１は１μＭで、４８時間の臓器培養後に収縮性応答をほぼ完全に阻害した（図１Ａ）。ＯＣ実験からのデータは、特異的ＥＴ_ＢアゴニストＳ６ｃを用いて評価した、ＭＥＫ１／２阻害剤とＥＴ_Ｂ受容体の機能的アップレギュレーションの間の強力な関連を示す。無細胞ＩＣ_５０値（図１３）もまた、ＥＴ_Ｂ受容体アップレギュレーションの阻害についてのＩＣ５０値と良く相関する（図２Ａ）。これは、ＭＥＫ１／２阻害剤と脳底動脈における機能的受容体変化の間の関連を裏付ける。

したがって、エクスビボでのＥＴ_Ｂ受容体の機能的アップレギュレーションは、ＭＥＫ１／２を含むシグナル伝達経路を阻害することにより、完全に防止できる。

実施例２：脳底動脈の４８時間の臓器培養後の血管運動を調節する経路に対する強力なＭＥＫ１／２阻害剤の効果
材料および方法
方法を、上記実施例において概説したように実行した。

結果
最も強力なＭＥＫ１／２阻害剤とともにインキュベートした動脈が、保全された内皮機能を示唆したので、この改善の可能な原因をさらに調査した。１μＭのトラメチニブまたはＰＤ０３２５９０１を用いるＯＣ後の動脈を、トロンボキサンＡ２アゴニスト、Ｕ４６６１９（１・１０^－７～３・１０^－７Ｍ）またはＫ^＋（４１ｍＭ）を用いて事前収縮させた。群間の事前収縮のレベルにおいて有意差はなかった。この新規の実験セットにおいて、カルバコールに応答して改善された血管拡張が、確認された（１０^－１０～１０^－５Ｍ、図３Ａ）。カルバコールのこの効果は、改善された内皮のＮＯ放出または血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）におけるＮＯ感受性の変化のいずれかにより引き起こされる可能性がある。図３Ｂに示すように、ＮＯ供与体ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、１０^－１１～１０^－４Ｍ）の添加後のＥ_ｍａｘにおいて有意差があった。これは、ＭＥＫ１／２阻害剤とのインキュベーション後の増加した見かけの内皮機能の原因として、ＶＳＭＣにおけるｃＧＭＰおよびＮＯ感受性シグナル伝達の変化を示唆する。ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの両方が、大脳動脈における血管運動を調節することにおいて重要であるので、ｃＡＭＰの生成に関連するシグナル伝達経路も調査した。ＣＧＲＰに対する応答における差（１０^－１２～１０^－７Ｍ、図３Ｃ）は、観察されなかった。

脳動脈が、脳虚血およびＳＡＨの後にＶＤＣＣ（電位依存性カルシウムチャネル）非依存的収縮を示すことは既知であり、これは、未使用の動脈では提示されない。増強された収縮につながる細胞経路における変化をさらに特徴づけるため、Ｃａ^２＋に対する濃度－応答曲線を、１０^－７Ｍニモジピン（Ｌ型ＶＤＣＣ阻害剤）を含む無Ｃａ^２＋緩衝液中でＥＴ－１を用いて事前収縮させたＢＡにＣａ^２＋を添加することにより、実行した。図３Ｄは、ＢＡのＶＤＣＣ非依存的収縮を示し、ここでトラメチニブのみ（Ｐ＝０．０１９）が、この増加したＶＤＣＣ非依存的収縮を有意に防止した。

結論
非ＳＡＨ大脳動脈または未使用の動脈において、ＶＤＣＣが優勢であり、これはニモジピン（ＳＡＨにおける標準処置）により遮断される可能性がある。本開示において、ＳＡＨおよび４８時間ＯＣで、カルシウムチャネルにおける変化があることが認められる。これらの手順は、非依存型のＶＤＣＣにおける増加された発現をもたらす、すなわち、ニモジピンを用いる標準処置により遮断できない。トラメチニブは、この増加されたＶＤＣＣ非依存的収縮を有意に防止することが認められ、これは（ｉ）カルシウムチャネル発現を正常化し、かつ（ｉｉ）おそらく、対象をニモジピンでの治療に適したものにする。

実施例３：ラットにおけるトラメチニブとＰＤ０３２５９０１の比較
材料および方法
ラットくも膜下出血モデル（インビボモデル）
ラットを、麻酔し、ＳＡＨをシミュレートする自己血の大槽注入のために準備した。シャム手術されたラットは、３００μＬの大槽内血液注射を省略して同じ手順を行った。手順の最後で、ＰｉｎＰｏｒｔ（ＰＮＰ３Ｆ２２、Ｉｎｓｔｅｃｈ、ＵＳ）を、ＩＣＰカテーテルの端に配置して、ＰｉｎＰｏｒｔ注射器（ＰＮＰ－３Ｍ、Ｉｎｓｔｅｃｈ、ＵＳ）によるくも膜下腔内（ｉ．ｔ．）注射可能な処置のためのアクセスを提供した。外科手術後２４時間で、ラットは、鎮痛のためにカルプロフェン（ノロディル、５ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｃａｎｖｅｔ、デンマーク）のｓ．ｃ．注射を受けた。

インビボ治療計画
本開示において使用されるトラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１の濃度および投与量は、この本開示からのエクスビボデータに基づく。すべての処置は、研究を通じて盲検化され、すべての治療計画は、図９で見出される。

くも膜下腔内処置
くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）処置量を、約９０μＬの脳脊髄液（ＣＳＦ）量と推定し（２１）、全投与量を、外科手術手技中に、大槽に配置されたＩＣＰカテーテルでＰｉｎＰｏｒｔを通じて３回の処置（４時間、１０時間および２４時間）として投与した。１回目および３回目の注射を、ラットの固定下で与えた。外科手術後１０時間の処置は１人の研究者により投与されたので、ラットに、ラットの突然の動きを防止するため、フェイスマスクを使用して大気／Ｏ_２（７０％／３０％）中でイソフルラン３．５～４％（１．７５～２％で維持）を用いて、短時間麻酔をかけた。動物に、外科手術直後ならびに１０時間および２４時間の処置と組み合わせて、脱水を回避するために２．５ｍｌの等張食塩水をｓ．ｃ．で与えた。すべてのインビボ処置を、エリオッツＢ（人工ＣＳＦ）：ＮａＣｌ １２５ｍＭ、ＮａＨＣＯ_３ ２３ｍＭ、デキストロース４ｍＭ、ＭｇＳＯ_４ １ｍＭ、ＫＣｌ ４ｍＭ、ＣａＣｌ_２ １ｍＭおよびＮａ_２ＨＰＯ_４ １ｍＭ中の０．５％クレモフォールＥＬ（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＥＬ）に溶解した。

外科手術パラメータ－ｉ．ｔ．群
全４１匹のラットにおいて、平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）、ｐＨ、ｐＣＯ_２、ｐＯ_２、ＩＣＰ（１３８．４±６．９ｍｍＨｇ）および温度は、外科手術中、許容可能な生理学的限界内であった。ＳＡＨ＋媒体群においてＳＡＨ後２４時間に、外科手術後の死亡の一例があった。

結果
ＳＡＨのラットモデルに対するＯＣ研究で同定された２つの最も強力なＭＥＫ１／２阻害剤を、さらに調査した。トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１は、最も高い効力を有し、それらがおそらく、現在の選択薬であるＵ０１２６よりもより少量で適用され得ることを意味する。ラットのＣＳＦ量（９０μＬであると推定）への１μＭ、１５μＬのｉ．ｔ．注射に続いて、希釈後の約１０^－７ＭのＣＳＦ濃度を、予測した。これは、エクスビボＯＣ研究で推定される７５％阻害剤効果に相当する（図２Ａ）。

結論
トラメチニブは、高い効力を有すると見出され、それが現在の選択薬Ｕ０１２６よりもより低い投与量で適用できることを示唆した。第１選択薬Ｕ０１２６は、インビボくも膜下腔内で同様の好都合な効果を有すると見出されたが、その貧溶解性のために、この薬剤を全身投与に変えることは不可能であった。トラメチニブは、優れた溶解性および効力を有すると見出され、このことは、それがより少量で使用でき、依然として好都合な抗ＳＡＨパラメータを示しながら全身的使用を可能にすることを示す。

実施例４：６０ｍＭ Ｋ^＋への収縮性応答に対するおよび内皮機能に対するｉ．ｔ．トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果
材料および方法
方法を、上記実施例において概説したように実行した。

結果
６０ｍＭ Ｋ^＋への全ＢＡ（カットオフ未満の血管を含む）の収縮性応答（Ｎｍ^－１）は、シャム＋ｉ．ｔ．媒体群（３．３０±０．４５Ｎｍ^－１）およびＳＡＨ＋ｉ．ｔ．媒体群（３．４５±０．２２Ｎｍ^－１）の両方と比較して、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブ群（５．００±０．２９Ｎｍ^－１）において有意に高い収縮性応答を示した（図４Ａ）。個々の切片の長さ（０．９～１．２ｍｍの範囲；１．０±０．１ｍｍ）は、群間で有意差がなかった。ＳＡＨ群は、他の群と比較してわずかに平均より低い内皮機能を有したが、有意差はなかった（ＳＡＨ ｖｓ．ｉ．ｔ．トラメチニブ、Ｐ＝０．１３８２）（図４Ｂ）。

結論
Ｕ０１２６よりも高い効力を有するＭＥＫ１／２阻害剤の使用は、見かけの内皮機能の濃度依存的保全を可能にする（図２Ｃ）。類似のパターンが、内皮機能および収縮性ＥＴ_Ｂ受容体の機能的アップレギュレーションの両方について観察された（図２Ａ）。そのため、ＭＥＫ１／２経路は、動脈を通る血流の減少に応答する内皮およびＶＳＭＣシグナル伝達の破壊に関与しているように見える。これは、ＣＧＲＰにより例示されるニューロンの血管拡張シグナル伝達とは対照的であり、変化は観察されなかった（図３Ｃ）。比較的高い変動性のために、有意な変化は、インビボでトラメチニブでもＰＤ０３２５９０１でも処置されなかった動物の内皮機能において観察されなかった。しかし、両方の群は、ＳＡＨ群およびＳＡＨ＋ｉ．ｔ．媒体群よりもより高い平均値を有した（図４Ｂ）。

ＥＴ_Ｂ受容体収縮性および見かけの内皮機能に対するトラメチニブまたはＰＤ０３２５９０１の効果とは対照的に、ＯＣ後のＫ^＋応答に対する阻害剤の濃度依存的効果は、観察されなかった（図２Ｂ）。しかし、ｉ．ｔ．トラメチニブ（ｉ．ｔ．ＰＤ０３２５９０１ではない）で処置されたラットは、実験的ＳＡＨの後、ｉ．ｔ．媒体での処置と比較してより高いＫ^＋応答を示した（図４Ａ）。ｉ．ｔ．トラメチニブまたはｉ．ｔ．ＰＤ０３２５９０１とインキュベートした血管は、ＯＣモデルにおいて試験された化合物の上限でＫ^＋応答を有した（図１Ｂ）。

実施例５：ＥＴ－１への収縮性応答に対するｉ．ｔ．トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果
材料および方法
方法を、上記実施例において概説したように実行した。

結果
Ｋ^＋応答が異なっていたので、非正規化データを、最初に使用した。全治療計画からのＢＡ（図９）を、ＥＴ－１（１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する累積濃度－応答曲線により比較した。曲線間の有意差は、観察されなかった（図５Ａ）。動脈のＥＴ－１感受性を、それら自身のＥＴ－１_ｍａｘに対して曲線を正規化することにより調査した。ＥＴ－１_ｍａｘ正規化データについて、低ＥＴ－１濃度（１０^{－１２．５}～１０^{－１１．０}Ｍ）での収縮は、ＳＡＨ＋媒体群と比較して、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブ群において有意に低下した（図５Ｂ）。競合曲線適合を、二相ｖｓ．４パラメータ可変勾配回帰を比較することにより実行した。全群について、二相性回帰モデルは、最良の曲線適合として許容された（図１０）。ＳＡＨ群についてのｌｏｇＥＣ_{５０（１）}９５％信頼区間（ＣＩ）（－１２．７４～－１２．１７）は、シャム＋ｉ．ｔ．媒体群（－１１．９１～－１０．０７）およびＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブ群（－１１．０４～－９．９３６）と比較して有意に高い感受性を有した。ｌｏｇＥＣ_{５０（２）}で、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブ群（－８．９６４～－８．８６２）は、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．媒体群（－９．２２８～－９．０５０）よりも有意に低い感受性であった。ｌｏｇＥＣ_{５０（１）}値およびｌｏｇＥＣ_{５０（２）}値は、絶対曲線（Ｎｍ^－１）およびＥＴ－１_ｍａｘ正規化曲線の両方について類似であった（図５Ａおよび図５Ｂ）。ｌｏｇＥＣ_{５０（１）}値、ｌｏｇＥＣ_{５０（２）}値および９５％ＣＩ値はすべて、図１０に見出される。

結論
ＳＡＨは、疾患の特徴である、ＥＴ－１に対する増加された感受性をもたらす。ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブは、ＥＴ－１に対しＳＡＨ＋ｉ．ｔ．媒体群よりも感受性が有意に低いと見出された。したがって、トラメチニブは、ＳＡＨ後のエンドセリン受容体の有害なアップレギュレーションを効果的に停止できた。

実施例６：ＶＤＣＣ非依存的カルシウムイオン収縮に対するｉ．ｔ．トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果
材料および方法
方法を、上記実施例において概説したように実行した。

結果
インビボ処置が、ＶＤＣＣ非依存的収縮性に影響するかを調査するため、ＥＴ－１（１０^－７Ｍ）予備収縮ＢＡでおよび１０^－７Ｍのニモジピンの存在下でのＣａ^２＋（０．０１２５～３ｍＭ）に対する累積濃度－応答曲線を、実行した。ＳＡＨ群（２．８±０．５Ｎｍ^－１）は、シャム＋ｉ．ｔ．媒体群（０．６±１．２Ｎｍ－１）、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．媒体群（１．２±０．２Ｎｍ^－１）およびＳＡＨ＋ｉ．ｔ．ＰＤ０３２５９０１群（１．０±０．３Ｎｍ^－１）と比較して、有意に高いニモジピン非感受性ＥＴ－１_ｍａｘ収縮を有したが、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブ群（１．８±０．５Ｎｍ^－１）および対照群の間で有意差はなかった（図６）。

結論
ＳＡＨは、高い度合いのニモジピン非感受性カルシウムチャネル応答をもたらした。トラメチニブ処置は、対照と同様のレベルにＶＤＣＣ非依存的収縮を正常化した。

実施例７：ｉ．ｔ．トラメチニブおよびＰＤ０３２５９０１処置の効果の神経学的評価
材料および方法
神経学的評価－回転ポール試験
総感覚運動機能を、ＳＡＨの誘導前日のベースライン評価を含む、回転ポール試験を使用して評価した。簡単に言うと、１０ｒｐｍの回転ポール（径４５ｍｍ、長さ１５０ｃｍ）を横断する動きを、末端でラット自身の床敷材（「家のような臭い」）を含むケージを用いて評価した。ラットの能力を、以下の定義にしたがって採点した：低、動物は落下せずにポールを横断できない；高、動物は落下することなくポール全体を横断できる。すべての動物を、外科手術前にポールを横断するように訓練した。ＳＡＨ前ならびに外科手術後１日目および２日目に、各動物を、左回転および右回転についてそれぞれ２回、すなわち動物１匹あたり４カウントで、採点した。動物を、動物の実験群を知らされていない職員により評価した。データを、％高スコアカウント／合計スコアカウントとしてパーセンテージで示す。

結果
本明細書において実行された回転ポール試験は、事前にラットの訓練が必要なため、純粋な運動機能試験ではない。学習の側面に加えて、ポールが回転しているということもまた、成功の要因であるモチベーションにつながる。そのため、記憶、動機付けおよび注意力を、成功スコアに含める。ラットを、３つの時点：ＳＡＨ前、ＳＡＨ後２４時間および４８時間で採点した（データを、％高スコアカウント／合計スコアカウントとして示す）。

すべてのラットは、外科手術前の回転ポール試験において１００％を得た（図７Ａ）。神経学的スコア不足は、シャム＋ｉ．ｔ．媒体群を除いて、ＳＡＨ後２４時間とＳＡＨ前を比較したすべての群について確認された（図７Ａ～Ｃ、図１２）。実験的ＳＡＨの後のラットは、ＳＡＨ前と比較した場合、４８時間後に有意に劣化された神経学的スコアを示した（前のスコア１００％に対し４８時間のスコア７５％、Ｐ＝０．００２２）。４８時間のエンドポイントで、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．トラメチニブ（４８時間のスコア９６％）、シャム＋ｉ．ｔ．媒体（４８時間のスコア１００％）およびＳＡＨ＋ｉ．ｔ．媒体（４８時間のスコア９４％）の群におけるラットは、ＳＡＨ群（４８時間のスコア７５％）におけるラットよりも有意に高い神経学的スコアを有した（図７Ｃ）。すべてのスコアパーセンテージについては図１２を参照されたい。

結論
改善された神経学的評価スコア（回転ポール試験）は、トラメチニブについて観察されたが、薬物動態学的に不安定なＰＤ０３２５９０１では観察されず、これは、ＳＡＨに続くＶＳＭＣで観察された表現型調節におけるＭＥＫ１／２経路の関与を裏付ける。

実施例８：６０ｍＭ Ｋ^＋、ＥＴ－１への収縮性応答に対するｉ．ｐ．トラメチニブ処置の効果および神経学的評価
材料および方法
腹腔内処置
腹腔内処置（ｉ．ｐ．）のために、化合物を、媒体としても機能するＮａＣｌ中の１０％クレモフォールＥＬ（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＥＬ）および１０％ＰＥＧ４００に溶解した。全投与量を、２回の処置（６時間および２４時間）として投与した。動物に、外科手術直後および処置と組み合わせて、脱水を回避するために２．５ｍｌの等張食塩水をｓ．ｃ．で与えた。

外科手術パラメータ－ｉ．ｐ．群
全１１匹のラットにおいて、平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）、ｐＨ、ｐＣＯ_２、ｐＯ_２、ＩＣＰ（１２４．２±６．３ｍｍＨｇ）および温度は、外科手術中、許容可能な生理学的限界内であった。

結果
ｉ．ｔ．概念実証研究からさらに進んで、トラメチニブを、ｉ．ｐ．注射処置プロトコルを使用して試験した。動物を、ＳＡＨに曝露し、ＳＡＨ後６時間および２４時間で、トラメチニブまたは媒体のｉ．ｐ．注射で処置した。誘導実験的ＳＡＨの後４８時間で、動脈を、ワイヤミオグラフのために分離した。個々の切片の長さ（０．９～１．２ｍｍの範囲；１．１３±０．０２ｍｍ）は、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体またはＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブの間で有意に異ならなかった。６０ｍＭ Ｋ^＋に対する全ＢＡの収縮性応答（Ｎｍ^－１）は、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブ群（３．０３±０．１９Ｎｍ－１）をＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体群（３．２３±０．２７Ｎｍ^－１）と比較した場合、差異を全く示さなかった（図８Ａ）。これは、ＳＡＨ＋ｉ．ｔ．処置とは対照的である（図４Ａ）。

ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブ群およびＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体群を、ＥＴ－１（１０^－１４～１０^－７Ｍ）に対する累積濃度－応答曲線により比較した。ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体群と比較して、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブ群について収縮性における有意な低下（１０^－９．５Ｍで）があった。競合曲線適合を、二相ｖｓ．４パラメータ可変勾配回帰を比較することにより実行した。両群について、二相性回帰モデルは、最良の曲線適合として受け入れられ、ｌｏｇＥＣ_{５０（１）}値、ｌｏｇＥＣ_{５０（２）}値および９５％ＣＩ値は、図１０に見出される。同じ動物を、回転ポール試験により神経学的損失について評価した（図８Ｃ／Ｄ）。ラットを、２つの時点：ＳＡＨ後２４時間および４８時間で採点した（データを、％高スコアカウント／合計スコアカウントとして示す）。４８時間のエンドポイントで、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブにおけるラット（４８時間のスコア１００％）は、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体（４８時間のスコア７１％）よりも有意により良く得点した（ｐ＝０．０１４３）。すべてのスコアパーセンテージについては図１２を参照されたい。

結論
ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブラットについて収縮性における有意な低下が、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．媒体群と比較して見出された。ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．トラメチニブでのラットは、回転ポール試験で、ＳＡＨ＋ｉ．ｐ．よりも有意により良く得点した。

実施例９：メスラットにおけるくも膜下出血の亜急性期の効果
材料および方法
動物
メスのスプラーグ－ドーリーラット（ＮＴａｃ：ＳＤ、タコニック・デンマーク）を、毎日１２時間明／１２時間暗のリズムで、一定温度（２２±２℃）および湿度（５５±１０％）で維持し、標準の固形飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ、Ｓｃａｎｂｕｒ、デンマーク）および水を自由に摂取させた。ラットを一般に、ユーロスタンダードケージ（１２３－蓋を備えたタイプＶＩ）に２～６匹一緒に収容し、外科手術手技後、１匹ずつ収容（１２３－蓋を備えたタイプＩＩＩ）した。すべてのラットを、実験前に、５～７週間順応させた。

膣スミア－発情周期の決定
ＳＡＨ外科出術前の２週間、各ラットの発情周期を、存在する細胞の種類の顕微鏡的特徴づけのため膣スミアの回収により毎日監視した。エストロゲンレベルの変動による潜在的な実験の変動を最小限にするために、発情前のメスラットを、研究から除外した。

ＳＡＨの実験モデル
すべての手順は、国内法およびガイドラインの範囲内で厳密に実行され、デンマークの動物実験検査官（ライセンス番号２０１６－１５－０２０１－００９４０）により認証された。

ＳＡＨを、オスラットに関して誘導した。メススプラーグ－ドーリーラットラット（２３０～３００ｇ、１４～１７週齢）を、Ｈｙｐｎｏｒｍ／ミダゾラムの混合物（Ｈｙｐｎｏｒｍ（フェンタニルクエン酸（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、フルアニソン（５．０ｍｇ／ｋｇ）およびミダゾラム（ハーメルンファーマ、ドイツ）（２．０ｍｇ／ｋｇ）の混合物０．２５ｍｌ／ｋｇ）の皮下（ｓ．ｃ）投与またはケタミン／はキシラジンの混合物（ケタミン（ＭＳＤアニマルヘルス）（１００ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（ＫＶＰファーマ、ドイツ）（２０ｍｇ／ｍｌ）の３：２混合物１．５ｍｌ／ｋｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ）投与のいずれかにより麻酔し、その後、挿管して３０％Ｏ_２および７０％大気で換気した。血液試料を、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８０ ＦＬＥＸ、ラジオメーター、デンマーク）中で定期的に分析した（ＰａＯ_２、ＰａＣＯ_２およびｐＨ）。体温を、調節された加熱パッド（ＴＣ－１０００、ＣＷＥ社、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて３７℃±０．５℃で維持した。ＭＡＢＰおよびＩＣＰを、それぞれ尾動脈および大槽に挿入され、圧力トランスデューサおよびＰｏｗｅｒｌａｂユニットに接続されたカテーテルを介して連続的に測定し、ＬａｂＣｈａｒｔソフトウエアにより記録した（両方ともＡＤインスツルメンツ、オックスフォード、ＵＫから）。レーザ－ドップラ血流計プローブ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ、ＵＫ）を、ブレグマから４ｍｍ前方で、正中線の３ｍｍ右方向にドリルで開けられた頭蓋骨の穴に通して硬膜に配置した（手順中に生理食塩水灌漑により定期的に冷却した）。正中線でブレグマから６．５ｍｍ前方にドリルで開けられた２番目の穴に通して、２５Ｇ Ｓｐｉｎｏｃａｎ（登録商標）カニューレ（ＲＥＦ：４５０５９０５、ビー・ブラウン・メルズンゲンＡＧ、ドイツ）を、視交叉のすぐ前方の先端の最終位置に向かって垂直面に対し３０°の角度で定位的に下降させた。平衡化の１０分後に、２５０μＬまたは３００μＬの血液を、尾カテーテルから引き出し、カニューレを通して手動で注入した。血液注入の圧力および速度を、ＩＣＰをすべての動物の平均ＭＡＢＰレベルのより高い範囲（約１５０ｍｍＨｇ）まで上げることを目的として、手動で制御し、同時に、注入速度を、ＣＢＦにおける急激で長期的な低下を生じるように制御した。続いて、ラットを、さらに３０分間麻酔下で維持した。手順の最後に、ＩＣＰカテーテルの先端を、ＩＣＰの後の測定のために、ＰｉｎＰｏｒｔ（ＰＮＰ３Ｆ２２、Ｉｎｓｔｅｃｈ、ＵＳ）でシールし、尾カテーテル、ニードルおよびレーザ－ドップラプローブを、注意深く取り出し、切開を、閉じた。ラットをその後、活性化し、抜管した。外科手術終了時およびその後１日１回、ラットに、カルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ、Ｓｃａｎ Ｖｅｔ、デンマーク）および２．５ｍＬの等張食塩水を皮下注射した。シャム手術されたラットは、カニューレが下降されず、かつ視交叉に血液が注入されなかったことを除いて、同じ手順を経た。ラットを、外科手術後２日で断頭による安楽死まで、単一のケージで維持した。

実験群
予備研究において、ＳＡＨを、２５０μＬの自己血を前視交叉槽に注入することにより、メスラットにおいて誘導し、脳底動脈（ＢＡ）および中大脳動脈（ＭＣＡ）の収縮性応答を、ミオグラフィーにより評価した（ｎ＝１２、７のＳＡＨおよび５のシャム手術）。実際の研究のための実験において、メスラットに、３００μＬの自己血を注入した。シャム手術されたラットは、対照として機能した（ｎ＝３４、１８のＳＡＨおよび１６のシャム手術）。ラットを、ＳＡＨまたはシャム群のいずれかに無作為に分割した。４６匹のラットの総数を、研究に利用した。

神経学的試験
ａ）回転ポール試験
総感覚運動機能を、異なる速度（３または１０ｒｐｍ）での回転ポール試験を使用して評価した。ポール（径４５ｍｍ、長さ１５０ｃｍ）の一端で、ケージを、入口穴をポールに面して配置した。ケージの床は、試験されているラットのホームケージからの寝具材料で覆われる。ラットの能力を、以下にしたがって採点した：スコア１、動物は、ポールでバランスをとることができず、すぐに落ちる；スコア２、動物はポール上でバランスをとるが、ポールを横切るのが非常に困難であり、＜３０ｃｍ移動する；スコア３、動物は、足でポールを抱き、ポールの端には到達しないが、なんとか＞３０ｃｍ動く；スコア４、動物は、ポールを横断するが、ポールを前足で抱きしめる、および／または後足でジャンプする；スコア５、動物は、通常の姿勢でポールを横断するが、＞３フィートのスリップがある；ならびに、スコア６、動物は、＜３フィートのスリップでポールを完全に横断する。外科手術前に、すべての動物を、スコア５または６に達するまで訓練する。外科手術後１日目および２日目に、各動物を、静止ポールで２回、各回転速度で４回、左への回転で２回および右への回転で２回試験した。

ｂ）行動観察
ラットを、１日１回観察し、それらの行動を、集められた以下のパラメータにしたがって採点した：体温、身体姿勢（腰部または猫背）、眼（閉じている、乾燥または充血）、毛皮（汚れまたは立毛）、糞便（乾燥またはなし）、ラットの鳴き声（ラットを扱うとき）、鳴き声感応性（活動過多）、気質（受動性、能動性）、運動、バランスおよび耳（白色）。全１１の観察を、以下のように採点した：正常状態＝０、中程度の状態＝１および不良状態＝２。各群についての平均スコアを、観察の各日について算出した。

大脳動脈の回収
ラットは、外科手術を受けた２日後、ＣＯ_２鎮静下で断頭された。脳を、迅速に取り出し、冷重炭酸塩緩衝溶液中で冷却した。脳底動脈（ＢＡ）および中大脳動脈（ＭＣＡ）を、注意深く脳から切断した。収縮性の測定のために、ＢＡおよびＭＣＡを、１～１．５ｍｍ長の円筒形切片に切断し、ワイヤミオグラフに固定した。

インビトロ薬理学
大脳動脈の収縮性応答の測定のため、ミオグラフ（Ｄａｎｉｓｈ Ｍｙｏｇｒａｐｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓ、デンマーク）を使用して、分離された動脈の切片における等尺性張力を記録した。血管切片を、ワイヤミオグラフセットアップにおいて、２つの径４０μｍのステンレス鋼ワイヤに固定した。切片をその後、以下の組成（ｍｍｏｌ／Ｌ）：ＮａＣｌ １１９、ＮａＨＣＯ_３ １５、ＫＣｌ ４．６、ＭｇＣｌ_２ １．２、ＮａＨ_２ＰＯ_４ １．２、ＣａＣｌ_２ １．５、およびグルコース５．５、の温度制御された重炭酸塩緩衝溶液（３７℃）に浸した。緩衝液を、ｐＨ７．４を維持しながら、Ｏ_２中の５％ＣＯ_２で継続的に通気する。血管切片を、以前に最適であると認められたように３段プロセスで最適なプレテンション（２ｍＮ）に引き伸ばし、その後、約２０～３０分間この張力で平衡化させる。血管をその後、上述した等張重炭酸塩緩衝溶液中のＫＣｌで５９．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを部分的に置換することにより得られた６０ｍＭ Ｋ^＋を含む重炭酸塩緩衝液に曝露した。Ｋ^＋誘発収縮性応答を、アゴニスト誘導応答の正規化のための参照値として、また、血管の脱分極誘導収縮能力を評価するために使用した。それぞれ＞２ｍＮおよび＞０．８ｍＮのＫ^＋誘導収縮性応答を有するＢＡおよびＭＣＡのみを、さらなる評価に使用した。血管切片中の機能的内皮の存在を、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）（シグマ－アルドリッチ、Ｈ９５２３）（３×１０^－７Ｍ）を用いる事前収縮、続いてカルバコール（シグマ－アルドリッチ、Ｃ４３８２）（１０^－５Ｍ）を用いる弛緩により評価した。コリン作動性受容体アゴニストであるカルバコールに対する弛緩応答は、機能的内皮の示唆とみなされる。濃度－応答曲線を、１０^－１４～１０^－７Ｍの濃度範囲において、エンドセリン受容体の天然リガンド（ＥＴ_Ａ／ＥＴ_Ｂ）、ＥＴ－１（Ｂａｃｈｅｍ、４０４０２５４）の累積的適用により得た。同様に、５－カルボキサミドトリプタミン（５－ＣＴ）（シグマ－アルドリッチ、Ｃ１１７）、５－ＨＴ_１Ｂ／５－ＨＴ_１Ｄアゴニストに対する濃度－応答曲線を、１０^－１２～１０^－５Ｍの濃度範囲において、５－ＣＴの累積的適用により得た。

頭蓋内圧測定
ＩＣＰ記録を、ラットにおける連続リアルタイムＩＣＰ測定用に開発された、新規液体充填密封ＰｉｎＰｏｒｔシステムを使用して、外科手術後１日および２日に実行した。大槽カテーテルの密封ＰｉｎＰｏｒｔ（ＰＮＰ３Ｆ２２、Ｉｎｓｔｅｃｈ、ＵＳ）を、ＰｉｎＰｏｒｔインジェクタ（ＰＮＰ－３Ｍ、Ｉｎｓｔｅｃｈ、ＵＳ）を有する液体充填管を介して、圧力トランスデューサに接続した。圧力トランスデューサを、ｐｏｗｅｒ ｌａｂと接続し、ＩＣＰを、ＬａｂＣｈａｒｔソフトウエア（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オックスフォード、ＵＫ）により記録した。動きにより影響されない測定を得るため、ラットを、ＩＣＰ記録の１５分前に０．５ｍＬ／ｋｇミダゾラム（２．０ｍｇ／ｋｇ）を用いて鎮静させ、続いて１５分間、ＩＣＰを記録し、その後、ＰｉｎＰｏｒｔインジェクタを取り除き、ラットを動物施設に戻した。

脳浮腫の評価
断頭術後、脳を、迅速に取り出し、氷冷重炭酸塩緩衝溶液に入れた。脳を、小脳のない２つの無傷の大脳半球に分割した。各半球を、脳浮腫形成の局所的決定のために以下の領域；線条体、海馬および皮質にさらに分割した。脳浮腫を、乾湿比（ＷＤＲ）を比較することにより評価した。組織を、０．１ｍｇ以内の目盛りで秤量した（湿重量（ｗｗ））。脳の乾燥重量（ｄｗ）を、乾燥オーブン中１１０℃で２４時間組織を加熱した後、測定した。組織の水分含量をその後、以下の式：（ｗｗ－ｄｗ／ｗｗ）×１００％を用いて、脳中の水分含量の％として算出した。

統計およびデータ解析
データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表され、ｎは、ラットの数を指す。インビトロ薬理学的研究について、収縮性応答は、ベースラインから最大６０ｍＭ Ｋ^＋誘導収縮のパーセンテージとして表される。Ｅ_ｍａｘ値は、アゴニストにより誘発された最大収縮性応答を表し、ｐＥＣ_５０は、最大応答の半分を誘発する薬剤濃度の負の対数である。二相性応答について、Ｅ_ｍａｘ１およびｐＥＣ_{５０ １}は、高親和性相を表し、Ｅ_ｍａｘ２およびｐＥＣ_{５０ ２}は、低親和性相を表す。濃度－応答曲線、回転ポールおよびＩＣＰ測定の間の統計的差異を、ボンフェローニ後検定を用いる二元配置分散分析を使用して分析した。２つの異なる観察／時点を比較する場合、統計的差異を、独立ｔ検定を使用して調査した。Ｇｒａｐｈｐａｄ５．１ソフトウエアを、統計分析およびデータ表示のために使用した。有意性ｐ値を、＊：Ｐ＝（＜０．０５）、＊＊：Ｐ＝（＜０．０１）、＊＊＊：Ｐ＝（＜０．００１）として定義した。

結果
外科手術、膣スミアおよび生理学的パラメータ
すべてのラットは、研究を生き延びた。２匹のラットは、外科手術当日でのホルモン状態（高レベルのエストロゲンを有する発情前のラット）により研究から除外された。膣スミアの毎日の評価は、外科手術当日に、残りのラットがシャムおよびＳＡＨ群の間の周期のステージ（発情後期、発情間期、発情期）に対して無作為に分割されたことを確認した。予備研究（２５０μＬの自己血注射、データを示さず）でも、主研究（３００μＬの血液注射、図１４）でも、ＳＡＨおよびシャム手術されたラットを比較して、生理学的パラメータ（重量、ＭＡＢＰ、ｐＨ、ｐＯ_２またはｐＣＯ_２）における有意差はなかった。血液注射の結果として、皮質血流は、３００μＬの自己血を受けたメスラットにおいて安静時血流の１６．２４±６％に低下した（図１５）。

予備研究（２５０μＬの血液を受けたメスラット）
シャムと比較して２５０μＬの自己血を受けたメスラットにおいてＳＡＨ後２日で部分的に増加した脳血管収縮
シャムおよびＳＡＨ手術されたラットからの動脈切片（ＢＡおよびＭＣＡ）を比較して、６０ｍＭ Ｋ^＋濃縮緩衝液を用いる脱分極誘導収縮における差異はなかった（図１６）。同様に、シャムおよびＳＡＨからの動脈切片（ＢＡおよびＭＣＡ）を比較して、５－ＨＴ事前収縮血管におけるアセチルコリン誘導性弛緩により研究された内皮媒介拡張における差異はなかった。オスＳＡＨ誘導ラットからの動脈切片は二相性曲線への移行を伴うＥＴ－１濃度－収縮曲線の左方向へのシフトをもたらし、一方でシャム手術されたオスラットについてのＥＴ－１濃度－収縮曲線はＳ字状であることが、以前に示されている。オスラットにおけるＳＡＨ後の二相性曲線は、既に存在する収縮性ＥＴ_Ａ受容体に加えて、ＶＳＭＣにおける収縮性ＥＴ_Ｂ受容体の発生を反映する。メスラットにおける２５０μｌの自己血を注射することによるＳＡＨ誘導を用いる予備研究において、ＥＴ－１は、それぞれＳＡＨ誘導ラットおよびシャム手術されたラットからのＢＡおよびＭＣＡ切片の両方においてＳ字曲線を誘導した。しかし、ＳＡＨに供されたメスラットからのＢＡおよびＭＣＡは、シャムと比較して左方向へのシフトおよびＥＴ－１に対する有意に増加された感受性をもたらした（図１６）。メスＳＡＨラットからのＭＣＡ切片において、シャムと比較して５－ＣＴ濃度－収縮曲線の有意な左方向へのシフトが観察され、したがって、ＢＡにおいて、ＳＡＨおよびシャムラットの間の５－ＣＴ誘導性収縮における明らかな差異はなかった（図１６）。

主研究（３００μＬの血液を受けたメスラット）
予備研究は、２５０μＬの血液を大槽内に受け取った、ＳＡＨに供されたメスラットが、大脳動脈においてＥＴ－１および５－ＣＴに対する増加した血管収縮を誘導したことを示した。しかし、ＥＴ－１誘導濃度－応答曲線における二相性曲線への移行の欠如、データの高いばらつきおよびシャムおよびＳＡＨを比較した場合のＢＡにおける５－ＣＴ誘導収縮に差異がないことにより、注射された血液の量が増加し、より大きなＳＡＨ誘導損傷をもたらした。そのため、提示された以下の結果（主研究）において、ＳＡＨに供されたすべてのラットは、大槽内に３００μＬの自己血を受けた。

メスラットにおけるＳＡＨ後の低下された一般的な健康状態および感覚運動認知
ＳＡＨがメスラットにおける神経学的損失を誘導するかどうかを評価するため、ラットの一般的な健康状態の観察および回転ポール試験の２つの異なる試験を、使用した。図１ａにおいて示されるように、ＳＡＨは、シャムと比較して、１日目および２日目の両方で、一般的な健康状態のスコアにおける有意な低下をもたらした。さらに、ＳＡＨに供されたメスラットは、それらが木製ポールを横断したとき、回転がないか、回転の２つの異なる速度であるかに関わらず、有意に損なわれたバランスおよび動きを示した。感覚運動障害は、シャムと比較してメスラットにおいてＳＡＨ後１日目および２日目で重大であった。

シャムと比較したメスラットにおけるＳＡＨ後の亜急性期の上昇された頭蓋内圧
頭蓋内圧は、外科手術の当日、シャム手術されたラットにおいて４．０±０．２ｍｍＨｇであり、ＩＣＰは、シャム手術後１日または２日で、有意に変化しなかった（図１５）。ＳＡＨ前の実験用ラットにおいて、ＩＣＰは、４．１±０．３ｍｍＨｇであった。ＩＣＰはその後、ＳＡＨ誘導時に平均１４９±１１．５ｍｍＨｇに一時的に増加し、ＳＡＨ後３０分で７．１±０．８ｍｍＨｇであった（図１５）。メスラットの平均ＩＣＰは、シャムと比較してＳＡＨ後１日目および２日目の両方で、有意に増加した。

メスＳＡＨラットにおいて、ＩＣＰは、外科手術後１日目に、ＳＡＨ前レベルと比較してすべてのラットにおいて増加し、一方で２日目に、ＩＣＰは、１日目のレベルに対して、さらに増加した（４匹／９匹のラット）か、低下した（５匹／９匹のラット）。しかし、ＳＡＨ後２日目にＩＣＰが低下したラットにおいて、ＩＣＰは、１匹を除くすべての５匹／９匹のラットでＳＡＨ前に記録されたＩＣＰと比較してさらに増加した。メスのシャム手術されたラットにおいて、ＩＣＰは、外科手術後１日目およびその後２日目に、わずかに増加した（５匹／９匹のラット）か、外科手術前のレベルで維持され、ＩＣＰは、１日目のＩＣＰと比較してわずかに低下した（２匹／９匹）か、ＳＡＨ前レベルで維持された（３匹／９匹）か、わずかに増加した（４匹／９匹）。

メスラットにおいてシャムと比較してＳＡＨ後２日で増加された脳血管収縮
６０ｍＭ Ｋ^＋濃縮緩衝液を用いるカリウム誘導応答は、シャムおよびＳＡＨ動物からの動脈切片（ＢＡおよびＭＣＡ）の間で有意に異ならなかった（図１６）。さらに、シャムおよびＳＡＨ手術されたラットからの動脈切片（ＢＡおよびＭＣＡ）を比較して、内皮媒介拡張における差異はなかった。

メスＳＡＨラットからのＢＡ切片のＥＴ－１に対する濃度－収縮曲線は、二相性曲線への移行の開始を伴い左にシフトした。メスＳＡＨラットからのＢＡ切片は、シャム手術されたラットからのＢＡ切片と比較してＥＴ－１に対する有意に増加した感受性を有した（図１６）。ＳＡＨ誘導メスラットからのＭＣＡはまた、二相性曲線を有するシャムと比較してＥＴ－１に対する有意に上昇した収縮を示した（増加したＥ_ｍａｘ１）。ＢＡ切片についてのＥＴ－１曲線とは対照的に、ＭＣＡ曲線は、シャムと比較してＳＡＨ後に左方向にシフトしなかった（図１６）。

オスラットにおいて、大脳動脈は、シャムと比較してＳＡＨ後の５－ＣＴに対する有意に増加された感受性を有することが実証されている。これらの曲線は、５－ＨＴ_１Ｂ受容体のアップレギュレーションを反映して、左方向にシフトしたと示された。メスＳＡＨラットからのＢＡおよびＭＣＡ切片の両方において、シャムと比較して、５－ＣＴ誘導収縮に対する有意に増加された感受性があった。ＳＡＨ後２日にメスラットからの大脳切片について得られた濃度－応答曲線は、シャムと比較して、左方向へのシフトを示した（図１６）。

シャムと比較したメスラットにおけるＳＡＨ後２日の増加された脳の水分含量
浮腫の形成を、分離した脳領域における脳の水分含量を算出することにより、線条体、皮質および海馬において別々に評価した。シャムと比較してメスラットにおけるＳＡＨ後２日に皮質の脳の水分の割合における有意な増加があった（ｐ＜０．０４７３）。脳の水分の割合は、シャムと比較してメスのラットにおけるＳＡＨ後２日で海馬において増加する傾向があった（Ｐ＝０．０５）。線条体における脳の水分含量は、ＳＡＨおよびシャム手術されたメスラットの間で異ならなかった（ｐ＜０．２７１１）。これらの結果は、シャムと比較してメスラットにおけるＳＡＨ後２日の皮質中および海馬中の限局性浮腫を示す。

結論
メスラットにおけるＳＡＨは、低下された一般的な健康状態および著しく低下された感覚運動機能を伴うＳＡＨ後のオスラットにおいて見られる神経学的傷害に類似することが示された。メスラットにおいてＳＡＨ後１日目および２日目の両方で、ＩＣＰにおける有意な増加が実証された。ＳＡＨ後の最初の数日間にわたるＩＣＰにおける変化の経過は、ＥＢＩおよびＤＣＩ感受性の予測を可能にできる。メスラットにおけるＳＡＨは、大脳動脈におけるＥＴ－１および５－ＣＴに対する増加された血管収縮性をもたらした。ＳＡＨ後の遅延した神経学的傷害を防止するために血管の変化を標的とすることはしたがって、オスおよびメスの両方における治療的戦略としてである。

したがって、これらの性別に依存しない機構の防止は、ＳＡＨ後のＤＣＩについて普遍的な処置戦略の基礎を与える。

実施例１０：メスラットにおける限局性脳虚血後のラット中大脳動脈の血管運動応答に対する卵巣摘出の効果
材料および方法
倫理
研究デザインは、ルンド地方行政裁判所（Ｍ１７８－１１、Ｍ８－０９）により承認された。すべての手順および動物の処置は、ルンド大学の倫理委員会のガイドラインにしたがった。この研究は、ＡＲＲＩＶＥガイドライン（動物研究：インビボ実験の報告）に準拠する。

インビボホルモン処置
ラットは、ベンダー（チャールズ・リバー、ラルブレルセデックス、フランス）により卵巣摘出され、ホルモンレベルを回復するために、プロゲステロン（９ｍｍ長）または１７β－エストラジオール（５ｍｍ長）のいずれかを含む皮下移植されたシラスティックカプセル（１．５７ｍｍＩＤ×３．１８ｍｍＯＤ、ダウコーニング、ヘムロック、ＭＩ、ＵＳＡ）で処置された。適切な長さの空のシラスティックカプセルを、プラセボとして使用した。卵巣摘出術およびカプセルの移植を、同じセッション中に実行した。このプロトコルは、生理学的範囲内のレベルの１７β－エストラジオールおよびプロゲステロンを生産することが示されている。

乾燥子宮重量および血清１７β－ストラジオールを、安楽死時に測定して、効果的なエストロゲン補充を検証した。体幹血液または心臓穿刺からの血液を、プレーンチューブに安楽死時に回収し、室温で４０分間凝固させた後、２，０００×ｇで１２分間、４℃で遠心分離した。上清を、回収し、１７β－エストラジオールの測定時（ラジオイムノアッセイ）まで、－８０℃にてアリコートで貯蔵した。ラジオイムノアッセイにおける１７β－エストラジオールの検出限界は、１１ｐｇ／ｍＬであった。

ホルモン処置の３週間後、エストロゲン処置卵巣摘出済みラット（ＯＶＸ＋Ｅ）は、卵巣摘出済み（ＯＶＸ）動物と比較して、低体重（１８７±４ｇ ｖｓ．２５４±８ｇ、Ｐ＜０．０５）および高子宮重量（９８±１６ｇ ｖｓ．１９±１ｇ、Ｐ＜０．０５）を有した。ＯＶＸ＋Ｅ動物における１７β－エストラジオールの血清レベルは、生理学的範囲内（２６±２ｐｇ／ｍＬ）であり、一方で卵巣摘出済み動物におけるレベルは、検出限界未満であった（全試料において＜１１ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）。

完全な卵巣を有するメスラットを、対照として含めた（この後、「処置されていない」と呼ぶ）。処置されていない動物における発情周期を、３回の連続した周期について膣スミアで監視した。発情周期の相を、確立された方法（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ、２００７、Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｒｅｐｒｏｄ Ｔｏｘｉｃｏｌ．）にしたがって存在する細胞の種類および細胞の量を調べることにより決定した。ホルモンレベルの変動により引き起こされる影響を排除するため、実験において使用された処置されていないラットを、循環するエストロゲンおよびプロゲステロンのレベルが発情前期と比較して低い場合、発情期または発情間期のいずれかの日にｔＭＣＡＯに供した。

一過性片側中大脳動脈閉塞
１２週齢でホルモン処置の３週間後、メスのウイスターラットを、腔内閉塞技術（Ｓｔｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ、２００２、Ｓｔｒｏｋｅ）を使用して一過性片側中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）に供した。麻酔を、Ｎ_２Ｏ：Ｏ_２（７０：３０）中の４．５％イソフルランにより誘導し、手順の間Ｎ_２Ｏ：Ｏ_２（７０：３０）中の１．５～２．０％イソフルランの吸入により維持した。平均動脈血圧、ｐＣＯ_２、ｐＯ_２、ｐＨおよび血漿グルコースを、動脈尾カテーテル（ラジオメーター；ＬａｂＣｈａｒｔ）を介して、閉塞前に測定した。等温ブランケットに接続された直腸体温計を使用して、外科手術手技の間体温を＋３７℃で維持した。首の正中線を切開して、右総頸動脈、内頸動脈、外頸動脈を露出させた。総頸動脈および外頸動脈を、縫合糸で永久的に結紮し、切開を、総頸動脈で行った。レーザードップラープローブ（Ｐｅｒｉｍｅｄ、イェルフェッラ、スウェーデン）を、中大脳動脈により供給される領域に対応する領域中で薄くなった頭蓋骨に固定した（ブレグマの後方１ｍｍで正中線から右６ｍｍ）。シリコン、ゴムコーティングされたモノフィラメント（Ｄｏｃｃｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、レッドランズ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、先端が右中大脳動脈（ＭＣＡ）の入口に到達するまで切り口を通して挿入した。閉塞を、レーザードップラーモニタリングを使用して観察された皮質血流の急激な減少により確認した。フィラメントを固定した後、皮膚を縫合し、麻酔を中止した。２時間の閉塞後に、ラットを短時間再麻酔してフィラメントを除去し、再灌流を可能にした。適切な再灌流を、レーザードップラー流速計により示されるように、血流の有意な増加により確認した。動物を、ＣＯ_２で麻酔し断頭される前に、食物および水を自由に摂取できる状態で、外科手術後４８時間で回復させた。脳を、取り出し、氷冷重炭酸塩緩衝溶液ですぐに冷却した（組成については、薬剤、化学薬品および溶液を参照されたい）。右（閉塞）および左（非閉塞）の中大脳動脈を、付着組織がない状態で切断し、ミオグラフ研究に使用した。

臓器培養
１２週齢のメスラットを、卵巣切除し、上述したように１７β－エストラジオールを含むシラスティックカプセルを移植した（ｎ＝６）。卵巣切除済みプラセボ処置ラット（ｎ＝６）および処置されていないラット（ｎ＝６）を、比較のために使用した。卵巣摘出術およびホルモンカプセル移植の後３週に；動物を、ＣＯ_２で麻酔し断頭した。脳を、すぐに取り出し、氷冷重炭酸塩緩衝液で冷却した（組成については、薬剤、化学薬品、および溶液を参照されたい）。ＭＣＡを、除去し、空気中にて加湿した５％ＣＯ_２中＋３７℃でペニシリン（１００Ｕ ｍｌ^－１）、ストレプトマイシン（１００μｇ ｍＬ^－１）およびアムホテリシンＢ（０．２５μｇ ｍＬ^－１）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いる臓器培養中で直後にまたは２４時間後にミオグラフィーで試験した。

インビトロ薬理学
中大脳動脈の収縮特性を、等尺性張力を記録するワイヤＭｕｌｖａｎｙ－Ｈａｌｐｅｒｎミオグラフ（Ｄａｎｉｓｈ Ｍｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓ、オーフス、デンマーク）を使用して調べた。動脈を、円筒形切片（２ｍｍ）に切断し、内腔を通って挿入された２本の平行な４０μｍワイヤにより、ミオグラフ中に固定した。ミオグラフ浴は、５ｍｌの＋３７℃重炭酸塩緩衝溶液（組成については、薬剤、化学薬品および溶液を参照されたい）を含み、酸素中にて５％二酸化炭素で継続的に通気され、ｐＨ７．４となった。２０分間の平衡化期間の後で、動脈を、１００ｍｍＨｇの経壁圧を用いる生理学的条件中に動脈のサイズに対応するワイヤの１つと接続されたマイクロメータねじを用いて通常の内周の９０％に伸ばした。他のワイヤを、アナログ－デジタルコンバータ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、チャルグローヴ、ＵＫ）に取り付けられた力変位トランスデューサに接続した。結果を、Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂユニット（ＡＤ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびソフトウエアＬａｂＣｈａｒｔ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してコンピュータ上で記録した。正規化手順の後で、動脈を、この張力で２０分間平衡化させた。

収縮能力を、緩衝液を５ｍｌカリウム濃縮緩衝液（６３．５ｍＭ、薬剤、化学薬品および溶液を参照されたい）に切り替えることにより試験した。最大カリウム媒介収縮を、収縮能力の参照値（＝１００％）として使用した。内皮の影響を排除するため、一酸化窒素およびプロスタグランジンの生産を、それぞれ、インビボ脳卒中モデルからの動脈に対する実験全体で組織浴中に存在していた１００μＭ Ｌ－ＮＧ－ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ）および１０μＭインドメタシンで遮断した。

５－ヒドロキシトリプタミン受容体（５－ＨＴ）に対する受容体を、１０^－１１～１０^－５Ｍの濃度範囲で、５－カルボキサミドトリプタミン（５－ＣＴ、非選択的５－ＨＴ_１アゴニスト）を添加することにより評価した（Ｈａｎｓｅｎ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ）。アンギオテンシン１型（ＡＴ_１）受容体を、１０^－１２～１０^－６Ｍの濃度範囲で、アンギオテンシンＩＩの累積適用により評価した。実験の３０分前に、ＡＴ_２受容体アンタゴニストであるＰＤ１２３３１９を添加して、あらゆるＡＴ_２受容体媒介効果を排除した。選択的ＥＴ_Ｂ受容体アゴニストであるサラフォトキシン６ｃ（Ｓ６ｃ）（アレックスバイオケミカルズ、ファーミングデール、ＮＹ、ＵＳＡ）を、１０^－１１～１０^－７Ｍの濃度範囲で添加した。

分析および統計
ノンパラメトリックマン・ホイットニーの検定を、２つの群の最大収縮（Ｅｍａｘ）を比較する場合に使用し、クラスカル－ウォリス検定、それに続くダンの多重比較検定を、３つ以上の群を比較する場合に使用した。０．０５未満のｐ値を有する統計分析を、有意であるとみなした。結果を、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝群中の動物の数である。

薬剤および溶液
すべての物質は、特に明記されていない場合、シグマ－アルドリッチ（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。重炭酸塩緩衝液は、以下の組成：１１９ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、４．６ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２ｍＭ ＭｇＣｌおよび５．６ｍＭグルコースを有した。６３．５ｍＭ Ｋ^＋を含む重炭酸塩緩衝溶液は、上記緩衝液中のＮａＣｌのＫＣｌへの部分交換により得られた。

結果
インビトロ薬理学
高カリウム（６３．５ｍＭ）により誘導された最大収縮性応答は、処置群間、閉塞および非閉塞半球の動脈間、または未使用および培養動脈間で有意に異ならなかった（全体の平均収縮は、４．２ｍＮであった）。各動脈切片において、最大カリウム誘導応答を、収縮能力についての参照（＝１００％）として使用して、応答における変化を比較した。

ｔＭＣＡＯ後の血管収縮応答：卵巣摘出術の効果
メスＭＣＡを、ワイヤミオグラフにおいて脳虚血後４８時間に調べた。脳の非閉塞側からの動脈において、以前の研究から予想されるように、選択的ＥＴ_Ｂ受容体アゴニストＳ６ｃに応答する収縮は、ほとんどなかったか、全くなかった。対照的に、一過的に閉塞された動脈は、Ｓ６ｃに応答して有意な収縮を示した（図１７Ａ、図２０）。Ｓ６ｃ媒介収縮は、処置されていないメスと比較して卵巣摘出済みメスからのＭＣＡにおいて有意に低かった（それぞれ８±９％および２２±１６％；ｐ＜０．０５）（図１７Ａ、図２０）。

５－ヒドロキシトリプタミン５－ＨＴ）受容体アゴニストである５－ＣＴについての濃度－応答曲線は、処置されていないメスおよび卵巣摘出済みメスからの非閉塞動脈において類似であった（図１７Ｂ、図２０）。非閉塞動脈における濃度－応答曲線は、二相性であり、オスの大脳動脈において以前に示されたように、５－ＣＴが、動脈中で１つ以上のタイプの収縮性５－ＨＴ受容体に作用したことを示唆した。処置されていないメスからの閉塞動脈において、５－ＣＴ媒介血管収縮は一般に、非閉塞動脈と比較して有意に低く、曲線は、単相であり、単一の受容体サブタイプと一致した。興味深いことに、卵巣摘出済み動物からの動脈は、５－ＣＴに対して血管収縮性応答をほとんど示さず（８±１１％）、これは処置されていないメスにおける応答（２７±１８％）と有意に異なる（ｐ＜０．０１）（図１７Ｂ、図２０）。したがって、ｔＭＣＡＯ後の５－ＣＴ媒介性の応答の平均の低下は、処置されていないメスと比較して卵巣摘出済みラットにおいてより大きかった。

アンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）に対するＡＴ_１受容体媒介収縮は、閉塞および非閉塞動脈において類似であった（図１７Ｃ、図２０）。この知見は、非閉塞動脈におけるＡＴ_１媒介収縮性が閉塞動脈と比較して比較的低いことが認められた、オスにおける過去のデータとはかなり異なる（図２０）。卵巣摘出術は、閉塞および非閉塞動脈で観察される強力なＡＴ_１受容体媒介収縮に影響しなかった（図１７Ｃ、図２０）。

ｔＭＣＡＯ後の血管収縮性応答：１７β－エストラジオールおよびプロゲステロン処置の効果
卵巣摘出済みラットを、移植されたカプセルを介して１７β－エストラジオール、プロゲステロンまたはプラセボを用いて３週間処置し、その後、片側ｔＭＣＡＯに供した。一般に、Ｓ６ｃ、Ａｎｇ ＩＩまたは５－ＣＴに対する閉塞および非閉塞動脈の最大の収縮性応答は、プラセボ処置の卵巣摘出済みラットからの動脈と比較して、ホルモン処置により影響されなかった（図１８Ａ～Ｃ）。図１７に示すように、卵巣摘出術は、処置されていないメスにおいて確認されるものと比較してＥＴ_Ｂおよび５－ＨＴ受容体媒介性の最大の収縮性応答を有意に低下させ、一方で、すでに強力なＡＴ_１受容体媒介性応答において差異はなかった。したがって、卵巣摘出術の後でプロゲステロンまたはエストロゲンの生理学的レベルを維持することは、ＥＴ_Ｂおよび５－ＨＴ受容体アゴニストに対する最大の収縮性応答の低下を防止するには不充分であった。

処置されていないメス、卵巣摘出済みメスおよび１７β－エストラジオール処置のメスからの動脈における臓器培養後の血管運動応答
ＯＶＸ、ＯＶＸ＋Ｅおよび処置されていないメスからのＭＣＡ切片を、分離直後または臓器培養の２４時間にワイヤミオグラフで研究した。ＥＴ_Ｂ受容体媒介性収縮は、Ｓ６ｃの累積適用により誘発された。新鮮な動脈（新鮮な対照）におけるＳ６ｃ媒介性収縮はなかった；しかし、Ｓ６ｃの増加した濃度に対する強力な収縮が、全ての培養動脈において確認され、かつこの応答は、処置群間で異ならなかった（図１９）。したがって、インビボでの卵巣ホルモンへの事前曝露は、培養中に動脈で生じるＥＴ_Ｂ受容体のアップレギュレーションに影響しなかった。

結論
エンドセリンＢ（ＥＴ_Ｂ）受容体アゴニストであるサラフォトキシン６ｃ（Ｓ６ｃ）により媒介される最大収縮性応答は、Ｉ／Ｒ後にメス動脈において増加されたが、最大応答は、卵巣摘出済みメスからのＭＣＡにおいて有意に低かった。

対照的に、５－ヒドロキシトリプタミン受容体アゴニストである５－カルボキサミドトリプタミン（５－ＣＴ）により媒介される最大収縮は、Ｉ／Ｒ後に低下され、卵巣摘出済みメスからの動脈は、最大の収縮性応答において大きな低下を示した。アンギオテンシンＩＩにより誘発される収縮は、どのような手順によっても変更されなかった。卵巣摘出済みメスにおけるエストロゲンまたはプロゲステロンのいずれかの補給は、ＥＴ_Ｂおよび５－ＣＴ誘導性血管収縮におけるＩ／Ｒ誘導性変化を修正しなかった。臓器培養に供された分離されたＭＣＡは、ＥＴ_Ｂ媒介収縮における増加を示した。応答は、処置されていないメス、プラセボ処置卵巣摘出済みメスおよびエストロゲン処置卵巣摘出済みメスから培養された動脈において類似であった。これらの知見は、性ホルモンは虚血性脳卒中後に生じる血管収縮性受容体の変化に直接影響しない；しかし、卵巣摘出術はこのプロセスに影響する、ということを示唆する。

ＥＴ_Ｂ受容体アップレギュレーションは、ｔＭＣＡＯ後のメスでよりもオスにおいてより顕著であった。対照的に、非閉塞メスＭＣＡにおける５－ＣＴおよびＡｎｇ ＩＩに対する収縮性応答は、オスの場合よりも強力であった。ｔＭＣＡＯ後に、５－ＣＴ応答は、両方の性で低下し、Ａｎｇ ＩＩ応答は、メスにおいては変化せず、オスにおいては増加した。したがって、血管応答の挙動は、性によりいくらか異なる（図２０）。

仮説は、これらのオス－メスの差異が、大脳動脈における収縮性応答に対する性ホルモンの影響を反映しているということであった。驚いたことに、ＥＴ_Ｂ媒介最大収縮はｔＭＣＡＯ後および臓器培養後に増加されたが、卵巣摘出術後の性ホルモン充填の効果は認められなかった。それどころか、ｔＭＣＡＯ後のメスの動脈において、Ｓ６ｃおよび５－ＣＴに対する血管収縮性応答は、オスについて以前報告されたよりも顕著に低い。最も興味深いことに、エストロゲンまたはプロゲステロンのいずれかの補充により逆転されなかった、ｔＭＣＡＯ後の血管収縮性受容体応答に対する卵巣摘出術の有意な効果があった。むしろ、これは、脳卒中の影響の取り扱いにおける性差を意味し、オスの場合よりもメスにおいて、より好都合である。

実施例１１：ラットにおけるインビボくも膜下出血後のＭＥＫ１／２阻害剤トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）の全身投与－Ｕ０１２６との比較
材料および方法
動物
オススプラーグ－ドーリーラットラット（３００～３５０ｇ、タコニック、デンマーク）を使用した。すべての手順は、国内法の範囲内で厳密に実行され、デンマークの動物実験検査官（２０１２－１５－２９３４－３８９）により承認された。

インビボくも膜下出血
ＳＡＨを、ラットに滅菌水中のＨｙｐｎｏｒｍ－ミダゾラム（１：１：２）の混合物２．５ｍＬ・ｋｇ－１で麻酔をかけたことを除いて、以前に詳細に説明されたように（Ｐｏｖｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１３、ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）誘導し、３００μｌの血液を、視交叉に注射した。

実験群
３２匹のラットを、本研究のために手術した。動物を、ＮａＣｌ中１０％クレモフォールおよび１０％ＰＥＧ４００中で希釈した、９５μｇ／体重の最終投与量をもたらす、トラメチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）の１ｍＭ溶液２５０μｌ／体重を用いて腹腔内処置した。媒体およびシャム群の動物を、ＮａＣｌ中の２５０μｌ／体重１０％クレモフォールおよび１０％ＰＥＧ４００で処置した。処置を、外科手術後１時間および２４時間または６時間および２４時間のいずれかで、腹腔内投与した。動物を、ＣＯ２麻酔および断頭により外科手術後４８時間に処分した。

インビトロ臓器培養
ＭＣＡを、ナイーブなラットから切断し、切片（１．５ｍｍ）を、加湿した５％ＣＯ２雰囲気でペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＬ－グルタミン（５８４ｍｇ／Ｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地中にて４８時間インキュベートした。インキュベーション前に、ＮａＣｌ中０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した、トラメチニブの４つの異なる濃度（５μＭ、１μＭ、０．１μＭまたは０．０３μＭ）またはＮａＣｌ中０．１％ＤＭＳＯ（媒体）を加えた。

ワイヤミオグラフィー
ワイヤミオグラフを使用して、分離した大脳動脈の切片（１．５ｍｍ）における等尺性張力を記録した。血管切片は、２ｍＮ／ｍｍの初期プレテンションを受け、６３．５ｍＭ Ｋ＋の溶液で事前収縮させた。２ｍＮを超えるＫ＋誘導応答を有する脳底動脈（ＢＡ）および０．７ｍＮを超えるＫ＋誘導応答を有する中大脳動脈（ＭＣＡ）のみを、実験に使用した。濃度－応答曲線を、サラフォトキシン（Sarafatoxin）６ｃ（Ｓ６ｃ）、１０^－１２～１０^－４Ｍの濃度範囲のＥＴＢ受容体特異的アゴニスト（アレックスバイオケミカルズ、ＵＳＡ）および１０^－１４～１０^－７Ｍの濃度範囲のエンドセリン－１（ＥＴ－１）（ＡｎａＳｐｅｃ、ＵＳＡ）の累積適用により得た。

細胞内フローサイトメトリー
ＭＣＡ、ＢＡおよびウィリス動脈輪を、１匹のラットからプールした。大脳動脈のＶＳＭＣを、２つのプロトコル（Ｎａｖｏｎｅ ｅｔ ａｌ、２０１３、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ；ｖａｎ Ｂｅｉｊｎｕｍ ｅｔ ａｌ、２００８、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ）に基づいて、本発明者らにより進歩させた新規技術により分離した。組織を、機械的に破壊し（外科用メス）、その後、高度に精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを用いる酵素的消化に供した。分離された細胞懸濁液を、３０分間４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、その後０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を用いて透過処理した。細胞を、５％ロバ血清を含むブロッキング緩衝液中に再懸濁し、同じブロッキング緩衝液中の一次ヤギ抗－ＳＭ２２α（１：１００、アブカム）またはヤギアイソトープコントロールＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ、アブカム）および一次抗体ウサギ抗－ＥＴ_Ｂ（１：１００、アブカム）またはウサギアイソトープコントロールＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ、アブカム）を用いて４℃で一晩、二重染色した。翌日、細胞試料を、ＲＴで２時間（暗所）Ａｌｅｘａ ４８８共役ロバ抗－ヤギＩｇＧ（１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役ロバ抗－ウサギＩｇＧ（１：１００）とインキュベートした。最後に、細胞懸濁液を、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ機（ＢＤバイオサイエンス、ＵＳＡ）上での蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により分析する前に、ＰＢＳで０．５ｍＬの最終容積へと希釈した。蛍光を、６４０ｎｍの赤色レーザを用いて誘導した。ＥＴ_Ｂを発現するＳＭ２２α陽性細胞の比率を、各試料中で算出した。データを、ＢＤ ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウエアにより分析した。

算出および統計
データは、平均±ＳＥＭとして表され、ｎは、ラットの数を指す。濃度－収縮曲線を、二元配置分散分析により比較した。正規化のため、Ｋ^＋誘発収縮性応答を、１００％に設定した。フローサイトメトリーを、一元配置分散分析により分析した。有意水準を、ｐ＜０．０５に設定した。

結果
全ラットにおいて、生理学的パラメータおよび温度は、群間にあらゆる差異なく外科手術中、許容限度内であった。ＩＣＰは、５．４ｍｍＨｇから１１６．８ｍｍＨｇに増加し、皮質ＣＢＦは、安静時の流れの１９％に低下した（全ＳＡＨ動物についての平均値）。

初期のインビトロ実験において、新たに分離したＭＣＡ（対照）は、ＥＴ_Ｂ受容体アゴニストであるＳ６ｃに対し収縮性応答を示さなかった。ＯＣの４８時間後に、Ｓ６ｃは、媒体とともにインキュベートしたＭＣＡにおいて強力な収縮性応答を生じた。しかし、トラメチニブとの共インキュベーションは、濃度依存的にＯＣ後４８時間でＳ６ｃ誘導収縮を有意に阻害した（図２１Ａ。全群において、Ｓ６ｃにより誘導された最大収縮（Ｅ_ｍａｘ）を、図２１Ｂに示す。上述した結果に基づいて、０．１μＭのトラメチニブは、増加したＥＴ－１誘導性血管収縮に対する阻害効果を確認した（図２１Ｃ）。媒体インキュベートＭＣＡにおいて、増強は、二相性曲線形状への移行を伴うＥＴ－１濃度－応答曲線の左方向へのシフトとして観察された。トラメチニブの存在下でインキュベートされたＭＣＡは、濃度－応答曲線の右方向へのシフトをもたらし、ＥＴ_Ｂ受容体サブタイプ応答の完全な遮断を示唆した。

ＳＡＨ誘導により増加したＥＴ－１媒介血管収縮に対するトラメチニブ処置のインビボ効果を確認するため、２つの異なる処置アプローチ；ＳＡＨ後１時間および２４時間（図２２Ａ）または６時間および２４時間（図２２Ｂ）での１ｍＭトラメチニブの腹腔内投与を、使用した。ＳＡＨ後のＢＡにおける増加したＥＴ－１誘導性収縮－応答曲線は、左方向へのシフトとして観察され、両方の処置アプローチを使用するトラメチニブにより有意に阻害された。ＳＡＨ処置後６時間後に観察された、増強された収縮性応答を、フローサイトメトリーを使用するタンパク質分析を用いて検証した。シャム（６１．４％±１０．２％；ｎ＝６）と比較して、ＳＡＨ（媒体）後にＳＭＣ発現ＥＴ_Ｂ受容体の有意な増加があった（７４．２％±１２．２％；ｎ＝７）。しかし、この増加したタンパク質発現は、この特定の処置アプローチを用いるトラメチニブにより有意に消失しなかった（図２２Ｃ）。

結論
ＭＥＫ１／２阻害剤であるトラメチニブは、インビトロＯＣ後の大脳動脈における増加されたＥＴ_Ｂ受容体媒介収縮を完全に阻害する能力を有する強力な化合物である。トラメチニブは、ラットにインビボで全身投与できるが、大槽内投与後と同じ割合で、ＳＡＨ後４８時間で大脳動脈において、増加されたＥＴ－１媒介血管収縮を依然として縮小させることができる。

初期インビボ実験は、０．１μＭトラメチニブが、ＥＴ－１により誘導される増加したＥＴ_Ｂ受容体媒介収縮を有意に阻害できたことを示した。同じインビトロセットアップを使用する以前の研究では、１０μＭの濃度のＵ０１２６が、同等の阻害のために使用された。Ｕ０１２６は以前に、１００％ＤＭＳＯに溶解した最終濃度５０ｍＭで、全脳虚血および局所的脳虚血のモデルにおいて、腹腔内にインビボ投与された。しかし、腹腔内投与は、ＳＡＨの初期の研究において使用されたことはなく、むしろ、ＳＡＨ後６時間、１２時間、２４時間および３６時間でのＵ０１２６（０．１％ＤＭＳＯに溶解した１０μＭ）の大槽内投与が使用されていた。現在の研究において、強力で選択的なＭＥＫ１／２阻害剤であるトラメチニブは、非ＤＭＳＯ溶液（ＮａＣｌ中のクレモフォール／ＰＥＧ４００）に溶解され、ラットは、最終濃度１ｍＭで２回（ＳＡＨ後１時間および２４時間または６時間および２４時間）腹腔内で処置された。これらの条件下で、結果は、ＳＡＨ後４８時間の大脳動脈における増加された血管収縮に対するトラメチニブの正の効果を示す。

結論として、結果は、強力なＭＥＫ１／２阻害剤であるトラメチニブが、ＳＡＨ後の増加された血管収縮の阻害のためのあらゆる処置用途により使用できることを示す。

Claims (40)

1. 対象における脳卒中の予防または処置における使用のための、式（Ｉ）
   

   

   のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
   （式中；
   Ｒ_１は、メチルなどの、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
   Ｒ_２は、シクロプロピルなどの、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
   Ａｒは、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される）。
2. Ｒ_１が、Ｃ１～Ｃ３アルキルである、請求項１に記載のＭＥＫ阻害剤。
3. Ｒ_１が、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである、請求項１から２のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
4. Ｒ_１が、メチルまたはエチルである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
5. Ｒ_１が、メチルである、請求項１から４のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
6. Ｒ_２が、Ｃ２～Ｃ４アルキルである、請求項１に記載のＭＥＫ阻害剤。
7. Ｒ_２が、Ｃ３～Ｃ４シクロアルキルである、請求項１から６のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
8. Ｒ_２が、シクロプロピルである、請求項１から７のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
9. Ａｒが、フェニルまたは置換フェニルである、請求項１から８のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
10. Ａｒが、置換フェニルである、請求項１から９のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
11. Ａｒが、２－フルオロ－４－ヨードフェニルである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
12. Ｒ_１が、Ｃ１～Ｃ３アルキルであり、Ｒ_２が、Ｃ２～Ｃ４アルキルであり、かつＡｒが、置換フェニルである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
13. Ｒ_１が、メチルまたはエチルであり、Ｒ_２が、Ｃ３またはＣ４シクロアルキルであり、かつＡｒが、置換フェニルである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＭＥＫ阻害剤。
14. ＭＥＫ阻害剤が、式（ＩＩ）、
    

    

    またはその医薬適合性のある塩である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
15. 脳卒中が、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、および一過性虚血発作からなる群より選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
16. 脳卒中が、全虚血および局所虚血からなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
17. 虚血性脳卒中が、塞栓症、血栓症、全身灌流低下、脳静脈洞血栓症、血圧の突然の低下もしくは心停止、大脳動脈もしくは細動脈の破裂、またはそれらの組み合わせに起因する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
18. 出血性脳卒中が、脳内出血、くも膜下出血、またはそれらの組み合わせに起因する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
19. 脳内出血が、脳実質内、脳室内、またはそれらの組み合わせである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
20. 脳卒中が、くも膜下出血（ＳＡＨ）に起因する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の使用のための使用のためのＭＥＫ阻害剤。
21. 脳卒中が、虚血性脳損傷（ＴＢＩ）に起因する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
22. 脳卒中が、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
23. ＤＣＩが、炎症、浮腫、遅発性脳血管痙攣（ＣＶＳ）、血液脳関門破綻および／またはエンドセリン、アンギオテンシン、セロトニンおよびトロンボキサンまたはプロスタグランジンに対するものなどの、収縮性受容体発現における増加を呈する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
24. ＭＥＫ阻害剤が、投与前に、投与と同時に、または投与に続いて外科手術なしで対象に投与される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
25. ＭＥＫ阻害剤が、血栓切除の前に、血栓切除と同時に、または血栓切除に続いて対象に投与される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
26. ＭＥＫ阻害剤が、血栓溶解の前に、血栓溶解と同時に、または血栓溶解に続いて対象に投与される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
27. ＭＥＫ阻害剤が、コイリングおよびクリッピングからなる群より選択される外科手術手技の前に、外科手術手技と同時に、または外科手術手技に続いて対象に投与される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
28. ＭＥＫ阻害剤が、神経放射線学的手技の前に、神経放射線学的手技と同時に、または神経放射線学的手技に続いて対象に投与される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
29. ＭＥＫ阻害剤が、神経放射線学的手技に起因する再灌流傷害を低減するまたは防止する、請求項１から２８のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
30. ＭＥＫ阻害剤が、対象が急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中に罹患しているかが決定される前に対象に投与される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
31. ＭＥＫ阻害剤が、経口で、くも膜下腔内で、腹腔内で、眼内で、鼻腔内で、または静脈内で投与される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
32. ＭＥＫ阻害剤が、静脈内で投与される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
33. ＭＥＫ阻害剤が、脳卒中の発症後１時間までなど、２時間までなど、３時間までなど、４時間までなど、５時間までなどの、脳卒中の発症後６時間まで対象に投与される、請求項１から３２のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
34. ＭＥＫ阻害剤が、脳卒中の発症後最大で３日間毎日１回または複数回投与される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
35. 対象が、ヒト対象である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の使用のためのＭＥＫ阻害剤。
36. ａ．エンドセリン－１誘導収縮性を低減すること；
    ｂ．エンドセリンＢ受容体機能を増加させること；および／または
    ｃ．誘導性くも膜下出血の後に、回転ポールを横断する対象の能力により評価されてよい、神経学的スコアを改善すること
    のための、請求項１から３５のいずれか一項において定義されるような式（Ｉ）のＭＥＫ阻害剤の使用。
37. 対象における脳卒中を処置するまたはそれを発症する危険性を低減する方法であって、それを必要とする対象に式（Ｉ）
    

    

    のＭＥＫ阻害剤またはその医薬適合性のある塩
    （式中；
    Ｒ_１は、メチルなどの、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
    Ｒ_２は、シクロプロピルなどの、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
    Ａｒは、アリール、フェニル、およびヘテロアリールからなる群より選択される）
    を投与するステップ、それにより脳卒中を処置するまたはそれを発症する危険性を低減するステップを含む、方法。
38. 式（ＩＩ）
    

    

    のＭＥＫ阻害剤、またはその医薬適合性のある塩、およびさらなる薬剤を、別個にまたは一緒に、含む組成物。
39. さらなる薬剤が、ニモジピンなどの、カルシウムチャネル遮断薬、およびクラゾセンタンなどの、エンドセリン受容体（ＥＴ）受容体遮断薬からなる群より選択される、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物。
40. 請求項１から３９のいずれか一項において定義されるようなＭＥＫ阻害剤；および
    請求項１から３９のいずれか一項において定義されるようなさらなる薬剤；
    および任意で使用のための説明書
    を含み、ＭＥＫ阻害剤およびさらなる薬剤が、同時のまたは順次の使用のために配合される、
    キットオブパーツ。

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