CN114502169A - 用于治疗中风的mek抑制剂 - Google Patents

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CN114502169A CN202080068488.5A CN202080068488A CN114502169A CN 114502169 A CN114502169 A CN 114502169A CN 202080068488 A CN202080068488 A CN 202080068488A CN 114502169 A CN114502169 A CN 114502169A
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Abstract

本发明涉及MEK抑制剂及其组合物，其用于治疗中风，特别是治疗蛛网膜下腔出血(SAH)。

Description

用于治疗中风的MEK抑制剂
技术领域
本发明涉及MEK抑制剂及其作为药物用于治疗中风(stroke)和相关状况，包括蛛网膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage，SAH)的用途。
背景技术
中风是全球第二大死亡原因，也是导致残疾的主要原因。由于人口老龄化，其发病率正在增加。此外，年轻人中风的发病率正在增加，特别是在低收入和中等收入国家。缺血性中风(Ischemic stroke)是更常见的中风类型，而出血性中风(haemorrhagic stroke)导致更多的死亡和伤残调整生命年损失。中风的发病率和死亡率因国家、地理区域和种族群体而异。主要在高收入国家，在过去30年中，预防、急性治疗和神经康复的改进已导致中风负担大幅下降。
动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)是出血性中风的一种变体，约占所有中风事件的5％，但死亡率高达50％。幸存者经常会出现认知障碍和生活质量下降，使其成为一种令人非常虚弱的疾病。SAH通常是由动脉瘤破裂引起的，导致动脉血快速泄漏到蛛网膜下腔中，随后是颅内压(ICP)急剧升高和脑血流量(CBF)下降。这导致大脑缺氧和缺葡萄糖，从而导致脑缺血和脑损伤，通常称为早期脑损伤。迟发性脑缺血(Delayed cerebral ischemia，DCI)与继发性迟发性脑损伤有关，并且由各种病理生理变化组成，包括炎症、水肿和血脑屏障破坏。DCI可能与脑动脉的重塑和变窄，尤其是血管高敏性(其经常被称为迟发性脑血管痉挛(delayed cerebral vasospasm，CVS))有关，目前对其只有很少的治疗选择。
因此，血管收缩性(Vascular contractility)已成为许多试图预防随后的DCI的临床和临床前研究的重点。这包括最近尝试调节急性血管收缩性，例如使用内皮素受体拮抗剂，包括特异性内皮素A(ETA)和内皮素B(ETB)受体拮抗剂克拉生坦(clazosentan)。不幸的是，这些尝试都没有成功。
因此，本领域中需要提供新的和更好的中风治疗，以解决由多种形式的中风引起的医疗负担。
发明内容
本发明人惊奇地发现，MEK抑制剂曲美替尼(trametinib)及其类似物在体内中风模型中与其他有效的MEK抑制剂相比显示出优异的效果。
在第一方面，提供了式(I)的MEK抑制剂，其用于预防或治疗受试者的中风，
Figure BDA0003570285400000021
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基、苯基和杂芳基。
在第二方面，用于本公开用途的MEK抑制剂具有式(II)，
Figure BDA0003570285400000022
或其药学上可接受的盐。
在第三方面，提供了式(I)的MEK抑制剂的用途，用于：
a.降低内皮素-1诱导的收缩性；
b.减少松弛内皮素B受体功能向收缩表型的表型变化；和/或
c.改善神经学评分，这可以通过在诱发的蛛网膜下腔出血之后受试者通过旋转杆的能力来评价。
在第四方面，提供了一种治疗受试者的中风或降低受试者发生中风的风险的方法，其中该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用式(I)的MEK抑制剂，
Figure BDA0003570285400000031
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基、苯基和杂芳基；
从而治疗中风或降低发生中风的风险。
在第五方面，提供了一种组合物，其分开或一起包含式(II)的MEK抑制剂，
Figure BDA0003570285400000032
或其药学上可接受的盐，以及另外的药物。
附图说明
图1.在基底动脉的48小时器官培养后，比较九种不同的MEK1/2抑制剂(1μM)的抑制能力。这导致表型改变以及血管平滑肌细胞中收缩ETB受体的上调。(A)与1μM不同MEK1/2抑制剂一起孵育后，对ETB特异性激动剂S6c的浓度-反应曲线。在新鲜血管中，S6c导致脑血管松弛或没有效果，但在器官培养后，收缩表型出现并在不同的中风模型中表现出相似的特征。(B)与1μM的不同MEK1/2抑制剂一起孵育后对60mM K+的最大收缩。溶媒(DMSO)和任何拮抗剂之间没有显著差异。(C)与溶媒(DMSO)相比，在用TAK-733、曲美替尼和PD0325901孵育的段中内皮诱发的扩张显著增加。通常器官培养显示内皮功能降低，但这些抑制剂保护了这种有害的作用。数据显示为平均值±SEM，通过双向ANOVA然后是Holm-Sidak多重比较检验进行统计。与DMSO相比，*P<0.05，**P<0.01。n＝4-15。
图2.所选的高效MEK1/2抑制剂的浓度-反应曲线。基于(A)S6c的Emax、(B)对60mM K+的最大收缩和(C)通过向用3·10-7M 5-HT预收缩的动脉添加10-5M卡巴胆碱(carbachol)评价的内皮功能，所选抑制剂的浓度-反应曲线。数据显示为平均值±SEM，n＝4。
图3.在基底动脉48小时器官培养后，曲美替尼和PD0325901对调节血管舒缩的通路的影响。在DMSO对照(n＝5)、1μM曲美替尼(n＝6)或PD0325901(n＝5)的存在下，来自OC的动脉用U46619(1-3·10-7M)或K+(41mM)预收缩，并通过添加(A)卡巴胆碱(10-10-10-5M)、(B)SNP(10-11-10-4M)或(C)CGRP(10-12-10-7M)绘制累积浓度-反应曲线。(D)在用DMSO对照(n＝15)、1μM曲美替尼(n＝4)或PD0325901(n＝4)进行器官培养后，在ET-1预收缩(10-7M)之后，用Ca2+(0.0125-3mM)绘制累积浓度-反应曲线。数据显示为平均值±SEM，通过双向ANOVA然后是Holm-Sidak多重比较检验进行统计，*/#P<0.05，**/##P<0.01，***/###P<0.001。对于归一化的数据，应用了Geisser-Greenhouse球形度校正。
图4.曲美替尼和PD0325901治疗在大鼠SAH和假手术后对60mM K+的收缩反应和内皮功能的影响。(A)由60mM K+诱发的Emax，K+(Nm-1)。(B)内皮功能。数据包括低于2.0mN截止值的基底动脉，用于比较所有动脉；假手术+溶媒(n＝10)、SAH(n＝11)、SAH+溶媒(n＝27)、曲美替尼(n＝13)和PD0325901(n＝12)。水平黑色虚线显示所有n(n＝73)的总平均值。数据显示为平均值±SEM，在此图中“n”等于单个动脉段。通过单向ANOVA然后是Holm-Sidak多重比较检验进行统计。*P<0.05，**P<0.01。
图5.曲美替尼和PD0325901治疗在大鼠SAH或假手术后对内皮素-1的收缩反应的影响。基底动脉对ET-1的累积浓度-反应曲线(10-14-10-7M)。对于假手术+溶媒(n＝5)、SAH(n＝5)、SAH+溶媒(n＝12)、SAH+曲美替尼(n＝6)和SAH+PD0325901(n＝6)，(A)ET-1(Nm-1)和(B)ET-1(ET-1max的％)。数据显示为平均值±SEM，通过双向ANOVA然后是Holm-Sidak多重比较检验进行统计。*P＝<0.05。ET-1max归一化数据使用Geisser-Greenhouse球形度校正，ET-1曲线是双相非线性回归曲线拟合。
图6.曲美替尼和PD0325901治疗对大鼠SAH或假手术后VDCC非依赖性ET-1诱发的收缩的影响。基底动脉用ET-1(10-7M)预收缩，随后用Ca2+(Nm-1)绘制累积浓度-反应曲线；假手术+溶媒(n＝5)、SAH(n＝5)、SAH+溶媒(n＝13)、SAH+曲美替尼(n＝7)和SAH+PD0325901(n＝6)。数据显示为平均值±SEM，通过双向ANOVA然后是Holm-Sidak多重比较检验进行统计。*/#/$P＝<0.05。
图7.曲美替尼和PD0325901治疗对神经功能的影响。
10rpm的旋转杆体内测试：(A)SAH前，(B)SAH后24小时和(C)SAH后48小时。每只动物以4次计数来评分，即左右旋转各2个分数；低＝一次尝试无法通过；高＝一次尝试能够通过。假手术+溶媒(n＝5)、SAH(n＝9)、SAH+溶媒(n＝14)、SAH+曲美替尼(n＝7)和SAH+PD0325901(n＝6)。除了假手术+溶媒组之外，所有动物都暴露于实验性SAH。通过Fischer精确检验、双侧、95％CI进行统计。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图8.大鼠SAH手术后i.p.曲美替尼治疗的影响。(A)SAH+i.p.溶媒(n＝10)、i.p.曲美替尼(n＝12)的由60mM K+诱发的K+的Emax(Nm-1)。数据显示为平均值±SEM。在该图中，“n”等于单个动脉段。(B)来自用SAH+i.p.溶媒(n＝5)或SAH+i.p.曲美替尼(n＝6)治疗的动物的相对于60mM K+归一化的基底动脉对ET-1(10-14-10-7M)的累积浓度-反应曲线。数据显示为平均值±SEM，通过双向ANOVA然后是Holm-Sidak多重比较检验进行统计。***P＝<0.001。ET-1曲线是双相非线性回归曲线拟合。右侧图片显示在(C)SAH后24小时和(D)SAH后48小时，以10rpm进行的用于神经功能的旋转杆测试。每只动物以4次计数来评分，即左右旋转各2个分数；低＝一次尝试无法通过；高＝一次尝试能够通过。通过Fischer精确检验、双侧、95％CI进行统计。*P<0.05。
图9.鞘内和腹膜内治疗方案的表。
图10.曲线拟合和EC50值比较的表。
图11.鞘内和腹膜内治疗的手术数据的表。
图12.来自旋转杆测试的数据的表。
图13.本研究中使用的抑制剂的概述。
图14.生理学参数：在雌性大鼠中经受实验诱发的SAH(脑池内注射300μL自体血液)或假手术(对照)的动物的体重、平均动脉血压(MABP)、pH、CO2压力(pCO2)和O2压力(pO2)。值是平均值±SEM，每组n＝16-18只大鼠。
图15.5-CT和ET-1在脑动脉中的收缩作用。在雌性大鼠中在实验诱发的SAH(注射250或300μL自体血液)或假手术(对照)之后2天，基底动脉(BA)和大脑中动脉(MCA)对5-CT(5HT1B/D激动剂)和ET-1(ETA/B激动剂)的收缩反应的生理学参数。收缩反应通过最大收缩反应(Emax)值(表示为60mM K+诱发的收缩(K+反应)的百分比)以及产生半数最大收缩(pEC50)的摩尔浓度的负对数值来表征。对于双相浓度-收缩曲线，提供了两相中每一相的Emax和pEC50值。值是平均值±SEM，n＝大鼠数目。
图16.手术之前、期间和之后颅内压和相对脑血流量。在雌性大鼠中在实验性诱发SAH(300μL自体血液注射)或假手术(对照)的手术过程中动物的颅内压(ICP)和相对脑血流量(rCBF)的变化。值是平均值±SEM，每组n＝16-18只大鼠。
图17.卵巢切除术对短暂性大脑中动脉闭塞后大脑中动脉血管收缩反应的影响。(A)由选择性内皮素B受体激动剂角蝰毒素(sarafotoxin)(S6c)诱发的收缩。a：与完整的非闭塞的相比，P<0.01。b：与卵巢切除的(OVX)非闭塞的相比，P<0.01。(B)由非选择性5-羟色胺受体激动剂5-羧基酰氨基色胺(5-CT)诱发的收缩。A：完整的非闭塞的与闭塞的相比，P<0.01。B：OVX非闭塞的与闭塞的相比，P<0.01。(C)血管紧张素II(Ang II)在血管紧张素II受体2型阻断剂(其导致血管紧张素II受体1型介导的反应)存在下诱发的收缩。收缩被表示为钾介导的最大收缩的百分比(平均值±SEM)。实验在分别阻断一氧化氮合酶和前列腺素产生的N-硝基-L-精氨酸甲酯(100μM)和吲哚美辛(indomethacin)(10μM)的存在下进行。*P<0.05。MCA：大脑中动脉
图18.卵巢切除的雌性中激素替代对短暂性大脑中动脉闭塞后大脑中动脉血管收缩反应的影响。(A)由选择性内皮素B受体激动剂角蝰毒素6c(S6c)诱发的收缩。由于来自不同组的非闭塞动脉的反应之间没有显著差异，因此将数据合并并在此处显示平均值。(B)由非选择性5-羟色胺受体激动剂5-羧基酰氨基色胺(5-CT)诱发的收缩。(C)由血管紧张素II(Ang II)在血管紧张素II受体2型受体阻断剂(其导致血管紧张素II受体1型介导的反应)存在下诱发的收缩。收缩被表示为钾介导的最大收缩的百分比(平均值±SEM)。实验在在分别阻断一氧化氮合酶和前列腺素产生的N-硝基-L-精氨酸甲酯(100μM)和吲哚美辛(10μM)的存在下进行。*P<0.05，***<0.001。OVX：卵巢切除的，E：17β-雌二醇，P：孕酮
图19.来自卵巢切除的雌性的经培养的大脑中动脉的内皮素B受体介导的收缩。选择性内皮素ETB受体激动剂角蝰毒素6c(S6c)在经受24小时器官培养的大脑中动脉中诱发的收缩。来自完整的雌性、卵巢切除的(OVX)或用17β-雌二醇治疗的OVX(OVX+E)的大脑中动脉之间的比较。收缩被表示为钾介导的最大收缩的百分比(平均值±SEM)。
图20.表1.tMCAO之后来自完整的雌性、卵巢切除的雌性和雄性的MCA中收缩反应的Emax值的比较。在短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)之后48小时分离的闭塞和非闭塞的大脑中动脉中，由角蝰毒素(S6c)、5-羧基酰氨基色胺(5-CT)和血管紧张素II(Ang II)诱发的最大收缩反应(Emax)。收缩被表示为钾介导的最大收缩的百分比(平均值±SD)。完整的：卵巢完整的雌性，OVX：卵巢切除的雌性。*P<0.05，与非闭塞的相比。**P<0.01，与非闭塞的相比。ns-闭塞的和非闭塞的之间没有显著差异。a,b-比完整的闭塞的更低的反应(P<0.05)。ns＝与非闭塞的相比，没有统计学上的显著差异。
图21.在体外实验中，新鲜分离的MCA(对照)显示对ETB受体激动剂S6c没有收缩反应。(A)在OC 48小时后，S6c在与溶媒一起孵育的MCA中产生强烈的收缩反应。然而，与曲美替尼(GSK1120212)共孵育在OC后48小时以浓度依赖性方式显著抑制S6c诱发的收缩。(B)在所有组中，由S6c诱发的最大收缩(Emax)。(C)0.1μM的曲美替尼(GSK1120212)证实了对增加的ET-1诱发的血管收缩的抑制作用。
图22.在体内实验中，曲美替尼(描述为GSK)治疗对SAH诱发的增加的ET-1介导的血管收缩的影响，使用了两种不同的治疗方法。在SAH后(A)1和24小时腹膜内施用1mM曲美替尼或(B)6和24小时腹膜内施用1mM曲美替尼。(C)流式细胞术：SAH后6小时治疗后观察到的增强的收缩反应通过使用流式细胞术的蛋白质分析得到验证。与假手术(61.4％±10.2％；n＝6)相比，SAH后(溶媒)表达ETB受体的SMC有显著增加(74.2％±12.2％；n＝7)。
详细描述
术语和定义
本文所用的术语“治疗(treatment和treating)”是指为了对抗状况、疾病或病症而对患者进行管理和护理。该术语旨在包括针对患者正在遭受的给定状况的全方位治疗。待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人类。然而，诸如小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛、羊和猪的动物的治疗也在本发明的范围内。待治疗的患者可以是不同年龄的。
本文所用的术语“全脑缺血(global ischemia)”是指影响脑部较广泛区域的缺血，并且通常发生在脑部的血液供应已经急剧减少或停止时。这通常是由心脏骤停(cardiac arrest)引起的。
本文所用的术语“局灶性缺血(focal ischemia)”是指局限在脑部特定区域的缺血。它通常发生在血凝块阻塞脑中的动脉时。局灶性缺血可能是血栓或栓子的结果。
术语“创伤性脑损伤(traumatic brain injury)”(TBI)，也称为颅内损伤，是由外力引起的脑损伤。TBI可以根据严重程度、机制(闭锁性或穿通性头部损伤)或其他特征(例如，发生在特定位置或广泛区域)进行分类。TBI可能导致身体、认知、社会、情感和行为症状，其后果可能从完全康复到永久性残疾或死亡。
MEK抑制剂
在一个实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂，其用于预防或治疗受试者的中风，
Figure BDA0003570285400000091
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基和杂芳基。
在本公开的一个实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂，其中R1是C1-C3烷基。在一个优选的实施方案中，R1是直链C1-C3烷基。在进一步优选的实施方案中，R1是甲基或乙基。在最优选的实施方案中，R1是甲基。
在本公开的一个实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂，其中R2是C2-C4烷基。在一个进一步的实施方案中，R2是C3或C4环烷基。在一个优选的实施方案中，R2是环丙基。
在本公开的一个实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂，其中Ar是苯基或取代的苯基。在一个进一步的实施方案中，Ar是取代的苯基。在一个优选的实施方案中，Ar是2-氟-4-碘苯基。
在本公开的一个实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂，其中R1是C1-C3烷基，R2是C2-C4烷基，且Ar是取代的苯基。
在本公开的一个优选实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂，其中R1是甲基或乙基，R2是C3或C4环烷基，且Ar是取代的苯基。
在一个实施方案中，提供MEK抑制剂用于如本文所定义的用途，其中MEK抑制剂具有式(II)，
Figure BDA0003570285400000101
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供了式(I)的MEK抑制剂用于以下的用途：
a.降低内皮素低-1诱导的收缩性；
b.减少增加的收缩内皮素B受体功能；和/或
c.改善神经学评分，这可以通过在诱发的蛛网膜下腔出血之后受试者通过旋转杆的能力来评价。
在一个实施方案中，提供了一种治疗受试者的中风或降低受试者发生中风的风险的方法，其中该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用式(I)的MEK抑制剂，
Figure BDA0003570285400000102
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基、苯基和杂芳基；
从而治疗中风或降低发生中风的风险。
取代基
“烷基”是指由碳和氢原子组成的直链、支链或环状烃链基团，不包含不饱和度，并且可以是直链或支链的、取代或未取代的。在一些优选的实施方案中，烷基可以由1至12个碳原子组成，例如1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子等，最多并包括12个碳原子。示例性烷基包括但决不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。烷基部分可以通过单键连接到分子的其余部分，例如甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(Pr)、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)和3-甲基己基。除非在说明书中另有特别说明，否则烷基基团任选地被一个或多个任何合适的取代基取代。烷基基团可以是一价、二价、三价或四价，视情况而定以满足化合价要求。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷基部分的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-。
“环烷基”是指具体包含环状部分的烷基基团。示例性环烷基基团包括但决不限于环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
“取代”是指从母体部分替换氢原子并被另一个化学基团替换。考虑的取代基包括但不限于：烷基基团，例如C1-C6烷基；烷氧基基团，例如C1-C6烷氧基；卤素原子，例如-F、-Cl、-Br或-I；-CN；-NO；-NO2；-SO2H；-SO3H；-CO2H；羟基；氨基；巯基；芳基；杂芳基；或酰基。
“芳基”是指未取代的和取代的芳基基团。
“杂芳基”是指未取代的和取代的杂芳基基团。
中风概述
中风可以分为至少两大类：缺血性的和出血性的。缺血性中风是由脑供血中断引起的，而出血性中风是由血管破裂或血管结构异常引起的。大约87％的中风是缺血性的，其余的是出血性的。根据本公开，中风还可以包括短暂性脑缺血发作(transient ischemicattack，TIA)或者可以是心脏停止跳动(heart stop)或通过其他方式例如心脏纤颤造成的全身血压急剧降低的结果。
在本公开的一个实施方案中，中风选自：缺血性中风、出血性中风和短暂性脑缺血发作。
在本公开的一个实施方案中，中风选自：全脑缺血和局灶性缺血。
在一个实施方案中，在确定受试者是否患有急性缺血性中风或出血性中风之前，将MEK抑制剂施用至受试者。
缺血性中风
在缺血性中风中，向脑的一部分的血液供应减少，导致该区域中的脑组织的功能障碍。发生这种情况的主要原因有四个：
1.血栓形成(通过局部形成血凝块阻塞血管)
2.栓塞(由于来自身体其他部位的栓子造成的阻塞)，
3.全身性低灌注(Systemic hypoperfusion)(血液供应普遍减少，例如在休克中)
4.脑静脉窦血栓形成。
但中风也可能由血压突然下降或心脏停止跳动、脑动脉或小动脉破裂或其组合引起。
在本公开的一个实施方案中，缺血性中风由创伤性脑损伤(TBI)也称为颅内损伤引起。
在本公开的一个实施方案中，缺血性中风由栓塞、血栓形成、全身性低灌注、脑静脉窦血栓形成、血压突然下降或心脏停止跳动、脑动脉或小动脉破裂或其组合引起。
出血性中风
至少有两种主要类型的出血性中风：
·“脑内出血，其基本上是由于脑实质内出血(脑组织内出血)或脑室内出血(脑室系统内出血)导致的脑本身内的出血(当脑中的动脉破裂，周围组织充满血液)。
·蛛网膜下腔出血(SAH)，其基本上是通常由于脑动脉破裂或动脉畸形而在脑组织之外但仍在颅骨内，确切地说是在蛛网膜和软脑膜(围绕脑的三层脑膜的脆弱的最内层)之间发生的出血。
以上两种主要类型的出血性中风也是两种不同形式的颅内出血，即颅顶内任何地方的血液积聚。
出血性中风可能发生在脑中血管改变的背景下，例如脑淀粉样血管病(cerebralamyloid angiopathy)、脑动静脉畸形和颅内动脉瘤，其能够引起脑实质内或蛛网膜下腔出血。
除了神经损害之外，出血性中风通常会引起特定的症状(例如，蛛网膜下腔出血通常会导致称为霹雳性头痛(thunderclap headache)的严重头痛)或显示先前头部受伤的证据。
在一个实施方案中，提供如本文所定义的MEK抑制剂用于预防或治疗中风，中风是由脑内出血、蛛网膜下腔出血或其组合引起的出血性中风。
在一个实施方案中，脑内出血是脑实质内的、脑室内的，或其组合。
在一个实施方案中，中风由蛛网膜下腔出血引起。
迟发性脑缺血(DCI)
迟发性脑缺血可能在蛛网膜下腔出血后数天发生，并且对于大约三分之一的首次出血幸存者来说是一种潜在可治疗的发病原因。虽然血管痉挛传统上与蛛网膜下腔出血后几天脑缺血的发展有关，但新出现的证据表明，迟发性脑缺血是更复杂的蛛网膜下腔出血后综合征的一部分。迟发性脑缺血的发展涉及早期小动脉血管痉挛，伴有微血栓形成、灌注不匹配(perfusion mismatch)和神经血管解偶联(neurovascular uncoupling)、扩散性去极化和炎症反应，它们开始于出血时并随着时间的推移而发展，最终导致皮层梗死(cortical infarction)。
在一个实施方案中，本文定义的MEK抑制剂用于治疗或预防迟发性脑缺血(DCI)。
在一个实施方案中，DCI表现为炎症、水肿、迟发性脑血管痉挛(CVS)、血脑屏障破坏和/或收缩受体表达增加，例如针对内皮素、血管紧张素、血清素和血栓素或前列腺素的那些。
手术和联合治疗
在一个实施方案中，将MEK抑制剂施用至受试者，而无需在施用之前、同时或之后进行手术。
在一个实施方案中，在血栓切除术之前、同时或之后将MEK抑制剂施用至受试者。
在一个实施方案中，在溶栓之前、同时或之后将MEK抑制剂施用至受试者。
在一个实施方案中，在选自弹簧圈栓塞术(coiling)和夹闭术(clipping)的手术操作之前、同时或之后将本公开的MEK抑制剂施用至受试者。
操作“弹簧圈栓塞术”或“血管内弹簧圈栓塞术”是为阻断来自动脉瘤(动脉壁中的弱化区域)的血流而执行的操作。血管内弹簧圈栓塞术是一种微创技术，这意味着治疗脑动脉瘤不需要颅骨切口。相反，使用导管以到达脑中的动脉瘤。在血管内弹簧圈栓塞术期间，导管通过腹股沟向上进入包含动脉瘤的动脉。然后释放铂弹簧圈。弹簧圈诱导动脉瘤凝固(栓塞术)，从而防止血液进入其中。
操作“夹闭术”或“显微手术夹闭术”是一种使用金属夹来阻断动脉瘤的血液供应的技术。该操作是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，在神经放射学操作之前、同时或之后将MEK抑制剂施用至受试者。
大多数“神经放射学操作”或“介入性神经放射学操作”开始于将导管插入到股动脉中，股动脉是位于腹股沟中的大动脉。导管是一根长而柔韧的空心管，其穿过导向线向上进入主动脉(即，为身体供血的主要动脉)，然后进入通向阻塞的脑动脉的颈部血管。然后使用类似于用于CT血管造影的放射造影染料拍摄动脉图像(也称为血管造影)。这些图片使介入性神经放射科医生能够识别闭塞部位并制定介入计划。然后将较小的导管(微导管)放置穿过初始导管并通过闭塞性凝块。
有两种主要的凝块清除方法：全凝块取出(whole-clot retrieval)(或血栓切除术)和凝块抽吸(clot aspiration)。在第一种技术中，凝块取出装置通过微导管放置，并穿过凝块打开。然后移除捕获凝块的装置。第二种技术，凝块抽吸，涉及凝块的碎裂和抽吸。这是使用比传统微导管更大的导管来执行的，从而提供更大的吸力。血栓切除术和抽吸技术经常结合使用。除了这些机械方法外，许多介入性神经放射科医生还使用局部TPA输注到凝块中以帮助溶解它。
在本公开的一个实施方案中，MEK抑制剂减少或防止由神经放射学操作导致的再灌注损伤。
再灌注损伤，有时称为缺血再灌注损伤(IRI)或复氧损伤，是在一段时间的缺血或缺氧(缺氧症或低氧)后，恢复血液供应到组织(再灌注)时引起的组织损伤。缺血期间血液中氧气和营养物质的缺乏导致这样的状况：其中循环的恢复通过诱导氧化应激而不是(或同时)恢复正常功能而导致炎症和氧化损伤。
在一个实施方案中，提供了一种组合物，其分开或一起包含式(II)的MEK抑制剂，
Figure BDA0003570285400000151
或其药学上可接受的盐，以及另外的药物。
在一个实施方案中，该另外的药物选自：钙通道阻滞剂例如尼莫地平(Nimodipine)，和内皮素受体(ET)受体阻滞剂例如克拉生坦。
在一个实施方案中，该另外的药物选自钙通道阻滞剂。
在一个实施方案中，该另外的药物选自钙通道阻滞剂的子类二氢吡啶(Dihydropyridine)。
在一个实施方案中，该另外的药物选自二氢吡啶，例如氨氯地平(Amlodipine)(Norvasc)、阿雷地平(Aranidipine)(Sapresta)、阿折地平(Azelnidipine)(Calblock)、巴尼地平(Barnidipine)(HypoCa)、贝尼地平(Benidipine)(Coniel)、西尼地平(Cilnidipine)(Atelec、Cinalong、Siscard)、氯维地平(Clevidipine)(Cleviprex)、依福地平(Efonidipine)(Landel)、非洛地平(Felodipine)(Plendil)、伊拉地平(Isradipine)(DynaCirc、Prescal)、拉西地平(Lacidipine)(Motens、Lacipil)、乐卡地平(Lercanidipine)(Zanidip)、马尼地平(Manidipine)(Calslot、Madipine)、尼卡地平(Nicardipine)(Cardene、Carden SR)、硝苯地平(Nifedipine)(Procardia、Adalat)、尼伐地平(Nilvadipine)(Nivadil)、尼莫地平(Nimodipine)(Nimotop)、尼索地平(Nisoldipine)(Baymycard、Sular、Syscor)、尼群地平(Nitrendipine)(Cardif、Nitrepin、Baylotensin)、普拉地平(Pranidipine)(Acalas)。
在一个实施方案中，提供了一种多部件试剂盒，其包括：
如本文所定义的MEK抑制剂；和
如本文所定义的另外的药物；
其中MEK抑制剂和另外的药物被配制用于同时或顺序使用；以及任选的使用说明。
组合物和施用
在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含有效量的MEK抑制剂和另外的药物。
虽然本文公开的MEK抑制剂可以以原始化学化合物的形式施用，但优选将活性成分任选地以生理学上可接受的盐的形式与一种或多种佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂、稀释剂和/或其他常用的药物助剂一起引入到药物组合物中。
在一个实施方案中，本公开提供了组合物，其包含本文所定义的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐或衍生物，以及用于它们的一种或多种药学上可接受的载体，以及任选的本领域已知和使用的其他治疗性和/或预防性成分。载体必须在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。在一个进一步的实施方案中，本发明提供了包含多于一种用于根据本公开的用途的化合物或前药的药物组合物或组合物，例如用于根据本公开的用途的两种不同的化合物或前药。
本公开的组合物可以是适合于口服、直肠、支气管、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、经皮、阴道或肠胃外(包括皮肤、皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、动脉内、脑内、眼内注射或输注)施用的那些，或适合通过吸入或吹入施用(包括粉末和液体气雾剂施用)的形式的那些，或通过缓释系统施用的那些。缓释系统的合适实例包括含有本公开的化合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质可以是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。另一个合适的实例是纳米颗粒。
在一个实施方案中，用于如本文所定义的用途的MEK抑制剂通过口服、鞘内、腹膜内、眼内或静脉内施用。
在一个实施方案中，用于如本文所定义的用途的MEK抑制剂通过鼻内施用。
在一个实施方案中，MEK抑制剂通过静脉内施用。在一个实施方案中，将MEK抑制剂在中风发作后最多6小时施用至受试者，例如中风发作后最多1小时，例如最多2小时，例如最多3小时，例如最多4小时，例如最多5小时。在一个实施方案中，在中风发作后第一剂量MEK抑制剂之后继续进行治疗，持续最多3天。
在一个实施方案中，MEK抑制剂在中风发作后每天施用一次或多次，持续最多3天。
在一个实施方案中，将MEK抑制剂与神经保护剂联合施用至受试者。可以在中风发作后1、2或3天停止用MEK抑制剂对受试者的治疗，而继续用神经保护剂治疗。在一个实施方案中，继续进行神经保护治疗，持续一个月或多个月。
受试者
根据本公开的受试者可以是任何患有或即将患有中风的受试者。优选地，受试者是人类受试者，例如患者。在一个实施方案中，受试者是没有任何过去中风病史的人类受试者。在一个实施方案中，人类受试者先前患有中风。
项目
1.式(I)的MEK抑制剂，其用于预防或治疗受试者的中风，
Figure BDA0003570285400000171
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基和杂芳基。
2.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是C1-C3烷基。
3.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是直链C1-C3烷基。
4.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是甲基或乙基。
5.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是甲基。
6.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R2是C2-C4烷基。
7.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R2是C3或C4环烷基。
8.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R2是环丙基。
9.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中Ar是苯基或取代的苯基。
10.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中Ar是取代的苯基。
11.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中Ar是2-氟-4-碘苯基。
12.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是C1-C3烷基，R2是C2-C4烷基，且Ar是取代的苯基。
13.根据前述项目中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是甲基或乙基，R2是C3或C4环烷基，且Ar是取代的苯基。
14.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂具有式(II)，
Figure BDA0003570285400000191
或其药学上可接受的盐。
15.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风选自：缺血性中风、出血性中风和短暂性缺血发作。
16.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风选自：全脑缺血和局灶性缺血。
17.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述缺血性中风是由栓塞、血栓形成、全身性低灌注、脑静脉窦血栓形成、血压突然下降或心脏停止跳动、脑动脉或小动脉破裂或其组合引起的。
18.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述出血性中风是由脑内出血、蛛网膜下腔出血或其组合引起的。
19.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述脑内出血是实质内的、脑室内的或其组合。
20.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风是由蛛网膜下腔出血引起的。
21.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风是迟发性脑缺血(DCI)。
22.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风是由创伤性脑损伤(TBI)引起的。
23.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述DCI表现为炎症、水肿、迟发性脑血管痉挛(CVS)、血脑屏障破坏和/或收缩受体表达增加，例如针对内皮素、血管紧张素、血清素和血栓素或前列腺素的那些。
24.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中将所述MEK抑制剂施用至受试者，而无需在所述施用之前、同时或之后进行手术。
25.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在血栓切除术之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
26.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在溶栓之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
27.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在选自弹簧圈栓塞术和夹闭术的手术操作之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
28.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在神经放射学操作之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
29.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂减少或防止由神经放射学操作导致的再灌注损伤。
30.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在确定受试者是否患有急性缺血性中风或出血性中风之前，将所述MEK抑制剂施用至所述受试者。
31.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂通过口服、鞘内、腹膜内、眼内或静脉内施用。
32.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂通过静脉内施用。
33.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中将所述MEK抑制剂在中风发作后最多6小时施用至受试者，例如中风发作后最多1小时，例如最多2小时，例如最多3小时，例如最多4小时，例如最多5小时。
34.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂在中风发作后每天施用一次或多次，持续最多3天。
35.根据前述项目中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述受试者是人类受试者。
36.前述项目中任一项所定义的式(I)的MEK抑制剂用于以下的用途：
a.降低内皮素-1诱导的收缩性；
b.增加内皮素B受体功能；和/或
c.改善神经学评分，这可以通过在诱发的蛛网膜下腔出血之后受试者通过旋转杆的能力来评价。
37.一种治疗受试者中风或降低受试者发生中风的风险的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用式(I)的MEK抑制剂的步骤，
Figure BDA0003570285400000221
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基、苯基和杂芳基；
从而治疗中风或降低发生中风的风险。
38.一种组合物，其分开或一起包含式(II)的MEK抑制剂，
Figure BDA0003570285400000222
或其药学上可接受的盐，以及另外的药物。
39.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述另外的药物选自：钙通道阻滞剂例如尼莫地平，和内皮素受体(ET)受体阻滞剂例如克拉生坦。
40.一种多部件试剂盒，其包括：
前述项目中任一项所定义的MEK抑制剂；和
前述项目中任一项所定义的另外的药物；
其中MEK抑制剂和另外的药物被配制用于同时或顺序使用；以及任选的使用说明。
实施例
实施例1：对选择的MEK1/2抑制剂的器官培养和浓度反应曲线
材料和方法
饲养、居所和伦理
将110只从Taconic(丹麦)获得的Sprague-Dawley大鼠(NTac:SD)维持在12/12小时的光暗循环(光照从上午7点开始)并安置在恒定的温度(22±2℃)和湿度(55±10％)下，随意进食和饮水。通常将大鼠2-6只一起安置在欧洲标准笼子(VI型，带123盖)中，并在手术操作后单独安置(III型，带123盖)。将52只雄性Sprague-Dawley大鼠(298-370g)用于手术操作，并获得了丹麦动物实验监查局(Danish Animal Experimentation Inspectorate)的批准(许可证号2016-15-0201-00940)。动物工作在丹麦Rigshospitalet-Glostrup的Glostrup研究园进行。
脑动脉的收获和器官培养(离体模型)
用O2/CO2(30/70％)使大鼠镇静并通过断头术处死。将脑轻轻取出并在以下组成的冷的充氧缓冲溶液中冷却：119mM NaCl、4.6mM KCl、1.5mM CaCl2、1.2mM MgCl2、1.2mMNaH2PO4、15mM NaHCO3和5.5mM葡萄糖；pH 7.4。在生理缓冲溶液中小心地将基底动脉(BA)从脑中解剖出来，然后进行OC(首次接受实验的动物(
Figure BDA0003570285400000231
animal))或直接安装在丝状肌动描记器(wire myograph)中(来自经历过手术操作的大鼠的动脉)。将段在补充有链霉素和青霉素的DMEM中在加湿的5％CO2/O2中在37℃下与抑制剂或溶媒(DMSO)一起孵育48小时。24小时后更换培养基。
肌动描记器-离体药理学(OC和体内)
为了进行收缩性测量，将孵育的BA(离体)和手术操作后的BA(体内)切成段并安装在肌动描记器浴中的一对金属丝(40μm)上。在培养基中48小时后以相同的方式安装来自OC的动脉。将一根丝连接到一个测微螺旋，该测微螺旋允许对丝之间的距离进行微调，控制血管紧张度。将第二根丝连接到与模数转换器(AD Instruments，Oxford，UK)配对的力位移传感器。
这些段在用95％O2/5％CO2充气的pH为7.4的生理缓冲液中平衡，温度设置为37℃，将丝分开以用于2Nm-1的等长预张力(isometric pretension)。通过用60mM K+缓冲溶液交换缓冲液，将动脉的段用60mM K+暴露2或3次。为了保持相同的摩尔渗透压浓度，已从缓冲液中去除了成比例量的Na+。将绝对截止值设置为2.0mN K+ max，以包含来自接受手术操作的大鼠的动脉段。通过添加5-HT(3·10-7M)然后添加卡巴胆碱(10-5M)来评价内皮功能。对于来自OC的动脉，实验方案如下：首先是绘制对角蝰毒素6C(S6c，10-14-10-7M)的累积浓度-反应曲线，然后是绘制对内皮素-1(ET-1，10-14-10-7M)的浓度-反应曲线。在ET-1峰值(10-7M)时，将缓冲液改为含有10-7M ET-1和尼莫地平(L型电压依赖性Ca2+通道进入阻滞剂，10-7M)的不含Ca2+的缓冲液。然后绘制对Ca2+的浓度-反应曲线(0.0125-3mM)。当研究血管舒张时，将动脉用U46619(1·10-7-3·10-7M)或K+(41mM)预收缩，并通过添加降钙素基因相关肽(CGRP，10-12-10-7M)、卡巴胆碱(10-10-10-5M)或SNP(10-11-10-4M)绘制累积浓度-反应曲线。
从每只经过手术的动物选择两个动脉段用于对ET-1(10-14-10-7M)的累积浓度-反应曲线或在尼莫地平(10-7M)存在下的ET-1预收缩(10-7M)的Ca2+浓度-反应曲线(0.0125-3mM)。如果在截止值之上只有一条曲线，则优先处理对ET-1的浓度-反应曲线。具有最高K+反应的段通常分配到对ET-1的浓度-反应曲线。通过向不含Ca2+的缓冲溶液添加增加体积的CaCl2(来自125mM储备溶液)来绘制对Ca2+的浓度-反应曲线。不含Ca2+的缓冲溶液具有与上述相似的组成，但1.5mM CaCl2被替换为0.03mM EDTA。
统计和数据采集
每个段的收缩反应根据动脉的长度进行调整，并表示为mN/mm(Nm-1)。如果对60mMK+的反应没有显著不同，则收缩性数据显示为单个血管60mM K+ max平台反应相对于基线的百分比。为了比较ET-1敏感性，将动脉归一化为单个血管ET-1max的百分比。当动脉在添加最后浓度之前达到最大收缩时，曲线被限制为该最大收缩。相对log IC50/log EC50是对应于较低和较高平台估计值之间的反应中间值的浓度。Emax是浓度反应曲线中的最大收缩，ET-1max是对ET-1的最大收缩。除非另有说明，否则所有定量数据均表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
通过单向ANOVA和Holm-Sidak的多重比较检验(所有组相互比较)对K+和内皮依赖性反应进行统计学比较。通过双向重复测量ANOVA与Holm-Sidak的多重比较检验对浓度-反应曲线进行统计学比较，并将Geisser-Greenhouse球形度校正用于归一化的ET-1max数据。通过比较双相与非线性回归曲线拟合、log(激动剂)-可变斜率来进行竞争曲线拟合。对于所有ET-1曲线，双相回归模型被认为是最佳曲线拟合。使用双尾Fischer精确检验来评价神经系统评估分数的显著性。使用Graphpad 8.02软件进行统计学分析，且将显著性p值定义为：*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。
试剂
S6c来自PolyPeptide Group(瑞典)，ET-1来自Bachem(德国)，CGRP来自Tocris(英国)。除了U0126之外，所有MEK1/2抑制剂均得自Selleckchem并溶解在DMSO中。U0126单乙醇化物(U120)、DMSO(Sigma D2650)和所有其他化学品均得自Sigma Aldrich。
结果
对从588只大鼠(Sprague Dawley雄性大鼠，～320g)分离的大鼠基底动脉(BA)进行器官培养(OC)，每个BA分为4段。起初以1μM的浓度测试了一组MEK1/2抑制剂，该浓度刚好低于迄今为止使用的U0126功效的既定阈值(10μM)。图1A显示了相对于60mM K+诱发的收缩，高度特异性ETB激动剂S6c诱发的收缩。在初步筛选后将抑制剂分为4组。各组如下：I)在1μM溶媒(DMSO)和U0126下无效。II)一些效果：比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(selumetinib)和RO5126766。III)临界有效：瑞法替尼(Refametinib)。IV)高度有效：考比替尼(Cobimetinib)、TAK-733、曲美替尼和PD0325901。基于无细胞IC50(图9)将后一组进一步分为两组，因为这两个亚组在1μM时无法相互区分。
在与DMSO(溶媒)或MEK1/2抑制剂一起孵育的动脉段之间去极化诱发的收缩没有显著差异(图1B)。还研究了动脉的内皮功能。这通过将10-5M卡巴胆碱应用到用3·10-7M的5-HT预收缩的动脉进行测试。采用DMSO或U0126的OC均与对卡巴胆碱的不良内皮反应有关(图1C)。有趣的是，一些组之间存在显著差异，这似乎遵循与对S6c抑制所观察到的相同的趋势(图1A)。与DMSO溶媒相比，三种MEK1/2抑制剂TAK-733(P＝0.0065)、曲美替尼(P＝0.0026)和PD0325901(P＝0.0474)具有显著更好的内皮功能。
对所选的抑制剂进行了表征。使用从对S6c诱发的收缩无抑制到接近最大抑制的整个对数浓度确定六种所选的候选物的IC50值(基于S6c的Emax)(图2A)。比美替尼(pIC505.17±0.46)和RO5126766(pIC50 5.68±0.26)是最低效的抑制剂，这与图1中的数据相符合。在分析抑制剂的浓度-反应曲线时，很明显TAK-733(pIC50 6.89±0.31)和考比替尼(pIC50 7.25±0.51)不如曲美替尼(pIC50 7.68±0.32)和PD0325901(pIC50 7.71±0.29)有效(图2A)，这在图1中未观察到。
此外，研究了是否对去极化(60mM K+)诱发的动脉收缩性有任何影响(图2B)。各组之间无显著差异，且未观察到明显的浓度依赖性影响。初始筛选(图1C)显示了MEK1/2抑制剂对内皮功能的有趣影响。图2C显示了MEK1/2抑制剂对响应于卡巴胆碱的内皮功能的浓度依赖性影响，具有与在S6c的Emax的浓度-反应曲线中对抑制剂所观察到的相似的趋势(图2A)。
结论
已知在48小时OC中用10μM U0126处理的脑动脉显示出对ETB特异性S6c诱发的收缩性的抑制作用。在本公开中，1μM U0126没有显示出显著作用，而1μM的曲美替尼和PD0325901在48小时器官培养后几乎完全抑制了收缩反应(图1A)。来自OC实验的数据说明用特异性ETB激动剂S6c进行评估后，MEK1/2抑制与ETB受体的功能性上调之间具有密切联系。无细胞IC50值(图13)也与抑制ETB受体上调的IC50值密切相关(图2A)。这支持了MEK1/2抑制与脑动脉中功能性受体变化之间的联系。
因此，通过抑制包括MEK1/2在内的信号通路，可以完全防止离体ETB受体的功能性上调。
实施例2：在基底动脉的48小时器官培养后，有效的MEK1/2抑制剂对调节血管舒缩 的通路的影响
材料和方法
方法如前述实施例所述进行。
结果
由于用最有效的MEK1/2抑制剂孵育的动脉表明内皮功能得以保留，因此进一步研究了这种改善的可能原因。将用1μM曲美替尼或PD0325901进行OC后的动脉用血栓素A2激动剂U46619(1·10-7-3·10-7M)或K+(41mM)预收缩。各组之间的预收缩水平没有显著差异。在这组新的实验中，证实了响应于卡巴胆碱的血管舒张的改善(10-10-10-5M，图3A)。卡巴胆碱的这种作用可能是由改善的内皮NO释放或血管平滑肌细胞(VSMC)中NO敏感性的变化引起的。如图3B所示，在添加NO供体硝普盐(nitroprusside)(SNP，10-11–10-4M)后Emax存在显著差异。这表明VSMC中cGMP和NO敏感信号传导的变化是与MEK1/2抑制剂一起孵育后表观内皮功能增加的原因。由于cGMP和cAMP在调节脑动脉血管舒缩方面都很重要，因此还研究了与cAMP产生相关联的信号通路。没有观察到对CGRP的反应的差异(10-12-10-7M，图3C)。
已知脑动脉在脑缺血和SAH后表现出VDCC(电压依赖性钙通道)非依赖性收缩，这在新鲜动脉中不存在。为了进一步表征导致收缩增强的细胞通路的变化，通过在含有10-7M尼莫地平(L型VDCC抑制剂)的不含Ca2+的缓冲液中将Ca2+添加到用ET-1预收缩的BA中，绘制对Ca2+的浓度-反应曲线。图3D显示了BA的VDCC非依赖性收缩，其中只有曲美替尼(P＝0.019)显著阻止了这种增加的VDCC非依赖性收缩。
结论
在非SAH脑动脉或在新鲜动脉中，VDCC占主导地位，这可被尼莫地平(SAH的标准治疗)阻断。在本公开中发现，在SAH和在48小时OC中，钙通道发生变化。这些操作导致非依赖类型的VDCC的表达增加，即不能被采用尼莫地平的标准治疗阻断。发现曲美替尼显著防止这种增加的VDCC非依赖性收缩，这(i)使钙通道表达正常化，和(ii)可能使受试者适合用尼莫地平治疗。
实施例3：曲美替尼和PD0325901在大鼠中的比较
材料和方法
大鼠蛛网膜下腔出血模型(体内模型)
将大鼠麻醉并准备自体血液的脑池输注，其用于模拟SAH。假手术的大鼠经历了相同的操作，省略了300μL的脑池内血液注射。在操作结束时，在ICP导管的末端放置PinPort(PNP3F22，Instech，美国)，以通过PinPort注射器(PNP-3M，Instech，US)为鞘内(i.t.)注射治疗提供通路。手术后24小时，大鼠接受皮下注射卡洛芬(Carprofen)(Norodyl，5mg/kg)(Scanvet，丹麦)用于镇痛。
体内治疗方案
本公开中使用的曲美替尼和PD0325901的浓度和剂量基于来自本公开的离体数据。在整个研究过程中，所有治疗都是设盲的，并且所有治疗方案都可以在图9中找到。
鞘内治疗
估计针对约90μL的脑脊液(CSF)体积(21)的鞘内(i.t.)治疗体积，且总剂量通过在手术操作过程中放置在小脑延髓池中的ICP导管中的PinPort以三个治疗(4小时、10小时和24小时)施用。第一次和第三次注射在大鼠固定下进行。由于手术后10小时的治疗由一名研究人员施用，因此使用面罩用在大气/O2(70％/30％)中的3.5-4％异氟烷(保持在1.75-2％)对大鼠进行短暂麻醉，以防止大鼠突然移动。手术后立即并连同10小时和24小时治疗向动物皮下给予2.5ml等渗盐水以避免脱水。所有体内治疗均溶解在含0.5％氢化蓖麻油(cremophor)EL(Kolliphor EL)的Elliott’s B(人工CSF)溶液中：NaCl 125mM、NaHCO323mM、葡萄糖4mM、MgSO4 1mM、KCl 4mM、CaCl2 1mM和Na2HPO4 1mM。
手术参数-i.t.组
在所有41只大鼠中，平均动脉血压(MABP)、pH、pCO2、pO2、ICP(138.4±6.9mmHg)和温度在手术期间均在可接受的生理限度内。在SAH+溶媒组中，在SAH后24小时出现一例手术后死亡。
结果
进一步研究了在OC研究中鉴定的两种对SAH的大鼠模型最有效的MEK1/2抑制剂。曲美替尼和PD0325901的效力最高，这意味着它们潜在地可以以比当前的药物选择U0126更小的体积应用。在将1μM、15μL i.t.注射到大鼠的CSF体积(假设为90μL)中之后，预测稀释后CSF浓度约为10-7M。这对应于离体OC研究中估计的75％抑制剂作用(图2A)。
结论
发现曲美替尼具有高效力，表明它可以以低于当前的药物选择U0126的剂量使用。发现首选药物U0126在体内鞘内具有类似的有利作用，但由于其溶解度差，无法将该药物转化为全身施用。发现曲美替尼具有出色的溶解度和效力，这表明它可以以较低的体积使用，允许全身使用，同时仍显示出有利的抗SAH参数。
实施例4：i.t.曲美替尼和PD0325901治疗对60mM K+的收缩反应和内皮功能的影 响
材料和方法
方法如前面实施例中概述进行。
结果
所有BA对60mM K+的收缩反应(Nm-1)(包括低于截止值的血管)显示，与假手术+i.t.溶媒组(3.30±0.45Nm-1)和SAH+i.t.溶媒组(3.45±0.22Nm-1)二者相比，在SAH+i.t.曲美替尼组(5.00±0.29Nm-1)显示出显著更高的收缩反应(图4A)。单个段长度(范围0.9-1.2mm；1.0±0.1mm)在各组之间没有显著差异。与其他组相比，SAH组具有略低的内皮功能平均值，但没有显著差异(SAH vs.i.t.曲美替尼，P＝0.1382)(图4B)。
结论
使用比U0126效力更高的MEK1/2抑制剂允许表观内皮功能的浓度依赖性保存(图2C)。对于内皮功能和收缩ETB受体的功能性上调，观察到类似的模式(图2A)。因此，MEK1/2通路似乎响应于通过动脉的血流减少而参与破坏内皮和VSMC信号传导。这与以CGRP为例的神经元血管舒张信号传导形成对比，对其未观察到变化(图3C)。由于相对较高的可变性，对用曲美替尼或PD0325901进行体内治疗的动物的内皮功能未观察到显著变化。尽管两组的平均值均高于SAH组和SAH+i.t.溶媒组(图4B)。
与曲美替尼或PD0325901对ETB受体收缩性和表观内皮功能的影响形成对比，没有观察到抑制剂对OC后K+反应的浓度依赖性影响(图2B)。然而，与用i.t.溶媒治疗相比，在实验性SAH后用i.t.曲美替尼(但不是i.t.PD0325901)治疗的大鼠显示出更高的K+反应(图4A)。用i.t.曲美替尼或i.t.PD0325901孵育的血管具有比OC模型中测试的化合物(图1B)更高端的K+反应。
实施例5：i.t.曲美替尼和PD0325901治疗对响应于ET-1的收缩反应的影响
材料和方法
方法如前面实施例中概述的进行。
结果
由于K+反应不同，最初使用非归一化数据。来自所有治疗方案(图9)的BA通过对ET-1(10-14–10-7M)的累积浓度-反应曲线进行比较。曲线之间没有观察到显著差异(图5A)。通过将曲线归一化为它们自己的ET-1max来研究动脉的ET-1敏感性。对于ET-1max归一化数据，与SAH+溶媒组相比，在SAH+i.t.曲美替尼组中，在低ET-1浓度(10-12.5–10-11.0M)下的收缩显著降低(图5B)。通过比较双相vs.四参数可变斜率回归来进行竞争曲线拟合。对于所有组，双相回归模型被认为是最佳曲线拟合(图10)。与假手术+i.t.溶媒组(-11.91至-10.07)和SAH+i.t.曲美替尼组(-11.04至-9.936)相比，SAH组的logEC50(1)95％置信区间(-12.74至-12.17)具有显著更高的敏感性。在logEC50(2)，SAH+i.t.曲美替尼组(-8.964至-8.862)的敏感性显著低于SAH+i.t.溶媒组(-9.228至-9.050)。logEC50(1)值和logEC50(2)值对于绝对曲线(Nm-1)和ET-1max归一化曲线都是相似的(图5A和5B)。所有logEC50(1)值、logEC50(2)值和95％CI值都可以在图10中找到。
结论
SAH导致对ET-1的敏感性增加，这是该疾病的标志。发现SAH+i.t.曲美替尼对ET-1的敏感性显著低于SAH+i.t.溶媒组。因此，曲美替尼能够有效阻止SAH后内皮素受体的有害上调。
实施例6：i.t.曲美替尼和PD0325901治疗对VDCC非依赖性钙离子收缩的影响
材料和方法
方法如前面实施例中概述地进行。
结果
为了研究体内治疗是否影响VDCC非依赖性收缩性，在ET-1(10-7M)预收缩的BA中和在10-7M尼莫地平的存在下绘制对Ca2+(0.0125-3mM)的累积浓度-反应曲线。与假手术+i.t.溶媒组(0.6±1.2Nm-1)、SAH+i.t.溶媒组(1.2±0.2Nm-1)和SAH+i.t.PD0325901组(1.0±0.3Nm-1)相比，SAH组(2.8±0.5Nm-1)具有显著更高的尼莫地平不敏感ET-1max收缩，而SAH+i.t.曲美替尼组(1.8±0.5Nm-1)和对照组之间没有显著差异(图6)。
结论
SAH导致更高程度的尼莫地平不敏感钙通道反应。曲美替尼治疗使VDCC非依赖性收缩正常化至与对照相似的水平。
实施例7：i.t.曲美替尼和PD0325901治疗效果的神经学评估
材料和方法
神经学评估-旋转杆测试
使用旋转杆测试评价总感觉运动功能，包括在诱发SAH前一天的基线评价。简而言之，用在末端装有大鼠自己的垫草材料的笼子(“闻起来像家一样”)对穿过10rpm旋转杆(直径45mm，长150cm)的运动进行了评价。根据以下定义对大鼠的表现进行评分：低，动物在不跌落的情况下不能穿过杆；高，动物可以通过整个杆而不跌落。所有动物在手术前都经过训练以通过杆。SAH前和手术后第1天和第2天，分别对每只动物就左和右旋转进行两次评分，即每只动物计数4次。由对动物实验组不知情的人员对动物进行分级。数据显示为高得分计数/总得分计数的百分比。
结果
本文进行的旋转杆测试不是纯粹的运动功能测试，因为它确实需要提前对大鼠进行训练。除了学习方面，杆是旋转的事实也导致动机成为成功的一个因素。因此，成功的得分牵涉记忆力、动机和注意力。在三个时间点对大鼠进行评分：SAH前、SAH后24小时和48小时(数据显示为高得分计数/总得分计数的％)。
手术前所有大鼠在旋转杆测试中得分均为100％(图7A)。将SAH后24小时与SAH前进行比较，除了假手术+i.t.溶媒组之外，所有组均出现神经学评分缺陷(图7A-C，图12)。与SAH前相比，实验性SAH后的大鼠在48小时后表现出显著恶化的神经学评分(之前的得分100％到48h的得分75％，P＝0.0022)。在48小时终点，SAH+i.t.曲美替尼组(48h的得分96％)、假手术+i.t.溶媒组(48h的得分100％)和SAH+i.t.溶媒组(48h的得分94％)的大鼠的神经学评分显著高于SAH组的大鼠(48h的得分75％)(图7C)。所有得分百分比参见图12。
结论
对于曲美替尼，观察到神经学评估得分(旋转杆测试)的改善，但对于药代动力学不稳定的PD0325901则没有观察到，这支持SAH后在VSMC中观察到的MEK1/2通路参与表型调节。
实施例8：i.p.曲美替尼治疗对响应于60mM K+、ET-1的收缩反应和神经学评估的 影响
材料和方法
腹膜内治疗
对于腹膜内治疗(i.p.)，将化合物溶解在含10％氢化蓖麻油EL(Kolliphor EL)和10％PEG400的NaCl溶液中，NaCl也用作溶媒。将总剂量作为两次治疗(6小时和24小时)施用。手术后立即并连同治疗向动物皮下给予2.5ml等渗盐水以避免脱水。
手术参数-i.p.组
在所有11只大鼠中，平均动脉血压(MABP)、pH、pCO2、pO2、ICP(124.2±6.3mmHg)和温度在手术期间均在可接受的生理限度内。
结果
由i.t.概念验证研究开始，进一步地，使用i.p.注射治疗方案对曲美替尼进行了测试。将动物暴露于SAH并在SAH后6和24小时用i.p.注射曲美替尼或溶媒进行治疗。诱导实验性SAH后48小时，将动脉分离用于丝状肌动描记器。在SAH+i.p.溶媒或SAH+i.p.曲美替尼之间，各个段长度(范围0.9-1.2mm；1.13±0.02mm)没有显著差异。在比较SAH+i.p.曲美替尼组(3.03±0.19Nm-1)与SAH+i.p.溶媒组(3.23±0.27Nm-1)时，所有BA对60mM K+的收缩反应(Nm-1)没有显示任何差异(图8A)。这与SAH+i.t.治疗形成对比(图4A)。
通过对ET-1(10-14–10-7M)的累积浓度-反应曲线比较了SAH+i.p.曲美替尼组和SAH+i.p.溶媒组。与SAH+i.p.溶媒组相比，SAH+i.p.曲美替尼组的收缩性(在10-9.5M下)显著降低。通过比较双相vs.四参数可变斜率回归来进行竞争曲线拟合。对于这两个组，双相回归模型被认为是最佳的曲线拟合，logEC50(1)值、logEC50(2)值和95％CI值可见于图10。通过旋转杆测试来评价相同动物的神经功能缺陷(图8C/D)。在两个时间点对大鼠进行评分：SAH后24小时和48小时(数据显示为高得分计数/总得分计数的％)。在48小时终点，SAH+i.p.曲美替尼(48h的得分100％)的大鼠的得分显著优于SAH+i.p.溶媒(48h的得分71％)(p＝0.0143)。所有得分百分比参见图12。
结论
与SAH+i.p.溶媒组相比，发现SAH+i.p.曲美替尼大鼠的收缩性显著降低。在旋转杆测试中，SAH+i.p.曲美替尼的大鼠的得分显著优于SAH+i.p.溶媒。
实施例9：雌性大鼠蛛网膜下腔出血亚急性期的影响
材料和方法
动物
将雌性Sprague-Dawley大鼠(NTac:SD，Taconic，丹麦)保持在恒定温度(22±2℃)和湿度(55±10％)下，每日节律为12小时光照/12小时黑暗，提供标准食物(Altromin，Scanbur，丹麦)和随意饮水。大鼠通常2-6只一起饲养在欧洲标准笼子(VI型，带123盖)中并在手术操作后单独饲养(III型，带123盖)。所有大鼠在实验前适应5-7周。
阴道涂片-动情周期测定
在SAH手术前两周，通过收集阴道涂片以对存在的细胞类型进行显微镜表征，每天监测每只大鼠的动情周期。为了尽量减少由于雌激素水平波动引起的潜在实验变异性，将动情前期的雌性大鼠排除在研究之外。
SAH的实验模型
所有程序均严格按照国家法律和指南执行，并得到丹麦动物实验监查局的批准(许可证号2016-15-0201-00940)。
与雄性大鼠一样诱发SAH。通过皮下(s.c.)施用hypnorm/咪达唑仑(midazolam)的混合物(0.25ml/kg Hypnorm的混合物(枸橼酸芬太尼(fentanyl citrate)(0.16mg/kg)、氟阿尼酮(fluanison)(5.0mg/kg)和咪达唑仑(Hameln Pharma，德国)(2.0mg/kg))或腹膜内(i.p.)施用氯胺酮(ketamin)/甲苯噻嗪(xylazine)的混合物(1.5ml/kg氯胺酮(MSDAnimal Health)(100mg/ml)和甲苯噻嗪(KVP pharma，德国)(20mg/ml)的3:2混合物)，将雌性Sprague-Dawley大鼠(230-300g，14-17周)麻醉，然后插管并用30％O2和70％大气进行通风。在血液气体分析仪(ABL80 FLEX，Radiometer，丹麦)中定期分析血液样品(PaO2、PaCO2和pH)。使用调节加热垫(TC-1000，CWE,Inc.，PA，美国)将体温保持在37℃±0.5℃。MABP和ICP通过分别插入到尾动脉和小脑延髓池中的连接到压力传感器和Powerlab单元的导管连续测量，并由LabChart软件(均来自AD Instruments，Oxford，英国)记录。通过在颅骨上前囟前4mm和中线向右3mm钻出的孔将激光多普勒血流计探头(Oxford Optronix，英国)放置在硬脑膜上(在操作过程中定期通过盐水冲洗冷却)。通过在中线上前囟前6.5mm钻出的第二个孔，将25G
Figure BDA0003570285400000351
套管(REF:4505905，B.Braun Melsungen AG，德国)以与垂直平面成30°角的方式向紧邻视交叉前方的尖端的最终位置立体定向下降。平衡10分钟后，从尾导管抽取250μL或300μL血液并将其通过套管手动注射。手动控制血液注射的压力和速度，旨在将ICP提高到所有动物的平均MABP水平的较高范围(约150mmHg)，同时控制注射速度以产生CBF的急性和长时间下降。随后，大鼠在麻醉下维持另外30分钟。在操作结束时，用PinPort(PNP3F22，Instech，美国)密封ICP导管的尖端，以便以后测量ICP，并将尾导管、针头和激光多普勒探头小心移除，并封闭切口。此后使大鼠苏醒并拔管。在手术结束时并在此后每天一次，大鼠接受皮下注射卡洛芬(5mg/kg，Scan Vet，丹麦)和2.5mL等渗盐水。假手术大鼠经历相同的操作，不同之处在于套管没有下降，并且没有将血液注射到视交叉中。将大鼠保持在单独的笼中直到手术后2天通过断头术安乐死。
实验组
在初步研究中，通过在交叉前池中注射250μL自体血液，在雌性大鼠中诱发SAH，并通过肌动描记法评价基底动脉(BA)和大脑中动脉(MCA)的收缩反应(n＝12，7只SAH和5只假手术)。在实际研究的实验中，雌性大鼠被注射了300μL自体血液。假手术大鼠作为对照(n＝34，18只SAH和16只假手术)。将大鼠随机分到SAH组或假手术组中。本研究中共使用了46只大鼠。
神经学测试
a)旋转杆测试
使用旋转杆测试以不同的速度(3或10rpm)评价总感觉运动功能。在杆(直径45mm，长150cm)的一端放置一个笼子，其具有朝向杆的进入口。笼子的地板上覆盖着来自被测大鼠的居住笼的垫草材料。大鼠表现按以下标准评分：1分，动物无法在杆上保持平衡，且立即跌落；2分，动物在杆上保持平衡，但穿过杆有严重困难，移动<30cm；3分，动物用其爪子抱住杆，没有到达杆的末端，但设法移动>30cm；4分，动物通过杆但用其爪子抱住杆和/或用其后腿跳跃；5分，动物以正常姿势通过杆，但脚滑>3次；6分，动物完美地通过杆，脚滑<3次。手术前对所有动物进行训练，直到它们达到5或6分。在手术后第1天和第2天，每只动物在静态杆上测试两次，并在每个旋转速度下测试4次，两次向左旋转，两次向右旋转。
b)行为观察
每天观察一次大鼠，并根据收集的以下参数对它们的行为进行评分：体温、身体姿势(背部低或弯曲)、眼睛(闭合、干燥或血液)、毛皮(脏或立毛)、粪便(干或无)、大鼠噪音(处理大鼠时)、噪音敏感(过度活跃)、性情(被动、攻击性)、移动、平衡和耳朵(白色)。对所有11项观察如下进行评分：正常状态＝0，中等状态＝1，不良状态＝2。对每天的观察计算每组的平均得分。
脑动脉的收获
在进行手术后两天在CO2镇静下使大鼠断头。迅速将脑取出并在冷的碳酸氢盐缓冲溶液中冷却。从脑中仔细解剖基底动脉(BA)和大脑中动脉(MCA)。对于收缩性测量，将BA和MCA切成1-1.5mm长的圆柱形段并安装在丝状肌动描记器上。
体外药理学
为了测量脑动脉的收缩反应，使用肌动描记器(Danish Myograph Technology A/S，丹麦)记录分离的动脉段的等长张力。将血管段安装在丝状肌动描记器装置中的两根40μm直径的不锈钢丝上。然后将这些段浸入到具有以下组成(mmol/L)的温控碳酸氢盐缓冲溶液(37℃)中：NaCl 119、NaHCO3 15、KCl 4.6、MgCl2 1.2、NaH2PO4 1.2、CaCl2 1.5和葡萄糖5.5。将缓冲液用含5％CO2的O2连续充气，保持pH 7.4。在三步过程中将血管段拉伸至先前发现是最佳的最佳预张力(2mN)，然后使其在此张力下平衡大约20-30分钟。然后使血管暴露于具有60mM K+的碳酸氢盐缓冲溶液，该溶液是通过在上述等渗碳酸氢盐缓冲溶液中用KCl部分地代替59.5mmol/L NaCl而获得的。K+诱发的收缩反应被用作激动剂诱导的反应的归一化的参考值，并评价去极化诱发的血管收缩能力。只有分别具有>2mN和>0.8mN的K+诱发的反应的BA和MCA被用于进一步评价。通过用5-羟色胺(5-HT)(Sigma-Aldrich，H9523)(3×10-7M)预收缩，然后用卡巴胆碱(Sigma-Aldrich，C4382)(10-5M)松弛，评估血管段中功能性内皮的存在。对胆碱能受体激动剂卡巴胆碱的松弛反应被认为是功能性内皮的指示。通过在10-14至10-7M的浓度范围内累积应用内皮素受体(ETA/ETB)的天然配体ET-1(Bachem，4040254)获得浓度-反应曲线。同样，通过在10-12至10-5M的浓度范围内累积应用5-HT1B/5-HT1D激动剂5-羧基酰氨基色胺(5-CT)(Sigma-Aldrich，C117)获得5-CT的浓度-反应曲线。
颅内压测量
在手术后1天和2天，使用一种被开发用于在大鼠中进行连续、实时ICP测量的新型充满流体的密封PinPort系统进行ICP记录。通过带有PinPort注射器(PNP-3M，Instech，美国)的流体填充管将小脑延髓池导管的密封PinPort(PNP3F22，Instech，美国)连接到压力传感器。将压力传感器连接到电源实验室(power lab)，并且通过LabChart软件(ADInstruments，Oxford，英国)记录ICP。为了获得不受运动干扰的测量结果，在ICP记录前15分钟用0.5mL/kg咪达唑仑(2.0mg/kg)对大鼠进行镇静，然后记录ICP15分钟，然后移除PinPort注射器并将大鼠返回到动物设施。
脑水肿的评估
断头术后，将脑迅速取出并置于冰冷的碳酸氢盐缓冲溶液中。将脑分为两个完整的脑半球，没有小脑。将每个半球进一步分为以下区域：纹状体、海马体和皮层，用于脑水肿形成的区域测定。通过比较湿干比(WDR)来评估脑水肿。用天平将组织称重(湿重(ww))至0.1mg以内。在干燥箱中在110℃加热组织24小时后，测量脑的干重(dw)。然后使用以下公式将组织水含量计算为脑中水含量的百分比：(ww-dw/ww)×100％。
统计和数据分析
数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)，n是指大鼠的数目。对于体外药理学研究，收缩反应表示为最大60mM K+诱发的收缩相对于基线的百分比。Emax值代表激动剂引起的最大收缩反应，而pEC50是引起半数最大反应的药物浓度的负对数。对于双相反应，Emax1和pEC50 1描述了高亲和力相，而Emax2和pEC50 2描述了低亲和力相。使用双向ANOVA与Bonferroni事后检验来分析浓度-反应曲线、旋转杆和ICP测量值之间的统计学差异。在比较两个不同的观察/时间点时，使用非配对t检验来研究统计学差异。使用Graphpad 5.1软件进行统计分析和数据呈现。显著性的p值定义为：*：P＝(<0.05)，**：P＝(<0.01)，***：P＝(<0.001)。
结果
手术、阴道涂片和生理学参数
所有大鼠均在研究中幸存。由于其在手术当天的激素状态(雌激素水平高的动情前期大鼠)，两只大鼠被排除在研究之外。阴道涂片的每日评价证实，在手术当天，剩余的大鼠在假手术组和SAH组之间相对于周期阶段(动情后期、动情间期、动情期)随机分配。在初步研究(注射250μL自体血液，数据未显示)或主要研究(注射300μL血液，图14)中，比较SAH大鼠和假手术大鼠，在生理学参数(重量、MABP、pH、pO2或pCO2)方面没有显著差异。作为血液注射的结果，在接受300μL自体血液的雌性大鼠中，皮层血流量下降到静息流量的16.24±6％(图15)。
初步研究(雌性大鼠接受250μL血液)
与假手术相比，接受250μL自体血液的雌性大鼠在SAH后2天的脑血管收缩部分增加
比较来自假手术大鼠和SAH手术的大鼠的动脉段(BA和MCA)，用60mM K+富集的缓冲液去极化诱发的收缩没有差异(图16)。类似地，比较来自假手术和SAH的动脉段(BA和MCA)，在5-HT预收缩的血管中，通过乙酰胆碱诱发的舒张而研究的内皮介导的扩张没有差异。先前已经表明，来自雄性SAH诱发的大鼠的动脉段导致ET-1浓度-收缩曲线向左移动并过渡到双相曲线，而假手术的雄性大鼠的ET-1浓度-收缩曲线是S形的。雄性大鼠SAH后的双相曲线反映了除了已经存在的收缩ETA受体之外，VSMC中还出现了收缩ETB受体。在通过向雌性大鼠注射250μl自体血液进行SAH诱发的初步研究中，ET-1分别在来自SAH诱发的大鼠和假手术大鼠的BA和MCA段中都诱发了S形曲线。然而，与假手术相比，来自经受SAH的雌性大鼠的BA和MCA导致向左移动和对ET-1的敏感性显著增加(图16)。在来自雌性SAH大鼠的MCA段中，观察到与假手术相比5-CT浓度-收缩曲线显著向左移动，因此，在BA中，在SAH和假手术大鼠之间5-CT诱发的收缩没有明显差异(图16)。
主要研究(雌性大鼠接受300μL血液)
初步研究表明，在脑池内接受250μL血液的经受SAH的雌性大鼠，在脑动脉中引起增加的针对ET-1和5-CT的血管收缩。然而，由于在ET-1诱发的浓度-反应曲线中缺乏向双相曲线的过渡、数据的高度可变性和比较假手术和SAH时5-CT诱发的BA收缩没有差异，注射的血液体积增加，导致更大的SAH诱发的损伤。因此，在呈现的以下结果(主要研究)中，所有经受SAH的大鼠在脑池内接受300μL自体血液。
雌性大鼠SAH后总体幸福感和感觉运动认知降低
为了评估SAH是否在雌性大鼠中诱发神经功能缺陷，使用了两种不同的测试，观察大鼠总体幸福感和旋转杆测试。如图1a所示，与假手术相比，SAH导致第1天和第2天的总体幸福感得分显著下降。此外，经受SAH的雌性大鼠在其通过木杆时，无论是没有旋转还是在两种不同的旋转速度下，都表现出显著的平衡和运动受损。与假手术相比，雌性大鼠在SAH后1天和2天的感觉运动缺陷是显著的。
与假手术相比，雌性大鼠SAH后亚急性期颅内压升高
假手术大鼠在手术当天颅内压为4.0±0.2mmHg，并在假手术后1天或2天ICP没有显著变化(图15)。在SAH之前的实验大鼠中，ICP为4.1±0.3mmHg。然后ICP在SAH诱发时瞬时增加至平均149±11.5mmHg，在SAH后30分钟为7.1±0.8mmHg(图15)。与假手术相比，在SAH后第1天和第2天雌性大鼠的平均ICP都显著增加。
在雌性SAH大鼠中，与SAH前水平相比，所有大鼠手术后第1天的ICP均增加，而在第2天，相对于第1天水平，ICP进一步增加(4/9只大鼠)或降低(5/9只大鼠)。然而，在SAH后第2天ICP降低的大鼠中，在所有5/9只大鼠中，除了1只之外，与SAH前记录的ICP相比，ICP仍然增加。在雌性假手术大鼠中，在手术后第1天ICP略有增加(5/9只大鼠)或保持在手术前水平，然后在第2天，与第1天的ICP相比，ICP略有降低(2/9)、保持在SAH前水平(3/9)或略有增加(4/9)。
与假手术相比，雌性大鼠SAH后2天的脑血管收缩增加
在来自假手术和SAH动物的动脉段(BA和MCA)之间，用60mM K+富集的缓冲液进行的钾诱发的反应没有显著差异(图16)。此外，比较来自假手术和SAH手术大鼠的动脉段(BA和MCA)，内皮介导的扩张没有差异。
来自雌性SAH大鼠的BA段对ET-1的浓度-收缩曲线向左移动，开始过渡到双相曲线。与来自假手术大鼠的BA段相比，来自雌性SAH大鼠的BA段对ET-1的敏感性显著增加(图16)。与具有双相曲线的假手术相比，来自SAH诱发的雌性大鼠的MCA也显示对ET-1的收缩显著升高(Emax1增加)。与BA段的ET-1曲线形成对比，与假手术相比，SAH后MCA曲线没有向左移动(图16)。
在雄性大鼠中已经证明，与假手术相比，SAH后脑动脉对5-CT的敏感性显著增加。这些曲线显示为向左移动，这反映了5-HT1B受体的上调。与假手术相比，在来自雌性SAH大鼠的BA和MCA段中，均有显著增加的对5-CT诱发的收缩的敏感性。与假手术相比，对SAH后2天来自雌性大鼠的脑段所获得的浓度-反应曲线显示向左移动(图16)。
与假手术相比，雌性大鼠SAH后2天脑水含量增加
通过计算分离的脑区域中的脑水含量，分别评价了纹状体、皮层和海马体中的水肿形成。与假手术相比，雌性大鼠SAH后2天皮层中脑水的百分比显著增加(p<0.0473)。与假手术相比，雌性大鼠SAH后2天海马体中脑水的百分比有增加的趋势(P＝0.05)。在SAH和假手术的雌性大鼠之间纹状体中的脑水含量没有差异(p<0.2711)。这些结果表明与假手术相比，雌性大鼠SAH后2天皮层和海马体中有局部水肿。
结论
显示雌性大鼠的SAH与SAH后雄性大鼠中观察到的神经损伤相似，总体幸福感降低，感觉运动功能显著降低。证实了在雌性大鼠中在SAH后第1天和第2天ICP均显著增加。SAH后最初几天ICP的变化过程可以用于预测EBI和DCI的严重程度。雌性大鼠的SAH导致脑动脉中对ET-1和5-CT的血管收缩性增加。因此，针对血管变化以便预防SAH后迟发性神经损伤是雄性和雌性两者的治疗策略。
因此，预防这些与性别无关的机制为SAH后DCI的普遍治疗策略提供了基础。
实施例10：卵巢切除术对雌性大鼠局灶性脑缺血后大鼠大脑中动脉血管舒缩反应 的影响
材料和方法
伦理
该研究设计已获得隆德县行政法院(Lund County Administrative Court)的批准(M178-11，M8-09)。所有程序和动物治疗均遵循隆德大学伦理委员会(the EthicsCommittee of Lund University)的指南。该研究符合ARRIVE指南(动物研究：报告体内实验(Animals Research:Reporting in Vivo Experiments))。
体内激素治疗
大鼠由供应商(Charles River，L′Arbresle Cedex，法国)切除卵巢并用含有孕酮(9mm长度)或17β-雌二醇(5mm长度)的皮下植入的硅酮胶囊(1.57mm ID x 3.18mm OD，DowCorning，Hemlock，MI，美国)治疗以恢复激素水平。使用适当长度的空硅酮胶囊作为安慰剂。在相同时间段期间进行卵巢切除术和胶囊植入。已经显示该方案产生了生理学范围内的17β-雌二醇和孕酮水平。
在安乐死时测量子宫干重和血清17β-雌二醇，以验证雌激素替代有效。在安乐死时将躯干血或来自心脏穿刺的血液收集在普通管(plain tube)中，并使其在室温下凝结40分钟，然后在4℃下以2,000x g离心12分钟。收集上清液并在-80℃下以等分试样的形式储存，直到测定17β-雌二醇的时间(放射免疫测定法)。在放射免疫测定中17β-雌二醇的检测限为11pg/mL。
激素治疗3周后，与卵巢切除(OVX)的动物相比，雌激素治疗的卵巢切除的大鼠(OVX+E)体重较轻(187±4g vs.254±8g，P<0.05)且子宫重量较高(98±16g vs.19±1g，P<0.05)。OVX+E动物中17β-雌二醇的血清水平在生理学范围内(26±2pg/mL)，而卵巢切除的动物中的水平低于检测限(所有样品中均<11pg/mL；p<0.05)。
包括具有完整卵巢的雌性大鼠作为对照(以下称为“完整的”)。用阴道涂片连续三个周期监测完整动物的动情周期。根据已建立的方法(Goldman et al,2007,DevelopReprod Toxicol.)，通过检查存在的细胞的细胞类型和量来确定动情周期的阶段。为了消除激素水平波动引起的影响，实验中使用的完整大鼠在动情日或动情间期(与动情前期相比，此时循环雌激素和孕酮的水平较低)经受tMCAO。
短暂性单侧大脑中动脉闭塞(Transient unilateral middle cerebral arteryocclusion)
在12周龄且在激素治疗3周后，使用腔内闭塞技术(Stenman et al,2002,Stroke)对雌性Wistar大鼠进行短暂性单侧大脑中动脉闭塞(tMCAO)。由含4.5％异氟醚的N2O:O2(70:30)诱发麻醉，并在操作过程中通过吸入含1.5-2.0％异氟醚的N2O:O2(70:30)来维持麻醉。在闭塞前通过动脉尾导管(Radiometer；LabChart)测量平均动脉血压、pCO2、pO2、pH和血浆葡萄糖。在手术操作过程中，使用连接到恒温毯的直肠温度计将体温保持在+37℃。在颈部中线切开一个切口，露出右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。用缝合线永久绑扎颈总动脉和颈外动脉，并在颈总动脉中切开一个切口。将激光多普勒探头(Perimed，
Figure BDA0003570285400000431
瑞典)固定在与大脑中动脉供应区域相对应的区域中的变薄颅骨(前囟后1mm，中线右侧6mm)。通过切口插入橡胶涂覆的硅酮单丝(Doccol Corporation，Redlands，CA，美国)，直到尖端到达右大脑中动脉(MCA)的入口。通过使用激光多普勒监测观察到的皮层血流量突然减少来确认闭塞。在将丝固定后，缝合皮肤并停止麻醉。闭塞两小时后，将大鼠短暂地重新麻醉以移除丝并允许再灌注。如激光多普勒血流仪所示，血流量显著增加证实了适当的再灌注。手术后48小时让动物恢复，自由进食和饮水，然后用CO2麻醉并断头。将脑取出并立即在冰冷的碳酸氢盐缓冲溶液中冷却(对于组成，参见药物、化学品和溶液(Drugs,Chemicals andSolutions))。将右(闭塞)和左(非闭塞)大脑中动脉从粘附组织中解剖出来并用于肌动描记研究。
器官培养
如上文所述将12周龄的雌性大鼠切除卵巢并植入含有17β-雌二醇(n＝6)的硅酮胶囊。使用卵巢切除的安慰剂治疗的大鼠(n＝6)和完整大鼠(n＝6)进行比较。卵巢切除术和激素胶囊植入后三周；将动物用CO2麻醉并断头。将脑立即取出并在冰冷的碳酸氢盐缓冲溶液中冷却(对于组成，参见药物、化学品和溶液)。取出MCA并立即或在用补充有青霉素(100U ml-1)、链霉素(100μg mL-1)和两性霉素B(0.25μg mL-1)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)在+37℃下在含5％CO2的加湿空气中进行器官培养24小时后用肌动描记法进行研究。
体外药理学
使用记录等长张力的丝状Mulvany-Halpern肌动描记器(Danish Myo TechnologyA/S，Aarhus，丹麦)检查大脑中动脉的收缩性质。将动脉切成圆柱形段(2mm)，并经由通过管腔插入的两条平行的40μm丝安装在肌动描记器中。肌动描记器浴含有5ml+37℃碳酸氢盐缓冲溶液(对于组成，参见药物、化学品和溶液)，用含5％二氧化碳的氧气连续充气，导致pH值为7.4。在20分钟的平衡期后，用连接到其中一根丝的测微螺旋将动脉拉伸至其正常内周长的90％，对应于跨壁压为100mm Hg的生理条件下动脉的大小。另一根丝连接到力位移传感器，该力位移传感器连接到模数转换器(AD Instruments，Chalgrove，英国)。使用PowerLab单元(AD instruments)和软件LabChart(ADInstruments)将结果记录在计算机上。在归一化程序后，使动脉在该张力下平衡20分钟。
通过将缓冲液切换为5ml富钾缓冲液(63.5mM，参见药物、化学品和溶液)来测试收缩能力。最大钾介导的收缩被用作收缩能力的参考值(＝100％)。为了消除内皮的影响，分别用100μM L-NG-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)和10μM吲哚美辛阻断一氧化氮和前列腺素的产生，它们在针对来自体内中风模型的动脉的整个实验中存在于组织浴中。
通过添加浓度范围为10-11至10-5M的5-羧基酰氨基色胺(5-CT，一种非选择性5-HT1激动剂)(Hansen-Schwartz)来评价5-羟色胺受体(5-HT)的受体。通过累积应用浓度范围为10-12至10-6M的血管紧张素II来评价血管紧张素I型(AT1)受体。实验前30分钟，添加AT2受体拮抗剂PD123319以消除任何AT2受体介导的作用。以10-11至10-7M的浓度添加选择性ETB受体激动剂角蝰毒素6c(S6c)(Alexis Biochemicals，Farmingdale，NY，美国)。
分析和统计
在比较两个组的最大收缩(Emax)时使用非参数Mann Whitney检验，而在比较三个或更多个组时使用Kruskal-Wallis检验然后是Dunn多重比较检验。p值低于0.05的统计学分析被认为是显著的。结果表示为平均值±SD，n＝组中的动物数目。
药物和溶液
如果没有另外说明，则所有物质均购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO，美国)。碳酸氢盐缓冲液具有以下组成：119mM NaCl、15mM NaHCO3、4.6mM KCl、1.5mM CaCl2、1.2mMNaH2PO4、1.2mM MgCl和5.6mM葡萄糖。含有63.5mM K+的碳酸氢盐缓冲溶液是通过在上述缓冲液中将NaCl部分交换为KCl而获得的。
结果
体外药理学
高钾(63.5mM)诱发的最大收缩反应在治疗组之间、来自闭塞和非闭塞半球的动脉之间或新鲜和培养的动脉之间没有显著差异(总体平均收缩为4.2mN)。在每个动脉段中，最大钾诱发的反应用作收缩能力的参考(＝100％)，以比较反应的变化。
tMCAO后的血管收缩反应：卵巢切除术的影响
脑缺血后48小时，用丝状肌动描记器检查雌性MCA。在来自脑非闭塞侧的动脉中，正如从先前研究所预期的那样，几乎没有至没有响应于选择性ETB受体激动剂S6c的收缩。与之相反，短暂性闭塞的动脉显示了响应于S6c的显著收缩(图17A，图20)。与完整的雌性相比，来自卵巢切除的雌性的MCA中S6c介导的收缩显著更低(分别为8±9％和22±16％；p<0.05)(图17A，图20)。
5-羟色胺(5-HT)受体激动剂5-CT的浓度-反应曲线在来自完整的和卵巢切除的雌性的非闭塞动脉中是相似的(图17B，图20)。非闭塞动脉中的浓度-反应曲线是双相的，表明5-CT作用于动脉中多于一种类型的收缩5-HT受体，如先前在雄性脑动脉中所示。在来自完整的雌性的闭塞动脉中，与非闭塞动脉相比，5-CT介导的血管收缩通常显著更低，并且曲线是单相的，与单一受体亚型一致。有趣的是，来自卵巢切除的动物的动脉对5-CT几乎不显示血管收缩反应(8±11％)，这与完整的雌性中的反应(27±18％)有显著差异(p<0.01)(图17B，图20)。因此，与完整的雌性相比，卵巢切除的大鼠在tMCAO后5-CT介导的反应的平均降低更大。
AT1受体介导的对血管紧张素II(Ang II)的收缩在闭塞和非闭塞动脉中是相似的(图17C，图20)。这一发现与雄性的历史数据有很大不同，在雄性历史数据中，与闭塞动脉相比，发现非闭塞动脉中AT1介导的收缩性相对较低(图20)。卵巢切除术不影响在闭塞和非闭塞动脉中观察到的强的AT1受体介导的收缩(图17C，图20)。
tMCAO后的血管收缩反应：17β-雌二醇和孕酮治疗的效果
卵巢切除的大鼠通过植入的胶囊用17β-雌二醇、孕酮或安慰剂治疗3周，然后经受单侧tMCAO。一般来说，与来自安慰剂治疗的卵巢切除的大鼠的动脉相比，闭塞和非闭塞动脉对S6c、Ang II或5-CT的最大收缩反应不受激素治疗的影响(图18A-C)。如图17所示，与在完整的雌性中所见的相比，卵巢切除术导致ETB-和5-HT-受体介导的最大收缩反应显著更低，而在已经很强的AT1受体介导的反应中没有差异。因此，在卵巢切除术后维持生理水平的孕酮或雌激素不足以防止对ETB和5-HT受体激动剂的最大收缩反应的降低。
在来自完整的、卵巢切除的和17β-雌二醇治疗的雌性的动脉中器官培养后的血管舒缩反应
在分离后立即或器官培养24小时后，在丝状肌动描记器中对来自OVX、OVX+E和完整的雌性大鼠的MCA段进行研究。ETB受体介导的收缩是由S6c的累积应用引起的。在新鲜动脉(新鲜对照)中没有S6c介导的收缩；然而，在所有培养的动脉中都观察到随着S6c浓度的增加而出现强烈收缩，并且这种反应在治疗组之间没有差异(图19)。因此，先前在体内暴露于卵巢激素不会影响培养期间在动脉中发生的ETB受体的上调。
结论
I/R后，由内皮素B(ETB)受体激动剂角蝰毒素6c(S6c)介导的最大收缩反应在雌性动脉中增加，但在来自卵巢切除的雌性的MCA中最大反应显著降低。
相比之下，由5-羟色胺受体激动剂5-羧基酰氨基色胺(5-CT)介导的最大收缩在I/R后降低，其中来自卵巢切除的雌性的动脉显示最大收缩反应的降低更大。血管紧张素II引起的收缩没有被任何操作改变。在卵巢切除的雌性中补充雌激素或孕酮不会改变ETB和5-CT诱发的血管收缩中I/R诱发的变化。经受器官培养的分离的MCA表现出ETB介导的收缩增加。在从完整的、安慰剂治疗的卵巢切除的和雌激素治疗的卵巢切除的雌性培养的动脉中，反应是相似的。这些发现表明，性激素不会直接影响缺血性中风后发生的血管收缩受体改变；然而，卵巢切除术确实会影响该过程。
在tMCAO之后，雄性中的ETB受体上调比雌性中更明显。相比之下，非闭塞的雌性MCA对5-CT和Ang II的收缩反应强于雄性：在tMCAO之后，两种性别中的5-CT反应均降低，且Ang II反应在雌性中不变，而在雄性中增加。因此，血管反应的行为因性别而有所不同(图20)。
假设是这些雄性-雌性差异反映了性激素对脑动脉中收缩反应的影响。令人惊讶的是，虽然在tMCAO之后和器官培养后ETB介导的最大收缩增加了，但在卵巢切除术后没有发现性激素替代的影响。相反，在tMCAO之后的雌性动脉中，对S6c和5-CT的血管收缩反应明显低于先前对雄性所报道的。最有趣的是，卵巢切除术对tMCAO后的血管收缩受体反应有显著影响，这未被雌激素或孕酮替代逆转。如果有的话，这意味着在处理中风影响方面存在性别差异，雌性比雄性更有利。
实施例11：大鼠体内蛛网膜下腔出血后MEK1/2抑制剂曲美替尼(GSK1120212)的全 身性施用-与U0126的比较
材料和方法
动物
使用雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g，Taconic，丹麦)。所有程序均严格按照国家法律和指南执行，并经丹麦动物实验监查局(2012-15-2934-389)批准。
体内蛛网膜下腔出血
如之前详细描述的那样诱发SAH(Povlsen et al,2013,BMC Neurosci)，不同之处在于用2.5 mL·kg-1在无菌水中的hypnorm-咪达唑仑(1:1:2)的混合物对大鼠进行麻醉并将300μl血液注射到视交叉中。
实验组
为这项研究对32只大鼠进行了手术。用250μl/体重的在10％氢化蓖麻油和10％PEG400的NaCl溶液中稀释的1mM曲美替尼溶液(Selleckchem)对动物进行腹膜内治疗，达到95μg/体重的最终剂量。溶媒和假手术组中的动物用250μl/体重的10％氢化蓖麻油和10％PEG400的NaCl溶液治疗。在手术后1小时和24小时或者6小时和24小时腹膜内施用治疗。手术后48小时通过CO2麻醉和断头术处死动物。
体外器官培养
从首次接受实验的大鼠解剖出MCA，并将段(1.5mm)在加湿的5％CO2气氛中在补充有青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)的含有L-谷氨酰胺(584mg/L)的Dulbecco改良的Eagle培养基中孵育48小时。在孵育之前，添加溶解在0.1％二甲亚砜(DMSO)的NaCl溶液中的4种不同浓度的曲美替尼(5μM、1μM、0.1μM或0.03μM)或者0.1％DMSO的NaCl溶液(溶媒)。
丝状肌动描记术
使用丝状肌动描记器记录分离的脑动脉的段(1.5mm)中的等长张力。血管段接受2mN/mm的初始预张力并用63.5mM K+溶液预收缩。只有具有超过2mN的K+诱发的反应的基底动脉(BA)和具有超过0.7mN的K+诱发的反应的大脑中动脉(MCA)被用于实验。通过累积应用浓度范围为10-12至10-4M的ETB受体特异性激动剂角蝰毒素(S6c)(Alexis Biochemicals，美国)和浓度范围为10-14至10-7M的内皮素-1(ET-1)(AnaSpec，美国)来获得浓度-反应曲线。
细胞内流式细胞术
从一只大鼠中汇集MCA、BA和Willis环。通过本发明人基于两个其他方案(Navoneet al,2013,Nat Protoc；van Beijnum et al,2008,Nat Protoc)提出的新技术分离脑动脉的VSMC。组织被机械破坏(解剖刀)，然后用高度纯化的胶原酶I和胶原酶II进行酶消化。将分离的细胞悬液用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗涤，然后用0.25％TritonX-100透化。将细胞重悬于含有5％驴血清的封闭缓冲液中，并在相同的封闭缓冲液中在4℃下用初级山羊抗SM22α(1:100，Abcam)或山羊同位素对照IgG(5μg/mL，Abcam)和初级抗体兔抗ETB(1:100，Abcam)或兔同位素对照IgG(10μg/mL，Abcam)双重染色过夜。第二天，将细胞样品与Alexa 488标记的驴抗山羊IgG(1:100，Jackson ImmunoResearch)和别藻蓝蛋白(APC)标记的驴抗兔IgG(1:100)在室温下孵育2小时(黑暗)。最后，用PBS将细胞悬液稀释至终体积为0.5mL，然后在BD FACSVerse机器(BD Biosciences，美国)上通过荧光激活细胞分选术(FACS)进行分析。用640nm红色激光诱发荧光。计算每个样品中表达ETB的SM22α阳性细胞的比例。数据由BD FACSuite软件分析。
计算和统计
数据表示为平均值±SEM，n是指大鼠的数目。将浓度-收缩曲线比作双向ANOVA。为了进行归一化，将K+引起的收缩反应设置为100％。用单向ANOVA分析流式细胞术。显著性水平被设置为p<0.05。
结果
在所有大鼠中，生理学参数和温度在手术期间都在可接受的限度内，组之间没有任何差异。ICP从5.4mmHg增加到116.8mmHg，皮层CBF下降到静息流量的19％(所有SAH动物的平均值)。
在最初的体外实验中，新鲜分离的MCA(对照)显示对ETB受体激动剂S6c没有收缩反应。在OC 48小时后，S6c在与溶媒一起孵育的MCA中产生强烈的收缩反应。然而，与曲美替尼共孵育在OC后48小时以浓度依赖性方式显著抑制S6c诱发的收缩(图21A)。在所有组中，由S6c诱发的最大收缩(Emax)如图21B所示。基于上述结果，0.1μM的曲美替尼证实了对增加的ET-1诱发的血管收缩的抑制作用(图21C)。在溶媒孵育的MCA中，观察到增强，ET-1浓度-反应曲线向左移动并过渡到双相曲线形状。在曲美替尼存在下孵育的MCA导致浓度-反应曲线向右移动，表明ETB受体亚型反应的完全阻断。
为了在体内证实曲美替尼治疗对SAH诱发的增加的ET-1介导的血管收缩的影响，使用了两种不同的治疗方法；在SAH后1和24小时(图22A)或者6和24小时(图22B)腹膜内施用1mM曲美替尼。观察到SAH后BA中增加的ET-1诱导的浓度-反应曲线向左移动，并且使用这两种治疗方法均被曲美替尼显著抑制。SAH后6小时治疗后观察到的增强的收缩反应通过使用流式细胞术的蛋白质分析得到验证。与假手术(61.4％±10.2％；n＝6)相比，SAH后(溶媒)表达ETB受体的SMC有显著增加(74.2％±12.2％；n＝7)。然而，用这种特殊的治疗方法，这种增加的蛋白质表达并没有被曲美替尼显著消除(图22C)。
结论
MEK1/2抑制剂曲美替尼是一种有效的化合物，其能够完全抑制体外OC后脑动脉中增加的ETB受体介导的收缩。曲美替尼可以体内全身施用于大鼠，但仍然以与脑池内施用后相同的比例减少SAH后48小时脑动脉中增加的ET-1介导的血管收缩。
最初的体外实验表明，0.1μM曲美替尼能够显著抑制由ET-1诱发的增加的ETB受体介导的收缩。在以前使用相同体外设置的研究中，使用浓度为10μM的U0126进行等效抑制。先前已经以溶解在100％DMSO中的50mM的最终浓度在全脑缺血和局灶性脑缺血模型中体内腹膜内施用U0126。然而，在SAH的早期研究中从未使用腹膜内施用，而是在SAH后6、12、24和36小时脑池内施用U0126(10μM溶解于0.1％DMSO)。在目前的研究中，将有效的选择性MEK1/2抑制剂曲美替尼溶解在非DMSO溶液(氢化蓖麻油/PEG400的NaCl溶液)中，并以1mM的最终浓度对大鼠进行两次腹膜内治疗(SAH后1和24小时或者6和24小时)。在这些条件下，结果表明曲美替尼对SAH后48小时脑动脉中增加的血管收缩有积极作用。
总之，结果表明，有效的MEK1/2抑制剂曲美替尼可用于任何治疗应用，以抑制SAH后增加的血管收缩。

Claims (40)

1.式(I)的MEK抑制剂，其用于预防或治疗受试者的中风，
Figure FDA0003570285390000011
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基和杂芳基。
2.根据权利要求1所述的MEK抑制剂，其中R1是C1-C3烷基。
3.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是直链C1-C3烷基。
4.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是甲基或乙基。
5.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是甲基。
6.根据权利要求1所述的MEK抑制剂，其中R2是C2-C4烷基。
7.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R2是C3或C4环烷基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R2是环丙基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中Ar是苯基或取代的苯基。
10.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中Ar是取代的苯基。
11.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中Ar是2-氟-4-碘苯基。
12.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是C1-C3烷基，R2是C2-C4烷基，且Ar是取代的苯基。
13.根据前述权利要求中任一项所述的MEK抑制剂，其中R1是甲基或乙基，R2是C3或C4环烷基，且Ar是取代的苯基。
14.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂具有式(II)，
Figure FDA0003570285390000021
或其药学上可接受的盐。
15.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风选自：缺血性中风、出血性中风和短暂性缺血发作。
16.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风选自：全脑缺血和局灶性缺血。
17.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述缺血性中风是由栓塞、血栓形成、全身性低灌注、脑静脉窦血栓形成、血压突然下降或心脏停止跳动、脑动脉或小动脉破裂或其组合引起的。
18.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述出血性中风是由脑内出血、蛛网膜下腔出血或其组合引起的。
19.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述脑内出血是实质内的、脑室内的或其组合。
20.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风是由蛛网膜下腔出血(SAH)引起的。
21.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风是由缺血性脑损伤(TBI)引起的。
22.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述中风是迟发性脑缺血(DCI)。
23.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述DCI表现为炎症、水肿、迟发性脑血管痉挛(CVS)、血脑屏障破坏和/或收缩受体表达增加，例如针对内皮素、血管紧张素、血清素和血栓素或前列腺素的那些。
24.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中将所述MEK抑制剂施用至受试者，而无需在所述施用之前、同时或之后进行手术。
25.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在血栓切除术之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
26.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在溶栓之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
27.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在选自弹簧圈栓塞术和夹闭术的手术操作之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
28.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在神经放射学操作之前、同时或之后将所述MEK抑制剂施用至受试者。
29.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂减少或防止由神经放射学操作导致的再灌注损伤。
30.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中在确定受试者是否患有急性缺血性中风或出血性中风之前，将所述MEK抑制剂施用至所述受试者。
31.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂通过口服、鞘内、腹膜内、眼内、鼻内或静脉内施用。
32.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂通过静脉内施用。
33.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中将所述MEK抑制剂在中风发作后最多6小时施用至受试者，例如在中风发作后最多1小时，例如最多2小时，例如最多3小时，例如最多4小时，例如最多5小时。
34.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂在中风发作后每天施用一次或多次，持续最多3天。
35.根据前述权利要求中任一项所述用途的MEK抑制剂，其中所述受试者是人类受试者。
36.前述权利要求中任一项所定义的式(I)的MEK抑制剂用于以下的用途：
a.降低内皮素-1诱导的收缩性；
b.增加内皮素B受体功能；和/或
c.改善神经学评分，这可以通过在诱发的蛛网膜下腔出血之后受试者通过旋转杆的能力来评价。
37.一种治疗受试者的中风或降低受试者发生中风的风险的方法，其中所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用式(I)的MEK抑制剂，
Figure FDA0003570285390000051
或其药学上可接受的盐，
其中
R1是C1-C6烷基，例如甲基，
R2是C1-C6烷基，例如环丙基，
Ar选自芳基、苯基和杂芳基；
从而治疗中风或降低发生中风的风险。
38.一种组合物，其分开或一起包含式(II)的MEK抑制剂，
Figure FDA0003570285390000061
或其药学上可接受的盐，以及另外的药物。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述另外的药物选自：钙通道阻滞剂例如尼莫地平，和内皮素受体(ET)受体阻滞剂例如克拉生坦。
40.一种多部件试剂盒，其包括：
前述权利要求中任一项所定义的MEK抑制剂；和
前述权利要求中任一项所定义的另外的药物；
其中所述MEK抑制剂和所述另外的药物被配制用于同时或顺序使用；以及任选的使用说明。
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