BR112016025559B1 - Composição farmacêutica, enxerto vascular, stent, ou implante, composição para a redução ou prevenção da infiltração de macrófagos, da ativação de plaquetas e de estenose ou reestenose de um enxerto vascular - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ENXERTO VASCULAR, STENT, OU IMPLANTE, COMPOSIÇÃO PARA A REDUÇÃO OU PREVENÇÃO DA INFILTRAÇÃO DE MACRÓFAGOS, DA ATIVAÇÃO DE PLAQUETAS E DE ESTENOSE OU REESTENOSE DE UM ENXERTO VASCULAR. Excessiva ou repetida ativação de mecanismos inflamatórios e pró-coagulantes no local da lesão de tecido contribui para o desenvolvimento de tecido de cicatriz que podem levar à hiperplasia da íntima e doenças fibróticas. Estabeleceu-se que inibição da proteína LYST está associada com respostas inflamatórias reduzidas e ativação de plaquetas reduzida no local do dano de tecido. Composições e métodos para inibição da expressão e função da proteína LYST são descritos. As composições e os métodos podem ser úteis para a modulação de processos imunes que contribuem para a formação de neoíntima e distúrbios fibroproliferativos ao se alterar a função de macrófago, plaqueta e célula exterminadora natural e para criar uma resposta imune pró-regenerativa.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. N° 61/987.910 intitulado "Composições e Métodos para Imunomodulação Anti-Lyst", depositado em 2 de maio de 2014, cujo teor é incorporado como referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] A listagem de sequência submetida em 4 de maio de 2015, como um arquivo de texto chamado "NWCH100 PCT_ST25.txt", criado em 1 de maio de 2015 e com um tamanho de 51.000 bytes é incorporado por meio deste documento como referência.

DECLARAÇÃO A RESPEITO DE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[0003] Esta invenção foi feita com o Apoio Governamental sob NIH concessão R01 HL098228 atribuída a Christopher Breuer pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0004] O campo da invenção está, de modo geral, relacionado a composições, dispositivos e métodos para intensificar a regeneração de tecido vascular, bem como reduzir a morbidade e mortalidade associada à doença de hiperplasia de neoíntima e fibroproliferativo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0005] Reparo de tecido é um processo complexo e gradual que facilita a remoção e substituição ordenada de células mortas ou danificadas em resposta à sinalização de citocina estimuladora de células pró- inflamatórias locais no local de lesão (Wynn e Barão, Semin Liver Dis., 30(3):245-257 (2010); Wynn, Clin. Invest. 117:524-529 (2007)). Entretanto, quando as respostas de reparo de tecido são inapropriadas ou persistirem por um período prolongado, por exemplo, em resposta à doença crônica ou lesão repetida, os mecanismos de regeneração normais podem dar origem a estados patológicos resultantes do crescimento de novo tecido excessivo e acúmulo de componentes de matriz extracelular (ECM) no local de lesão.

[0006] Pensa-se que excessiva ou repetida ativação de mecanismos inflamatórios e pró-coagulantes no local de lesão vascular contribui para o desenvolvimento de hiperplasia da íntima. Sob condições patológicas, lesão vascular causa desnudamento da camada endotelial e desencadeia uma série de respostas inflamatórias agudas e crônicas caracterizadas pela produção de vários fatores de crescimento e citocinas inflamatórias (Murakami, et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 272:L197-L202 (1997); Cotran, et al., J Am Soc Nephrol., 1:225-235 (1990)). Hiperplasia da íntima que ocorre após procedimentos cirúrgicos, tais como angioplastia e colocação de stent, desvios cirúrgicos ou endarterectomia para doença arterial coronariana e/ou periférica pode causar reestenose de vasos sanguíneos em até 80% dos pacientes (Seedial, et al., J Vasc Surg., 57(5):1403-1414 (2013); Glagov, Circulation, 89:2888-2891 (1994)). Mostrou-se que formação de neoíntima pode ser acelerada pela presença de materiais estranhos, tais como próteses no interior de vasos sanguíneos, e hiperplasia de neoíntima descontrolada é um obstáculo importante que limita a eficiência clínica em longo prazo de intervenção cardiovascular (Frank, et al., Curr. Opin. Lipidol., 15:523 (2004)). Além disso, formação de neoíntima é associada com o desenvolvimento e progressão de diversas doenças cardiovasculares proliferativas, incluindo aterosclerose, hipertensão e complicações vasculares diabéticas.

[0007] A regeneração da camada endotelial inibe o desenvolvimento de neoíntima e facilita o reparo vascular (Bauters, et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 40:107-116 (1997); Kinlay, et al., Curr. Opin.Lipidol., 12:383 (2001)). Entretanto, fármacos de anti-neoíntima disponíveis atualmente bloqueiam de forma indiscriminada a proliferação de células endoteliais (EC) e de células musculares lisas (SMC) resultando em reendotelização prejudicada e prolongamento do processo de cicatrização de feridas. Ainda permanece uma necessidade para desenvolver uma estratégia de anti-proliferação que é sensível a SMC.

[0008] Respostas inflamatórias não reguladas para dano de tecido repetido também podem dar origem a fibrose patológica de tecidos e órgãos, tais como a pele, fígado, coração e pulmão (Huang e Ogawa, Connect Tissue Res ., 53(3):187-196 (2012)). Dano crônico e inflamação do tecido do fígado levam ao acúmulo de proteínas de ECM que causa a formação de cicatriz excessiva e distorce a arquitetura hepática, que por sua vez, leva à cirrose e insuficiência hepática (Battler e Brenner, J Clin Invest., 115:209-218 (2005)). Da mesma forma, deposição excessiva de tecido fibrótico no interior do pulmão dá origem a cicatrizes progressivas e irreversível destruição da arquitetura do pulmão, que, em última análise, leva ao mau funcionamento do órgão, interrupção de troca gasosa e morte por insuficiência respiratória.

[0009] Plaquetas ativadas aumentam a adesão de leucócitos ao endotélio danificado e promovem a ativação de leucócitos através da deposição de quimiocinas no endotélio. Isso possibilita que leucócitos se liguem firmemente à parede do vaso e transmigrem no tecido subendotelial. Entretanto, as quimiocinas derivadas de plaquetas também são conhecidas por desempenhar um papel na proliferação de neoíntima, reestenose após lesão arterial e aterosclerose (Chandrasekar, et al., J Am College Cardiology, Vol 35, N° 3, pág. 555-562 (2000)). Certos grupos de pacientes com função anormal de plaquetas, incluindo aqueles com doença renal, diabetes mellitus e hiperlipidemia, também estão em maior risco de reestenose.

[0010] Distúrbios fibroproliferativos são uma causa principal de morbidade e mortalidade nos Estados Unidos (Bitterman e Henke, Chest, 99(3):s81-s84 (1991)). Em particular, doenças hepáticas e pulmonares fibróticas são normalmente refratárias ao tratamento e levam uma alta taxa de mortalidade. Cirrose hepática estabelecida tem uma taxa de mortalidade de 10 anos de 34-66% e é responsável por aproximadamente 27.000 mortes a cada ano apenas nos Estados Unidos. A prevalência de fibrose pulmonar idiopática (IPF) é estimada entre 14 e 42,7 por 100.000, e este número vem aumentando década após década nos últimos 30 anos (Olson, et al., Am J Respir Crit Care Med. 176:277-2843 (2007); Gribbin, et al., Thorax, 61:980-985 (2006)). Atualmente, o tratamento mais eficaz para fibrose pulmonar ou hepática é o transplante de órgão.

[0011] Portanto, é um objetivo da invenção prover composições, dispositivos, enxertos e métodos de uso destes para modular processos imunes para reduzir ou prevenir a formação de neoíntima, estenose, reestenose ou uma combinação destes em um sujeito.

[0012] Também é um objetivo da invenção prover composições, dispositivos, enxertos e métodos de uso destes para reduzir ou prevenir a ativação de plaquetas inapropriada ou prejudicial em um sujeito.

[0013] Também é um objetivo da invenção prover composições, métodos e dispositivos para reduzir ou prevenir a resposta imune a uma prótese implantável em um sujeito.

[0014] É um objetivo adicional da invenção prover composições, métodos e dispositivos para promover a cura e inibir a formação de cicatriz, aderências e doenças fibroproliferativas em um sujeito.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0015] Estabeleceu-se que inibição da proteína reguladora de trafego lisossomal ("LYST") está associada com respostas inflamatórias reduzidas no local do dano de tecido. Composições e métodos para inibição da expressão e função da proteína LYST são descritos. As composições e os métodos podem ser úteis para a modulação de processos imunes que contribuem para a formação de distúrbios de neoíntima e fibroproliferativos ao se alterar a função de macrófago, plaqueta e célula exterminadora natural e para criar uma resposta imune pró-regenerativa.

[0016] Composições incluindo um ou mais inibidores de LYST em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir a formação de tecido de cicatriz em um sujeito são divulgadas. Composições incluindo um ou mais inibidores de LYST em uma quantidade eficaz para reduzir ou evitar a ativação de plaquetas em um sujeito também são divulgadas.

[0017] Normalmente, as composições incluem um carreador fisiologicamente aceitável. Em modalidades preferenciais, a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a formação de novo tecido vascular no sujeito. Normalmente, as composições incluem um ou mais inibidores de LYST em uma quantidade entre 0,1 e 1000 mg/kg de peso corporal de um ser humano.

[0018] Em uma modalidade, um ou mais inibidores de LYST são um anticorpo.

[0019] Em outra modalidade, um ou mais inibidores de LYST são um ácido nucleico funcional. Ácidos nucleicos funcionais exemplares incluem uma molécula anti-sentido, siRNA, miRNA, aptâmeros, ribozimas, moléculas de formação de triplex, RNAi e sequências guia externas. O um ou mais ácidos nucleicos funcionais podem ser expressos a partir de um vetor de expressão.

[0020] Em algumas modalidades, as composições de um ou mais inibidores de LYST incluem um veículo de entrega. Veículos de entrega exemplares incluem nanopartículas, micropartículas, micelas, partículas de lipoproteína sintética, lipossomas e nanotubos de carbono. As composições divulgadas também podem incluir um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Enxertos vasculares e dispositivos médicos incluindo um ou mais inibidores de LYST são divulgados. Em algumas modalidades, a composição de um ou mais inibidores de LYST é revestida sobre ou incorporada no enxerto ou dispositivo. Dispositivos médicos exemplares incluem stents, implantes, agulhas, cânulas, cateteres, shunts, balões e válvulas. O dispositivo pode ser um stent, tal como um stent de eluição de fármaco que elui a composição de um ou mais inibidores de LYST. Enxertos vasculares exemplares incluem enxertos autólogos, autólogos preservados, alogênicos, xenogênicos ou sintéticos.

[0021] Métodos para reduzir ou prevenir a formação de tecido de cicatriz em um sujeito incluindo administrar a um sujeito que necessite disso uma composição incluindo um ou mais inibidores de LYST também são providos. Métodos para reduzir ou prevenir o desenvolvimento de trombose venosa ou arterial em um sujeito incluem administrar a um sujeito que necessite disso uma composição incluindo um ou mais inibidores de LYST. Em algumas modalidades, o sujeito corre o risco de desenvolver, ou ter desenvolvido, reestenose ou outros distúrbios de proliferação vascular. Em modalidades adicionais, o sujeito foi submetido, está se submetendo ou irá se submeter a trauma vascular, angioplastia, cirurgia vascular ou arteriopatia de transplante. Os métodos podem promover a cura, reduzir ou prevenir o desenvolvimento de cicatriz hipertrófica, queloides ou aderências, reduzir ou prevenir a fibrose do fígado, fibrose dos pulmões, fibrose do coração ou fibrose dos rins, reduzir ou prevenir a formação de neoíntima, estenose ou reestenose ou qualquer combinação disso no sujeito em relação a um sujeito de controle não tratado. Os métodos podem promover integração, mas bloqueiam encapsulamento de um ou mais dispositivos protéticos, tais como marca-passos, estimuladores de nervo, cabos de marca-passo, válvulas cardíacas de substituição e juntas artificiais ou componentes destes. Os métodos podem ser eficazes para tratar ou prevenir a formação de neoíntima em um local de implantação de um implante vascular, um local de lesão vascular ou um local de cirurgia no sujeito em relação a um sujeito de controle não tratado. Os métodos podem ser eficazes para reduzir ou prevenir a expressão de fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de transformação de crescimento beta ou qualquer combinação destes em um sujeito em relação a um sujeito de controle não tratado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] A Figura 1 é um histograma mostrando o diâmetro (mm) do duto no interior de enxertos de duto biodegradável duas semanas após o implante em camundongos bege (bg; gráfico preto) e camundongos de tipo selvagem (WT; gráfico cinza). N=10 e N=25 para camundongos beges e camundongos WT, respectivamente.

[0023] A Figura 2 é um histograma mostrando o número de células de macrófagos (células/HPF) no interior de enxertos de duto biodegradável explantados de camundongos bege (Bg; gráfico cinza) e ratos de tipo selvagem (WT; gráfico preto), respectivamente, duas semanas após o implante. P = 0,0048.

[0024] A Figura 3 é um esquema mostrando a diferença entre as sequências de nucleotídeos (no topo) dos camundongos de tipo selvagem (WT) e bege (Bg) no gene LYST no éxon 52. Diferenças correspondentes entre as sequências de aminoácido da proteína LYST de camundongos WT e Bg também são mostradas em um alinhamento de sequência de aminoácido (médio). O alinhamento de sequência de aminoácido (no fundo) mostra a conservação entre as sequências de aminoácido de polipeptídeos LYST a partir de ser humano, camundongo e rato. A posição de deleção no interior do LYST de camundongos bege (Bg) é indicada pelo *. Ácidos nucleicos e aminoácidos são representados usando os respectivos códigos de letra única padrão.

[0025] A Figura 4 é um histograma mostrando o nível relativo de mRNA correspondente ao produto de gene LYST, amplificado usando cada um dos 5 primers de oligonucleotídeos diferentes (LYST-1, LYST-3, LYST- 4, LYST-5 e LYST-6), em células obtidas a partir de ratos de tipo selvagem (WT-1(1); WT-2 (2)), camundongos bege (Bege-1 (3); Bege-2 (4)) ou uma linha celular "Bruta" padrão (5), respectivamente.

[0026] A Figura 5 é um histograma mostrando a incidência de estenose (%) em camundongos C57BL/6 (tipo selvagem) e camundongos nocautes C57BL/6 Lysttm1b, respectivamente, (n=5) 2 semanas após o implante. ***p = 0,0001.

[0027] A Figura 6 é um histograma mostrando a quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) secretado a partir de PRP (μg/ml) em repouso (controle) e camundongos C57BL/6 (tipo selvagem) ativados por trombina, bem como camundongos C57BL/6 Bege (Bg), respectivamente. Concentrações totais de PDGF secretado de cada grupo (n=7) foram comparadas ao repouso, controles não ativados (n = 5).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[0028] O termo "estenose" diz respeito a um estreitamento anormal em um vaso sanguíneo que ocorre após uma lesão à parede do vaso (endotélio). Em algumas modalidades, estenose envolve uma redução na circunferência de um lúmen de 50% ou mais. O termo "reestenose" diz respeito à estenose em um local previamente estenótico ou estreitamento do lúmen de um vaso sanguíneo ou enxerto sintético após um procedimento intervencionista. Reestenose, como usado neste documento, engloba oclusão. Lesões exemplares que resultam em estenose ou reestenose incluem trauma a uma lesão aterosclerótica (como visto com angioplastia ou stent), uma ressecção de uma lesão (como visto com endarterectomia), um trauma externo (por exemplo, uma lesão do ligamento cruzado) ou uma anastomose cirúrgica.

[0029] O termo "estenose de neoíntima" diz respeito ao estreitamento anormal de um vaso sanguíneo resultante da formação de neoíntima.

[0030] O termo "neoíntima" diz respeito a uma camada renovada ou espessada da íntima (revestimento interno) formada em um vaso sanguíneo em resposta a sinais de células endoteliais lesadas.

[0031] Os termos "tecido de cicatriz" e "cicatrizes" dizem respeito ao tecido fibroso que é produzido para substituir tecido danificado após a lesão.

[0032] Os termos "distúrbios fibroproliferativos", "FPD" e "doenças fibróticas" são usados de forma intercambiável e incluem doenças benignas e malignas ou condições que resultam da deposição anormal e excessiva de tecido conjuntivo.

[0033] O termo "ativação de plaquetas" é o processo fisiológico gradual que dá origem a aderência e agregação de plaquetas circulantes em resposta à lesão de tecido, tais como dano ou interrupção do endotélio. Ativação de plaquetas dá origem a expressão e secreção de agentes quimiotáticos, tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de transformação de crescimento beta (TGFβ).

[0034] "Carreador farmaceuticamente aceitável" engloba qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada de fosfato, água e emulsões, tais como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes umectantes.

[0035] "Inibir" ou outras formas da palavra, tais como "inibindo" ou "inibição", significa retardar ou restringir uma característica particular. Entende-se que isto é normalmente em relação a algum valor padrão ou esperado, ou seja, é relativo, mas que não é sempre necessário para o valor padrão ou relativo a ser referido. Por exemplo, "inibe LYST" significa retardar, interferir ou restringir a atividade do gene LYST em relação a um padrão ou um controle. "Inibe LYST" também pode significar retardar ou restringir a síntese, expressão ou função da proteína LYST em relação um padrão ou controle.

[0036] "Tratamento" ou "tratar" significa administrar uma composição a um sujeito ou um sistema com uma condição indesejada (por exemplo, reestenose ou um distúrbio fibroproliferativo). A condição pode incluir uma doença. "Prevenção" ou "prevenir" significa administrar uma composição a um sujeito ou um sistema em risco para a condição. A condição pode ser uma predisposição a uma doença. O efeito da administração da composição ao sujeito (ou tratamento e/ou prevenção) pode ser, mas não está limitado a, a suspensão de um sintoma particular de uma condição, uma redução ou prevenção dos sintomas de uma condição, uma redução da gravidade da condição, a ablação completa da condição, uma estabilização ou atraso do desenvolvimento ou progressão de um evento ou característica particular, ou minimização das chances que um evento ou característica particular irá ocorrer.

[0037] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo, a menos que claramente indicado o contrário. Portanto, um "anticorpo" pode ser de ocorrência natural ou artificial, tais como anticorpos monoclonais produzidos por tecnologia de hibridoma convencional. Anticorpos incluem anticorpos monoclonais e policlonais, bem como fragmentos contendo o domínio de ligação de antígeno e/ou uma ou mais regiões de determinação complementares destes anticorpos. "Anticorpo" diz respeito a qualquer forma de anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste e inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multi específicos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos.

II. Composições

[0038] Estabeleceu-se que os processos de reparo de tecido podem ser mediado pela manipulação da expressão e função do gene LYST. Especificamente, a perda de função do produto de gene LYST dá origem à função anormal em certas células imunes, resultando em disfunção imune e uma redução associada em distúrbios proliferativos. Células imunes que podem ser influenciadas pela modulação do gene LYST ou proteína LYST incluem células imunes inatas, macrófagos e plaquetas.

Células Imunes Inatas

[0039] Processos imunes inatos incluindo inflamação, remoção de células danificadas e detritos, bem como o desenvolvimento de novo tecido e outros mecanismos de reparo da ferida são um componente importante das respostas fisiológicas à lesão. Reparo de tecido tem quatro estágios distintos, incluindo: a) coagular/coagulação; b) inflamação; c) migração/proliferação de fibroblasto; e d) uma fase de remodelação final onde a arquitetura de tecido normal é restaurada. Nos primeiros estágios após dano de tecido, células epiteliais e/ou células endoteliais liberam mediadores inflamatórios que iniciam uma cascata de coagulação antifibrinolítica que desencadeia a coagulação e o desenvolvimento de uma matriz extracelular provisória (ECM). Agregação e degranulação posterior de plaquetas promovem a dilatação de vaso sanguíneo e permeabilidade aumentada, permitindo eficiente seleção de células inflamatórias, tais como neutrófilos, macrófagos, linfócitos e eosinófilos para o tecido danificado. Os neutrófilos são a célula inflamatória mais abundante nos primeiros estágios da cura de feridas, mas são rapidamente substituídos por macrófagos após degranulação de neutrófilos. Macrófagos e neutrófilos ativados desbridam a ferida, eliminam quaisquer organismos invasores e produzem uma variedade de citocinas e quimiocinas que amplificam a resposta inflamatória, bem como a desencadear proliferação e seleção de fibroblastos. Após a ativação, fibroblastos se transformam em miofibroblastos que secretam α-actina de músculo liso e componentes de ECM. Finalmente, na fase de remodelagem, células epiteliais/endoteliais se dividem e migram sobre a matriz temporária para regenerar o tecido danificado. Deste modo, cura e geração de novo tecido é um processo finamente regulado que equilibra a necessidade de regenerar tecido e engrossar paredes de vasos sanguíneos, sem espessamento excessivo e estenose ou fibrose.

Macrófagos

[0040] Mostrou-se que a presença de monócitos circulantes e macrófagos de infiltração é essencial para cura de ferida e novo tecido de desenvolvimento (Arras, et al., J Clin Invest, 101(1): 40-50 (1998)). Entretanto, a extensão de infiltração de macrófagos em um local de dano de tecido também foi correlacionado com a desregulação proliferativa e formação de neoíntima (Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)). Além disso, numerosos estudos indicaram que os macrófagos e fibroblastos são as células efetoras principais envolvidas na patogênese de fibrose (revisto em Wynn, Nat Rev Immunol. 4(8):583-94 (2004)).

[0041] Após o dano vascular, células inflamatórias de monócito (CD16-hi, CD64-hi e CD14-hi em seres humanos; CD115+, CD11b+ e Ly6c-hi em camundongos) são selecionadas para o tecido danificado e se diferenciam em macrófagos ativados (Emr1-hi em seres humanos; F4/80-Hi em camundongos) após a exposição a fatores de crescimento locais, citocinas pró-inflamatórias e compostos microbianos (Geissmann et al., Science 327: 656-661 (2010)). Excessiva infiltração de macrófagos resulta em estenose, enquanto completa inibição da infiltração de macrófagos previne a formação de novo tecido (Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)).

[0042] Dois estados distintos de ativação polarizada para macrófagos foram definidos: o fenótipo de macrófago classicamente ativado (M1) e o fenótipo de macrófago alternativamente ativado (M2) (Gordon e Taylor, Nat. Rev. Immunol. 5: 953-964 (2005); Mantovani et al., Trends Immunol. 23: 549-555 (2002)). O papel do macrófago classicamente ativado (M1) é uma célula efetora em respostas imunes celulares TH1, considerando que macrófago alternativamente ativado (M2) parece estar envolvido na imunossupressão e cura de ferida/reparo de tecido. Macrófagos M1 e M2 têm quimiocina distinta e perfis receptores de quimiocina, com M1 secretando as quimiocinas atraindo a célula TH1 CXCL9 e CXCL10 e com os macrófagos M2 expressando quimiocinas CCL17, CCL22 e CCL24.

[0043] A presença de macrófagos M2 foi associada com o desenvolvimento do neo-íntima e estenose (Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)). A correlação entre a extensão de infiltração de macrófago, formação de novo tecido e estenose em certos momentos após implante de enxerto de tecido provêm meios para prevenir a estenose através da modulação de atividade de macrófago.

[0044] Além disso, os macrófagos estão normalmente localizados perto de células de miofibroblasto produtoras de colágeno, e mostrou-se que os macrófagos derivados de monócitos criticamente perpetuam respostas inflamatórias após lesão como um pré-requisito para a fibrose (Wynn e Barron, Semin Liver Dis., 30(3):245-257 (2010)). Os macrófagos produzem mediadores pró-fibróticos que ativam os fibroblastos, incluindo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), um potente agente quimiotático e fator de transformação de crescimento beta (TGF-B). Especificamente, um aumento acentuado do subconjunto de macrófagos M2 não clássicos (CD14+, CD16+) foi correlacionado com citocinas pró- inflamatórias e progressão clínica em pacientes que sofrem de doença hepática crônica. Durante a progressão de fibrose, macrófagos derivados de monócito liberam citocinas que perpetuam a inflamação crônica, bem como células estreladas hepáticas diretamente ativas (HSCs), resultando em sua proliferação e transdiferenciação em miofibroblastos produtores de colágeno (Zimmermann, et al., PLOS One, 5(6):e11049 (2010)).

Plaquetas

[0045] Plaquetas agregadas auxiliam o reparo de vasos sanguíneos ao se secretar substâncias químicas que atraem os fibroblastos do tecido conjuntivo circundante na área ferida para curar a ferida ou, no caso de respostas inflamatórias desreguladas, forma tecido de cicatriz. Em resposta à lesão de tecido, plaquetas se tornam ativadas em liberam uma multiplicidade de fatores de crescimento que estimulam a deposição de matriz extracelular, tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), um potente agente quimiotático, bem como fator de transformação de crescimento beta (TGF-β). Mostrou-se que ambos desses fatores de crescimento desempenham um papel significativo no reparo e regeneração de tecidos conjuntivos. PDGF funciona como um mitógeno primário e quimioatrativo que aumenta significativamente o influxo de fibroblastos e células inflamatórias, bem como estimular a proliferação celular e a expressão de gene. PDGF possibilita que leucócitos se liguem firmemente à parede do vaso e finalmente transmigrem no tecido subendotelial. Entretanto, as quimiocinas derivadas de plaquetas também são conhecidas por induzir a proliferação de célula de músculo liso (SMC) e desempenha um papel na proliferação de neoíntima e fibrose de órgão (Chandrasekar,et al., J Am College Cardiology, Vol 35, N° 3, pág. 555-562 (2000)). Expressão aumentada de PDGF e seus receptores são associados com esclerodermia pulmonar e tecido de pele. Especificamente, há evidências para um ciclo de sinalização mediado por receptor de PDGF autócrino em fibroblastos de esclerodermia pulmonar e pele, implicando tanto vias TGF-β e PDGF em fibrose crônica em esclerodermia (Trojanowska, Rheumatology; 47:v2-v4 (2008)). Além disso, a desregulação de sinalização de PDGF está associada com indicações cardiovasculares, tais como hipertensão pulmonar e aterosclerose.

[0046] Proliferação de migração de célula de músculo liso (SMC) de camada mediana em resposta ao PDGF induzido por lesão são eventos essenciais que contribuem para espessamento de neoíntima (Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86:8412 (1989); Clowes, et al., Circ.Res., 56:139-145 (1985)) que eventualmente leva ao estreitamento dos vasos sanguíneos e estenose.

[0047] Outros fatores de crescimento associados à cura liberados pelas plaquetas incluem fator de crescimento de fibroblasto básico, fator de crescimento similar à insulina 1, fator de crescimento epidérmico derivado de plaquetas e fator de crescimento endotelial vascular.

[0048] Deste modo, inibidores do gene LYST e proteína LYST podem criar um ambiente imune pró-regenerativo que intensifica a cura de ferida e previne distúrbios proliferativos, tais como hiperplasia da íntima, desenvolvimento de tecido cicatriz excessivo e doença fibrótica. Modulação de LYST também pode modular a função e atividade de plaquetas. Deste modo, inibidores do gene LYST e/ou proteína LYST podem ser usados para reduzir ou prevenir as funções biológicas de plaquetas, tais como agregação de plaquetas e a produção/expressão de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF).

[0049] Composições para promover regeneração de tecido e prevenir ou reduzir doenças caracterizadas pela formação de tecido de cicatriz excessivo pelo bloqueio da expressão e/ou a função da proteína LYST são divulgadas.

A. LYST

[0050] O produto de gene regulador de tráfego de lisossomal (LYST) é uma proteína ubíqua associada com o transporte de material intracelular para a lisossoma. Estabeleceu-se que mutações que reduzem ou inibem a função da proteína LYST interferem nas funções normais de macrófagos e também impacta nas atividades biológicas de células exterminadoras naturais (nk) e plaquetas. Acredita-se que a modulação da proteína LYST provê um meio para modular processos imunes que dão origem a distúrbios vasculares proliferativos, formação de neoíntima, fibrose e cicatrização excessiva.

1. O Gene LYST

[0051] O gene LYST humano está localizado no cromossomo 1, (segmento 1q42.1-q42.2pares de base 235.661.030 a 235.883.707) (Barrat, et al., Am. J. Hum. Genet, 59:625-632 (1996)). Sequências de ácido nucleico para o produto de gene LYST são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Sequência de Referência NCBI: NM_000081.3, regulador de tráfego lisossomal (LYST) de Homo sapiens, variante de transcrição 1, mRNA, que provê a sequência de ácido nucleico: 1 GTGCGCGGCG GCGGCGGCAG CGGCGTCGGC TCGGGGTTCT CCGGGAGAGG GGGAGTGCGC 61 GGCGGCCGCA GCTGCCACAA ACCAGGTGAA GCTTTGTTCT AAGAATATTT GTTTCATCTA 121 GTTTATGAGT CCAAATGATA TAGACTGTAA ATGTCACAGC AGTGGTGAAA GACTGCTCGG 181 TCATGAGCAC CGACAGTAAC TCACTGGCAC GTGAATTTCT GACCGATGTC AACCGGCTTT 241 GCAATGCAGT GGTCCAGAGG GTGGAGGCCA GGGAGGAAGA AGAGGAGGAG ACGCACATGG 301 CAACCCTTGG ACAGTACCTT GTCCATGGTC GAGGATTTCT ATTACTTACC AAGCTAAATT 361 CTATAATTGA TCAGGCATTG ACATGTAGAG AAGAACTCCT GACTCTTCTT CTGTCTCTCC 421 TTCCACTGGT ATGGAAGATA CCTGTCCAAG AAGAAAAGGC AACAGATTTT AACCTACCGC 481 TCTCAGCAGA TATAATCCTG ACCAAAGAAA AGAACTCAAG TTCACAAAGA TCCACTCAGG 541 AAAAATTACA TTTAGAAGGA AGTGCCCTGT CTAGTCAGGT TTCTGCAAAA GTAAATGTTT 601 TTCGAAAAAG CAGACGACAG CGTAAAATTA CCCATCGCTA TTCTGTAAGA GATGCAAGAA 661 AGACACAGCT CTCCACCTCA GATTCAGAAG CCAATTCAGA TGAAAAAGGC ATAGCAATGA 721 ATAAGCATAG AAGGCCCCAT CTGCTGCATC ATTTTTTAAC ATCGTTTCCT AAACAAGACC 781 ACCCCAAAGC TAAACTTGAC CGCTTAGCAA CCAAAGAACA GACTCCTCCA GATGCTATGG 841 CTTTGGAAAA TTCCAGAGAG ATTATTCCAA GACAGGGGTC AAACACTGAC ATTTTAAGTG 901 AGCCAGCTGC CTTGTCTGTT ATCAGTAACA TGAACAATTC TCCATTTGAC TTATGTCATG 961 TTTTGTTATC TTTATTAGAA AAAGTTTGTA AGTTTGACGT TACCTTGAAT CATAATTCTC 1021 CTTTAGCAGC CAGTGTAGTG CCCACACTAA CTGAATTCCT AGCAGGCTTT GGGGACTGCT 1081 GCAGTCTGAG CGACAACTTG GAGAGTCGAG TAGTTTCTGC AGGTTGGACC GAAGAACCGG 1141 TGGCTTTGAT TCAAAGGATG CTCTTTCGAA CAGTGTTGCA TCTTCTGTCA GTAGATGTTA 1201 GTACTGCAGA GATGATGCCA GAAAATCTTA GGAAAAATTT AACTGAATTG CTTAGAGCAG 1261 CTTTAAAAAT TAGAATATGC CTAGAAAAGC AGCCTGACCC TTTTGCACCA AGACAAAAGA 1321 AAACACTGCA GGAGGTTCAG GAAGATTTTG TGTTTTCAAA GTATCGTCAT AGAGCCCTTC 1381 TTTTACCTGA GCTTTTGGAA GGAGTTCTTC AGATTCTGAT CTGTTGTCTT CAAAGTGCAG 1441 CTTCAAATCC CTTCTACTTC AGTCAAGCCA TGGATTTGGT TCAAGAATTC ATTCAGCATC 1501 ATGGATTTAA TTTATTTGAA ACAGCAGTTC TTCAAATGGA ATGGCTGGTT TTAAGAGATG 1561 GAGTTCCTCC CGAGGCCTCA GAGCATTTGA AAGCCCTAAT AAATAGTGTG ATGAAAATAA 1621 TGAGCACTGT CAAAAAAGTG AAATCAGAGC AACTTCATCA TTCGATGTGT ACAAGAAAAA 1681 GGCACAGACG ATGTGAATAT TCTCATTTTA TGCATCATCA CCGAGATCTC TCAGGTCTTC 1741 TGGTTTCGGC TTTTAAAAAC CAGGTTTCCA AAAACCCATT TGAAGAGACT GCAGATGGAG 1801 ATGTTTATTA TCCTGAGCGG TGCTGTTGCA TTGCAGTGTG TGCCCATCAG TGCTTGCGCT 1861 TACTACAGCA GGCTTCCTTG AGCAGCACTT GTGTCCAGAT CCTATCGGGT GTTCATAACA 1921 TTGGAATATG CTGTTGTATG GATCCCAAAT CTGTAATCAT TCCTTTGCTC CATGCTTTTA 1981 AATTGCCAGC ACTGAAAAAT TTTCAGCAGC ATATATTGAA TATCCTTAAC AAACTTATTT 2041 TGGATCAGTT AGGAGGAGCA GAGATATCAC CAAAAATTAA AAAAGCAGCT TGTAATATTT 2101 GTACTGTTGA CTCTGACCAA CTAGCCCAAT TAGAAGAGAC ACTGCAGGGA AACTTATGTG 2161 ATGCTGAACT CTCCTCAAGT TTATCCAGTC CTTCTTACAG ATTTCAAGGG ATCCTGCCCA 2221 GCAGTGGATC TGAAGATTTG TTGTGGAAAT GGGATGCTTT AAAGGCTTAT CAGAACTTTG 2281 TTTTTGAAGA AGACAGATTA CATAGTATAC AGATTGCAAA TCACATTTGC AATTTAATCC 2341 AGAAAGGCAA TATAGTTGTT CAGTGGAAAT TATATAATTA CATATTTAAT CCTGTGCTCC 2401 AAAGAGGAGT TGAATTAGCA CATCATTGTC AACACCTAAG CGTTACTTCA GCTCAAAGTC 2461 ATGTATGTAG CCATCATAAC CAGTGCTTGC CTCAGGACGT GCTTCAGATT TATGTAAAAA 2521 CTCTGCCTAT CCTGCTTAAA TCCAGGGTAA TAAGAGATTT GTTTTTGAGT TGTAATGGAG 2581 TAAGTCAAAT AATCGAATTA AATTGCTTAA ATGGTATTCG AAGTCATTCT CTAAAAGCAT 2641 TTGAAACTCT GATAATCAGC CTAGGGGAGC AACAGAAAGA TGCCTCAGTT CCAGATATTG 2701 ATGGGATAGA CATTGAACAG AAGGAGTTGT CCTCTGTACA TGTGGGTACT TCTTTTCATC 2761 ATCAGCAAGC TTATTCAGAT TCTCCTCAGA GTCTCAGCAA ATTTTATGCT GGCCTCAAAG 2821 AAGCTTATCC AAAGAGACGG AAGACTGTTA ACCAAGATGT TCATATCAAC ACAATAAACC 2881 TATTCCTCTG TGTGGCTTTT TTATGCGTAA GTAAAGAAGC AGAGTCTGAC AGGGAGTCGG 2941 CCAATGACTC AGAAGATACT TCTGGCTATG ACAGCACAGC CAGCGAGCCT TTAAGTCATA 3001 TGCTGCCATG TATATCTCTC GAGAGCCTTG TCTTGCCTTC TCCTGAACAT ATGCACCAAG 3061 CAGCAGACAT TTGGTCTATG TGTCGTTGGA TCTACATGTT GAGTTCAGTG TTCCAGAAAC 3121 AGTTTTATAG GCTTGGTGGT TTCCGAGTAT GCCATAAGTT AATATTTATG ATAATACAGA 3181 AACTGTTCAG AAGTCACAAA GAGGAGCAAG GAAAAAAGGA GGGAGATACA AGTGTAAATG 3241 AAAACCAGGA TTTAAACAGA ATTTCTCAAC CTAAGAGAAC TATGAAGGAA GATTTATTAT 3301 CTTTGGCTAT AAAAAGTGAC CCCATACCAT CAGAACTAGG TAGTCTAAAA AAGAGTGCTG 3361 ACAGTTTAGG TAAATTAGAG TTACAGCATA TTTCTTCCAT AAATGTGGAA GAAGTTTCAG 3421 CTACTGAAGC CGCTCCCGAG GAAGCAAAGC TATTTACAAG TCAAGAAAGT GAGACCTCAC 3481 TTCAAAGTAT ACGACTTTTG GAAGCCCTTC TGGCCATTTG TCTTCATGGT GCCAGAACTA 3541 GTCAACAGAA GATGGAATTG GAGTTACCTA ATCAGAACTT GTCTGTGGAA AGTATATTAT 3601 TTGAAATGAG GGACCATCTT TCCCAGTCAA AGGTGATTGA AACACAACTA GCAAAGCCTT 3661 TATTTGATGC CCTGCTTCGA GTTGCCCTCG GGAATTATTC AGCAGATTTT GAACATAATG 3721 ATGCTATGAC TGAGAAGAGT CATCAATCTG CAGAAGAATT GTCATCCCAG CCTGGTGATT 3781 TTTCAGAAGA AGCTGAGGAT TCTCAGTGTT GTAGTTTTAA ACTTTTAGTT GAAGAAGAAG 3841 GTTACGAAGC AGATAGTGAA AGCAATCCTG AAGATGGCGA AACCCAGGAT GATGGGGTAG 3901 ACTTAAAGTC TGAAACAGAA GGTTTCAGTG CATCAAGCAG TCCAAATGAC TTACTCGAAA 3961 ACCTCACTCA AGGGGAAATA ATTTATCCTG AGATTTGTAT GCTGGAATTA AATTTGCTTT 4021 CTGCTAGTAA AGCCAAACTT GATGTGCTTG CCCATGTATT TGAGAGTTTT TTGAAAATTA 4081 TTAGGCAGAA AGAAAAGAAT GTTTTTCTGC TCATGCAACA GGGAACTGTG AAAAATCTTT 4141 TAGGAGGGTT CTTGAGTATT TTAACACAGG ATGATTCTGA TTTTCAAGCA TGCCAGAGAG 4201 TATTGGTGGA TCTTTTGGTA TCTTTGATGA GTTCAAGAAC ATGTTCAGAA GAGCTAACCC 4261 TTCTTTTGAG AATATTTCTG GAGAAATCTC CTTGTACAAA AATTCTTCTT CTGGGTATTC 4321 TGAAAATTAT TGAAAGTGAT ACTACTATGA GCCCTTCACA GTATCTAACC TTCCCTTTAC 4381 TGCACGCTCC AAATTTAAGC AACGGTGTTT CATCACAAAA GTATCCTGGG ATTTTAAACA 4441 GTAAGGCCAT GGGTTTATTG AGAAGAGCAC GAGTTTCACG GAGCAAGAAA GAGGCTGATA 4501 GAGAGAGTTT TCCCCATCGG CTGCTTTCAT CTTGGCACAT AGCCCCAGTC CACCTGCCGT 4561 TGCTGGGGCA AAACTGCTGG CCACACCTAT CAGAAGGTTT CAGTGTTTCC CTGTGGTTTA 4621 ATGTGGAGTG TATCCATGAA GCTGAGAGTA CTACAGAAAA AGGAAAGAAG ATAAAGAAAA 4681 GAAACAAATC ATTAATTTTA CCAGATAGCA GTTTTGATGG TACAGAGAGC GACAGACCAG 4741 AAGGTGCAGA GTACATAAAT CCTGGTGAAA GACTCATAGA AGAAGGATGT ATTCATATAA 4801 TTTCACTGGG ATCCAAAGCG TTGATGATCC AAGTGTGGGC TGATCCCCAC AATGCCACTC 4861 TTATCTTTCG TGTGTGCATG GATTCAAATG ATGACATGAA 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ACAGTCTTCT GTTTTCAATC 8281 CATTTCAGAA AGAAATTTTT ACATATCTGG TAGAAGGATT CAAAGTATCT ATTGGTTCAA 8341 GTAAAGCCAG TGGTTCCAAG CAGCAATGGA CTAAAATTCT GTGGTCTTGT AAGGAGACCT 8401 TCCGAATGCA GCTTGGGAGA CTACTAGTGC ATATTTTGTC GCCAGCCCAC GCTGCACAAG 8461 AGAGAAAGCA AATTTTTGAA ATAGTTCATG AACCAAATCA TCAGGAAATA CTACGAGACT 8521 GTCTCAGCCC ATCCCTACAA CATGGAGCCA AGTTAGTTTT GTATTTGTCA GAGTTGATAC 8581 ATAATCACCA AGGTGAATTG ACTGAAGAAG AGCTAGGCAC AGCAGAACTG CTTATGAATG 8641 CTTTGAAGTT ATGTGGTCAC AAGTGCATCC CTCCCAGTGC ATCAACAAAA GCAGACCTTA 8701 TTAAAATGAT CAAAGAGGAA CAAAAGAAAT ATGAAACTGA AGAAGGAGTG AATAAAGCTG 8761 CTTGGCAGAA AACAGTTAAC AATAATCAAC AAAGTCTCTT TCAGCGTCTG GATTCAAAAT 8821 CAAAGGATAT ATCTAAAATA GCTGCAGATA TCACCCAGGC AGTGTCTCTC TCCCAAGGAA 8881 ATGAGAGAAA AAAGGTGATC CAGCATATTA GAGGAATGTA TAAAGTAGAT TTGAGTGCCA 8941 GCAGACATTG GCAGGAACTT ATTCAGCAGC TGACACATGA TAGAGCAGTA TGGTATGACC 9001 CCATCTACTA TCCAACCTCA TGGCAGTTGG ATCCAACAGA AGGGCCAAAT CGAGAGAGGA 9061 GACGTTTACA GAGATGTTAT TTAACTATTC CAAATAAGTA TCTCCTTAGG GATAGACAGA 9121 AATCAGAAGA TGTTGTCAAA CCACCACTCT CTTACCTGTT TGAAGACAAA ACTCATTCTT 9181 CTTTCTCTTC TACTGTCAAA GACAAAGCTG CAAGTGAATC TATAAGAGTG AATCGAAGAT 9241 GCATCAGTGT TGCACCATCT AGAGAGACAG CTGGTGAATT GTTACTAGGT AAATGTGGAA 9301 TGTATTTTGT GGAAGATAAT GCTTCTGATA CAGTTGAAAG TTCGAGCCTT CAGGGAGAGT 9361 TGGAACCAGC ATCATTTTCC TGGACATATG AAGAAATTAA AGAAGTTCAC AAGCGTTGGT 9421 GGCAATTGAG AGATAATGCT GTAGAAATCT TTCTAACAAA TGGCAGAACA CTCCTGTTGG 9481 CATTTGATAA CACCAAGGTT CGTGATGATG TATACCACAA TATACTCACA AATAACCTCC 9541 CTAATCTTCT GGAATATGGT AACATCACCG CTCTGACAAA TTTATGGTAT ACTGGGCAAA 9601 TTACTAATTT TGAATATTTG ACTCACTTAA ACAAACATGC TGGCCGATCC TTCAATGATC 9661 TCATGCAGTA TCCTGTGTTC CCATTTATAC TTGCTGACTA CGTTAGTGAG ACACTTGACC 9721 TCAATGATCT GTTGATATAC AGAAATCTCT CTAAACCTAT AGCTGTTCAG TATAAAGAAA 9781 AAGAAGATCG TTATGTGGAC ACATACAAGT ACTTGGAGGA AGAGTACCGC AAAGGAGCCA 9841 GAGAAGATGA CCCCATGCCT CCCGTGCAGC CCTATCACTA TGGCTCCCAC TATTCCAATA 9901 GCGGCACTGT GCTTCACTTC CTGGTCAGGA TGCCTCCTTT 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ACATTCAGTG GTCAGCCATC CTGAGCTGGG 10801 GATATGCTGA TAATATTTTA AGGTTGAAGA GTAAACAAAG TGAGCCTCCA GTAAACTTTA 10861 TTCAAAGTTC ACAACAGTAC CAGGTGACTA GTTGTGCTTG GGTGCCTGAC AGTTGCCAGC 10921 TGTTTACTGG AAGCAAATGC GGTGTCATCA CAGCCTACAC AAACAGATTT ACAAGCAGCA 10981 CGCCATCAGA AATAGAAATG GAGACTCAAA TACATCTCTA TGGTCACACA GAAGAGATAA 11041 CCAGCTTATT TGTTTGCAAA CCATACAGTA TACTGATAAG TGTGAGCAGA GACGGAACCT 11101 GCATCATATG GGATTTAAAC AGGTTATGCT ATGTACAAAG TCTGGCGGGA CACAAAAGCC 11161 CTGTCACAGC TGTCTCTGCC AGTGAAACCT CAGGTGATAT TGCTACTGTG TGTGATTCAG 11221 CTGGCGGAGG CAGTGACCTC AGACTCTGGA CGGTGAACGG GGATCTCGTT GGACATGTCC 11281 ACTGCAGGGA GATCATCTGT TCCGTGGCTT TCTCCAACCA GCCTGAGGGA GTATCTATCA 11341 ATGTAATCGC TGGGGGATTA GAAAATGGAA TTGTAAGGTT ATGGAGCACA TGGGACTTAA 11401 AGCCTGTGAG AGAAATTACA TTTCCCAAAT CAAATAAGCC CATCATCAGC CTTACATTTT 11461 CTTGTGATGG CCACCATTTG TACACAGCAA ACAGTGATGG GACCGTGATT GCCTGGTGTC 11521 GGAAGGACCA GCAGCGCTTG AAACAGCCAA TGTTCTATTC CTTCCTTAGC AGCTATGCAG 11581 CCGGGTGAAT GCGAATGAAC TTCACGTTCT CCAAAGCACT TTAACTCCAA ACTAGATTTG 11641 TTGACTTCAC CAGTTTTAGG AGGTTGAACC TAAAGAAATG GATGACTGGA CAAACCATCC 11701 AAATAATGAT AAAGTCTATT CATCTGCACA AAATTCTGAA GAGTCACATG ATCCTAAGAG 11761 GAAAGTTCTG TTCTATTTTA GTGATAATCT GGAAGATTGT GTCAATATGC ACTAGCCAAC 11821 AAGTTTTAAG CCTCGCATGG TACATTAAAA TGATATTCTT AAAATTTTTT CCCACCAAGG 11881 TATTCCAAAG AAAATATTAA GGTCTCCCCT TTTTCTATGA TTCCAAAAGG ACCAGTAGAA 11941 TTTAAATTGG TTGGTTGATT GTTTATATAA AACACACTAA AATTATATTT TAAAAGTTTA 12001 CTGCCATGAA ATACTCCTCC CACCACACAC ACATGCTCCA AAAGAGGAAA GAAAAAAAGA 12061 TAATTTTTAG GACTTGATAA TTGCTTTCTT TGAGAAGCAA ATTATTCAGT AGGTGCCTCT 12121 GTACCAAATA TTTTATGGAA TATCTAAATA CTAAAATAAA CTATGAATGA ATCTCAAAAT 12181 TAGGCAGTTT TTGCCAGTTG CTTTCTTAGC TCAAAGGAGA ACCAGAATTT TTTTGACAGC 12241 CACAAACAAG AATACAGGTA TCTTGGATTT CAGACACATT CTGTTTCTTC ATAAAAATTT 12301 TACTTAAAAT CTGTAACGCT AGATATTGAC TATCCTTAGT TGAGTCACTG AGGTTTAAAC 12361 ACAATGGTAA GTCTTAAAGT CTGCTATTTA CAGAGCATTG AATCTGTACC AATTTGCAAT 12421 AGAAAGCCTT 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GAAAATATGC AGAATAACTG GTCTTGTTAA GAGTGCAATA TTATATTTTT ATGTAAAAAT 13321 AAAAATTAAT TTGGGGGGAT TATTTATTCA GCATGAAACC TAATATGTAT ATGTTTGAAA 13381 TACTTCATAA TGTGCATGTT GTAGCAAACA TTTCTGTAAA TTATCACAAG CTCTGTTACC 13441 TTTATATACA CTGCCTCTTC AATTTGGAAA TAAATTTCAT AAAAATAGAT GTAAACAAAA 13501 AAA (SEQ ID N°: 1). Sequências de nucleotídeo que tenham pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácido para SEQ ID N°: 1 também são divulgadas. 2. A Proteína LYST

[0052] O polipeptídeo LYST é uma proteína citoplasmática de aminoácido 3.801 (também conhecido como regulador de tráfego lisossomal, proteína CHS, proteína CHS1 ou LYST) com um peso molecular de aproximadamente 429 kDa (Barbosa, et al., Nature, 382(6588): 262-265 (1996)).

[0053] A proteína LYST existe como uma das três isoformas e prevê-se adotar uma estrutura helicoidal (Barbosa, et al., Nature, 382(6588): 262-265 (1996)).

[0054] A proteína LYST é altamente conservada através de espécies de mamíferos e é expressa em níveis baixos em todos os tipos de células, mas é abundantemente expressa no timo adulto e fetal, leucócitos sanguíneos periféricos, medula óssea e várias regiões do cérebro adulto (ver revisão por Dotta, et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 8:168 (2013) e referências nele).

[0055] Sequências de aminoácido da proteína LYST humana são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Acesso GenBank N° U67615: MSTDSNSLAR EFLTDVNRLC NAVVQRVEAR EEEEEETHMA TLGQYLVHGR GFLLLTKLNS 60 IIDQALTCRE ELLTLLLSLL PLVWKIPVQE EKATDFNLPL SADIILTKEK NSSSQRSTQE 120 KLHLEGSALS SQVSAKVNVF RKSRRQRKIT HRYSVRDARK TQLSTSDSEA NSDEKGIAMN 180 KHRRPHLLHH FLTSFPKQDH PKAKLDRLAT KEQTPPDAMA LENSREIIPR QGSNTDILSE 240 PAALSVISNM NNSPFDLCHV LLSLLEKVCK FDVTLNHNSP LAASVVPTLT EFLAGFGDCC 300 SLSDNLESRV VSAGWTEEPV ALIQRMLFRT VLHLLSVDVS TAEMMPENLR KNLTELLRAA 360 LKIRICLEKQ PDPFAPRQKK TLQEVQEDFV FSKYRHRALL LPELLEGVLQ ILICCLQSAA 420 SNPFYFSQAM DLVQEFIQHH GFNLFETAVL QMEWLVLRDG VPPEASEHLK ALINSVMKIM 480 STVKKVKSEQ LHHSMCTRKR HRRCEYSHFM HHHRDLSGLL VSAFKNQVSK NPFEETADGD 540 VYYPERCCCI AVCAHQCLRL LQQASLSSTC VQILSGVHNI GICCCMDPKS VIIPLLHAFK 600 LPALKNFQQH ILNILNKLIL DQLGGAEISP KIKKAACNIC TVDSDQLAQL EETLQGNLCD 660 AELSSSLSSP SYRFQGILPS SGSEDLLWKW DALKAYQNFV FEEDRLHSIQ IANHICNLIQ 720 KGNIVVQWKL YNYIFNPVLQ RGVELAHHCQ HLSVTSAQSH VCSHHNQCLP QDVLQIYVKT 780 LPILLKSRVI RDLFLSCNGV SQIIELNCLN GIRSHSLKAF ETLIISLGEQ QKDASVPDID 840 GIDIEQKELS SVHVGTSFHH QQAYSDSPQS LSKFYAGLKE AYPKRRKTVN QDVHINTINL 900 FLCVAFLCVS KEAESDRESA LPCISLESLV LPSPEHMHQA 960 ADIWSMCRWI YMLSSVFQKQ LFRSHKEEQG KKEGDTSVNE 1020 NQDLNRISQP KRTMKEDLLS SLGKLELQHI SSINVEEVSA 1080 TEAAPEEAKL FTSQESETSL QQKMELELPN QNLSVESILF 1140 EMRDHLSQSK VIETQLAKPL AMTEKSHQSA EELSSQPGDF 1200 SEEAEDSQCC SFKLLVEEEG LKSETEGFSA SSSPNDLLEN 1260 LTQGEIIYPE ICMLELNLLS RQKEKNVFLL MQQGTVKNLL 1320 GGFLSILTQD DSDFQACQRV LLRIFLEKSP CTKILLLGIL 1380 KIIESDTTMS PSQYLTFPLL KAMGLLRRAR VSRSKKEADR 1440 ESFPHRLLSS WHIAPVHLPL VECIHEAEST TEKGKKIKKR 1500 NKSLILPDSS FDGTESDRPE SLGSKALMIQ VWADPHNATL 1560 IFRVCMDSND DMKAVLLAQV QQPQGKRRIH GKISIWVSGQ 1620 RKPDVTLDFM LPRKTSLSSD LAGKWDLGNL LLFNGAKVGS 1680 QEAFYLYACG PNHTSVMPCK QIRELFMTKK DVDIGLLIES 1740 LSVVYTTYCP AQYTIYEPVI QSILLEPHHL KNLQPTEYKT 1800 IQGILHEIGG TGIFVFLFAR VVELSSCEET QALALRVILS LIKYNQQRVH ELENCNGLSM 1860 IHQVLIKQKC IVGFYILKTL LEGCCGEDII YMNENGEFKL DVDSNAIIQD VKLLEELLLD 1920 WKIWSKAEQG VWETLLAALE VLIRADHHQQ MFNIKQLLKA QVVHHFLLTC QVLQEYKEGQ 1980 LTPMPREVCR SFVKIIAEVL GSPPDLELLT IIFNFLLAVH PPTNTYVCHN PTNFYFSLHI 2040 DGKIFQEKVR SIMYLRHSSS GGRSLMSPGF MVISPSGFTA SPYEGENSSN IIPQQMAAHM 2100 LRSRSLPAFP TSSLLTQSQK LTGSLGCSID RLQNIADTYV ATQSKKQNSL GSSDTLKKGK 2160 EDAFISSCES AKTVCEMEAV LSAQVSVSDV PKGVLGFPVV KADHKQLGAE PRSEDDSPGD 2220 ESCPRRPDYL KGLASFQRSH STIASLGLAF PSQNGSAAVG RWPSLVDRNT DDWENFAYSL 2280 GYEPNYNRTA SAHSVTEDCL VPICCGLYEL LSGVLLILPD VLLEDVMDKL IQADTLLVLV 2340 NHPSPAIQQG VIKLLDAYFA RASKEQKDKF LKNRGFSLLA NQLYLHRGTQ ELLECFIEMF 2400 FGRHIGLDEE FDLEDVRNMG LFQKWSVIPI LGLIETSLYD NILLHNALLL LLQILNSCSK 2460 VADMLLDNGL LYVLCNTVAA LNGLEKNIPM SEYKLLACDI QQLFIAVTIH ACSSSGSQYF 2520 RVIEDLIVML GYLQNSKNKR TQNMAVALQL RVLQAAMEFI RTTANHDSEN LTDSLQSPSA 2580 PHHAVVQKRK SIAGPRKFPL AQTESLLMKM RSVANDELHV MMQRRMSQEN PSQATETELA 2640 QRLQRLTVLA VNRIIYQEFN SDIIDILRTP ENVTQSKTSV FQTEISEENI HHEQSSVFNP 2700 FQKEIFTYLV EGFKVSIGSS KASGSKQQWT KILWSCKETF RMQLGRLLVH ILSPAHAAQE 2760 RKQIFEIVHE PNHQEILRDC LSPSLQHGAK LVLYLSELIH NHQGELTEEE LGTAELLMNA 2820 LKLCGHKCIP PSASTKADLI KMIKEEQKKY ETEEGVNKAA WQKTVNNNQQ SLFQRLDSKS 2880 KDISKIAADI TQAVSLSQGN ERKKVIQHIR GMYKVDLSAS RHWQELIQQL THDRAVWYDP 2940 IYYPTSWQLD PTEGPNRERR RLQRCYLTIP NKYLLRDRQK SEDVVKPPLS YLFEDKTHSS 3000 FSSTVKDKAA SESIRVNRRC ISVAPSRETA GELLLGKCGM YFVEDNASDT VESSSLQGEL 3060 EPASFSWTYE EIKEVHKRWW QLRDNAVEIF LTNGRTLLLA FDNTKVRDDV YHNILTNNLP 3120 NLLEYGNITA LTNLWYTGQI TNFEYLTHLN KHAGRSFNDL MQYPVFPFIL ADYVSETLDL 3180 NDLLIYRNLS KPIAVQYKEK EDRYVDTYKY LEEEYRKGAR EDDPMPPVQP YHYGSHYSNS 3240 GTVLHFLVRM PPFTKMFLAY QDQSFDIPDR TFHSTNTTWR LSSFESMTDV KELIPEFFYL 3300 PEFLVNREGF DFGVRQNGER VNHVNLPPWA RNDPRLFILI HRQALESDYV SQNICQWIDL 3360 VFGYKQKGKA SVQAINVFHP ATYFGMDVSA VEDPVQRRAL ETMIKTYGQT PRQLFHMAHV 3420 SRPGAKLNIE GELPAAVGLL VQFAFRETRE QVKEITYPSP LSWIKGLKWG EYVGSPSAPV 3480 PVVCFSQPHG ERFGSLQALP TRAICGLSRN FCLLMTYSKE QGVRSMNSTD IQWSAILSWG 3540 YADNILRLKS KQSEPPVNFI QSSQQYQVTS CAWVPDSCQL FTGSKCGVIT AYTNRFTSST 3600 PSEIEMETQI HLYGHTEEIT SLFVCKPYSI LISVSRDGTC IIWDLNRLCY VQSLAGHKSP 3660 VTAVSASETS GDIATVCDSA GGGSDLRLWT VNGDLVGHVH CREIICSVAF SNQPEGVSIN 3720 VIAGGLENGI VRLWSTWDLK PVREITFPKS NKPIISLTFS CDGHHLYTAN SDGTVIAWCR 3780 KDQQRLKQPM FYSFLSSYAA G 3801 (SEQ ID N°: 2)

[0056] Polipeptídeos LYST que tenham pelo menos 80%, 85%,90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácido para SEQ ID N°: 2 são divulgados.

[0057] Embora a proteína LYST tenha sido associada com muitas atividades celulares diversas, particularmente no tráfego de proteína intracelular em endossomos e lisossomos, a função biológica da proteína LYST manteve-se em grande parte desconhecida.

[0058] Expressão e função anormal do produto de gene LYST foram envolvidas em numerosos distúrbios patológicos, incluindo doenças autoimunes, distúrbios hiperproliferativos e disfunção de plaquetas. Especificamente, mutações no gene LYST estão associadas com a doença humana síndrome de Chediak-Higashi (CHS) (Barrat, et al., Am. J. Hum. Genet, 59:625-632 (1996)). No paciente com CHS, o gene LYST contém uma mutação do tipo frame-shift em nucleotídeos 117-118 do domínio de codificação.

[0059] CHS é um distúrbio de armazenamento lisossomal raro caracterizado por hipopigmentação, deficiência imunológica grave, uma tendência a sangramento, anormalidades neurológicas, transporte intracelular anormal para e a partir do lisossomo e corpos de inclusão gigantes em uma variedade de tipos de célula. Pelo menos 30 mutações no gene LYST foram identificadas em pessoas com síndrome de Chediak- Higashi. Estas mutações prejudicam a função normal da proteína reguladora de tráfego lisossomal, que interrompe o tamanho, estrutura e função de Iisossomos e estruturas relacionadas no interior das células. Pessoas com mutações LYST têm lisossomos anormalmente grandes e estruturas relacionadas em células por todo o corpo. Estas estruturas ampliadas interferem com as funções celulares normais. Lisossomos ampliados em células do sistema imunológico, tais como macrófagos, previnem que essas células respondam adequadamente às bactérias e outros invasores estranhos; grandes lisossomos perinucleares são dispostos de forma tubular no interior das células de macrófagos de pessoas com CHS. Neutrófilos e monócitos afetados têm uma capacidade de quimiotática e migratória que é cerca de 40% daquela de células normais. Pacientes afetados também têm uma tendência ao sangramento devido à disfunção de plaquetas. Como resultado da capacidade de resposta diminuída aos estímulos quimiotáticos, o sistema imunológico defeituoso não pode proteger o corpo de infecções graves e recorrentes. Frequentemente, CHS é fatal em função de os pacientes serem imunocomprometidos e serem incapazes de montar uma resposta imune eficaz à infecção.

[0060] Na cepa de camundongo bege (Bg), o homólogo de rato de LYST ("Lyst") é interrompido por uma deleção que elimina a expressão de proteína Lyst funcional. Verificou-se que camundongos BG exibem doenças proliferativas reduzidas, incluindo uma taxa inferior de estenose após o implante de enxertos de tecido vascular, em comparação aos camundongos do tipo selvagem. O efeito da proteína Lyst disfuncional em camundongos Bg é macrófago altamente específico, conforme determinado por experimentos de transplante de medula óssea (ver Exemplos).

C. Inibidores de LYST

[0061] Estabeleceu-se que o bloqueio da proteína LYST pode reduzir ou prevenir processos imunes que dão origem a distúrbios proliferativos vasculares, doença fibroproliferativa e tecido de cicatriz excessivo após a lesão. Agentes imunomoduladores que inibem ou reduzem a transcrição, tradução ou a função da proteína LYST são divulgados.

[0062] Inibidores de LYST podem de ligar ao gene LYST ou à proteína LYST e direta ou indiretamente bloquear a função biológica de proteína LYST. Inibidores também podem bloquear a função biológica de uma ou mais vias de sinalização que constituem a função biológica a jusante de LYST. Em algumas modalidades, inibidores de LYST atuam ao se prevenir que ligantes endógenos da proteína LYST interajam com ou se liguem diretamente à proteína LYST. Os inibidores podem bloquear interações de proteína-proteína, envolvendo a proteína LYST, ou eles podem prevenir ou reduzir a atividade funcional de um complexo da proteína LYST e um ligante. Inibidores que se ligam diretamente à proteína LYST podem atuar por oclusão direta de um local ativo na proteína LYST, ou através da oclusão indireta, tais como por bloqueio esteárico de interações LYST. Por exemplo, em algumas modalidades, o inibidor obstrui ou oclui a função de um domínio de interação de proteína, tais como o domínio de proteína solenoide formado por cópias em tandem do motif de repetição de WD40. Em outras modalidades, inibidores se ligam a um local que é espacialmente distinto de um local ativo.

[0063] Inibidores que se ligam à proteína LYST podem prevenir a função de LYST por mecanismos incluindo, mas não limitados a, induzir dimerização, induzir oligomerização, induzir mudanças conformacionais, prevenir funções catalisadoras, induzir degradação, induzir absorção por células imunes, prevenir a absorção por células alvo, prevenir ligação de ligante, prevenir fosforilação, induzir desnaturação, prevenir uma ou mais modificações após tradução ou, de outra forma, alterar a estrutura terciária nativa da proteína LYST.

[0064] Entende-se que iniciação ou transdução de vias de sinalização celular por LYST pode exigir a ligação de um ligante à proteína LYST. Portanto, proteínas, anticorpos ou pequenas moléculas que bloqueiam vias de transdução de sinal envolvendo LYST e, opcionalmente, prevenir coligação de LYST e seus receptores são agentes imunomoduladores úteis. Classes de inibidores de LYST discutidas abaixo incluem anticorpos e ácidos nucleicos funcionais.

i. Anticorpos

[0065] Anticorpos que inibem a função de LYST ao se ligar diretamente à proteína LYST, seus ligantes ou suas moléculas acessórias são divulgados. Qualquer anticorpo específico pode ser usado nos métodos e composições providas neste documento. Os anticorpos podem incluir um local de ligação de antígeno que se liga a um epítopo na proteína LYST. Ligação de um anticorpo para LYST pode inibir ou reduzir a função da proteína LYST por meio de um ou mais mecanismos distintos.

[0066] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno liga-se especificamente a um epítopo no interior da proteína codificada pela sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2. O epítopo pode ser um epítopo linear e pode incluir um ou mais aminoácidos consecutivos da sequência primária de SEQ ID N°: 2. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste pode se ligar a um epítopo conformacional que inclui um recurso de superfície 3D, formato ou estrutura terciária da proteína LYST. Em algumas modalidades, um recurso de superfície 3D pode incluir qualquer número de aminoácidos a partir de SEQ ID N°: 2, ou os resíduos correspondentes em um homólogo, ortólogo, parálogo ou variante destes.

[0067] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que se liga especificamente a um epítopo no interior da proteína codificada pela sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2 só pode se ligar se a proteína codificada pela sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2 não está ligada por um ligante ou molécula pequena.

[0068] Vários tipos de anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser usados nas composições e métodos divulgados, incluindo imunoglobulina inteira de qualquer classe, e fragmentos desta e proteínas sintéticas contendo pelo menos o domínio variável de ligação de antígeno de um anticorpo. O anticorpo pode ser um anticorpo IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Um anticorpo pode estar na forma de um fragmento de ligação de antígeno incluindo um fragmento Fab, fragmento F(ab')2, uma região variável de cadeia única e similares. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais (mAb). Anticorpos monoclonais incluem anticorpos "quiméricos", em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, enquanto eles especificamente ligam o antígeno alvo e/ou exibem a atividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos divulgados também podem ser modificados por meios recombinantes, por exemplo, por exclusões, adições ou substituições de aminoácidos, para aumentar a eficácia do anticorpo ao mediar a função desejada. Substituições podem ser substituições conservadoras. Por exemplo, pelo menos um aminoácido na região constante do anticorpo pode ser substituído por um resíduo diferente (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.624.821; Patente U.S. N° 6.194.551; WO 9958572; e Angal, et al., Mol. Immunol. 30:105-08 (1993)). Em alguns casos, mudanças são feitas para reduzir atividades indesejadas, por exemplo, citotoxicidade dependente de complemento. O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico com especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos antigênicos diferentes. Em uma modalidade, os epítopos são do mesmo antígeno. Em outra modalidade, os epítopos são de dois antígenos diferentes. Anticorpos biespecíficos podem incluir fragmentos de anticorpo biespecíficos (ver, por exemplo, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 90:6444-48 (1993); Gruber, et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).

[0069] Uma variedade de anticorpos que se liga à proteína LYST humana é comercialmente disponível a partir de múltiplas fontes, por exemplo, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA, Cat. N° sc-136746). Anticorpos podem ser gerados por qualquer meio conhecido na técnica. Meios de descrições exemplares para a geração e produção de anticorpos incluem Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles And Practice (Academic Press, 1993); e Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, edição mais recente). Fragmentos de moléculas Ig intactas podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo a digestão enzimática e meios recombinantes.

ii. Ácidos Nucleicos Funcionais

[0070] Ácidos nucleicos funcionais que inibem a transcrição, tradução ou função dos produtos de gene LYST são divulgados. Ácidos nucleicos funcionais são moléculas de ácido nucleico que têm uma função específica, tal como a ligação de uma molécula alvo ou catalisação de uma reação específica. Como discutido mais detalhadamente abaixo, moléculas de ácido nucleico funcional podem ser divididas nas seguintes categorias não limitantes: moléculas anti-sentido, siRNA, miRNA, aptâmeros, ribozimas, moléculas de formação triplex, RNAi e sequências guia externas. As moléculas de ácido nucleico funcional podem agir como efetores, inibidores, moduladores e estimuladores de uma atividade específica possuída por uma molécula alvo ou as moléculas de ácido nucleico funcional podem possuir uma atividade independente de novo de quaisquer outras moléculas.

[0071] Moléculas de ácido nucleico funcional podem interagir com qualquer macromolécula, tal como cadeias de DNA, RNA, polipeptídeos ou carboidrato. Deste modo, ácidos nucleicos funcionais podem interagir com o mRNA ou o DNA genômico do polipeptídeo LYST ou eles podem interagir com o polipeptídeo LYST em si. Frequentemente, ácidos nucleicos funcionais são projetados para interagir com outros ácidos nucleicos, com base na homologia de sequência entre a molécula alvo e a molécula de ácido nucleico funcional. Em outras situações, o reconhecimento específico entre a molécula de ácido nucleico funcional e a molécula alvo não se baseia em homologia de sequência entre a molécula de ácido nucleico funcional e a molécula alvo, mas, em vez disso, baseia-se na formação da estrutura terciária que permite que o reconhecimento específico ocorra. Portanto, as composições divulgadas podem incluir um ou mais ácidos nucleicos funcionais projetados para reduzir a expressão ou função da proteína LYST.

[0072] Em algumas modalidades, a composição inclui um ácido nucleico ou polipeptídeo funcional projetado para visar e reduzir ou inibir a expressão ou a tradução de mRNA LYST; ou para reduzir ou inibir a expressão, reduzir a atividade ou aumentar a degradação de proteína LYST. Em algumas modalidades, a composição inclui um vetor adequado para expressão in vivo do ácido nucleico funcional.

[0073] Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou polipeptídeo funcional é projetado para visar um segmento do ácido nucleico codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2, ou o complemento deste ou variantes deste com uma sequência de ácido nucleico 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica a um ácido nucleico codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2.

[0074] Em outras modalidades, um ácido nucleico ou polipeptídeo funcional é projetado para visar um segmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID N°: 1, ou o complemento deste ou variantes deste com uma sequência de ácido nucleico pelo menos 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica à SEQ ID N°: 1.

[0075] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de função hibridiza para o ácido nucleico de SEQ ID N°: 1, ou um complemento deste, por exemplo, sob condições estritas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico de função hibridiza a uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID N°: 2, ou um complemento deste, por exemplo, sob condições estritas.

[0076] Métodos para fazer e usar vetores para expressão in vivo dos ácidos nucleicos funcionais divulgados, tais como oligonucleotídeos anti-sentido, siRNA, shRNA, miRNA, EGSs, ribozimas e aptâmeros são conhecidos na técnica.

iii. Moléculas Anti-sentido

[0077] Os ácidos nucleicos funcionais podem ser moléculas anti-sentido. Moléculas anti-sentido são projetadas para interagir com uma molécula de ácido nucleico alvo através do emparelhamento de base canônica ou não canônica. A interação da molécula anti-sentido e da molécula alvo é projetada para promover a destruição da molécula alvo através de, por exemplo, RNAse H mediada por degradação híbrida de RNA-DNA. Alternativamente, a molécula anti-sentido é projetada para interromper uma função de processamento que normalmente ocorreria na molécula alvo, tal como a transcrição ou replicação. Moléculas anti-sentido podem ser projetadas com base na sequência da molécula alvo. Há inúmeros métodos para a otimização da eficiência anti-sentido ao se encontrar as regiões mais acessíveis da molécula alvo. Métodos exemplares incluem experimentos de seleção in vitro e estudos de modificação de DNA usando DMS e DEPC. É preferencial que moléculas anti-sentido se liguem à molécula alvo LYST com uma constante de dissociação (Kd) inferior ou igual a 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12.

iv. Aptâmeros

[0078] Os ácidos nucleicos funcionais podem ser aptâmeros. Aptâmeros são moléculas que interagem com a molécula alvo, preferencialmente de forma específica. Normalmente, aptâmeros são pequenos ácidos nucleicos que variam de 15-50 bases de comprimento que dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas, tais como ciclo de grampo de cabelo (hairpin loop) ou quartetos G. Aptâmeros podem ligar moléculas pequenas, tais como ATP e teofilina, bem como grandes moléculas, tais como a transcriptase reversa e trombina. Aptâmeros podem se ligar muito firmemente com Kd's da molécula alvo inferiores a 10-12 M. É preferencial que o aptâmeros se liguem à molécula alvo LYST com um Kd inferior a 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12. Aptâmeros podem ligar a molécula alvo com um alto grau de especificidade. Por exemplo, aptâmeros que foram isolados têm diferença superior a 10.000 vezes em afinidades de ligação entre a molécula alvo e outra molécula que difere em apenas uma posição única na molécula. É preferencial que o aptâmero tenha um Kd com uma molécula LYST alvo de pelo menos 10, 100, 1000, 10.000 ou 100.000 vezes inferior do que o Kd com uma molécula de ligação de fundo. É preferencial ao fazer a comparação a uma molécula, tal como um polipeptídeo, que a molécula de fundo seja um polipeptídeo diferente.

v. i. Ribozimas

[0079] Os ácidos nucleicos funcionais podem ser ribozimas. Ribozimas são moléculas de ácido nucleico que são capazes de catalisar uma reação química, de forma intramolecular ou intermolecular. É preferencial que as ribozimas catalisem reações intermoleculares. Diferentes tipos de ribozimas que catalisam nuclease ou reações de tipo polimerase de ácido nucleico que se baseiam em ribozimas encontradas em sistemas naturais, tais como ribozimas de cabeça de martelo, são divulgados. Ribozimas que não são encontradas em sistemas naturais, mas que foram modificadas para catalisar reações específicas de novo também são divulgadas. Ribozimas preferenciais clivam substratos de RNA ou DNA, e mais preferencialmente clivam substratos de RNA. Ribozimas normalmente clivam substratos de ácido nucleico através de reconhecimento e ligação do substrato alvo com clivagem subsequente. Frequentemente, este reconhecimento baseia-se principalmente em interações de pares de base canônica ou não canônica. Esta propriedade torna ribozimas particularmente boas candidatas para visar clivagem específica de ácidos nucleicos em função do reconhecimento do substrato alvo ser baseado na sequência de substratos alvo.

vi. Oligonucleotídeos de Formação Triplex

[0080] Os ácidos nucleicos funcionais podem ser moléculas de oligonucleotídeo de formação triplex. Moléculas de ácido nucleico funcional de formação triplex são moléculas que podem interagir com ácido nucleico de filamento simples ou de filamento duplo. Quando moléculas triplex interagem com uma região alvo, uma estrutura chamada de triplex é formada na qual há três filamentos de DNA formando um complexo dependente tanto de pares de base Watson-Crick e Hoogsteen. Moléculas triplex são preferenciais porque elas podem ligar regiões alvo com alta afinidade e especificidade. É preferencial que as moléculas de formação triplex ligam a molécula alvo com um Kd inferior a 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12.

vii. Sequências Guia Externas

[0081] Os ácidos nucleicos funcionais podem ser sequências guia externas. Sequências guia externas (EGSs) são moléculas que se ligam a uma molécula de ácido nucleico alvo formando um complexo, que é reconhecido por RNase P, que então cliva a molécula alvo. EGSs podem ser projetadas para visar especificamente uma molécula de RNA de escolha. RNAse P auxilia no processamento de RNA de transferência (tRNA) no interior de uma célula. RNAse P bacteriana pode ser selecionada para clivar praticamente qualquer sequência de RNA ao se usar um EGS que faz com que RNA alvo:EGS complexa imite o substrato de tRNA natural. De forma similar, clivagem direcionada por EGS eucariótica/RNAse P de RNA pode ser utilizada para clivar alvos desejados no interior das células eucarióticas. Exemplos representativos de como fazer e usar moléculas EGS para facilitar a clivagem de uma variedade de moléculas alvo diferentes são conhecidos na técnica.

viii. RNA de Interferência

[0082] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos funcionais induzem silenciamento de gene através de interferência de RNA (siRNA). Expressão do gene LYST pode ser silenciada de forma eficaz de maneira altamente específica através da interferência de RNA.

[0083] Silenciamento de gene foi originalmente observado com a adição de RNA de filamento duplo (dsRNA) (Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51). Uma vez que dsRNA entra em uma célula, é clivado por uma enzima do tipo RNase III chamada Dicer, em RNAs de interferência pequenos de filamento duplo (siRNA) de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento que contêm 2 nucleotídeos salientes nas extremidades 3' (Elbashir, et al.,Genes Dev., 15:188-200 (2001); Bernstein, et al., Nature, 409:363-6 (2001); Hammond, et al., Nature, 404:293-6 (2000); Nykanen, et al., Cell, 107:309-21 (2001); Martinez, et al., Cell, 110:563-74 (2002)). O efeito de iRNA ou siRNA ou seu uso não está limitado a qualquer tipo de mecanismo.

[0084] Em uma modalidade, um siRNA desencadeia a degradação específica de moléculas de RNA LYST homólogas, tais como mRNAs LYST, no interior da região de identidade de sequência tanto entre o siRNA quanto o RNA LYST alvo.

[0085] Silenciamento de gene específico de sequência pode ser atingido em células de mamíferos usando RNAs de filamento duplo curto e sintéticos que imitam os siRNAs produzidos pelo dicer de enzima (Elbashir, et al., Nature, 411:494-498 (2001)) (Ui-Tei, et al., FEBS Lett, 479:79-82 (2000)).

[0086] siRNA pode ser sintetizado quimicamente ou in vitro ou pode ser o resultado de RNAs do tipo grampo de cabelo de filamento duplo curto (shRNAs) que são processados em siRNAs dentro da célula. Por exemplo, WO 02/44321 divulga siRNAs capazes de degradação de sequência específica de mRNAs alvo quando base emparelhada com extremidades salientes 3', incorporadas neste documento por referência para o método para fazer estes siRNAs. siRNAs sintéticos são, de modo geral, projetados usando algoritmos e um sintetizador de DNA/RNA convencional. Fornecedores incluem Ambion (Austin, Texas), ChemGenes (Ashland, Massachusetts), Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virginia), MWB Biotech (Esbersberg, Alemanha), Proligo (Boulder, Colorado) e Qiagen (Vento, Países Baixos). siRNA também pode ser sintetizado in vitro usando kits, tais como Kit de construção de siRNA SILENCER® a partir de Ambion. Em algumas modalidades, a composição inclui um vetor expressando o ácido nucleico funcional. A produção de siRNA a partir de um vetor é mais comumente feita através da transcrição de uma RNAse de grampo de cabelo curto (shRNAs). Kits para a produção de vetores incluindo shRNA estão disponíveis, tais como, por exemplo, Kits de construção GENESUPPRESSOR™ a partir de Imgenex e plasmídeo de RNAi induzível e vetores de lentivírus BLOCK-IT™ a partir de Invitrogen. Em algumas modalidades, o ácido nucleico funcional é siRNA, shRNA ou miRNA.

B. Excipientes, Veículos de Entrega e Dispositivos

[0087] Inibidores de LYST podem ser administrados e retomados nas células de um sujeito com ou sem o auxílio de um veículo de entrega. Veículos de entrega apropriados para os inibidores divulgados são conhecidos na técnica e podem ser selecionados de acordo com o inibidor particular. Em uma modalidade preferencial, o inibidor é entregue por injeção por via intravenosa, por via subcutânea, por via intraperitoneal ou por via local. Carreadores típicos são solução salina, solução salina tamponada de fosfato e outros carreadores injetáveis.

[0088] Formulações incluindo um ou mais inibidores de LYST com ou sem veículos de entrega são divulgadas. Os inibidores de LYST divulgados podem ser formulados em composições farmacêuticas incluindo um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Composições farmacêuticas podem ser formuladas para diferentes mecanismos de administração, de acordo com o inibidor e o uso pretendido. Composições farmacêuticas formuladas para administração por via de administração parenteral (injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutânea), tópica ou transdérmica (de forma passiva ou usando iontoforese ou eletroporação) ou usando inserções biodegradáveis são divulgadas.

1. Administração Parenteral

[0089] Em algumas modalidades, um ou mais inibidores de LYST e, opcionalmente, um veículo de entrega são formulados para administração em solução aquosa, por injeção parenteral. A formulação também pode estar na forma de uma suspensão ou emulsão. Em geral, composições farmacêuticas são providas incluindo quantidades eficazes de um agente ativo, fração de direcionamento e, opcionalmente, um veículo de entrega e, opcionalmente, incluem diluentes farmaceuticamente aceitos, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou carreadores. Tais composições podem incluir os diluentes água estéril, solução salina tamponada de vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iônica e, opcionalmente, aditivos, tais como detergentes e agentes solubilizantes (por exemplo, TWEEN® 20, TWEEN® 80, também referidos como polissorbato 20 ou 80), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio) e conservantes (por exemplo, Thimersol, álcool benzílico) e substâncias de volume (por exemplo, lactose, manitol). Exemplos de solventes ou veículos não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite de oliva e óleo de milho, gelatina e ésteres orgânicos injetáveis, tais como o oleato de etila. As formulações podem ser liofilizadas e dissolvidas/suspensas novamente imediatamente antes do uso. A formulação pode ser esterilizada por, por exemplo, filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ao incorporar agentes esterilizantes nas composições, ao irradiar as composições ou ao aquecer as composições.

2. Administração Pulmonar e Mucosal

[0090] Em modalidades adicionais, um ou mais inibidores de LYST e, opcionalmente, um veículo de entrega são formulados para administração à mucosa, tal como a mucosa bucal, ocular, nasal, oral (sublingual, bucal), vaginal ou retal.

[0091] Formulações para administração à mucosa serão normalmente partículas de fármaco secas por pulverização, as quais podem ser incorporadas em um comprimido, gel, cápsula, suspensão ou emulsão. Excipientes farmacêuticos padrão estão disponíveis a partir de qualquer formulador.

[0092] Em uma modalidade, os compostos são formulados para entrega pulmonar, tal como administração intranasal ou inalação oral. O trato respiratório é a estrutura envolvida na troca de gases entre a atmosfera e a corrente sanguínea. As vias aéreas superiores e inferiores são chamadas as vias aéreas condutoras. Os bronquíolos terminais se dividem em bronquíolos respiratórios, os quais, então, levam para a zona respiratória final, os alvéolos ou pulmão profundo. O pulmão profundo, ou alvéolos, é o principal alvo de aerossóis terapêuticos inalados para entrega sistêmica de fármaco. Agentes terapêuticos que são ativos nos pulmões podem ser administrados de forma sistêmica e visados por meio de absorção pulmonar. O termo aerossol, como usado neste documento, refere-se a qualquer preparação de uma fina névoa de partículas, a qual pode ser em solução ou uma suspensão, se ou não for produzida usando um propelente. Aerossóis podem ser produzidos usando técnicas padrão, tais como ultrassonicação ou tratamento de alta pressão.

[0093] Carreadores para formulações pulmonares podem ser divididos naqueles para formulações de pó seco e para a administração como soluções. Aerossóis para a entrega de agentes terapêuticos ao trato respiratório são conhecidos na técnica. Para a administração por meio do trato respiratório superior, a formulação pode ser formulada em uma solução, por exemplo, água ou solução salina isotônica, tamponada ou não tamponada ou como uma suspensão para a administração intranasal como gotas ou como um pulverizador. Preferencialmente, tais soluções ou suspensões são isotônicas em relação às secreções nasais e de cerca do mesmo pH, variando, por exemplo, de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 7,4 ou de pH 6,0 a pH 7,0. Tampões devem ser fisiologicamente compatíveis e incluem, simplesmente a título de exemplo, tampões de fosfato. Um versado na técnica pode facilmente determinar um teor de solução salina adequado e pH para uma solução aquosa inócua para administração nasal e/ou respiratória superior.

[0094] Composições podem ser entregues aos pulmões durante a inalação e atravessa por todo o revestimento epitelial do pulmão para a corrente sanguínea quando entregue ou como um aerossol ou partículas secas por pulverização com um diâmetro aerodinâmico inferior a cerca de 5 mícrons.

[0095] Formulações de pó seco ("DPFs") com tamanho de partícula grande têm características de fluidez melhoradas, tais como menos agregação, aerossolização mais fácil e potencialmente menos fagocitose. Aerossóis de pó seco para terapia de inalação são, de modo geral, produzidos com diâmetros médios principalmente na faixa inferior a 5 mícrons, embora uma faixa preferencial esteja entre um e dez mícrons de diâmetro aerodinâmico. Partículas de "transportador" grandes (que não contêm nenhum fármaco) foram co-entregues com aerossóis terapêuticos para auxiliar na obtenção de aerossolização eficiente entre outros possíveis benefícios. Formulações para entrega pulmonar incluem vesículas fosfolipídicas unilamelares, lipossomas ou partículas de lipoproteína. Formulações e métodos para fazer tais formulações contendo ácido nucleico são bem conhecidos por alguém com competência comum na técnica. Uma ampla faixa de dispositivos mecânicos projetados para entrega pulmonar de produtos terapêuticos pode ser usada, incluindo, mas não se limitando a, nebulizadores, inaladores de dose calibrada e inaladores de pó, dos quais todos são familiares àqueles versados na técnica.

3. Administração Tópica e Transdérmica

[0096] O agente ativo e o veículo de entrega opcional podem ser aplicados topicamente. Administração tópica pode incluir aplicação de forma direta à vasculatura ou aos tecidos ou próteses, por exemplo, durante a cirurgia, ou pela administração direta sobre a pele.

[0097] Formulações transdérmicas também podem ser preparadas. Estas serão, normalmente, pomadas, loções, pulverizadores ou emplastros, dos quais todos podem ser preparados usando tecnologia padrão. Formulações transdérmicas podem incluir intensificadores de penetração. Excipientes farmacêuticos padrão para administração tópica ou transdérmica estão disponíveis a partir de qualquer formulador.

4. Matrizes de Entrega Controlada

[0098] Dispositivos poliméricos de liberação controlada podem ser feitos para liberação em longo prazo de forma sistêmica após a implantação de um dispositivo polimérico (haste, cilindro, película, disco) ou injeção (micropartículas). A matriz pode estar na forma de micropartículas, tais como microesferas, em que inibidores de LYST são dispersos no interior de uma matriz polimérica sólida ou microcápsulas, em que o núcleo é de um material diferente do que a cobertura polimérica, e um ou mais inibidores de LYST são dispersos ou suspensos no núcleo, o qual pode ser líquido ou sólido na natureza. A menos que especificamente definido neste documento, micropartículas, microesferas e microcápsulas são usadas de forma permutável. Alternativamente, o polímero pode ser moldado como um placa fina ou película, variando de nanômetros a quatro centímetros, um pó produzido pela moagem ou outras técnicas padrão, ou mesmo um gel, tal como um hidrogel.

[0099] Matrizes não biodegradáveis ou biodegradáveis podem ser usadas para a entrega de inibidores de LYST divulgados, embora matrizes biodegradáveis sejam preferenciais. Estes podem ser polímeros naturais ou sintéticos, embora polímeros sintéticos sejam preferenciais devido a melhor caracterização de perfis de degradação e liberação. O polímero é selecionado com base no período durante o qual a liberação é desejada. Em alguns casos, liberação linear pode ser mais útil, embora, em outros, uma liberação de pulso ou "lançamento a granel" pode prover resultados mais eficazes. O polímero pode estar na forma de um hidrogel (normalmente na absorção até cerca de 90% em peso de água) e, opcionalmente, pode ser reticulado com íons multivalentes ou polímeros.

[00100] As matrizes podem ser formadas por evaporação de solvente, secagem por pulverização, extração de solvente e outros métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Microesferas biodegradáveis podem ser preparadas usando qualquer um dos métodos desenvolvidos para fazer microesferas para entrega de fármaco, por exemplo, como descrito por Mathiowitz e Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); e Mathiowitz, et al.,J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988). Os dispositivos podem ser formulados para liberação local para tratar a área de implantação ou injeção, que normalmente irá entregar uma dosagem que é muito menor do que a dosagem para o tratamento de um corpo inteiro. Os dispositivos também podem ser formulados para entrega local ou sistêmica.

[00101] Micro e nanopartículas projetadas para entregar carga, tais como fármacos e anticorpos para a vasculatura, para células de músculo liso vascular ou locais ou coágulos ou trombose são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Wickline, et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 26:435-441 (2006), publicado on-line (dezembro de 2005) e Pedido Publicado U.S. N° 2002/0168320, 2003/0086867,2003/0129136, 2004/0058951, 2004/0115192, 2006/0147380,2006/0239919, 2007/0140965, 2007/0202040, 2007/0258908,2008/0175792, 2008/0247943 e 2013/0064765.

[00102] Por exemplo, nanopartículas de perfluorocarbono, anteriormente consideradas como substitutas de sangue artificial, foram desenvolvidas em uma tecnologia de plataforma para representação gráfica molecular e entrega de fármaco alvo, ou seja, uma tecnologia chamada "teranóstica". Estas partículas encapsuladas com lipídios, que nominalmente são de 250 nm de diâmetro, podem ser administradas por via intravenosa e normalmente são restringidas pelo tamanho para a vasculatura intacta.

[00103] Em algumas modalidades, o veículo de entrega é uma lipossoma. Se o inibidor de LYST for um anticorpo, proteína ou molécula pequena, o veículo de entrega preferencial pode ser uma lipossoma. As lipossomas são divulgadas para a entrega dos inibidores de LYST divulgados diretamente a um certo tipo de célula, por exemplo, células de macrófagos. Células de macrófagos podem internalizar lipossomas, levando à entrega de um ou mais inibidores para os compartimentos intracelulares do macrófago. Métodos, materiais e lipídios adequados para fazer lipossomas são conhecidos na técnica. Veículos de entrega de lipossoma são comercialmente disponíveis a partir de múltiplas fontes. Lipossomas podem ser formadas a partir de uma única bicamada lipídica (ou seja, a lipossoma pode ser unilamelar) ou várias bicamadas lipídicas concêntricas (ou seja, a lipossoma pode ser multilamelar). A lipossoma pode ser formada a partir de um único lipídio; entretanto, em algumas modalidades, a lipossoma é formada a partir de uma combinação de mais de um lipídio. Os lipídios podem ser neutros, aniônicos ou catiônicos em pH fisiológico.

[00104] Lipídios neutros e aniônicos adequados incluem esteróis e lipídios, tais como colesterol, fosfolipídios, lisolipídios, lisofosfolipídios e esfingolipídios. Lipídios neutros e aniônicos incluem, mas não estão limitados a, fosfatidilcolina (PC) (tal como PC de ovo, PC de soja), incluindo 1,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas; fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol (PI); glicolipídios; esfingofosfolipídios, tais como esfingomielina, esfingoglicolipídios (também conhecidos como glicosídeos de 1-ceramidila), tais como galactopiranosídeo de ceramida, gangliosídeos e cerebrosídeos; ácidos graxos, esteróis que contém um grupo ácido carboxílico, tal como colesterol ou derivados destes; e 1,2-diacil-sn-glicero- 3-fosfoetanolaminas, incluindo 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina ou 1,2-dioleolilglicerila fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dihexadecilfosfoetanolamina (DHPE), 1,2-distearoilfosfatidilcolina (DSPC), 1,2-dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e 1,2-dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC).

[00105] Sais de trimetilamônio, também referidos como lipídios TAP, por exemplo, como um sal de metilsulfato. Lipídios TAP adequados incluem, mas não estão limitados a, DOTAP (dioleoil-), DMTAP (dimiristoil-), DPTAP (dipalmitoil-) e DSTAP (distearoil-). Outros lipídios catiônicos adequados incluem brometo de dimetildioctadecilamônio (DDAB), 1,2- diaciloxi-3-trimetilamônio propanos, N-[1-(2,3-dioloiloxi)propil]-N,N-dimetil amina (DODAP). Outros lipídios adequados incluem derivados peguilados dos lipídios neutros, aniônicos e catiônicos descritos acima. Incorporação de um ou mais derivados de lipídios peguilados pode resultar em uma lipossoma que exibe cadeias de polietilenoglicol em sua superfície. Os lipossomas resultantes podem possuir estabilidade aumentada e tempo de circulação in vivo em comparação a lipossomas que carecem de cadeias de PEG em suas superfícies.

[00106] Se o inibidor de LYST for um ácido nucleico ou vetor, o veículo de entrega pode ser um vetor viral, por exemplo, uma preparação disponível comercialmente, tais como um vetor de adenovírus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canadá). A entrega de vetor viral pode ser por meio de um sistema viral, tal como um sistema de vetor retroviral que pode embalar um genoma retroviral recombinante (ver, por exemplo, Pastan et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 85:4486; Miller et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895). O retrovírus recombinante pode, então, ser usado para infectar e, desse modo, entregar às células infectadas ácido nucleico codificando o inibidor de LYST. O método exato para introduzir o ácido nucleico alterado em células de mamíferos não é, certamente, limitado ao uso de vetores retrovirais. Outras técnicas são amplamente disponíveis para este procedimento, incluindo o uso de vetores adenovirais (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941-948 (1994)), vetores adenovirais associados (AAV) (Goodman et al., Blood 84:1492-1500 (1994)), vetores lentivirais (Naidini et al., Science 272:263-267 (1996)), vetores retrovirais pseudotipados (Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738747 (1996)).

[00107] Técnicas de transdução física também podem ser usadas, tais como entrega de lipossoma e mecanismos de endocitose mediada por receptor e outros mecanismos (ver, por exemplo, Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478 (1996)). Preparações de lipossoma disponíveis comercialmente, tais como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemanha) e TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wisconsin), bem como outras lipossomas desenvolvidas de acordo com os procedimentos padrão na técnica são bem conhecidas. Além disso, o ácido nucleico ou vetor divulgado pode ser entregue in vivo por eletroporação, a tecnologia para a qual está disponível a partir de Genetronics, Inc. (San Diego, Califórnia), bem como por meio de uma máquina de sonoporação ou sonicação (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona). As composições e os métodos divulgados podem ser usados em conjunto com qualquer um destes ou outros métodos de transferência de gene comumente usados.

5. Enxertos e Dispositivos Médicos

[00108] As composições divulgadas para imunomodulação por inibição de LYST podem ser revestidas sobre ou incorporadas em dispositivos médicos, ou podem ser usadas para pré-tratar enxertos vasculares implantáveis ex vivo.

Enxertos

[00109] Inibidores de LYST podem ser usados para pré-tratar enxertos vasculares ex vivo antes da implantação em um sujeito. Composições incluindo um ou mais inibidores de LYST e, opcionalmente, um veículo de entrega pode ser aplicados ao tecido por métodos para assegurar que eles adiram e sejam distribuídos por todo o tecido ou o enxerto em locais ideais para tratamento com fármaco. Em algumas modalidades, um ou mais inibidores de LYST são entregues usando nanopartículas, micropartículas, lipossomas, micelas, emulsões, géis ou revestimentos que se destinam a aderir às regiões de interesse, levar carga de fármaco suficiente para prover tratamento local por períodos prolongados, liberar os inibidores de LYST em uma taxa ou programação desejada, penetrar no tecido ou enxerto em uma medida ideal, ou uma combinação disso.

[00110] Enxertos para uso em cirurgia também podem ser formados por células inoculadoras ex-vivo sobre uma estrutura biodegradável. Os enxertos podem ser autólogos, por exemplo, veia safena ou artéria radial; autólogos preservados, por exemplo, veia criopreservada; alogênicos; xenogênicos; ou sintéticos, por exemplo, poliéster em tecido, poliuretano (LYCRA®), politetraflouroetileno (PTFE), GORE-TEX® ou tereftalato de polietileno (DACRON®). Homoenxertos arteriais usando artérias mamárias internas, radiais ou hipogástrica são exemplos de dutos vasculares úteis e duráveis. Enxertos exemplares são discutidos abaixo.

Enxerto Vascular de Engenharia de Tecido

[00111] Enxertos vasculares de engenharia de tecido (TEVG) incluindo um ou mais inibidores da LYST são divulgados. Enxertos vasculares de engenharia de tecido (TEVGs) são a grande promessa para o avanço no campo da cirurgia cardíaca congênita, em que sua capacidade de crescimento pode ser usada para o seu pleno potencial. Por exemplo, TEVGs podem ser projetados para uso como um duto vascular conectando a veia cava inferior à artéria pulmonar em pacientes submetidos à cirurgia de Fontan modificada. Em longo prazo (> 10 anos) os resultados de um estudo piloto avaliando o uso do TEVG em 25 pacientes com anomalias cardíacas de ventrículo único demonstraram nenhuma morte relacionada ao enxerto ou falhas de enxerto. Também confirmou a capacidade de crescimento do TEVG tornando-o o primeiro enxerto feito pelo homem com capacidade de crescimento. A principal complicação relacionada ao enxerto foi a estenose, afetando aproximadamente 30% dos pacientes com 16% (4/25) necessitando angioplastia para tratar a estenose crítica.

[00112] Em uma modalidade, um TEVG é formado a partir de uma estrutura tubular biodegradável fabricada a partir de um tubo de fibra de ácido poliglicólico. O tubo pode ser revestido com um copolímero, tal como uma proporção de 50:50 de ácido polilático (PLA) e de policaprolactona. A estrutura pode ser inoculada com células antes da implantação em um sujeito. Em algumas modalidades, as células são células autólogas do recipiente pretendido.

[00113] Estabeleceu-se que a excessiva infiltração de macrófagos para enxertos vasculares de engenharia de tecido (TEVGs) promoveu a cicatrização, resultando em espessamento de vaso, oclusão e estenose. Portanto, as composições e os métodos descritos neste documento podem ser usados para entregar um ou mais inibidores de LYST de forma local e de forma controlada a um TEVG para prevenir ou inibir a infiltração por macrófagos.

Enxerto de Desvio

[00114] Enxertos de desvio (bypass) incluindo um ou mais inibidores de LYST são divulgados. Uma forma comum de cirurgia de safena envolve a ressecção da veia safena da perna para autotransplante de artéria coronária. Em um número significativo de casos, estes enxertos falham, em grande parte, devido a reestenose causada por hiperplasia de neoíntima. As composições e os métodos descritos neste documento podem ser usados para entregar um ou mais inibidores de LYST de forma local e de forma controlada ao enxerto autólogo. O inibidor pode ser administrado antes da, no momento da e/ou imediatamente após a cirurgia. Após a ressecção da veia safena, o tecido pode ser (e é frequentemente) suspenso por horas em solução salina durante a abertura do peito e preparação para implantação de enxerto. Composições incluindo um ou mais inibidores de LYST e um sinal de direcionamento opcional, veículo de entrega ou combinação destes podem ser incubados com a veia safena durante este período de tempo.

Enxerto Arteriovenoso

[00115] Enxertos arteriovenosos incluindo um ou mais inibidores de LYST são divulgados. Doença renal de estágio final é crescente nos Estados Unidos. Morbidade de acesso de hemodiálise continua sendo uma questão de qualidade de vida principal para pacientes; também representa um custo significativo para a sociedade. Uma fístula arteriovenosa nativa (AVF) continua sendo o duto de escolha para prover acesso para hemodiálise e provê resultados superiores quando comparado com outras opções, tais como uma AVG protética. Infelizmente, cada indivíduo é limitado no número de AVF nativa que pode ser criado devido ao número limitado de locais e vasos adequados. Locais de acesso são limitados conforme pacientes com doença renal de estágio final geralmente têm comorbidade grave, exigindo extensa punção venosa para diagnóstico e terapia para a vida. Em pacientes que esgotaram todas as opções para AVF primária, novos locais de acesso devem usar enxertos AV. Estes enxertos são suscetíveis à reestenose por hiperplasia de neoíntima limitando a sua eficácia. Incubação de uma composição incluindo um ou mais inibidores de LYST e, opcionalmente, incluindo um sinal de direcionamento, um veículo de entrega ou uma combinação destes sobre o enxerto pode ser feita no momento da cirurgia.

Dispositivos Médicos

[00116] Em algumas modalidades, uma composição, incluindo um ou mais inibidores de LYST é revestida sobre, ou incorporada em, um dispositivo médico ou componente deste (tais como em reservatórios poliméricos em stents vasculares) para reduzir ou inibir distúrbios de proliferação vascular, tais como formação de neoíntima em um sujeito. O dispositivo pode ser um dispositivo que é inserido no sujeito de forma transitória ou um dispositivo que é implantado permanentemente. Em algumas modalidades, o dispositivo é um dispositivo cirúrgico.

[00117] Exemplos de dispositivos médicos incluem, mas não estão limitados a, agulhas, cânulas, cateteres, shunts, balões e implantes, tais como stents e válvulas.

[00118] Em algumas modalidades, o inibidor de LYST ou a composição farmacêutica pode ser formulada para permitir sua incorporação no dispositivo médico, o qual pode aplicar o inibidor diretamente ao local para prevenir ou tratar condições, tais como reestenose ou outros distúrbios de proliferação vascular. O inibidor de LYST ou a composição farmacêutica deste pode ser formulada ao se incluir no interior de um revestimento sobre o dispositivo médico. Há vários revestimentos que podem ser utilizados, tais como, por exemplo, revestimentos de polímero que podem liberar o inibidor durante um período de tempo prescrito. O inibidor, ou uma composição farmacêutica deste, pode ser incorporado diretamente no interior do dispositivo médico. Em algumas modalidades, o inibidor de LYST é revestido sobre ou no interior do dispositivo em um veículo de entrega, tal como uma micropartícula ou lipossoma que facilita a sua liberação e entrega.

Stents

[00119] Em algumas modalidades, o dispositivo médico é um implante vascular, tal como um stent. Stents são utilizados na medicina para prevenir ou eliminar restrições vasculares. Stents podem ser inseridos em um vaso restrito de modo que o vaso restrito seja ampliado. A experiência com tais implantes vasculares indica que o crescimento excessivo das células adjacentes resulta, novamente, em uma restrição do vaso particularmente nas extremidades dos implantes que resulta em reduzida eficácia dos implantes. Se um stent é inserido em uma artéria humana para a eliminação de uma estenose aterosclerótica, hiperplasia da íntima pode ocorrer dentro de um ano nas extremidades do implante vascular e resulta em estenose renovada.

[00120] Por conseguinte, em algumas modalidades, os stents são revestidos ou carregados com uma composição incluindo um inibidor de LYST e, opcionalmente, um veículo de entrega.

[00121] Muitos stents são disponíveis comercialmente ou, de outra forma, conhecidos na técnica. Stents podem ser formados, ou seja, decapados ou cortados, a partir de um tubo fino de material adequado, ou a partir de uma placa fina de material adequado e enrolado em um tubo.

[00122] Materiais adequados para o stent incluem, mas não estão limitados a, aço inoxidável, irídio, platina, ouro, tungstênio, tântalo, paládio, prata, nióbio, zircônio, alumínio, cobre, índio, rutênio, molibdênio, nióbio, estanho, cobalto, níquel, zinco, ferro, gálio, manganês, cromo, titânio, alumínio, vanádio e carbono, bem como combinações, ligas e/ou laminações destes. Por exemplo, o stent pode ser formado a partir de uma liga de cobalto, tal como L605 ou MP35N®, Nitinol (liga de memória de formato de níquel-titânio), ABI (liga de paládio-prata), Elgiloy® (liga de cobalto-cromo-níquel) etc. Também se contempla que o stent pode ser formado a partir de dois ou mais materiais que são laminados juntos, tais como tântalo que é laminado com MP35N®. Os stents também podem ser formados a partir de fios com camadas concêntricas de diferentes metais, ligas ou outros materiais. Modalidades do stent também podem ser formadas a partir de tubos ocos ou tubos que foram preenchidos com outros materiais. Os materiais e laminações mencionados acima se destinam a ser exemplos e não se destinam a ser limitantes de forma alguma.

[00123] Stents podem ser stents de eluição de fármaco. Vários stents de eluição que entregam simultaneamente uma substância terapêutica ao local de tratamento ao prover suporte radial artificial para o tecido de parede são conhecidos na técnica. Dispositivos endo-luminais incluindo stents podem ser revestidos em suas superfícies externas com uma substância, tal como um agente de liberação de fármaco, fator de crescimento, anticorpos ou similares. Stents também foram desenvolvidos com uma estrutura tubular oca com orifícios ou portas que cortam a parede lateral para permitir que eluição de fármaco de um lúmen central. Embora a natureza oca do stent permita que o lúmen central seja carregado com uma solução de fármaco que é entregue por meio das portas ou orifícios na parede lateral do stent, a estrutura tubular oca pode não ter resistência mecânica adequada para prover estruturação adequada no vaso.

[00124] Stents que eluem inibidores de LYST são divulgados. Em algumas modalidades, os dispositivos também são revestidos ou impregnados com um inibidor de LYST e um ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo, mas não limitados a, agentes antiplaquetários, agentes anticoagulantes, agentes antimicrobianos e agentes antimetabólitos.

[00125] Stents exemplares que podem ser usados com as composições e métodos divulgados neste documento incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos na Patente U.S. N° 5.891.108, 6.918.929, 6.923.828, 6.945.992, 6.986.785, 7.060.090, 7.144.419, 7.163.555, 7.323.008, 7.651.527, 7.655.034, 7.678.141, 7.744.645, 7.942.917, 8.001.925, 8.001.925, 8.034.099, 8.048.149, 8.066.760, 8.100.960, 8.157.855, 8.172.893, 8.182.524, 8.187.284, 8.187.322, 8.197.528, 8.206.432, 8.221.490, 8.231.669, 8.236.044, 8.252.048, 8.252.065, 8.257.425, 8.257.431, 8.292.945, 8.298.278, 8.298.280, 8.348.991, 8.348.992, 8.348.993, 8.353.952, 8.359.998, 8.361.140, 8.372.134, 8.372.138, 8.377.112, 8.388.676, 8.398.695, 8.414.637,8.414.639 e 8.414.656.

Biopróteses

[00126] Vários outros dispositivos protéticos podem incluir um ou mais inibidores de LYST, incluindo, mas não limitado a, válvulas cardíacas, juntas artificiais, marca-passos, cateteres interiores e implantes cosméticos.

[00127] Acredita-se que os inibidores de LYST divulgados podem reduzir ou prevenir respostas inflamatórias e distúrbios fibroproliferativos associados com a presença de uma bioprótese. Por conseguinte, em algumas modalidades, as biopróteses são revestidas ou carregadas com uma composição incluindo um inibidor de LYST e, opcionalmente, um veículo de entrega.

IV. Métodos de Uso

[00128] Métodos para usar os inibidores de LYST divulgados são providos. Os métodos podem incluir administrar a um sujeito uma quantidade eficaz de uma composição incluindo um ou mais inibidores de LYST para prevenir, reduzir ou inibir a expressão ou função de LYST no sujeito; pré-tratar um dispositivo médico ou enxerto vascular com uma quantidade eficaz de uma composição incluindo um inibidor de LYST para prevenir, reduzir ou inibir a formação de neoíntima após a inserção ou a implantação do dispositivo ou enxerto no sujeito; ou uma combinação destes.

A. Distúrbios e Doenças a serem Tratados

[00129] Inibidores de LYST podem ser usados para alterar as funções imune, incluindo, mas não limitadas a, função de macrófago, plaqueta e célula exterminadora natural, criando um ambiente imune pró- regenerativo. Métodos para usar inibidores de LYST incluindo, mas não limitados a, métodos projetados para inibir ou bloquear a transcrição, tradução ou função da proteína LYST podem ser usados para modular a resposta imune. Em algumas modalidades, os métodos promovem a formação de novo tecido vascular, inibem a formação de neoíntima e melhorar a desobstrução vascular, por exemplo, após a cirurgia vascular. Métodos para usar inibidores de LYST para prevenir a hiperplasia da íntima e de neoíntima tanto em dutos vasculares biológicos quanto sintéticos são providos. Os métodos podem reduzir ou prevenir estenose de TEVG e melhorar a função de TEVG.

[00130] Além disso, inibidores de LYST podem ter implicações mais amplas para promover a regeneração de tecidos, melhorando a cura de feridas e modulando a resposta de corpo estranho. Deste modo, também são descritos métodos para usar inibidores de LYST como um adjuvante para aplicações de medicina regenerativa. Em algumas modalidades, os métodos para usar inibidores de LYST podem promover a cura e prevenir a formação de cicatriz, por exemplo, promover a cura e prevenir aderências após a cirurgia abdominal.

[00131] Os métodos podem modular a quantidade de Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) produzido como resultado de lesão de tecido. Portanto, os métodos podem tratar doenças associadas com a expressão excessiva ou indesejável de PDGF.

[00132] Os métodos também podem prevenir ou tratar doenças resultantes de fibrose excessiva, por exemplo, doenças fibróticas do fígado, pulmão ou coração. Finalmente, os métodos de terapia de anti-LYST podem resultar em imunomodulação que altera a reação de corpo estranho e promove a integração, mas bloqueia o encapsulamento de biopróteses, deste modo, melhorando a função e longevidade de dispositivos, tais como marca-passo ou estimuladores de nervo, ou integração de válvulas cardíacas de substituição ou juntas artificiais.

[00133] Em modalidades preferenciais, um ou mais inibidores de LYST são eficazes para reduzir, inibir ou atrasar um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição em um sujeito. Os inibidores de LYST divulgados tem uma ampla variedade de usos terapêuticos e profiláticos, por exemplo, eles podem ser usados para tratar ou prevenir distúrbios vasculares proliferativos após a lesão ou vários procedimentos cirúrgicos, cicatrizes e doenças fibróticas. Métodos para usar um ou mais inibidores de LYST para tratar uma doença caracterizada pela presença de cicatriz excessiva ou tecido fibrótico são descritos. Métodos para usar um ou mais inibidores de LYST para terapia antiplaquetária, por exemplo, para tratar doenças resultantes a partir de atividade de plaquetas aberrante, excessiva ou, de outra forma, indesejável ou sinalização de PDGF também são providos.

Distúrbios Proliferativos Vasculares

[00134] Em algumas modalidades, os inibidores de LYST divulgados podem ser usados para tratar ou prevenir distúrbios proliferativos vasculares. Exemplos de tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a, proliferação vascular envolvida em aterosclerose, proliferação vascular após a implantação de dispositivo intravascular, proliferação vascular no local da anastomose vascular como, de modo geral, ocorre após o procedimento de revascularização ou shunt A-V, proliferação vascular após endarterectomia de carótida e vasculopatia de transplante.

[00135] Métodos para tratar ou prevenir distúrbios proliferativos vasculares pela administração de um ou mais inibidores de LYST são providos. Os métodos normalmente reduzem ou inibem a infiltração de células de macrófagos, ou a conversão de células de macrófagos de fenótipo M1 a M2, ou ambos, em comparação a um controle. Em algumas modalidades, os métodos reduzem ou inibem a proliferação de células de macrófagos sem reduzir ou inibir o desenvolvimento de novo tecido vascular. Um sujeito pode ter estenose, reestenose ou outros distúrbios de proliferação vascular ou ser identificado como correndo o risco para reestenose ou outros distúrbios de proliferação vascular, por exemplo, sujeitos tenham se submeteram, estão se submetendo ou irão se submeter a um trauma vascular, angioplastia, cirurgia ou arteriopatia de transplante etc. Doenças, distúrbios e condições que podem ser tratadas usando as composições divulgadas são discutidas mais detalhadamente abaixo.

Lesão Vascular

[00136] Em algumas modalidades, um ou mais inibidores de LYST podem ser aplicados antes, no momento ou após um trauma vascular.

[00137] Lesão vascular desencadeia uma cascata de eventos que inclui o desnudamento ou disfunção endotelial, inflamação, bem como ativação e proliferação de células de músculo liso vascular (VSMC). Múltiplos fatores de crescimento e citocinas são liberados por células endoteliais disfuncionais, células inflamatórias, plaquetas e VSMCs. Estes fatores de crescimento e citocinas mediam quimioatração, migração celular, proliferação, apoptose e modulação de matriz e estão implicados em um número de distúrbios proliferativos vasculares.

[00138] Doenças e distúrbios proliferativos vasculares podem ser iniciados por lesão mecânica, bioquímica ou imunológica às paredes de vasos sanguíneos. Trauma vascular típico inclui aqueles associados tanto com lesões contusas quanto penetrantes incluindo, mas não limitadas a, lacerações, perfurações, lesões por esmagamento, ferimentos de bala, facadas, lesões ocupacionais, quedas e acidentes com veículos motorizados, bem como intervenções médicas, tais como cirurgia ou angioplastia.

[00139] Em algumas modalidades, o sujeito se submeteu, está se submetendo ou irá se submeter a uma cirurgia. Cirurgias podem incluir cirurgia invasiva, minimamente invasiva ou percutânea. Por exemplo, em algumas modalidades, o sujeito está fazendo uma cirurgia para tratar ou reparar aneurisma da aorta abdominal, estenose de carótida, veias varicosas, doença oclusiva arterial periférica, isquemia aguda dos membros ou dissecção da aorta. Cirurgias vasculares comuns incluem, mas não estão limitadas a, reparo de aneurisma da aorta abdominal aberto, reparo de aneurisma endovascular (EVAR), endarterectomia de carótida, colocação de stent de carótida, remoção de veia, escleroterapia e escleroterapia com espuma, tratamento a laser endovenoso, ablação de veia com radiofrequência, flebectomia ambulatorial, angioplastia com/sem colocação de stent, endarterectomia e aterectomia de cirurgia de safena, embolectomia com balão, trombectomia, cirurgia de safena, reparo aberto, reparo de aneurisma endovascular torácico (TEVAR). Um cirurgião pode aplicar um ou mais inibidores de LYST ao local cirúrgico no momento da cirurgia, antes da cirurgia ou após a cirurgia, para intensificar o processo de cura de feridas, ou prevenir o desenvolvimento de distúrbios proliferativos vasculares, tais como aqueles que dão origem à estenose ou reestenose.

Hiperplasia da Íntima

[00140] Hiperplasia da íntima é uma resposta de cura fisiológica para a lesão do endotélio de vasos sanguíneos. Lesão à camada endotelial desencadeia uma série de respostas inflamatórias agudas e crônicas que desencadeiam a agregação de plaquetas, a deposição de fibrina e atrai leucócitos para a área (Murakami, et al., Am J Physiol., 272:L197-L202 (1997); Cotran, et al., J Am Soc Nephrol., 1:225-235 (1990)). Deste modo, processos regenerativos que dão origem à formação de novo vaso e hiperplasia da íntima parecem ser fenômenos imunomediados, similares ao papel proposto por monócitos-macrófagos em outros processos biológicos vasculares humanos, tais como a adaptação do enxerto de veia (Ratliff e Myles, Arch. Pathol. Lab. Med. 113:772-776 (1989); Motwani e Topol,Circulation 97:916-931 (1998)).

Estenose

[00141] Hiperplasia da íntima pode levar ao espessamento da túnica íntima de um vaso sanguíneo, levando a uma complicação de estenose do vaso sanguíneo. Pensa-se que a ativação de mecanismos inflamatórios e pró-coagulantes contribui significativamente para a iniciação e o desenvolvimento de estenose. Durante um período de tempo que varia de algumas semanas a meses, células de músculo liso da região medial de um vaso sanguíneo lesionado se transferem para a região da íntima. Estas células proliferam e depositam matriz extracelular para formar uma nova íntima no local da lesão em um processo análogo à formação de cicatriz (Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86:8412 (1989); Clowes, et al., Circ. Res., 56:139-145 (1985)). Deste modo, uma resposta de cura robusta leva a um espessamento interno da parede do vaso (hiperplasia da íntima) e eventualmente reduz o lúmen do vaso, causando estenose. A formação de hiperplasia da íntima pode ser acelerada pela presença de materiais estranhos, tais como prótese no interior do vaso e pode resultar da intervenção endovascular incluindo angioplastia, safena e arteriopatia de transplante etc. (Glagov, Circulation, 89:2888-2891 (1994)).

[00142] Portanto, métodos para usar os inibidores de LYST divulgados que previnem hiperplasia da íntima e estenose são providos.

Reestenose

[00143] Métodos para prevenir ou reduzir reestenose da vasculatura coronária ou o sistema circulatório periférico são providos. Reestenose de vasos sanguíneos é, de modo geral, devido à hiperplasia da íntima. Um dispositivo cirúrgico, tal como um stent, pode ser inserido para abrir o vaso com estenose, entretanto, isto também é problemático em função de o stent em si poder estimular, adicionalmente, a hiperplasia da íntima. Além disso, tecido da íntima hiperplásica pode crescer através dos interstícios de um stent convencional e reestenose do vaso. Enquanto stents cobertos podem prevenir que isto aconteça, hiperplasia da íntima pode ainda ocorrer nas extremidades do stent onde há mais irritação da parede de vaso. Pacientes com reestenose no stent correm o risco de complicações sérias, como estenose a partir de hiperplasia da íntima, são frequentemente difíceis de tratar. Ao contrário de placas de ateroma macias, estas estenoses são firmes e exigem pressões de alta inflação prolongada para dilatar com um balão. As estenoses frequentemente recorrem e dilatação repetida do vaso leva à lesão da íntima repetida e perpetua a resposta de cura da íntima.

[00144] Por conseguinte, as composições, dispositivos ou enxertos divulgados podem ser administrados a um sujeito para reduzir ou inibir a proliferação de célula de músculo liso, migração e uma combinação disso em uma quantidade eficaz para reduzir ou inibir a formação de neoíntima e, desse modo, tratar ou prevenir reestenose e outros distúrbios de proliferação vascular no sujeito. Em algumas modalidades, a desobstrução dos enxertos e dispositivos pode ser aumentada usando uma composição contendo um inibidor de LYST. Portanto, são providos métodos para administrar uma composição contendo um inibidor de LYST a dispositivos e enxertos ou ao sujeito antes ou depois da implantação.

Aterosclerose

[00145] Aterosclerose envolve múltiplos processos, incluindo inflamação, proliferação vascular e alteração de matriz (revisto em Dzau, et al., Nat Med., 8(11) (2002)). Na aterosclerose, VSMC dá origem à inflamação, à retenção de lipoproteínas do sangue, bem como o desenvolvimento de um depósito fibroso que constituem uma placa. Mostrou-se que a inflamação media todos os estágios de aterosclerose: no desenvolvimento de uma placa de ateroma, VSMCs produzem mediadores pró-inflamatórios, tais como proteínas quimioatraentes de monócito e sintetizam moléculas de matriz que dão origem à retenção de lipoproteínas do sangue; e, após o desenvolvimento de uma placa, meio inflamatório local pode induzir a expressão de colagenase e inibir a expressão de inibidores proteolíticos, tornando a tampa fibrosa fraca e suscetível à ruptura. Portanto, em algumas modalidades, os inibidores de LYST divulgados são usados para tratar, reduzir, inibir ou prevenir distúrbios de proliferação vascular em um sujeito.

Angioplastia

[00146] Em algumas modalidades, o sujeito se submeteu, está se submetendo ou irá se submeter a angioplastia. Angioplastia é a técnica para ampliar de forma mecânica artérias estreitadas ou obstruídas, tais como aquelas obstruídas como resultado de aterosclerose. Em geral, angioplastia inclui inserir na vasculatura do sujeito um balão vazio e fechado em um fio guia, conhecido como um cateter balão, o qual é passado nos locais estreitados e então inflado a um tamanho fixo. O balão força a expansão das células sanguíneas brancas internas/ depósitos de placa de coágulo e a parede muscular circundante, abrindo o vaso sanguíneo para fluxo melhorado, e o balão é, então, desinflado e retirado. Um stent pode ou não ser inserido no momento da distensão para assegurar que o vaso permaneça aberto. Angioplastia inclui angioplastia periférica (ou seja, vasos sanguíneos fora das artérias coronárias, tais como no abdômen ou pernas), angioplastia coronária, angioplastia de artéria renal, angioplastia da carótida e angioplastia das artérias cerebrais.

[00147] Em algumas modalidades, o sujeito se submeteu, está se submetendo ou irá se submeter à angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA). O uso de PTCA reduziu muito o número de mortes em pacientes que sofrem infarto do miocárdio (Fischman, et al., N Engl J Med., 331:496-501 (1994); Elezi, et al., Circulation 98:1875-1880 (1998); Bennett e O'Sullivan, Pharmacol Ther., 91:149-166 (2001)). Durante a PTCA, as paredes das artérias são expandidas em várias vezes o seu diâmetro original em uma tentativa de aumentar o diâmetro do lúmen e melhorar o fluxo. Infelizmente, esta técnica é marcada por uma alta incidência de reestreitamento de vaso ou reestenose, ocorrendo em 30-40% dos pacientes dentro de 6 meses do procedimento (Anderson et al., J Interv. Cardiol., 6:187-202 (1993); Fischman et al., N Engl J Med, 331:496-501 (1994); Elezi et al., Circulation 98:1875-1880 (1998); Bennett e O'Sullivan, Pharmacol Ther, 91:149-166 (2001); Heckenkamp et al., J Cardiovasc. Surg. (Torino), 43:349-357 (2002)).

[00148] A prevenção de reestenose após PTCA bem sucedida permanece uma das tarefas mais desafiadoras no tratamento da doença arterial coronariana obstrutiva. As tentativas de melhorar esta resposta proliferativa envolve o uso de stents coronários, os quais melhoraram significativamente os resultados tanto em curto prazo quanto em longo prazo após procedimentos de revascularização coronária. Apesar de uma redução na taxa de reestenose com implantação de stent, reestenose ainda ocorre em 15-30% dos pacientes dentro de 6 meses (Fischman et al., N Engl J Med, 331:496-501 (1994); Elezi et al., Circulation, 98:1875-1880 (1998)). Espera-se que essa incidência de reestenose no stent aumenta à medida que colocação de stent coronário está se tornando mais frequente e é usada em lesões menos ideais. Os inibidores de LYST divulgados podem ser usados para tratar ou prevenir a reestenose, aderências abdominais e cicatriz após angioplastia.

Arteriopatia de Transplante

[00149] Em algumas modalidades, o sujeito se submeteu, está se submetendo ou irá se submeter a um transplante. Arteriopatia crônica de transplante (CTA) é um causa principal de perda de aloenxerto tardia após transplante de coração ou de rim (Taylor, et al., J. Heart Lung Transplant., 24:945-955 (2005), Burke, et al., Transplantation, 60:1413-1417 (1995); Cornell e Colvin, Curr. Opin. Nephrol Hypertens., 14:229-234 (2005)).Portanto, em algumas modalidades, os inibidores de LYST divulgados são usados para reduzir, inibir ou prevenir arteriopatia de transplante em um receptor de transplante.

Cicatriz Excessiva

[00150] Os inibidores de LYST divulgados podem ser usados para tratar, retardar ou prevenir cicatriz, incluindo a formação de queloides e aderências abdominais, por exemplo, após lesão, doença ou procedimentos cirúrgicos.

[00151] São providos métodos para usar um ou mais inibidores de LYST para diminuir a quantidade de crescimento de vaso sanguíneo no local de uma lesão ou cirurgia. Em algumas modalidades, os métodos previnem ou diminuem a formação de alta densidade celular e tecido conjuntivo que dão origem a cicatrizes, queloides ou aderências. Preferencialmente, a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a cura de feridas.

Cicatriz Hipertrófica

[00152] Em algumas modalidades, os inibidores de LYST divulgados são usados para tratar, reduzir, inibir ou prevenir o desenvolvimento de cicatrizes hipertróficas. Cicatriz excessiva pode ocorrer quando a resposta de tecido está fora da proporção com a quantidade de tecido de cicatriz necessária para reparo normal e cura. Quando uma ferida profunda envolve uma perda significativa da derme, tecido de cicatriz hipertrófica pode ser depositado no local da ferida. O tecido de cicatriz contém uma alta densidade de células, volume aumentado de tecido conjuntivo e um fornecimento vascular aumentado resultante do número de vasos sanguíneos aumentado. Cicatrizes hipertróficas podem ocorrer como resultado de defeitos na fase de remodelação de reparo de tecido (Ehrlich e Kelley, Plast Reconstr Surg., 90:993-998 (1992)).

[00153] Os inibidores de LYST divulgados podem ser usados para diminuir ou prevenir o desenvolvimento dos vasos sanguíneos na área de uma ferida para reduzir, retardar ou prevenir o desenvolvimento de cicatriz hipertrófica.

Queloides

[00154] Em algumas modalidades, os inibidores de LYST divulgados são usados para tratar, reduzir, inibir ou prevenir o desenvolvimento de cicatrizes queloides. Uma cicatriz queloide é uma cicatriz aumentada ou espessada que excede o limite da lesão e pode continuar a desenvolver e ampliar durante um período de tempo prolongado. Durante o desenvolvimento de um crescimento de queloide, colágeno, usado no reparo de ferida cresce demais produzindo uma protuberância muitas vezes maior do que aquela da cicatriz original.

[00155] Inibidores de LYST podem ser usados para prevenir o desenvolvimento de queloide associado com lesões de pele, por exemplo, perfuração de orelha, laceração, queimaduras, vacinação ou processos inflamatórios. Inibidores de LYST podem ser aplicados de forma local ou tópica, conforme necessário.

Aderências

[00156] As aderências são bandas fibrosas que se formam entre os tecidos e órgãos, frequentemente como resultado de lesão durante a cirurgia. Elas podem ser consideradas como tecidos de cicatriz interna que conectam os tecidos normalmente não conectados, geralmente através de um espaço virtual, tal como a cavidade peritoneal. Após cirurgia abdominal ou trauma, a produção ou a atividade de enzimas fibrinolíticas pode ser comprometida por causa de lesão e aderência fibrinosa se desenvolve. Se permitir que isso aconteça, células de reparo de tecido, tais como macrófagos, fibroblastos e outras células do vaso sanguíneo penetraram a aderência fibrinosa para depositar colágeno e outras substâncias de matriz para formar uma aderência fibrosa permanente.

[00157] Aderências exemplares que podem ser tratadas, reduzidas ou prevenidas pelos inibidores de LYST divulgados incluem aderências abdominais, aderências pélvicas, incluindo aderências pélvicas que resultam de endometriose, aderências pericárdicas, aderências peridurais e aderências peritendinosas. Sintomas de aderências podem incluir dor abdominal, bloqueios, dor pélvica crônica, câimbras, náuseas, flexibilidade limitada e inflamação ou inchaço no local da aderência.

Outras Doenças Fibroproliferativas

[00158] Em algumas modalidades, um ou mais inibidores de LYST podem ser aplicados para tratar uma doença fibroproliferativa.

[00159] Fibrose é a deposição de excesso de tecido conjuntivo fibroso em um órgão ou tecido em resposta à inflamação e/ou ao dano (Wynn, Nat Rev Immunol., 4(8): 583-594 (2004)). O reparo de tecidos danificados envolve a produção de componentes de matriz extracelular no local da lesão de tecido. Macrófagos e tecidos danificados liberam citocinas e TGF beta, os quais estimulam as células a fixar tecido conjuntivo, incluindo colágeno e glicosaminoglicanos. Entretanto, desregulação deste processo pode levar à deposição excessiva deste tecido conjuntivo, que pode destruir a estrutura e a função de órgãos subjacentes, levando à patologia de doença fibrótica. Fibrose pode ocorrer em muitos tecidos dentro do corpo, incluindo o fígado, pulmões, coração e rim. Métodos são providos para tratar fibrose e distúrbios fibroproliferativos em órgão principal.

Cirrose Hepática

[00160] Fibrose do fígado leva a danos no fígado à medida que hepatócitos são substituídos por tecido de cicatriz não funcional em um processo conhecido como cirrose (Masuoka, et al. Ann NY Acad. Sci., 1281:106-122 (2013)). Fibrose hepática e a cirrose resultante representam a via comum final de praticamente todas as doenças hepáticas crônicas e podem levar à insuficiência hepática, câncer de fígado e morte relacionada ao fígado. Cirrose hepática ocorre à medida que tecido de cicatriz substitui o parênquima normal. Após lesão hepática aguda (por exemplo, hepatite viral), células parenquimatosas regeneram e substituem células necróticas ou apoptóticas em um processo associado com uma resposta inflamatória. Se a lesão hepática persistir, o processo de regeneração hepática eventualmente falha e hepatócitos são substituídos por abundante matriz extracelular, incluindo colágeno fibrilar. Fibrose avançada é caracterizada por um acúmulo de proteínas de matriz extracelular ricas em colágenos fibrilares (predominantemente colágeno I e colágeno III) (revisto em Iredale, J Clin Invest., 117 (3):529-548 (2007); Bataller e Brenner, J Clin Invest, 115(2):209-218 (2005)). Células inflamatórias que ativam as células estreladas hepáticas (HSC) a secretar colágeno são um fator importante em doenças hepáticas fibróticas. Crescentes números de monócitos foram associados com a progressão da doença, especificamente com a progressão da doença não cirrótica a cirrótica.

[00161] Métodos são providos para tratar fibrose hepática em um sujeito, incluindo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um ou mais inibidores de LYST para reduzir, diminuir, limitar ou prevenir um ou mais sintomas de doença hepática em relação a um sujeito de controle não tratado. Os sintomas típicos de doenças hepática incluem, mas não estão limitados a, aumento da massa abdominal, fadiga, dor abdominal, caquexia, icterícia, síndromes obstrutivas, incluindo linfadema e acúmulo de ascite, anemia e dor nas costas (Sun, et al., Clin J. Oncol. Nurs., 12:759-766 (2008)). Em algumas modalidades, um ou mais inibidores de LYST melhoram a função hepática, reduzem a inflamação, reduzem a fibrose ou uma combinação disso em um sujeito com doença hepática em relação a um sujeito de controle não tratado.

Fibrose Pulmonar

[00162] Fibrose pulmonar é caracterizada pela deposição do excesso de tecido fibroso nos pulmões que causam marcante distorção de arquitetura e perda de espaços alveolares, levando à falência de órgão e, finalmente, a morte por insuficiência respiratória. Fibrose pulmonar envolve a troca gradual de parênquima pulmonar normal com tecido fibrótico, causando diminuição irreversível da capacidade de difusão de oxigênio.

[00163] Fibrose pulmonar (também conhecida como alveolite fibrosante criptogênica) está associada a doenças pulmonares intersticiais (ILD), tais como doenças de tecido conjuntivo ou doença inflamatória crônica (por exemplo, artrite reumatoide), infecções, doença pulmonar idiopática e malignidades. Exposição ambiental a toxinas inaladas, medicamentos e terapia de radiação também foi associada com fibrose pulmonar.

[00164] Métodos são providos para tratar ou prevenir fibrose pulmonar em um sujeito, incluindo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um ou mais inibidores de LYST para reduzir, diminuir, limitar ou prevenir um ou mais sintomas de fibrose pulmonar em relação a um sujeito de controle não tratado. Os sintomas típicos incluem tosse seca crônica, falta de ar, fadiga e fraqueza, desconforto no peito, perda de apetite e perda de peso. Em algumas modalidades, um ou mais inibidores de LYST melhoram a função respiratória, reduzem a inflamação, reduzem a fibrose ou uma combinação disso em um sujeito com fibrose pulmonar em relação a um sujeito de controle não tratado.

Outras Doenças Fibróticas

[00165] Métodos são providos para tratar ou prevenir doenças caracterizadas por fibrose excessiva em um sujeito, incluindo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um ou mais inibidores de LYST para reduzir, diminuir, limitar ou prevenir um ou mais sintomas de fibrose excessiva em relação a um sujeito de controle não tratado. Doenças e distúrbios exemplares que podem ser tratados pelos métodos divulgados incluem nefroesclerose, esclerodermia, síndrome de Sharp, neurofibromatose, mielofibrose, esclerose sistêmica, contratura de Dupuytren e degeneração macular. Além disso, métodos são providos para o tratamento de cicatriz e fibrose associadas com complicações cirúrgicas, quimioterápicos ou outra fibrose induzida por fármaco, fibrose induzida por radiação, fibrose resultante de lesão e queimaduras.

Doenças associadas com a função de plaquetas

[00166] Métodos são providos para tratar ou prevenir doenças caracterizadas por ativação de plaquetas excessiva ou prejudicial e/ou sinalização mediada por fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Em função de as plaquetas desempenharem um papel fundamental no processo de coagulação sanguínea, terapias direcionadas contra as plaquetas são algumas das mais importantes na luta contra doenças vasculares do coração e do cérebro. Ativação inadequada ou excessiva de plaquetas pode dar origem à formação de coágulo no interior de um vaso intacto (trombose). Um coágulo que se libera e começa a viajar pelo corpo (tromboembolismo) pode causar obstrução ou oclusão de vaso, estase sanguínea, isquemia, acidente vascular cerebral e/ou morte.

[00167] Estabeleceu-se que LYST reduzida leva à ativação de plaquetas reduzida e expressão reduzida de PDGF (ver Exemplo 7). Por conseguinte, inibidores de LYST podem ser usados como fármacos antiplaquetários para reduzir ou prevenir a agregação de plaquetas prejudiciais e formação de trombos. Métodos são providos para tratar ou prevenir doenças caracterizadas por ativação de plaquetas prejudiciais ou excessiva em um sujeito, incluindo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um ou mais inibidores de LYST para reduzir, diminuir, limitar ou prevenir um ou mais sintomas de agregação de plaquetas prejudiciais ou excessiva em relação a um sujeito de controle não tratado. Deste modo, inibidores de LYST podem ser usados para tratar ou prevenir doenças ou distúrbios associados com a função de plaquetas indesejáveis ou prejudiciais. Exemplos de distúrbios resultantes da ativação inadequada/prejudicial de plaquetas incluem hiperagregação de plaquetas ou volume de plaquetas médio aumentado (MPV) e trombose arterial de trombocitose; trombose venosa (síndrome de Budd-Chiari; trombose do seio cavernoso; trombose do seio venoso cerebral; trombose venosa profunda; doença de Paget-Schroetter; trombose de veia porta; trombose de veia jugular; trombose de veia renal); e trombose microcirculatória. Trombose arterial pode obstruir parcial ou completamente o fluxo de sangue causando isquemia a jusante, acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio.

[00168] Super expressão aumentada ou descontrolada de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e sinalização de PDGF descontrolada esteve envolvida no crescimento, angiogênese e metástase de células de câncer, bem como doenças associadas, tais como o desenvolvimento, sobrevivência e metástase de tumores (revisto em Andrae, et al., Genes Dev., 22:pp1276-1312 (2008)). Mostrou-se que inibição de PDGF reduz o crescimento de células de glioma. Vários inibidores de sinalização mediada por PDGFR, tais como imatinibe, entraram em ensaios clínicos para o tratamento de uma variedade de malignidades. Por conseguinte, um ou mais inibidores de LYST podem ser usados para tratar ou prevenir qualquer doença associada com expressão aumentada ou elevada de PDGF e/ou sinalização de PDGF descontrolada. Doenças exemplares incluem cânceres, tais como glioblastomas (por exemplo, oligodendrogliomas anaplásicos) e sarcomas (por exemplo, sarcoma dérmico; sarcomas de células escamosas esofágicas), bem como doença vascular da retina (por exemplo, retinopatias isquêmicas).

B. Métodos de Tratamento

[00169] Inibição de LYST pode ser usada como um mecanismo terapêutico através de entrega local ou sistêmica. Em algumas modalidades, as composições são administradas de forma sistêmica. Veículos de entrega podem ser selecionados e usados para visar os inibidores a uma localização ou tipo de célula particular. Em outras modalidades, os inibidores são administrados diretamente à vasculatura usando um dispositivo ou enxerto, tais como aqueles discutidos acima. Em modalidades adicionais, a via de administração visa os inibidores diretamente a um órgão específico ou ao local da lesão.

[00170] Estabeleceu-se que os processos de proliferação e inflamação vascular estão ligados. Acredita-se que LYST modera processos imunes que contribuem para distúrbios proliferativos, tais como o processo de reestenose. Intervenção farmacológica precoce pode eliminar a terapia crônica e quaisquer efeitos colaterais potencialmente adversos associados à terapia crônica. Por exemplo, as composições divulgadas neste documento podem reduzir ou prevenir a formação de neoíntima, mas permitem que o crescimento de novo tecido ocorra. Métodos de tratamento e prevenção de doenças e distúrbios usando os inibidores de LYST divulgados incluindo, opcionalmente, um veículo de entrega são discutidos mais detalhadamente abaixo.

Controles

[00171] O efeito de um inibidor de LYST pode ser comparado a um controle. Controles adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, células não tratadas ou um sujeito não tratado. Em algumas modalidades, o controle é tecido não tratado a partir do sujeito que é tratado ou de um sujeito não tratado. Preferencialmente, as células ou tecido do controle são derivados do mesmo tecido como as células tratadas ou tecido. Em algumas modalidades, um sujeito de controle não tratado sofre da mesma doença ou condição como o sujeito tratado. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais dos marcadores farmacológicos ou fisiológicos ou vias afetadas por tratamento anti-LYST são comparados ao mesmo marcador farmacológico ou fisiológico ou via em células de controle não tratadas ou sujeitos não tratados. Por exemplo, sujeitos tratados com anti-LYST podem ser comparados a sujeitos tratados com outros inibidores de formação de neoíntima, tal como rapamicina. Os sujeitos tratados com outros inibidores de formação de neoíntima podem ter uma incidência maior de estenose pós-operatória, ou uma formação reduzida de novo tecido vascular do que sujeitos tratados com os inibidores de LYST.

[00172] Composições farmacêuticas incluindo um ou mais inibidores de LYST podem ser administrados de diversas maneiras, dependendo de se o tratamento local ou sistêmico é desejado e dependendo da área a ser tratada. Por exemplo, as composições divulgadas podem ser administradas intravenosa, por via intraperitoneal, por via intramuscular, por via subcutânea, por via intracavitária ou por via transdérmica. As composições podem ser administradas por via parenteral (por exemplo, por via intravenosa), por injeção intramuscular, por injeção intraperitoneal, por via transdérmica, por via extracorporal, por via tópica ou similares, incluindo a administração intranasal tópica ou administração por inalação.

[00173] Administração parenteral da composição, se usada, é, de modo geral, caracterizada por injeção. Formulações injetáveis podem ser preparadas em formas convencionais, como soluções líquidas ou suspensões, formas sólidas adequadas para solução de suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Administração envolvendo o uso de um sistema de liberação lenta ou de liberação sustentada, de tal modo que uma dosagem constante é mantida, também é discutida.

[00174] Em certas modalidades, as composições são administradas localmente, por exemplo, por injeção diretamente em um local a ser tratado. Entrega local de fármacos pode reduzir efeitos colaterais ou toxicidade associada com entrega sistêmica e pode resultar em resultado de tratamento intensificado devido a uma dose localizada aumentada.

[00175] Métodos são providos para administrar os inibidores de LYST divulgados localmente (ou seja, por meio de entrega de fármaco local, LDD). Em certas modalidades, inibidores de LYST podem ser administrados diretamente a um tecido tratado, tal como uma artéria ou veia, sem gerar efeitos sistêmicos adversos. Em modalidades adicionais, as composições são injetadas ou, de outra forma, administradas diretamente a um ou mais locais cirúrgicos. Normalmente, a injeção local causa uma concentração localizada aumentada das composições que é maior do que aquela que pode ser atingida por administração sistêmica. Em modalidades preferenciais, as composições são entregues diretamente ao tecido, próteses, enxertos ou dispositivos médicos por injeção local ou administração tópica. Em algumas modalidades, inibidores de LYST entregues localmente resultam em concentrações que são duas vezes, 10 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes ou mais do que 1000 vezes maior do que aquelas atingidas pela administração sistêmica do mesmo composto. Em algumas modalidades os inibidores de LYST administrados localmente são liberados constantemente no local de entrega a uma taxa constante ao longo de um período de tempo. Preferencialmente, a liberação constante mantém uma concentração desejada do inibidor de LYST no local de entrega.

[00176] Os inibidores de LYST divulgados podem ser administrados durante um período antes, durante ou depois do aparecimento dos sintomas da doença, ou qualquer combinação de períodos antes, durante ou depois do aparecimento de um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, uma ou mais doses da composição podem ser administradas ao sujeito a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 ou 48 dias antes do aparecimento dos sintomas da doença. Uma ou mais doses da composição podem ser administradas ao sujeito a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 ou 48 dias após o aparecimento dos sintomas da doença. Em algumas modalidades, as múltiplas doses das composições são administradas antes de uma melhoria na condição da doença ser evidente. Por exemplo, em algumas modalidades, o sujeito recebe 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 14, 21, 28, 35 ou 48, por um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 ou 48 dias ou semanas antes de uma melhoria na doença ou condição ser evidente.

[00177] Deste modo, as composições divulgadas incluindo um ou mais inibidores de LYST podem ser administradas em momentos diferentes em relação a um diagnóstico, prognóstico, cirurgia ou lesão dependendo da doença ou distúrbio a ser tratado. O momento de início de terapia anti- LYST deve ser determinado com base nas necessidades do sujeito e pode variar do momento da cirurgia ou lesão, a um ou mais dias, semanas ou meses após a cirurgia ou lesão. Métodos são providos para usar formulações de liberação retardada de inibidores de LYST. Em algumas modalidades, terapia usando inibidores de LYST pode ser interrompida uma vez que o crescimento do novo tecido vascular tenha ocorrido.

[00178] Em algumas modalidades, uma dose única de um ou mais inibidores de LYST é entregue a um sujeito como uma ou mais doses em bólus para elevar a concentração sanguínea do um ou mais inibidores a um nível desejado. O bólus pode ser dado por qualquer meio, tais como por meio de injeção. A colocação da dose de bólus pode ser variada dependendo do efeito desejado e o órgão ou tecido alvo a ser tratado. Em uma modalidade particular, um bólus é dado antes da administração de outras formas de dosagem, tais como formas de dosagens de liberação pulsátil. Deste modo, a concentração de sangue desejada de um ou mais inibidores de LYST pode ser mantida por um período de tempo desejado usando uma combinação de formulações para liberação imediata, retardada ou pulsátil.

[00179] No caso de aderências, a deposição de tecido conjuntivo entre estruturas anatômicas normais é desnecessária e, deste modo, prevenção do desenvolvimento de tecido vascular não é prejudicial. Deste modo, para a prevenção e redução de aderências, inibidores de LYST seriam normalmente aplicados no momento da cirurgia, ou pouco tempo depois, por exemplo, dentro de uma semana. No caso de procedimentos cirúrgicos com risco de formação de neoíntima, por exemplo, estenose ou reestenose de enxertos de tecido ou stents, um ou mais inibidores de LYST podem ser administrados no momento da cirurgia. No caso de lesão ou cirurgia envolvendo a pele, os inibidores de LYST podem ser aplicados após a reepitelização da superfície da pele.

Revestimento sobre Enxertos e Dispositivos

[00180] Um ou mais inibidores de LYST podem ser entregues localmente ao se incorporar o um ou mais inibidores em um dispositivo médico, tal como um stent ou outras próteses, ao se carregar o(s) inibidor(es) em ou sobre um material estrutural ou de vedação do dispositivo. A taxa de liberação do(s) inibidor(es) pode ser controlada por um número de métodos incluindo variar um ou mais dentre a proporção do material absorvível para o agente, o peso molecular: do material absorvente, da composição do(s) inibidor(es), da composição do polímero absorvível, da espessura do revestimento, do número de camadas de revestimento e suas espessuras relativas, a concentração de inibidor e/ou ligação física ou química ou ligação do(s) inibidor(es) ao dispositivo ou material de vedação. Revestimentos de topo de polímeros e outros materiais, incluindo polímeros absorvíveis, também podem ser aplicados para controlar a taxa de liberação do um ou mais inibidores.

[00181] Em algumas modalidades, a quantidade de inibidor de LYST presente em um dispositivo ou enxerto de tecido pode ser ajustado ao se mudar o veículo de entrega. A penetração do inibidor por todo o tecido também pode ser ajustada. Desta forma a quantidade de fármaco liberada localmente no local de implantação pode ser cuidadosamente controlada. Normalmente, o inibidor de LYST ou um veículo de entrega levando o inibidor é posto em contato com um dispositivo ou material de enxerto ex vivo. O contato pode ocorrer na ausência ou presença de agitação moderada, ou outros métodos conhecidos na técnica para assegurar que o inibidor se liga ao ou penetra o dispositivo ou tecido de enxerto. Agitação pode ser conseguida, por exemplo, por incubação em um agitador orbital ou pela rotação vertical, tal como por incubação em um carrossel vertical de um forno de hibridização. O protocolo de incubação pode ser variado para afetar o posicionamento das partículas no dispositivo ou enxerto. A quantidade e a localização da ligação de veículos de entrega, tais como partículas ao dispositivo ou enxerto, também podem ser variadas ao se variar o tipo e a densidade de ligação e visar ligantes, tais como aqueles descritos, apresentados no veículo. Composições e métodos exemplares para entregar fármacos a enxertos vasculares ex vivo são discutidos no pedido Publicados U.S. N° 2006/0002971, 2010/0151436 e Patente U.S. N° 7.534.448.

[00182] As composições e os métodos podem ser usados para entregar inibidores de LYST de forma local a enxertos com ou sem a exigência de procedimentos invasivos adicionais, tais como a colocação de um enxerto vascular ou stent.

C. Dosagens e Quantidades Eficazes

[00183] Em algumas abordagens in vivo, as composições de inibidores de LYST são administradas a um sujeito em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Como usado neste documento, o termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma dosagem suficiente para tratar, inibir ou aliviar um ou mais sintomas do distúrbio a ser tratado ou, de outra forma, prover um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. A dosagem precisa irá variar de acordo com uma variedade de fatores, tais como variáveis dependentes do sujeito (por exemplo, idade, saúde do sistema imunológico etc.), a doença ou o distúrbio e o tratamento sendo efetuado.

[00184] Para todos os compostos divulgados, à medida que estudos adicionais são conduzidos, informações irão surgir com relação aos níveis de dosagem apropriados para o tratamento de várias condições em vários pacientes e o trabalhador com competência comum na técnica, considerando o contexto terapêutico, idade e saúde geral do receptor, será capaz de determinar a dosagem apropriada. A dosagem selecionada depende do efeito terapêutico desejado, da via de administração e da duração do tratamento desejado. Em geral, os níveis de dosagem dentre 0,001 e 100 mg/kg de peso corporal diariamente são administrados aos mamíferos, mais preferencialmente, seres humanos. Em geral, para injeção intravenosa ou infusão, dosagem pode ser menor. Preferencialmente, as composições são formuladas para atingir um nível de soro inibidor de LYST dentre cerca de 1 a cerca de 1000 μM no local onde o tratamento é desejado.

[00185] Em algumas modalidades, os inibidores de LYST são eficazes para prevenir as atividades biológicas normais de células imunes, tais como macrófagos, plaquetas e células NK. Por exemplo, um ou mais inibidores podem estar em uma quantidade eficaz para reduzir ou evitar a atividade migratória ou quimiotática de macrófagos.

[00186] Em uma modalidade, o um ou mais inibidores de LYST estão em uma quantidade eficaz para prevenir ou reduzir a formação de neoíntima em um sujeito. Em uma modalidade preferencial, a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a cura de ferida ou a formação de novo tecido em um sujeito em comparação com um controle não tratado. Preferencialmente, a quantidade de um ou mais inibidores de LYST é eficaz para prevenir ou reduzir a formação de neoíntima e intensificar a cura de feridas em um sujeito em comparação com um controle não tratado.

[00187] Em outra modalidade, o um ou mais inibidores de LYST estão em uma quantidade eficaz para diminuir a quantidade de crescimento de vaso sanguíneo no local de uma lesão ou cirurgia, para prevenir ou diminuir a formação de alta densidade celular e tecido conjuntivo que dão origem à fibrose, cicatrizes, queloides ou aderências. Preferencialmente, a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a cura de feridas.

[00188] Em outra modalidade, um ou mais inibidores de LYST estão em uma quantidade eficaz para diminuir ou inibir a ativação de plaquetas. Por exemplo, inibidores de LYST podem estar em uma quantidade eficaz para prevenir ou inibir a agregação inapropriada de plaquetas e secreção de quimiocinas no local de uma lesão ou cirurgia. Em uma modalidade adicional, o um ou mais inibidores de LYST estão em uma quantidade eficaz para diminuir a quantidade de Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) e/ou Fator de Transformação de Crescimento Beta (TGFβ) produzidos ou secretados por células em resposta à ativação pela trombina em um local de uma lesão ou cirurgia. Um ou mais inibidores de LYST podem ser eficazes para reduzir a produção ou secreção de PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C ou PDGF-D. Deste modo, um ou mais inibidores de LYST podem ser eficazes para reduzir a quantidade de PDGF biologicamente ativo no soro. Por exemplo, a quantidade de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD ou PGDF-AB pode ser reduzida em relação à quantidade em um controle não tratado. Por conseguinte, um ou mais inibidores de LYST podem ser eficazes para reduzir ou prevenir uma ou mais atividades biológicas que ocorrem como resultado de PDGF, ou como resultado de eventos de sinalização a jusante controlados por PDGF. Por exemplo, um ou mais inibidores de LYST podem ser eficazes para reduzir ou prevenir a ativação de um ou mais receptores de tirosina quinase, tais como Receptor α de PDGF (PDGFRα); Receptor β de PDGF (PDGFRβ); e/ou Receptor αβ de PDGF (PDGFαβ). Ao se reduzir ou prevenir a atividade de um ou mais PDGFs, os inibidores de LYST podem reduzir ou prevenir a indução mediada por PDGF de várias vias de sinalização controlando atividades celulares incluindo proliferação celular, quimiotaxia e reorganização de actina.

[00189] Em outra modalidade, o um ou mais inibidores de LYST estão em uma quantidade eficaz para prevenir ou diminuir a formação de alta densidade celular e tecido conjuntivo que dão origem à fibrose, cicatrizes, queloides ou aderências. Preferencialmente, a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a cura de feridas.

D. Terapias de Combinação

[00190] As composições, os dispositivos e os enxertos divulgados incluindo inibidores de LYST podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes ativos adicionais, como parte de um regime de tratamento terapêutico ou profilático. Por exemplo, a composição pode ser administrada no primeiro, segundo, terceiro ou quarto dia ou combinações destes. A composição pode ser administrada no mesmo dia ou um dia diferente do que o segundo agente ativo.

[00191] O termo "combinação" ou "combinado" é usado para se referir à administração concomitante, simultânea ou sequencial de dois ou mais agentes. Portanto, as combinações podem ser administradas concomitantemente (por exemplo, como uma mistura), separadamente, mas simultaneamente (por exemplo, por meio de linhas intravenosas separadas no mesmo sujeito), ou sequencialmente (por exemplo, um dos compostos ou agentes é dado primeiro seguido pelo segundo).

[00192] Os agentes terapêuticos adicionais podem ser outros agentes anti-neoíntima, agentes quimioterápicos, anticorpos, antibióticos, antivirais, anti-inflamatórios esteroides e não esteroides, agentes imunoterápicos convencionais, imunossupressores, citocinas, quimiocinas e/ou fatores de crescimento, agentes antiproliferativos ou antimigrantes projetados para tratar ou prevenir a formação de neoíntima ou reestenose, agentes que afetam a migração e a produção de matriz extracelular, agentes que afetam a deposição de plaquetas ou formação de trombos e agentes que promovem a cura vascular e reendotelização, descrito em Tanguay et al., Current Status of Biodegradable Stents, Cardiology Clinics, 12:699-713 (1994), J. E. Sousa, P. W. Serruys e M. A. Costa, Circulation 107 (2003) 2274 (Parte I), 2283 (Parte II), K. J. Salu, J. M. Bosmans, H. Bult e C. J. Vrints, Acta Cardiol 59 (2004) 51.

[00193] Agentes de antitrombina exemplares incluem, mas não estão limitados a, heparina (incluindo heparina de baixo peso molecular), R- hirudina, hirulog, argatrobana, efegatrana, peptídeo anticoagulante de carrapato e Ppack.

[00194] Agentes antiproliferativos exemplares incluem, mas não estão limitados a, paclitaxel (Taxol), vincristin QP-2, metotrexato, angiopeptina, mitomicina, BCP 678, c-myc anti-sentido, ABT 578, actinomicina-D, RestenASE, 1-cloro-deoxiadenosina, Ribozima PCNA e celecoxibe.

[00195] Agentes exemplares modulando replicação/proliferação celular incluem alvos de inibidores de rapamicina (TOR) (incluindo sirolimus, everolimus e ABT-578), paclitaxel e agentes antineoplásicos, incluindo agentes de alquilação (por exemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucila, melfalano, carmustina, lomustina, ifosfamida, procarbazina, dacarbazina, temozolomida, altretamina, cisplatina, carboplatina e oxaliplatina), antibióticos antitumorais (por exemplo, bleomicina, actinomicina D, mitramicina, mitomicina C, etoposídeo, teniposídeo, ansacrina, topotecana, irinotecana, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona e mitoxantrona), antimetabólitos (por exemplo, deoxicoformicina, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, azatioprina, 2-clorodeoxiadenosina, hidroxiureia, metotrexato, 5- fluorouracila, capecitabina, citosina arabinosida, azacitidina, gencitabina, fosfato de fludarabina e asparaginase), agentes antimicóticos (por exemplo, vincristina, vimblastina, vinorelbina, docetaxel, estramustina) e agentes molecularmente visados (por exemplo, imatinibe, tretinoína, bexaroteno, bevacizumabe, gentazumabe ogomicina e diftitox denileuquina).

[00196] Agentes de anti-reestenose exemplares incluem, mas não estão limitados a, imunomoduladores, tais como sirolimus (rapamicina), tacrolimus, Biorest, mizoribina, ciclosporina, Interferon gama 1b, leflunomida, tranilaste, corticosteroide, ácido micofenólico e bifosfonato.

[00197] Agentes antimigrantes exemplares e moduladores de matriz extracelular incluem, mas não estão limitados a, halofuginona, inibidores de propil-hidroxilase, inibidores de C-Proteinase, inibidores de MMP, batimastate, probucol.

[00198] Exemplos de agentes antiplaquetários incluem, mas não estão limitados a, heparina.

[00199] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é N-3,4-trihidroxibenzamida ou um sal farmaceuticamente aceito ou éster deste, didox, imidato ou hidroxiureia, como descrito na Patente U.S. N° 8.029.815.

[00200] Os agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados de forma local ou sistêmica ao sujeito, ou revestidos ou incorporados sobre ou em um dispositivo ou enxerto. Os reagentes terapêuticos adicionais podem ser administrados pelas mesmas, ou por diferentes, vias e por diferentes meios. Por exemplo, um ou mais inibidores de LYST podem ser entregues de forma local combinados com um ou mais dentre paclitaxel, taxotere e outros compostos de taxoide, metotrexato, antraciclinas, tais como doxorrubicina, everolimus, serolimus, rapamicina ou derivados de rapamicina entregues por diferentes meios, tais como por via sistêmica.

[00201] Em modalidades adicionais, um ou mais inibidores de LYST podem ser usados para reduzir ou prevenir os efeitos colaterais indesejados associados com o uso de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, um ou mais inibidores de LYST podem ser usados com a bleomicina de agente anti-neoplásico, para prevenir fibrose pulmonar associada com bleomicina.

[00202] A presente invenção será entendida, adicionalmente, com referência aos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos Exemplo 1: A mutação bege reduz a estenose em enxertos de tecido Métodos e Materiais

[00203] Enxertos vasculares de engenharia de tecido (TEVG) foram desenvolvidos ao se inocular células mononucleares derivadas de medula óssea autóloga sobre uma estrutura tubular biodegradável fabricada a partir de um tubo de fibra de ácido poliglicólico revestido com um copolímero de ácido polilático e policaprolactona de 50:50.

[00204] Um modelo murino para avaliar a função de TEVG foi desenvolvido em um esforço para elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à formação de TEVG. O modelo de enxerto de interposição da veia cava inferior (IVC) é um modelo validado para investigar o uso de enxertos vasculares em uma baixa pressão, sistema circulatório de alto fluxo similar à circulação de Fontan. Este modelo foi amplamente usado para estudar a formação de novo tecido no TEVG.

[00205] Um enxerto de duto biodegradável composto de PGA- PCL/LA foi implantado na veia cava inferior de camundongos de tipo selvagem e camundongos mutantes bege, respectivamente, sem inoculação de célula. Enxertos foram explantados 2 semanas após a cirurgia, seccionados e medidos para o diâmetro do vaso e avaliado para desobstrução.

Resultados

[00206] Variação significativa nas taxas de estenose foi observada quando os TEVG foram implantados como enxertos de interposição IVC, dependendo da cepa do camundongo. Especificamente, observou-se que TEVG implantados em camundongos com uma mutação bege tinham taxas de estenose excepcionalmente baixas. A desobstrução e diâmetro luminal de TEVG implantados como enxertos de interposição IVC foram comparados tanto em C57B6 (camundongos de tipo selvagem) (N= 25) e mutantes bege (N= 10) (Tabela 1). Os camundongos de tipo selvagem exibiram uma estenose de 80% com diâmetros luminais medindo 0,33 mm, considerando que os camundongos bege exibiram uma taxa de estenose de 10% com diâmetros luminais medindo 0,71 mm (teste-T < 0,001 e qui-quadrado 0,0002) (Figura 1).Tabela 1: Diferenças na desobstrução e diâmetros luminais de TEVG explantados de camundongos bege (Bg) e de tipo selvagem (Wt).

Exemplo 2: A mutação bege reduz a infiltração de macrófagos em enxertos de tecido Métodos e Materiais

[00207] Foi demonstrado anteriormente usando o modelo murino que formação de novo tecido vascular surge a partir de células derivadas do hospedeiro e que o processo de formação de novo tecido vascular é orquestrada pelo sistema imunológico, especificamente os macrófagos derivados do hospedeiro. Infiltração de macrófagos excessiva leva à estenose, enquanto a inibição de infiltração de macrófagos previne a formação de novo tecido.

[00208] O número de macrófagos nos enxertos explantados descritos acima no Exemplo 1 foi medido tanto para camundongos bege quanto de tipo selvagem. Imuno-histoquímica foi realizada em seções de tecido de cada enxerto para caracterizar o número e a morfologia de células endoteliais em cada grupo, usando um anticorpo específico para o marcador celular CD31.

Resultados

[00209] Os TEVG implantados nos camundongos bege exibiram significativamente menos infiltração de macrófagos do que TEVG implantados em camundongos de tipo selvagem em 2 semanas após a cirurgia. Ver a Figura 2. Notavelmente, a imuno-histoquímica para células endoteliais (usando um anticorpo específico para CD31) não mostrou qualquer diferença entre as seções de enxerto de camundongos de tipo selvagem e bege, indicando que a formação de novo tecido foi similar nos dois grupos.

Exemplo 3: O fenótipo bege surge de uma mutação no gene LYST Métodos e Materiais

[00210] A mutação bege surge de uma mutação espontânea do gene LYST (Figura 3). Para a análise de expressão de proteína, 6 primers diferentes, designados LYST1, LYST3, LYST4, LYST5 e LYST6, respectivamente, foram projetados para cobrir a região de gene LYST completa. O primer LYST-5 cobriu a área de éxon 52 que incluía a mutação de aminoácido identificada no genótipo de camundongo bege. Células brutas foram usadas como um padrão para calcular os níveis de mRNA relativo.

Resultados

[00211] A mutação específica responsável para o fenótipo bege em camundongos bege foi identificada. O comprimento total do gene LYST codifica um polipeptídeo de aminoácido 3801. A mutação de LYST ocorreu no éxon 52 resultando em deleção do aminoácido isoleucina (ile3741del) (Figura 3).

[00212] Análises moleculares demonstraram que não houve nenhuma diferença significativa na expressão do mRNA entre ambos os grupos. Apesar de níveis equivalentes de transcrição das proteínas do tipo selvagem e mutantes, não houve nenhuma tradução da proteína mutante.

[00213] Além disso, a expressão de proteína LYST foi esgotada em camundongo mutante bege por imuno-histoquímica e por western blot (Figura 4). Estes resultados indicaram que a mutação de gene LYST em camundongo bege afeta o nível de modificação de proteína após a tradução do gene.

Exemplo 4: A mutação bege no gene LYST altera processos imunes Métodos e Materiais

[00214] A hipótese de que a mutação bege inibe a formação de estenose de TEVG ao se modular o sistema imune foi testada. Medula óssea foi transplantada de camundongos C57B6 (tipo selvagem) em camundongos mutantes bege, e vice-versa. Análises de FACS foram realizadas para determinar a porcentagem de monócitos de LYST em camundongos bege e de tipo selvagem. Além disso, a capacidade de ativação de plaquetas mediante estimulação com fibrina foi reduzida em camundongos mutantes bege em comparação com o tipo selvagem.

Resultados

[00215] Inibição significativa de estenose de TEVG foi demonstrada em camundongos de tipo selvagem transplantados com medula óssea dos camundongos bege. Da mesma forma, quando TEVG foram implantados em camundongos bege transplantados com a medula óssea de camundongos de tipo selvagem, eles exibiram altas taxas de estenose de TEVG. Estas constatações indicaram que a mutação bege inibe a estenose de TEVG por meio de seu efeito no sistema imunológico. Análise de FACS de monócitos e macrófagos a partir de camundongos Wt e bege, respectivamente, demonstrou diferenças na população de fenótipo. Uma série de gráficos de ponto de dispersão mostrando resultados representativos de citometria de fluxo analítico mostra a proporção de células de monócitos coradas para CD115 (eixo y) e CD11b (eixo x) a partir de camundongos WT3, WT4, bg3 e bg4, respectivamente. A distribuição de células que estão coradas para LYC6 e F4/80 a partir de camundongos WT3, WT4, bg3 e bg4, respectivamente, também foi determinada. A porcentagem de células designadas como LYC6 "alto" e LYC6 "baixo" foi calculada. Os resultados são representativos de macrófagos peritoneais 3 dias após estimulação com tioglicolato, fechados para excluir células mortas e detritos.

[00216] Gráficos de ponto de dispersão mostraram resultados representativos de citometria de fluxo analítico, células de representação coradas para PE-A (eixo y) contra fluorescência de FITC-A (eixo x) de camundongos WT e camundongos bege, respectivamente. As células foram fechadas para excluir células mortas e detritos após a ativação de plaquetas após estimulação com fibrina. O número de monócitos LY6C "altos" foi maior no grupo de tipo selvagem (WT3, WT4), considerando que o número de monócitos Ly6C "baixos" foi maior no grupo bege (bg 3, bg) em macrófagos peritoneais em 3 dias após a estimulação com tioglicolato.

[00217] Análise de FACS também demonstrou que a capacidade de ativação de plaquetas mediante estimulação de células com fibrina foi reduzida em camundongos mutantes bege, em comparação com os camundongos de tipo selvagem.

Exemplo 5: Imunomodulação mediada por LYST pode ser atingida usando um anticorpo para a proteína LYST Métodos e Materiais

[00218] Os efeitos do bloqueio da proteína LYST foram investigados usando um anticorpo anti-LYST. Camundongos C57B6 foram tratados com o anticorpo anti-LYST e então implantados com TEVG.Anticorpo anti-LYST foi injetado no peritônio de camundongo de tipo selvagem em cada um dos três grupos de tratamento diferentes (0 mg/kg (controle), 10 mg/kg ou 50 mg/kg) 1 dia antes da cirurgia, bem como 1 semana após a cirurgia. Camundongos foram sacrificados e o enxerto e o baço foram explantados 2 semanas após a cirurgia. Histologia foi realizada usando coloração hematoxilina e eosina (coloração HE) do enxerto. Tecido de baço foi analisado por Western blot, usando um anticorpo específico para a proteína LYST para determinar a quantidade eficaz relativa de proteína LYST em cada grupo de tratamento.

Resultados

[00219] A injeção sistêmica de anticorpo anti-LYST mostrou melhoria de desobstrução de enxerto em forma dependente de dose. Observou-se uma notável inibição de infiltração de macrófagos e diminuição de estenose de TEVG. Este aumento dependente de dose na desobstrução foi acompanhado por uma redução dependente de dose na presença da proteína LYST no interior do tecido de baço, como determinado pela imuno-histoquímica. Deste modo, um método de imunomodulação que resulta na formação de novo tecido melhorada e inibição da formação de estenose de TEVG foi estabelecido.

Exemplo 6: Camundongos transgênicos que carecem de um gene Lyst funcional não exibem estenose de TEVG Métodos e Materiais

[00220] Camundongos transgênicos C57BL/6 que carecem de uma proteína LYST funcional foram gerados. Estes camundongos foram designados C57BL/6 Lysttm1b. A tecnologia usada para gerar esta cepa nocaute usa um repórter LacZ. PCR para LacZ confirmou o modelo nocaute.

[00221] Para determinar se os camundongos nocaute C57BL/6Lysttm1b iriam desenvolver estenose após a implantação de TEVG, 5 camundongos C57BL/6 Lysttm1b e 5 camundongos de tipo selvagem C57BL/6 foram implantados com TEVG não inoculados. Os TEVG foram explantados e examinados 2 semanas após a implantação.

Resultados

[00222] 100% de enxertos vasculares de engenharia de tecido (TEVG) não inoculados implantados em camundongos nocaute Lysttm1b (n= 5) foram abertos após o implante de 2 semanas (ver a Figura 5; Tabela 1). Por outro lado, camundongos de tipo selvagem C57BL/6 exibiram aproximadamente 90% de incidência de estenose.

Exemplo 7: Lyst modula a função de plaquetas em resposta à ativação Métodos e Materiais

[00223] Entende-se que a proteína Lyst a ser envolvida na função de plaquetas, e síndrome de Chediak Higashi, no humano correlato, é caracterizado como uma "deficiência de piscina de armazenamento de plaquetas". Plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido de camundongos bege (Bg) e de tipo selvagem (WT). As amostras foram ativadas por trombina e concentrações totais de PDGF secretado (fator de crescimento derivado de plaquetas) de cada grupo (n= 7) foram comparadas ao repouso, controles não ativados (n= 5).

Resultados

[00224] Tanto nos grupos ativados quanto de repouso, ativação da trombina resultou em concentrações significativamente maiores de PDGF. Entretanto, a secreção de PDGF de plaquetas ativadas foi significativamente diminuída no grupo bege quando comparado ao tipo selvagem (ver Figura 6). Deste modo, a redução de atividade de Lyst também reduziu PDGF, indicando que os agentes que reduzem a atividade de Lyst também podem funcionar como agentes antiplaquetários.

Claims (15)

1. Composição farmacêutica para uso em um método para a redução ou prevenção de formação de cicatriz ou estenose em um sujeito, caracterizada pelo fato de compreender: um ou mais inibidores de regulador de tráfego lisossomal (LYST), e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o um ou mais inibidores de LYST são anticorpos ou fragmentos de anticorpos tendo pelo menos um domínio variável de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-LYST, em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir a infiltração de macrófagos, a ativação da célula exterminadora natural, e/ou a ativação de plaquetas no sujeito, mas não impede a formação de neotecido vascular no sujeito quando administrado ao sujeito até três dias antes da cirurgia, no momento da cirurgia ou até 14 dias após a cirurgia.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser em uma formulação de dosagem que entrega um ou mais inibidores de LYST em uma quantidade entre 0,1 e 1000 mg/kg de peso corporal de um ser humano.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser em uma dosagem eficaz para reduzir ou prevenir a infiltração de macrófagos.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser em uma dosagem eficaz para reduzir ou prevenir a ativação de plaquetas.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente, um veículo de entrega selecionado a partir do grupo consistindo em nanopartículas, micropartículas, micelas, emulsões, partículas de lipoproteína sintética, lipossomas, nanotubos de carbono, géis, ou revestimentos.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente, um ou mais agentes terapêuticos adicionais selecionados a partir do grupo consistindo em outros agentes anti-neoíntima, agentes quimioterápicos, anti-inflamatórios esteroides ou não esteroides, agentes imunoterápicos convencionais, imunossupressores, citocinas, quimiocinas, e fatores de crescimento.

7. Enxerto vascular, stent, ou implante, caracterizado pelo fato de compreender: a) um ou mais inibidores de regulador de tráfego lisossomal (LYST) em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir a infiltração de macrófagos, ativação da célula exterminadora natural e/ou a ativação de plaquetas em um sujeito, e b) um carreador fisiologicamente aceitável, em que a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a cura normal da ferida no sujeito.

8. Enxerto vascular, stent, ou implante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é revestida sobre ou incorporada no enxerto, stent, ou implante.

9. Enxerto vascular, stent ou implante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição é revestida sobre ou incorporada no enxerto, stent, ou implante.

10. Enxerto vascular, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o enxerto é um enxerto autólogo, autólogo preservado, alogênico, xenogênico, ou sintético.

11. Composição para reduzir ou prevenir a infiltração de macrófagos, a formação de cicatriz ou estenose em um sujeito, caracterizada pelo fato de compreender: a) um ou mais inibidores de regulador de tráfego lisossomal (LYST) em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir a infiltração de macrófagos, ativação da célula exterminadora natural e/ou a ativação de plaquetas em um sujeito, e b) um carreador fisiologicamente aceitável, em que a quantidade de um ou mais inibidores de LYST não previne a cura normal da ferida no sujeito, e em que a composição tem uma formulação de dosagem que entrega um ou mais inibidores de LYST em uma quantidade entre 0,1 e 1000 mg/kg de peso corporal de um ser humano, em que um ou mais inibidores de LYST são anticorpos, fragmentos de anticorpos ou proteínas com a especificidade de ligação de um anticorpo anti-LYST.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de ter uma dosagem eficaz para reduzir ou prevenir a infiltração de macrófagos.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de ter uma dosagem eficaz para reduzir ou prevenir a ativação de plaquetas.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente, um veículo de entrega selecionado a partir do grupo consistindo em nanopartículas, micropartículas, micelas, emulsões, partículas de lipoproteína sintética, lipossomas, nanotubos de carbono, géis, ou revestimentos.

15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente, um ou mais agentes terapêuticos adicionais selecionados a partir do grupo consistindo em outros agentes anti-neoíntima, agentes quimioterápicos, anti- inflamatórios esteroides ou não esteroides, agentes imunoterápicos convencionais, imunossupressores, citocinas, quimiocinas, e fatores de crescimento.