EA004145B1

EA004145B1 - ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ РЕЦЕПТОРОВ-ИНТЕГРИНОВ α1β1 И ИНГИБИТОРОВ ТРФ-β1 ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПОЧЕК

Info

Publication number: EA004145B1
Application number: EA200001092A
Authority: EA
Inventors: Доминик Козгров
Original assignee: Бойз Таун Нэшнл Рисёрч Хоспитал
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2004-02-26
Also published as: CN1310625A; BR9911067A; EP1079843A2; CZ296262B6; WO1999061040A3; CA2329757A1; JP2002516287A; NO20005883D0; TR200003432T2; CN1187084C; DE69935853T2; CA2329757C; WO1999061040A2; NZ508317A; EE04581B1; PT1079843E; EP1079843B1; PL345946A1; ATE359804T1; ES2285841T3

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложены способ лечения или ограничения расстройств почек (например, почечного гломерулонефрита и/или почечного фиброза), способы задерживания начала и/или замедления развития заболевания почек при инсулинзависимом сахарном диабете, способы задерживания начала и/или замедления развития синдрома Альпорта и способы ограничения почечного фиброза, включающие введение ингибитора рецептора-интегрина α1β1 возможно в комбинации с ингибитором ТРФ-β1. Также, согласно настоящему изобретению предложена мышиная модель заболевания почек, причем эта мышь не экспрессирует нормальный состав коллагена типа 4 в КБМ (то есть, у этой мыши не включены в ее клубочковую базальную мембрану цепи коллагена α3(IV), α(IV) и α5(IV)) и не экспрессирует рецептор-интегрин α1β1. Предложен также способ отбора агента для применения в ограничении расстройств почек с использованием мышиной модели по изобретению и способ ограничения накопления матрикса в клубочковой базальной мембране у пациента с синдромом Альпорта, включающий снижение у него активности ТРФ-β1. Предложена также фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор рецептора-интегрина α1β1 и ингибитор ТРФ-β1.

Description

Область изобретения

Это изобретение относится к области заболевания почек (т.е. расстройства почек), характеризующегося гломерулонефритом и/или фиброзом. В частности, это изобретение относится к применению ингибиторов рецепторовинтегринов α1β1 при расстройствах почек. Далее это изобретение относится к применению ингибиторов интегрина α1β1 в комбинации с ингибиторами ТРФ-β 1 при расстройствах почек.

Предпосылки изобретения

В Соединенных Штатах в настоящее время примерно 12000 человек живут с синдромом Альпорта. Это наследственное расстройство приводит к прогрессирующему заболеванию почек, которое можно лечить только диализом и трансплантацией почек. Трансплантированные почки обычно отторгаются. Таким образом, нужны альтернативные способы лечения. Однако в настоящее время нет лечения, которое направлено на механизм начала или развития этого заболевания. Таким образом, тем, что нужно, является лечение, которое действует на механизм начала и/или развития заболевания и могло бы значительно замедлить болезненные состояния, такие как почечный гломерулонефрит или почечный фиброз.

Ряд заболеваний почек связан с изменениями гомеостаза матрикса, при которых нарушается тонкий баланс между синтезом и обменом структурных молекул. Как один из примеров, синдром Альпорта является заболеванием, которое приводит к прогрессирующей почечной недостаточности и связано с потерей слуха, относящейся к чувствительному нерву. Более всего страдают носители-мужчины, и ультраструктурные исследования выявляют аномалии в клубочковой базальной мембране (КБМ) страдающих людей. Синдром Альпорта наблюдается примерно у одного из 20000 человек, что делает это заболевание одним из самых частых генетических расстройств. См., например, ΑΐΚίη е! а1., Αίροή 8упйготе в Р.А. 8кпет & С.А. Со115с11а1к (Ейк.), ЭБеаке οί !ке К1йпеу, 41Н ей. Скар. 19, ЬкИе Βτονη, Βοκ!οη, ρρ. 617-641, 1988. Связанный с Х-хромосомой синдром Альпорта вызывает любая из серии мутаций в гене коллагена 4А5 (Вагкег е! а1. 8с1епсе, 348: 1224-1227, 1990). Идентифицировано по меньшей мере 60 разных мутаций этого гена. Аутосомная форма синдрома Альпорта имеет такой же диапазон фенотипов, как и форма, связанная с Xхромосомой, и является результатом мутаций любого гена коллагена 4А3 (СОБ4А3) или 4А4 (СОБ4А4) базальной мембраны. См., например, Ьеттшк е! а1., Нит. Μο!. Оеп., 3:1269-1273, 1994 и Μοθιίζιι1<ί е! а1., Ха!иге Сепе!., 8:77-81, 1994. Другие заболевания базальной мембраны включают в себя синдром Гудпасчера, который происходит из-за острой аутоиммунной реакции, направленной против эпитопа на домене

ЫС1 коллагена 4А3 (Нийгоп е! а1., К1йпеу Ιη!., 43:145-139, 1993), и диффузный лейомиоматоз, доброкачественную гладкомышечную опухоль, которая связана с делецией обоих коллагенов 4А5 и 4А6 (ΖΗου е! а1., 8с1епсе, 261:1167-1169, 1993).

Базальные мембраны представляют собой специализированные внеклеточные структуры, связанные почти с каждым органом и тканью организма. Обычно они находятся на границе между клетками и соединительной тканью, но также могут находиться между эпителиальными и эндотелиальными клетками, как в случае почечного клубочка (т.е. скопления капилляров). Преобладающие строительные блоки базальных мембран включают в себя коллаген типа IV, ламинин, гепаринсульфатпротеогликан, энтактин и, иногда, фибронектин и коллаген типа V. Наиболее сильно представленным компонентом всех базальных мембран является коллаген типа IV, особый тип коллагена, обнаруживаемый только в базальных мембранах. В своей нативной форме тип IV, как все коллагены, состоит из трех молекул коллагена, собранных в тройную спираль, состоящую из определенных комбинаций шести альфа-цепей (4А1-4А6). Наиболее обычны цепи 4А1 и 4А2 (которые также называют цепями «ШУ) и а2(ГУ)) (Т1тр1, I. Βίοскет., 180:487-502, 1989). Коллаген типа IV отличается от интерстициального коллагена во многом. Спиральная структура ассоциации альфа-цепей не точно соответствует фрагменту глицин-Χ-Υ, наблюдаемому у других коллагенов, она содержит 3-гидроксипролин, а не 4гидроксипролин, и богата углеводами. Получающаяся суперструктура представляет собой подобие мелкой сетки из коллагена базальной мембраны. Эта сетка является основой, с которой связываются вспомогательные молекулы (ламинин, гепаринсульфат и тому подобное).

Базальные мембраны являются весьма гетерогенными структурами, что объясняет их различные функциональные свойства. Сложность этих структур все еще плохо осознана. Несколько новых цепей коллагенов базальных мембран (альфа-цепи 3, 4, 5 и 6) были открыты только недавно. См., например, Оииетат е! а1., I. Βΐο1. Скет., 266:15318-15324, 1990; ^кЕкка е! а1., Ргос. Ыа1к Асай. δοΐ. И8А, 87:1606:160, 1990; Βυΐίονδίί е! а1., I. Βίο1. Скет., 262:7874-7877, 1987; и Ζΐιοιι е! а1., 8Оепсе, 261:1167-1169, 1993. Интересно, что новые цепи найдены только в определенных тканях (например, в клубочках почек, в оболочках Дециме (Оестекз) глаза, в хрусталике, коже, легких, семенниках и улитке). См., например, К1ерре1 е! а1., Ат. I. Ра!М., 134:813-825, 1989 и Тгуддуагоп е! а1., К1йпеу Ш!., 43:38-44, 1993. В настоящее время роль этих новых цепей в сборке и функции базальных мембран не известна. Считают, что эти новые коллагены базальных мембран образуют отдельные сетки, отличные от сеток коллагена типов 4А1 (αΐ(ΐν) и 4А2 (α2(ΐν)).

Клубочковые базальные мембраны (КБМ) почек неотъемлемы для процесса ультрафильтрации (т.е. того, в котором кровь фильтруется с целью удаления метаболитов для экскреции, например, в форме мочи). Синдром Альпорта приводит к массивному накоплению внеклеточного матрикса и нарушенной базальной мембране, что приводит к фокальному и сегментному гломерулонефриту (т.е. воспалению капиллярных петель в клубочках почки), что, в конечном счете, приводит к фатальной уремии (т.е. избытку мочевины в крови в результате почечной недостаточности). Многие из тех же молекул внеклеточного матрикса (например, коллаген типа ΐ, фибронектин, ламинин и коллаген типа ΐν) прогрессивно накапливаются также и в КБМ пациентов с нефритом при ИЗСД (инсулинзависимый сахарный диабет). Однако при этом заболевании КБМ утолщаются, но не имеют фокального утончения и расщепления (сегментирования) КБМ, которые характерны для синдрома Альпорта.

Интегрины представляют собой семейство гетеродимерных трансмембранных гликопротеиновых рецепторов, которые связываются с компонентами базальной пластинки и внеклеточного матрикса. Они функционируют как адгезионные молекулы, участвующие в агрегации клеток и прикреплении клеток к базальной пластинке. Также они передают сигналы в ядро и участвуют в модулировании экспрессии генов, особенно экспрессии генов для миграции и дифференцировки клеток (Нупск. Се11, 69:11-25, 1992). Известно более 20 разных рецепторовинтегринов, которые включают в себя около 14 разных альфа-субъединиц и около 8 разных бета-субъединиц (Όίδίιηοηο, Сигг. Ορίη. Се11. ΒίοΙ., 6:182-194, 1994).

В почечном клубочке имеются отдельные совокупности рецепторов-интегринов. Они связаны либо с мезангиальным матриксом (то есть, мембраной, которая помогает поддерживать капиллярные петли в клубочке почки), либо с висцеральными эпителиальными клетками (Ра!еу е! а1., Се11 Аббекюп Соттип., 2:159-167, 1994). Наиболее распространенным рецептороминтегрином на взрослых клубочковых висцеральных эпителиальных клетках является гетеродимер α3β1 (Аб1ег, Ат. 1. Ра!бо1., 141:571578, 1992; и Ра!еу е!. а1., Се11 Аббекюп Соттип., 2:159-167, 1994). Показано, что субъединица β5 экспрессируется во взрослых висцеральных эпителиальных клетках (Уатаба е! а1., Се11 Аббекюп Соттишс., 3:311-325, 1995), а рецепторы-интегрины α1, α3, α5, αν и β3 экспрессируются в развитии во время морфогенеза почек (Когбопеп е! а1., Баб. 1пуек!., 62:616-625, 1990; №аба е! а1., 1. Се11 Вю1., 132:1161-1176, 1996; и Уатаба е! а1., Се11 Аббекюп Соттишс., 3:311

325, 1995). Гетеродимерный рецептор-интегрин α1β1 является единственным рецептороминтегрином, идентифицированным на поверхности мезангиальных клеток в почечном клубочке.

Была получена мышь с выбитым геном в субъединице α3 рецепторов-интегринов. Потомство погибает от дисфункции почек вскоре после рождения (Кте1ббетд е! а1., Эеу., 122:35373547, 1996). Ультраструктурная патология КБМ у новорожденных этой модели примечательным образом похожа на ту, которую наблюдают при далеко зашедшем синдроме Альпорта. Базальная мембрана выглядит разреженной (т.е. нерегулярно утолщенной, истонченной и расщепленной), а опорные отростки висцеральных эпителиальных клеток выглядят слитыми. Поскольку одним из лигандов рецептора α3β1 является коллаген типа IV (Кпкбпатшб е! а1., Баб. 1пуек!., 74: 650-665, 1996; и Вирргесб! е! а1., К1бпеу 1п!.. 49:1575-1582, 1996), и поскольку этот рецептор локализован вдоль плоскости контакта между висцеральными эпителиальными клетками и КБМ (Вага1б1 е! а1., Ыербтоп, 66:295-301, 1994), вышеперечисленные наблюдения касательно выбивания интегрина α3 подтверждают модель, где такое взаимодействие между интегрином и лигандом играет важную роль в развитии базальной мембраны.

У нормального животного коллаген типа ΐν в эмбриональной клубочковой базальной мембране (КБМ) вплоть до времени рождения состоит полностью из цепей α1(ΐν) и α2(ΐν) (которые называют классическими цепями коллагена). Вскоре после рождения происходит связанное с развитием переключение, при котором в КБМ можно четко определять цепи α3(ΐν) α4(ΐν) и α5(ΐν) (которые называют новыми цепями коллагена), а цепи α1(ΐν) и α2(ΐν) становятся преимущественно локализованными в мезангиальном матриксе (Мшот & Запек, 1. Се11. Вю1., 127:879-891, 1994).

Во взрослой почке тонкий слой КБМ, включающий в себя цепи α1(ΐν) и α2(ΐν), лежит, примыкая к слою эндотелиальных клеток, тогда как большая часть всей толщи КБМ включает в себя цепи α3(ΐν), α4(ΐν) и α5(ΐν) (Эек|агбепк & Вепбауап, 1. Се11. Вю1., 113:689-700, 1991; и Какб!ап е! а1., 1. Сбп. Шуек!., 78:10351044, 1996). Существуют биохимические свидетельства, из которых следует, что эти две разных совокупности цепей коллагена образуют отдельные сетки (К1ерре1 е! а1., 1. Вю1. Сбет., 267:4137-4142, 1992). При семейном нефрите нуль-мутации (т.е. мутации, которые ликвидируют экспрессию генов) любого из генов, α3(ΐν), α4(ΐν) или α5(ΐν), приводят к отсутствию всех трех цепей в КБМ, предположительно вследствие обязательных ассоциаций в макромолекулярной сборке надструктуры КБМ. Это приводит к наличию цепей α1(ΐν) и α2(ΐν) по всей толще КБМ. Таким образом, рецепторы коллагена типа IV на поверхности висцеральных эпителиальных клеток в Альпортовской почке (т.е. в почке индивидуума с синдромом Альпорта) находятся в прямом контакте с КБМ, имеющей нехарактерный состав цепей коллагена типа IV. По меньшей мере одно исследование касалось относительной способности висцеральных эпителиальных клеток приставать к коллагену типа IV, имеющему разные составы, причем было найдено, что при прямом сравнении с классическими цепями αΐ(ΐν) и α2(ΐν) они пристают значительно лучше к базальной мембране, включающей в себя новые цепи. Эту адгезию можно было блокировать антителами против рецептора-интегрина α3.

С помощью направленного мутагенеза в гене проколлагена СОЬ4А3 создали мышиную модель аутосомной формы синдрома Альпорта (Сокдгоуе е! а1., Сепек Эеу., 10:2981-2992, 1996). В этой животной модели развивается прогрессирующий гломерулонефрит с началом протеинурии в возрасте около четырех недель и средним возрастом наступления смерти от почечной недостаточности около 8,5 недель в инбредном фоне 129 8ν/Γ Ультраструктурные изменения в КБМ наблюдаются уже в возрасте одной недели, а по всей КБМ большинства клубочков - к возрасту три недели, задолго до начала протеинурии. В КБМ накапливаются компоненты внеклеточного матрикса, в том числе ламинин-1, гепаринсульфатпротеогликан, фибронектин и энтактин. Эта мышь названа здесь Альпортовской мышью.

Накопление внеклеточного матрикса в КБМ и мезангии в зависимости от развития заболевания почек является свойством, которое присуще разнообразным заболеваниям клубочков - как у пациентов, так и в экспериментальных животных системах. См., например, Соуа1 & ^ίββίηδ. Ат. 8ос. №ркто1., 1:1334-1342; \νί1коп е! а1., Соп1пЬ. №ркто1. Ваке1. Кагдег, 118:126-134, 1996; Ва//ас.|ие е! а1., С1ш. №ркто1., 46:213-214, 1996; УокЫока е! а1., К1йпеу ΐη!., 35:1203-1211. 1989; и К1акг е! а1., N. Εη§1. I. Мей., 318:1657-1666. 1988. Считается, что при диабете главным медиатором этого эффекта является длительное воздействие со стороны сывороточных белков, подвергнутых неферментативному глюкозилированию, которое является результатом хронических высоких уровней глюкозы (Эо1 е! а1., Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А, 89:2873-2877,1992; и Ноу е! а1., I. С1ш. ΐηνοδί, 93:483-442, 1994).

Для большинства прогрессирующих расстройств клубочков представляется, что с накоплением внеклеточного матрикса, ведущим к фиброзу (т.е. образованию фиброзной ткани), тесно связана чрезмерная продукция трансформирующего ростового фактора ТРФ-βΚ См.

например Вогйег & К.ио81ак11, №1Шге (Ьопйоп),

346:371-374, 1992; Уапд е! а1., I. Ат. 8ос. №ркго1., 5:1610-1617, 1995; и Уатато!о е! а1., К1йпеу 1п!., 45:916-927. В животной модели аутоиммунного нефрита инъекция либо антител к ТРФβ1, либо антисмысловых олигонуклеотидов к соответствующей и РНК ингибировала прогрессирующий гломерулонефрит и накопление внеклеточного матрикса (Вогйег е! а1., №!ите (Ьопйоп), 346:371-374; и Акащ е! а1., К1йпеу 1п!., 50:148-155, 1996).

На основании исследований вытеснения метки с использованием ³Н-пролина определили, что период полужизни коллагена базальных мембран в КБМ крысы находится между 16 и 40 днями (Эака е! а1., №рктоп, 22:522-528, 1978). Это очень медленно относительно обмена гепаринсульфатпротеогликанов (!_1/2 = 20 ч) или других сульфатированных макромолекул в КБМ (!_1/2 = 20-60 ч). Вероятно, что накопление белков базальной мембраны в КБМ в модели Альпортовской мыши (Сокдоте е! а1., Сепек Эеу., 10: 2981-2992, 1996), является результирующим эффектом изменений как в синтезе, так и в распаде этих белков. Из числа протеаз, участвующих в обмене как КБМ, так и мезангиального матрикса, наиболее характерны металлопротеиназы ММР-2 (коллагеназа 72 кДа) и ММР-9 (коллагеназа 92 кДа), а также ММР-3 (стромолизин-1). Эти ферменты разлагают коллаген типа IV в дополнение к разным другим компонентам внеклеточного матрикса.

Мезангиальные клетки (и вероятно другие типы клубочковых клеток) также продуцируют природные ингибиторы металлопротеиназ. Их называют ТИМП (тканевые ингибиторы металлопротеиназ). Они представляют собой гликопротеины с относительно низкой молекулярной массой. Из них ТИМП-1 специфичен к стромолизину и ММР-9, тогда как ТИМП-2 и ТИМП-3 ингибируют ММР-2 (Со1йЬетд е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8οΐ. И8А, 86:8207-8211, 1989; 81акки8 е! а1., I. Вю1. Скет., 266:449-454, 1991; и 8!е!1ет81еуепкоп е! а1., I. Вю1. Скет., 264:17374-17378, 1989).

Вероятно, что модулирование металлопротеиназ и их соответствующих ингибиторов играет роль в поддержании надлежащих уровней обмена КБМ. Хотя о том, какова в клубочке регуляция генов, кодирующих эти белки, известно мало, ключевым аспектом этого процесса может быть передача сигналов через взаимодействие рецепторов-интегринов и внеклеточного матрикса (ВМ).

Сохраняется потребность в животных моделях синдрома Альпорта, особенно такой, в которой развитие заболевания значительно замедлено.

Также сохраняется потребность в новых способах лечения, чтобы лечить заболевания почек, связанные с расширением мезангиального матрикса и прогрессирующим накоплением матрикса в клубочковой базальной мембране и

Ί интерстициально-канальцевом пространстве, в том числе, например, синдром Альпорта и инсулинзависимый сахарный диабет.

Создание указанных моделей и способов лечения, а также фармацевтических композиций, которые могут быть использованы в этих способах, и входило в задачу настоящего изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения

Поставленная задача решается тем, что предложен способ лечения или ограничения расстройства почек у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора рецептора-интегрина α 1β1.

В частности, указанное расстройство почек включает в себя почечный гломерулонефрит, почечный фиброз или оба указанные заболевания.

В конкретном случае почечный гломерулонефрит или почечный фиброз связан с синдромом Альпорта, нефритом при инсулинзависимом сахарном диабете, мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом, мембранозно-пролиферативным гломерулонефритом, серповидным гломерулонефритом, диабетической нефропатией или почечным интерстициальным фиброзом.

Предпочтительно, когда ингибитор рецептора-интегрина α1β1 представляет собой блокирующий агент, который связывается с участком связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки.

Поставленная задача решается также тем, что предложен способ задерживания начала и/или замедления развития синдрома Альпорта у пациента, включающий блокирование участка связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки пациента.

Предпочтительным является указанный способ, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора рецептораинтегрина α 1β1.

Для решения поставленной задачи предложен способ задерживания начала и/или замедления развития заболевания почек при инсулинзависимом сахарном диабете у пациента, включающий блокирование участка связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки пациента.

Предпочтительно блокирование участка связывания рецептора-интегрина α1β1 осуществляют с помощью агента, который содержит пептид, нейтрализующее антитело или протеолитический фрагмент.

Указанный пептид предпочтительно представляет собой по меньшей мере 9-мерный фрагмент белка, выбранного из группы, состоящей из ламинина, фибронектина, энтактина и коллагена типа 4.

Поставленная задача решается также тем, что предложен способ задерживания начала и/или замедления развития синдрома Альпорта у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества агента, который ингибирует передачу сигналов через рецепторинтегрин α1β1 клетки почки.

Предпочтительно все указанные выше способы по изобретению включают дополнительное введение пациенту ингибитора ТРФ-βΙ.

Особенно предпочтительно, когда введение ингибитора рецептора-интегрина α1β1 и ингибитора ТРФ-βΙ осуществляют одновременно или последовательно.

Предпочтительно, чтобы в указанных способах по изобретению ингибитор ТРФ-βΙ необратимо связывался с ТРФ-βΙ и ингибировал его способность связываться со своим рецептором.

Предпочтительно также, чтобы в указанных способах ингибитор ТРФ-βΙ представлял собой агент, который ингибирует способность ТРФ-βΙ передавать сигналы в ядро клетки почки.

Наиболее предпочтительно ингибитор ТРФ-βΙ представляет собой ингибитор кальцийнейрина или химерный слитой белок.

Поставленная задача решается также тем, что предложен способ задерживания начала и/или замедления развития заболевания почек при инсулинзависимом сахарном диабете у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества агента, который ингибирует передачу сигналов через рецептор-интегрин α1β1 клетки почки.

Для решения указанной задачи предложен, кроме того, способ ограничения почечного фиброза у пациента, включающий снижение активности ТРФ-βΙ у пациента при одновременном ингибировании рецепторов-интегринов α 1β1 клеток почки пациента.

Предпочтительным является указанный способ, при котором снижение активности ТРФβ1 осуществляют путем использования агента, который необратимо связывается с ТРФ-βΙ и ингибирует его способность связываться со своим рецептором либо ингибирует способность ТРФ-βΙ передавать сигналы в ядро клетки почки.

Для решения поставленной задачи предложен также способ ограничения почечного фиброза у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора кальцийнейрина.

Предпочтительно ингибитор кальцийнейрина представляет собой такролимус.

В рамках решения поставленной задачи предложена мышиная модель заболевания почек, отличающаяся тем, что мышь не экспрессирует нормальный состав коллагена типа 4 в своей клубочковой базальной мембране и не экспрессирует рецептор-интегрин α 1β1.

Предпочтительной является модель по изобретению, где у мыши не включены в ее клубочковую базальную мембрану цепи коллагена α3(ΐν), α4(ΐν) и α5(ΐν).

Предложен также способ отбора агента для применения в ограничении расстройства почек, включающий введение агента мышиной модели по изобретению и последующую оценку состояния почечной ткани указанной модели.

Дополнительно предложен способ ограничения накопления матрикса в клубочковой базальной мембране (КБМ) у пациента с синдромом Альпорта, включающий снижение у пациента активности ТРФ-βΙ.

Поставленная задача решается также тем, что предложена фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор рецептора-интегрина α1β1 и ингибитор ТРФ-βΙ.

Предпочтительной является фармацевтическая композиция по изобретению, где ингибитор рецептора-интегрина α1β1 представляет собой блокирующий агент, который связывается с участком связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки, более предпочтительно, чтобы указанный агент, блокирующий рецептор-интегрин α1β1, содержал пептид, нейтрализующее антитело или протеолитический фрагмент.

Наиболее предпочтительно указанный пептид представляет собой по меньшей мере 9мерный фрагмент белка, выбранного из группы, состоящей из ламинина, фибронектина, энтактина и коллагена типа 4.

Предпочтительной композицией по изобретению является любая вышеуказанная композиция, где ингибитор ТРФ-[11 необратимо связывается с ТРФ-[11 и ингибирует его способность связываться со своим рецептором, и композиция, где ингибитор ТРФ-[11 представляет собой агент, который ингибирует способность ТРФ-[11 передавать сигналы в ядро клетки почки, предпочтительно ингибитор кальцийнейрина.

Наиболее предпочтительно, когда ингибитор кальцийнейрина представляет собой такролимус.

У мыши с двумя выбитыми генами имеет место задержанное начало протеинурии по сравнению с моделью Альпортовской мыши из предшествующего уровня техники. Более того, эти животные живут почти в два раза дольше, чем Альпортовские животные того же помета. В возрасте около 8 недель, который у Альпортовской мыши является средним возрастом наступления смерти, модель с двумя выбитыми генами демонстрирует заметно сниженную гломерулярную патологию. То есть, при сравнении с Альпортовской мышью того же возраста, мышь с двумя выбитыми генами имеет заметно сниженное ультраструктурное повреждение со значительно меньшим разрежением КБМ и очень малым сглаживанием опорных отростков подоцитов. Также, в КБМ происходит ослабленное накопление фибронектина, ламинина-1 и гепаринсульфатпротеогликана, причем, при сравнении с Альпортовскими мышами, накопление энтактина и коллагена типа IV не изменено. Эти результаты показывают, что существует особая роль рецептора-интегрина α1β1 в патогенезе Альпортовского заболевания почек. Это примечательно с учетом того, что выбивание одного лишь интегрина α1 не оказывает очевидного действия на почечную физиологию или функцию.

Эту мышь можно использовать для изучения синдрома Альпорта, инсулинзависимого сахарного диабета и других расстройств, которые характеризуются гломерулонефритом и/или фиброзом. Эту мышь можно также использовать для отбора агентов, которые можно применять лечения синдрома Альпорта и инсулинзависимого сахарного диабета и других расстройств, которые характеризуются отложением внеклеточного матрикса и/или фиброзом.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 иллюстрирует начало протеинурии у Альпортовских мышей в сравнении с дважды мутантными мышами, которое изучали путем сбора мочи от мышей через недельные интервалы. Цифры указывают возраст мышей (в неделях) во время сбора мочи. А = Альпортовская мышь; Б = дважды мутантная мышь; Мг = стандарты молекулярной массы.

Фиг. 2 иллюстрирует ультраструктурное повреждение клубочковой капиллярной петли у контрольных мышей и у дважды мутантных мышей. Корковое вещество почки от нормальных мышей (А), Альпортовских мышей (Б) и дважды мутантных мышей (В) собирали на седьмой неделе и заключали в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы окрашивали и анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Стрелки обозначают опорные отростки. С = просвет капилляра; и = пространство, занятое мочой. Масштабные штрихи соответствуют 0,5 мкм.

Фиг. 3 представляет результаты иммунофлуоресцентного анализа белков внеклеточного матрикса у нормальных мышей, Альпортовских мышей и дважды мутантных мышей. Замороженные криосрезы коркового вещества почки подвергали взаимодействию с антителами, специфичными к белкам внеклеточного матрикса, которые указаны метками на оси Υ. Проявляли сигнал, используя подходящее меченное флуоресцином второе антитело, накапливали изображения в цифровой форме и обрабатывали с использованием программного обеспечения СуЮгыоп ийга (Аррйеб 1тащпд. 1пс.). Стрелки обозначают клубочковые капиллярные петли. 4А1,2 = цепи коллагена α1(ΐν) и α2(ΐν); Ьат-1 = ламинин-1; Р1Ь = фибронектин; Н8Р = гепаринсульфатпротеогликан; еШ = энтактин. α1+/+ = гомозиготные нормальные по гену интегрина α1; α1-/- = гомозиготные мутантные по гену интегрина α1; α3(ΐν)+/+ = гомозиготные нормальные по гену коллагена α3(ΐν);

α3(ΐν)-/- = гомозиготные мутантные по гену коллагена α3(ΐν).

Фиг. 4 показывает результаты нозернанализа иРНК из общей почки во время развития Альпортовского заболевания почек. Суммарную РНК, выделенную из почек, взятых в указанные (в неделях) моменты времени, фракционировали на денатурирующих агарозных гелях, наносили пятном на нейлон и зондировали мышиными кДНК, кодирующими либо ТРФβ1, либо разные компоненты клубочковой базальной мембраны и/или внеклеточного матрикса. Пробы для получения данных, показанных в панелях, указаны ниже: А, ТРФ-β 1; Б, коллаген α1(ΐν); В, коллаген α2(ΐν); Г, фибронектин; Д, энтактин; Е, цепь ламинина β1; Ж, цепь ламинина β2.

Фиг. 5 иллюстрирует количественный анализ индукции иРНК во время развития Альпортовского заболевания почек. После экспозиции на рентгеновской пленке анализировали мембраны, использованные для получения фиг. 4, с применением фосфовизуализатора ΒίοΚηά С8525. Нанесенные на рисунок цифры указывают кратность индукции специфичных иРНК в Альпортовском образце относительно той, которая наблюдалась у нормальных животных одного помета. Все полосы вычитали по фону. Специфичные проанализированные разновидности иРНК обозначены во вставке.

Фиг. 6 иллюстрирует анализ гибридизацией ίη 8Йи специфических транскриптов у Альпортовских мышей после развития протеинурии. Анализировали почки нормальных животных одного помета (А, Г, Ж и К) наряду с таковыми Альпортовских мышей (Б, Д, З и Л). Антисмысловые зонды были специфичными к домену N01 коллагена α1(ΐν) (А и Б), к ТРФ-31 (Г и Д), к фибронектину (Ж и З), к энтактину (К и Л) или к цепи ламинина β1 (Н и О). В качестве контроля на неспецифическое связывание использовали зонд, специфичный к бактериальной β-галактозидазе (В, Е, И, М и П).

Фиг. 7 иллюстрирует иммунопероксидазное окрашивание на ТРФ-β 1 в срезах тканей от нормальных и Альпортовских мышей. Окрашивали заключенные в парафин срезы на активную форму ТРФ-β 1 с применением иммунопероксидазной детекции. Р = подоциты; М = мезангиальные клетки.

Фиг. 8 иллюстрирует анализ детекции РНКазой на иРНК ТРФ[Л в корковом веществе почки нормальных людей и людей с синдромом Альпорта. Выделяли суммарную РНК из коркового вещества почки нормальных людей и людей с синдромом Альпорта и подвергали по 10 мкг каждой из РНК анализу, основанному на защите от РНКазы, используя в качестве зонда меченную радиоактивным изотопом часть антисмысловой иРНК ТРФ-β 1 человека.

Результатом определения был защищенный фрагмент размером 264 пары оснований. Маркерами молекулярной массы являются меченные радиоактивным изотопом ΡΒΚ.322, разрезанные с использованием Μ8Ρ1, и для сравнения обозначены соответствующие фрагменты. N = норма; А = Альпорт.

Фиг. 9 иллюстрирует нозерн-блоттинг РНК из коркового вещества почки нормальных и Альпортовских мышей, а также мышей без интегрина α1 и мышей без интегрина α1 и коллагена α3(ΐν). Суммарную РНК выделяли из коркового вещества почки мышей (из одного помета) в возрасте 7 недель с указанными генотипами: +/+ = нормальные по обеим аллелям, -/- = мутантные по обеим аллелям.

Фиг. 10 представляют собой микрофотографию, полученную просвечивающей электронной микроскопией, КБМ Альпортовского животного в возрасте 7 недель, которому сделали инъекцию нейтрализующего антитела, специфичного к интегрину α1. Обратите внимание на регулярный трехслойный вид КБМ и отсутствие фокально утолщенных участков. Увеличение х 10500.

Фиг. 11 иллюстрирует влияние ингибиторов ТРФ-β 1 на ультраструктуру КБМ Альпортовской мыши 1298ν/1. Животных подвергали действию либо ЕК506, либо растворимого рецептора ТРФ-β 1. Корковое вещество почки заключали в эпоксидную смолу, нарезали, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали просвечивающей электронной микроскопией. А = контроль; Б = Альпортовские, не подвергнутые воздействию; В = Альпортовские, подвергнутые воздействию ЕК506; Г = Альпортовские, подвергнутые воздействию растворимого рецептора ТРФ-β 1. Увеличение х11000.

Фиг. 12 представляет собой полученную сканирующей электронной микроскопией микрофотографию клубочков Альпортовских мышей 1298ν/1, подвергнутых воздействию, в сравнении с таковыми, не подвергнутыми воздействию. Корковое вещество почки мышей лиофилизировали, скалывали и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, использованных для фиг. 11, и идентифицировали обнаженные клубочки и фотографировали, используя сканирующий электронный микроскоп. А = контроль; Б = Альпортовские без инъекции; В = Альпортовская мышь, подвергнутая воздействию растворимого рецептора ТРФ-β 1. Увеличение х2500.

Фиг. 13 демонстрирует влияние воздействия лекарственными средствами на альбумин в моче у Альпортовских мышей 129 δν/Ι. Во время воздействия лекарственными средствами мочу собирали, лиофилизировали и эквивалент

0,5 мкл фракционировали на полиакриламидном геле. Окрашивали гели кумасси голубым и визуализировали. Первые две дорожки представляли контроли без инъекций, следующие две (группа I) инъекцию ЕК606, и третьей группе (группа II) делали инъекции растворимого рецептора ТРФ-βΙ. Цифры внизу представляют возраст мышей в неделях во время сбора мочи. С = контроль; А = Альпорт.

Фиг. 14 иллюстрирует влияние ингибиторов ТРФ-βΙ на ультраструктуру КБМ у мышей с двумя выбитыми генами. Животных не подвергали воздействию или их подвергали воздействию либо ЕК506, либо растворимого рецептора ТРФ-βΙ. Корковое вещество почки заключали в эпоксидную смолу, нарезали, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали просвечивающей электронной микроскопией. А = контроль без инъекций; Б = два выбитых гена без инъекций; В = два выбитых гена, действие ЕК506; Г = два выбитых гена, действие растворимого рецептора для ТРФ-βΙ. Увеличение х8000.

Фиг. 15 иллюстрирует пример нормальной клубочковой формы у мыши в возрасте 10 недель с двумя выбитыми генами, подвергнутой воздействию ингибиторов ТРФ-βΙ. Примерно 25% клубочков у мышей, подвергнутых воздействию любого из ингибиторов ТРФ-βΙ, были морфологически неотличимыми от таковых у контрольных животных. Животных не подвергали воздействию или их подвергали воздействию ЕК506. Корковое вещество почки заключали в эпоксидную смолу, нарезали, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали просвечивающей электронной микроскопией. А = контроль без инъекций; Б = два выбитых гена, действие ЕК506.

Фиг. 16 демонстрирует влияние воздействия лекарственными средствами на альбумин в моче у мышей с двумя выбитыми генами. Во время воздействия лекарственными средствами, мочу собирали и лиофилизировали и эквивалент 0,5 мкл фракционировали на полиакриламидном геле. Окрашивали гели кумасси голубым и визуализировали. Возраст мышей (в неделях) во время сбора мочи указан внизу рисунка. А = два выбитых гена без инъекций; Б = два выбитых гена, инъекции растворимого рецептора; В = контрольная мышь, инъекция ЕК506; Г = два выбитых гена, инъекция ЕК506.

Фиг. 17 представляет собой полученную сканирующей электронной микроскопией микрофотографию клубочков Альпортовских мышей в сравнении с мышами с двумя выбитыми генами. Корковое вещество почки животных в возрасте 7 недель лиофилизировали, скалывали и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, и обнаженные клубочки идентифицировали и фотографировали, используя сканирующий электронный микроскоп. А = контроль; Б =

Альпорт; В = два выбитых гена.

Фиг. 18 показывает двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на цепь ламинина α2 у нормальных и мутантных мышей. Клубочковую базальную мембрану окрашивали в зеленый цвет, используя специфичные к энтактину первые антитела и меченные флуоресцином вторые антитела. Цепь ламинина α2 окрашивали в красный цвет, используя меченные техасским красным вторые антитела. Совместная локализация в капиллярных петлях приводит к желтой окраске. Группа I представляют собой клубочки от мышей в возрасте 7 недель; А = контроль без инъекций; Б = Альпортовские без инъекций; В = Альпортовские, инъекция растворимого рецептора; Г = два выбитых гена, без инъекций. Группа II представляет собой клубочки от мышей в возрасте 2 недель; А = контроль; Б = Альпортовские. Стрелки обозначают иммуноокрашивание в капиллярных петлях клубочков.

Фиг. 19 представляет собой полученную просвечивающей электронной микроскопией микрофотографию КБМ нормальной мыши в возрасте 2 недель в сравнении с Альпортовской мышью. Корковое вещество почки заключали в эпоксидную смолу, нарезали, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали просвечивающей электронной микроскопией. А = контроль; Б = Альпортовские.

Фиг. 20 демонстрирует влияние ингибиторов ТРФ-[И на происходящую в почках экспрессию РНК, кодирующих молекулы клеточного матрикса или ингибиторы металлопротеиназ, у нормальных мышей в сравнении с Альпортовскими. Выделяли суммарную РНК из почек нормальных (С) или Альпортовских (А) мышей в возрасте 7 недель, подвергнутых (I) или не подвергнутых (N1) воздействию ЕК506. Фракционировали РНК на денатурирующих агарозных гелях и анализировали гибридизацией с меченными радиоактивным изотопом зондами, кодирующими либо молекулы внеклеточного матрикса, либо ингибиторы металлопротеиназ. После гибридизации промывали мембраны и экспонировали на рентгеновской пленке. Использованные зонды указаны слева от панелей. аЩУ) = коллаген а1(ГУ); ίη = фибронектин; сп1 = энтактин; Τίιηρ2 = ингибитор металлопротеиназ ТИМП-2; Τίιηρ3 = ингибитор металлопротеиназ ТИМП-3.

Фиг. 21 демонстрирует влияние ингибиторов ТРФ-[И на происходящую в почках экспрессию РНК, кодирующих молекулы клеточного матрикса или ингибиторы металлопротеиназ, у нормальных мышей в сравнении с мышами с двумя выбитыми генами. Выделяли суммарную РНК из почек нормальных мышей (С) или мышей с двумя выбитыми генами (Око) в возрасет 10 недель, подвергнутых воздействию ЕК506 (I) или растворимого рецептора ТРФ-[И (II) или не подвергнутых воздействию (N1). Фракционировали РНК на денатурирующих агарозных гелях и анализировали гибридизацией с меченными радиоактивным изотопом зондами, кодирующими либо молекулы внеклеточного матрикса, либо ингибиторы металлопротеиназ. После гибридизации промывали мембраны и экспонировали на рентгеновской пленке. Использованные зонды указаны слева от панелей. αΐ(ΐν) = коллаген αΐ(ΐν); ίη = фибронектин; ей! = энтактин; Т1тр2 = ингибитор металлопротеиназ ТИМП-2; Т1тр3 = ингибитор металлопротеиназ ТИМП-3.

Фиг. 22 иллюстрирует ингибирование накопления матрикса в интерстициальноканальцевом пространстве мышей с двумя выбитыми генами при использовании ингибиторов ТРФ-βΙ. Заключали в пластик почки нормальных мышей или мышей с двумя выбитыми генами в возрасте десяти недель и окрашивали срезы толщиной 1 мкм, применяя метод Джонса с метенамином серебра. А = нормальная почка; Б= почка мыши с двумя выбитыми генами, без инъекций; В = почка мыши с двумя выбитыми генами, воздействие ЕК506; Г = почка мыши с двумя выбитыми генами, воздействие растворимого рецептора ТРФ-β 1.

Фиг. 23 иллюстрирует ингибирование накопления коллагена типа I в интерстициальноканальцевом пространстве мышей с двумя выбитыми генами при использовании ингибиторов ТРФ-βΙ. Заключали в пластик почки нормальных мышей или мышей с двумя выбитыми генами в возрасте десяти недель и проводили иммуноокрашивание срезов толщиной 1 мкм, используя антитела, специфичные к коллагену типа I. Окрашивание проявляли, используя набор для окраски стрептавидином АЕС Хес!ог 1аЬога1опе8). А = нормальная почка; Б = почка мыши с двумя выбитыми генами, без инъекций; В = почка мыши с двумя выбитыми генами, воздействие ЕК506; Г = почка мыши с двумя выбитыми генами, воздействие растворимого рецептора ТРФ-β 1.

Фиг. 24 иллюстрирует ингибирование накопления фибронектина в интерстициальноканальцевом пространстве мышей с двумя выбитыми генами при использовании ингибиторов ТРФ-βΙ. Заключали в пластик почки нормальных мышей или мышей с двумя выбитыми генами в возрасте десяти недель и проводили иммуноокрашивание срезов толщиной 1 мкм, используя антитела, специфичные к фибронектину. Окрашивание проявляли, используя набор для окраски стрептавидином АЕС Хес!ог 1аЬогаФпек). А = нормальная почка; Б = почка мыши с двумя выбитыми генами, без инъекций; В = почка мыши с двумя выбитыми генами, воздействие ЕК506; Г = почка мыши с двумя выбитыми генами, воздействие растворимого рецептора ТРФ-βΙ.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Согласно настоящему изобретению предложены способы лечения, которые воздействуют на тот механизм почечного заболевания (т.е. заболевания почек), который может существенно замедлить начало и/или развитие болезненных состояний, каких как гломерулонефрит и почечный фиброз. Считается, что способы по настоящему изобретению могут даже реверсировать такие состояния. В частности, согласно этому изобретению предложены способы для лечения заболевания почек, связанного с присутствием риска или увеличенным риском развития гломерулонефрита и почечного фиброза в клубочках почек, такого, который появляется при мезангиальном пролиферативном гломерулонефрите, мембранозно-пролиферативном гломерулонефрите, серповидном гломерулонефрите, диабетической нефропатии и почечном интерстициальном фиброзе. Гломерулонефрит включает в себя повреждение клубочков, в типичных случаях связанное с неровностями мембраны, представляющими собой утолщение, утончение и/или расщепление КБМ. Это может завершаться в общем пути интерстициально-канальцевого фиброза. Эти состояния в типичных случаях характеризуются появлением миофибробластов и накоплением матрикса (включающего в себя коллаген типа I, фибронектин, ламинин и коллаген типа IV) в интерстициально-канальцевом пространстве. Эффективность терапевтических агентов, применяемых в способах по настоящему изобретению, можно определить, оценив одну или более чем одну из этих характеристик.

Согласно данному изобретению также предложена мышиная модель для исследования способов и отбора агентов для лечения пациентов с заболеванием почек, связанного с наличием риска или повышенным риском развития накопления внеклеточного матрикса вообще и, в частности, в почечных клубочках и интерстициально-канальцевом пространстве. Так, в одном воплощении, согласно настоящему изобретению предложена мышиная модель синдрома Альпорта. Эта мышиная модель включает в себя инактивированный рецептор-интегрин α 1β1 в комбинации с инактивированной молекулой коллагена (типа IV). В предпочтительном воплощении, молекулу коллагена (типа IV) инактивируют прекращением экспрессии субъединицы α3 коллагена (типа IV). В результате этого у такой мыши не включены в КБМ цепи коллагена «ЗВ V), а4(Щ) или а5(Щ).

Эту мышиную модель можно использовать в способах для тестирования агентов для лечения почечной дисфункции, как она случается при синдроме Альпорта, инсулинзависимом сахарном диабете или других заболеваниях почек, где раннее заболевание характеризуется расширением мезангиального матрикса и пролиферацией мезангиальных клеток в сочетании с повреждением клубочковой базальной мембраны, которое характеризуется утолщением, утончением, расщеплением базальной мембраны и сглаживанием опорных отростков подоцитов или любой комбинацией вышеуказанного.

В предпочтительном воплощении, согласно этому изобретению предложены ингибиторы для блокирования или инактивирования иным образом функции рецептора-интегрина α 1β1 в качестве способа задерживания начала (определяемого по появлению альбумина в моче) или замедления развития (определяемого по скорости, с которой увеличивается уровень сывороточного альбумина в моче) или даже реверсирования (как это определяют по скорости, с которой увеличивается уровень сывороточного альбумина в моче) гломерулонефрита и/или фиброза (с проявлениями в виде появления миофибробластов и накопления внеклеточного матрикса, в том числе ламинина, фибронектина, коллагена типа 1 и коллагена типа IV, в интерстициально-канальцевом пространстве) при развитии гломерулярного заболевания. Можно применять множество разных агентов, синтетических или природных, которые подробнее описаны ниже.

Еще в одном воплощении это изобретение направлено на роль ТРФ-βΙ в патогенезе заболевания почек, представляющего собой синдром Альпорта, и других таких заболеваний почек. В использованных здесь мышиных моделях наблюдают резко выраженное увеличение уровней иРНК для ТРФ-βΙ после начала протеинурии. Гибридизация ίη ЙШ показывает, что подоциты, которые продуцируют мало иРНК для ТРФ-βΙ или не продуцируют ее до начала протеинурии, экспрессируют избыток иРНК для ТРФ-βΙ после начала протеинурии вплоть до конечной стадии почечной недостаточности. Примерно в то же время наблюдают активацию иРНК, кодирующих фибронектин, СОЬ4А1 и СОЬ4А2 и энтактин. Поэтому способы уменьшения уровня ТРФ-β 1 представляют собой еще один механизм лечения почечных состояний, таких как гломерулонефрит и/или фиброз. Эффекты ингибирования активности ТРФ-β 1 можно измерять, определяя момент времени появления (начала) или скорость увеличения альбумина в моче и/или появления миофибробластов (в интерстициально-канальцевом пространстве) и/или накопления молекул внеклеточного матрикса в КБМ и интерстициально-канальцевом пространстве.

В другом воплощении, посредством применения ингибиторов ТРФ-β 1 у Альпортовых мышей, не имеющих интегрин α1, это изобретение направлено на синергизм комбинационного лечения ингибиторами интегрина α1β1 и ингибиторами ТРФ-β 1 в том, что касается замедления начала и развития гломерулонефрита и/или предотвращения фиброза.

Мышиная модель.

Важным аспектом ведения пациентов с синдромом Альпорта и другими заболеваниями, которые связаны с прогрессирующим повреждением клубочков, связанным с проявлениями неровностей КБМ, представляющих собой утолщение, утончение или расщепление, и завершающим в общем пути интерстициальноканальцевого фиброза, как это характеризуется появлением миофибробластов и накоплением матрикса (в том числе коллагена типа I, фибронектина, ламинина и коллагена типа IV) в интерстициально-канальцевом пространстве, является определение причины и/или механизма развития заболевания. Например, при том, что мутации в генах коллагена α3(ΐν) или α4(ΐν) приводят к аутосомным рецессивным формам синдрома Альпорта, а мутации в гене α5(ΐν) приводят к форме этого заболевания, связанного с Х-хромосомой, эти мутации сами по себе не вызывают прогрессирующую почечную недостаточность. Представляется, что вместо этого отсутствие коллагена α3(ΐν), α4(ΐν) или α5(ΐν) приводит к персистенции той КБМ, которая подобна эмбриональной и состоит из цепей коллагена α1(ΐν) и α2(ΐν). Эта подобная эмбриональной КБМ является подходящим клубочковым фильтром примерно в первой декаде жизни у людей (или около первых трех недель у мышиной модели). Однако после этого времени КБМ, подобная эмбриональной, не представляется функционирующей эффективно. Например, у одного из пациентов с синдромом Альпорта ультраструктурные исследования КБМ 9летнего пациента с синдромом Альпорта выявили относительно нормальную ультраструктуру (СапдюФ с1 а1., №рйго1. Л1а1. Тгап§р1ап1., 11:1829-1834, 1996). Однако ультраструктура КБМ того же пациента в возрасте 18 лет указывала на далеко зашедший Альпортовский гломерулонефрит.

При синдроме Альпорта базальная мембрана у людей относительно нормальна вплоть до возраста от пяти до десяти лет, когда потерю целостности базальной мембраны можно отслеживать по прогрессирующему увеличению альбумина в моче. Исследования с применением биопсии подтвердили то, что ультраструктура базальной мембраны у пациентов с синдромом Альпорта до протеинурии является нормальной. В ультраструктурном отношении свидетельством заболевания КБМ являются нерегулярные утолщение и утончение КБМ. Считают, что расщепление этой мембраны является причиной микрогематурии (т. е. небольшого числа эритроцитов, определяемых в моче), наблюдаемой наряду с протеинурией.

О механизме начала и развития заболевания почек Альпорта известно мало, однако, предполагают, что накопление компонентов

КБМ и разрежение КБМ может происходить из19 за увеличенной подверженности мембраны протеолизу и/или увеличенного синтеза молекул матрикса вследствие изменений нормальных регуляторных путей.

Таким образом, из-за ограничений, свойственных исследованиям образцов от людей, существует потребность в модели синдрома Альпорта. Люди проявляют диапазон тяжести в развитии этой болезни, предположительно из-за различий в генетическом фоне. Значительные исследования, которые направлены на молекулярную природу начала и развития этого заболевания, по логике, не возможны на людях, что замедляет прогресс исследований заболевания почек Альпорта.

Мышиную модель аутосомного синдрома Альпорта получили направленным мутагенезом гена, кодирующего цепь α3(ΐν) коллагена типа

IV (Сокдгоуе е! а1., Сепек Оеуе1., 10:2981-2992, 1996). У этой животной модели развивался прогрессирующий гломерулонефрит. Ультраструктурные изменения в КБМ наблюдались уже в возрасте одной недели. Эта мышь называется здесь Альпортовской мышью.

Также получили мышь направленным мутагенезом гена, кодирующего субъединицу α1 рецептора-интегрина (Сагдиег е! а1., Эеу. Βίο1., 175:301-313, 1996). Эта субъединица интегрина образует гетеродимер с субъединицей (31 интегрина с образованием биологически активного гетеродимера-интегрина α1β1, который в почечном клубочке обнаруживается на поверхности мезангиальных клеток. Рецептор-интегрин α1β1 является единственным рецептороминтегрином, обнаруживаемом в мезангиальном матриксе, где он локализован исключительным образом. Кроме измененной адгезии фиброцитов к коллагеновому матриксу, эта мышь с выбитым геном не имеет очевидного фенотипа. Она развивается нормально, фертильна и проживает нормальную продолжительность жизни.

V этих мышей нет почечной недостаточности и видимых отличий молекулярного состава или ультраструктуры клубочков. Поскольку гетеромерный рецептор-интегрин α1β1 является единственным рецептором-интегрином, идентифицированным на поверхности мезангиальных клеток в почечном клубочке, было неожиданным то, что отсутствие этого рецептора не сказывалось на нормальном развитии почек и/или на их функции. Из этого следует, что он либо не требуется, либо его отсутствие может быть компенсировано резервными путями.

Согласно настоящему изобретению предложена новая мышиная модель с двумя выбитыми генами (т.е. дважды мутантная). Ее вывели скрещиванием линии мышей, имеющих выбитый α1, с линией мышей, имеющих выбитый коллаген α3(ΐν) (Альпортовская мышь), с получением мутантов, не имеющих как гена субъединицы α1 рецептора-интегрина, так и гена коллагена α3(ΐν). Хотя отсутствие рецептораинтегрина α1β1, вероятно, не играет роли в нормальном развитии почек и их нормальной функции, но из-за того, что мезангиальный матрикс является местом синтеза металлолпротеиназ и цитокинов, таких как ТРФ-βΕ а ранние стадии гломерулонефрита Альпорта включают в себя пролиферацию мезангиальных клеток и расширение мезангиального матрикса, считают, что рецептор-интегрин α1β1 может иметь особую роль в патогенезе почек. И действительно, особенно исключительны и важны исследования животных с двумя выбитыми генами α1интегрина и коллагена α3(ΐν). Нижеследующее обсуждение описывает многие характеристики мыши с двумя выбитыми генами по настоящему изобретению.

Хорошей общей оценкой целостности почечного фильтра является протеинурия (т.е. присутствие избытка сывороточных белков в моче). Как иллюстрирует фиг. 1, при двух выбитых генах начало протеинурии задержано по меньшей мере на одну неделю и достигает пика в срок между 9 и 9,5 неделями в отличие от срока от 6 до 6,5 недель у животных одного помета, являющихся Альпортовскими (т.е. не имеющих гена колагена α3(ΐν), но имеющих ген субъединицы α1 интегрина). Начало и скорость увеличения протеинурии (т.е. наличия сывороточного альбумина в моче) являются хорошим показателем для оценки эффективности способов по настоящему изобретению. Уровни сывороточного альбумина можно легко измерять либо гельэлектрофорезом и окрашиванием с помощью кумасси голубого (при разгонке эквивалента 1 мкл мочи) либо имеющимися в продаже тестами в виде палочек. Средний возраст наступления смерти из-за почечной недостаточности у Альпортовских мышей составляет от 8 до 9 недель независимо от того, представляет ли собой генетический фон мышей 1298ν/1 или 1298ν (для того, чтобы установить эту точку по меньшей мере по десять мышей, с каждым из генетических фонов получили возможность дойти до конечной стадии). Мыши с двумя выбитыми генами живут в среднем до возраста от около 15 недель до около 16,5 недель.

Поэтому удаление рецептора-интегрина α1β1 оказывало заметное действие на начало и развитие заболевания Альпорта. Более того, мыши без рецептора α1β1 имели улучшенную функцию клубочков по сравнению с другими протестированными мышами. У животных, которые не экспрессировали ген α3(ΐν) и были гетерозиготными по мутации, представляющей собой выбитый ген α1, имело место промежуточное улучшение функции клубочков и развития заболевания, что иллюстрирует зависимое от дозы действие интегрина α1 на развитие заболевания Альпорта (т.е. снижение экспрессии интегрина α1 наполовину приводило к защит ному эффекту, который находится между таковым у Альпортовой мыши и у животного с двумя выбитыми генами). Это промежуточное защитное действие у Альпортовских мышей, гетерозиготных по мутации интегрина α1, иллюстрирует то, что частичное ингибирование рецептора-интегрина α1β1 производит полезные преимущества. Это открытие является значительным, поскольку оно применимо к способам лечения, которые включают в себя ингибирование рецептора-интегрина α1β1 в применении к людям.

На почках от мышей в возрасте 7 недель, которые были либо нормальными по обеим аллелям (контроль), имели нуль-мутации по коллагену α3(ΐν) и были нормальными по интегрину α1 (Альпорт), или имели нуль-мутации как по коллагену α3(ΐν), так и по интегрину α1 (с двумя выбитыми генами), был проведен анализ просвечивающей электронной микроскопией. Этот момент времени был выбран потому, что в этом возрасте Альпортовские мыши приближаются к конечной стадии. Панели, выбранные для фиг. 2, репрезентативны по меньшей мере для пяти разных клубочковых полей. Как иллюстрирует фиг. 2, клубочковая капиллярная петля нормальной мыши (фиг. 2А) имела трехслойную базальную мембрану с однородной толщиной и регулярными опорными отростками (опорные отростки на всех трех панелях обозначены стрелками). Капиллярная петля Альпортовской мыши (фиг. 2Б) демонстрировала разреженную базальную мембрану с фокальным утолщением и утончением (что характерно для далеко зашедшего заболевания). Опорные отростки были разбухшими и выглядели слитыми друг с другом, что является свойством, которое считают влияющим на эффективность почечной фильтрации. У животного с двумя выбитыми генами (фиг. 2В) базальная мембрана была поражена гораздо меньше, чем у Альпортовской мыши (фиг. 2Б). При том, что базальная мембрана была тоньше, чем у контроля, она была значительно менее разреженной, и опорные отростки подоцитов выглядели в значительной степени нормальными. У Альпортовской мыши около 40% клубочков были фиброзными, тогда как у дважды мутантного животного фиброзными были только 5%.

Иммунофлуоресцентный анализ выполняли с использованием замороженного коркового вещества почки, взятого от тех же животных, которых использовали для фиг. 2. Эту ткань подвергали взаимодействию с антителами, специфичными к белкам, известным их накоплением в КБМ в зависимости от развития заболевания Альпорта. Результаты, которые показывает фиг. 3, иллюстрируют то, что распределение цепей коллагена СОЬ 4А1 (α1(ΐν)) и 4А2 (α2(ΐν)) было одним и тем же как в Альпортовском клубочке, так и в клубочке дважды му тантного животного. В обоих случаях капиллярные петли (обозначенные на всех панелях фиг. 3 стрелками) и мезангиальный матрикс были позитивными (фиг. 3Б, 3В). Ламинин-1 демонстрировал заметное накопление в КБМ Альпортовской мыши при сравнении с контролем (сравните фиг. 3Г с 3Д), однако, у дважды мутантного животного (фиг. 3Е) накопление ламинина-1 было заметно ослабленным в сравнении с таковым в Альпортовских клубочках. В норме фибронектин локализован исключительно в мезангиальном матриксе, но у Альпортовских мышей было найдено, что он локализован в КБМ, а так же в мезангиальном матриксе (фиг. 3З). Удивительно, что у дважды мутантного животного накопление фибронектина в капиллярных петлях не наблюдается (фиг. 3И). Этот результат был весьма воспроизводимым. Напротив, окрашивание на гепаринсульфатпротеогликан показало ослабленное окрашивание в мезангиальном матриксе дважды мутантного животного (фиг. 3М) при сравнении либо с контролем (фиг. 3К), либо с Альпортовской мышью (фиг. 3Л). Накопление энтактина в КБМ наблюдали в образцах как от Альпортовских животных, так и от дважды мутантных животных, при отсутствии заметных отличий между ними (фиг. 3О и 3П).

Все вместе эти данные иллюстрируют то, что у дважды мутантного животного нульмутация по α1 приводит к замедлению развития заболевания почек Альпорта. Это ясно как на физиологическом (задержанное начало протеинурии, как показывает фиг. 1), так и ультраструктурном (сниженное повреждение КБМ и сглаживание опорных отростков, как показывает фиг. 2) уровнях. Исследования с помощью иммунофлуоресценции, представленные фиг. 3, иллюстрируют то, что элиминация рецептораинтегрина α1β1 приводит к специфическим изменениям в накоплении компонентов внеклеточного матрикса как в КБМ, так и в мезангиальном матриксе. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя способы лечения, при которых блокируют участок связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки. Такие способы лечения более детально описаны ниже.

Более того, фиг. 9 показывает, что при том, что у Альпортовской мыши индуцирован цитокин ТРФ-βΓ он не индуцирован у Альпортовских мышей, которые имеет также и мутацию интегрина α1. Таким образом, при отсутствии интегрина α1β1 индукция ТРФ-[Л не наблюдается, что является причиной снижения накопления матрикса в клубочковой базальной мембране и, таким образом, значительного снижения скорости, с которой прогрессирует это заболевание почек. Эта роль ТРФ-[Л при заболевании почек обсуждена более детально в следующем разделе.

Роль ТРФ-βΙ.

Приведенные здесь данные ясно доказывают, что в использованной здесь мышиной модели ТРФ-βΙ индуцирован в специфическом типе клубочковых клеток (подоцитах). Индукция иРНК ТРФ-βΙ отражается индукцией генов, кодирующих молекулы матрикса, известные их накоплением в клубочковой базальной мембране в зависимости от прогрессирующего гломерулонефрита в этой модели (например, ламинин, фибронектин, энтактин, коллаген типа IV). Более того, приведенные здесь данные показывают, чтоТРФ-βΙ индуцирован в человеческом Альпортовском корковом веществе почки. Это подтверждает пригодность этой животной модели в смысле ее способности имитировать то, что происходит в человеческой Альпортовской почке.

Для того чтобы продемонстрировать роль ТРФ-βΙ, выделяли суммарную РНК из почек Альпортовских животных и зондировали меченными радиоактивным изотопом зондами, специфичными по отношению либо к цепям коллагена αΐ(ΐν) или α2(ΐν), энтактину, цепям ламинина βΐ или β2, фибронектину, либо ТРФβΐ. Результаты, показанные на фиг. 4, иллюстрируют то, что в модели Альпортовской мыши иРНК для всех этих белков за исключением лиминина βΐ индуцированы после начала протеинурии. Для того же промежутка времени были проведены анализы нозерн-блоттингом на ламинин αΐ, ламинин β2, ламинин γΐ, коровый белок гепаринсульфатпротеогликана и цепи коллагена α4(ΐν) и α5(ΐν). При сравнении контроля с мутантом не было заметных различий между уровнями иРНК для этих других белков базальной мембраны.

Результаты анализа нозерн-блоттингом были проанализированы, чтобы непосредственно получить количественную оценку относительных изменений в экспрессии специфичных иРНК в этот период времени. Фиг. 5 иллюстрирует то, что индукция специфичных иРНК впервые становится заметной в возрасте шести недель. К восьми неделям уровни иРНК достигают пика, причем иРНК, кодирующие ТРФ-βΐ и фибронектин, индуцированы до уровней в 6,6 и 9,4 раза соответственно, выше, чем у контрольных мышей. К восьмой неделе уровни иРНК для коллагена αΐ(ΐν), α2(ΐν) и энтактина были все индуцированы примерно в три раза. Напротив, ни в один из моментов развития заболевания почек не наблюдались значительные изменения иРНК, кодирующих цепи ламинина βΐ и β2, как определено нозерн-блоттингом тех же самых суммарных РНК.

Клубочки составляют только небольшую часть суммарной массы почки. Индивидуальные типы клеток в клубочках составляют еще меньшие части. Поэтому маловероятно, что нозернблоттинг суммарных РНК почек выявляет индукцию иРНК, которые специфичны для клубочков или для конкретного типа клубочковых клеток. Для того чтобы проверить, были ли иРНК, кодирующиеТРФ-βΐ или разные компоненты базальной мембраны, индуцированы в конкретных типах клубочковых клеток, проводили гибридизацию ίη δίΐιι. используя меченные дигоксигенином антисмысловые зонды, специфичные для этих иРНК. Результаты показаны на фиг. 6. У нормальных мышей транскрипты для ТРФ-βΐ (фиг. 6Г), фибронектина (фиг. 6Ж) и ламинина βΐ (фиг. 6Н) локализованы исключительно в мезангиальных клетках, тогда как у Альпортовских мышей те же самые транскрипты (фиг. 6Д, 6З и 6О соответственно) четко локализованы в подоцитах (кольцо клеток на внешней части клубочка), что иллюстрирует активацию генов в этом типе клубочковых клеток. Также видна активация коллагена αΐ(ΐν) в подоцитах (сравните фиг. 6Б и 6 А). Активация генов, кодирующих белки матрикса в клубочковых подоцитах, может приводить к изменениям состава КБМ.

Данные о белке ТРФ-βΐ, основанные на иммунопероксидазной детекции с использованием антител, специфичных по отношению к активной изоформе этого цитокина, подтверждают данные, полученные анализом на иРНК ТРФ-βΐ, который представляет собой гибридизацию ίη 8Йи. Данные, которые показаны на фиг. 7, иллюстрируют то, что повышенная экспрессия иРНК ТРФ-βΐ в подоцитах транслируется в повышенный уровень белка.

Поскольку получали данные для ТРФ-βΐ с использованием мышиной модели для определения, являются ли уровни иРНК для этого цитокина повышенными также и в человеческом корковом веществе почки из пациентов с болезнью Альпорта в сравнении с таковой из контрольных пациентов, выполняли анализ, представляющий собой защиту от РНКазы.

Данные, которые показаны на фиг. 8, иллюстрируют повышение иРНК ТРФ-βΐ в человеческом Альпортовском корковом веществе почки в 3-4 раза относительно контроля. Это доказывает, что этот цитокин чрезмерно экспрессируется также и в человеческих Альпортовских почках. Таким образом, ингибирование активности ТРФ-βΐ дает разумный протокол лечения синдрома Альпорта, в частности, для ограничения и предпочтительно даже предотвращения накопления матрикса в КБМ.

Как обсуждено выше, на фиг. 9 показано, что, тогда как ТРФ-βΐ индуцирован у Альпортовой мыши, он не индуцирован в мышах с двумя выбитыми генами, которые имеют также и мутацию интегрина αΐ. Таким образом, в отсутствие интегрина αΐβΐ индукция ТРФ-βΐ не наблюдается, что является причиной снижения накопления матрикса в клубочковой базальной мембране и, таким образом, значительного сни25 жения скорости, с которой прогрессирует это заболевание почек.

Важно, что блокирование (или иная инактивация) рецептора αΐβΐ-интегрин, и ингибирование ТРФ-βΙ синергичны в смягчении начала и развития заболевания почек (в частности, заболевания почек Альпорта) и/или его реверсирования. Этот синергический эффект продемонстрирован с использованием, в качестве примеров, двух разных агентов, которые блокируют активность ТРФ-βΙ тремя разными путями. Оба они были исследованы с целью доказательства, что эти результаты имели место из-за ингибирования активности ТРФ-βΙ, а не из-за побочных эффектов воздействия лекарственными средствами.

Первым примером является лекарственное средство, которое производит Бирзата Рйагтасеибса1 Со., Пб.. Осака, Япония, и которое называется такролимус или БК506. Это лекарственное средство обычно используют как иммуносуппрессор, чтобы предотвращать отторжение органа после трансплантации. Оно действует, ингибируя существенно важную субъединицу Т-клеточного рецептора, называемого кальцийнейрином, который является серин-треонинфосфатазой и существенно важным компонентом передачи сигналов Т-клеточного рецептора. Как было рассмотрено недавно (СгаЫгее, Се11, 96:611-614, 1999), кальцийнейрин является субъединицей многих разных рецепторов. Об одном из этих рецепторов недавно сообщено, что это рецептор для ТРФ-β 1 (Уапд е1 а1., Се11, 86:435-444, 1996). Лекарственное средство

БК506 было протестировано в качестве ингибитораТРФ-βΡ Таким образом, воздействие на мышей подходящей дозой БК506 должно ингибировать передачу сигнала от рецепторов типа Ι/типа II для ТРФ-β 1.

Поскольку у БК506 есть другие биологические эффекты кроме ингибирования ТРФ-β 1 (самый примечательный из них состоит в сильной иммуносупрессии посредством ингибирования Т-клеточных рецепторов), была проведена оценка второго ингибитора ТРФ-β 1. Этим вторым ингибитором является экспериментальное лекарственное средство, которое разрабатывается в Вюдеп 1пс., СатЬпбде, МА. Это лекарственное средство является конкурентным ингибитором этого цитокина, впитывающим активный цитокин в виде неактивного комплекса с растворимым рецептором. Это растворимый химерный УРФ^/РИЛд^ (иммуноглобулин С1) мышиный слитой белок (см. Международную публикацию УО 98/48024). В описанных экспериментах в хвостовую вену мыши дважды в неделю делали инъекции двадцати пяти микрограммов этого ингибитора.

Поскольку характер активности и потенциальные побочные эффекты БК506 и растворимого ингибитора ТРФ-β 1 от Вюдеп столь различны, сделан вывод, что одинаковые наблюдения, сделанные с обоими лекарственными средствами на животных модельных системах являются следствием ингибирования активности ТРФ-βΕ

Провели два типа экспериментов. Для того чтобы проверить биологические эффекты ингибирования ТРФ-β 1 как такового, тестировали оба агента, используя мышиную модель 129 δν/1 (Альпортовская мышь). Во-вторых, тестировали оба агента на мышиной модели с двумя выбитыми генами, чтобы проверить биологические эффекты ингибирования интегрина α1β1 в комбинации с ингибированием ТРФ-β 1. Во всех случаях представленные здесь данные были повторены по меньшей мере три раза с высокой степенью согласованности.

Когда ингибируют ТРФ-β 1 на модели Альпортовской мыши, имеют место некоторые полезные эффекты. Происходит общее улучшение морфологии базальной мембраны, однако все еще наблюдается значительное сглаживание опорных отростков. Таким образом, ТРФ-β 1 может улучшать морфологию КБМ, снижая скорость накопления матрикса, но не оказывает значительного действия на механизмы, лежащие в основе сглаживания опорных отростков. Это значит, что маловероятно, что ингибиторы ТРФβ1, когда дают только их, хотя и обеспечивают улучшение, могут успешно улучшить все характеристики синдрома Альпорта или других таких расстройств. У мышей с двумя выбитыми генами большинство опорных отростков к десятинедельному возрасту выглядит нормально, однако в КБМ имеет место значительное накопление матрикса. Если воздействовать на тех же самых животных любым из использованных ингибиторов ТРФ-β 1, начиная с четырехнедельного возраста, и собирать ткани в десятинедельном возрасте, около 30% клубочков ультраструктурно не отличимы от таковых у нормальных мышей. Таким образом, применяя ингибиторы ТРФ-β 1 в комбинации с ингибиторами рецепторовинтегринов α1β1, в описанных здесь протоколах воздействия можно достичь значительного улучшения.

Данные нозерн-блоттинга о специфичных мРНК из почек, взятых либо от Альпортовских мышей, либо от мышей с двумя выбитыми генами, на которых действовали любым из двух ингибиторов ТРФ-β 1, демонстрируют наличие четких различий между тем, как ТРФ-β 1 или мутация, представляющая собой выбитый интегрин α1β1, влияет на экспрессию иРНК, которые кодируют любые из молекул матрикса, накапливающиеся в КБМ. иРНК, которые кодируют металлопротеиназы (в том числе матриксную металлопротеиназу 2 (ММР-2)) и их соответствующие ингибиторы (в том числе ТИМП-2 и ТИМП-3), считающиеся модуляторами обмена молекул, которые составляют КБМ, также по разному подвержены влиянию у Альпортовских мышей и у мышей с двумя выбитыми генами, на которых действуют любым из ингибиторов ТРФ-βΙ. Конкретно, ТИМП-3, уровень экспрессии которого очень высок у нормальных мышей, подавлен как у Альпортовских мышей, так и у мышей с двумя выбитыми генами. Воздействие на мышей с двумя выбитыми генами ингибиторами ТРФ-βΙ предотвращает супрессию ТИМП-3, восстанавливая иРНК до уровней, сравнимых с теми, что наблюдаются у контрольных мышей (фиг. 21).

Таким же образом экспрессия ламинина α2 в норме жестко ограничена мезангиальным матриксом. Отложение ламинина α2 представляет собой самое раннее молекулярное изменение, которое идентифицируют в связи с началом заболевания КБМ Апьпорта, проявляющееся в то же время, когда впервые выявляют утолщение базальной мембраны. Отложение ламинина α2 в КБМ мышей с двумя выбитыми генами не наблюдают даже, когда они достигают семинедельного возраста (фиг. 18, группа 1Г). Введение ингибиторов ТРФ-βΙ Альпортовским мышам 8У/1 не ингибирует отложение ламинина α2 (фиг. 18, группа 1В). Это подчеркивает другое различие, состоящее в том, как интегрин α1β1 при сравнении с ТРФ-[В функционирует при замедлении развития заболевания, и является веским обоснованием того, почему комбинация воздействий производит синергические полезные эффекты.

Считают, что неспособность ТРФ-[В ингибировать сглаживание опорных отростков подоцитов прямо связана с наблюдениями, касающимися ламинина α2. Ламинины образуют гетеродимеры, состоящие из цепей альфа, бета и гамма. В базальной мембране они пересекаются одна с другой, образуя подобную листку суперструктуру, которая является интегральной частью базальной мембраны. Известно, что ламинины взаимодействуют с рецепторами-интегринами и играют важные роли в дифференцировке и подержании функции тканей. У нормальных мышей КБМ содержит главным образом ламинин-11, гетеродимер из цепей α5, β2 и γ1. Известно, что этот ламинин с высоким сродством связывается на поверхности подоцитов с рецептором-интегрином α3β1. Многие считают, что это взаимодействие играет ключевую роль в поддержании сложного строения цитоскелета, который образует опорные отростки. Гетеродимеры ламинина, которые содержат цепь α2 (ламинин-2 и ламинин-4), не связываются с интегрином α3β1. Таким образом, присутствие цепи ламинина-2 в КБМ может приводить к наблюдаемому сглаживанию опорных отростков, ингибируя связывание интегрина α3β1 с его нормальным субстратом (ламинином-11). Как упоминалось, у животных с двумя выбитыми генами отложение ламинина α2 подавлено, что хо рошо коррелирует с поддержанием опорных отростков у этой линии мышей.

К проблеме интерстициального фиброза имеют отношение дополнительные наблюдения. Интерстициальный фиброз происходит на поздних стадиях развития синдрома Альпорта. В модели Альпортовской мыши 1298ν/Ι до семи недель наблюдают небольшой фиброз, причем средний возраст наступления смерти равен 8 неделям. Однако у животных с двумя выбитыми генами начало фиброза имеет место в возрасте от 8 до 9 недель, и он прогрессирует до наступления смерти, которая в среднем наступает в возрасте 15 недель. Таким образом, животные с двумя выбитыми генами являются превосходной моделью для изучения фиброза. У мыши с двумя выбитыми генами происходит значительный фиброз, и его можно в значительной степени предотвращать применением ингибиторов ТРФ-βΡ

Способы лечения.

По одному из аспектов это изобретение относится к применению ингибиторов (например, блокирующих агентов) для блокирования или инактивирования иным образом функции рецептора-интегрина α1β1 в качестве способа задерживания начала (измеряемого по появлению определяемых уровней сывороточного альбумина в моче с использованием либо имеющегося в продаже теста в виде палочки, либо гельэлекторофореза и процедуры окрашивания геля), замедления развития (определяемого измерением скорости, с которой уровни альбумина в моче, измеряемые как выше, увеличиваются в зависимости от времени) или даже реверсирования гломерулярного заболевания, в частности прогрессирующего гломерулярного нефрита и/или фиброза. Они включают в себя, например, по меньшей мере 9-мерные пептиды из белков, которые связываются с рецептором-интегрином α1β1, таких как ламинин, коллаген типа IV, фибронектин и энтактин, но не ограничены ими. На основании исследований белка/рецептораинтегрина α1β1 можно создавать небольшие молекулы, связывающиеся с рецепторным/лигандным участком рецептора α1β1. По этому изобретению можно применять антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с участком связывания рецептораинтегрина α1β1. Эти антитела или фрагменты антител включают в себя поликлональные, моноклональные, антиидиотипические, получаемые от животных, гуманизированные и химерные антитела.

В способах по настоящему изобретению можно применять агент (искусственный лиганд), который блокирует участок связывания для рецептора-интегрина α1β1. Примеры таких агентов включают в себя нейтрализующее антитело, пептид, протеолитический фрагмент или тому подобное, но не ограничены ими. Счита29 ют, что такие агенты блокируют передачу сигнала через этот рецептор. Эффективность таких воздействий можно также определять, оценивая эффекты в прямом направлении на экспрессию генов, например, ТРФ-βΙ, фибронектина, цепей ламинина и т. д., по морфометрическим изменениям в клубочковых базальных мембранах и/или по тому улучшению клубочкового сита, о котором свидетельствует снижение скорости начала и развития протеинурии.

Антитело, которое нейтрализует функцию интегрина α1β1 предложено в примерах и фиг. 10. В качестве примера для иллюстрации того, что растворимый агент, способный блокировать взаимодействие интегрина α 1 β 1 с его лигандом, должен производить те же эффекты по отношению к патогенезу заболевания, как и мутация, представляющая собой выбитый ген α1, получили антитело, описанное в РаЬЬп е1 а1., Тккие Лп1щсп5. 48:47-51, 1996. Это антитело инъецировали (400 нг/инъекция, трижды в неделю, внутрибрюшинно) и при этом показали, что оно ингибирует повреждение клубочковой мембраны в модели Альпортовской мыши во многом так же, как это наблюдалось у дважды мутантного животного.

По другому аспекту это изобретение относится к применению агентов, которые снижают уровень ТРФ-β 1, в качестве способа замедления накопления матрикса при развитии гломерулярного заболевания, в частности, прогрессирующего гломерулонефрита. Таким образом, можно использовать такие агенты, чтобы лечить пациентов с синдромом Альпорта и пациентов с инсулинзависимым сахарным диабетом, а также других, страдающих, в частности, прогрессирующим гломерулонефритом или любым таким расстройством, которое характеризуется расширением мезангиального матрикса, пролиферацией мезангиальных клеток, отложением матрикса в клубочковой базальной мембране, приводящим к утолщению, утончению, расщеплению или какой-либо такой же нерегулярности, сглаживанием опорных отростков подоцитов или какой-либо комбинацией вышеперечисленных проявлений, из которых все достигают апогея в общем пути фиброза почек (в предотвращении которого особенно эффективна комбинационная терапия, состоящая в ингибиторах интегрина α1β1 и ингибиторах ТРФ-в1). К настоящему времени для того, чтобы блокировать экспрессию ТРФ-β 1 или белка рецептора-интегрина α1β1 можно использовать способы лечения антисмысловыми агентами, как это описано в данной области. Можно применять множество разных агентов, синтетических и природных.

В способах по настоящему изобретению можно применять агент, который нейтрализует способность цитокина ТРФ-β 1 взаимодействовать с его рецептором. Примеры таких агентов включают в себя нейтрализующее антитело, ингибитор кальцийнейрина (т.е. микролид), такой как раскрыт в патенте США № 5260301 (ИакапкЫ е1 а1.) (например РК506 или такролимус и структурно родственные соединения), растворимый рецептор, такой как растворимый рекомбинантный рецептор ТРФ-β 1, раскрытый в международной публикации XVО 98/48024 (Вюдеп 1пс.) (например растворимый химерный ТРФ-[Ж11/1дС1 слитой белок), пептидный фрагмент этого рецептора или какой-либо такой фрагмент, имеющий способность необратимо (устойчиво) связываться с цитокином и ингибировать его способность связываться со своим рецептором, но не ограничены ими. Вдобавок, можно применять агент, который ингибирует способность ТРФ-β 1 передавать сигналы в ядро. Эффективность таких воздействий можно определять, оценивая эффекты в прямом направлении, оказываемые на экспрессию генов, например, фибронектина, цепей ламинина и так далее, по морфометрическим изменениям в клубочковых базальных мембранах и/или по тому улучшению в клубочковом сите, о котором свидетельствует снижение скорости начала или развития протеинурии.

В одном из примеров можно применять РК506 или циклоспорин А для того, чтобы ингибировать кальцийнейриновую часть рецептора для ТРФ-β 1, ингибируя передачу сигналов через рецепторный комплекс, как было раскрыто для некоторых других заболеваний почек (Χνηηβ с1 а1., Сс11 86:435-444, 1996 и МШет с1 а1., Еп6осипо1, 3:1926-1934, 1989), и тем самым ингибируя (посредством неизвестного механизма) начало протеинурии, как было описано для тех же заболеваний почек (Са11к е1 а1., РеФа1г, Иерйго1., 6:140-144, 1992). До настоящего изобретения такие рекомендации не были даны для синдрома Альпорта, сахарного диабета или для болезней, связанных с увеличением внеклеточного матрикса в клубочках почек.

В частности, настоящее изобретение иллюстрирует влияние комбинационной терапии, состоящей в ингибировании рецептораинтегрина α1β1 и ТРФ-β 1 и имеющей синергический эффект по отношению к предотвращению как гломерулярного заболевания, так и фиброза, связанного с синдромом Альпорта. Из этого должно следовать, что такое лечение может быть полезным и в случаях других заболеваний, которые включают в себя расширение мезангиального матрикса, пролиферацию мезангиальных клеток, прогрессирующее повреждение базальных мембран, проявляющееся в утолщении, утончении, расщеплении одной или более чем одной из КБМ, сглаживание опорных отростков подоцитов, или любую комбинацию вышеуказанного. В дополнение авторы изобретения иллюстрируют эффективность этой комбинационной терапии при предотвращении интерстициально-канальцевого фиброза при син31 дроме Альпорта. Фиброз представляет собой общий путь, причем считают, что его механизм идентичен у всех заболеваний почек, которые включают в себя фиброз. Поэтому эффективность этой комбинационной терапии при лечении фиброза должна распространяться на все формы фиброза почек независимо от лежащей в основе причины, которая инициировала путь, ведущий к фиброзу.

Агенты, применяемые в способах по настоящему изобретению, можно вводить в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Агенты по настоящему изобретению изготавливают в виде фармацевтических композиций (т.е. препаратов) и затем, в соответствии со способом по этому изобретению, вводят млекопитающему, такому как пациенту-человеку, во многих разных формах, адаптированных к выбранному пути введения. Эти препараты в типичных случаях включают в себя те, что пригодны для парентерального (в том числе подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного и внутривенного) введения или для других способов, которые обеспечивают стабильность этих агентов.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители могут быть в форме жидкостей, полутвердых веществ, мелкодисперсных твердых веществ или их комбинаций. Общепринято, чтобы препараты, пригодные для парентерального введения, включали в себя стерильный водный препарат агента или дисперсии стерильных порошков, содержащих этот агент, которые предпочтительно изотоничны с кровью реципиента. Изотоничные агенты, которые можно включать в жидкие препараты, включают в себя сахара, буферы и хлорид натрия. Растворы этого агента можно готовить в воде, возможно смешанной с нетоксичным поверхностно-активным агентом. Дисперсии этого агента можно готовить в воде, этаноле, полиоле (таком как глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и тому подобное), растительных маслах, эфирах глицерина и их смесях. Готовая лекарственная форма является стерильной и стабильной в условиях изготовления и хранения. Необходимой текучести можно достичь, например, используя липосомы, применяя подходящие размеры частиц в случае дисперсий или используя поверхностно-активные агенты. Стерилизации жидкого препарата можно достичь любым общепринятым способом, который сохраняет биологическую активность этого агента, предпочтительно стерилизацией фильтрованием. Предпочтительные способы получения порошков включают в себя вакуумную сушку и лиофилизацию стерильных растворов для инъекций. Последующее микробное загрязнение можно предотвратить, используя различные противомикробные агенты, например антибактериальные, противовирусные, противогрибковые агенты, в том числе парабены, хлор бутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал (!б1тегока1) и тому подобное. Всасывания этих агентов в течение длительного времени можно достичь включением задерживающих агентов, например желатина или моностеарата алюминия.

Препараты по этому изобретению могут в добавление к вышеупомянутым ингредиентам далее включать в себя один или более чем один вспомогательный ингредиент, в том числе разбавители, буферы, связывающие вещества, разрыхлители, поверхностно-активные агенты, загустители, смазывающие вещества, консерванты (в том числе антиоксиданты) и тому подобное. Эти препараты можно общепринятым образом предоставлять в стандартной лекарственной форме и можно получать любым из способов, известных в фармации.

Полезные дозы (т.е. эффективные количества, которые производят желаемый эффект) описанных здесь агентов можно определять сравнением их активности ш νίΙΐΌ с активностью 1п у1уо на животных моделях. В данной области известны способы, чтобы экстраполировать на людей дозы, эффективные у мышей и других животных. Например, дозы агента для внутривенного введения от около 150 мг на кг до около 300 мг на кг дважды в день. Вообще подходящими дозами для введения являются те, которые достаточны, чтобы производить желаемый эффект, такие как индуцирующие демонстрируемое увеличение экспрессии ферментов фазы ΐΐ или других описанных здесь характеристик.

Примеры

В примерах дано описание двух разных животных моделей. Первая модель представляет собой Альпортовскую мышь, которая не экспрессирует коллаген α3(ΐν) и нормальна по интегрину α1, как описано в Сокдгоуе е! а1., Сенек Оеу., 10:2981-2992, 1996, а вторая, которую называют мышью с двумя выбитыми генами, выведена скрещиванием Альпортовской мыши с мышью, у которой была нуль-мутация по гену интегрина α1. Между Альпортовской мышью и мышью с двумя выбитыми генами есть различия, которые служат для того, чтобы иллюстрировать эффективность блокирования функции интегрина α1β1 при замедлении гломерулярного заболевания. Эти эффекты описаны подробно.

Альпортовская мышь имеет чистый генетический фон 129 8ν/1, а мышь с двумя выбитыми генами имеет чистый на 97,5% генетический фон 129 3ν. Исключением являются животные, которые были использованы для получения фиг. 4, 5 и 6. Эти эксперименты были выполнены рано в истории модели Альпортовской мыши, и, таким образом, получены скрещиванием химерных самцов с самками С57В1/6, а затем скрещиванием получившихся гетерозигот с получением гомозиготных Альпортовских мышей, которые должны относиться к поколению Р2. Это то же самое поколение животных, которое использовали в первоначальном описании модели Альпортовской мыши (Со^дгоус с1 а1., Сенек Όβν., 10:2981-2992, 1996). Это обычно для ранних исследований по выбиванию генов, поскольку ускоряет идентификацию фенотипа с выбитым геном. В том, что касается индукции специфичных иРНК, результаты, полученные с этими Р2, соответствуют результатам, полученным для чистого фенотипа 129 8ν/ί с выбитым геном. Следует отметить, что все эксперименты, которые обеспечивают сравнительный анализ Альпортовских мышей в сопоставлении с мышами, имеющими два выбитых гена, были выполнены на инбредных линиях.

Проверяли роль ТРФ-β 1 в развитии заболевания почек, а также развитии фиброза в обеих животных моделях. Это сделали проверкой двух разных ингибиторов ТРФ-β 1, которые действуют совершенно разными путями. Использование двух разных ингибиторов (РК506 и растворимого рецептора ТРФ-β 1) дает доказательство того, что этот эффект происходит из-за ингибирования ТРФ-β 1, а не из-за побочных эффектов использованных агентов. РК506 может быть терапевтическим в лечении прогрессирующего фиброза, связанного с чрезмерной экспрессией ТРФ-β 1.

При анализе разных описанных животных моделей и воздействий лекарственными препаратами имеет место специфический ход оценки, который на всем протяжении оставался постоянным. Оценивали три разные сферы. Вопервых, проверяли функцию почек, что дает оценку общей целостности клубочкового фильтра. Это делали проверкой выхода сывороточного альбумина в мочу. Во-вторых, проверяли структурную целостность этой ткани на уровнях как световой, так и электронной микроскопии. Применяли как просвечивающие, так и сканирующие процедуры электронной микроскопии. Эти процедуры были предназначены для того, чтобы определять степень почечной гистопатологии в этих разных условиях. Наконец, выполняли эксперименты по молекулярному анализу, чтобы проверять, какие изменения происходят в специфических генах и соответствующих белках в результате этих разных условий. Их проверяли, выявляя специфичные иРНК с использованием нозерн-блоттинга, гибридизации ίη κϊΐιι и защиты от РНКаз и с использованием иммуногистохимической детекции специфических белков. Ввиду повторения этих специфических процедур для анализа разных животных моделей и для разных воздействий лекарственными препаратами в разных животных моделях настоящим утверждается, во избежание избыточности, что выполнение всех процедур было идентичным (насколько можно ожидать в каждодневной практике) во всех случаях, и они, таким образом, описаны один раз, и затем на них даны ссылки в последующих конкретных примерах.

Существует множество разных альтернативных методик, доступных специалистам, в одинаковой степени позволяющих успешно осуществлять задуманное изобретение. Получали все реагенты от δίβΐηα СНет1са1 Со., 8ΐ. Ьошз, МО, если не указано иначе. Забуференный фосфатом физиологический раствор, использованный во всех описанных здесь исследованиях, был приобретен в форме таблеток от δίβΐηα С11еш1са1 Со., 8ΐ. Ьошз, МО, номер продукта Р4417, причем каждую таблетку восстанавливали в 200 мл воды с получением забуференного физиологического раствора с рН 7,4.

Методы.

ΐ. Функция почек.

А. Анализ белка. Выполняли исходные измерения белка в моче, используя индикатор А1Ьизйх (М11ез ЬаЬогайпез, Е1кНаг1. ΐΝ) и определяя относительные количества по цветовой карте, прилагаемой к набору.

Собирали образцы мочи через недельные интервалы и фракционировали 0,5 мкл электрофорезом в 10% денатурирующих акриламидных гелях. Белок в гелях окрашивали кумасси голубым и фотографировали. В качестве стандарта молекулярной массы использовали бычий сывороточный альбумин.

ΐΐ. Структурная целостность.

А. Просвечивающая электронная микроскопия. Измельчали свежее внешнее корковое вещество почки в 4% параформальдегиде, давали фиксироваться в течение 2 ч и хранили при 5°С в забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4). Ткань тщательно промывали (5 раз в течение 10 мин, каждый раз при 4°С) 0,1М буфером Соренсона (буфер Соренсона получали объединением 100 мл 200 мМ первичного кислого (орто)фосфата натрия и 400 мл 200 мМ вторичного кислого (орто)фосфата натрия с 500 мл воды и доводили рН до 7,4), и проводили постфиксацию в 1% тетроксиде осмия в буфере Соренсона в течение 1 ч. Затем ткань обезвоживали в серии разведений этанола (70%, затем 80%, затем 90%, затем 100%, каждый раз по 10 мин) и, наконец, в оксиде пропилена и заключали в эпоксидную смолу Ро1у/Веб 812 (Ро1узс1епсез, 1пс., ХУагппдЮп, РА) с последующей процедурой, описанной изготовителем. Вкратце, смешивали 42 мл Ро1у/Веб 812 с 26 мл додецилянтарного ангидрида (ΌΌ8Α, Ро1узс1епсе, 1пс.) и 24 мл надик-метилового ангидрида (Ро1узс1епсез 1пс.). Добавляли полтора миллилитра 2,4,6-три-(диметиламинометил)фенола в качестве катализатора и замораживали активированную смолу в аликвотах по 10 мл, пока она не становилась нужна, чтобы заключать в нее образец. Идентифицировали клубочки в срезах толщиной 1 мкм (микрон) и окраши35 вали толуидиновым синим и затем разрезали срезы до толщины 70 нм (нанометров), пользуясь ультрамикротомом Векйей йшд ийгаси! Е (СатЬпбде 1п51гитеп1 Со, V^еηηа, Аи51па). Устанавливали срезы на сетках и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, пользуясь известными процедурами. Исследовали и фотографировали установленные на решетках срезы, используя электронный микроскоп РЫШрз СМ10.

Б. Сканирующая электронная микроскопия. Фиксировали небольшие кусочки (примерно двухмиллиметровые кубики) коркового вещества почки в 3% глутаровом альдегиде, забуференном фосфатом, затем проводили постфиксацию в 1% тетроксиде осмия, забуференном фосфатом. Образцы затем обезвоживали в серии разведений этанола и сушили до критической точки в диоксиде углерода. Затем раскалывали кубики на кусочки, надавливая на них острием бритвы, и устанавливали с помощью клея на штыри сколотой поверхностью вверх. На поверхность напыляли золото/палладий, используя хорошо известные процедуры, и визуализировали ее с помощью сканирующего электронного микроскопа.

В. Окраска метенамином серебра по Джонсу. Окраску по Джонсу выполняли на заключенных в парафин почках, пользуясь методом, который описали Вигпз и Вге15сй5сйпе1бег в Т1ип 15 ш: р1а8Йс етЬеббшд оГ Й55ие Гог Ндй! ιηίсгозсору, Ебисабоп Ргобисй ОМзюп, Атепсап 8ос1е1у оГ С11шса1 Ра1йо1од1515, СЫсадо, 1Ь, рр. 24-25,1981.

ΐΐΐ. Молекулярный анализ.

А. Анализ нозерн-блоттингом. Удаляли почки, моментально замораживали их в жидком азоте и размалывали до порошка в жидком азоте, пользуясь ступкой и пестиком. Солюбилизировали этот порошок в реагенте ТЯЕОЬ (01ЬСо/ВВЬ, Огапб 151апб, ΝΥ), используя по 5 мл реагента на почку. Экстрагировали суммарные клеточные РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Фракционировали двадцать микрограммов (20 мкг) РНК в 1,0% геле, состоящем из агарозы, формальдегида и МОР8 (3-(№мофолино)пропансульфоновая кислота), электрофорезом при 80 В в течение 4 ч. Вымачивали гели в воде в течение 45 мин и переносили на НуЬопб N (незаряженный нейлон, №\ν Епд1апб Шс1еаг, 1пс., Во51оп, МА) капилляроблоттингом в течение ночи, используя в качестве буфера для переноса 750 мМ ацетат аммония (в воде). Пришивали РНК к блоту ультрафиолетом, используя 81га1аИпкег (81га1адепе, 1пс., Ьабо11а, СА). Предварительно гибридизовали блоты в растворе, включающем в себя 50% формамида, десятикратный раствор Денхардта, 1М №С1, 50 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 1% додецилсульфат натрия и 200 мкг/мл обработанной ультразвуком и денатурированной ДНК спермы лосося (81дта Сйетка1 Со., 8ΐ. Ьош5, МО). Ме тили зонды (³²Р-меченные фрагменты кДНКзонда) случайным примированием до концентрации 10⁹ имп/мин, используя набор для мечения ДНК случайным примированием (Воейппдег Мапп11е1т, 1пб1апаро115, ΙΝ). Буферы для предварительной гибридизации и гибридизации состояли из пятикратного буфера, представляющего собой физиологический раствор с цитратом (88С), пятикратного раствора Денхардта, 0,5% додецилсульфата натрия (8Ό8) и 200 мкг/мл обработанной ультразвуком и денатурированной ДНК спермы лосося.

Предварительно гибридизовали фильтры в течение по меньшей мере 5 ч и затем гибридизовали в течение ночи, используя зонд в дозе 1 миллион распадов в минуту на 1 мл раствора для гибридизации. Затем промывали фильтры при высокой строгости (два раза по 30 мин, каждый раз при 65°С, в растворе, состоящем из 300 мМ №С1, 30 мМ цитрата натрия и 0,2% додецилсульфата натрия в воде) и экспонировали на рентгеновской пленке. Оценивали качество препаратов РНК и стабильность нанесения, окрашивая гели бромидом этидия и сканируя полосы, соответствующие рибосомальным РНК 188 и 288 с использованием прибора цифровой визуализирующей системы 0е1 1тадег 2000 и пакета программ (АррНеб 1тадтд, 8ап!а С1ага, СА). Надлежащие соотношения рибосомальных полос подтверждали, что препараты РНК были должного и стабильного качества. Количественное денситометрическое сканирование подтвердило не более чем 10%-ное варьирование нанесения образцов. Использовали это средство вместо контрольного зонда из-за беспокойства, что изменения физиологии клеток, сопутствующие прогрессирующему фиброзу, делают такие контрольные зонды ненадежными. Оценивали количественные различия в экспрессии анализом, представляющим собой фосфовизуализацию, с использованием фосфовизуализатора ВюВаб 08-525 (Вю Ваб, 1пс., Негси1е5, СА) и вычитали их для фоновой гибридизиции.

Выделяли зонды из библиотеки 5'концевых кДНК мышиных почек (С1опе1есй) ПЦР-амплификацией, используя опубликованную последовательность для кДНК разных коллагенов базальных мембран и тех кДНК для связанных белков. Для зондов коллагенов базальных мембран амплифицировали последовательность, кодирующую консервативный домен NС1. Использованные праймеры и условия были идентичны тем, которые применяли Мтег и 8апе5, 1. Се11 Вю1., 127:879-891, 1994. Для коллагена СОЬ4А1 праймерами были (МиШикитагап е! а1., 1. Вю1. Сйет., 264:6310-6317, 1989): смысловой 5'ТСТ0Т00АССАТ00СТТС3' (8Е0 ΙΌ N0:1); антисмысловой 5'ТТСТСАТ0САСА СТТ00С3' (8Е0 ΙΌ N0:2). Для коллагена СОЙ4А2, праймеры были (8аи5 е! а1., 1. Вю1. Сйет., 264:6318-6324,1989): смысловой

5'00СТАССТССТ00Т0АА03' (8Е0 ΙΌ N0:3);

антисмысловой 5'ТТСАТССАСАСТТСССАС3' (8ЕО ГО N0:4). Амплифицировали как СОБ4А1, так и СОБ4А2 в тех же условиях. Подвергали вирионы (а х 10⁶) 35 циклам ПЦР, используя высокотемпературный старт (10 мин при 95°С), затем 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Субклонировали зонды и проверяли анализом последовательности ДНК.

Амплифицировали зонды на белки, связанные с базальными мембранами, из той же библиотеки, что и в случае коллагенов базальной мембраны. Брали праймеры из 3'последовательности. Для корового белка гепаринсульфатпротеогликанов праймерами были (Nοοηаη е! а1., I. Βΐο1. Скет., 263:16379-16387, 1988): смысловой 5'ССССССАСАТТСТСС3' (8Е0 ГО NО:5); антисмысловой, 5'ССАСТС ССССТТССАТТ3' (8ЕС) ГО ^:6). Для ламинина В2 праймерами были (8акак1 апй Υатайа, I. Βΐο1. Скет., 262:17111-17117, 1987): смысловой 5'АССАСТАССААСССССА3' (8 ЕС) ГО ^:7); антисмысловой 5'ТСАТТСАССТТСТТСАСС3' (8Е0 ГО NО:8). Для ламинина В1 праймерами были (8акак1 е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8сЕ И8А, 84:935-939, 1987): смысловой 5'ТАСАССТТА ТТТТССАССАСА3' (8 ЕС) ГО ^:9); антисмысловой 5'ТТССАТАТССТСАТСАССТТС3' (8Е0 ГО NО: 10). Для энтактина праймерами были (Мапп е! а1., ЕΜΒО .Фигпа1, 8:65-72, 1989): смысловой 5'СТССТТТАСТССАСАСАСАТС3' (8ЕО ГО NО:11), антисмысловой 5'ССААТС ТСТССААТАААСС3' (8 ЕС) ГО 12). Для цепи А ламинина праймерами были ГОиеБшапп е! а1., Еиг. I. Β^οскет., 177:35-45, 1988): смысловой 5'АСАСАСТССААССССАСААААСС ААС3' (8ЕО ГО NО: 13); антисмысловой 5'САСССААСАСТССТТСТАССТСАА3' (8ЕС) ГО NО: 14). Для 8-ламинина праймерами были (Нип!ег е! а1., №1иге, 338:229-234, 1989): смысловой 5'ССАСАССССССАСССАСС3' (8 ЕС) ГО 15), антисмысловой 5'ТСТАССТСССАТ ССТСТССТС3' (8 ЕС) ГО 16). Условия ПЦР были идентичными тем, которые применяли для вышеуказанных цепей коллагена типа IV.

Выделяли зонды для ММР-2, ТИМП-2, и ТИМП-3, используя суммарную РНК из 13дневных эмбрионов мышей, используя ПЦР после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Набор праймеров для ММР-2 амплифицирует фрагмент иРНК длиной 237 пар оснований (Κеροηеη е! а1., I. Βΐο1. Скет., 267:7856-7862,1992) и включает в себя праймер в обратном направлении 5'ССССТАТСТАСАССТАСАССА3' (8ЕС) ГО NО:17) и праймер в прямом направлении 5'ТСТСАСТСТСССССАААТААА3' (8 ЕС) ГО NО:18). Набор праймеров для ТИМП-2 амплифицирует фрагмент РНК длиной 195 пар оснований (8к^т^ζи е! а1., Сепе, 114:291-292, 1992) и включает в себя праймер в обратном направлении 5'САСААСААСАСССТСААССАСА3' (8ЕО ГО NО: 19) и праймер в прямом направлении 5'СТА ССА ССС ССА АСА АСС3' (8ЕС) ГО

NО:20). Набор праймеров для ТИПМ-3 амплифицирует фрагмент иРНК длиной 337 пар оснований (Ар!е е! а1.. ОеуеФртеп!а1 Оупаткк, 200:177-197, 1994) и включает в себя праймер в обратном направлении 5'ССТ СТА САС ТАТ ТАА ССА САТ САА 03' (8ЕС) ГО ^:21) и праймер в прямом направлении 5'ААА АТТ ССА САС САТ СТС ССТ (8ЕС) ГО ^:22). Для всех трех зондов на одном микрограмме суммарной РНК проводили обратную транскрипцию, используя обратную транскриптазу СФС^ 8ирег5спр! р1ик и праймер в прямом направлении, в соответствии с протоколами, описанными изготовителем. Одну десятую этой реакционной смеси подвергали 40 циклам ПЦР с высокотемпературным стартом, используя полимеразу РЕИ (81га1адепе, Шс.).

Зонд на ТРФ-β 1 был подарен Н.Ь. Μο^8 (МШег е! а1., Μο1. Еп^сйшЕ, 3:1926-1934, 1989), кроме защиты от РНКазы, для которой нужен зонд от человека. Для этого зонда фрагмент ТРФ-β 1 длиной 24 пары оснований амплифицировали ПЦР из библиотеки кДНК почек человека (СШпе!еск, Ра 1ο А1Ю, СА). Набором использованных праймеров были ССА САА СТТ ССС АТС СТА С (8ЕС) 10 ^:23) (нижний) и ССА САТ САА ССС СТТ САС ТА (8Е0 ГО NО:24) (верхний). Этот фрагмент подвергали повторной амплификации полимеразой РЕи (81га!адепе) и тупой конец лигировали в плазмиду 8К+.

Б. Гибридизация ш Ши. Сначала фиксировали почки медленной транскардиальной перфузией (используя 4% параформальдегид в забуференном фофатом физиологическом растворе). Животных подвергали глубокой анестезии, используя Ауегйп (2,2,2-трибромэтанол, А1йпск Скет1са1 Сс., М1Ша1кее, А1). Вскрывали грудную клетку и делали маленькое отверстие в правом желудочке пункцией с помощью туберкулиновой иглы, чтобы дать вход перфузату. Вторую туберкулиновую иглу, подсоединенную к шприцу на 30 мл, содержащему перфузионный буфер, вставляли в верхушку левого желудочка. Вводили фиксаж в количестве один миллилитр на один грамм массы тела со скоростью около 3 мл в минуту. Должным образом фиксированные почки были твердыми и выглядели мраморными. После перфузии удаляли почечную капсулу ирисовым пинцетом, разрезали почки вдоль пополам (разрезая пополам почечную лоханку, мозговой слой и корковое вещество) и помещали в фиксаж при 4°С еще на один час. Заключали фиксированные половинки в парафин, нарезали на 6 мкм и переносили на слайды для микроскопии 8иРЕРЕРО8Т РШ8 (Ещкег 8с1еп!1йс Шс., РйФЬигд, РА). Сушили слайды на нагревателе слайдов при 60°С в течение 20 мин и хранили при 4°С до использования (слайды годны в течение срока до шести недель). Заключали почки от контрольных и Аль39 портовских животных одного помета рядом, чтобы контролировать малейшие различия, которые могут быть внесены во время процедуры гибридизации.

Сушили слайды в вакуумной печи при 60°С в течение 1 ч, затем удаляли из них парафин тремя последовательными двухминутными промывками в ксилолах. Обезвоживали ткань в этаноле, удаляли из нее белок инкубацией в 0,2н. НС1 в течение 15 мин, промывали в забуференном фосфатом физиологическом растворе и обрабатывали протеиназой К в концентрации 3 мкг/мл (Воейппдег МаппНепп. [иН1аиоро118, ΓΝ) при 37°С в течение 10 мин. Ферментацию останавливали промыванием в 2 мг/мл растворе глицина в забуференном фосфатом физиологическом растворе. После обезвоживания ткани в серии разведений этанола (70%, 80%, 90%, 100%, каждый раз 10 мин при комнатной температуре) ткань предварительно гибридизовали, гибридизовали и промывали в соответствии с протоколом, описанном в приложении к набору Сешик для гибридизации ίη κίΐη (ВоеНппдег МаппНепп, [пШапороНк, ΓΝ), со следующими модификациями. В оба раствора для предварительной гибридизации и гибридизации включали тРНК, полученную экстрагированием фенолом/хлороформом из пекарских дрожжей, в концентрации 10 мг/мл. Данная стадия значительно снижала неспецифический сигнал. После гибридизации ткань дважды промывали в двукратном 88С при 50°С и затем обрабатывали РНКазой А в течение 6 мин при комнатной температуре. Количество РНКазы А определяли для каждого зонда (диапазон от 200 нг/мл до 5 мкг/мл). Зонды для отрицательного контроля включали в себя кодирующую последовательность для бактериальной β-галактозидазы или неомицинфосфотрансферазы. Все зонды имели длину примерно 200 пар оснований, их клонировали в сайт 8ас1 плазмиды В1ие8спр1 8К+ (81га1адепе, Ьа1о11а, СА) и транскрибировали (после линеаризации) со стороны Т3. Единственным исключением был ТРФ-β 1, у которого было 973 пары оснований, а клонирование проводили в вектор ртТ.

В. Анализ защитой от РНКазы. Проводили эксперименты, используя набор ВРАН (АтШоп Шс., Аикйп, ТХ) и следуя протоколу, приложенному к набору. Для получения зонда фрагмент ТРФ-[В длиной 264 пары оснований амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК почки человека (С1опе1есН, Ра1о А1!о, СА). Использованными наборами праймеров были ССА САА СТТ ССС АТС СТА С (8ЕС ГО N0:25) (нижний) и ССА САТ САА ССС СТТ САС ТА (8ЕО ГО N0:26) (верхний). Этот фрагмент повторно амплифицировали полимеразой РЕИ (81га1адепе) и тупой конец лигировали в плазмиду рВЬиекспр! 8К+ (81га1адепе). Антисмысловой зонд получали с промотора Т7.

Г. Иммунофлуоресцентный анализ. Извлекали свежие почки, нарезали на поперечные срезы толщиной 3 мм, заключали в водную смесь Т1ккие Тек ОСТ (номер продукта 4583, М11ек ЬаЬогаШпек, Е1кНаг1, ΓΝ) и замораживали, помещая в морозильник при -150°С. Нарезали срезы толщиной 3 мкм, используя криостат М1сгот, тип ΗΜ505Ν (2е1кк, Шс., \Уа11богГ, Сегтапу), и оттаивали на слайдах, покрытых полиЬ-лизином. Фиксировали слайды в течении 15 мин вымачиванием либо в холодном (-20°С) 95% этаноле с целью использовать для окрашивания антителами, специфичными к коллагенам базальных мембран, либо в холодном (20°С) ацетоне для окрашивания антителами, специфичными для белков, связанных с базальными мембранами. Слайдам давали сохнуть на воздухе в течение ночи и до использования хранили их в десикаторе при -80°С.

Образцам давали достичь температуры окружающей среды, затем промывали их три раза в забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) при комнатной температуре. Для окрашивания антителами против коллагенов типа IV предварительно обрабатывали ткани 0,1М глицином и 6М мочевиной (рН 3,5), чтобы денатурировать белок и обнажить антигенные участки. Наносили на образец подходящие разведения (определенные эмпирически) первых антител и давали им реагировать в течение 3 ч при 5°С в увлажняемом боксе. Разбавляли антитела в растворе 5% обезжиренного сухого молока в забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4). Применение обезжиренного сухого молока существенно снижает фоновую флуоресценцию. Промывали образцы четыре раза в забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4), каждый раз в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить первое антитело, а затем приводили их во взаимодействие с подходящим меченным флуоресцином вторым реагентом. Использовали все вторые реагенты в разведении 1:100, применяя в качестве разбавителя 7% обезжиренное сухое молоко в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Вторым реагентам давали реагировать в течение 2 ч при 4°С. Затем промывали слайды четыре раза холодным забуференным фосфатом физиологическим раствором (рН 7,4) с последующим нанесением антифэдинговой закрепляющей среды ХесШг ЬаЬогаШпек Шс., ВпгНпдате, СА). Запечатывали слайды под стеклянными покровными стелами, используя прозрачный лак для ногтей. Фотографировали слайды при увеличении х 1000. Окрашивали образцы, заключенные пластик, по Джонсу метенамином серебра.

Приобретали козьи антисыворотки против цепей С0Ь4А1 и С0Ь4А2 у 8оп1Негп Вю1есНпо1оду, Шс. ВитаШдйат, АЬ. Это антитело было проверено на перекрестную реактивность изготовителем. Оно производило паттерн окраши41 вания в клубочке, который соответствовал тому, который наблюдали с другими препаратами антител против этих цепей (Мшег апб 8апек, 1. Се11 ΒίοΙ., 127:879-891, 1994). Антитело против гепаринсульфатпротеогликана (Н8Р6) представляет собой крысиное моноклональное антитело, индуцированное против корового белка Н8РС, очищенного из опухолей мышей ЕН8. Это антитело было проверено на перекрестную реактивность с ламинином, коллагеном типа IV, фибронектином и энтактином производителем с помощью иммуноанализа с применением вестерн-блоттинга и дот-блот иммуноанализа (Скеткоп ШКта1кпа1, Тетеси1а, СА), а также как описано в других публикациях (НопдисЫ е1 а1., 1. НЩоскет. С/Носкет., 37:969-970, 1989). Антитела против ламинина-1 представляют собой кроличьи антисыворотки. Иммуноген очищали из базальной мембраны Е8Н и приобретали у 8щта Iтшиηοскет^са1κ (8ΐ. Ьошк, МО). Дот-блот иммуноанализ, выполненный изготовителем (8^та), подтвердил отсутствие перекрестной реактивности с коллагеном IV, фибронектином, витронектином и хондроитинсульфатом типов А, В и С. Антифибронектин представляет собой кроличью антисыворотку, индуцированную против фибронектина, очищенного из плазмы человека. Изготовитель (8|§та Ш1типосйеткаЦ) проверил его на перекрестную реактивность с коллагеном IV, ламинином, витронектином и хондроитинсульфатом типов А, В и С, используя дот-блот иммуноанализ. Антиэнтактин представляет собой крысиное моноклональное антитело, полученное с использованием энтактина, происходящего из ЕН8, в качестве иммуногена. Приобретали этот реагент у ир51а1е Вккскпо1оду Шсогрогакб, Ьаке Р1ас1б, ΝΥ, и проверяли его на соответствующую иммунореактивность, а также на отсутствие перекрестной реактивности с другими существенными компонентами базальных мембран анализом, представляющим собой вестерн-блоттинг (ЦнЬипоу е1 а1., Ехр. Се11. Век., 165:530-540, 1986).

Записывали и обрабатывали изображения иммунофлуоресценции и окраски по Джонсу, используя флуоресцентный микроскоп О1утрик ВН2 ВРЬА в комплексе с системой анализа изображений АррЕеб Iшад^ηд СуЮуыоп ИЙга (Арркеб IшадШд, Шс.). Снимали изображения, используя черно-белую видеокамеру высокого разрешения. Модифицировали эти изображения, используя системное программное обеспечение. При обработке изображений старались точно аппроксимировать флуоресценцию, наблюдаемую непосредственно через микроскоп.

Д. Иммунопероксидазная детекция. Метод, представляющий собой иммунопероксидазную детекцию, использовали для иммуноокрашивания наТРФ^ в клубочках, а также на фибронектин и коллаген типа I в интерстициальноканальцевом пространстве. Антитело против коллагена типа I является кроличьим антимышиным, его приобретали у В|одепе818, Шс. (8апбодп, N4). Для иммунопероксидазного окрашивания использовали эти антисыворотки в разведении 1:100. Антитело против фибронектина было тем же, что и для иммунофлуоресцентного окрашивания (кроличья антисыворотка против человеческого фибронектина, которую приобретали у 8щта Скетка1 Сотрапу, 8ΐ. Ьошк, МО), ее применяли в разведении 1:100. Вторыми реагентами были биотинилированные антикроличьи антитела, их приобретали у Vес1ог ЬаЬогаШгкк (Вигкпдате, СА) и применяли в разведении 1:100.

Заключали ткань в парафин (используя ту же процедуру, что описана для гибридизации Ш кйи) и делали срезы толщиной 3 мкм. Предварительно обрабатывали обеспарафиненные срезы пятью микрограммами протеиназы К (Воекппдег МаппкеШ1, Шб^аηарο1^κ, ΕΝ) в 100 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), чтобы обнажить эпитопы. Обработку протеиназой останавливали инкубацией в 2 мг/мл глицине в забуференном фосфатом физиологическом растворе в течение 30 с. Ткань после удаления парафина и обработки протеиназой К трижды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и приводили во взаимодействие с первым антителом в течение 1 ч при комнатной температуре, трижды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором и приводили во взаимодействие с биотинилированным вторым антителом в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки забуференным фосфатом физиологическим раствором инкубировали слайды с комплексом стрептавидина и пероксидазы хрена (3 мкг/мл, Vесΐο^ ЬаЬогаШпек) в течение 30 мин при комнатной температуре. После трех промывок забуференным фосфатом физиологическим раствором проявляли субстратной системой АЕС (Уескг АЕС 8К-4200, Vесΐο^ ЬаЬогаШгкк) связывание антител, следуя процедуре, которую описал производитель.

Для ТРФ-[В первое антитело было куриным против а-ТРФ^ человека (Κ&Ό 8уйетк, Мтпеаро118, ΜΝ), его применяли в разведении 1:15 в 7% обезжиренном сухом молоке в забуференном фосфатом физиологическом растворе (который использовали в качестве разбавителя для всех антител). Ему давали реагировать по меньшей мере 3 ч при комнатной температуре. Второе антитело было биотинилированным козьим против куриного для ТРФ-[В ^ес1ог ЬаЬогаШгкк Вигкпдате, СА), его применяли в разведении 1:100 и давали ему реагировать в течение по меньшей мере 1 ч. После трех отмывок выполняли иммунопероксидазную детекцию, используя набор АЕС ^ес1ог ЬаЬогакгкк Виг1Шдаше, СА).

Пример 1. Получение дважды мутантного животного Альпорт/интегрин α1.

Мышиную модель аутосомной формы синдрома Альпорта создавали направленным мутагенезом гена проколлагена СОЬ4А3, как было описано ранее (Сокдгоуе с! а1., Сспс5 Эсу.. 10:2981-2992, 1996). Это называется здесь

Альпортовской мышью и имеется в продаже у 1аск8оп ЬаЬогаЮпск, Ваг НагЬог, штат Мэн под номером доступа 2908. Эту мышь с выбитым α3(ΐν) на генетическом фоне 129 8ν/1 скрещивали (пять последовательных обратных скрещиваний с чистыми 129 8ν, затем с мышью, являющей нулевой по интегрину α1 и чистой по генетическому фону 129 8ν) так, что получили мышь с двумя выбитыми генами, которая более чем на 97,5% является чистой 129 8ν. Мышь с выбитым α1 предоставил НитрЬгсу Сагбпсг из 8спрр5 1п8111и(с в ЬаЧоПа, Калифорния, а описана она в Сагбпсг с! а1., Осу. Вю1., 175:301-313, 1996.

Пример 2. Оценка развития заболевания почек Альпорта в мышиных моделях.

В число мышей, которых изучали в этом примере, входили Альпортовские мыши, которые не экспрессируют коллаген α3(ΐν) и нормальны по интегрину α1 (имеются в продаже у Часккоп ЬаЬога!опс8, Ваг АгЬог, штат Мэн), и животные с двумя выбитыми генами (т. е. дважды мутантные), которые не экспрессируют коллаген α3(ΐν) или интегрин α1. Эти дважды мутантные животные имели генетически фон, который на 97,5% был 8ν и на 2,5% был δν/к

Собирали от этих мышей мочу через недельные интервалы и выполняли анализ белка как описано в разделе “Методы”. Как показывает фиг. 1, у животных, которые не экспрессировали коллаген α3(ΐν) и были нормальными по интегрину α1, средний возраст начала заболевания почек Альпорта (на основании исследования 6 индивидуумов), как определяли по началу протеинурии, был от 3,5 до 4 недель. Протеинурия прогрессировала быстро, достигая пиковых уровней в возрасте от 6 до 6,5 недель. Средний возраст наступления смерти из-за почечной недостаточности был от 8 до 9 недель. Ни одно из животных (было протестировано 9 животных) этого генотипа не жило дольше 9 недель. Уровни азота мочевины крови (УАМ) становились повышенными в возрасте от 7 недель до 7,5 недель. В дважды мутантных животных (для этих измерений протестировали четырех из них) начало протеинурии было в возрасте от 5 до 5,5 недель, и она прогрессировала более медленно, достигая пиковых уровней в период от 9 до 9,5 недель. Средний возраст наступления смерти из-за почечной недостаточности был от 15 до 16,5 недель. Повышенный УАМ развивался у животных в возрасте от 10 до 11 недель.

Пример 3. Характеристика мышиной модели с двумя выбитыми генами.

Используя множество разных методик, анализировали три разных совокупности животных (нормальные контроли; животные, не экспрессирующие ген α3(ΐν) и нормальные по интегрину α1 (Альпортовские мыши); дважды мутантные), находящихся в возрасте от 4 до 7 недель.

Чтобы оценивать целостность базальных мембран, выполняли просвечивающую электронную микроскопию. В возрасте 4 недели (данные не показаны), Альпортовские мыши одного помета демонстрировали разреженные базальные мембраны в 100% клубочковых капиллярных петель. Дважды мутантные животные демонстрировали некоторую разреженность клубочковых базальных мембран (КБМ), состоящую в нерегулярном утолщении, утончении и расщеплении, однако она была нечастой и редко обширной. Около 20% клубочков у дважды мутантных животных вообще демонстрировали отсутствие видимого разрежения базальных мембран. У Альпортовых мышей около 5% гломерул в это время были фиброзными, тогда как у двойных мутантов фиброзных клубочков не находили. Фиг. 2 иллюстрирует степень повреждения клубочковых базальных мембран, характерную для этих разных мышей в возрасте около 7 недель. Иллюстрирована типичная клубочковая капиллярная петля. Клубочковая базальная мембрана в Альпортовских мышах в этот момент развития тяжело повреждена в практически всех клубочках. На фиг. 2Б ясно видно грубое нерегулярное утолщение и утончение и сильное сглаживание опорных отростков подоцитов. Однако у животных с двумя выбитыми генами (фиг. 2В) КБМ в ультраструктурном отношении по большей части нормальна, за исключением некоторых небольших неровностей, а опорные отростки подоцитов сохраняют нормальное строение (сравните области, указанные стрелками для нормальной мыши на фиг. 2А с таковыми для мыши с двумя выбитыми генами на фиг. 2В). В это время у Альпортовской мыши от 30 до 50% клубочков были фиброзными, тогда как у дважды мутантных животных фиброзными были менее 5% гломерул.

Сканирующая электронная микроскопия 7недельных мышей (данные не показаны) показывала, что Альпортовские мыши демонстрировали значительное набухание опорных отростков подоцитов, нарушающее структуру этих клеток, которая в норме элегантна и сложна. Это сглаживание опорных отростков было описано для Альпортовского гломерулонефрита. У дважды мутантных животных, эта структура, хотя не была безукоризненной, была очень близкой к тому, что наблюдают в клубочках из контрольных мышей. Разбухание этих опорных отростков является причиной блокирования клубочкового фильтра и ведет к уремии. Поэто45 му это открытие важно в том, что касается улучшенной клубочковой функции у дважды мутантного животного при сравнении с Альпортовскими животными одного помета.

Окрашивали заключенные в парафин гистологические препараты целых почек из 7недельных мышей, используя метод Джонса, и подсчитывали общее число фиброзных клубочков (данные не показаны). Практически все клубочки Альпортовских мышей были до некоторой степени поражены. Большинство демонстрировало повышенное содержание паренхиматозных клеток в клубочках и расширение мезангиального матрикса, а около трети были фиброзными. Напротив, в том, что касается мезангиального матрикса и насыщенности клетками, клубочки мышей, являвшихся дважды мутантными, были по большей части нормальными. Около 25% действительно демонстрировали доказательство пролиферации мезангиальных клеток и 5% были фиброзными. Повторяли эти анализы на двух разных совокупностях мышей с получением очень сходных результатов.

Иммунофлуоресцентный анализ выполняли, используя замороженное корковое вещество почки, взятое из тех же животных. Эту ткань приводили во взаимодействие с антителами, специфичными для белков, известных их накоплением в КБМ в зависимости от развития заболевания почек Альпорта. Они включают в себя ламинин-1 (Ьаш-1) (применяли их в разведении 1:200), цепи коллагена α1(ΐν) и α2(ΐν) (СОЬ 4А1,2) (применяли их в разведении 1:15), фибронектин (ИЬ) (применяли их в разведении 1:200), гепаринсульфатпротеогликан (Н8Р) (применяли их в разведении 1:100) и энтактин (сп1) (применяли их в разведении 1:200). Разбавляли все антитела в 7% обезжиренном сухом молоке в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Результаты показывает фиг. 3. В возрасте 7 недель в КБМ Альпортовской мыши при сравнении с контролем все эти компоненты были значительно повышены. В фиброзных клубочках все эти компоненты имелись в изобилии. У дважды мутантного животного иммуноокрашивание на цепи коллагена α1(ΐν) и α2(ΐν) было сравнимо с таковым в нефиброзных клубочках у Альпортовских мышей. Этого ожидали, поскольку состав коллагена ΐν в КБМ у дважды мутантного животного такой же, как у Альпортовской мыши (т.е. составлен исключительно из цепей коллагена α1(ΐν) и α2(ΐν)). Окрашивание на ламинин-1 и гепаринсульфатпротеогликан в КБМ дважды мутантных животных было значительно снижено при сравнении с Альпортовскими мышами (сравните фиг. 3Е с 3Д и фиг. 3М с 3Л соответственно), и в КБМ дважды мутантных животных не было видимого окрашивания на фибронектин (фиг. 3И), которое обильно в КБМ Альпортовских мышей (фиг. 3З). Иммуноокрашивание на эти белки в мезан гиальном матриксе у дважды мутантных животных и у Альпортовских мышей было сравнимым, однако, окрашивание на гепаринсульфатпротеогликан в мезангиальном матриксе у дважды мутантных животных (фиг. 3М) было снижено относительно такового как у нормальных контролей (фиг. 3К), так и у Альпортовских мышей (фиг. 3Л).

Анализ нозерн-блоттингом выполняли, используя РНК, выделенные из суммарного коркового вещества почки от Альпортовских и дважды мутантных мышей в возрасте 7 недель. Фракционировали по 20 мкг каждого образца РНК на агарозном геле, переносили на нейлон капиллярным блоттингом и гибридизовали с меченным радиоактивным изотопом зондом, соответствующим части кДНК мышиного ТРФβ1. После серии отмывок с высокой строгостью экспонировали эти мембраны на рентгеновской пленке. Фиг. 9 показывает, что тогда как ТРФβ1 индуцирован в Альпортовской мыши (четвертая дорожка слева в сравнении со второй дорожкой слева, являющейся контролем), он не индуцирован в Альпортовских мышах, которые несут мутацию интегрина α1 (с двумя выбитыми генами) (третья дорожка слева в сравнении со второй дорожкой слева, которая является контролем). Именно эти данные привели исследователей к размышлениям о том, может ли эффект ингибиторов α1 быть опосредованным супрессией ТРФ-β 1. Таким образом, чтобы выяснить этот вопрос, провели эксперименты с ингибитором ТРФ-β 1, которые описаны ниже.

Пример 4. Роль ТРФ-β 1 в развитии заболевания почек Альпорта после протеинурии.

Собирали ткани от поколения Е2, полученного обратным скрещиванием исходных животных 129 8ν/1 с животными, имеющими генетический фон С57 Βΐ/6 (см. выше). Выполняли эксперименты по меньшей мере дважды (на образцах от двух разных совокупностей животных). Результаты для представленных здесь данных были ясными и устойчивыми.

Выполняли эти эксперименты, чтобы проиллюстрировать два момента. Во-первых, есть ли корреляция во времени между индукцией иРНК ТРФ-β 1 и иРНК, кодирующих белки матрикса, которые накапливаются в зависимости от развития заболевания почек Альпорта, и, вовторых, действительно ли эти иРНК индуцируются в клубочках? (Поскольку клубочки составляют только 5% от массы почек во влажном состоянии, индукция специфичных иРНК в суммарном корковом веществе почки в целом имеет больше отношения к прогрессирующему фиброзу, чем к гломерулоенфриту).

Выделяли суммарную РНК из почек Альпортовских животных и контрольных животных одного помета через двухнедельные интервалы, начиная с возраста 6 недель и заканчивая возрастом 12 недель. Протеинурия у мышей Е2, использованных в этом исследовании, начинается, когда возраст у этих мышей составляет примерно от 5,5 до 6 недель (данные не показаны). Фракционировали эту РНК на денатурирующих агарозных гелях, переносили на нейлоновые подложки и зондировали меченными радиоактивным изотопом зондами, специфичными для цепей коллагена αΐ(ΐν) или α2(ΐν), энтактина, цепей ламинина βΐ или β2, фибронектина или ТРФ-βΐ. Результаты фиг. 4 иллюстрируют то, что в модели Альпортовской мыши иРНК для всех этих белков, за исключением ламинина βΐ, индуцируются после начала протеинурии.

Также в то же время выполняли нозернблоттингом анализы для ламинина αΐ, ламинина β2, ламинина γΐ, корового белка гепаринсульфатпротеогликана и цепей коллагена α4(ΐν) и α5(ΐν) (данные не показаны). При сравнении контроля с мутантом не было видно значительных различий в уровнях иРНК для этих других белков базальных мембран.

Чтобы сделать непосредственную количественную оценку относительных изменений экспрессии специфичных иРНК по ходу этого времени, анализировали эти результаты анализа нозерн-блоттингом, используя фосфовизуализатор. Фиг. 5 иллюстрирует то, что индукция уровней этих специфичных иРНК сначала заметна в возрасте 6 недель или около того самого времени, когда у мышей Р2 белок в мочевом пространстве достигает максимальных уровней (Сокдгоуе е1 а1., Сенек Όβν., ΐ0:298ΐ-2992, ΐ996). К возрасту 8 недель уровни иРНК достигают пика, причем иРНК, кодирующие ТРФ-βΐ и фибронектин, индуцируются до уровней, которые в 6,6 и 9,4 раза, соответственно, больше таковых у контрольных мышей. В возрасте 8 недель уровни иРНК для коллагена αΐ (ΐν) и α2(ΐν) и энтактина были все индуцированы примерно в три раза. Напротив, по результатам тех же анализов суммарной РНК нозернблоттингом, значительных изменений в иРНК, кодирующих цепи ламинина βΐ и β2, не наблюдали ни в какой из моментов развития заболевания почек.

Чтобы проверить, индуцированы ли иРНК, кодирующие ТРФ-βΐ или другие компоненты базальных мембран, в конкретном типе клубочковых клеток, выполняли гибридизацию ίη Ши, используя меченые дигоксигенином антисмысловые зонды, специфичные по отношению к этим иРНК. Собирали почки от ΐθ-недельных Альпортовских мышей Р2 и от нормальных контролей из одного помета после перфузии через сердце 4%-ым формальдегидом в забуференном фосфатом физиологическом растворе и обрабатывали их для анализа, представляющего собой гибридизацию ίη Ши, как описано в разделе Методы. Антисмысловые зонды были специфичными по отношению к домену ЫС1 коллагена αΐ(ΐν), к ТРФ-βΐ, фибронектину, энтак тину или цепи ламинина βΐ. Зонд, специфичный по отношению к бактериальной β-галактозидазе, применяли как контроль на неспецифичное связывание (негативный контроль), поскольку этот зонд не гибридизовался с суммарной РНК почек мыши при нозерн-блоттинге (данные не показаны). Этот контрольный зонд гибридизовали в то же время, что и каждый специфический зонд, и после процедуры гибридизации обрабатывали той же концентрацией РНКазы А. Обработку РНКазой А проводили при концентрации 0,25 мкг/мл для αΐ(ΐν), ТРФβΐ и фибронектина и при 3 мкг/мл для энтактина и ламинина βΐ. Результаты показаны на фиг.

6.

Результаты, которые представляет фиг. 6, иллюстрируют то, что у мышей с выбитым СОЬ4Л3 (Альпортовские мыши) в висцеральных эпителиальных клетках (подоцитах) клубочка ясно наблюдаются повышенные уровни всех проверенных специфичных иРНК. В случае цепи коллагена αΐ(ΐν) экспрессия ее иРНК в контроле наблюдается как в мезангиальных, так и эндотелиальных клетках клубочка (фиг. 6А), что соответствует тому, где локализована эта молекула у зрелого животного. У мутанта может быть повышена экспрессия в мезангиальном матриксе, как об этом свидетельствует гораздо более темное окрашивание при сравнении с окрашиванием мезангиальных клеток в контрольном образце, однако наиболее очевидным различием между контролем и мутантом является кольцо окрашенных клеток, соответствующих подоцитам и выстилающих внешний периметр клубочка (фиг. 6Б). Экспрессия фибронектина в контрольном клубочке наблюдается главным образом в мезангиальных клетках (фиг. 6Г). При том, что окрашивание в мезангиальных клетках наблюдается также и в мутанте, значительные уровни иРНК фибронектина явно экспрессируются подоцитами (фиг. 6Д). Экспрессия ТРФ-βΐ в клубочках контрольных животных очень слабая, однако, в мезангиальных клетках контрольных животных некоторое специфическое окрашивание наблюдается (фиг. 6Ж). У мутанта уровни иРНК ТРФ-βΐ значительно повышены в мезангиальных клетках, эндотелиальных клетках и опять же в подоцитах (фиг. 63). В случае энтактина иРНК в контроле локализована в подоцитах, что не является неожиданным, поскольку этот белок локализован конкретно в КБМ. Неожиданно то, что у контрольных животных наблюдается некоторое окрашивание, специфичное по отношению к мезангиальным клеткам. Хотя окрашивание в висцеральных эпителиальных клетках у мутанта указывает, по-видимому, на повышенную экспрессию, данный анализ не является количественным, и различие между контролем и мутантом слишком мало, чтобы быть несомненным (сравните фиг. 6К и 6 Л).

Нозерн-блоттинг выявил то, что уровни иРНК для цепей ламинина β1 не изменялись в контроле при сравнении с мутантом на всем протяжении времени. Анализ гибридизацией ш 81!и для этих же иРНК иллюстрировал ожидаемую специфичную по отношению к мезангиальным клеткам локализацию в клубочках из контрольных почек (фиг. 6Н). Однако в клубочках из мутантных мышей иРНК явно индуцирована в висцеральных эпителиальных клетках (фиг. 60).

Собирали образцы ткани, когда возраст был 3 недели и 5 недель, и анализировали их гибридизацией ш 81!и, используя те же зонды. Паттерн окрашивания в этих клубочках был не отличим от такового у нормальных животных того же помета (данные не показаны). Из этого следует, что активация этих генов в подоцитах происходит после начала протеинурии.

Данные о белке ТРФ-31, основанные на иммунопероксидазной детекции с использованием антител, специфичных к активной изоформе этого цитокина, подтверждают данные, полученные анализом, представляющим собой гибридизацию ш 81!и, на иРНК ТРФ-31 (сравните иммуноокрашивание на фиг. 7Б и 7А). Это иллюстрирует то, что повышенная экспрессия иРНК ТРФ-31 в подоцитах транслируется в повышенный уровень белка.

Анализ защитой от РНКазы выполняли, чтобы определить, повышены ли уровни иРНК для этого цитокина также и в человеческом корковом веществе пациентов с синдромом Альпорта при сравнении с контрольными пациентами. Извлекали корковое вещество почки человека с синдромом Альпорта у 15-летнего мальчика при трансплантационной операции. Образец имел умеренный уровень скарификации, причем 50% клубочков были фиброзными. Образец немедленно извлекали и быстро замораживали в жидком азоте. РНК нормальных почек человека приобретали у С1опе!еск (Ра1о А1!о, СА), это был объединенный образец из коллекции нормальных человеческих источников. РНК из Альпортовского образца выделяли, используя ту же процедуру, что и в случае почек мыши. Проверяли эту РНК на целостность, фракционируя 10 мкг в агарозном геле и окрашивая гель бромидом этидия (10 мкг в мл воды). Судя по относительным количествам полос рибосомальных РНК 288 и 188, как нормальные, так и Альпортовские образцы были интактными. Эксперимент по защите от РНКазы проводили в соответствии с разделом “Методы”. Данные на фиг. 8 иллюстрируют то, что в человеческом Альпортовском корковом веществе почки иРНК ТРФ-31 увеличена в 3-4 раза относительно контроля. Это доказывает, что этот цитокин чрезмерно экспрессируется также в человеческих Альпортовских почках. Эти данные подтверждают предположение, что эта технология должна работать у людей.

Пример 5. Применение нейтрализующего антитела для блокирования интегрина α 1β1.

В качестве примера того, что растворимый агент, способный блокировать взаимодействие интегрина α1β1 с его лигандом, должен производить те же эффекты по отношению к патогенезу заболевания почек Альпорта, что и мутация, представляющая собой выбитый ген α1, получали антитело, которое описали РаЬЬп е! а1., Т188ие Апйдепк, 48:47-51, 1996. Это антитело инъецировали (400 нг/инъекция, внутрибрюшинно, три раза в неделю) Альпортовским мышам, начиная с возраста 2 недели. Собирали животных в возрасте 6 недель и анализировали базальные мембраны просвечивающей электронной микроскопией. Как показывает фиг. 10, базальные мембраны этих животных, подвергнутых воздействию, были по большей части регулярными, имеющими нормальный трехслойный вид. Набухание эндотелиальных клеток наблюдалось из-за иммунного ответа на антитело. Эти результаты иллюстрируют то, что растворимый агент, который блокирует рецептор-интегрин α1β1 должен замедлять развитие заболевания КБМ Альпорта во многом тем же путем, какой наблюдался в линии мышей с двумя выбитыми генами.

Пример 6. Эффекты ингибирования одного только ТРФ-[Н в модели Альпортовской (129 8ν/1) мыши.

Экспериментальный протокол состоял в том, чтобы инъецировать РК506 (2 мкг/г массы тела, внутрибрюшинное введение, Рицката Ркагтасеи!1са1 Со., Ь!й., Осака, Япония) или растворимый рецептор ТРФ-[Я (25 мкг/инъекция, внутривенно через хвостовую вену, ВШдеп Шс., Кэмбридж, Массачусетс) дважды в неделю, начиная с возраста 3 недели. Собирали почки в возрасте 7 недель и подвергали их описанным анализам.

Фиг. 11 иллюстрирует анализ просвечивающей электронной микроскопией ультраструктуры базальной мембраны в разных условиях. Фиг. 11А показывает клубочковую капиллярную петлю из нормального животного, не подвергнутого воздействию. Следует отметить регулярные опорные отростки и регулярное окрашивание трехслойной базальной мембраны. Фиг. 11Б показывает капиллярную петлю из типичной семинедельной Альпортовской мыши 129 8ν/Τ Следует отметить разбухшие опорные отростки и грубое фокальное утолщение КБМ. Фиг. 11 В иллюстрирует типичную капиллярную петлю из семинедельной Альпортовской мыши 129 8ν/1, подвергнутой воздействию РК506. Имеет место очевидное отсутствие утолщения базальной мембраны, из чего следует, что это лекарственное средство снижает скорость накопления матрикса в КБМ. Однако имеет место значительная степень набухания опорных отростков в сочетании с примечательным отсутствием строения опорного отростка. То же самое наблюдали и у мышей, которым инъецировали растворимый рецептор ТРФ-βΙ (фиг. 11Г). Эти данные иллюстрируют то, что ингибиторы ТРФβ1 могут предотвращать нерегулярное утолщение КБМ, но не могут предотвращать связанные с далеко зашедшим заболеванием КБМ Альпорта изменения в строении опорных отростков.

Обрабатывали некоторые из образцов почек для сканирующей электронной микроскопии. Обнажали клубочки морозобитием коркового вещества почки, которое удаляет боуманову (ВоАтаи'к) капсулу, обнажая внешний слой подоцитов, покрывающих капиллярные петли клубочка. Нормальный клубочек иллюстрирует фиг. 12А, где сложное строение подоцитов весьма очевидно, причем ветвящиеся опорные отростки опутывают капиллярные петли. У типичной семинедельной Альпортовской мыши на поверхности подоцитов в клубочках примечательно отсутствие нитчатых ответвлений, которые уничтожены набуханием (фиг. 12Б). У Альпортовского животного, подвергнутого действию либо ЕК506, либо растворимого рецептора ТРФ-31, поверхность клубочка выглядит во многом такой же, как у Альпортовской мыши, не подвергнутой воздействию (фиг. 12В). Эта фигура ясно демонстрирует то, что блокирование только ТРФ-31 не защищает от связанных с далеко зашедшим гломерулярным заболеванием Альпорта изменений в строении опорных отростков.

Протеинурию измеряли электрофорезом в полиакриламидном геле лиофилизированной мочи, которую собирали через недельные интервалы в течение воздействия лекарственным средством. Как отмечено прежде, присутствие и обилие альбумина в моче дает полную оценку целостности клубочкового фильтра. Фиг. 13 иллюстрирует то, что, хотя введение ингибиторов ТРФ-31 задерживает начало протеинурии, развитие к высоким уровням альбумина в моче происходит очень быстро (1 неделя). Эти результаты означают то, что ингибиторы ТРФ-31, когда применяют только их одних, не улучшают клубочковый фильтр, хотя они задерживают начало протеинурии. Вероятно, что это свойство имеет прямое отношение к неспособности этих ингибиторов предотвращать сглаживание опорных отростков подоцитов, описанное выше и проиллюстрированное фиг. 11 и 12.

Следует отметить, что введение лекарственных средств нормальным животным одного помета не приводило к различимым отличиям при сравнении с нормальными мышами, которыми не делали инъекций.

Пример 7. Влияние ингибиторов ТРФ-31 на мышей с двумя выбитыми генами (ΌΚΘ).

Мышам (мыши ΌΚΘ являются нулевыми по генам коллагена α3(ΐν) и интегрина α1) инъецировали ингибиторы ТРФ-31, которыми были ЕК506 (2 мкг/г массы тела дважды в неделю, внутрибрюшинные инъекции) и полученный от Вюдеи растворимый рецептор ТРФ-31 (25 мкг на инъекцию, дважды в неделю, внутривенное введение), начиная с возраста четыре недели. Брали почки в возрасте 10 недель и анализировали. Момент времени 10 недель был выбран потому, что при двух выбитых генах заболевание обычно прогрессирует до точки, в которой наблюдается значительное нерегулярное утолщение КБМ, и животные начинают переходить к конечной стадии почечной недостаточности. Таким образом, если ингибиторы ТРФ-[(1 должны приносить дополнительные защитные преимущества, эти преимущества должны быть заметными на этой стадии развития заболевания КБМ. Анализ просвечивающей электронной микроскопией показал очень ясные и устойчивые различия между мышами, которым инъецировали эти ингибиторы, и не подвергнутыми воздействию мышами с двумя выбитыми генами. Типичный пример этих различий проиллюстрирован на Фиг. 14. Фиг. 14 иллюстрирует типичный пример этих различий. Фиг. 14В иллюстрирует типичный профиль клубочковой капиллярной петли у десятинедельной мыши с двумя выбитыми генами. Примечательны значительные очаги утолщения базальной мембраны, характерные для прогрессирующего гломерулонефрита Альпорта. Опорные отростки подоцитов даже на стадии далеко зашедшего заболевания обладают высокой степенью регулярного строения с хорошо развитыми щелевыми диафрагмами. Эти характеристики мышей с двумя выбитыми генами отсутствуют у Альпортовских мышей (сравните опорные отростки с теми, что показывает фиг. 12Б).

Когда на мышей с двумя выбитыми генами воздействовали ингибиторами ТРФ-βΕ имело место значительное снижение как фокального утолщения КБМ, так и сглаживания опорных отростков (фиг. 14В: действие ЕК506; фиг. 14Г: действие растворимого рецептора ТРФ-31). Хотя в большинстве клубочков ультраструктура КБМ не была полностью нормальной (следует отметить умеренную нерегулярность КБМ на фиг. 14Г), у тех мышей с двумя выбитыми генами, которых не подвергали воздействиям, на этой стадии развития полностью отсутствуют значительные очаги утолщения КБМ (как в фиг. 14Б). Примерно у 25% клубочков, которых анализировали таким путем, ингибиторы ТРФ-[(1 восстанавливали клубочковую ультраструктуру до степени, при которой клубочки мышей ΌΚΘ были неотличимы от таковых у нормальных мышей (фиг. 15А показывает КБМ десятинедельной нормальной мыши; фиг. 15Б показывает КБМ десятинедельной мыши с двумя выби53 тыми генами, которую подвергали действию РК506). Этот результат воистину уникален и примечателен с учетом того, что это двухнедельный срок после среднего возраста наступления конечной стадии почечной недостаточности у не подвергнутой манипуляциям животной Альпортовской модели.

Протеинурию проверяли у этих же самых мышей еженедельными сборами по ходу воздействия. Анализировали образцы (эквивалентные примерно половине микролитра) электрофорезом на полиакриламидных гелях. Визуализировали альбумин красителем кумасси синим. Результаты, которые показывает фиг. 16, иллюстрируют то, что оба воздействия, как РК506 (фиг. 16Г), так и растворимым рецептором для ТРФ-31 (фиг. 16Б), значительно улучшали работу клубочкового фильтра при сравнении с теми мышами с двумя выбитыми генами, которых не подвергали воздействию (фиг. 16 А). Фиг. 16В показывает белок мочи нормальных мышей, подвергнутых воздействию РК506. Примечательна диффузная группа полос, видных на каждой точке времени как у нормальных мышей, так и у мышей ΌΚΘ (фиг. 16Г), которых подвергали воздействию РК506. Это всегда наблюдали у мышей, на которых действовали этим лекарственным средством, и, возможно, это имеет отношение к нефротоксическим эффектам, о которых сообщали при лечении этим лекарственным средством некоторых пациентов после пересадки органа (8о1ех е! а1., Тгапкр1ап!аΐΐοη, 66:1736-1740, 1998).

Пример 8. Механизмы синергических эффектов блокаторов интегрина α1 и ингибиторов ТРФ-31 при замедлении начала и развития гломерулонефрита Альпорта.

Фиг. 11, 12 и 14 вместе иллюстрируют данные, из которых следует, что причина синергичности блокаторов интегрина α1 с блокаторами ТРФ-31 состоит в том, что ингибирование α 1 приводит к улучшенному строению опорных отростков подоцитов, тогда как ингибирование ТРФ-31 приводит к сниженным отложениям матрикса в КБМ. Фиг. 17 дана для того, чтобы далее подтвердить роль блокаторов интегрина α1 в улучшении строения опорных отростков подоцитов. Корковое вещество почки подготавливали тем же путем, как и в случае, который иллюстрирует фиг. 12. Фиг. 17А иллюстрирует поверхность клубочка из нормальной мыши в возрасте 7 недель. Фиг. 17Б иллюстрирует поверхность клубочка из Альпортовской мыши в возрасте 7 недель. Следует отметить потерю строения подоцитов из-за сглаживания опорных отростков. Фиг. 17В иллюстрирует поверхность клубочка из мыши с двумя выбитыми генами в возрасте 7 недель. Следует отметить почти полное восстановление нормального строения базальных отростков. Эти данные соответствуют виду поперечного, полученному просвечивающей электронной микроскопией, который показывает фиг. 14Б, где опорные отростки у мыши с двумя выбитыми генами имеют великолепную морфологию.

Пример 9. Эффект блокирования интегрина α1.

При исследовании правдоподобного механизма этого феномена оценивали цепи ламинина. Поскольку известно, что первичным ламинином, обнаруживаемым в клубочковой базальной мембране, является ламинин 11 (Мтег е! а1.,

1. Се11 Βίο1., 137:65-701, 1997), считали, что появление нового ламинина в Альпортовских КБМ может участвовать в потере прикрепления подоцитов к КБМ. Действительно, при проверке состава ламининов в Альпортовских КБМ обнаружили в КБМ Альпортовских мышей цепь ламинина α2, которая в норме локализована исключительно в мезангиальном матриксе нормальных мышей. Фиг. 18 иллюстрирует серию панелей иммуноокрашивания клубочков с использованием протокола, предусматривающего двойное флуоресцентное мечение.

При анализе двойной флуоресценцией свежее корковое вещество почки заключали в водную среду Тщкие Тек, моментально замораживали и нарезали на криостате при толщине 4 микрона. Слайды подвергали постфиксации в холодном (-20°С) ацетоне в течение 10 мин и затем сушили на воздухе в течение ночи. Восстанавливали гидратацию тканей тремя промывками в забуференном фосфатом физиологическом растворе, каждая по 10 мин. Разбавляли первые антитела все вместе в 7% обезжиренном сухом молоке (ΒίοРад). В качестве известного маркера клубочковых базальных мембран использовали антиэнтактиновое антитело (Сйеш1соп 1пс.) в разведении 1:200. Антитело, специфичное к цепи ламинина α2, подарил д-р Ре!ег Уигскепко (РоЬеП Аоод ШЬпкоп Мед1са1 8скоо1, Рйсарцуау. N1). Специфичность этого антитела для цепи ламинина α2 иллюстрирована в Скепд е! а1., 1. Вю1. С1ет., 272:31525-31532, 1997. Это антитело использовали в концентрации 1:10. Первым антителам давали реагировать в течение ночи при 4°С в увлажненной кювете. Промывали слайды три раза, по 10 мин каждый раз, в холодном забуференном фосфатом физиологическом растворе, затем приводили их во взаимодействие со вторыми антителами, причем их также добавляли всех вместе. Вторыми антителами для ламинина α2 были меченные техасским красным антикроличьи антитела, а для энтактина - меченные флуоресцином антикрысиные антитела, причем применяли и те, и другие в разведении 1:100 ^ес!ог ЬаЬога!опе8, ВиДтдате, СА). Вторым реагентам давали реагировать в течение 4 ч при 4°С. Промывали слайды три раза, по 10 мин каждый раз, в холодном забуференном фосфатом физиологическом растворе и перед герметизацией под по55 кровными стеклами наносили каплю антифэдинговой закрепляющей среды νοοίακίιίοΐά (νοοίΘΓ БаЬогаЮпск. ВЫтдате, СА). Накладывали изображения для каждого антитела одно на другое цифровым способом, используя эпифлуоресцентный микроскоп ВН-2 в комплексе с системой анализа изображений СуЮуыоп ИНга (АррНеб 1тадшд, 1пс.).

Антиген, специфичный для клубочковых базальных мембран (энтактин), окрашивается в зеленый цвет, тогда как цепь ламинина α2 окрашивается в красный цвет. В местах, где энтактин и ламинин α2 локализованы совместно, окраска желтая. На фиг. 18, группа I, панель А представляет иммуноокрашивание клубочка из нормальной мыши в возрасте 7 недель. Здесь ламинин α2 локализован исключительно в мезангиальном матриксе. Панель Б иллюстрирует окрашивание у Альпортовской мыши одного помета в возрасте 7 недель. Указанные стрелками капиллярные петли окрашены преимущественно в желтый цвет, иллюстрируя то, что у Альпортовской мыши ламинин α2 локализован как в мезангиальном матриксе, так и в клубочковой базальной мембране. Панель В показывает иммуноокрашивание в клубочке из Альпортовской мыши 129 δν/Б, которую подвергали воздействию РК506 (корковое вещество брали от животных, использованных в вышеописанных экспериментах, представленных фиг. 11, 12 и 13). Здесь опять же клубочковые капиллярные петли в большинстве желтые, и это показывает, что ингибирование активности ТРФ-β 1 не предотвращает накопление ламинина α2 в КБМ Альпортовских мышей. Однако у семинедельных мышей с двумя выбитыми генами иммуноокрашивание на ламинин α2 в клубочковых капиллярных петлях отсутствует (панель Г, стрелки). Преобладающим рецептороминтегрином на поверхности подоцитов является интегрин α3β1 (Ра!еу е! а1., Се11 АбБекюп апб Соттишсабоп, 2:159-167, 1994). Широко распространено мнение, что этот интегрин играет ключевую роль в прикреплении подоцитов к КБМ и поддержании нормального строения опорных отростков (8тоуег апб Мипбе1, Б. Мо1. Меб., 76:172-183, 1998). В качестве примера, недавно было показано, что выбивание гена интегрина α3 приводит к полному разрушению строения опорных отростков подоцитов (Кге1Ьегд е! а1., Оеуе1ортеп1, 122:3537-3547, 1996). Более недавно был получен растворимый рецептор-интегрин α3β1, и было показано, что он с высоким сродством связывается с ламининами, содержащими цепь ламинина α5 (типа ламинина-11, который является гетеродимером, состоящим из цепей α5, β2 и γ1), но не ламининами, содержащими цепь ламинина α2 (ЕЬ1е е! а1., ВюсНетМгу, 37:10945-10955, 1998). Взятые вместе с этой информацией, представленные здесь данные подтверждают модель, в которой у

Альпортовской мыши прогрессивное отложение ламининов, содержащих ламинин α2, в КБМ приводит к сниженной адгезии через рецепторы-интегрины α3β1, что приводит к сглаживанию опорных отростков. Блокирование цепи интегрина α1 приводит к снижению или отсутствию отложения цепи ламинина α2 в КБМ, что предотвращает потерю нормального строения опорных отростков.

Для того чтобы обосновать эту позицию далее, оценивали распределение цепи ламинина α2 у двухнедельных Альпортовских мышей δν/Б в сравнении с нормальными мышами одного помета. На этой, самой ранней, стадии развития заболевания КБМ имели место заметные очаги утолщения КБМ, разреженно распределенные на примерно половине клубочков. Один такой очаг утолщения КБМ показан на фиг. 19Б. На этой стадии развития, КБМ и опорные отростки подоцитов являются морфологически нормальными и непораженными областями клубочков, однако в областях фокального утолщения опорные отростки распухшие и сглаженные, что во многом подобно более генерализованным изменениям, распознаваемым позже в развитии заболевания КБМ. Полагали, что, если отложение ламинина α2 приводит к потере фокальных адгезионных контактов с подоцитами, у двухнедельных Альпортовских мышей должны быть видны фокальные отложения ламинина α2 в КБМ. Это действительно так, как иллюстрирует фиг. 18, группа II. Стрелки на панели Б обозначают фокальное отложение ламинина α2 в КБМ двухнедельных Альпортовских мышей. Это самое раннее молекулярное изменение (отличное от изменения состава коллагена типа IV, которое происходит из-за врожденных генетических мутаций), когда-либо выявленное в модели Альпортовской мыши и оно в точности соответствует началу выявляемого повреждения КБМ.

Пример 10. Синергический эффект ингибиторов ТРФ-β 1 и блокаторов интегрина α1.

Как иллюстрирует фиг. 3, матрикс, который накапливается в КБМ и интерстициальном пространстве в зависимости от патогенеза заболевания почек Альпорта, включает в себя цепи коллагена а1(РУ) и а2(БУ), фибронектин и энтактин. Как иллюстрирует фиг. 20 (первые две дорожки каждого геля), иРНК, кодирующие каждый из этих белков, в Альпортовских почках индуцированы относительно нормальных контролей. Введение ингибиторов ТРФ-β1 значительно снижает степень индукции (фиг. 20, две последние дорожки на геле). Это может быть причиной снижения утолщения базальных мембран, наблюдаемого у Альпортовских мышей δν/Б, которых подвергали воздействию ингибиторов ТРФ-β 1 (иллюстрировано фиг. 11).

Такую же совокупность анализов нозернблоттингом выполняли с использованием РНК из почек мышей с двумя выбитыми генами, ли57 бо не подвергнутых воздействиям, либо получивших инъекции ингибиторов ТРФ-β 1. Это были те же мыши, которых использовали, чтобы получить данные, представленные фиг. 14, так что протокол инъекции лекарственных средств описан в примере 7. Из данных, представляемых фиг. 21, очевидно, что введение ингибиторов ТРФ-β 1 не приводит к значительным изменениям уровней иРНК, кодирующих белки матрикса, если сравнивать с не получавшим инъекций контролем относительно мышей с двумя выбитыми генами. Однако имеет место выраженное действие на экспрессию иРНК, кодирующих ингибитор металлопротеиназ ТИМП-3, при добавлении к зондам (фиг. 21, нижний ряд). Как видно по дорожкам 1 и 2, в почке тех десятинедельных мышей с двумя выбитыми генами, на которых не оказывали воздействия, имеет место выраженное снижение экспрессии ТИМП-3 относительно контрольных мышей (девятикратная разница, по результатам анализа фосфовизуализацией). Это снижение экспрессии ТИМП-3 не наблюдается у тех мышей с двумя выбитыми генами, которым инъецировали либо РК506 (дорожки 3 и 4), либо растворимый рецептор ТРФ-β 1 (дорожки 5 и 6). Это же действие на экспрессию ТИМП-3 наблюдали у мышей 3ν/1 (фиг. 20, нижний ряд), что иллюстрирует то, что способность ингибировать подавление иРНК ТИМП-3 у Альпортовских мышей является результатом ингибирования ТРФ-β 1, а не двойного ингибирования интегрина α1 и ТРФ-β 1.

Функциональная важность этого наблюдения основана на том факте, что ТИМП-3 является модулятором матриксных металлопротеиназ, и предполагается, что он играет ключевую роль в гомеостазе почечных базальных мембран и в потере гомеостаза при заболевании (Екрокйо е! а1., К1бпеу 1п!., 50:506-514, 1996; ЕШо! е! а1., 1. Ат. Зос. ЫербгоР, 10:62-68, 1999).

Снижение экспрессии ингибитора металлопротеиназ ТИМП-3 должно приводить к соответствующему увеличению активности металлопротеиназ. Такое увеличение может вызывать повреждение базальных мембран, приводящее к активации ТРФ-β 1 с одновременным накоплением матрикса. Разрыв этого цикла будет, таким образом, приводить к восстановлению гомеостаза базальных мембран, что должно выражаться восстановлением морфологии КБМ, причем именно это и наблюдалось (фиг. 11, 14 и 15).

Пример 11. Ингибирование интерстициального фиброза у подвергнутых воздействию ингибиторов ТРФ-β 1 мышей с двумя выбитыми генами.

Роль ТРФ-β 1 в повышении уровня матриксных белков и в почечном фиброзе вполне установлена (Уапб е! а1., 1. Ат. Зос. ЫерЬгоР,

5:1610-1617, 1994; Вогбег апб Виок1аб!1, 1. С1ш.

[пуекТ, 90:1-7, 1992). У мышей с двумя выбитыми генами почечный интерстициальный фиброз задержан, но становится широко распространенным в возрасте около 10 недель и прогрессирует через конечную стадию почечной недостаточности в возрасте около 15 недель. Анализировали животных, которым вводили ингибиторы ТРФ-β 1, с использованием трех маркеров интерстициального фиброза и при прямом сравнении с десятинедельными животными с двумя выбитыми генами, на которых не воздействовали ингибиторами. Животным делали инъекции с применением того же протокола как и тот, который применяли, чтобы получить фиг. 14 в примере 7. У фиг. 22, 23 и 24 панель А представляет контроль, панель Б представляет тех мышей с двумя выбитыми генами, которые не были подвергнуты воздействию, панель В представляет тех мышей с двумя выбитыми генами, которых подвергали действию РК506, а панель Г представляет тех мышей с двумя выбитыми генами, которых подвергали действию растворимого рецептора ТРФ-β 1. Все эти графические материалы представляют полученные при низком увеличении (х 50) картины коркового вещества почки. Фиг. 22 представляет окрашивание метенамином серебра по Джонсу, которое является стандартным гистохимическим окрашиванием для матрикса. Очевидно, что матрикс накапливается в интерстициальном пространстве коркового вещества почки у мышей, не подвергнутых воздействиям (сравните панель Б с панелью А). Однако корковое вещество почки от животных, на которых действовали какимлибо из ингибиторов ТРФ-β 1, было неотличимо от контроля, что указывает на то, что фиброз небольшой, или его нет. Обычно применяемые молекулярные маркеры почечного интерстициального фиброза включают в себя коллаген типа ΐ и фибронектин (Уатато!о е! а1., К1бпеу 1п!., 45:916-927, 1994). Фиг. 23 иллюстрирует иммуноокрашивание на коллаген типа ΐ. Ясно, что коллаген типа ΐ накапливается в интерстициальном пространстве коркового вещества почки животных, которых не подвергали воздействиям (сравните панель Б с контролем в панели А). Панели Б и В фиг. 23 иллюстрируют относительное отсутствие накопления коллагена типа ΐ в почках из тех мышей с двумя выбитыми генами, которых подвергали воздействию РК506 или растворимого рецептора, соответственно. То же сценарий справедлив и для фибронектина, который обилен в корковом веществе почки у тех мышей с двумя выбитыми генами, который не подвергали воздействиям (фиг. 24Б), и во многом подобен контролям в корковом веществе почки тех мышей, которым инъецировали ингибиторы ТРФ-β 1 (фиг. 24, панели В и Г). Все вместе эти данные указывают на то, что ингибиторы ТРФ-β 1 в комбинации с блокаторами интегрина α1 эффективны в предотвращении (или задерживании) интерстициального фиброза в модели Альпортовской мыши.

Все ссылки, патенты, заявки на патенты и публикации, которые были здесь цитированы, явным образом включены в данное описание ссылками на них. Специалисты должны понимать, что, хотя это изобретение было описано выше в связи с конкретными воплощениями и примерами, это изобретение, таким образом, совсем не ограничено, и что можно создавать многие другие воплощения, примеры, применения, модификации и отступления от этих воплощений, примеров и применений без отступления от объема изобретения этой заявки.

Перечень последовательностей <110> ΒΟΥ3 ТОНН ЫАТЮЫАЬ КЕ5ЕАВСН НОЗЙТАЬ <120> Применение ингибиторов рецепторов-интегринов α1β1 и ингибиторов ΤΡΦ-βΐ при лечении заболевания почек <130> 249.00010230 <140> РСТ/Ц399/11073 <141> 1999-05-19 <150> 60/006,507 <151> 1990-05-22 <150> 09/088,766 .

<151> 1998-06-02 ’ <150> 09/150,405 <151> 1990-09-09 <160> 26 <170> Раеепе1п Уег. 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 1

СсСдСддасс аСддсССс 10 <210> 2 · <211> 18 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 2

ССсСеа1:дса сасЬСддс 18 <210> 3 <211> 18 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 3 ддсСассСсс ЕддСдаад ' 18 <210> 4 . .

<211> 18 ' <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 4

ССсаСдсаса с^Еддсад 18 <210> 5 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 5 сдддссасаС ЕсСсс 15 <210> 6 <211> 17 <212> ДНК · <21з> Искусственная последовательность .

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 6 ддадкддссд ЬСдсаСЕ17 <210> 7 <211> 17.

<212> ДНК<21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 7 ассадСасса аддсдда17 <210> 8 ' <211> 18 <212> ДНК · <213> Искусственная последовательность <220> ' <223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 8‘

ЪсаСТдадсс ЬдЬСса.дд18 <210> 9 <211> 21 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 9

ЕададдСЪас СБСдсадсад а 21 <210> 10 <211> 21 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220> · <223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 10

- СБддаБаСсс ТсаСсадсСЬ д 21 <210> 11 <211> 21 <212> ДНК <21Э> Искусственная последовательность <220> · <223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> И дЕддЕЕСасс ддасадасас с 21 <210> 12 · <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 12 ссааЕсЕдСс сааСааадд 19 <21О> 13 <211> 26 <212> ДНК _; <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 13, асасасЕсса адсссасааа адсаад26 <210> 14 <211> 24 <212> ДНК· <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 14 дадддаадас СссЕСдЕадд Есаа 24 <210> 15 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 15 дсададсддд сасддадс 18 <210> 16 <211> 21 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 16

СдСассЕдсс аСссЬсЬссЕ д 21 <210> 17 <211> 21 · <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> ' <223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 17 .

ссссеаСсСа сассЬасасс а ‘ 21 <210> 18 · <211> 21 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 18

СдСсасЕдЕс сдссаааСаа а - 21 <210> 19 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 19 садаадаада дссСдаасса са ' 22 <210> 20 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 20 дЕассасдсд саадаасс 18 <210> 21 ' <211> 25 <212> ДНК .

<213> Искусственная последовательность <220> · · <223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 21 ддЕсЕасасС аЕЕаадсада Едаад ’ 25 <210> 22 <211> 21 · <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220>

<22з> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 22 ааааСЬддад адсаЕдЕсдд Е 21 <210> 23 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22з> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 23 дсадаадЕЕд дсаСддЕад 19 <210> 24 <211> 20 · <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 24 ддасассаас дддЬЕсасЕа 20 <210> 25 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 25 дсадаадСЕд дсаЕддСад 19 <210> 26 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 26 ддасаСсаас дддСЕсасЕа 20

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения или ограничения расстройства почек у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора рецептора-интегрина α 1β1.
2. Способ по п.1, где указанное расстройство почек включает в себя почечный гломерулонефрит, почечный фиброз или оба указанные заболевания.
3. Способ по п.2, где почечный гломерулонефрит или почечный фиброз связан с синдромом Альпорта, нефритом при инсулинзависимом сахарном диабете, мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом, мембранознопролиферативным гломерулонефритом, серповидным гломерулонефритом, диабетической нефропатией или почечным интерстициальным фиброзом.
4. Способ по любому из пп.1-3, где ингибитор рецептора-интегрина α1β1 представляет собой блокирующий агент, который связывается с участком связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки.
5. Способ задерживания начала и/или замедления развития синдрома Альпорта у пациента, включающий блокирование участка связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки пациента.
6. Способ задерживания начала и/или замедления развития заболевания почек при инсулинзависимом сахарном диабете у пациента, включающий блокирование участка связывания рецептора-интегрина α1β1 на поверхности клетки почки пациента.
7. Способ по п.4, 5 или 6, где блокирование участка связывания рецептора-интегрина α 1β1 осуществляют с помощью агента, который содержит пептид, нейтрализующее антитело или протеолитический фрагмент.
8. Способ по п.7, где пептид представляет собой антитело.
9. Способ по п. 8, где пептид представляет собой по меньшей мере 9-мерный фрагмент белка, выбранного из группы, состоящей из ламинина, фибронектина, энтактина и коллагена типа 4.
10. Способ задерживания начала и/или замедления развития синдрома Альпорта или заболевания почек у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора рецептора-интегрина α1β1, представляющего собой агент, который ингибирует передачу сигналов через рецептор-интегрин α 1β1 клетки почки.
11. Способ задерживания начала и/или замедления развития синдрома Альпорта или заболевания почек у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора рецептора-интегрина α 1β1.
12. Способ лечения неровностей клубочковой базальной мембраны у пациента, страдающего заболеванием почек, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора рецептора-интегрина α1β1.
13. Способ по п.12, где неровности клубочковой базальной мембраны приводят к сглаживанию опорных отростков подоцитов.
14. Способ по п.10, 11 или 12, где ингибитор рецептора-интегрина α1β1 содержит пептид.
15. Способ по п.14, где пептид представляет собой антитело.
16. Способ по любому из пп.5-9, включающий дополнительное введение пациенту ингибитора ТРФ-β 1.
17. Способ по любому из пп.1-4 или 10-12, включающий дополнительное введение пациенту ингибитора ТРФ-β 1.
18. Способ по п.17, при котором введение ингибитора рецептора-интегрина α1β1 и инги битора ТРФ-β 1 осуществляют одновременно или последовательно.
19. Способ по п.16, 17 или 18, где ингибитор ТРФ-β 1 необратимо связывается с ТРФ-β 1 и ингибирует его способность связываться со своим рецептором.
20. Способ по п.16, 17 или 18, где ингибитор ТРФ-β 1 представляет собой агент, который ингибирует способность ТРФ-β 1 передавать сигналы в ядро клетки почки.
21. Способ по п.16, 17 или 20, где ингибитор ТРФ-β 1 представляет собой ингибитор кальцийнейрина или химерный слитой белок.
22. Способ задерживания начала и/или замедления развития заболевания почек при инсулинзависимом сахарном диабете у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества агента, который ингибирует передачу сигналов через рецептор-интегрин α 1β1 клетки почки.
23. Способ ограничения почечного фиброза у пациента, включающий снижение активности ТРФ-β 1 у пациента при одновременном ингибировании рецепторов-интегринов α1β1 клеток почки пациента.
24. Способ по п.23, при котором снижение активности ТРФ-β 1 осуществляют путем использования агента, который необратимо связывается с ТРФ-β 1 и ингибирует его способность связываться со своим рецептором либо ингибирует способность ТРФ-β 1 передавать сигналы в ядро клетки почки.
25. Способ ограничения почечного фиброза у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества ингибитора кальцийнейрина.
26. Способ по п.21 или 25, где ингибитор кальцийнейрина представляет собой такролимус.
27. Мышиная модель заболевания почек, отличающаяся тем, что мышь не экспрессирует нормальный состав коллагена типа 4 в своей клубочковой базальной мембране и не экспрессирует рецептор-интегрин α 1β1.
28. Мышиная модель по п.27, где у мыши не включены в ее клубочковую базальную мембрану цепи коллагена α3(ΐν), α4(ΐν) и α5(ΐν).
29. Способ отбора агента для применения в ограничении расстройства почек, включающий введение агента мышиной модели по п.27 или 28 и последующую оценку состояния почечной ткани указанной модели.
30. Способ ограничения накопления матрикса в клубочковой базальной мембране (КБМ) у пациента с синдромом Альпорта, включающий снижение у пациента активности ТРФ-β 1.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор рецептора-интегрина α1β1 и ингибитор ТРФ-β 1.
32. Фармацевтическая композиция по п.31, где ингибитор рецептора-интегрина α1β1 пред65 ставляет собой блокирующий агент, который связывается с участком связывания рецептораинтегрина αϊβΐ на поверхности клетки почки.
33. Фармацевтическая композиция по п.32, где указанный агент, блокирующий рецепторинтегрин αϊβΐ, содержит пептид, нейтрализующее антитело или протеолитический фрагмент.
34. Фармацевтическая композиция по п.33, где пептид представляет собой по меньшей мере 9-мерный фрагмент белка, выбранного из группы, состоящей из ламинина, фибронектина, энтактина и коллагена типа 4.
35. Фармацевтическая композиция по любому из пп.31-34, где ингибитор ТРФ-βΐ необ ратимо связывается с ТРФ-βΐ и ингибирует его способность связываться со своим рецептором.
36. Фармацевтическая композиция по любому из пп.31-34, где ингибитор ТРФ-βΐ представляет собой агент, который ингибирует способностьТРФ-βϊ передавать сигналы в ядро клетки почки.
37. Фармацевтическая композиция по п.36, где ингибитор ТРФ-βΐ представляет собой ингибитор кальцийнейрина.
38. Фармацевтическая композиция по п.37, где ингибитор кальцийнейрина представляет собой такролимус.