ES2285841T3

ES2285841T3 - Uso de inhibidores del receptor de integrina alfa1beta1 e inhibidores de tgf-beta1 en el tratamiento de la enfermedad renal.

Info

Publication number: ES2285841T3
Application number: ES99923224T
Authority: ES
Inventors: Dominic Cosgrove
Original assignee: Boys Town National Research Hospital
Current assignee: Boys Town National Research Hospital
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2019-05-19
Also published as: EA004145B1; CN1310625A; BR9911067A; EP1079843A2; CZ296262B6; WO1999061040A3; CA2329757A1; JP2002516287A; NO20005883D0; TR200003432T2; CN1187084C; DE69935853T2; CA2329757C; WO1999061040A2; NZ508317A; EE04581B1; PT1079843E; EP1079843B1; PL345946A1; ATE359804T1

Abstract

Uso de un inhibidor del receptor de integrina alfa1beta1 para la preparación de una composición farmacéutica para limitar un trastorno renal.

Description

Uso de inhibidores del receptor de integrina \alpha1\beta1 e inhibidores de TGF-\beta1 en el tratamiento de la enfermedad renal.

Esta invención se refiere al campo de la enfermedad renal (es decir, trastorno renal) caracterizada por glomerulonefritis y/o fibrosis. En particular, esta invención se refiere al uso de inhibidores del receptor de integrina \alpha1\beta1 para preparar una composición farmacéutica para limitar trastornos renales. Además, esta invención se refiere al uso de inhibidores de integrina \alpha1\beta1 combinados con inhibidores de TGF-\beta1 para preparar una composición farmacéutica para limitar los trastornos renales.

En Estados Unidos, aproximadamente 12.000 personas viven actualmente con el síndrome de Alport. Este trastorno hereditario da como resultado una enfermedad renal progresiva que sólo se puede tratar con diálisis y transplante de riñón. Los riñones transplantados normalmente son rechazados. Por lo tanto, se necesitan tratamientos alternativos. Sin embargo, actualmente no hay un tratamiento que se dirija al mecanismo del inicio o el avance de la enfermedad. Por lo tanto, lo que se necesita es un tratamiento que ataque el mecanismo del inicio y/o avance de la enfermedad, uno que pueda ralentizar sustancialmente las afecciones de la enfermedad, tales como la glomerulonefritis y la fibrosis renal.

Hay una serie de enfermedades renales asociadas con alteraciones en la homeostasia de la matriz, en las que se interrumpe el delicado equilibrio de la síntesis y el ciclo metabólico de las moléculas estructurales. Como ejemplo, el síndrome de Alport es una enfermedad que da como resultado la insuficiencia renal progresiva asociada con pérdida auditiva neurosensorial. Afecta más a los portadores varones y los estudios ultraestructurales ponen de manifiesto anomalías en la membrana basal glomerular (GBM) de los individuos afectados. Aproximadamente una de cada 20.000 personas tiene síndrome de Alport, los cual hace que la enfermedad sea uno de los trastornos genéticos conocidos más frecuente. Véase, por ejemplo, Atkin y col., "Alport Syndrome" en R.W. Schrier & C.W. Gottschalk (Eds.), Diseases of the Kidney, 4th ed., Chap. 19, Little Brown, Boston, pp. 617-641, 1988. El síndrome de Alport ligado al cromosoma X lo causa cualquiera de una serie de mutaciones en el gen del colágeno 4A5 (Barker y col., Science, 348:1224-1227, 1990). Se han identificado al menos 60 mutaciones diferentes en el gen. La forma autosómica del síndrome de Alport presenta la misma variedad de fenotipos que la forma ligada al cromosoma X y resulta de mutaciones en el gen 4A3 (COL4A3) o 4A4 (COL4A4) del colágeno de la membrana basal. Véase, por ejemplo, Lemmink y col., Hum. Mol. Gen., 3:1269-1273, 1994, y Mochizuki y col., Nature Genet., 8:77-81, 1994. Otras enfermedades de la membrana basal incluyen el síndrome de Goodpasture que se debe a una respuesta autoinmune aguda dirigida contra un epítopo del dominio NC1 del colágeno 4A3 (Hudson y col., Kidney Int., 43:135-139, 1993), y la leiomiomatosis, un tumor benigno del músculo liso que se asocia con la deleción tanto del colágeno 4A5 como 4A6 (Zhou y col, Science, 261:1167-1169, 1993).

Las membranas basales son estructuras extracelulares especializadas asociadas con casi todos los órganos y tejidos del cuerpo. Normalmente se encuentran en el límite entre las células y el tejido conjuntivo, pero también se pueden encontrar entre las células epiteliales y endoteliales, como en el caso de un glomérulo renal (es decir, grupo de capilares). Las unidades estructurales predominantes de las membranas basales incluyen colágeno de tipo IV, laminina, proteoglicano sulfato de heparina, entactina y a veces fibronectina y colágeno de tipo V. El componente de mayor representación en todas las membranas basales es el colágeno de tipo IV, un tipo de colágeno distinto que se encuentra sólo en membranas basales. En su forma original, tipo IV, como todos los colágenos, está compuesto de tres moléculas de colágeno unidas en una triple hélice que consiste en diferentes combinaciones de seis cadenas alfa (4A1-4A6). Las cadenas 4A1 y 4A2 (también denominadas las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV)) son las más comunes (Timpl, J. Biochem., 180:487-502, 1989). Los colágenos de tipo IV difieren de los colágenos intersticiales en una serie de aspectos. La estructura helicoidal de la asociación de cadenas alfa no se adhiere estrictamente al motivo de glicina-X-Y observado en otros colágenos; contiene 3-hidroxiprolina en lugar de 4-hidroxiprolina, y es rico en hidratos de carbono. La superestructura de colágeno resultante es una red como una tela metálica de colágeno de la membrana basal. Esta red es el cimiento sobre el que se unen las moléculas auxiliares (laminina, sulfato de heparina, etc.)

Las membranas basales son estructuras muy heterogéneas, lo cual explica sus propiedades funcionales diversas. La complejidad de estas estructuras todavía se entiende poco. Hace poco que se han descubierto varias cadenas nuevas de colágeno de la membrana basal (cadenas alfa 3, 4, 5 y 6). Véase, por ejemplo, Gunwar y col., J. Biol. Chem., 266:15318-15324, 1990; Hostikka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1606-1610, 1990; Butkowski y col., J. Biol. Chem., 262:7874-7877, 1987; y Zhou y col., Science, 261:1167-1169, 1993. Es interesante que las nuevas cadenas sólo se han encontrado en determinados tejidos (p. ej., el glomérulo del riñón, la membrana de Decimet del ojo, el cristalino, la piel, el pulmón, los testículos y la cóclea). Véase, por ejemplo, Kleppel y col., Am. J. Pathol., 134:813-825,1989, y Tryggvason y col., Kidney Int., 43:38-44, 1993. Actualmente se desconoce la función de estas nuevas cadenas en el conjunto de la membrana basal. Se cree que estos nuevos colágenos de la membrana basal forman redes separadas distintas de las redes de los tipos de colágeno 4A1 (\alpha1(IV)) y 4A2 (\alpha2(IV)).

Las membranas basales glomerulares del riñón (GBM) forman parte del proceso de ultrafiltración (es decir, en el que se filtra la sangre para separar los metabolitos para la excreción en forma de orina, por ejemplo). El síndrome de Alport da como resultado una acumulación masiva de matriz extracelular y una membrana basal afectada, que da como resultado la glomerulonefritis focal y segmentaria (es decir, inflamación de los bucles capilares en los glomérulos del riñón), que finalmente da como resultado uremia mortal (es decir, exceso de urea en la sangre como resultado de insuficiencia renal). Muchas de las moléculas de la misma matriz extracelular (p. ej., colágeno de tipo I, fibronectina, laminina, y colágeno de tipo IV) también se acumulan progresivamente en la GBM de los pacientes con nefritis por DMDI (diabetes mellitus dependiente de insulina). Sin embargo, en esta enfermedad, la GBM se hace más gruesa, pero carece del adelgazamiento focal y división (segmentación) de la GBM, que es característico del síndrome de Alport.

Las integrinas son una familia de receptores de glicoproteínas transmembrana que se unen a componentes de la lámina basal y la matriz extracelular. Funcionan como moléculas de adhesión implicadas en la agregación celular y en el anclaje de células a la lámina basal. También transducen señales al núcleo, y están implicadas en la modulación de la expresión de genes, en particular la expresión de genes para la migración celular y diferenciación celular (Hynes, Cell, 69:11-25,1992). Se conocen unos 20 receptores de integrina diferentes, que incluyen aproximadamente 14 subunidades alfa diferentes y aproximadamente 8 subunidades beta diferentes (DiSimone, Curr. Opin. Cell Biol., 6:182-194,
1994).

En el glomérulo renal (riñón), hay distintos grupos de receptores de integrinas. Están asociados con la matriz mesangial (es decir, una membrana que ayuda a mantener los bucles capilares en un glomérulo renal) o células epiteliales viscerales (Patey y col., Cell Adhesión Commun., 2:159-167, 1994). El receptor de integrina más frecuente en las células epiteliales viscerales glomerulares en el adulto es el heterodímero \alpha3\beta1 (Adler, Am. J. Pathol, 141:571-578, 1992; y Patey y col., Cell Adhesión Commun., 2:159-167, 1994). Se ha mostrado que la subunidad \beta5 se expresa en células epiteliales viscerales en el adulto (Yamada y col., Cell Adhesion Communic., 3:311-325, 1995), y los receptores de integrina \alpha1, \alpha3, \alpha5, \alphaV, \beta1 y \beta3 se expresan en el desarrollo durante la morfogénesis del riñón (Korhonen y col., Lab. Invest., 62:616-625, 1990; Wada y col., J. Cell. Biol., 132:1161-1176,1996; y Yamada y col., Cell Adhesion Communic., 3:311-325, 1995). El receptor de integrina heterodímera \alpha1\beta1 es el único receptor de integrina identificado en la superficie de células mesangiales en el glomérulo renal.

Se ha producido un ratón con el gen de la subunidad del receptor de integrina \alpha3 silenciado. Las crías murieron de disfunción renal poco después de nacer (Kreidberg y col., Dev., 122:3537-3547, 1996). La patología ultraestructural de la GBM en los neonatos de este modelo es muy similar a la observada en el síndrome de Alport avanzado. La membrana basal aparece enrarecida (es decir, engrosada, adelgazada y dividida de forma irregular) y los procesos pediculares de las células epiteliales viscerales aparecen fusionados. Puesto que un ligando para el receptor \alpha3\beta1 es el colágeno de tipo IV (Krishnamurti y col., Lab. Invest., 74:650-665, 1996; y Rupprecht y col., Kidney Int., 49:1575-1582, 1996), y puesto que este receptor se localiza a lo largo del plano de contacto entre las células epiteliales viscerales y la GBM (Baraldi y col., Nephron, 66:295-301, 1994), las observaciones listadas antes para el silenciamiento de la integrina \alpha3 apoyan un modelo en el que dichas interacciones de integrina/ligando tienen una función importante en el desarrollo de la membrana basal.

En un animal normal, el colágeno de tipo IV en la membrana basal glomerular (GBM) embrionaria hasta el momento del nacimiento está compuesta enteramente de las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) (denominadas cadenas de colágeno clásicas). Inmediatamente después del nacimiento, se produce un cambio en el desarrollo en el que las cadenas \alpha3(IV), \alpha4(IV) y \alpha5(IV) (denominadas las nuevas cadenas de colágeno) se detectan claramente en la GBM, y las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) se localizan predominantemente en la matriz mesangial (Minor & Sanes, J. Cell Biol., 127:879-891, 1994).

En el riñón del adulto una capa gruesa de GBM compuesta de las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) se encuentra adyacente a la capa celular endotelial, mientras que la mayor parte del grosor completo de la GBM está compuesta de las cadenas \alpha3(IV), \alpha4(IV) y \alpha5(IV) (Desjardins & Bendayan, J. Cell. Biol., 113:689-700, 1991; y Kashtan y col., J. Clin. Invest., 78:1035-1044, 1996). Hay pruebas bioquímicas que sugieren que los dos grupos diferentes de cadenas de colágeno forman redes separadas (Kleppel y col., J. Biol. Chem., 267:4137-4142, 1992). En la nefritis familiar, las mutaciones nulas (es decir, mutaciones que destruyen la expresión de genes) en los genes de \alpha3(IV), de \alpha4(IV) o de \alpha5(IV) dan como resultado la ausencia de las tres cadenas en la GBM, seguramente debido a las asociaciones obligatorias en el ensamblaje macromolecular de la supraestructura de la GBM. Esto da como resultado la presencia de las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) a lo largo de todo el grosor de la GBM. Por lo tanto, los receptores del colágeno de tipo IV en la superficie de las células epiteliales viscerales en el riñón de Alport (es decir, el riñón de un individuo con síndrome de Alport) están en contacto directo con una GBM de composición de cadenas de colágeno de tipo IV no característica. Al menos un estudio se ha dirigido a la capacidad relativa de las células epiteliales viscerales para adherirse al colágeno de tipo IV con estas diferentes composiciones, y se ha encontrado que se adhieren significativamente mejor en la membrana basal compuesta de las cadenas nuevas, cuando se compara directamente con las cadenas clásicas \alpha1(IV) y \alpha2(IV). Esta adhesión se podía bloquear con anticuerpos contra el receptor de integrina \alpha3.

Se creó un modelo de ratón para la forma autosómica del síndrome de Alport mediante mutagénesis dirigida del gen de procolágeno COL4A3 (Cosgrove y col., Genes Dev., 10:2981 - 2992, 1996). El modelo animal desarrolla una glomerulonefritis progresiva con inicio de proteinuria aproximadamente a las 4 semanas de edad y una edad media de muerte por insuficiencia renal de aproximadamente 8,5 semanas en el antecedente 129Sc/J congénito. Los cambios ultraestructurales en el GBM se observan tan pronto como con 1 semana de edad, y por toda la GBM de la mayoría de los glomérulos a las 3 semanas de edad, mucho antes del inicio de la proteinuria. Los componentes de la matriz extracelular, incluidos la laminina 1, proteoglicano sulfato de heparina, fibronectina y entactina, se acumulan en la GBM. Este ratón en el presente documento se denomina el ratón "Alport".

La acumulación de la matriz extracelular en la GBM y el mesangio en función del avance de la enfermedad renal es una característica que comparten una variedad de enfermedades glomerulares, tanto los pacientes como los sistemas de animales experimentales. Véase, por ejemplo, Goyal & Wiggins, Am. Soc. Nephrol, 1:1334-1342, 1991; Wilson y col., Contrib. Nephrol. Basel, Karger, 118:126-134, 1996; Razzaque y col., Clin. Nephrol., 46:213-214, 1996; Yoshiokay col., Kidney Int., 35:1203-1211, 1989; y Klahr y col., N. Engl. J. Med., 318:1657-1666,1988. En la diabetes, se cree que el mediador principal de este efecto es la exposición prolongada a proteínas del suero no glucosiladas enzimáticamente que resulta de los niveles de glucosa altos crónicos (Doi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2873-2877, 1992; y Roy y col., Clin. Invest., 93: 483-442, 1994).

Para la mayoría de los trastornos glomerulares progresivos, parece que la sobreproducción del factor de crecimiento transformante TGF-\beta1 está muy asociada con la acumulación de matriz extracelular que conduce a la fibrosis (es decir, la formación de tejido fibroso). Véase, por ejemplo, Border & Ruoslahti, Nature (London), 346:371-374, 1992; Yang y col., J. Am. Soc. Nephrol., 5:1610-1617, 1995; y Yamamoto y col, Kidney Int., 45:916-927, 1994. En un modelo animal de nefritis autoinmune, la inyección con anticuerpos para TGF-\beta1, o de oligonucleótidos antisentido para el correspondiente ARNm inhibía la glomerulonefritis progresiva y la acumulación de matriz extracelular (Border y col., Nature (London), 346:371-374, 1990; y Akagi y col., Kidney Int., 50:148-155, 1996).

Se ha estimado que la semivida del colágeno de la membrana basal en la GBM de la rata es entre 16 y 40 días basado en los estudios de seguimiento y pulsado con ^{3}H-prolina (Daha y col., Nephron. 22:522-528, 1978). Esto es muy lento en relación con el ciclo metabólico de proteoglicanos sulfato de heparina (t_{1/2} = 20 horas) u otras moléculas sulfatadas en la GBM (t_{1/2} = 20-60 horas). La acumulación de proteínas de la membrana basal en la GBM del modelo de ratón Alport (Cosgrove y col., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996) probablemente es el efecto neto de los cambios tanto en la síntesis como en la degradación de estas proteínas. De las proteasas implicadas en el ciclo metabólico tanto de la GBM como de la matriz mesangial, las más caracterizadas son las metaloproteinasas MMP-2 (colagenasa de 72 kD) y MMP-9 (colagenasa de 92 kD), así como MMP-3 (estromolisina-1). Estas enzimas degradarán el colágeno de tipo IV, además de una variedad de otros componentes de la matriz extracelular.

Las células mesangiales (y probablemente otros tipos de células glomerulares) también producen inhibidores naturales de las metaloproteinasas. Las células llamadas TIMP (inhibidores tisulares de metaloproteinasas, por sus siglas en inglés Tissue Inhibitors of MetalloProteinases). Estas son glicoproteínas de peso molecular relativamente bajo. De estas, TIMP-1 es específica para la estromolisina-1 y MMP-9, mientras que TIMP-2 y TIMP-3 inhibirán MMP-2 (Goldberg y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8207-8211, 1989; Staskus y col., Biol. Chem., 266:449-454, 1991; y Stetler-Stevenson y col., J. Biol. Chem., 264:17374-17378, 1989).

La modulación de las metaloproteinasas y sus correspondientes inhibidores es probable que tengan una función en el mantenimiento de niveles adecuados del ciclo metabólico de GBM. Aunque se sabe poco en relación con la regulación de los genes que codifican estas proteínas en el glomérulo, la transducción de señales por la interacción de receptor de integrina/ECM (matriz extracelular) puede ser un aspecto clave en este procedimiento.

Siguen siendo necesarios modelos animales para el síndrome de Alport, en particular uno en el que se ralentice significativamente el avance de la enfermedad. También siguen siendo necesarias nuevas terapias para tratar enfermedades renales asociadas con la expansión de la matriz mesangial, y la acumulación progresiva de matriz en la membrana basal glomerular y el intersticio tubular, incluido el síndrome de Alport y la diabetes mellitus dependiente de insulina, por ejemplo.

El documento WO 97/11718 describe inhibidores de la activación de un receptor de integrina para promover la curación de heridas o trastornos fibróticos con menos cicatrización.

La presente invención proporciona diferentes medios de tratamiento para tratar o limitar (es decir, retrasar el inicio, ralentizar el avance, y/o invertir) un trastorno renal en un paciente (preferiblemente, un mamífero y más preferiblemente un ser humano). El trastorno renal preferiblemente incluye glomerulonefritis renal, fibrosis renal, o ambos. Estas afecciones pueden estar asociadas, por ejemplo, con el síndrome de Alport, nefritis por DMDI, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis crescéntica, nefropatía diabética y fibrosis intersticial renal.

En una realización, el procedimiento implica el uso de un inhibidor del receptor de integrina \alpha1\beta1 para preparar una composición farmacéutica para tratar un trastorno renal. Este inhibidor del receptor de integrina \alpha1\beta1 puede ser un agente bloqueante que se une al sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal. El agente bloqueante puede ser un fragmento de péptido al menos nonámero de una proteína seleccionada del grupo que consiste en laminina, fibronectina, entactina y colágeno de tipo 4. Alternativamente, el agente bloqueante puede ser un anticuerpo. También se pueden usar otros agentes que inhiben (es decir, inactivan) el receptor de integrina \alpha1\beta1 por otros mecanismos.

En otra realización, el procedimiento implica el uso de un inhibidor de TGF-\beta1 además del inhibidor del receptor de integrina \alpha1\beta1 para preparar una composición farmacéutica para tratar un trastorno renal. Estos inhibidores se puede administrar de manera simultánea (p. ej., como en una mezcla) o secuencial. El inhibidor de TGF-\beta1 puede ser un agente que se una de forma irreversible a TGF-\beta1 e inhiba su capacidad para unirse a su receptor. Alternativamente, el inhibidor de TGF-\beta1 puede ser un agente que inhibe la capacidad de TGF-\beta1 para transducir señales al núcleo de una célula renal. Este último tipo de inhibidor preferiblemente es un inhibidor de calcineurina, tal como tacrolimus (disponible en el comercio como FK506). También se pueden usar otros agentes que inhiben (es decir, inactivan) TGF-\beta1 por otros mecanismos.

Preferiblemente, la presente invención proporciona medios para retrasar el inicio y/o ralentizar el avance del síndrome de Alport en un paciente. En una realización, este medio implica el uso de un agente que inhibe la transducción de señales por un receptor de integrina \alpha1\beta1 de una célula renal. En una realización, este medio implica bloquear un sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal del paciente. Estos medios se pueden potenciar más mediante el uso de un inhibidor de TGF-\beta1.

Preferiblemente, la presente invención también proporciona medios para retrasar el inicio y/o ralentizar el avance de la enfermedad renal en la diabetes mellitus dependiente de insulina en un paciente. En una realización, este medio implica el uso de un agente que inhibe la transducción de señales por un receptor de integrina \alpha1\beta1 de una célula renal. En otra realización, este medio implica el bloqueo del sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal. Este medio se puede potenciar además por el uso de un inhibidor de TGF-\beta1.

Además, se proporcionan medios para limitar la fibrosis renal en un paciente. En una realización, el medio implica reducir la actividad de TGF-\beta1 en el paciente a la vez que se inhiben los receptores de integrina \alpha1\beta1 de las células renales del paciente. Esta actividad se puede reducir usando un agente que se una de forma irreversible a TGF-\beta1 e inhiba su capacidad para unirse a su receptor. Alternativamente, esta actividad se puede reducir usando un agente capaz de inhibir la capacidad de TGF-\beta1 para transducir señales al núcleo de una célula renal.

En otra realización más, se proporcionan medios para limitar la acumulación de matriz en la GBM de un paciente con síndrome de Alport. En una realización, el medio implica reducir la actividad de TGF-\beta1 en el paciente. Esto se puede llevar a cabo usando inhibidores de TGF-\beta1 como se describe en el presente documento.

En una realización particularmente preferida, se proporciona un medio para limitar la fibrosis renal usando un inhibidor de calcineurina, preferiblemente tacrolimus.

Además, la presente invención proporciona un ratón que no expresa una composición de colágeno de tipo IV normal en la GBM como resultado del silenciamiento del gen \alpha3(IV) del colágeno. Es decir, el ratón no incorpora las cadenas \alpha3(IV), \alpha4(IV) o \alpha5(IV) del colágeno en la membrana basal glomerular (por lo tanto, la GBM está compuesta enteramente por cadenas de colágeno \alpha1(IV) y \alpha2(IV), con respecto a su composición de cadenas de colágeno de tipo IV). Además, no expresa el receptor de integrina \alpha1\beta1 como resultado del silenciamiento del gen de la subunidad \alpha1.

En el ratón doblemente silenciado se produce el inicio retrasado de proteinuria comparado con el modelo de ratón Alport de la técnica anterior. Además, el animal vive casi el doble que los Alport de la misma camada. Aproximadamente a las 8 semanas de edad, que es la edad media de muerte en el ratón Alport, el ratón doblemente silenciado muestra una patología glomerular notablemente menor. Es decir, comparado con los ratones Alport de la misma edad, el ratón doblemente silenciado tiene un daño ultraestructural notablemente menor, con mucho menor enrarecimiento de la GBM y muy poco borrado de los procesos pediculares de los podocitos. Además, se produce la acumulación atenuada de la fibronectina, laminina 1 y proteoglicano sulfato de heparina en la GBM, mientras que la acumulación de entactina y colágeno de tipo IV no cambian, con respecto al ratón Alport. Estos resultados indican que hay una función específica para el receptor de integrina \alpha1\beta1 en la patogénesis de la enfermedad renal de Alport. Esto es importante consi-
derando que el silenciamiento de la integrina \alpha1 individual no tiene un efecto evidente en la fisiología o función renal.

Este ratón se puede usar para estudiar el síndrome de Alport, diabetes mellitus dependiente de insulina, y otros trastornos que se caracterizan por glomerulonefritis y/o fibrosis. Este ratón también se puede usar para cribar agentes que se pueden usar para tratar el síndrome de Alport y la diabetes mellitus dependiente de insulina y otros trastornos que se caracterizan por deposición de la matriz extracelular y/o fibrosis.

Además, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un receptor de integrina \alpha1\beta1 y un inhibidor de TGF-\beta1.

la fig. 1 ilustra el inicio de proteinuria en ratones Alport frente a mutantes dobles, que se estudió recogiendo orina de los ratones a intervalos semanales. Los números indican la edad (en semanas) de los ratones en el momento de recolección de la orina. A = ratón Alport; B = ratón mutante doble; Mr = patrones de peso molecular.

la fig. 2 ilustra el daño ultraestructural al bucle capilar glomerular en ratones control y mutantes dobles. Se recogió la corteza renal de ratones normales (A), Alport (B) y mutantes dobles (C) a las 7 semanas, y se insertaron en resina epoxídica. Se tiñeron las secciones ultrafinas y se analizaron por microscopía de transmisión electrónica. Las flechas indican procesos pediculares. C = lumen capilar; U = espacio urinario. Las barras de aumento representan 0,5 \mum.

la fig. 3 proporciona los resultados del análisis de inmunofluorescencia de las proteínas de la matriz extracelular en ratones normales, Alport y mutantes dobles. Se hicieron reaccionar criosecciones congeladas de corteza renal con anticuerpos específicos para las proteínas de la matriz extracelular indicadas en las etiquetas del eje Y. La señal se desarrolló usando el anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína adecuado, y las imágenes se recogieron digitalmente y se procesaron usando el software Cytovision Ultra (Applied Imaging, Inc.). Las flechas indican bucles capilares glomerulares. 4A1,2 = cadenas de colágeno \alpha1(IV) y \alpha2(IV); Lam-1 = laminina 1; Fib = fibronectina; HSP = proteoglicano sulfato de heparina; ent = entactina. \alpha1 +/+ = homocigoto normal en el gen de integrina \alpha1; \alpha1 -/- = homocigoto mutante en el gen de integrina \alpha1; \alpha3(IV) +/+ = homocigoto normal en el gen \alpha3(IV) de colágeno; \alpha3(IV) -/- = homocigoto mutante en el gen \alpha3(IV) de colágeno.

la fig. 4 muestra los resultados de los análisis Northern de los ARNm totales del riñón durante el transcurso de tiempo del avance de la enfermedad renal de Alport. El ARN total aislado de riñones recogido en los momentos indicados (semanas), se fraccionó en geles de agarosa desnaturalizantes, se transfirió sobre nailon, y se trató con sonda de ADNc murino que codificaba TGF-\beta1 o diferentes componentes de la membrana basal glomerular y/o la matriz extracelular. Las sondas usadas para generar los datos ilustrados en los paneles son las siguientes: A, TGF-\beta1; B, colágeno \alpha1(IV; C, colágeno \alpha2(IV); D, fibronectina; E, entactina; F, cadena \beta1 de laminina; G, cadena \beta2 de laminina.

la fig. 5 ilustra el análisis cuantitativo de la inducción de ARNm durante el avance de la enfermedad renal de Alport. Después de exposición a película de rayos X, se analizaron las membranas usadas para producir la figura 4 usando un Phosphoroimager BioRad GS-525. Los valores representados indican el número de veces de inducción del ARNm específico en la muestra Alport frente a la observada en los normales de la misma camada. En todas las bandas se restó la señal de fondo. La especie de ARNm específico analizado se indica en el inserto.

la fig. 6 ilustra los análisis de hibridación in situ de transcritos específicos en ratones Alport post-preoteinúricos. Se analizaron los riñones de los ratones normales de la misma camada (A, D, G y J) junto con los de los ratones Alport (B, E, H y K). Las sondas antisentido eran específicas para el dominio NC1 del colágeno \alpha1(IV) (A y B), TGF-\beta1 (D y E), fibronectina (G y H), entactina (J y K) o la cadena \beta1 de laminina (M y N). Se usó una sonda específica para la \beta-galactosidasa bacteriana como control para la unión no específica (C, F, I, L y O).

la fig. 7 ilustra la tinción con inmunoperoxidasa para TGF-\beta1 en secciones de tejido de ratones normales y Alport. Las secciones insertadas en parafina se tiñeron para la forma activa de TGF-\beta1 usando la detección con inmunoperoxidasa. P = podocitos; M = células mesangiales.

la fig. 8 ilustra el análisis de detección con RNasa para el ARNm de TGF-\beta1 en la corteza renal humana normal y Alport. Se aisló el ARN total de la corteza renal humana normal y Alport, y se sometieron 10 \mug de cada uno al análisis de protección de RNasa usando una parte radiomarcada del mensaje antisentido de TGF-\beta1 humano como sonda. El ensayo dio como resultado un fragmento protegido de 264 pb. Los marcadores de tamaño molecular son MSP1-PBR322, y se indican los fragmentos adecuados para comparar. N = normal; A = Alport.

la fig. 9 ilustra la transferencia Northern del ARN de la corteza renal de ratones normales, Alport, deficientes en integrina \alpha1, y deficientes tanto en integrina \alpha1 como en colágeno \alpha3(IV). El ARN total se aisló de la corteza renal de ratones de 7 semanas de edad (de la misma camada) con los genotipos indicados +/+ = normal en ambos alelos; -/- = mutantes en ambos alelos.

la fig. 10 es una micrografía de transmisión electrónica de la GBM de un animal Alport de 7 semanas de edad al que se ha inyectado un anticuerpo neutralizante específico para la integrina \alpha1. Obsérvese el aspecto trilaminar regular de la GBM y la ausencia de regiones focalmente engrosadas. El aumento es 10.500X.

la fig. 11 ilustra el efecto de los inhibidores de TGF-\beta1 en la ultraestructura de la GBM en el ratón Alport 129 Sv/J. Los animales se trataron con FK506 o el receptor soluble de TGF-\beta1. La corteza renal se insertó en resina epoxídica, se cortó, se tiñó con acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizó por microscopía de transmisión electrónica. A = control; B = Alport no tratado; C = Alport tratado con FK506; D = Alport tratado con el receptor de TGF-\beta1 soluble. El aumento es 11.000X.

la fig. 12 es una micrografía electrónica de barrido de glomérulos de ratones Alport 129 Sv/J tratados frente a no tratados. La corteza renal de los ratones usados en la figura 11 se liofilizó, se resquebrajó, se tiñó con acetato de uracilo y citrato de plomo, y los glomérulos expuestos se identificaron y fotografiaron usando microscopio electrónico de barrido. A = control; B = Alport no inyectado; C = ratón Alport tratado con receptor soluble de TGF-\beta1. El aumento es 25000X.

la fig. 13 demuestra el efecto del tratamiento con fármaco en la albúmina de la orina en ratones Alport 129 Sv/J. Durante el transcurso del tiempo del tratamiento con fármaco, se recogió la orina, se liofilizó, y el equivalente de 0,5 \mul se fraccionó en un gel de poliacrilamida. El gel se tiñó con azul de coomassie y se visualizó. Las dos primeras calles eran controles no inyectados, las siguientes dos (grupo I) eran inyectados con FK506, y el tercer grupo (grupo II) eran inyectados con el receptor de TGF-\beta1 soluble. Los números en la parte inferior representan la edad de los ratones en el momento de recolección de la orina, en semanas. C = control; A = Alport.

la fig. 14 ilustra el efecto de los inhibidores de TGF-\beta1 en la ultraestructura de la GBM en los ratones doblemente silenciados. Los animales no se trataron o se trataron con FK506 o receptor soluble de TGF-\beta1. Se insertó corteza renal en resina epoxídica, se cortó, se tiñó con acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizó por microscopía electrónica de transmisión. A = control no inyectado; B = doblemente silenciado no inyectado; C = doblemente silenciado tratado con FK506; D = doblemente silenciado tratado con el receptor soluble para TGF-\beta1. El aumento es de 8000X.

la fig. 15 ilustra un ejemplo de la arquitectura glomerular normal en un ratón doblemente silenciado de 10 semanas de edad tratado con inhibidores de TGF-\beta1. Aproximadamente el 25% de los glomérulos en los ratones tratados con inhibidor de TGF-\beta1 eran morfológicamente indistinguibles de los de los animales control. Los animales no se trataron, o se trataron con FK506. La corteza renal se insertó en resina epoxídica, se cortó, se tiñó con acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizó por microscopía electrónica de transmisión. A = control no inyectado; B = doblemente silenciado tratado con FK506.

la fig. 16 demuestra el efecto del tratamiento con fármaco en la albúmina de la orina en ratones doblemente silenciados. Durante el transcurso del tiempo del tratamiento con fármaco, se recogió orina, se liofilizó, y se fraccionó el equivalente de 0,5 \mul en un gel de poliacrilamida. El gel se tiñó con azul coomassie y se visualizó. La edad de los ratones en el momento de recoger la orina se indica en la parte inferior de la figura (en semanas). A = doblemente silenciado no inyectado; B = doblemente silenciado al que se ha inyectado el receptor soluble; C = ratón control al que se ha inyectado FK506; D = doblemente silenciado al que se ha inyectado FK506.

la fig. 17 es una micrografía electrónica de barrido de los glomérulos de ratones Alport frente a ratones doblemente silenciados. Se liofilizó la corteza renal de animales de 7 semanas de edad, se resquebrajó, se tiñó con acetato de uranilo y citrato de plomo y los glomérulos expuestos se identificaron y fotografiaron usando un microscopio electrónico de barrido. A = control; B = Alport; C = doblemente silenciado.

la fig. 18 muestra la tinción inmunofluorescente doble para la cadena de laminina \alpha2 en ratones normales y mutantes. La membrana basal glomerular se tiñó de verde usando un anticuerpo primario específico para entactina y un anticuerpo secundario conjugado con FITC. La cadena de laminina \alpha2 se tiñó de rojo usando un anticuerpo secundario conjugado con rojo Texas. La localización simultánea en los bucles capilares producía tinción amarilla. El Grupo I son glomérulos de ratones de 7 semanas; A = control no inyectado; B = Alport no inyectado; C = Alport al que se ha inyectado receptor soluble; D = doblemente silenciado no inyectado. El Grupo II son glomérulos de ratones de 2 semanas de edad; A = control; B = Alport. Las flechas indican inmunotinción en los bucles capilares de los
glomérulos.

la fig. 19 es una micrografía de transmisión electrónica de la GBM de un ratón de 2 semanas de edad normal frente a uno Alport. La corteza renal se insertó en resina epoxídica, se cortó, se tiñó con acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizó por microscopía electrónica de transmisión. A = control; B = Alport.

la fig. 20 demuestra el efecto de los inhibidores de TGF-\beta1 en la expresión, en el riñón, de los ARN que codifican las moléculas de la matriz celular o inhibidores de metaloproteinasas en ratones normales frente a Alport. Se aisló el ARN total de los riñones de ratones normales de 7 semanas de edad (C) o Alport (A), que se trataron con FK506 (I) o no se trataron (NI). Se fraccionaron los ARN en geles de agarosa desnaturalizantes y se analizaron por hibridación con sondas radiomarcadas que codificaban las moléculas de la matriz extracelular o los inhibidores de metaloproteinasas. Después de la hibridación, las membranas se lavaron y se expusieron a película de rayos X. Las sondas usadas están indicadas a la izquierda de los paneles. \alpha1(IV) = colágeno \alpha1(IV); fn = fibronectina; ent = entactina; Timp2 = inhibidor de metaloproteinasa Timp-2; Timp3 = inhibidor de metaloproteinasa Timp-3.

la fig. 21 demuestra el efecto de los inhibidores de TGF-\beta1 en la expresión, en el riñón, de los ARN que codifican las moléculas de la matriz celular o los inhibidores de metaloproteinasas en ratones normales frente a doblemente silenciados. El ARN total se aisló de los riñones de ratones de 10 semanas de edad normales (C) o doblemente silenciados (Dko), que se trataron con FK506 (I), que se trataron con FK506 (I), el receptor soluble de TGF-\beta1 (II), o no se trataron (NI). Los ARN se fraccionaron en geles de agarosa desnaturalizantes, y se analizaron por hibridación con sondas radiomarcadas que codificaban moléculas de la matriz extracelular o inhibidores de metaloproteinasas. Después de la hibridación, las membranas se lavaron y se expusieron a película de rayos X. Las sondas usadas están indicadas a la izquierda de los paneles. \alpha1(IV) = colágeno \alpha1(IV); fn = fibronectina; ent = entactina; Timp2 = inhibidor de metaloproteinasa Timp-2; Timp3 = inhibidor de metaloproteinasa Timp-3.

la fig. 22 ilustra la inhibición de la acumulación de matriz en el intersticio tubular de ratones doblemente silenciados usando inhibidores de TGF-\beta1. Los riñones de ratones de 10 semanas de edad normales o doblemente silenciados se insertaron en plástico, y se tiñeron secciones 1 \muM usando el procedimiento de metenamina-plata de Jones. A = riñón normal; B = riñón doblemente silenciado, no inyectado; C = riñón doblemente silenciado tratado con FK506; D = riñón doblemente silenciado tratado con receptor soluble de TGF-\beta1.

la fig. 23 ilustra la inhibición de la acumulación del colágeno de tipo I en el intersticio tubular de ratones doblemente silenciados usando inhibidores de TGF-\beta1. Los riñones de ratones de 10 semanas de edad normales o doblemente silenciados se insertaron en plástico, y se inmunotiñeron secciones 1 \muM usando anticuerpos específicos para el colágeno de tipo I. La tinción se reveló usando el kit de tinción de estreptavidina AEC de Vector laboratories. A = riñón normal; B = riñón doblemente silenciado, no inyectado; C = riñón doblemente silenciado tratado con FK506; D = riñón doblemente silenciado tratado con receptor soluble de TGF-\beta1.

la fig. 24 ilustra la inhibición de la acumulación fibronectina en el intersticio tubular de los ratones doblemente silenciados usando inhibidores de TGF-\beta1. Los riñones de ratones de 10 semanas de edad normales o doblemente silenciados se insertaron en plástico, y se inmunotiñeron secciones 1 \muM usando anticuerpos específicos para la fibronectina. La tinción se reveló usando el kit de tinción de estreptavidina AEC de Vector laboratories. A = riñón normal; B = riñón doblemente silenciado, no inyectado; C = riñón doblemente silenciado tratado con FK506; D = riñón doblemente silenciado tratado con receptor soluble de TGF-\beta1.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y su preparación para el ataque del mecanismo de la enfermedad renal (es decir, enfermedad de riñón), una que pueda ralentizar sustancialmente el inicio y/o el avance de los estados patológicos, tales como la glomerulonefritis y fibrosis renal. Se cree que las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluso invertir dichas afecciones. En particular, la invención proporciona composiciones farmacéuticas y su preparación para el tratamiento de la enfermedad renal asociada con la presencia de o con un riesgo mayor de desarrollar glomerulonefritis y fibrosis renal en los glomérulos renales, como ocurre en la glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis crescéntica, nefropatía diabética y fibrosis renal intersticial. La glomerulonefritis implica el daño glomerular típicamente asociado con irregularidades de engrosamiento, adelgazamiento y/o división en la GBM. Esto puede terminar en la ruta común de la fibrosis tubulointersticial. Estas afecciones en general se caracterizan por la aparición de miofibroblastos y la acumulación de matriz (incluyendo el colágeno de tipo I, fibronectina, laminina y colágeno de tipo IV) en el intersticio tubular. La eficacia de los agentes terapéuticos en la presente invención se puede determinar evaluando una o más de esas características.

La invención también proporciona un ratón para estudiar procedimientos y para el cribado de agentes para tratar pacientes con enfermedad renal asociada con la presencia de o con un riesgo mayor de desarrollar una acumulación de matriz extracelular en general, y en particular en los glomérulos renales y el intersticio tubular. Así, en una realización, la presente invención proporciona un ratón para el síndrome de Alport. Este ratón incluye un receptor de integrina \alpha1\beta1 inactivado combinado con una molécula de colágeno (tipo IV) inactivada. En una realización preferida, la molécula de colágeno (tipo IV) se inactiva por la interrupción de la expresión de la subunidad \alpha3 del colágeno (tipo IV). Como resultado, el ratón no incorpora las cadenas \alpha3(IV), \alpha4(IV) o \alpha5(IV) del colágeno en la GBM.

Este ratón se puede usar en procedimientos para ensayar agentes para tratar la disfunción renal, como ocurre en el síndrome de Alport, diabetes mellitus dependiente de insulina, y otras enfermedades renales, en las que la enfermedad temprana se caracteriza por la expansión de la matriz mesangial y proliferación de células mesangiales asociado con el daño de la membrana basal glomerular, caracterizado por el engrosamiento, adelgazamiento, división y borrado de los procesos pediculares de los podocitos de la membrana basal, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización preferida, la invención proporciona inhibidores para bloquear o inactivar de otra forma la función del receptor de integrina \alpha1\beta1 como procedimiento para retrasar el inicio (medido por la aparición de albúmina en la orina) o ralentizar el avance (medido por la velocidad a la que aumenta el nivel de albúmina sérica en la orina) o incluso invertir (medido por la velocidad a la que disminuye el nivel de albúmina sérica en la orina) de la glomerulonefritis y/o fibrosis (puesto de manifiesto por la aparición de miofibroblastos y la acumulación de matriz extracelular, incluyendo laminina, fibronectina, colágeno de tipo I y colágeno de tipo IV en el intersticio tubular) en el avance de la enfermedad glomerular. Se pueden usar una variedad de agentes sintéticos o naturales, que se describen a continuación con más detalle.

En otra realización más, la invención se dirige a la función de TGF-\beta1 en la patogénesis de la enfermedad renal de Alport y otras de dichas enfermedades renales. Se observa un aumento pronunciado de los niveles de ARNm para TGF-\beta1 después del inicio de proteinuria en el ratón usado en el presente documento. La hibridación in situ indica que los podocitos, que producen poco o no producen ARNm para TGF-\beta1 antes del inicio de la proteinuria, expresan ARNm para TGF-\beta1 en abundancia después del inicio de la proteinuria hasta la etapa final de insuficiencia renal. Aproximadamente al mismo tiempo, se observa la activación de los ARNm que codifican la fibronectina, COL4A1 y COL4A2 y entactina. Por lo tanto, disminuir el nivel de TGF-\beta1 es otro mecanismo para tratar las afecciones renales tales como la glomerulonefritis y/o fibrosis. Los efectos de la inhibición de la actividad de TGF-\beta1 se puede medir determinando el momento de aparición (el inicio) y la velocidad de aumento de la albúmina en la orina y/o aparición de miofibroblastos (en el intersticio tubular) y/o acumulación de moléculas de la matriz extracelular en la GBM y el intersticio tubular.

En otra realización, mediante el uso de inhibidores de TGF-\beta1 en ratones Alport deficientes en integrina 1, la invención se dirige a la sinergia de un tratamiento de combinación de inhibidores de integrina \alpha1\beta1 e inhibidores de TGF-\beta1 en la ralentización del inicio y avance de la glomerulonefritis, y/o prevención de la fibrosis.

Modelo de ratón

Un aspecto importante para tratar pacientes con síndrome de Alport y otras enfermedades asociadas con el daño glomerular progresivo asociado con irregularidades de engrosamiento, adelgazamiento o división en la GBM y que terminan en la ruta común de la fibrosis tubulointersticial caracterizada por la aparición de miofibroblastos y la acumulación de matriz (incluyendo colágeno de tipo I, fibronectina, laminina y colágeno de tipo IV) en el intersticio tubular, es determinar la causa y/o el mecanismo del avance de la enfermedad. Por ejemplo, aunque las mutaciones en los genes \alpha3(IV) o \alpha4(IV) del colágeno dan como resultado las formas recesivas autosómicas del síndrome de Alport, y las mutaciones en el gen \alpha5(IV) dan como resultado la forma de la enfermedad ligada al cromosoma X, estas mutaciones por si mismas no "producen" la insuficiencia renal progresiva. En su lugar, la ausencia de colágeno \alpha3(IV), \alpha4(IV) o \alpha5(IV) parece que produce la persistencia de la GBM de tipo embrionario compuesta de cadenas de colágeno \alpha1(IV) y \alpha2(IV). Esta GBM de tipo embrionario es un filtro glomerular adecuado durante aproximadamente la primera década de vida en seres humanos (o aproximadamente las tres primeras semanas en el modelo de ratón). Sin embargo, parece que después de este tiempo la GBM de tipo embrionario no funciona eficazmente. Por ejemplo, en un paciente con síndrome de Alport, los estudios ultraestructurales de la GBM de un paciente de 9 años de edad con el síndrome de Alport pusieron de manifiesto una ultraestructura relativamente normal (Cangiotti y col., Nephrol. Dial. Transplant., 11:1829-1834, 1996). Sin embargo, a la edad de 18, la ultraestructura de la GBM del mismo paciente indicaba glomerulonefritis de Alport avanzada.

En el síndrome de Alport, la membrana basal en seres humanos es relativamente normal hasta entre los 5 y 10 años de edad cuando se puede seguir la pérdida de integridad de la membrana basal por un aumento progresivo de la albúmina en la orina. Los estudios de biopsia han confirmado que la ultraestructura de la membrana basal es normal en pacientes Alport pre-proteinúricos. Desde el punto de vista ultraestructural, la enfermedad de la GBM se pone de manifiesto por un engrosamiento y adelgazamiento irregulares de la GBM. Se cree que la división de la membrana explica la microhematuria (es decir, número pequeño de eritrocitos detectables en la orina) observada junto con la proteinuria.

Se sabe poco respecto al mecanismo del inicio y avance de la enfermedad renal de Alport; sin embargo, se ha especulado que la acumulación de los componentes de la GBM y el enrarecimiento de la GBM pueden deberse a una mayor susceptibilidad de la membrana a la proteolisis, y/o mayor síntesis de moléculas de la matriz debido a alteraciones en las rutas reguladoras normales.

Por lo tanto, es necesario un modelo para el síndrome de Alport debido a las limitaciones inherentes al estudio de la especie humana. Los seres humanos presentan una variedad de gravedades en el avance de la enfermedad, seguramente debido a diferencias en los antecedentes genéticos. Los estudios significativos que se dirigen a la naturaleza molecular del inicio y avance de la enfermedad son logísticamente imposibles en seres humanos, dificultando la investigación en la enfermedad renal de Alport.

Se produjo un modelo de ratón para el síndrome Alport autosómico por mutagénesis dirigida del gen que codifica la cadena \alpha3(IV) del colágeno de tipo IV (Cosgrove y col., Genes Devel., 10:2981-2992, 1996). El modelo animal desarrolló una glomerulonefritis progresiva. Se observaron cambios ultraestructurales en la GBM tan pronto como a la semana de edad. Este ratón se denomina en este documento el ratón "Alport".

También se produjo un ratón por mutagénesis dirigida del gen que codifica la subunidad del receptor de integrina \alpha1 (Gardner y col., Dev. Biol, 175: 301-313, 1996). Esta subunidad de integrina forma un heterodímero con la subunidad de integrina \beta1 para formar el heterodímero de integrina \alpha1\beta1 biológicamente activo, que se encuentra en la superficie de las células mesangiales en el glomérulo renal. El receptor de integrina 1\beta1 es el único receptor de integrina que se encuentra en la matriz mesangial, donde se localiza de forma exclusiva. Aparte de la adhesión alterada de fibrocitos a las matrices de colágeno, el ratón silenciado no tiene fenotipo evidente. Se desarrolla normalmente, es fértil, y vive un tiempo de vida normal. No hay insuficiencia renal y no hay diferencias evidentes en la composición molecular o ultraestructura del glomérulo en estos ratones. Debido a que el receptor de la integrina heterodímera \alpha1\beta1 es el único receptor de integrina identificado en la superficie de las células mesangiales en el glomérulo renal, era sorprendente que la ausencia de este receptor no tuviera efecto en el desarrollo y/o función renales normales. Esto sugiere que o bien no es necesario o bien que rutas redundantes pueden compensar su ausencia.

La presente invención proporciona un nuevo ratón doblemente silenciado (es decir, mutante doble). Este se desarrolló cruzando la cepa de ratón silenciado para \alpha1 con la cepa silenciada para \alpha3(IV) de colágeno (ratón Alport) para producir mutantes que carecían tanto del gen de la subunidad de receptor \alpha1 de integrina como del gen de \alpha3(IV) del colágeno. Aunque la ausencia del receptor de integrina \alpha1\beta1 aparentemente no tiene una función en el desarrollo y función renales normales, puesto que la matriz mesangial es el sitio de síntesis de las metaloproteinasas y citocinas tales como TGF-\beta1, y las etapas tempranas de la glomerulonefritis de Alport implican la proliferación y expansión de células mesangiales de la matriz mesangial, se cree que el receptor de integrina \alpha1\beta1 puede tener una función específica en la patogénesis renal. Realmente, los estudios de silenciamiento doble de integrina \alpha1 colágeno \alpha3(IV) son particularmente únicos e importantes. La siguiente discusión describe muchas de las características del ratón doblemente silenciado de la presente invención.

Una buena valoración global de la integridad del filtro renal es la proteinuria (es decir, la presencia de un exceso de proteínas del suero en la orina). Como se ilustra en la figura 1, el inicio de la proteinuria en el ratón doblemente silenciado se retrasó al menos una semana y alcanzó el máximo aproximadamente de 9 semanas a aproximadamente 9,5 semanas frente a aproximadamente de 6 semanas a aproximadamente 6,5 semanas en la misma camada que los Alport (es decir, que carecían del gen \alpha3(IV) del colágeno, pero contenían el gen de la subunidad de integrina \alpha1). El inicio y velocidad de aumento de la proteinuria (es decir, la presencia de albúmina del suero en la orina) es una buena medida para evaluar la eficacia de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los niveles de albúmina en el suero se pueden medir por electroforesis en gel y tinción con azul coomassie (experimento con el equivalente a 1 microlitro de orina) o ensayos de tiras reactivas disponibles en el comercio. La edad media de muerte debido a la insuficiencia renal es de aproximadamente 8 a aproximadamente 9 semanas en ratones Alport independientemente de si estos ratones tienen antecedentes 129 Sv/J o 129 Sv (se dejó que al menos 10 ratones avanzaran a la etapa final para cada antecedente genético para establecer este punto). Los ratones doblemente silenciados viven una media de aproximadamente 15 semanas a aproximadamente 16,5 semanas de edad.

Por lo tanto, la eliminación del receptor de integrina \alpha1\beta1 tenía un efecto pronunciado en el inicio y avance de la enfermedad renal de Alport. Además, los ratones sin el receptor \alpha1\beta1 tenían mejor función glomerular comparado con los otros ratones ensayados. En los animales que no expresaban el gen \alpha3(IV) y eran heterocigotos para la mutación de silenciamiento de \alpha1, había una mejora intermedia de la función glomerular y avance de la enfermedad que ilustra que la integrina \alpha1 tenía un efecto dependiente de la dosis en el avance de la enfermedad renal de Alport (es decir, la reducción de la expresión de la integrina \alpha1 a la mitad proporcionaba un efecto protector que está entre el ratón Alport y el doblemente silenciado). Este efecto protector intermedio en animales Alport heterocigotos para la mutación de la integrina \alpha1 ilustra que la inhibición parcial del receptor de integrina \alpha1\beta1 proporciona beneficios útiles. Esto es un descubrimiento importante puesto que se aplica a terapias que implican la inhibición del receptor de integrina \alpha1\beta1 cuando se usa en seres humanos.

Se llevó a cabo el análisis por microscopía electrónica de transmisión de riñones de ratones de 7 semanas de edad que eran normales en ambos alelos (control), nulos en colágeno \alpha3(IV) y normales en integrina \alpha1 (Alport), o nulos tanto en colágeno \alpha3(IV) como en integrina \alpha1 (silenciamiento doble). Se escogió este momento ya que los ratones Alport a esta edad están acercándose a la etapa final. Los paneles elegidos para la figura 2 son representativos de al menos 5 campos glomerulares diferentes. Como se ilustra en la figura 2, el bucle capilar glomerular del ratón normal (figura 2A) tenía una membrana basal trilaminar con grosor uniforme u procesos pediculares regulares (los procesos pediculares en los tres paneles se indican con flechas). El bucle capilar del ratón Alport (figura 2B) mostró membrana basal enrarecida con engrosamiento y adelgazamiento focal (característicos de la enfermedad avanzada). Los procesos pediculares se hinchaban apareciendo fusionados, una propiedad que se cree afecta a la eficacia de la filtración renal. En el ratón doblemente silenciado (figura 2C) la membrana basal estaba notablemente menos afectada que la del ratón Alport (figura 2B). Aunque la membrana basal era más delgada que la del control, estaba mucho menos enrarecida y los procesos pediculares de los podocitos aparecían en gran medida normales. En el ratón Alport, aproximadamente 40% de los glomérulos eran fibróticos, mientras que sólo el 5% eran fibróticos en el mutante doble.

Los análisis de inmunfluorescencia se realizaron usando corteza renal congelada tomada de los mismos animales usados en al figura 2. El tejido se hizo reaccionar con anticuerpos específicos para proteínas que se sabía que se acumulaban en la GBM en función del avance de la enfermedad renal de Alport. Los resultados en la Figura 3 ilustran que la distribución de las cadenas de colágeno COL 4A1 (\alpha1(IV)) y 4A2 (\alpha2(IV)) era la misma tanto para los glomérulos en el Alport como para los del mutante doble. En ambos casos, los bucles capilares (indicados en todos los paneles de la figura 3 con flechas) y la matriz mesangial eran positivos (figura 3B, C). La laminina 1 mostró una marcada acumulación en la GBM del ratón Alport comparado con el control (compárese la figura 3D con la figura 3E), sin embargo, en el mutante doble (figura 3F), la acumulación de laminina 1 se atenuaba marcadamente respecto a la de los glomérulos en el Alport (figura 3E). La fibronectina normalmente se localiza exclusivamente en la matriz mesangial, pero se encontró que se localizaba en la GBM además de en la matriz mesangial en los ratones Alport (figura 3H). Sorprendentemente, en el mutante doble no se observa la acumulación de fibronectina en los bucles capilares (figura 3I). Este resultado era muy reproducible. A diferencia de esto, la tinción para el proteoglicano sulfato de heparina mostró tinción atenuada en la matriz mesangial del mutante doble (figura 3L) comparado con el control (figura 3J) o el ratón Alport (figura 3K). La acumulación de entactina en la GBM se observó tanto en las muestras de Alport como de mutante doble, sin diferencias discernibles entre los dos (figuras 3N y 3O).

La combinación de estos datos ilustra que la mutación nula de \alpha1 en el mutante doble produce una ralentización del avance de la enfermedad renal de Alport. Esto esta claro tanto a nivel fisiológico (inicio retrasado de la proteinuria mostrado en la figura 1) como en el ultraestructural (menor daño de la GBM y borrado de los procesos pediculares, mostrado en la figura 2). Los estudios de inmunofluorescencia proporcionados en la figura 3 ilustran que la eliminación del receptor de integrina \alpha1\beta1 produce cambios específicos en la acumulación de los componentes de la matriz extracelular tanto en la GBM como en la matriz mesangial. Por lo tanto, la presente invención implica procedimientos de tratamiento en los que se bloquea el sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal. Dichos procedimientos de tratamiento se describen a continuación con más detalle.

Además, la figura 9 muestra que, mientras que la citocina TGF-\beta1 es inducida en el ratón Alport, no es inducida en el ratón Alport que también alberga la mutación de la integrina \alpha1. Por lo tanto, en ausencia de la integrina \alpha1\beta1, no se observa la inducción de TGF-\beta1, lo cual explica la disminución de la acumulación de matriz en la membrana basal glomerular, y por lo tanto, una disminución significativa de la velocidad a la que avanza la enfermedad renal. Esta función de TGF-\beta1 en la enfermedad renal se discute con más detalle en la siguiente sección.

Función de TGF-\beta1

Los datos del presente documento establecen claramente que TGF-\beta1 es inducido en un tipo de célula glomerular específica (los podocitos) en los modelos de ratón usados en el presente documento. La inducción del ARNm de TGF-\beta1 se refleja por la inducción de los genes que codifican las moléculas de la matriz que se sabe que se acumulan en la membrana basal glomerular en función de la glomerulonefritis progresiva en el modelo (p. ej., laminina, fibronectina, entactina, y colágeno de tipo IV). Además, los datos en el presente documento muestran que el TGF-\beta1 es inducido por la corteza renal Alport en seres humanos. Esto apoya la validez del modelo animal en su capacidad para mimetizar que ocurre en el riñón Alport humano.

Para demostrar la función de TGF-\beta1, se aisló el ARN total de riñones de animales Alport y se trató con sondas radiomarcadas específicas para las cadenas de colágeno \alpha1(IV) o \alpha2(IV), entactina, la cadena \beta1 o \beta2 de laminina, fibronectina o TGF-\beta1. Los resultados en la figura 4 ilustran que los ARNm para todas estas proteínas con excepción de la cadena \beta1 de laminina son inducidos después del inicio de proteinuria en el modelo de ratón Alport. También se llevaron a cabo las transferencias Northern para este mismo periodo de tiempo para la laminina \alpha1, laminina \beta2, laminina \gamma1, proteína central proteoglicano sulfato de heparina, y las cadenas de colágeno \alpha4(IV) y \alpha5(IV). No se observaron diferencias significativas en los niveles de ARNm para estas otras proteínas de la membrana basal cuando se comparaba el control con el mutante.

Se analizaron los resultados de los análisis Northern para cuantificar directamente los cambios relativos en la expresión de ARNm específico durante el transcurso del tiempo. La figura 5 ilustra que la inducción de los niveles de ARNm específico es apreciable primero a las 6 semanas de edad. A las 8 semanas, los niveles de ARNm alcanzan el máximo, con los ARNm que codifican TGF-\beta1 y fibronectina inducidos 6,6 y 9,4 veces frente al ratón control, respectivamente. Los niveles de ARNm para el colágeno \alpha1(IV), \alpha2(IV) y la entactina eran todos aproximadamente inducidos 3 veces más, la semana 8. A diferencia de esto, no se observaron cambios significativos en los ARNm que codifican las cadenas \beta1 y \beta2 de laminina, determinado por las mismas transferencias Northern de los ARN totales, en ningún punto del avance de la enfermedad renal.

Los glomérulos comprenden solo un pequeño porcentaje de la masa total del riñón. Los tipos de células individuales dentro de los glomérulos comprenden un porcentaje incluso menor. Por lo tanto, no es probable que las transferencias Northern del ARN total de riñón detecten la inducción de mensajes que deben ser específicos para los glomérulos o para un tipo de célula glomerular particular. Para examinar si se inducían ARNm que codifican TGF-\beta1 o los diferentes componentes de la membrana basal en un tipo de célula glomerular particular, se llevó a cabo la hibridación in situ usando sondas antisentido marcadas con digoxigenina específicas para los ARNm. Los resultados se muestran en la figura 6. En ratones normales, los transcritos para TGF-\beta1 (figura 6D), fibronectina (figura 6G) y laminina \beta1 (figura 6M) se localizan exclusivamente en las células mesangiales, mientras que en los ratones Alport, los mismos transcritos (figura 6 E, H y N, respectivamente) se localizan claramente en los podocitos (el anillo de células en la parte exterior de los glomérulos), lo que ilustra la activación de genes en este tipo de célula glomerular. La activación de podocitos del colágeno \alpha1(IV) también es evidente (compárese la figura 6B con la 6A). La activación de genes que codifican las proteínas de la matriz en los podocitos glomerulares podía producir cambios en la composición de la
GBM.

Los datos de la proteína TGF-\beta1 basados en la detección con inmunoperoxidasa usando anticuerpos específicos para la isoforma activa de la citocina corroboran los datos obtenidos en el análisis de hibridación in situ para el ARN mensajero de TGF-\beta1. Los datos mostrados en la figura 7 ilustran que la expresión elevada del ARN mensajero de TGF-\beta1 en los podocitos se traduce en nivel elevado de proteína.

Puesto que los datos para TGF-\beta1 se adquirieron usando un modelo de ratón, se llevaron a cabo análisis de protección de RNasa para determinar si los niveles de ARNm para la citocina también son elevados en la corteza renal humana de pacientes con Alport frente a control. Los datos en la figura 8 ilustran una elevación de 3-4 veces del ARN mensajero de TGF-\beta1 en la corteza renal humana de pacientes con Alport frente a control. Esto demuestra que la citocina también es sobreexpresada en los riñones Alport humanos. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de TGF-\beta1 proporciona un protocolo de tratamiento razonable para el síndrome de Alport, en particular para limitar y preferiblemente incluso para prevenir, la acumulación de matriz en la GBM.

Como se ha discutido antes, la figura 9 muestra que mientras que TGF-\beta1 es inducido en el ratón Alport, no es inducido en el ratón doblemente silenciado que también alberga la mutación de la integrina \alpha1. Por lo tanto, en ausencia de la integrina \alpha1\beta1, no se observa inducción de TGF-\beta1, lo cual explica la disminución de la acumulación de matriz en la membrana basal glomerular, y por lo tanto, una disminución significativa de la velocidad a la que avanza la enfermedad renal.

Es significativo que el bloqueo (o inactivación de otra forma) del receptor de integrina \alpha1\beta1 y la inhibición de TGF-\beta1 sea sinérgico en la atenuación del inicio, avance y/o inversión de la enfermedad renal (en particular la enfermedad renal de Alport). Este efecto sinérgico se demuestra usando, por ejemplo, dos agentes diferentes que bloquean la actividad de TGF-\beta1 de tres formas diferentes. Se estudiaron ambos para asegurar que los resultados se debían a la inhibición de la actividad de TGF-\beta1, en lugar de a un efecto secundario del tratamiento con fármaco.

El primer ejemplo es un fármaco producido por Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japón, denominado tacrolimus o FK506. Este fármaco se usa habitualmente como un inmunosupresor para prevenir el rechazo después del transplante de órganos. Funciona por inhibición de una subunidad crítica del receptor de células T llamada calcineurina, que es una serina treonina fosfatasa, y una parte crítica de la transducción de señales del receptor de células T. Como se ha revisado recientemente (Crabtree, Cell, 96:611-614, 1999), la calcineurina es una subunidad de una variedad de receptores. Se ha publicado recientemente (Wang y col., Cell, 86:435-444,1996) que uno de esos receptores era el de TGF-\beta1. El fármaco FK506 se ensayó como un inhibidor de TGF-\beta1. Por lo tanto, el tratamiento de ratones con la dosis adecuada de FK506 inhibirá la transducción de señales del receptor de TGF-\beta1 de tipo I/tipo II.

Puesto que FK506 tiene otros efectos biológicos además de inhibir TGF-\beta1 (inmunosupresión potente en la que la más notable es la inhibición del receptor de células T), se evaluó un segundo inhibidor de TGF-\beta1. Este segundo inhibidor es un fármaco experimental en desarrollo de Biogen Inc., Cambridge, MA. Este fármaco es un inhibidor competitivo de la citocina, que absorbe la citocina activa en forma de complejo de receptor soluble inactivo. Es una proteína de fusión murina TGF-\betaRII/IgG1 quimérica (véase, la publicación internacional WO 98/48024). Se inyectaron 25 \mug del inhibidor a ratones por la vena de la cola dos veces por semana en los experimentos descritos.

Puesto que el modo de actividad y los potenciales efectos secundarios de FK506 y el inhibidor de TGF-\beta1 soluble de Biogen son tan diferentes, se concluyó que las observaciones hechas usando los sistemas de modelo animal que eran concordantes con ambos fármacos, se debían a la inhibición de la actividad de TGF-\beta1.

Se llevaron a cabo dos tipos de experimentos. Se ensayaron ambos agentes usando el modelo de ratón 129 Sv/J (el ratón Alport) para examinar los efectos biológicos de la propia inhibición de TGF-\beta1. Segundo, se ensayaron ambos agentes en el modelo de ratón doblemente silenciado para examinar los efectos biológicos de la inhibición de la integrina \alpha1\beta1 combinada con la inhibición de TGF-\beta1. En todos los casos, los datos presentados en el presente documento se repitieron al menos tres veces con un grado de consistencia alto.

Cuando se inhibe TGF-\beta1 en el modelo de ratón Alport hay algunos efectos beneficiosos. Hay una mejora general de la morfología de la membrana basal, sin embargo, todavía se observa borrado del proceso pedicular. Así pues, TGF-\beta1 puede mejorar la morfología de la GBM reduciendo la velocidad de acumulación de matriz, pero no tiene un efecto significativo en los mecanismos subyacentes del borrado del proceso pedicular. Esto significa que los inhibidores de TGF-\beta1 dados solos, aunque proporcionan mejora, no es probable que puedan mejorar todas las características del síndrome de Alport u otros de dichos trastornos. En los ratones doblemente silenciados, a las 10 semanas de edad, la mayoría de los procesos pediculares parecían normales, sin embargo, había una acumulación significativa de la matriz en la GBM. Si se tratan estos mismos animales con cualquiera de los inhibidores de TGF-\beta1 usados empezando a las 4 semanas de edad, y se recogen los tejidos a las 10 semanas de edad, aproximadamente el 30% de los glomérulos son ultraestructuralmente indistinguibles de los de los ratones normales. Así pues, se pueden lograr mejoras significativas en los protocolos de tratamiento descritos en el presente documento, usando inhibidores de TGF-\beta1 combinados con inhibidores del receptor de integrina \alpha1\beta1.

Los datos de transferencia Northern de ARNm específicos de riñones tomados de ratones Alport o ratones doblemente silenciados con cualquiera de los inhibidores de TGF-\beta1, demuestran que hay diferentes distintas entre como afecta la mutación de TGF-\beta1 o de integrina \alpha1\beta1 en la expresión de esos mensajes que codifican las moléculas de la matriz que se acumulan en la GBM. Los ARNm que codifican metaloproteinasas (incluyendo metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2)) y sus correspondientes inhibidores (incluyendo TIMP-2 y TIMP-3), que se cree que modulan la velocidad de ciclo metabólico de moléculas que comprenden la GBM, también afectan de forma diferente en ratones Alport frente a ratones doblemente silenciados tratados con cualquiera de los inhibidores de TGF-\beta1. Específicamente, Timp-3, que se expresa con niveles muy altos en ratones normales es suprimido en los ratones tanto Alport como los doblemente silenciados. El tratamiento de ratones doblemente silenciados con inhibidores de TGF-\beta1 evita la supresión de TIMP-3, restableciendo el ARNm a los niveles comparables con los observados en los ratones control (figura 21).

En este mismo sentido, la expresión de la laminina \alpha2 normalmente está estrictamente restringida a la matriz mesangial. La deposición de laminina \alpha2 es el cambio molecular más temprano identificado asociado con el inicio de la enfermedad Alport de la GBM, que al mismo tiempo muestra como se detecta primero el engrosamiento de la membrana basal. La deposición de laminina \alpha2 en la GBM del ratón doblemente silenciado no se observa, incluso a las 7 semanas de edad (figura 18, grupo 1D). La administración de inhibidores de TGF-\beta1 a ratones Alport SV/J no inhibe la deposición de laminina \alpha2 (figura 18, grupo 1C). Esto resalta otra diferencia en como funcionan la integrina \alpha1\beta1 frente a TGF-\beta1 en la ralentización del avance de la enfermedad, confirmando con pruebas porque un tratamiento combinado proporciona beneficios sinérgicos.

Se cree que el fallo de TGF-\beta1 para inhibir el borrado de los procesos pediculares de podocitos está directamente unido a las observaciones relacionadas con la laminina \alpha2. Las lamininas forman heterotrímeros que consisten en una cadena alfa, beta y gamma. En la membrana basal, se reticulan entre sí para formar una superestructura de tipo lámina que es una parte integrante de la membrana basal. Se sabe que las lamininas interaccionan con los receptores de integrina, y tienen funciones importantes en la diferenciación y mantenimiento de la función tisular. En ratones normales, la GBM contiene predominantemente laminina 11, un heterodímero de cadenas \alpha5, \beta2 y \gamma1. Se sabe que esta laminina se une con afinidad alta al receptor de integrina \alpha3\beta1 en la superficie de los podocitos. Muchos creen que esta interacción tiene una función importante en el mantenimiento de la arquitectura del citoesqueleto complejo que forma los procesos pediculares. Los heterotrímeros de laminina que contienen la cadena \alpha2 (laminina 2 y laminina 4) no se unen a la integrina \alpha3\beta1. Por lo tanto, la presencia de la cadena de laminina 2 en la GBM puede producir el borrado del proceso pedicular observado por inhibición de la unión de la integrina \alpha3\beta1 a su sustrato normal (laminina 11). Como se ha mencionado, en el silenciamiento doble, se inhibe la deposición de laminina \alpha2, lo cual se correlaciona bien con el mantenimiento de procesos pediculares en esta cepa de ratón.

Las observaciones adicionales se refieren a la fibrosis intersticial. La fibrosis intersticial se produce tarde en el avance del síndrome de Alport. En el modelo del ratón Alport 129 Sv/J, se observa poca fibrosis antes de las 7 semanas, con una edad media de muerte de 8 semanas. Sin embargo, en el doblemente silenciado, el inicio de la fibrosis es a las 8 a 9 semanas, y avanza hasta la edad media de muerte a las 15 semanas. Por lo tanto, el silenciamiento doble es un modelo excelente para el estudio de la fibrosis. Hay un desarrollo de fibrosis significativo en el ratón doblemente silenciado, y esto se puede evitar en gran medida usando inhibidores de TGF-\beta1.

Uso de acuerdo con la invención

En un aspecto la invención se refiere al uso de inhibidores (p. ej., agentes bloqueantes) que bloquean o inactivan de otra forma la función del receptor de integrina \alpha1\beta1, para preparar un medicamento para retrasar el inicio (medido como la aparición de niveles detectables de albúmina del suero en la orina, usando un ensayo de tira reactiva disponible en el comercio o procedimiento de electroforesis en gel y tinción de gel), ralentizar el avance (determinado por la medición de la velocidad a la que aumentan los niveles de albúmina en la orina en función del tiempo, como se ha medido antes), o incluso invertir la enfermedad glomerular, en particular la nefritis glomerular progresiva y/o fibrosis. Esto incluye, por ejemplo, péptidos al menos nonámeros de proteínas que se unen al receptor de integrina \alpha1\beta1, tales como, pero sin limitar, laminina, colágeno de tipo IV, fibronectina y entactina. Se puede crear la unión de moléculas pequeñas en el sitio del receptor/ligando del receptor \alpha1\beta1 basándose en los estudios de proteína/receptor de integrina \alpha1\beta1. En esta invención se pueden usar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente al sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, antiidiotipos, derivados de animales, humanizados y quiméricos.

Se puede usar un agente (ligando artificial) que bloquea el sitio de unión para el receptor de integrina \alpha1\beta1 en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los ejemplos de dichos agentes incluyen, pero no se limitan, un anticuerpo neutralizante, péptido, fragmento proteolítico o similares. Se cree que dichos agentes bloquean la transducción de señales por el receptor. La eficacia de dichos tratamientos se puede determinar evaluando los efectos secuencia abajo en la expresión de genes, por ejemplo, de TGF-\beta1, fibronectina, cadenas de laminina, etc., por los cambios morfométricos en las membranas basales glomerulares, y/o la mejora del cribado glomerular que se pone de manifiesto en la velocidad de inicio y avance de la proteinuria.

Un anticuerpo que neutralice la integrina \alpha1\beta1 funciona como se proporciona en los ejemplos y en la figura 10. Como ejemplo para ilustrar que un agente soluble capaz de bloquear la interacción de la integrina \alpha1\beta1 con su ligando produciría los mismos efectos en la patogénesis de la enfermedad renal que la mutación de silenciamiento del gen \alpha1, se obtuvo el anticuerpo descrito por Fabbri y col., Tissue Antigens, 48:47-51, 1996. Este anticuerpo se inyectó (400 ng/inyección, tres veces por semana, por vía intraperitoneal), y mostró que inhibía el daño basal glomerular en el modelo de ratón Alport, principalmente de la misma forma observada en el mutante doble.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de agentes que disminuyen el nivel de TGF-\beta1 como medio para ralentizar la acumulación de matriz en el avance de la enfermedad glomerular, en particular la glomerulonefritis progresiva. Por lo tanto, dichos agentes se pueden usar para tratar pacientes con síndrome de Alport y pacientes con diabetes mellitus dependiente de insulina, así como otros que padecen en particular glomerulonefritis progresiva, o cualquiera de dichos trastornos caracterizados por la expansión de la matriz mesangial, proliferación de las células mesangiales, deposición de la matriz en la membrana basal glomerular que produce engrosamiento, adelgazamiento, división u otra irregularidad, borrado de los procesos pediculares de podocitos, o alguna combinación de las manifestaciones listadas antes, todas las cuales culminan en la ruta común de la fibrosis renal (para cuya prevención es particularmente eficaz la terapia de combinación de inhibidores de integrina \alpha1\beta1 e inhibidores de TGF-\beta1). Para este fin, se pueden usar terapias con moléculas antisentido, como se describen en la técnica, para bloquear la expresión de TGF-\beta1 o la proteína receptor de integrina \alpha1\beta1. Se pueden usar una variedad de agentes sintéticos o
naturales.

En las composiciones farmacéuticas de la presente invención se puede usar un agente que neutraliza la capacidad de la citocina TGF-\beta1 para interaccionar con su receptor. Los ejemplos de dichos agentes incluyen, pero no se limitan, un anticuerpo neutralizante, un inhibidor de calcineurina (es decir, micrólido) tal como los descritos en la patente de EE.UU. nº (5.260.301) (Nakanishi y col.) (p. ej., FK506 o tacrolimus y compuestos estructuralmente relacionados), un receptor soluble tal como el receptor de TGF-\beta1 recombinante soluble descrito en la publicación internacional WO 98/48024 (Biogen Inc.) (p. ej., una proteína de fusión TGF-\betaRII/IgG1 quimérica soluble), un fragmento de péptido del receptor, o parte de dicho fragmento que tiene la capacidad de unirse de forma irreversible (o estable) a la citocina e inhibir su capacidad para unirse con su receptor. Además, se puede usar un agente que inhiba la capacidad de TGF-\beta1 de transducir señales al núcleo. La eficacia de dichos tratamiento se puede determinar evaluando los efectos secuencia abajo en la expresión de genes, por ejemplo de fibronectina, cadenas de laminina, etc., por los cambios morfométricos en las membranas basales glomerulares, y/o mejora en el cribado glomerular puesto de manifiesto por la disminución de la velocidad de inicio y avance de la proteinuria.

En un ejemplo, se puede usar FK506 o ciclosporina A para inhibir la parte de calcinuerina del receptor de TGF-\beta1, inhibiendo la transducción de señales por el complejo receptor, como se ha descrito para algunas otra enfermedades renales (Wang y col., Cell 86:435-444,1996 y Miller y col., Endocrinol., 3:1926-1934,1989), e inhibiendo así (por un mecanismo desconocido) el inicio de proteinuria, como se ha descrito para las mismas enfermedades renales (Callis y col., Pediatr. Nephrol., 6:140-144, 1992). Antes de la presente invención no se habían hecho dichas recomendaciones para el síndrome de Alport, la diabetes mellitus o para las enfermedades asociadas con un aumento de matriz extracelular en los glomérulos renales.

En particular, la presente invención ilustra el efecto de una terapia de combinación de inhibición del receptor de integrina \alpha1\beta1 y de TGF-\beta1 que tiene un efecto sinérgico para prevenir tanto la enfermedad glomerular como la fibrosis asociada con el síndrome de Alport. Se podría deducir que otras enfermedades que implican la expansión de la matriz mesangial, la proliferación de células mesangiales, el daño progresivo de la membrana basal, que se manifiestan por uno o más de engrosamiento, adelgazamiento, división de la GBM, borrado de procesos pediculares de los podocitos, o cualquier combinación de los anteriores, también se beneficiará con este tratamiento. Además, se ilustra la eficacia del tratamiento de combinación en la prevención de fibrosis del intersticio tubular en el síndrome de Alport. La fibrosis es una ruta común, cuyo mecanismo se cree que es idéntico para todas las enfermedades renales para las que la fibrosis está implicada. Por lo tanto, la eficacia de esta terapia de combinación en el tratamiento de la fibrosis, debería ser aplicable a todas las formas de fibrosis renal, independientemente de la causa subyacente que inicia la ruta que conduce al a fibrosis.

Los agentes usados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar combinados con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los agentes de presente y invención se formulan en composiciones farmacéuticas (es decir, formulaciones) para administrar a un mamífero, tal como un paciente humano, en una variedad de formas adaptadas a la vía de administración elegida. Las formulaciones en general incluyen aquellas adecuadas para la administración parenteral (incluidas la subcutánea, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa) u otros procedimientos que permiten la estabilidad de los agentes.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados pueden estar en forma de líquidos, semisólidos, sólidos finamente divididos o combinaciones de los mismos. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden de forma conveniente una preparación acuosa estéril del agente, o dispersiones de polvos estériles que comprenden el agente y que preferiblemente son isotónicas con la sangre del receptor. Los agentes isotónicos que se pueden incluir en la preparación líquida incluyen azúcares, tampones y cloruro sódico. Las soluciones del agente se pueden preparar en agua, opcionalmente mezclados con un tensioactivo no tóxico. Las dispersiones del agente se pueden preparar en agua, etanol, un poliol (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerol, y mezclas de los mismos. La forma de dosificación final es estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La fluidez necesaria se puede lograr, por ejemplo, usando liposomas, usando el tamaño de partículas adecuado en el caso de dispersiones o usando tensioactivos. La esterilización de una preparación líquida se puede lograr por cualquier procedimiento conveniente que conserve la bioactividad del agente, preferiblemente por esterilización por filtración. Los procedimientos preferidos para preparar polvos incluyen secado a vacío y liofilización de las soluciones inyectables estériles. La posterior contaminación microbiana se puede evitar usando diferentes agentes microbianos, por ejemplo, agentes antibacterianos, antivíricos y antifúngicos incluyendo parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. La absorción de los agentes durante un periodo prolongado se puede lograr incluyendo agentes para el retardo, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Además de los ingredientes mencionados, las formulaciones de esta invención pueden incluir además uno o más ingredientes auxiliares incluidos diluyentes, tampones, aglutinantes, disgregantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes) y similares. Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica de la farmacia.

Las dosificaciones útiles (es decir, cantidades eficaces que proporcionan un efecto deseado) de los agentes descritos en el presente documento, se pueden determinar comparando su actividad in vitro y la actividad in vivo en modelos animales. En la técnica se conocen procedimientos para extrapolar las dosificaciones eficaces en ratones y otros animales, a seres humanos. Por ejemplo, dosis de aproximadamente 150 mg por kg a aproximadamente 300 mg por kg dos veces al día de agente para inyección intravenosa. Las dosis adecuadas para administrar son, en general, las que son suficientes para producir un efecto deseado, tal como inducción de un aumento demostrable de la expresión de enzima de fase II, u otra característica descrita en el presente documento.

Ejemplos

En los ejemplos se proporciona una descripción de dos modelos animales diferentes. El primero es un modelo de ratón "Alport" que no expresa el colágeno \alpha3(IV) y es normal para la integrina \alpha1 y lo describen Cosgrove y col., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996, y el segundo, que se denomina el ratón "doblemente silenciado", que se obtuvo cruzando el ratón Alport con un ratón que era nulo para el gen de la integrina \alpha1. Hay diferencias entre el ratón Alport y el doblemente silenciado que sirven para ilustrar la eficacia del bloqueo de la función de la integrina \alpha1\beta1 en la ralentización de la enfermedad glomerular. Estos efectos se describen con detalle.

El ratón Alport tiene un antecedente genético puro 129 Sv/J y el ratón doblemente silenciado tiene un antecedente 129 Sv 97,5% puro. Una excepción de estos, son los animales que se usaron para generar las figuras 4, 5 y 6. Estos experimentos se llevaron a cabo pronto en la historia del modelo de ratón Alport, y se generaron cruzando machos quiméricos con hembras C57 B1/6, y después cruzando los heterocigotos resultantes para generar ratones Alport homocigotos que serían la generación F2. Esta es la misma generación de animales usados en la descripción original del modelo de ratón Alport (Cosgrove y col., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996). Esto es habitual para los estudios de silenciamiento de genes tempranos, puesto que acelera la identificación del fenotipo silenciado. Los resultados obtenidos de estos F2 con respecto a la inducción de ARNm específico, están de acuerdo con los resultados obtenidos para el silenciado 129 Sv/J puro. Hay que indicar que todos los experimentos que proporcionan análisis comparativos de los ratones Alport frente a los ratones doblemente silenciados se llevaron a cabo en cepas endogámicas.

Se examinó la función de TGF-\beta1 en el avance de la enfermedad renal, así como en el desarrollo de fibrosis en ambos modelos animales. Esto se hizo examinando dos inhibidores diferentes de TGF-\beta1 que funcionaban de formas muy diferentes. El uso de dos inhibidores diferentes (FK506 y un receptor de TGF-\beta1 soluble) proporciona la prueba de que el efecto se debe a la inhibición de TGF-\beta1 en lugar de a un efecto secundario del agente usado. FK506 puede ser un agente terapéutico en el tratamiento de la fibrosis progresiva relacionada con la sobreexpresión de TGF-\beta1.

En el curso del análisis de los diferentes modelos animales y los tratamientos con fármacos descritos, hay un curso de evaluación específico que se mantiene siempre constante. Se evaluaron tres áreas diferentes. Primero, se examinó la función renal, que proporciona una valoración de la integridad en conjunto del filtro glomerular. Esto se hizo examinando el resultado de la albúmina del suero en la orina. Segundo, se examinó la integridad estructural del tejido tanto a nivel de microscopio electrónico como óptico. Se usaron los procedimientos tanto de microscopía electrónica de transmisión como de barrido. Estos procedimientos se diseñaron para determinar el grado de histopatología renal en esas diferentes condiciones. Finalmente, se llevaron a cabo experimentos de análisis molecular para examinar que cambios se producían en los genes específicos y sus proteínas correspondientes como resultados de esas condiciones diferentes. Estos se examinaron mirando los ARN específicos usando transferencias Northern, hibridación in situ y protección de RNasa, y usando detección inmunohistoquímica para proteínas específicas. Cuando se repitieron los procedimientos específicos para el análisis de diferentes modelos animales y diferentes tratamientos con fármacos en diferentes modelos animales, para evitar la redundancia ahora se establece que los procedimientos se llevaron a cabo de forma idéntica (de forma tan cercana como se puede esperar en la práctica actual) en todos los casos, y por tanto se describen una vez y después se hace referencia a ellos en los ejemplos específicos posteriores.

Hay una variedad de técnicas y procedimientos alternativos disponibles para los expertos en la materia, que de la misma forma permitirán llevar a cabo con éxito la invención pretendida. Todos los reactivos se obtuvieron de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, salvo que se especifique lo contrario. La PBS usada en todos los estudios descritos en el presente documento se adquirieron en forma de comprimidos, y cada comprimido se reconstituyó en 200 ml de agua para hacer pH 7,4, PBS de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, número de producto P-4417.

Procedimientos I. Función renal

A. Análisis de proteínas: Las mediciones iniciales de proteína en la orina se llevaron a cabo usando Albustix (Miles Laboratories, Elkhart, IN) y leyendo las cantidades relativas de la tabla de colores proporcionada con el kit.

Las muestras de orina se recogieron a intervalos semanales y se fraccionaron 0,5 \mul por electroforesis por geles de acrilamida desnaturalizantes al 10%. La proteína en los geles se tiñó con azul coomassie y se fotografiaron. Se usó albúmina de suero bovino como patrón de peso molecular.

II. Integridad estructural

A. Microscopía electrónica de transmisión: Corteza renal externa recién sacada se trituró en paraformaldehído al 4%, se dejó fijar durante 2 horas, y se almacenó a 5ºC en PBS (pH 7,4). El tejido se lavó extensamente (5 veces durante 10 minutos cada vez a 4ºC) con tampón de Sorenson 0,1 M (el tampón de Sorenson estaba hecho combinando 100 ml de fosfato sódico monobásico 200 mM y 400 ml de fosfato sódico dibásico 200 mM con 500 ml de agua y se ajustó a pH 7,4), y posteriormente se fijó en tetraóxido de osmio al 1% en tampón de Sorenson durante 1 hora. Después el tejido se deshidrató en etanol graduado (al 70%, después 80%, después 90%, después 100% durante 10 minutos cada uno), y finalmente en óxido de propileno y se insertaron en resina epoxídica Poly/Bed 812 (Polysocuces, Inc., Warrington, PA) siguiendo los procedimientos descritos por el fabricante. De forma breve, se mezclaron 42 ml de polybed 812 con 26 ml de anhídrido dodecilsuccínico (DDSA, Polysciences, Inc.) y 24 ml de anhídrido metil-nádico (Polysciences Inc.). Se añadieron 1,5 ml de 2,4,6-tri(dimetilaminometil)fenol como catalizador, y la resina activada se congeló en partes alícuotas de 10 ml hasta que fuera necesario para insertar la muestra. Los glomérulos se identificaron en secciones de 1 \mum teñidas con azul toluidina y las secciones finas se cortaron con 70 nm de grosor usando un ultramicrotomo Ultracut E Reichert Jung (Cambridge Instrument Co, Viena, Austria). Las secciones se montaron en rejillas y se tiñeron con acetato de uracilo y citrato de plomo usando procedimientos conocidos. Las secciones montadas en rejilla se examinaron y se fotografiaron usando un microscopio electrónico Phillips CM10.

B. Microscopía electrónica de barrido: Se fijaron trozos pequeños (cubos de aproximadamente 2 mm) de corteza renal en glutaraldehído tamponado con fosfato al 3%, y después se fijaron en tetraóxido de osmio tamponado con fosfato al 1%. Después las muestras se deshidrataron en etanoles graduados y se secaron al punto crítico en dióxido de carbono. Después los cubos se resquebrajaron en trozos tensándolos con el borde de una cuchilla de afeitar, y se montaron con pegamento en matrices con la superficie resquebrajada hacia arriba. La superficie se recubrió por pulverización catódica con oro/paladio usando procedimientos conocidos y se visualizaron con un microscopio electrónico de barrido.

C. Tinción con metenamina-plata de Jones: La tinción de Jones se llevó a cabo insertando los riñones en parafina usando el procedimiento descrito por Burns y Bretschschneider, Thin is in: plastic embedding of tissue for light microscopy, Educational Products División, American Society of Clinical Pathologists, Chicago, IL, pp. 24-25, 1981.

III. Análisis molecular

A. Análisis por transferencia Northern: Se sacaron los riñones y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se trituraron hasta un polvo en nitrógeno líquido usando un mortero y mano de mortero. El polvo se solubilizó en reactivo TRIZOL (GibCo/BRL, Grand Island, NY) usando 5 ml de reactivo por riñón. El ARN total celular se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se fraccionaron 20 \mug de ARN en un gel de agarosa/formaldehído/(MOPS) (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico) al 1,0% por electroforesis a 80V durante 4 horas. Los geles se sumergieron en agua durante 45 minutos y se transfirieron a Hybond N (nailon no cargado, New England Nuclear, Inc., Boston, MA) por transferencia capilar toda la noche usando acetato de amonio 750 mM (en agua) como tampón de transferencia. El ARN se reticuló con luz UV con la transferencia usando un Stratalinker (Stratagene, Inc., LaJolla, CA). Las transferencias se prehibridaron en una solución compuesta de formamida al 50%, solución de Denhardt 10X, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, SDS al 1%, y 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonicado (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las sondas se marcaron (fragmentos de sonda de ADNc marcados con ^{32}P) mediante cebado aleatorio a una concentración de 10^{9} cpm/\mug usando un kit de marcaje de ADN de cebado aleatorio (Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN). Los tampones de prehibridación e hibridación consistían en solución salina-tampón de citrato sódico (SSC) 5X, solución de Denhardt 5X, dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5% y 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonicado. Los filtros se prehibridaron durante al menos 5 horas y después se hibridaron toda la noche usando 1 millón de DPM (desintegraciones por minuto) de sonda por ml de solución de hibridación. Después los filtros se lavaron en condiciones restrictivas (2 veces durante 30 minuto cada vez a 65ºC en una solución compuesta de NaCl 300 mM, citrato sódico 30 mM, y dodecilsulfato sódico al 0,2% en agua) y se expusieron a película de rayos X. La calidad de las preparaciones de ARN y la consistencia de la carga se evaluó tiñendo los geles con bromuro de etidio y barriendo las bandas de ARN ribosómico 18S y 28S usando un instrumento de sistema de imagen digital Gel Imager 2000 y un paquete de software (Applied Imaging, Santa Clara, CA). Las relaciones adecuadas de las bandas ribosómicas confirmaron que las preparaciones de ARN tenían una calidad alta y consistente. El barrido densitométrico cuantitativo confirmó no más de un 10% de variación en la carga de muestra. Se usaron estas herramientas en lugar de una sonda de control por la preocupación de que los cambios en la fisiología celular concomitantes con la fibrosis progresiva hicieran las sondas no fiables. Se evaluaron las diferencias cuantitativas de expresión por análisis de Phosphorimage usando un Phosphorimager BioRad GS-525 (Bio Rad, Inc., Hercules. CA), y se restó la hibridación de fondo.

Las sondas se aislaron de una biblioteca de ADNc desde 5' de riñón murino (Clonotech) por amplificación por PCR usando la secuencia publicada para los diferentes ADNc de colágeno de la membrana basal y los de las proteínas asociadas. Para las sondas de colágeno de la membrana basal, se amplificó la secuencia que codifica el dominio NC1 conservado. Los cebadores y las condiciones usadas eran idénticas a las usadas por Miner y Sanes, J. Cell Biol., 127:879-891, 1994. Para el colágeno COL4A1, los cebadores eran (Muthukumaran y col., J. Biol. Chem., 264:6310-6317, 1989): homosentido, 5'TCTGTGGACCATGGCTTC3' (ID SEC Nº: 1); antisentido, 5'TTCTCATGCACACTTGGC3' (ID SEC Nº: 2). Para el colágeno COL4A2, los cebadores eran (Saus y col., J. Biol. Chem., 264:6318-6324, 1989): homosentido, 5'GGCTACCTCCTGGTGAAG3' (ID SEC Nº: 3); antisentido, 5'TTCATGCACACTTGGCAG3' (ID SEC Nº: 4). Tanto COL4A1 como COL4A2 se amplificaron en las mismas condiciones. Los viriones (a x 10^{6}) se sometieron a 35 ciclos de PCR usando un inicio caliente (10 minutos a 95ºC), después 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto. Las sondas se subclonaron y se verificaron por análisis de la secuencia de ADN.

Las sondas para las proteínas asociadas a la membrana basal se amplificaron a partir de la misma biblioteca como los colágenos de la membrana basal. Los cebadores se tomaron de la secuencia 3'. Para la proteína nuclear HSPG, los cebadores eran (Noonan y col., J. Biol. Chem., 263:16379-16387, 1988): homosentido, 5'CGGGCCACATTCTCC3' (ID SEC Nº: 5); antisentido, 5'GGAGTGGCCGTTGCATT3' (ID SEC Nº: 6). Para la laminina B2, los cebadores eran (Sasaki y Yamada, J. Biol. Chem., 262:17111-17117, 1987): homosentido 5'ACCAGTACCAAGGCGGA3' (ID SEC Nº: 7); antisentido, 5'TCATTGAGCTTGTTCAGG3' (ID SEC Nº: 8). Para la laminina B1, los cebadores eran (Sasaki y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:935-939, 1987): homosentido 5'TAGAGGTTATTTTGCAGCAGA3' (ID SEC Nº: 9); antisentido 5' TTGGATATCCTCATCAGCTTG3' (ID SEC Nº: 10). Para la entactina, los cebadores eran (Mann y col., EMBO Journal, 8:65-72, 1989): homosentido 5'GTGGTTTACTGGACAGACATC3' (ID SEC Nº: 11), antisentido, 5'CCAATCTGTCCAATAAAGG3' (ID SEC Nº: 12). Para la cadena A de laminina, los cebadores eran (Duetzmann y col., Eur. J. Biochem., 177:35-45, 1988): homosentido 5'ACACACTCCAAGCCCACAAAAGCAAG3' (ID SEC Nº: 13); antisentido 5'GAGGGAAGACTCCTTGTAGGTCAA3' (ID SEC Nº: 14). Para la S-laminina, los cebadores eran (Hunter y col., Nature, 338:229-234, 1989): 5'GCAGAGCGGGCACGGAGC3' (ID SEC Nº: 15), antisentido 5'TGTACCTGCCATCCTCTCCTG3' (ID SEC Nº: 16). Las condiciones de la PCR eran idénticas a las usadas para las cadenas de colágeno de tipo IV anteriores.

Las sondas para MMP-2, Timp2 y Timp3 se aislaron usando el ARN total de embriones de ratón de 13 días por RT-PCR. El cebador aplicado para MMP-2 amplifica un fragmento de 237 pb a partir del ARNm (Reponen y col., J. Biol. Chem., 267:7856-7862, 1992), e incluía el cebador secuencia arriba 5'CCC CTA TCT ACA CCT ACA CCA3' (ID SEC Nº: 17) y el cebador secuencia abajo 5'TGT CAC TGT CCG CCA AAT AAA3' (ID SEC Nº: 18). El cebador aplicado para Timp-2 amplifica un fragmento de 195 pb del ARNm (Shimizu y col., Gene, 114:291-292, 1992), e incluía el cebador secuencia arriba 5'CAG AAG AAG AGC CTG AAC CAC A3' (ID SEC Nº: 19) y el cebador secuencia abajo 5'GTA CCA CGC GCA AGA ACC3' (ID SEC Nº: 20). El cebador aplicado para Timp-3 amplifica un fragmento de 337 pb a partir del ARNm (Apte y col., Developmental Dynamics, 200:177-197, 1994), e incluía el cebador secuencia arriba 5'GGT CTA CAC TAT TAA GCA GAT GAA G3' (ID SEC Nº: 21) y el cebador secuencia abajo 5'AAA ATT GGA GAG CAT GTC GGT (ID SEC Nº: 22). Para las tres sondas, se hizo la transcripción inversa de 1 \mug del ARN total usando la transcriptasa inversa Superscript plus de GibCo y el cebador secuencia abajo, de acuerdo con los protocolos descritos por el fabricante. Una décima parte de la reacción se sometió a 40 ciclos de PCR con inicio en caliente usando PFU polimerasa (Stratagene, Inc.).

La sonda de TGF-\beta1 fue un regalo de H.L. Moses (Miller y col., Mol. Endocrinol., 3:1926-1934, 1989), excepto para la protección de RNasa que requería una sonda humana. Para esta sonda, se amplificó un fragmento de 24 pares de bases de TGF-\beta1 por PCR, de la biblioteca de ADNc de riñón humano (Clonetech, Palo Alto, CA). Los grupos de cebadores usados fueron GCA GAA GTT GGC ATG GTA G (ID SEC Nº: 23) (inferior) y GGA CAT CAA CGG GTT CAC TA (ID SEC Nº: 24) (superior). El fragmento se reamplificó con PFU polimerasa (Stratagene) y se ligó con extremo romo en el plásmido pBluescript SK+.

B. Hibridación in situ : Los riñones se fijaron inicialmente por perfusión transcardiaca lenta (usando paraformaldehído al 4% en PBS). Los animales primero se anestesiaron profundamente usando Avertin (2,2,2-tribromoetanol, Aldrich Chemical Co., Milwalkee, WI). Se abrió la cavidad pectoral, y se hizo un pequeño agujero en el ventrículo derecho por punción con una aguja de tuberculina para permitir la salida del perfusato. Se insertó una segunda aguja de tuberculina conectada con una jeringuilla de 30 ml que contenía tampón de perfusión en el vértice del ventrículo izquierdo. Se perfusionó 1 ml de fijador por gramo de peso corporal a una velocidad de aproximadamente 3 ml por minuto. Los riñones adecuadamente fijados estaban firmes y tenían un aspecto amarmolado. Después de la perfusión, se sacó la cápsula renal con fórceps Iris, se cortaron los riñones por la mitad longitudinalmente (cortando en dos la pelvis, médula y corteza) y se pusieron en fijador a 4ºC durante una hora adicional. Las mitades fijadas se insertaron en parafina, se cortaron a 6 \mum, y se transfirieron a portaobjetos de microscopio SUPERFROST PLUS (Fisher Scientific, Inc., Pittsburg, PA). Los portaobjetos se hornearon en un calentador de portaobjetos a 60ºC durante 20 minutos y se almacenaron a 4ºC hasta usarlo (los portaobjetos son útiles hasta 6 semanas). Los riñones de los ratones control y Alport de la misma camada se insertaron lado con lado para controlar las diferencias sutiles que podían haber incurrido durante el procedimiento de hibridación.

Los portaobjetos se hornearon en un horno a vacío a 60ºC durante 1 hora, después se desceraron mediante 3 lavados sucesivos de 2 minutos en xilenos. El tejido se deshidrató en etanol, se desproteinó incubando en HCl 0,2 N durante 15 minutos, se lavó con PBS y se hizo digerir con proteinasa K 3 \mug/ml (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) durante 10 minutos a 37ºC. La digestión se paró lavando en glicina 2 mg/ml en PBS. Después de la deshidratación del tejido en soluciones de etanol graduadas (70%, 80%, 90%, 100% durante 10 minutos cada uno, a temperatura ambiente), el tejido se prehibridó, se hibridó, y se lavó de acuerdo con los protocolos descritos con el kit de hibridación in situ de Genius (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) con las siguientes modificaciones. En las soluciones tanto de prehibridación como de hibridación, se incluyó ARNt de levadura de panadería extraída en fenol/cloroformo 10 mg/ml. Esta etapa redujo significativamente la señal no específica. Después de la hibridación, el tejido se lavó dos veces en SSC 2X a 50ºC, después se hizo digerir con RNasa A durante 6 minutos a temperatura ambiente. La cantidad de RNasa A se determinó para cada sonda (intervalo de 200 ng/ml a 5 \mug/ml). Las sondas de control negativo incluyen la secuencia de codificación para \beta-galactosidasa bacteriana o neomicina fosfotransferasa. Todas las sondas tenían aproximadamente 200 bases de longitud, se clonaron en el sitio SacI de BlueScript SK+ (Stratagene, Inc., LaJolla, CA), y se transcribieron (después de linearización) desde el lado de T3. La única excepción era TGF-\beta1, que tenía 974 bases y se clonó en un vector pmT.

C. Ensayo de protección de RNasa: Se llevaron a cabo experimentos usando un kit de RPAII (Ambion, Inc., Austin, TX) siguiendo los protocolos proporcionados con el kit. Para una sonda se amplificó un fragmento de 264 bases de TGF-\beta1 por PCR a partir de la biblioteca de ADNc de riñón humano (Clonetech, Palo Alto, CA). Los conjuntos de cebadores usados fueron GCA GAA GTT GGC ATG GTA G (ID SEC Nº: 25) (inferior) y GGA CAT CAA CGG GTT CAC TA (ID SEC Nº: 26) (superior). El fragmento se reamplificó con PFU polimerasa (Stratagene) y se ligó con extremo romo en el plásmido pBluescript SK+ (Stratagene). La sonda antisentido se generó a partir del promotor T7.

D. Análisis de inmunofluorescencia: Se sacaron riñones recientes, se cortaron en secciones transversales de 3 mm de grosor, se insertaron en compuesto acuoso Tissue Tek OCT (número de producto 4583, Miles Laboratories, Elkhart, IN), y se congelaron poniéndolas en un refrigerador a -150ºC. Se cortaron secciones de 3 \mum usando un criostato Microm tipo HM505N (Zeiss, Inc., Walldorf, Alemania) y se descongelaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Los portaobjetos se fijaron durante 15 minutos sumergiéndolos en etanol frío (-20ºC) al 95%, si se iban a usar para teñir con anticuerpos específicos de colágeno de la membrana basal, o con acetona fría (20º) para la tinción con anticuerpos específicos para las proteínas asociadas a la membrana basal. Los portaobjetos se dejaron secar al aire toda la noche, y se almacenaron desecados a -80ºC hasta su uso.

Se dejó que las muestras alcanzaran la temperatura ambiente, después se lavaron 3 veces en PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente). Para la tinción con anticuerpos contra los colágenos de tipo IV, el tejido se pretrató con glicina 0,1 M y urea 6 M (pH 3,5) para desnaturalizar la proteína y exponer los sitios antigénicos. Las diluciones adecuadas (determinadas de forma empírica) de los anticuerpos primarios se aplicaron a la muestra y se dejaron reaccionar durante 3 horas a 5ºC en una caja humidificada. Los anticuerpos se diluyeron en una solución de leche en polvo sin grasa al 5% en PBS (pH 7,4). El uso de la leche en polvo sin grasa redujo sustancialmente la fluorescencia de fondo. Las muestras se lavaron 4 veces en PBS (pH 7,4) durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente para separar el anticuerpo primario, y después se hicieron reaccionar con el reactivo secundario conjugado con FITC adecuado. Todos los reactivos secundarios se usaron con una dilución 1:100 usando leche en polvo sin grasa al 7% en PBS como diluyente. Los reactivos secundarios se dejaron reaccionar durante 2 horas a 4ºC. Después los portaobjetos se lavaron 4 veces con PBS frío (pH 7,4) seguido de la aplicación de medio de montaje de antidecoloración (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Las muestras se sellaron bajo los cubreobjetos usando barniz de uñas transparente. Los portaobjetos se fotografiaron con 1000X aumentos. La tinción con metenamina-plata de Jones se llevó a cabo en la muestra insertada en plástico.

El antisuero de cabra contra las cadenas COL4A1 y COL4A2 se adquirió en Southern Biotechnology, Inc., Birmingham, AL. El fabricante ensayó en este anticuerpo la reactividad cruzada y produjo un patrón de tinción en el glomérulo que estaba de acuerdo con el observado para otras preparaciones de anticuerpos contra estas cadenas (Miner y Sanes, J. Cell. Biol., 127:879-891, 1994). El anticuerpo anti-proteoglicano sulfato de heparina (HSPG) es un anticuerpo monoclonal de rata cultivado contra la proteína central HSPG purificada de tumor de ratón EHS. El fabricante ensayó la reactividad cruzada del anticuerpo con laminina, colágeno de tipo IV, fibronectina y entactina por transferencia western e inmunoensayo de transferencia en mancha (Chemicon International, Temecula, CA) y como se describe en otra parte (Horiguchi y col., J. Histochem. Cytochem., 37:961-970, 1989). Los anticuerpos anti-laminina-1 son un antisuero de conejo. El inmunógeno se purificó de la membrana basal de EHS y se adquirió en Sigma Immunochemicals (St. Louis. MO). El inmunoensayo por transferencia en mancha realizado por el fabricante (Sigma) confirmaba la ausencia de reactividad cruzada del colágeno de tipo IV, fibronectina, vitronectina y sulfatos de condroitina de tipos A, B y C. La antifibronectina es un antisuero de conejo cultivado contra la fibronectina purificada de plasma humano. El fabricante (Sigma Immunochemicals) la ensayó frente a la reactividad cruzada con el colágeno IV, laminina, vitronectina, y sulfato de condroitina A, B y C usando inmunoensayo de transferencia en mancha. La anti-entactina es un anticuerpo monoclonal de rata producido usando entactina derivada de EHS como inmunógeno. Este reactivo se adquirió de Upstate Biotechnology Incorporated, Lake Placid, NY, y se ensayó la inmunorreactividad adecuada así como la ausencia de reactividad cruzada con otros componentes mayoritarios de la membrana basal (Ljubimov y col., Exp. Cell Res., 165:530-540, 1986).

La inmunofluorescencia y la tinción de Jones se registraron y se procesaron usando un microscopio de fluorescencia RFLA Olympus BH2 en interfase con un sistema de análisis de imágenes Applied Imaging Cytovision Ultra (Applied Imaging Inc.). Estas imágenes se capturaron usando una cámara de vídeo en blanco y negro de alta resolución. Estas imágenes se modificaron usando el sistema de software. En el tratamiento de las imágenes se tuvo cuidado de aproximar bien la fluorescencia observada directamente en el microscopio.

E. Detección por inmunoperoxidasa: El procedimiento de detección por inmunoperoxidasa se usó en la inmunotinción para TGF-\beta1 en los glomérulos así como para la fibronectina y colágeno de tipo I en el intersticio tubular. El anticuerpo del colágeno de tipo I es antirratón de conejo, y se adquirió en Biogenesis, Inc. (Sandow, NH). El antisuero se usó con una dilución 1:100 para la tinción con inmunoperoxidasa. El anticuerpo de fibronectina usado era el mismo que para la tinción inmunofluorescente (un antisuero de fibronectina antihumano de conejo de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y se usó con una dilución 1:100. Los reactivos secundarios eran anticuerpos anticonejo biotinilados adquiridos en Vector laboratories (Burlingame, CA) y se usaron con una dilución de 1:100. El tejido se insertó en parafina (usando el mismo procedimiento descrito para la hibridación in situ) y se cortó en secciones de 3 \mum. Las secciones desparafinadas se pretrataron con 5 \mug de proteinasa K (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) en Tris-HCl 100 mM (pH 7,4) para exponer los epítopos. La digestión con proteinasa se paró por incubación en glicina 2 mg/ml en PBS durante 30 segundos. El tejido tratado con proteinasa K descerado se lavó 3 veces con PBS y se hizo reaccionar con el anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó 3 veces con PBS y después se hizo reaccionar con un anticuerpo secundario biotinilado durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con PBS (pH 7,4), los portaobjetos se incubaron con peroxidasa de rábano picante con estreptavidina (3 \mug/ml, Vector Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 3 lavados con PBS, se reveló la unión del anticuerpo con el sistema de sustrato AEC (Vector AEC SK-4200, Vector Laboratories) siguiendo los procedimientos descritos por el fabricante.

Para TGF-\beta1, el anticuerpo primario era TGF-\beta1 \alpha-humano de pollo (R&D Systems, Minneapolis, MN) usado con una dilución 1:15 en leche en polvo sin grasa al 7% en PBS (que se usó como diluyente para todos los anticuerpos). Esto se dejó reaccionar durante al menos 3 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario era un antipollo de cabra biotinilado para TGF-\beta1 (Vector Laboratories Burlingame, CA) y se aplicó con una dilución 1:100 y se dejó reaccionar durante al menos 1 hora. Después de 3 lavados, la detección de la inmunoperoxidasa se llevó a cabo usando un kit de AEC (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Ejemplo 1 Producción de un doble mutante Alport/Integrina \alpha1

Se creó un modelo de ratón para la forma autosómica del síndrome de Alport por mutagénesis dirigida del gen de procolágeno COL4A3 como se ha descrito previamente (Cosgrove y col., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996). Este, en el presente documento, se denomina el "ratón Alport" y está disponible en Jackson Laboratories en BarHarbor, Maine con nº de acceso 2908. Este ratón silenciado para \alpha3(IV) que tiene un antecedente de 129 Sv/J, se cruzó (5 retrocruzamientos sucesivos con 129 Sv puro, después con el ratón nulo para integrina \alpha1, que es 129 Sv puro), para producir un ratón "doblemente silenciado" que es 129 Sv aproximadamente 97,5% puro. El ratón silenciado para \alpha1 lo suministró Humphrey Gardner del Scripps Institute en LaJolla, CA y lo describen Gardner y col., Dev. Biol., 175:301-313, 1996.

Ejemplo 2 Valoración del avance de la enfermedad renal de Alport en modelos de ratón

Los ratones estudiados en este ejemplo incluían ratones Alport, que no expresan colágeno \alpha3(IV) y son normales para la integrina \alpha1 (disponible en Jackson Laboratories of Bar Harbor, Maine), y doblemente silenciados (es decir, mutantes dobles) que no expresan el colágeno \alpha3(IV) ni la integrina \alpha1. Los mutantes dobles tenían antecedentes 97,5% de 129 SV y 2,5% de Sv/J.

Se recogió la orina de los ratones a intervalos semanales y el análisis de proteínas se llevó a cabo como se describe en la sección de procedimientos. Como se muestra en la figura 1, los animales no expresaban el colágeno \alpha3(IV) y eran normales para la integrina \alpha1, la edad media para el inicio de la enfermedad renal Alport (basado en un estudio de 6 individuos), medido por el inicio de proteinuria, era de 3,5 a 4 semanas. La proteinuria avanzaba rápidamente, alcanzando niveles máximos entre las 6 semanas y 6,5 semanas de edad. La edad media de muerte debido a insuficiencia renal era entre 8 semanas y 9 semanas de edad. Ningún animal de este genotipo (se ensayaron 9) vivió más de 9 semanas. Los niveles de nitrógeno de la urea en la sangre (BUN) se volvieron elevados de 7 semanas a 7,5 semanas de edad. En los mutantes dobles (se ensayaron 4 para estas mediciones), el inicio de proteinuria era entre 5 semanas y 5,5 semanas de edad y avanzó más lentamente, alcanzando los niveles máximos a las 9 a 9,5 semanas. La edad media de muerte debido a insuficiencia renal era entre 15 semanas y 16,5 semanas. Los animales desarrollaron BUN elevado entre las 10 semanas y 11 semanas de edad.

Ejemplo 3 Caracterización del modelo de ratón doblemente silenciado

Se analizaron 3 conjuntos diferentes de animales (controles normales, animales que no expresan el gen de \alpha3(IV) y normales para la integrina \alpha1 (ratones Alport), y mutantes dobles) a las 4 y 7 semanas de edad usando una serie de técnicas diferentes.

Se llevó a cabo la microscopía electrónica de transmisión para valorar la integridad de la membrana basal. A las 4 semanas de edad (no se muestran datos), los Alport de la misma camada mostraron membranas basales enrarecidas en el 100% de los bucles capilares glomerulares. Los mutantes dobles mostraron algo de enrarecimiento de la membrana basal glomerular (GBM) (es decir, engrosamiento, adelgazamiento y división irregulares), sin embargo, era infrecuente y en general no extenso. Aproximadamente el 20% de los glomérulos en los mutantes dobles no mostraron enrarecimiento en absoluto de la membrana basal. Aproximadamente 5% de los glomérulos en los ratones Alport en este mismo momento eran fibróticos, mientras que no se encontraron glomérulos fibróticos en los mutantes dobles de la misma camada. La figura 2 ilustra el grado de daño de la membrana basal glomerular característico de los diferentes ratones a las 7 semanas de edad. Se ilustra un bucle capilar glomerular típico. La membrana basal glomerular en los ratones Alport en este momento del desarrollo está gravemente dañada en casi todos los glomérulos. En la figura 2B es evidente el grueso engrosamiento y adelgazamiento irregular, y el borrado extensivo de los procesos pediculares de los podocitos. Sin embargo, en el doblemente silenciado (figura 2C) la GBM, en la mayor parte, es ultraestructuralmente normal, con excepción de pequeñas irregularidades, y los procesos pediculares de los podocitos mantienen una arquitectura normal (compárense las regiones indicadas por flechas para el ratón normal en la figura 2A con el ratón doblemente silenciado en la figura 2C). En este momento entre 30% y 50% de los glomérulos en el ratón Alport eran fibróticos, mientras que menos del 5% eran fibróticos en los mutantes dobles.

La microscopía electrónica de barrido de los ratones de 7 semanas de edad (no se muestran los datos) indicaban que los ratones Alport mostraban un hinchamiento significativo de los procesos pediculares de los podocitos, destruyendo la estructura normalmente elegante y compleja de estas células. Este borrado de los procesos pediculares se ha descrito para la glomerulonefritis de Alport. En los mutantes dobles, aunque la arquitectura no es perfecta, es muy cercana a la observada en los glomérulos de los ratones control. El hinchamiento de estos procesos pediculares es responsable del bloqueo del filtro glomerular y conduce a la uremia. Por lo tanto, este descubrimiento es importante con respecto a la mejor función glomerular en el mutante doble respecto a los Alport de la misma camada.

Los montajes de los riñones enteros insertados en parafina de los ratones de 7 semanas de edad se tiñeron usando el Método de Jones, y se contó el número total de glomérulos fibróticos (no se muestran los datos). Prácticamente todos los glomérulos de los ratones Alport estaban afectados en el mismo grado. La mayoría mostró hipercelularidad glomerular y expansión de la matriz mesangial, y aproximadamente un tercio eran fibróticos. A diferencia de esto, los glomérulos de los ratones mutantes dobles eran en gran medida normales con respecto a la matriz mesangial y la celularidad. Aproximadamente el 25% no mostró pruebas de proliferación celular mesangial y el 5% eran fibróticos. Los análisis se repitieron en dos grupos deferentes de ratones con resultados muy similares.

Se llevaron a cabo análisis de inmunofluorescencia usando corteza renal congelada tomada de estos mismos animales. Los tejidos se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para proteínas que se sabe se acumulan en la GBM en función del avance de la enfermedad renal de Alport. Estas incluían laminina 1 (Lam-1) (usada con dilución 1:200), cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) de colágeno (COL 4A1,2) (usada con una dilución 1:15), fibronectina (Fib) (usada con una dilución 1:200), proteoglicano sulfato de heparina (HSP) (usado con una dilución 1:100), y entactina (ent) (usado con una dilución 1:200). Todos los anticuerpos se diluyeron en leche en polvo sin grasa al 7% en PBS. Los resultados se muestran en la figura 3. A las 7 semanas de edad, todos estos componentes eran significativamente elevados en la GBM de los ratones Alport respecto a los controles. En los glomérulos fibróticos, todos estos componentes eran abundantes. En el mutante doble, la inmunotinción para las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) de colágeno era comparable a la del ratón Alport en los glomérulos no fibróticos. Esto es lo esperado, puesto que la composición del colágeno de tipo IV de la GBM en el mutante doble es la misma que en el ratón Alport (es decir, compuesta enteramente de cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) de colágeno). La tinción para la laminina 1 y el proteoglicano sulfato de heparina se redujeron significativamente en la GBM de los mutantes dobles respecto a los ratones Alport (compárese la figura 3F con 3E y la figura 3L con la figura 3K, respectivamente), y no había una tinción evidente para la fibronectina en la GBM de los mutantes dobles (figura 3I), que es abundante en la GBM de los ratones Alport (figura 3H). La inmunotinción de estas proteínas en la matriz mesangial era comparable entre los ratones mutantes dobles y Alport, sin embargo para el proteoglicano sulfato de heparina la tinción mesangial era menor en los mutantes dobles (figura 3L) respecto a los controles normales (figura 3J) o ratones Alport (figura 3K).

El análisis de transferencia Northern se realizó usando el ARN aislado de la corteza renal total de ratones normales, Alport y dobles mutantes de 7 semanas de edad. Se fraccionaron 20 \mug de cada muestra de ARN en un gel de agarosa, se transfirieron a nailon por transferencia capilar y se hibridaron a una sonda radiomarcada correspondiente a una parte del ADNc de TGF-\beta1 de ratón. Después de una serie de lavados en condiciones muy restrictivas, la membrana se expuso a película de rayos X. La figura 9 muestra que, aunque es inducido el TGF-\beta1 en el ratón Alport (cuarta calle desde la izquierda comparado con la segunda calle desde la izquierda que es el control), no es inducido en ratones Alport que albergan la mutación de la integrina \alpha1 (silenciamientos dobles) (tercera calle desde la izquierda comparado con la segunda calle desde la izquierda que es un control). Estos datos son los que condujeron a los investigadores a especular si el efecto de los inhibidores de \alpha1 podía ser mediado por la supresión de TGF-\beta1. Por lo tanto, los siguientes experimentos con inhibidor de TGF-\beta1 se llevaron a cabo para aclarar esta cuestión.

Ejemplo 4 Función del TGF-\beta1 en el avance de la enfermedad renal de Alport post-proteinúrica

Se recogieron tejidos de retrocruzados F-2 de animales fundadores 129 Sv/J con el antecedente C57 B1/6 (véase antes). Los experimentos se llevaron a cabo al menos dos veces (una especie de dos grupos diferentes de animales). Los resultados de los datos presentados en este documento eran claros y consistentes.

Estos experimentos se llevaron a cabo para ilustrar dos puntos. Primero, ¿hay una correlación temporal entre la inducción del ARNm de TGF-\beta1 y los ARNm que codifican las proteínas de la matriz que se acumulan en función del avance de la enfermedad renal de Alport?, y segundo ¿estos ARNm son realmente inducidos en los glomérulos? (Puesto que sólo el 5% del peso húmedo de los riñones son de los glomérulos, la inducción del ARNm específico en la corteza renal total se refiere más a la cuestión de la fibrosis progresiva que a la glomerulonefritis).

Se aisló el ARN total de riñones de animales Alport y control de la misma camada a intervalos de 2 semanas empezando a las 6 semanas y terminando a las 12 semanas de edad. La proteinuria en los ratones F2 usados en este estudio empieza cuando los ratones tienen aproximadamente 5,5 a 6 semanas (no se muestran los datos). El ARN se fraccionó en geles de agarosa desnaturalizantes, se transfirieron a soportes de nailon, y se añadieron sondas con radiomarcaje específico para las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) de colágeno, entactina, la cadena \beta1 o \beta2 de laminina, fibronectina o TGF-\beta1. Los resultados en la figura 4 ilustran que los ARNm para todas estas proteínas, a excepción de la laminina \beta1 son inducidos después del inicio de la proteinuria en el modelo de ratón Alport.

También se llevaron a cabo transferencias Northern para el mismo transcurso de tiempo para la laminina \alpha1, laminina \beta2, laminina \gamma1, proteína nuclear proteoglicano sulfato de heparina y las cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) de colágeno (no se muestran los datos). No había diferencias significativas en los niveles de ARNm para estas otras proteínas de la membrana basal, cuando se compararon el control con el mutante.

Los resultados de los análisis Northern se analizaron usando un Phosphorimager para cuantificar directamente los cambios relativos en la expresión del ARNm específico durante el transcurso de tiempo. La figura 5 ilustra que la inducción de los niveles de ARNm específicos, son evidentes primero a las 6 semanas de edad, o aproximadamente en el momento en el que la proteína en el espacio urinario alcanza los niveles máximos en los ratones F2 (Cosgrove y col., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996). A las 8 semanas, los niveles de ARNm alcanzaron el máximo, con los ARNm que codifican TGF-\beta1 y la fibronectina inducidos 6,6 y 9,4 veces frente a los ratones control, respectivamente. Los niveles de ARNm para el colágeno \alpha1(IV) y \alpha2(IV) y la entactina fueron todos inducidos aproximadamente 3 veces más la semana 8. A diferencia de esto, no se observaron cambios significativos en los ARNm que codifican las cadenas \beta1 y \beta2 de laminina, determinado por las mismas transferencias Northern de los ARN totales, en ningún momento del avance de la enfermedad renal.

Para examinar si los ARNm que codifican el TGF-\beta1 o los diferentes componentes de la membrana basal eran inducidos en un tipo de célula glomerular particular, se llevó a cabo la hibridación in situ usando sondas antisentido marcadas con digoxigenina específicas para los ARNm. Los riñones se recogieron de ratones Alport F2 y normales control de la misma camada de 10 semanas de edad, le siguió la perfusión con paraformaldehído al 4% en PBS, y se trataron para el análisis de hibridación in situ como se describe en la sección de procedimientos. Las sondas antisentido eran específicas para el dominio NC1 del colágeno \alpha1(IV), TGF-\beta1, fibronectina, entactina, o la cadena \beta1 de laminina. Se usó una sonda específica para la \beta-galactosidasa bacteriana como control para la unión no específica (un control negativo), puesto que esta sonda no hibridaba con el ARN total de riñón de ratón en las transferencias Northern (no se muestran los datos). La sonda control se hibridó al mismo tiempo como cada sonda específica y se trató con la misma concentración de RNasa A después del procedimiento de hibridación. El tratamiento con RNasa A se llevó a cabo con 0,25 \mug/ml para \alpha1(IV), TGF-\beta1 y fibronectina, y con 3 \mug/ml para la entactina y laminina \beta1. Los resultados se muestran en la figura 6.

Los resultados en la figura 6 ilustran que, para todos los ARNm específicos examinados, se observan claramente niveles elevados en las células epiteliales viscerales (podocitos) del glomérulo en los ratones silenciados para COL4A3 (ratones Alport). Para la cadena \alpha1(IV) de colágeno, la expresión del ARNm en el control se observa tanto en las células mesangiales como en las células endoteliales del glomérulo (figura 6A), que está de acuerdo con que esta molécula se encuentre en el animal maduro. En el mutante, la expresión en la matriz mesangial puede ser elevada, como se pone de manifiesto por la tinción mucho más oscura cuando se compara con la tinción de células mesangiales en la muestra control, sin embargo la diferencia más evidente entre el control y el mutante es el anillo de células teñidas que recubren la circunferencia exterior del glomérulo, correspondiente a los podocitos (figura 6B). Se observa expresión de fibronectina en el glomérulo control principalmente en las células mesangiales (figura 6D). Aunque también se observa la tinción de las células mesangiales en el mutante, los podocitos expresan claramente niveles significativos de ARNm de fibronectina (figura 6E). La expresión de TGF-\beta1 es muy débil en los glomérulos en los animales control, sin embargo, se observa algo de tinción específica en las células mesangiales de los animales control (figura 6G). En el mutante, los niveles de ARNm de TGF-\beta1 son significativamente elevados en las células mesangiales, las células endoteliales y otra vez en los podocitos (figura 6H). Para la entactina, el ARNm se localizó en los podocitos del control, lo cual no es inesperado puesto que esta proteína se localiza específicamente en la GBM. De forma inesperada se observa algo de tinción específica para células mesangiales en el animal control. Mientras que la tinción en las células epiteliales viscerales en el mutante parece que indica expresión elevada, este no es un ensayo cuantitativo, y la diferencia entre el control y el mutante es demasiado pequeña para que se definitiva (compárese la figura 6J con 6K).

Las transferencias Northern pusieron de manifiesto que los niveles de ARNm para la cadena \beta1 de laminina no habían cambiado en el control frente al mutante en el transcurso de tiempo. El análisis de hibridación in situ para este mismo mensaje ilustraba la localización específica de células mesangiales esperada en los glomérulos de los riñones control (figura 6M). Sin embargo, en los glomérulos de los ratones mutantes, el ARNm es inducido claramente en las células epiteliales viscerales (figura 6N).

Las muestras de tejido se recogieron a las 3 y 5 semanas de edad, y se analizaron por hibridación in situ usando estas mismas sondas. El patrón de tinción en estos glomérulos eran indistinguible de los normales de la misma camada (no se muestran los datos). Esto sugiere que la activación de estos genes en los podocitos se produce después del inicio de la proteinuria.

Los datos de la proteína TGF-\beta1 basados en la detección con inmunoperoxidasa usando anticuerpos específicos para la isoforma activa de la citocina, corroboran los datos obtenidos por el análisis de hibridación in situ para el ARN mensajero de TGF-\beta1 (compárese la inmunotinción de la figura 7B con la figura 7A). Esto ilustra que la expresión elevada del ARN mensajero de TGF-\beta1 en los podocitos se traduce en alto nivel de proteína.

El análisis de protección de RNasa se llevó a cabo para determinar si los niveles de ARNm para la citocina también eran elevados en la corteza renal humana de pacientes Alport frente a control. Se quitó la corteza renal Alport humana de un chico de 15 años durante la cirugía de transplante. La muestra tenía un nivel moderado de escarificación, con aproximadamente 50% de los glomérulos fibróticos. La muestra se sacó inmediatamente y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido. El ARN de riñón humano normal se adquirió en Clonetech (Palo Alto, CA) y era una muestra de un grupo de recolección de fuentes humanas normales. El ARN de la muestra Alport se aisló usando el mismo procedimiento que se usó para los riñones de ratón. Se examinó la integridad del ARN por fraccionamiento de 10 \mug en un gel de agarosa y tinción del gel con bromuro de etidio (10 \mug/ml en agua). Tanto la muestra normal como la Alport estaban intactas basándose en la cantidad relativa de bandas de ARN ribosómico 28S y 18S. El experimento de protección de RNasa se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos. Los datos en la figura 8 ilustran una elevación de 3-4 veces del ARN mensajero de TGF-\beta1 en la corteza renal Alport humana respecto al control. Esto prueba que la citocina también es sobreexpresada en los riñones Alport humanos. Este dato respalda la esperanza de que esta tecnología también funcionará en seres humanos.

Ejemplo 5 Uso de un anticuerpo neutralizante para bloquear la integrina \alpha1\beta1

Como ejemplo para ilustrar que un agente soluble capaz de bloquear la interacción de la integrina \alpha1\beta1 con su ligando produciría los mismos efectos en la patogénesis de la enfermedad renal de Alport que la mutación de silenciamiento del gen \alpha1, se obtuvo el anticuerpo descrito por Fabbri y col., Tissue Antigens, 48:47-51, 1996. Se inyectó este anticuerpo (400 ng/inyección, tres veces por semana, por vía intraperitoneal) en ratones Alport empezando a las 2 semanas de edad. Los animales se recogieron a las 6 semanas de edad y se analizaron las membranas basales por microscopía electrónica de transmisión. Como es evidente en la figura 10, las membranas basales en estos animales tratados eran en gran medida regulares, y tenían el aspecto trilaminar normal. Se observó el hinchamiento de células endoteliales debido a la respuesta inmunitaria del anticuerpo. Estos resultados ilustran que un agente soluble que bloquea el receptor de integrina \alpha1\beta1 ralentizará el avance de la enfermedad Alport de la GBM de la misma forma que se observa en la línea de ratón doblemente silenciado.

Ejemplo 6 Efectos de la inhibición de TGF-\beta1 solo en el modelo de ratón Alport (129 Sv/J)

El protocolo experimental era la inyección de FK506 (1 \mug/g de peso corporal, inyectado por vía intraperitoneal, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japón), o un receptor de TGF-B1 soluble (25 \mug/inyección, por vía intravenosa por la vena de la cola, Biogen Inc., Cambridge. MA) dos veces por semana empezando a las 3 semanas de edad. Los riñones se recogieron a las 7 semanas de edad y se sometieron a los análisis descritos.

El análisis por microscopía electrónica de transmisión de la ultraestructura de la membrana basal en diferentes condiciones se ilustra en la figura 11. La figura 11A muestra un bucle capilar glomerular de un animal normal no tratado. Obsérvense los procesos pediculares normales regulares y la tinción de la membrana basal trilaminar. La figura 11B muestra un bucle capilar de un ratón Alport 129 Sv/J de 7 semanas de edad típico. Obsérvense los procesos pediculares hinchados y el engrosamiento focal grande de la GBM. La figura 11C ilustra un bucle capilar típico de un animal Alport de 7 semanas de edad tratado con FK506. Hay una falta obvia de engrosamiento de la membrana basal, lo que sugiere que el fármaco reduce la tasa de acumulación de matriz en la GBM. Sin embargo, hay un grado significativo de hinchamiento en los procesos pediculares, con una falta notable de arquitectura de los procesos pediculares. Esta misma observación se hace en los ratones en los que se ha inyectado receptor soluble de TGF-\beta1 (figura 11D). Estos datos ilustran que los inhibidores de TGF-\beta1 pueden prevenir el engrosamiento irregular de la GBM, pero no pueden prevenir los cambios en la arquitectura de los procesos pediculares asociados con la enfermedad de la GBM de Alport avanzada.

Algunas de las muestras de riñón se trataron para la microscopía electrónica de barrido. Los glomérulos se expusieron por fractura de la corteza renal congelada, que elimina la cápsula de Bowman, exponiendo la capa exterior de los podocitos cuando cubren los bucles capilares de los glomérulos. Se ilustra un glomérulo normal en la figura 12A, en la que la arquitectura compleja de los podocitos es muy evidente ya que los procesos pediculares que se ramifican se enrollan alrededor de los bucles capilares. En un ratón Alport típico de 7 semanas de edad, la superficie de los podocitos en los glomérulos carece notablemente de ramas filamentosas finas que se han eliminado por hinchamiento (figura 12B). En el animal Alport tratado con FK506 o el receptor soluble para TGF-\beta1, la superficie del glomérulo parece la misma que la del ratón Alport no tratado (figura 12C). Esta figura demuestra claramente que el bloqueo de TGF-\beta1 solo no protege contra los cambios en la arquitectura de los procesos pediculares asociada con la enfermedad glomerular de Alport.

Se midió la proteinuria por electroforesis en gel de poliacrilamida de orina liofilizada recogida en momentos semanales durante el transcurso del tratamiento con fármaco. Como se ha mencionado previamente, la presencia y abundancia de albúmina en la orina proporciona una valoración comprensiva de la integridad del filtro glomerular. La figura 13 ilustra que mientras que la administración de inhibidores de TGF-\beta1 retrasa el inicio de la proteinuria, el avance a altos niveles de albúmina en la orina se produce muy rápidamente (1 semana). Estos resultados implican que cuando los inhibidores de TGF-\beta1 se usan solos, no mejora el filtro glomerular aunque retrasan el inicio de la proteinuria. Es probable que esta propiedad esté directamente relacionada con la incapacidad de estos inhibidores para prevenir el borrado de los procesos pediculares de los podocitos descritos antes e ilustrados en las figuras
11 y 12.

Hay que indicar que la administración de fármaco a los miembros normales de la misma camada dio como resultado diferencias no discernibles cuando se compararon con los ratones normales a los que no se había inyectado.

Ejemplo 7 Efectos de los inhibidores de TGF-\beta1 en el ratón doblemente silenciado (DKO)

Se inyectó a ratones (los ratones DKO son nulos para los genes tanto de colágeno \alpha3(IV) como de integrina \alpha1) inhibidores de TGF-\beta1 FK506 (2 \mug/g de peso corporal, dos veces por semana, con inyecciones intraperitoneales) o receptor soluble de TGF-\beta1 de Biogen (25 \mug por inyección, dos veces por semana, con inyecciones intravenosas) empezando a las 4 semanas de edad. Los riñones se tomaron a las 10 semanas de edad y se analizaron. Se escogió el tiempo de 10 semanas ya que en los ratones doblemente silenciados, la enfermedad en general avanza hasta el punto en el que se observa un engrosamiento irregular significativo de la GBM, y los animales empiezan a progresar hacia la etapa final de insuficiencia renal. Así pues, si los inhibidores de TGF-\beta1 proporcionaran beneficios protectores adicionales, esos beneficios serían evidentes en esta etapa de la enfermedad de la GBM. El análisis por microscopía electrónica de transmisión mostró muy claramente y de forma consistente diferencias entre los ratones a los que se había inyectado los inhibidores y los ratones doblemente silenciados que no se habían tratado. Un ejemplo típico de estas diferencias se ilustra en la figura 14. La figura 14B ilustra el perfil típico de un bucle capilar glomerular en el ratón doblemente silenciado a las 10 semanas de edad. Destacan los bolsillos significativos de engrosamiento de la membrana basal característicos del avance de la glomerulonefritis de Alport. Los procesos pediculares de los podocitos tienen un nivel alto de arquitectura regular con diafragmas de división bien desarrollados incluso en el estado avanzado de la enfermedad. Esta característica de los ratones doblemente silenciados no la comparten los ratones Alport (compárense los procesos pediculares con los mostrado en la figura 12B).

Cuando los ratones doblemente silenciados se trataron con inhibidores de TGF-\beta1, hubo una reducción notable tanto del engrosamiento focal de la GBM como de el borrado de los procesos pediculares (en la figura 14C se trató con FK506 y en la figura 14D se trató con el receptor soluble de TGF-\beta1). Aunque la GBM de la mayoría de los glomérulos no tiene la ultraestructura completamente normal (obsérvese la irregularidad moderada de la GBM en la figura 14D), carecen completamente de los bolsillos significativos del engrosamiento de la GBM evidentes en la mayoría de los bucles capilares glomerulares de los animales doblemente silenciados a los que no se ha tratado (como en la figura 14B) en esta etapa del desarrollo. En aproximadamente 25% de los glomérulos examinados de esta forma, los inhibidores de TGF-\beta1 restauraron la ultraestructura glomerular a un grado en el que los glomérulos de los DKO eran indistinguibles de los de los ratones normales (la figura 15A muestra la GBM de un ratón normal de 10 semanas de edad; la figura 15B muestra la GBM de uno doblemente silenciado de 10 semanas de edad tratado con FK506). Considerando que esto es 2 semanas más que la edad media de la etapa final de insuficiencia renal en el modelo de animal Alport no manipulado, esto es un descubrimiento verdaderamente único y notable.

Se examinó la proteinuria en los mismos ratones recogidos semanalmente durante el transcurso del tratamiento. Las muestras (equivalentes a aproximadamente ½ microlitro) se analizaron por electroforesis en geles de poliacrilamida. La albúmina se visualizó por tinción con azul coomassie. Los resultados en la figura 16 ilustran que tanto el tratamiento con FK506 (figura 16D) como con el receptor soluble para TGF-\beta1 (figura 16B) mejoran notablemente el rendimiento del filtro glomerular respeto a los ratones doblemente silenciados que no se han tratado (figura 16A). La figura 16C muestra la proteína de la orina para un ratón normal tratado con FK506. Es notable el grupo difuso de bandas evidentes en un momento temprano tanto en los ratones normales como DKO (figura 16D) tratados con FK506. Esto se observa siempre en ratones tratados con el fármaco, y probablemente está relacionado con los efectos nefrotóxicos descritos en algunos pacientes tratados con el fármaco después de transplante (Solez y col., Transplanlation. 66: 1736- 1740, 1998).

Ejemplo 8 Mecanismos para los efectos sinérgicos de los bloqueantes de integrina \alpha1 e inhibidores de TGF-\beta1 en la ralentización del inicio y avance de la glomerulonefritis de Alport

Los datos ilustrados en las figuras 11, 12 y 14 sugieren de forma colectiva que la razón de que los bloqueantes de la integrina \alpha1 sean sinérgicos con los bloqueantes de TGF-\beta1 es que la inhibición de \alpha1 produce una mejora de la arquitectura de los procesos pediculares de los podocitos, mientras que la inhibición de TGF-\beta1 produce depósitos menores de matriz en la GBM. La figura 17 se proporciona para respaldar más la función de los bloqueantes de integrina \alpha1 en la mejora de la arquitectura de los procesos pediculares. Se preparó corteza renal de la misma forma ilustrada en la figura 12. La figura 17A ilustra la superficie de un glomérulo de un ratón normal de 7 semanas de edad. La figura 17B ilustra un glomérulo de un ratón Alport de 7 semanas de edad. Obsérvese la pérdida de la arquitectura de los podocitos debido al borrado de los procesos pediculares. La figura 17C ilustra la superficie de un glomérulo de un ratón doblemente silenciado de 7 semanas de edad. Obsérvese la restauración casi completa de la arquitectura de los procesos pediculares. Estos datos están de acuerdo con la vista de la sección transversal proporcionada por microscopía electrónica de transmisión mostrada en la figura 14B, en la que los procesos pediculares tienen una morfología excelente en el ratón doblemente silenciado.

Ejemplo 9 Efecto del bloqueo de la integrina \alpha1

En el examen de un mecanismo plausible para este fenómeno se evaluaron las cadenas de laminina. Puesto que se sabe que la laminina principal que se encuentra en la membrana basal glomerular es la laminina 11 (Miner y col., J. Cell Biol., 137:65-701, 1997), se pensó que el aspecto de una laminina nueva en la GBM de Alport debería contribuir a la pérdida de unión de los podocitos a la GBM. Tras examinar la composición de laminina de la GBM de Alport, se encontró que la cadena \alpha2 de laminina que normalmente se localiza exclusivamente en la matriz mesangial en ratones normales, se encontraba en la GBM de los ratones Alport. La figura 18 ilustra una serie de paneles de glomérulos inmunoteñidos usando un protocolo de marcaje fluorescente doble.

En el análisis de fluorescencia doble, se insertó corteza renal reciente en compuesto de inserción acuoso Tissue Tek, se congeló inmediatamente y se cortó en un criostato en secciones de 4 \mum. Los portaobjetos se fijaron después en acetona al 100% fría (-20ºC) durante 10 minutos y después se secaron al aire toda la noche. El tejido se rehidrató mediante 3 lavados en PBS durante 10 minutos cada uno. Los anticuerpos primarios se diluyeron junto con leche en polvo sin grasa al 7% (BioRad). Se usó un anticuerpo antientactina (Chemicon Inc.) como marcador conocido para la membrana basal glomerular con una dilución 1:200. El anticuerpo específico para la cadena \alpha2 de laminina fue un obsequio del Dr. Peter Yurchenco (Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ). La especificidad de este anticuerpo por la cadena \alpha2 de laminina la ilustra Cheng y col., J. Biol. Chem., 272:31525-31532, 1997. El anticuerpo se usó con una concentración 1:10. Los anticuerpos primarios se dejaron reaccionar toda la noche a 4ºC en una placa humidificada. Los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 10 minutos cada vez en PBS frío, y después se hicieron reaccionar con los anticuerpos secundarios, que también se añadieron. Los anticuerpos secundarios eran uno anticonejo conjugado con rojo Texas para la laminina \alpha2 y uno antirrata conjugado con FITC para la entactina, ambos usados con una dilución 1:100 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Los reactivos secundarios se dejaron reaccionar durante 4 horas a 4ºC. Los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 10 minutos cada vez con PBS y se aplicó una gota de medio de montaje de antidecoloración Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) antes del sellado con las cubiertas de vidrio. Las imágenes para cada anticuerpo se cubrieron digitalmente usando un microscopio de epifluorescencia BH-2 en interfase con un sistema de análisis de imágenes Cytovision Ultra (Applied Imaging, Inc.).

Para el antígeno específico para la membrana basal glomerular (entactina) la tinción es verde, mientras que para la cadena \alpha2 de laminina es roja. En los sitios en los que se encuentran juntas la entactina y laminina \alpha2 la tinción es amarilla. En la figura 18 el panel A del grupo I representa la inmunotinción de un glomérulo de un ratón normal de 7 semanas de edad. Aquí la laminina \alpha2 se localiza exclusivamente en la matriz mesangial. El panel B ilustra la tinción en un ratón Alport de la misma camada de 7 semanas de edad. Están indicados con flechas los bucles capilares teñidos de amarillo de forma predominante, que ilustra que en el ratón Alport, la laminina \alpha2 se localiza tanto en la matriz mesangial como en la membrana basal glomerular. El panel C muestra la inmunotinción en los glomérulos de un ratón Alport Sv/J tratado con FK506 (la corteza se sacó de los animales usados en los experimentos descritos antes y representados en las figuras 11, 12 y 13). Aquí, otra vez, la mayoría de los bucles capilares glomerulares son amarillos, lo que indica que la inhibición de la actividad de TGF-\beta1 no previene la acumulación de laminina \alpha2 en la GBM de los ratones Alport. Sin embargo, en un ratón doblemente silenciado de 7 semanas de edad, no hay inmunotinción de laminina \alpha2 en los bucles capilares de los glomérulos (Panel D, flechas). El receptor de integrina predominante en la superficie de los podocitos es la integrina \alpha3\beta1 (Patey y col., Cell Adhesion and Communication, 2:159-167, 1994). Se cree ampliamente que esta integrina tiene una función fundamental en la unión de podocitos a la GBM y mantenimiento de la arquitectura normal del proceso pedicular (Smoyer and Mundel, J. Mol. Med., 76:172-183, 1998). Como ejemplo, recientemente se ha mostrado que el silenciamiento del gen de la integrina \alpha3 daba como resultado la eliminación completa de la arquitectura del proceso pedicular de los podocitos (Kreidberg y col., Development, 122:3537-3547, 1996). Más recientemente, se ha producido un receptor de integrina \alpha3\beta1 soluble y se mostró que se unía con afinidad alta a las lamininas que contenían cadena \alpha5 de laminina (como la laminina 11 que es un heterotrímero compuesto de una cadena \alpha5, \beta2 y \gamma1), pero no a las lamininas que contenían la cadena \alpha2 (Eble y col., Biochemistry, 37:10945-10955,1998). Los datos presentados en este documento considerados junto con esta información, apoyan un modelo en el que en el ratón Alport, la deposición progresiva de lamininas que contienen laminina \alpha2 en la GBM produce el borrado de los procesos pediculares. El bloqueo de la cadena de integrina \alpha1 da como resultado la menor deposición o ausencia de deposición de la cadena \alpha2 de laminina en la GBM, que previene la pérdida de la arquitectura normal de los procesos pediculares.

Para respaldar más este punto, se evaluó la distribución de cadena \alpha2 de laminina en el ratón Alport Sv/J de 2 semanas de edad comparado con un miembro de la camada normal. En esta etapa temprana en el avance de la enfermedad de la GBM, había importantes "bolsillos" de engrosamiento de la GBM escasamente distribuidos en aproximadamente la mitad de los glomérulos. Uno de dichos bolsillos de engrosamiento de la GBM se muestra en la Figura 19B. La GBM y los procesos pediculares de los podocitos son morfológicamente normales en las regiones de los glomérulos no afectadas en esta etapa del desarrollo, sin embargo, en las regiones de engrosamiento focal los procesos pediculares están hinchados y borrados, como los cambios generalizados reconocidos más tarde en el desarrollo de la enfermedad de la GBM. Se supuso que si la deposición de la laminina \alpha2 produce falta de contacto de adhesión focal con los podocitos, deberían verse los depósitos focales de laminina \alpha2 en la GBM de ratones Alport de 2 semanas de edad. Este es el caso que se ilustra en el Grupo II de la figura 18. Las flechas en el panel B indican deposición focal de laminina \alpha2 en la GBM de ratones Alport de 2 semanas de edad. Este es el cambio molecular más temprano (distinto del cambio de la composición del colágeno de tipo IV, que resulta de la mutación genética congénita) que se ha detectado en el modelo de ratón Alport, y se corresponde exactamente con el inicio del daño de la GBM detectable.

Ejemplo 10 Efecto sinérgico de los inhibidores de TGF-\beta1 con los bloqueantes de integrina \alpha1

Como se ilustra en la figura 3, la matriz que se acumula en la GBM y el intersticio en función de la patogénesis de la enfermedad renal de Alport incluye cadenas \alpha1(IV) y \alpha2(IV) de colágeno, fibronectina y entactina. Como se ilustra en la figura 20 (las dos primeras calles de cada gel), los ARN mensajeros que codifican cada una de esas proteínas son inducidos en el riñón Alport respecto a los controles normales. La inyección de los inhibidores de TGF-\beta1 reduce el grado de inducción sustancialmente (figura 20, las dos últimas calles del gel). Esto puede explicar la reducción del engrosamiento de la membrana basal observada en los ratones Alport Sv/J tratados con inhibidores de TGF-\beta1 (ilustrado en la figura 11).

Se llevó a cabo esto conjunto similar de transferencias Northern usando ARN de riñones de ratones doblemente silenciados que no se habían tratado, o se les habían inyectado inhibidores de TGF-\beta1. Estos eran los mismos ratones usados para obtener los datos presentados en la figura 14, y por lo tanto el protocolo de inyección de fármaco se describe en el Ejemplo 7. A partir de estos datos presentados en la figura 21 es evidente que la administración de inhibidores de TGF-\beta1 no cambia significativamente los niveles de los ARNm que codifican las proteínas de la matriz cuando se compara el control al que no se ha inyectado frente a los ratones doblemente silenciados. Sin embargo, hay un notable efecto en la expresión del ARNm que codifica el inhibidor de metaloproteinasa Timp-3 (figura 21, fila inferior). Como es evidente en las calles 1 y 2, hay una notable reducción de la expresión de Timp-3 en el riñón de un ratón doblemente silenciado no tratado de 10 semanas de edad respecto a los ratones control (una diferencia de 9 veces en el análisis con Phospohorimage). Esta reducción de la expresión de Timp-3 no se observa en los ratones doblemente silenciados a los que se inyectó FK506 (calles 3 y 4) o el receptor soluble de TGF-\beta1 (calles 5 y 6). Se observó este mismo efecto en la expresión de Timp-3 en ratones Sv/J (figura 20, fila inferior) que ilustra que la capacidad para inhibir la supresión del ARNm de Timp-3 en ratones Alport es un resultado de los inhibidores de la inhibición de TGF-\beta1 más que un resultado de la doble inhibición de la integrina \alpha1 y TGF-\beta1.

La importancia funcional de esta observación se basa en el hecho de que Timp-3 es un modulador de las metaloproteinasas de la matriz, y se ha sugerido que es un jugador importante en la homeostasis de la membrana basal renal y pérdida de homeostasis en la enfermedad (Esposito y col., Kidney Int., 50:506-514, 1996; y Elliot y col., J. Am. Soc. Nephrol., 10:62-68, 1999). Una reducción de la expresión del inhibidor de metaloproteinasa Timp-3 producirá un aumento correspondiente de la actividad de la metaloproteinasa. Dicho aumento puede producir daño en la membrana basal, dando como resultado la activación de TGF-\beta1 con la acumulación concomitante de la matriz. El romper este ciclo produciría la restauración de la homeostasis de la membrana basal, que se pondría de manifiesto por la restauración de la morfología de la GBM, que es lo que se observaba (figuras 11, 14 y 15).

Ejemplo 11 Inhibición de la fibrosis intersticial en los ratones doblemente silenciados tratados con inhibidores de TGF-\beta1

La función de TGF-\beta1 en favorecer la expresión de las proteínas de la matriz en la fibrosis renal está bien establecida (Yand y col., J. Am. Soc. Nephrol., 5:1610-1617, 1994; Border y Ruoslahti., J. Clin. Invest., 90:1-7, 1992). En el ratón doblemente silenciado, la fibrosis intersticial renal se retrasa, pero está ampliamente extendida aproximadamente a las 10 semanas de edad y avanza a la etapa final de insuficiencia renal aproximadamente a las 15 semanas de edad. Los animales a los que se inyectó inhibidores de TGF-\beta1 se analizaron usando tres marcadores para la fibrosis intersticial, y se compararon directamente con animales doblemente silenciados de 10 semanas de edad que no se habían tratado con inhibidores. La inyección de los animales se hizo usando el mismo protocolo que el usado para generar la figura 14 en el Ejemplo 7. Para las figuras 22, 23 y 24, el panel A es un control, el panel B es uno doblemente silenciado que no se ha tratado, el panel C es uno doblemente silenciado tratado con FK506, y el panel D es uno doblemente silenciado tratado con un receptor soluble de TGF-\beta1. Todas estas figuras representan vistas en el aumento bajo de 50X de la corteza renal. La figura 22 es una tinción con metenamina-plata de Jones, que es un patrón de tinción histoquímica para la matriz. Es evidente que la matriz se acumula en el intersticio de la corteza renal en el ratón que no se ha tratado (compárese el panel B con el panel A). Sin embargo, las cortezas renales de animales tratados con el inhibidor de TGF-\beta1, eran indistinguibles de los controles, lo que indicaba poca o nada de fibrosis. Los marcadores moleculares usados habitualmente para la fibrosis intersticial renal incluyen el colágeno de tipo I y la fibronectina (Yamamoto y col., Kidney Int., 45:916-927, 1994). La figura 23 ilustra la inmunotinción para el colágeno de tipo I. Claramente, el colágeno de tipo I se acumula en el intersticio de la corteza renal de los animales que no se han tratado (compárese el panel B con el control en el panel A). Los paneles B y C de la figura 23 ilustran una ausencia relativa de acumulación de colágeno de tipo I en riñones de ratones doblemente silenciados tratados con FK506 o el receptor soluble, respectivamente. El mismo escenario es cierto para la fibronectina, que es abundante en la corteza de los doblemente silenciados que no se han tratado (figura 24B) y como los controles en la corteza renal de ratones a los que se han inyectado los inhibidores de TGF-\beta1 (figura 24, paneles C y D). En conjunto, estos datos indican que los inhibidores de TGF-\beta1 combinados con bloqueantes de integrina alfa 1 son eficaces para prevenir (o retrasar) la fibrosis intersticial en el modelo de ratón Alport.

Claims

1. Uso de un inhibidor del receptor de integrina \alpha1\beta1 para la preparación de una composición farmacéutica para limitar un trastorno renal.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el trastorno renal comprende glomerulonefritis renal, fibrosis renal o ambas.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que la glomerulonefritis renal o fibrosis renal está asociada con el síndrome de Alport, nefritis por DMDI, glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis crescéntica, nefropatía diabética o fibrosis renal intersticial.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de receptor de integrina \alpha1\beta1 es un agente bloqueante que se une al sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal.

5. Uso de un agente que bloquea un sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal, para preparar una composición farmacéutica para retrasar el inicio y/o ralentizar el avance del síndrome de Alport o la enfermedad renal en la diabetes mellitus dependiente de insulina.

6. El uso de la reivindicación 4 ó 5, en el que el agente bloqueante del receptor de integrina \alpha1\beta1 comprende un péptido, un anticuerpo neutralizante o un fragmento proteolítico.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que el péptido es al menos un fragmento nonámero de una proteína seleccionada del grupo que consiste en laminina, fibronectina, entactina y colágeno de tipo 4.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la composición farmacéutica comprende un inhibidor de TGF-\beta1.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que el inhibidor de receptor de integrina \alpha1\beta1 y el inhibidor de TGF-\beta1 se administran simultánea o secuencialmente.

10. El uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que el inhibidor de TGF-\beta1 se une de forma irreversible a TGF-\beta1 e inhibe su capacidad para unirse con su receptor.

11. El uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que el inhibidor de TGF-\beta1 es un agente que inhibe la capacidad de TGF-\beta1 para transducir señales al núcleo de una célula renal.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que el inhibidor de TGF-\beta1 es inhibidor de calcineurina.

13. Uso de un agente que inhibe la transducción de señales por un receptor de integrina \alpha1\beta1 de una célula renal, para preparar una composición farmacéutica para retrasar el inicio y/o ralentizar el avance del síndrome de Alport o la enfermedad renal en la diabetes mellitus dependiente de insulina.

14. Uso de un antagonista irreversible o inhibidor de transducción que reduce la actividad de TGF-\beta1 para preparar una composición farmacéutica para limitar la fibrosis renal, en el que dicha composición se va a administrar a un paciente mientras se inhiben los receptores de integrina \alpha1\beta1 de las células renales del paciente.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que dicho agente se une de forma irreversible a TGF-\beta1 e inhibe su capacidad para unirse con su receptor, o inhibe la capacidad de TGF-\beta1 para transducir señales al núcleo de una célula renal.

16. Uso de un inhibidor de calcineurina para preparar una composición farmacéutica para limitar la fibrosis renal.

17. El uso de la reivindicación 12 ó 16, en el que el inhibidor de calcineurina es tacrolimus.

18. Uso de un agente que reduce la actividad de TGF-\beta1, para preparar una composición farmacéutica para limitar la acumulación de matriz en la membrana basal glomerular (GBM) de un paciente con síndrome de Alport.

19. Un ratón que no expresa una composición normal de colágeno de tipo 4 en la membrana basal glomerular y no expresa el receptor de integrina \alpha1\beta1.

20. El ratón de la reivindicación 19, en el que el ratón no incorpora las cadenas \alpha3(IV), \alpha4(IV) y \alpha5(IV) de colágeno en su membrana basal glomerular.

21. Un procedimiento para cribar un agente para su uso en limitar un trastorno renal, por el cual el agente se va a administrar al ratón de la reivindicación 19 ó 20.

22. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de receptor de integrina \alpha1\beta1 y un inhibidor de TGF-\beta1.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en la que el inhibidor del receptor de integrina \alpha1\beta1 es un agente bloqueante que se une al sitio de unión del receptor de integrina \alpha1\beta1 en la superficie de una célula renal.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en el que el agente bloqueante del receptor de integrina \alpha1\beta1 comprende un péptido, un anticuerpo neutralizante o un fragmento proteolítico.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, en la que el péptido es al menos un fragmento nonámero de una proteína seleccionada del grupo que consiste en laminina, fibronectina y actina, y colágeno de tipo 4.

26. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en la que el inhibidor de TGF-\beta1 se une de forma irreversible a TGF-\beta1 e inhibe su capacidad para unirse a su receptor.

27. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en la que el inhibidor de TGF-\beta1 es un agente que inhibe la capacidad de TGF-\beta1 para transducir señales al núcleo de una célula renal.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en la que el inhibidor de TGF-\beta1 es inhibidor de calcineurina.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, en la que el inhibidor de calcineurina es tacrolimus.