PT1079843E

PT1079843E - Utilização dos inibidores do receptor de integrina 1 1 e dos inibidores de fct- 1 no tratamento de doenças do rim

Info

Publication number: PT1079843E
Application number: PT99923224T
Authority: PT
Inventors: Dominic Cosgrove
Original assignee: Boys Town Nat Res Hospital
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2007-06-26
Also published as: TR200003432T2; HUP0202048A2; SG117434A1; BR9911067A; EE04581B1; WO1999061040A9; EE200000685A; PL345946A1; EP1079843A2; CA2329757A1; ES2285841T3; CN1310625A; NO20005883L; ATE359804T1; NO20005883D0; EP1079843B1; DE69935853T2; CA2329757C; DE69935853D1; SI1079843T1

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DOS INIBIDORES DO RECEPTOR DE INTEGRINA αΐβΐ E DOS INIBIDORES DE FCT-βΙ NO TRATAMENTO DE

DOENÇAS DO RIM A presente invenção tem por objecto o campo das doenças do rim (isto é, distúrbios do rira) caracterizadas por glomerulcnefrite e/ou fibrose. Em particular, a presente invenção tem por objecto a utilização de inibidores do receptor de integrina αΐβΐ para a preparação de uma composição farmacêutica para limitar os distúrbios dos rins. Além disso, a presente invenção tem por objecto a utilização de inibidores de integrina αΐβΐ em combinação com inibidores do FCT-βΙ (factor de crescimento do tumor) para a preparação de uma composição farmacêutica para limitar os distúrbios dos rins.

Nos Estados Unidos, aproximadamente 12.000 pessoas vivem hoje em dia com o síndroma de Alport. Este distúrbio hereditário resulta numa doença renal progressiva que se pode tratar apenas por diálise e transplante do rim. Os rins transplantados são normalmente rejeitados. Assim, sãc necessários tratamentos alternativos. Contudo, não há hoje em dia tratamentos que se destinem ao tratamento do mecanismo de início da doença ou da sua progressão. Assim, do que se necessita é de um processo de tratamento que ataque o mecanismo de inicio da doença e/ou da sua progressão, um tratamento que possa retardar significativamente as condições da doença, oal como glomerulcnefrite renal e fibrose renal. 1

Um certo número de doenças do rim está associado com alterações na homeostase da matriz, em que o delicado equilíbrio entre a síntese e a transformação das moléculas estruturais está interrompido. Como exemplo, o síndroma de Alpcrt é uma doença que resulta numa insuficiência renal progressiva que está associada com a perda sensorio-neural da audição. Os portadores homens são os ma is afectados e estudos ultra-estruturais revelaram anomalias na membrana basal glomerular (MBG) dos indivíduos afectados. Cerca de uma em cada 2C. 000 pessoas tem síndroma de Alport, tornando a doença uma das doenças genéticas conhecidas ma is prevalentes. Ver , por exemplo, Atkin et al., "Alport Syndrome" em R. W. Schrier & C. . W. Gottschalk (Eds.), Diseases of the Kidney, 4a ed., Gap. 19, Little Brown,

Boston, pp. 617-641, 1988. 0 síndroma de Alport ligado a X é causado por uma qualquer de uma série de mutações no gene 4A5 do colagénio (Barker et al., Science, 348: 1224-1227, 1990). Identificaram-se pelo menos 60 mutações diferentes no gene. A forma auto-somal do síndroma de Alport exibe a mesma gama de fenotipos que a forma ligada a X e resulta de mutações em cada um dos genès 4A3 do colagénio da membrana basal (COL4A3) ou 4A4 (COL4A4). Ver, por exemplo, Lemmink et al, Hum. Mol. Gen., 3: 1269-1273, 1994, e Mochizuki et al., Nature Genet., 8: 77-81, 1994. Outras doenças da membrana basal incluem o síndroma de Goodpasture, que é devido a uma resposta auto-imune aguda dirigida contra um epítopo no domínio NC1 da cadeia 4A3 do colagénio (Hudscn et al., Kidney Int., 43: 135-139, 1993) e difunde leiomiomatose, um tumor benigno do músculo liso que está associado com a eliminação tanto de 4A5 como de 4A6 do colagénio (Zhou et al., Science, 261: 1167-1169, 1993).

As membranas basaií especializadas associadas sãc estruturas extra-celulares com praticamente todos os órgãos 2 e os aecidos dc corpo. En contram-se normaimente na frontei ra entre as células e o tecido conjuntivo, mas rambérri se podem encontrar entre as células epiteliais e as endoteiiais, como no caso nos gloméruios do rim (isto e, um conjunto de capilares). Os blocos predominantes aa construção das membranas basais incluem cciagenio do tipo IV, laminina, proteoglicano de sulfato de iiepanna, entactina e, algumas vezes, fibronectina e colagénio do tipo V. A componente que está mais altamente representada em todas as membranas basais é o colagénio do tipo IV, um tipo de colagénio diferente que se encontra apenas na membrana basal. Na sua forma natural, o tipo IV, tal como todos os colagénios, é composto por três moléculas de colagénio unidas numa hélice tripla que consiste em combinações distintas de seis cadeias alfa (4A1-4A6). As cadeias 4A1 e 4A2 (também aqui referidas como as cadeias oíI(IV) e a2(IV)) são as mais comuns (Timpl, J. Biochem., 180: 487-502, 1989). Os colagénios do tipo IV diferem dos colagénios intersticiais num certo número de maneiras. A estrutura helicoidal da associação das cadeias alfa não adere estrictamente ao elemento glicina-X-Y, como se observa nos outros colagénio; contém 3-hidroxiproiina em vez de 4-hidrcxiproiína e é rica em hidratos de carbono. A super-estrutura do colagénio resultante é como uma rede de galinheiro do colagénio da membrana basal. Esta rede é a fundação sobre a qual se ligam as moléculas acessórias (laminina, sulfato de heparina, etc.). estruturas muit heterogéneas, suas diversas propriedades tas e struturas é ainda muito sovas cadeias de colagénio da 3 4 ' / 4 r te o) só recentemente exemp lo, Gunwar et al., J.

As membranas basais que são responsáveis pelas funcionais. A complexidade de mal compreendida. Algumas das membrana basal (cadeias alfa ioram oescooertas. ver, oor 3

Biol. Chem., 266: 15318-15324, 1990; Hostikka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 1606-1610, 1990; Butkowski et al., J. Biol. Chem., 262: 7874-7877, 1987; e Zhou et al., Science, 261: 1167-1169, 1993. É interessante notar que se verificou que as novas cadeias só se encontram em certos tecidos (por exemplo, os glomérulos dos rins, a membrana de Decimet dos olhos, as lentes, a pele, o pulmão, os testículos e o caracol ósseo). Ver, por exemplo, Kleppel et al., Am. J. Pathol, 134: 813-825, 1989 e Tryggvason et al., Kidney Int., 43: 38-44, 1993. 0 papel destas novas cadeias na junção da membrane basal e a sua função são hoje desconhecidos. Crê-se que estes novos colagénios da membrana basal formam redes separadas, distintas das redes do colagénio do tipo 4A1 (al(IV) e 4A2 (a2(IV)).

As membranas basais glomerulares (MBGs) do rim ficam inteiras com o processo de ultrafiltração (isto é, em que o sangue é filtrado para eliminar os metabolitos para excreção sob a forma de urina, por exemplo). O síndroma de Alport resulta numa acumulação massiva de matriz extracelular e uma membrana basal comprometida, resultando numa glomerulonefrite focal e segmentada (isto é, inflamação das ansas capilares nos glomérulos dos rins), que, em última análise, resulta em urémia fatal (isto é, excesso de ureia no sangue como resultado da insuficiência renal). Muitas das mesmas moléculas da matriz extracelular ipor exemplo, colagénio do tipo I, fibronectina, laminina e colagénio do tipo IV) também se acumulam progressivamente nas MBG de pacientes com nefrite da DMDI (diabetes mellitus dependente de insulina). Nesta doença, contudo, A MBG fica raais espessa, mas perde a finura focal e o seccionamento (segmentação) da MBG que é característica do síndroma de Alport. 4

As integrinas são uma família de receptores de glicoproteína da transmembrana hetercdimérica da lâmina basal e da matriz extraceluiar. Funcionam como moléculas de adesão envolvidas na agregação das células e no ancorarrtento das células à Lâmina basal. Também fazem a transdução do sinal para o núcleo e estão envolvidas na modulação da expressão dos genes, particularmente a expressão dos genes para a migração das células e a diferenciação das células (Hynes, Cell, 69: 11-25, 1992). São conhecidos maís de 20 receptores de íntegrina diferentes, que incluem cerca de 14 sub-unídades alfa diferentes e cerca de 8 sub-unidades beta diferentes (DiSimone, Curr. Opin. Cell Biol., 6: 182-194, 1994)

Nos glomérulos renais (do rim), há conjuntos distintos de receptores de íntegrina. Estes estão associados quer à matriz mensageira (isto é, uma membrana que ajuda a suportar os anéis capilares num glomérulo de rím), quer a células epitelíais de vísceras (Patey et al., Cell Adhesion Commun, 2: 159-167, 1994). O receptor de íntegrina mais prevalente nas células epitelíais de vísceras glomerular de adultos é o heterodímero α3β1 (Adler, Am. J. Pathol., 141: 571-578, 1992; e Patey et al., Cell Adhesion Commun, 2: 159-167, 1994). Tem-se verificado que a sub-unidade β5 é expressa nas células epitelíais de vísceras de adultos (Yamada er al., Cell Adhesion Commun, 3: 311-325, 1995) e os receptores de íntegrina al, a3, a5, aV, βΐ e β3 são expressos, de uma forma progressiva durante a morfogénese do rím (Kor honen et al., £j dd j£ Invest. , 62 : 6 16-625, 1990; Wac a et d-L . J. Cell Biol f 1 32: 1161-11 7 6 i 996; e Yamada et a .i., Co 7 : Adhesion Comm un, 3 . 111 - -¾ 2 S 1 G Q5 ) . 0 re CSpcO £ da inte. grin a heterodimérí ca αΐβΐ é o ún ico rorpmf cr r\cn. Av xy U Ky ú— 'wt Xy int Pdf i n xií ientifícadc na superfície de cé l.ul as mens agi ai s nos gloméru) .OS Γ6IlciXS , 5

Tem-se produzido um gene mutado de rato na sub-unidade do receptor de integrina a3. A cria morre de disfunção do :z: rim pouco depois do nascimento (Kreídberg et al,, Dev. 3537-3547, 1996). A patologia ultr-estrutural da MBG nos recém-nascidos deste modelo é rnarcadamente semelhante à observada no síndroma de Alport avançado. A membrana basal aparece rarefeita (isto é, com um espessamento irregular, maís fina e fraccionada) e os processos das pedicelas das células epiteliais de vísceras parecem fundidos. Dado que um dos ligandos para o receptor de α3β1 é colagénio dc tipo IV (Krishnamurti et al., Lab. Invest., 74: 650-665, 1996; e Rupprecht et al., Kídney Int., 49: 1575-1582, 1996) e dado que o receptor se localiza ao longo do plano de contacto entre as células epiteliais de vísceras e a MBG (Baraidi et al., Nephron, 66: 295-301, 1994) as observações registadas antes para a mutação de integrina a3, suporta um modelo em que essas interacções de íntegrína/ligando desempenham um papel importante no desenvolvimento da membrana basal.

Num animal normal, o colagénio do tipo IV na membrana basal glomerular (MBG), até ao momento do nascimento, é completamente composto pelas cadeias al(IV) e a2(IV) (referidas como as cadeias clássicas de colagénio). Pouco depois do nascimento, ocorre o desenvolvimento de uma ligação em que as cadeias α3(IV), a4(IV) e a5 (IV) (referidas como as novas c adeias de colagénio) são claramente detectáveis na MBG e : as cadeias al(IV) e a2(IV) se localizam predominantemente ma matriz mesângica (Minor e Sanes, J. Ce 11, Biol., 172: 879-891, 1994 ).

No rim de adulto 1 UIÍLâ CSIftéãCis XXÍid de MBG, constituída por ol(IV) e α2(IV) esta cdlSCente 8 camada das células endo telíaís, enquanto a maior parte de toda a espessura da MBG é constituída pelas cadeias α3(IV), «4(iV) e αο(IV) 6 U . (Desjardins & Bendayan, J. Cell. Biol., 113: 689 /0u, 1591; e Kashtan et al., J. Clín. Invest., 78: 1035-1044, 1356). Há uma evidência bioquímica que sugere que os dois conjuntos de cadeias de colagénio formam redes separadas {Kleppel et al., J. Biol. Cheia., 267: 4137-4142, 1992). Na nefrite familiar, as mutações nuli (isco é, mutações que destroem a expressão dos genes) quer nos genes das cadeias α3(IV), cr 4(TV) ou α5(IV) resultam na ausência das três cadeias na MEG, presumivelmente devido às associações obrigatórias na junção macroirtolecular da supra—estrutura de MBG. Isto resulta na presença das caseias al(IV) e oí2(IV) ao longo de toda a espessura da MBG. Assim, os receptores de colagénio do tipo IV na superfície das células epiteliais viscerais no rim de Alport (isto é, o rim de um indivíduo com síndroma de Alport) estão em contacto directo com a MBG da composição da cadeia de colagénio de tipo IV incaracterística. Pelo menos um estudo mostrou a capacidade relativa das células epiteliais viscerais para aderirem ao colagénio de tipo IV com estas diferentes composições e verificou-se que aderem significativamente melhcr à membrana basal constituída pelas cadeias novas quando comparadas directamente com as cadeias clássicas ai(IV) e a2(IV). Esta adesão pode ser bloqueada com anticorpos contra o receptor de integrina a3.

Criou-se um modelo de rato para a forma autosómica. do síndroma de Alport por meio de mutagénese dirigida do gene de pró-colagénío COL4A3 (Cosgrove et al., Genes Dev., 10: 2981-2992, 1996). 0 modelo animal desenvolve uma glomerulonefrite progressiva com o início de proteinúria próximo das quatro semanas de idade e uma idade média de morte por i nsuficiêncía renal a cerca de 8,5 semanas num quadro da ninhada de 129Sv/J. As alterações ultra- estruturais na MBG obser vam-se logo na primeira semana de 7 idade e ao longo da MBG da maior parte do glcrnérulo pelas 3 semanas de idade, muito antes do aparecimento da proteinúria. As componentes extracelulares da matriz, inclui.ndo laminina-1, proteogiicano de sulfato de heparina, fibrcnectina e entactina, acumulam-se na MBG. Este rato é referido aqui como o rato de "Alport". A acumulação da matriz extracelular na MBG e o mesângic como uma função da progressão da doença renal é uma característica partilhada por uma variedade de doenças glomerulares, tanto em pacientes como em sistemas experimentais em animais. Ver, por exemplo, Goyal & Wiggíns, Am. Soo. Nephrol., 1: 1334-1342, 1991; Wilson et al., Contrib. Nepkrol. Nasel, Krager, 118: 126-134, 1996); Razzaque et al., Clin. Nephrol., 46: 213-214, 1996; Yoshioka et al., Kidney In t., 35 : 1203-1211, 1989 ; e Klahr et al., N. Engl. J. Med. , 318: 1657-1666, 1988. Na diabetes, pensa-se que o mediador primário deste efeito é a exposição prolongada a proteínas do soro glicosíladas nao enzimaticamente a partir de níveis elevados de glicose crónicos (Doí et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 89: 2873-2877, 1992 e Roy et al., J. Clin. Invest., 93 : 483-442, 1994).

Para a maioria dos distúrbios glomerulares progressivos, a sobre-produção do factor de crescimento de transformação FCT-βΙ parece estar fortemente associada à ac um J. _L ação matriz e xt Γ acelulsr o que 1 0 V â a •f X ν' p* 1__.v r v se U st - Pi t °· fo rmaçã o de tec ido fibre so) . Ve -3 t por exempl o, Bc TGf & R U 0 s lahtí f iVa -- ure (Lcndres ), 346: 3 71-37 4, 199 Y r Ya nq e l 81 ♦ / J, Al n. So c. Nephrol. , ς ; 1 5' ( d _ 1 J 617, 1 0i 0. . -L. w f e Ya riiai iO Lo et al . , 11; dney J n t ., 4 5: 91 S-927. 1 99 4 . Nu m mo de -0 de a nl ma I pai? d 8 nef ri t 0 auteimune , a mg ec Ç80 ''UQr fr om an — J_ d 0 Γ D 0 S de FCT-β 1 ou com clicfonuc. _eótidos anti-p araiel 0 s 8 com c ARNm correspondente, inibiu a gloirierulonef rite progressiva e a acumulação de matriz extraceiular (Boeder et al., Kature (Londres), 346: 371-374, 1990; e Akagi et al., Kidney Int., 50: 148-155, 1996).

Tem-se estimado que o semi-período de vida do colagénío da membrana basal na MBG de rato está entre 16 e 4 0 dias com base nos estudos dos casos de estimulação com 3H-prolíne (Daha et al., Nephron. 22: 522-528, 1978). É muito lento em relação à rotatividade dos proteoçlícanos de sulfato de heparina (t1/2 20 horas) ou outras macromoléculas sulfatadas na MBG (ti/?. ~ 20-60 horas) . A acumulação das proteínas da membrana basal na MBG do modelo de Alport de rato (Cosgrcve et al., Genes Dev., 10: 2981-2992, 1996) é provavelmente o efeito líquido das alterações tanto na síntese como na degradação destas proteínas. Das proteases envolvidas na rotatividade tanto da MBG como na matriz mensageira, as mais caracterizadas são as meteloproteinases MMP-2 (colagenase de 72 kD) e MMP-9 (colagenase de 92 kD) , assim como a MMP-3 (estromolisina-1). Estas enzimas vão degradar o colagénio do tipo IV, para além de uina variedade de outras componentes da matriz extraceiular.

As células mesangiaís (e provavelmente outros tipos de células glomerulares) também produzem iriibidores naturais das metaloproteinases. Estes são designados por ITMPs (inibidores de tecido de metalo-proteir.ases, TIMP' s na terminologia inglesa). São glicoproteínas de peso molecular relativaraente baixo. Destes, o IIMP-1 é específico para a estromolisina-1 e a MMP-9, enquanto que ITMP-2 e IIMP-3 i.. a inibi r a MI 4P-2 (Goldber g et al., Proc. Natl. Ac sd Sei. USA, 86: 8; 207-8 211, 198 9; Staskus et a( L . , u, Bi o 1—> Chem. , 266 : 4 49- 454, 1991; e Stetier-Steverso; Cl et al., J Biol, Chem. ., 264: 17 3 74-17378, 1989). 9 A modulação das m etaloproteinases e o; s seus cor r 0 spondentes inibido res provavelmente de 3 empe :nha um papei nã manutenção dos r i veis apropriados de rot ação da M3G • Embora se saiba pouco no que respeita a r egui .ação oe gen es que codificam es mas proteínas nos glornén ales, a tra ns dução do sinal por ~t q α Gd .^nterdCCdO do rece D t O X de ínr eg rína/ MEC (matriz PXt raeelular) pode ser um aspecto cha ve neste processo.

Permanece uma necessidade de modelos de animal para o síndroma de Alport, particularmente um em que a progressão da doença está signif icativarr.ente retardada. Permanece também a necessidade de novas terapias para tratar doenças do rim associadas com a expansão da matriz mesângica e a acumulação progressiva da matriz na membrana basal glomerular e o interstício tubular, incluindo o síndroma de Alport e a diabetes mellitus dependente de insulina, per exemplo. A parente de invenção WO 97/11718 descreve inibideres de activação de um receptcr de íntegrína para a promoção da cura de feridas ou distúrbios fibróticos com poucas escaras. A presente invenção tem por objecto vários meios de tratamento para o tratamento ou a limitação (isto é, o ret dxcidmor tc do in ÍC1C 0 d Cl 1C -L p* nda mento aa progres sã 0 e/ou a revers 3-0 de um distúrbi o do rim num oa ci ente IPX | Τ' t · ( _L Ò. 1 f*’’: j um m P T uid is pre ferenci al me nte, um ser h uma no . /O dist árb io do 27 -j tq i nc J- U 7.. f pre ferenci al rr ente, glome rulonefr X L Θ re ‘fia f L· ibrese X Θ na — Ou. umfc as. Es ta s con j 1Ç G 0 Q podem se r as soei a d a s c om f por exe mpio, 1 ndroir α de Aipo rt, Π 6 frO J_ -i__L l p pj o c MDI, G — u merulon ef ite p roli fe rativa i nesâr.G ÍCc p g lomerul on s f rioe 10 proliferativa da membrana, glomeruloneirite creseêntica, nefropatia diabética e fibrose renal intersticial.

Num enquadramento, o processo envolve a utilização de um inibídor do receptor de integrina αΐβΐ para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio do rim. Este inibidor do receptor de integrina αΐβΐ pode ser um agente de bloqueio que se liga a um sítio de ligação do receptor de integrina αΐβΐ na superfície de uma célula do rím. 0 agente de bloqueio pode ser um fragmento de péptido 9-mer de uma proteína seleccionada no grupo que consiste em laminina, fibronectina, entactina e colagénío do tipo 4. Alternativamente, o agente de bloqueio pode ser um anticorpo. Podem utilizar-se outros agentes que inibem (isto é, inactivam) o receptor de integrina αΐβΐ por outros mecanismos.

Num outro enquadramento, o processo envolve a utilização de um inibidor do FCT-1 para além do inibidor do receptor de integrina αΐβΐ para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios dc rim. Estes inibidores podem ser administrados simultaneamente (por exemplo, como numa mistura) ou sequencialmente. 0 inibidor de FCT-βΙ pode ser um agente que se liga irreversivelmente a FCT-βΙ e inibe a sua capacidade de se ligar ao seu receptor. Alternativamente, o inibidor de FCT-βΙ pode ser um agente que inibe a capacidade de FCT-βΙ para transduzir sinais para os núcleos de uma célula de rim. Es te último tipo de inibidor é preferencia 1mente um inibií ior de calcineur ina, tal como tacrolimus (comerc x 8. -.ríient θ disponível como FK506). Podem utilizar-se outros agentes que inibem (isto é, inactivam) FCT-βΙ por outros mecanismos. 11

Preferencialmente, a presente invenção tem por obiecto meios para atrasar o inicio ao síndroma de Arport e/ou retardar a sua progressão num paciente. Num enquadramento, estes meios envolvem a utíeizaçso de um agente que mxfce a transdução do sinal através de um receptor de incegrina αΐβΐ de uma célula de rim. Num outro enquadramento, es.es meios envolvem o bloaueio do sítio de ligação do receptor de integrina αΐβΐ na superiície de uma cérula do rim do paciente. Estes meies podem ainda ser potenciados pela utilização de um inibidor de FCT-βΙ.

Preferencialmente, a presente invenção tem também por objecto meios para atrasar o início de doenças do rim e/ou retardar a sua progressão num paciente com diabetes meilitus dependente de insulina. Num outre enquadramento, estes meios envolvem a utilização de um agente que inibe a transdução do sinal através de um receptor de integrina οίΐβΐ de uma célula de rim. Num outro enquadramento, estes meios envolvem o bloqueio do sitio de ligação do receptor de integrina αΐβΐ na superfície de uma célula do rim do paciente. Estes meios podem ainda ser potenciados pela utilização de um inibidor de FCT-βΙ.

Além disso, providenciam-se meios para limitar a fibrose renal num paciente. Num enquadramento, os meios envolvem a redução da actívidade de FCT-βΙ no paciente, ao mesmo tempo que inibem os receptores de integrina αΐβΐ das células do rim do paciente. Esta actívidade pode ser reduzida pela utilização de um agente que se liga irreversivelmente a FCT-βΙ e inibe a sua capacidade para se ligar com o seu receptor. Alternativamente, esta activd dade pode st er reduzida pela UX IJ-izSÇciO de um agente capaz de inibir a capa cidade de FCT-βΙ para transduzir sinais para os núcl eos de uma célula de rim. 12

Ainda num outro enquadramento, providenciam-se meios de um paciente mo, os meios . no paciente, ínibidores de para limitar a acumulação da matriz na MBG com síndroma de Alport. Num enquadramen envolvem a redução da actividade de FCT-βΙ Isto pode ser conseguido pela utilização de tCT-βΙ, conforme se descreve aqui.

Num· enquadramento particularmente preferido, providen-cia-se um meio para limitar as fibroses renais por meio da urilização do inibidor de calcineurina, preferencialmente tacrolimus.

Além disso, a presente invenção tem por objecto um rato que não expressa uma composição de colagénio normal do tipo 4 na MBG como resultado da desactivação do gene ao colagénio a3(IV). Isto é, o rato não incorpora as cadeias de colagénio α 3(IV), α 4(IV) ou a5(IV) na membrana da base glomerular (assim a MBG está compreendida inteiramente nas cadeias α 1(IV), a2(IV) do colagénio no que respeita à sua composição da cadeia de colagénio do tipo IV). Além disso, não expressa o receptor de integrina αΐβΐ como resultado da desactivação do gene da sub-unidade cd.

Numa dupla mutação no rato, retarda-se o início da proteinúria quando se compara com o modelo de Alport de rato da técnica anterior. Além disso, o animal vive aprcximadadamente duas vezes mais tempo que cs seus companheiros de ninhada. Próximo das 8 semanas de idade, que é a idade média da morte em ratos com Alport, a desactivação dupla mostra uma patologia glomerular marcadarnente reduzida. Isto é, o rato com desactivação dupla tem dai nos ultra-estruturaís mar cadamen te reduzidos com muito menos rarefacçâo da MBG e muito pouco apagamento dos processos da base dc podócito. Também ocorre uma 13 atenuação da acumulação de fibronectina, laminina-1 e proteoglícano de sulfato de heparano na MBG, ao mesmo tempo que a acumulação de entactina e colagénio de tipo IV permanece inalterada, relativamente aos ratos com síndroma de Alport. Estes resultados indicam que há um papel específico para o receptor de integrina al(31 na patogénese da doença renal de Alport. Isto é notável, considerando que a simples desactivação da integrina al não tem um efeito óbvio na fisiologia ou na função renal.

Este rato pode ser utilizado para estudar o síndroma de Alport, a diabetes mellitus dependente de insulina e outros distúrbios que são caracterizados por gloinerulcne-frite e/ou fíbrose. Este rato pode também ser utilizado para avaliar agentes que podem ser utilizados para tratar o síndroma de Alport e a diabetes mellitus dependente de insulina e outros distúrbios que são caracterizados por deposição da matriz extracelular e/ou da fibrose. A presente invenção tem ainda por objecto uma composição farmacêutica que compreende um inibidor do receptor de integrina αΐβΐ e um inibidor de FCT-βΙ. A figura 1 ilustra o início da proteínúria em Alport versus um rato duplamente mutante, que fci estudado recolhendo urina de ratos a intervalos de uma semana. Os números indicam a idade (em semanas) dos ratos no momento da recolha de urina. A = rato com Alport; B = rato duplamente mutante; Mr = padrões de peso molecular. A figura 2 ilustra cs danos ultra-estruturais nos anéis capilares glomerulares de controlo e dos ratos duplamente mutantes. 0 córtex renal de ratos normais 14 (A) , com A Xpert ( B) e duplamen te mutante S i i o* \ «. U / i-h O H- col hido s s 7 serr ;ana - t embebid o em resí .na epo xi. v- aram -se secções ul t ra-fínas e analisaram- se por ΓΠ. 2_ c roso opia de t: rans TT- issãc elect rónica. As se tas índ içam processos c iâ S P: edicelas. C = lúmen cap ilar r U ;spaç o urinário. As barras de a umento r 'epr esen iam Π κ Γ,η \J f -S ^wij.1 t * A figura 3 dá os resultados da análise de imuno-fluorescência das proteínas da matriz extracelular em ratos normais, com Alport e duplamente mutantes. Fez-se reagir as crio-secções congeladas do córtex renal ccm anticorpos específicos para as proteínas da matriz extracelular indicadas como legenda do eixo dos YY. Desenvolveu-se o sinal utilizando o anticorpo secundário apropriado, conjugado com fluoresceína e recolheram-se as imagens digitalmente e trataram-se utilizando o software Cytcvisicn Ultra (Applied Imaging, Inc.). As setas indicam anéis capilares glomerulares. 4A1,2 = cadeias al(IV) e a2(IV) de colagénio; Lam-1 = laminina-1; Fib = fibronectina; PSH = prtoteoglicanos de sulfato de heparina; ent = entactína. al + /+ = homozigoto normal no gene de integrina al; al -/- = homozigoto mutante no gene de integrína al; a3(IV) +/+ = homczigoto normal no gene a3(IV) do colagénio; α3(IV) -/- = homczigoto mutante no gene α3(IV) do colagénio. /A figura 4 mostra os resu. _tac tu S u. Ca a’ oál 1S e de ma v-\ ζρ pzç de Northern d.0 s ARNms de t odo o rim d ara nt e o dec urso da progress ão da doença renal de Al P 1 T~ b • Γ 1 accic nou — se o ARN to tal isolado dos rins, col ido r. os jp vy·. ntos i '3 i ]. ca d os ein s eme ris s 0ΙΠ (Ai : gtj de ag arose 06 QC snaturaçã o - r de que se fo z manch 5 S 0 ITi nylo Ή o o sonaou-se com ADNcs de murino codificando quer FCT-βΙ ou vários componentes da membrana basal glomerular e/ou da matriz extracelular. As sondas utilizadas para gerar os dados ilustrados nos painéis são as seguintes: A, FCT-βΙ; B, Col .agénio al(IV); i ^ t Colagénio a2 ( IV); D, Fibronectir ia; E, Entactina; F, cadeia M de Laminina; G, cadeia β-2 de Laminina. A figura 5 ilustra a análise quantitativa da indução de ARNin durante a progressão da doença renal de Alport. Mo seguimento da exposição a um filme de raios X, as membranas utilizadas para produzir a figura 4 foram analisadas utilizando um leitor de imagens de fósforo GS 525 da Bio-Rad. Os valores do gráfico indicam as vezes da indução do ARNm especifico na amostra de Alport em relação às observadas nos seus companheiros de ninhada normais. Subtraíram-se todas as bandas do valor inicial. As espécies de ARNm específicas analisadas estão indicadas no lado de dentro. A figura 6 ilustra a análise de hibridação in si tu dos transcritos específicos em ratos com Alport, oost-proteinúricos. Analisaram-se os rins de ratos normais companheiros da ninhada (A, D, G, e J) ao mesmo tempo que os ratos com Alport (B, E, H e K). As sondas anti- pctXcXOld S fcram específicas para o domínio NC 1 colagénio al (IV) (A e ΒΊ u / f a CT-β 1 ( l) θ

Fibronectina (G e H) , entactina (J e K) , ou a cadeia BI de laminina (M e N) . Utilizou-se uma sonda específica para B-galactosidase bacteriana como um controlo para ligações não específicas (C, F, I, L e 16 0) . Ά figura 7 ilustra a coloração com imuno-peroxidase para o FCT-βΙ em secções de tecido para ratos normais e com Alport. As As secções embebidas em parafina fcram coradas para a forma activa de FCT-ÍJl utilizando a detecção ca imuno-peroxidase. P = podócitos; M = células mesangiais. A figura 8 ilustra a análise de aetecção de RN ase para o ARNm de FCT-31 no córtex renal em seres humanos normais e com Alport. Isolou-se o ARN total do córtex renal em seres humanos normais e com Alport e submeteu-se 10 pg de cada a uma análise de protecção de RNase utilizando uma porção radiomarcada da mensagem anti-paralela de FCT-BÍ humane como sonda. O ensaio resulta em num fragmento protegido com 264 pb. Os marcadores da dimensão molecular são cortes PBR322 de MSP1 radiomarcados e os fragmentos apropriados estão indicados por comparação. N = normal; A -Alport. A figura 9 ilustra a análise de mancha de Northern de ARN de córtex renal de ratos normais, com Alport, deficientes em integrina al e ratos deficientes tanto em integrina al como ratos deficientes em colagénio a3 (IV) . Isolou-se o ARN total do córtex renal de ratos com 7 semanas de idade (companheiros de ninhada) com os genótipos indicados; +/+ = normal em ambos os alelos; -/- = mutante em ambos os alelos. A figura 10 representa um micrográfíco de transmissão electróníca da MBG de um animal com Alport com 7 semanas de idade injectado com um anticorpo de neurraiízação específico para a integrina al- De notar a aparência trilaminar regular ca MBG e a ausência de 17 mento é de 10.50( regiões espessadas focalmen A figura II ilustra o efeito dcs inibidores de FCT-B1 na ultra-estrutura de MBG em ratos ccm Alport de 129 Sv/J. Trataram-se os animais quer ccm FK506 ou o rec eptor sorúver de FCT-βΙ . rmfcebeu-se c córtex rena em epoxi, cortou-se, corou- se com acetato de uranilo cit rato de chumbo Θ c i 11 α 1.1 S C U “ S Θ Dor meio d microscopia de transmissão eiectrónica. A = controlo; B = com Alport não tratados; C = Alport tratados com FK506; D = Alport tratados com o receptor de FCT-iil receptor solúvel. A ampliação é de 11.000 X. A figura 12 representa um micrográfico de varrimento electrónico dos glomérulos de ratos com Alport de 129 Sv/J tratados versus não tratados. O córtex renal dos ratos utilizados na figura 11 foi congeladpe e seco, craqueado, corado com acetato de uracilo e citrato de chumbo e expôs-se os glomérulos identificados e fotografados utilizando um microscópio de varrimento electrónico. A = controlo; B Alport não injectados; C = ratos com Alport tratados com o receptor solúvel de FCT-B1. A ampliação é de 2.500 X. A f igur a 13 de monstra c efeito do 4- ratamento com o fá rmacc na a 1b umí na urin á r 1 a em T. d tf 3s 129 Sv } L c om. AI port. Duran te 0 período de t rata mer t O COili O f G rmac re colheu-se uri n is + f líofi) -izou -se e equivaler ite de n v t 5 pL foi fr ionadc num gel de poliacríl amia d « Co rou-sc o ge X corr > azul o e Co oma s o - 0 e visualiz ou-s Θ . As prín 6Í ras duas coluna s re pre s SHt d. m conrrolc ,-s n ão 1 π j Θ C X â C Jos 3. S duas s p q i t r· 1 l8 S ( rupc I) x cr 3.3X1 injectados com FK5C6 e o terceiro grupo (grupo II) foi 18 injectado com o receptor solúvel de FCT-fil. Os números na parte de baixo representam a idade dos ratos no momento da colheita de urina, em semanas. C = controlo; A = Alport. A figura 14 ilustra o efeito dos ínibídores de FCT-fil na ultra-estrutura da MBG nos ratos com uma dupla inactivação. Os animais não foram tratados ou foram tratados quer com FK506 ou com o receptor solúvel de FCT-βΙ. Embebeu-se o córtex renal em epoxi, cortou-se, corou-se ccm acetato de uranilo e citrato de chumbo e analisou-se por meio de microscopía de transmissão electrónica. A = controlo não injectado; B = não injectados, duplamente inactivados; C = duplamente inactivados, tratados com FK506; D = duplamente inactivados, tratados com com o receptor solúvel de FCT-B1. A ampliação é de 8 000 X. A figura 15 ilustra um exemplo da arquitectura normal dos glcmérulos num rato duplamente inactivado, de 10 semanas de idade, tratados com inibidores de FCT-Bl. Aproximadamente 25 % dos gloméruios em ratos tratados quer com o inibídor de FCT-Bl eram indistinguíveis sob o ponto de vista morfológico do que nos animais de controlo. Os animais não foram tratados ou foram tratados com FK506. Embebeu-se o córtex renal em epoxi, cortou-se, corou-se com acetato de uranilo e citrato de chumbo e analisou-se por meio de microscopía de transmissão electrónica. A = controlo não injectado; B = duplamente inactivados tratados com A figura 16 demonstra o efeito do tratamento com o fármaco na albumina da urina em ratos com dupla 19 inactivação. Durante o decurso do tratamento com o fármaco, colheu-se urina, líofilizou-se e o equivalente de 0,5 qL foi fraccionado em gel de poliacrilamida. Corou-se o gel com azul de coomassie e visualizcu-se. A idade dos ratos no momento da colheita da urina está indicada no fundo da figura (em semanas). A = não injectados, duplamente inactivados; B = injectados com o receptor solúvel, duplamente inactivados; C = rato de controlo ínjectado com FK506; D = duplamente inactivados, injectados com FK506. A figura 17 representa um micrográfico de varrimento electrónico de glomérulos de Alport versus ratos duplamente inactivados. córtex renal de ratos com 7 semanas de idade foi congelado, seco, craqueado, corado com acetato de uracilo e citrato de chumbo e expôs-se os glomérulos identificados e fotografados utilizando um microscópio de varrimento electrónico. A = controlo; B = Alport; C = Dupla inactivação. A figura 18 mostra uma coloração por imuno-fluorescência para a cadeia a2 de laminina em ratos normais e mutantes. Corou-se de verde a membrana basal glomerular utilizando um anticorpo primário específico da entactina e um anticorpo secundário conjugado com F1TC. Corou-se de vermelho a cadeia a2 de laminina \à L. X ò izando um anticorp a sec undá rio con j ugado com vermelho do Texas. /1 co-Iocal dza ção 10 s 3Ώ éis capi la res i? e ii i r. 3. n. urna c oloraç 3,0 amar eia. 0 grupo i reor esenta gloirieruãos oe ratos com 7 s emanas de i Gd. de; A = contro lc nàc injectado; B = AI por 1 não inj ec ta do; loort om 0 receptor solúvel; D não â. iv. \J PÓ. f dupla iriact ivação. 0 grupe II repr isento 111 OS de rostos com 2 semanas de idade; 20 A = controlo; 3 = Alpcrt. As setas indicam a imuno-eoloração nos anéis capilares dos çiomérulos. A figura 19 representa um ncrográfico de varrimento electrónico da MBG de um roto normal com 2 semanas de idade versus um rato com Alport. Embebeu-se o correr renal en epoix, cortou-se, corou-se ccm acetato de uracilo e citrato de chumbo e analisou-se por microscopia de transmissão electrónica. A = controlo; B = Alport. A figura 20 demonstra o efeito dos inibidores de FCT-βΙ na expressão, no rim, de ARNs que codificam as moléculas da matriz das células ou inibidores de metalcproteinases em ratos normais versus um rato com Alport. Isolou-se o ARN total a partir de rins de ratos normais (C) ccm 7 semanas de idade ou ratos com Alport (A), que ou foram tratados com FK506 (I), ou não foram tratados (NI). Os ARNs foram fraccionados em geles de agarose de desnaturação e analisaram-se por hibridação com sondas radiomarcadas que codificam quer as moléculas da matriz extracelular, quer os inibidores de metaloproteinase. No seguimento da hibridação, lavaram-se as membranas e expuseram-se a um filme de raios X. As sondas utilizadas estão indicadas à esquerda dos painéis, ai (IV) = colagénío cd (IV); fn = fibronectina; ent = entactina; Timp2 = íníòidcr de metaloproteinase Timp-2; Timp3 = iníbídor de metaloproteinase Timp-3. A figura 9' 7 demonstra o e f e i to dos inibidores de FCT-βΙ na expr 0 s s 3. o f η ο τ j i T;, de AHÍ "s que codificam as rp Q í pp-il β cq O.â. pp p; T- γ ç >7 (dp g cé 1 u ias ou inibidores Cíc metaloprcteínases em ratos normais versus um 21 dup larr enre in acti vado. Iso lou-se o A RN t otai a r^. m v>H-Uu i. L ir de r í_r . S GO '£ c tos norma. _s {C; com 10 s eu anas de 4 X O.CL de ou latOS Q dp_ .arnente in act ivacos í n a { LsJl Π } / que ou for am tra ta d os com FK5C a (D ou com o T 0 ce L. cr sc lú vel 0 Θ -βΐ o a na o fora m t ratados (N ^ 1 / Os ARNs f fjr am fra ccí onaao s em geles de agaros 3 G d esnat uração e ctl"la lis aram- se por hierí daç ao com S ΟΓ- da s raciomarcad as que codificam quer as moléculas da matriz extracelular, quer os inibidores de metaloprcteínase. No seguimento da hibridaçáo, lavaram-se as membranas e expuseram-se a um filme de raios X. As sondas utilizadas estão indicadas à esquerda dos painéis, ai (IV)= colagénio cd (IV); fn = fibronectina; ent = entactina; Timp2 = inibidor de metaloproteinase Iimp-2; Timp3 = inibidor de metaloproteinase Iimp-3. A figura 22 ilustra a inibição da acumulação da matriz no túbulo-interstício dos ratos duplamente inactivados utilizando inibidores de FCT-βΙ. Embeberam-se os rins de ratos com dez semanas de idade ou ratos duplamente inactivados em plástico e coraram-se secções de 1 μΜ utilizando o método de metenamina e prata de Jones. A = rim normal; B = rins duplamente inactivados, não injectados; C = rins duplamente inactivados, tratados com FK506; D = rins duplamente inactivados, tratados com o receptor solúvel de FCT-βί. A f i gura 2 3 1 usf da W' Ga a j-í. bx çã o o.a acur rui ação de col ag énío do típ o I na túbu lo -interst C j. o d cs ra 1 OS g ap la mente ί Π8 C f ]TT u. X v σ QO S u _ í ii zando 1 nib: _dc ^res de T-spu-r “β 1. Em Ke beram .-se cs rins de ratos /V 1 L L ez sema r as p pi id ade o u ratos dt plame nte ÍP.c iCtívado s μο,-ρ-j 7'c i W Qpl—} Q 0 e imu π 0 -cora ra m-se 30C ções de 1 μΐ 1 — t” j_ J_ v7 a cd.O an ticor D CS esp ec if ico c para o cclag énío α o tico j. A c olor a c ão 22 desenvolveu-se utilizando o kit de coloração com estreptavidína AEG dc Vector laboratories. A " nrn normal; B — riin aupiumenLe inâctivsoo, nao mjectado, C — nn dupaumente inaccivaGO, tratado com FK506; D = rim duplamente inactivado, tratado com o receptcr solúvel de FCT-p-l. A figura 24 ilustra a inibição da acumulação de fibronectina no tuoulo-interstício dos ratos dupiamer ite inactiva dos uti .lizandc ínibidcres de FCT-βΙ. Emb eb e ram— s e os ri ns de ratos normais com dez S ΘΧΓί<αΠ3. S de idade ou ratos du .piamente inactivados, em plástico e irmano-coraram-se secções de 1 μ.Μ utilizando anticorpos específicos para a fibronectina. A coloração desenvolveu-se utilizando o kit de coloração com estreptavidína AEG do Vector laboratories. A = rim normal; B -- rim duplamente mactivado, não injectado, C = rim duplamente inactivado, tratado com FK506; D = rim duplamente inactivado, tratado com o receptor solúvel de FCT-βΙ. A presente invenção tem por objecto composições farmacêuticas e a sua preparação, composições essas que ataquem o mecanismo de doenças renais (isto é, doenças do rim), que podem retardar substancialmente o início e/ou a de condições de doença, tar como progressão glcmerulonefrite e fibrcse renal. Crê-se que as composições farmacêuticas da presente invenção podem mesmo reverter _ ™ ~ ... pOi essa s cond ições. Em parti cul ar, a prese 4- lí ut s invenção tem ob je ct O C Ct mposíçõ 0S farma cêu tícas € d S U3 preparação pjd r t -4 - braf Ç. d. (-4 ‘w am Ap-Q de dof p Γ • pj y jCi Π α 1 s ass OC IdCtc i S à presença cj p risc 0 d. Cl’6 ie desen 1 ver g 1 nr CO ΓΊ lo: nefrite e J- -L ^ ^ T θ π s ] nos í gloméru 5 ClO Γ Ϊ rn tal occ )1Γ0 He 3 glomerulci 06 fr mesangiCí roiitei α j. v α . aiomeruione: :e pj -CiâtlVa Pa 23 membrana, glomeralonefrite crescêntica, nefropatía diabética e fibrose renal intersticial. A glomeruionefrite envolve os danos glomerulares tipicainente associados ao espessamento; o adelgaçamento e/ou o corte das irregularidades na MBG. Isto pode culminar numa via comum da fibrose túbulo-intersticial. Estas condições são tipicamente caraclerízadas pelo aparecimento de miofibroblastos e a acumulação da matriz (Incluindo o coiagénio do tipo I, fibronectina, ]amínina e colagénío do tipo IV no túbulo-interstício. A eficácia dos agentes terapêuticos utilizados na presente invenção pode ser determinada avaliando uma ou mais destas características. A presente invenção também tem por objectivo um rato para o estudo dos processes e para a avaliação dos agentes para o tratamento de pacientes com doenças dos rins associadas com a presença ou com um risco acrescido de desenvolver uma acumulação da matriz extraceluiar de uma forma geral e, particularmente, dentro dos glomérulos do rim e do túbulo-interstício. Assim, num enquadramento, a presente invenção tem por objectivo um rato com síndroma de Alport. Este rato inclui um receptor de integrina αΐβΐ inactivado, em combina ção com uma molécula inactivada de coiagénio (tipo IV) . Num e n qu a d r a m e n t o preferido, a molécula de coiagénio (tipo ; EV) é inactíva da através da interrupção da expressão da sub-unídade «3 do coiagénio (tipo IV). Como resulta do, o rate d não incorpora as cadeias de colagénío a3 (IV), «4 (IV), ou α 5(IV) na MBG. Este rato pode ser utiliz ado em processos para o 6HSâio d.Q agent es para traçar di L al como ocorre com o síndror ia de AI port, diabetes ΓΓ lellitus deoendente de í Π S U jL X H 3, e outras doenças renais ΘΓΓ 1 Cf U β o. doença precoce é cara zterizada pela expansão da Ui 3 triz 24 rr.esângica e a proliferação das células mesangiaís em associação com os danes da membrana basal glomerular, ca.ractθγizad.a pero esoessamento oa membrana DdSa^/ o seu adelgaçamento, coroe e apagamento dos processos da base do Dodóclto ou qualquer uma das suas combinações.

Num enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto iníbidores para bloquear ou de alguma forma inactivar a função do receptor da íntegrina αΐβΐ como um processo par a atrasar o inicio (conforme se mede pe .lo aparecimento de albumina na urina ) ou o retardamento da progressão ( conforme medido pela taxa à qual aumenta o nível de albumina do soro na urina) ou mesmo revertendo (conforme medido pela taxa à qual aumenta o nível de albumina do soro na urina) a glomeruionefrite e/ou a fibrose (como se manifesta pelo aparecimento de miofibroblastos e a acumulação da matriz extracelular, incluindo laminina, fibronectina, colagénio do tipo I e colagénio do tipo IV no interstício do túbulo) na progressão da doença glomerular. Pode-se utilizar uma variedade de agentes sintéticos ou naturais, que estão descritos com maior detalhe a seguir. /linda num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto o papel do FCT-βΙ na patogénese da doença renal de Alport e noutras como as doenças do rim. Observa-se um aumento pronunciado nes níveis de ARNm para o FCT-βΙ no seguimento do início da proteinúria no rato aqui utilizado. A hi rv -v—i r* m. r~ . .n** —í— U— 'ão ili tO _í_ L- ύύ indí c -3 C[U0 os podó eitos ; qu p o- r 0 d ii zem pouc o ou nen hum ARNj T: par S 0 r P0T~ í< 1 r " antes d início da prot einúri α f ' exp r os sa m com abur.à . S 0 ARI Jm pa ra po p _ p 1 i. .i. βΡ —i- no se cu imer.to do in icio Od pr oteinu .ria a té 0 0 S tã n - ~ Ti p H p uG i n su fi cíên C18 re nai. A act 1van ^^ do s AKl Mms O ue 0 odifican f íbr cnecti na, Cí DL4A1 e COL4A2 p ent act ; 1 n 3 Q bservam- -se 25 praticamente ao mesmo tempo. Por isso, a diminuição do nível de FCT-βΙ é outro mecanismo para o tratamento de condições renais tal como glomerulonefrite e/ou fibrose. Os efeitos da inibição da actividade do FCT-βΙ podem ser medidos pela determinação do período de tempo de aparecimento (início) e taxa de aumento da albumina na urina e/ou acumulação de moléculas da matriz extraceiuiar na MBG e no interstício do túbulo.

Num outro enquadramento, através da utilização de ínibídores de FCT-βΙ em ratos com Alport deficientes em integrina al, a presente invenção tem por objecto a sinergia de um tratamento de combinação de ínibídores de integrina αΐβΐ e ínibídores de FCT-βΙ no retardamento do início e da progressão de glomerulonefrite e/ou fibrose.

Modelo de rato

Um aspecto importante para a gestão de pacientes com síndroma de Alport e outras doenças associadas com os danos glomeruiares progressivos associados com o espessamento, o adelgaçamento e/ou o corte das irregularidades na MBG e culminando numa via comum da fibrose do interstício do túbulo, conforme caracterizado pelo aparecimento de micfibroblastos e a acumulação da matriz (incluindo o colagénío do tipo I, fibronectina, lamínina e colagénio dc tipo IV) no interstício do túbulo é determinando a causa e/ou o mecanismo da progressão da doença. Por exemplo, embora as mutações nos genes do colagénío «3(IV) ou «4(IV) resulta em formas recessivas autosomais de síndroma de Alport e as mutações no gene α5(IV) resulta na forma ligada a X da doença, não "causando" estas próprias mutações uma insuficiência renal progressiva. Em vez disso, a ausência de colagénio α3(IV), α4(IV) ou α5(IV) parece resultar na 26 persistência da MBG semelhante à embriónica constituídas pelas cadeias de colagénio ai (IV) e a2(IV), Esta MBG semelhante à embriónica é um filtro glomerular apropriado para aproxímadamente a primeira década da vida em seres humanos (ou aproxímadamente nas primeiras três semanas do modelo de rato). Contudo, depois deste tempo, a MBG semelhante à embriónica não parece funcionar com eficácia. Por exemplo, num paciente com síndroma de Alport, estudos ultra-estruturais da MBG de um pacien "C e c oro 9 anos de idade com síndroma de Alport revelou uma ultra-estrutura relativamente normal (Cangiotti et al., Nephrol. Dial.

Transplant., 11: 1829-1834, 1996). Com a idade de 18 anos, contudo, a ultra-estrutura da MBG do mesmo paciente indicava uma glomerulonefrite de Alport avançada.

No síndroma de Alport, a membrana basal em seres humanos é relativamente normal até entre cinco e dez anos de idade, quando a perda da integridade da membrana basal pode ser monitorizada por um aumento progressivo da albumina na urina. Estudos sobre biopsias confirmaram que a ultra-estrutura da membrana basal é normal em paciente pré-proteinúricos com Alport. Ultra-estrutualmente, a doença da MBG é evidenciada por um espessamento irregular e um adelgaçamento da MBG. Pensa-se que o seccionamento da membrana é responsável pela micro-hematúria (isto é, pequenos números de eritrócitos detectáveis na urina) observada ao mesmo tempo que a proteinúria.

Sabe-se pouco no que respeita ao mecanismo do início e da progressão da doença renal de Alport; contud: jf tem-se especulado que a acumuiaçao dos componentes da MBG e a rarefacção da MBG pode ser devida a uma suscept ibilídade acrescida da membrana à proteólise e/ou a síntese acrescida 27 de moléculas da matriz devido a alterações nas vias reguladores normais.

Assim, existe a necessidade de um modelo para o síndroma de Alport por causa das limitações inerentes ao estudo da espécie humana. Cs seres humanos exibem uma gama de severidade na progressão da doença, presumivelmente devido às diferenças nos antecedentes genéticos. Estudos significativos que se dedicam à natureza molecular do início e progressão da doença são impossíveis sob o ponto de vista logístico em seres humanos, dificultando o progresso na investigação das doenças renais de Alport.

Produziu-se um modelo de rato para o síndroma autosomal de Alport por meio da mutagénese atingida do gene que codifica a cadeia a3(IV) do colagénio do tipo IV(Cosgrove et al., Genes Devei., 10: 2981-2992, 1996).0 modelo de animal desenvolveu uma glomerulonefrite progressiva. As alterações ultra-estruturais na MBG foram observadas tão cedo quanto à primeira semana de idade. Este rate é referido aqui como o rato "Alport".

Também se produziu um rato por mutagénese dirigida do gene que codifica a sub-unidade al do receptor de inteçrina (Gardner et al., Dev. Biol., 175: 301-313, 1996). Esta sub- suõ :egrina forma um heterodímero com unidade de integrir.a βΐ para formar c heterodímero de integrina αΐβΐ, activa sob o ponto de vista biológico, que se enconcrou na superncie glomérulos renais. O receptc oa s uas mesanqiais receot de ínteoi ou orn ísta exc usívamente lo ie integrina αΐβΐ é o ún:encontrou ma matriz mesângíc calizada. Indeoendentemente adesão alterada dos rato inactivado nãc :itos 'ds ΓΠ5"trizes ’ colagénio, o Desenvolve-se 28 norrealiTi .ente, é f értil e vive UFilo. vida ! a o mal. Não há insufle iência rei ial e não há G.í f 0 Σ θ n C 3. s aparer ites na compcsi ção molecu lar ou na ui -1 US“Θ 3 trutura Λ,Ο Q r* \ f -_X A _j_ imérulos nestes ratos. D. ado que o ΓΘ ceptor het erodimér :icc de mtegri na αΐβΐ é o único recep ter de xnuegri Για UGenuiliCdCiO na supe rfície das células mesa ngi ais nos glc mérulos renais, foi surpreendente que a ausên cia deste recepuor nã o tenha efeito no desen volvimento ppp d _L normal e/ou na sua função. Isto sugere que ou não é necessário ou que as vias redunda ntes pc d em compensar pe J_ d sua ausênci a. A presente invenção tem por objecto um rato com uma nova dupla inactivação (isto é uma dupla mutação). Desenvolveu-se por meio do cruzamento da estirpe de mutação al do rato com a estirpe de mutação oí3 do colagénio (rato Alport) para produzir mutantes defectivos tanto no gene do receptor da sub-unidade da integrina al como no gene a3(IV) do colagénio. Embora a ausência do receptor de integrina αΐβΐ aparentemente não desempenhe um papel no desenvolvimento e na função renal normal, por causa da matriz mesângica é o sitio de síntese para as metaloproteinases e as cítocinas, tais como FCT-βΙ e os estádio precoces da giomerulonefrite de Alport envolvem a proliferação de células mesangiais e a expansão da matriz mesângica, crê-se que o receptor de integrina αΐβΐ possa ter um papel específico na patogénese renal. Na verdade, estudos sobre a mutação dupla al de integrina e a3(Iv) do colagénio, são particularmente únicos e importantes. A discussão que se segue descreve muitas das características do rato com a dupla mutação da presente invenção.

Uma bo d dVdildÇ ão global da or idade do filtro rena) l é a ro r· rvh jr- ^ elnúria (isto é, a pre senç a. α e um 0 X C 0 d d proteínas dc S oro na urina). Como cs tá i lu strado 11 α rp 29 1, o início da prcteinúría na mutação dupla foi atrasado de peio menos uma semana e teve o seu pico às cerca de 9 semanas a cerca de 9,5 semanas, versus cerca de 6 semanas a cerca de 6,5 semanas nos companheiros de ninhada com doença de Alport (isto é, a que falta o gene α3 (IV) do colagénic, mas contendo o gene da sub-unidade ai de integrina) . C início e a taxa de aumento da proteinúria (isto é, a presença de albumina de soro na urina) é uma boa medida para a avaliação da eficácia das composições farmacêuticas da presente invenção. Os níveis de albumina no soro podem ser medidos quer por electroforese em gel como por coloração com azul de coomassie (fazendo passar o equivalente de 1 micrclitro de urina) ou os testes de fitas comercialmente disponíveis. A idade média da morte devida à insuficiência renal é de cerca de 8 a cerca de 9 semanas em ratos com Alport, independentemente de esses ratos descenderem ou não de ratos 12 9 Sv/J ou 129 Sv (deixou-se que pelo menos 10 ratos progredissem até ao estádio final para cada antecedente genético para estabelecer este ponto). Os ratos com uma dupla mutação viveram uma média de cerca de 15 semanas até cerca de 16,5 semanas de idade.

Por isso, a eliminação do receptor de integrina αΐβΐ tem um marcado efeito no inicio e na progressão da doença renal de Alport. Além disso, os ratos sem o receptor αΐβΐ têm uma função glomerular melhorada quando comparada com ou outros ratos testados. Em animais que não expressam o gene «3(IV) e que eram heterozigóticos para a mutação de inactzvação de al, houve uma melhoria intermédia na função glomerular e a progressão da doença ilustra que a integrina al tem um efeito dependente da dose na progressão da doença renal de Alport (isto é, reduzindo a expressão da integrina al para metade providenciando um efeito protector que está entre o rato com Alport e o que tem uma dupla mutação) . 30 protector intermédio em animais com Alport, a mutação de integrina αΐβΐ ilustra

Imen te o rec eptor de int egrina al βΐ fiei os úteis Esta é uma V θ ~ 1 Γ j- C 3 Ç ão S Θ aplica a terap ias que envolvem C de int 6 C Γ Í H 3 αΐβΐ quar do i itilizado em

Este efeito heterozigóticos para que inibindo parcia providenciam-se bene importante daoo pue inioição do receptor seres humanos.

Realizou-se a análise com um microscópio de transmissão electrónica em rins de ratos com. 7 semanas de idade que ou eram normais nos dois aielos (controlo), nulos no colagénio a3(IV) e normais na integrina al (Alport) ou nulos tanto no colagénio α3(IV) como na integrina al (Alport) (dupla mutação). Escolheu-se este momento dado que os ratos com Alport, com esta idade, aproximam-se do estágio final. Os painéis escolhidos para a figura 2 são representativos de pelo menos 5 campos glomerulares diferentes. Como se ilustra na figura 2, o anel capilar glomerular do rato normal (figura 2a) tem uma membrana basal trilaminar com uma espessura uniforme e processos de base regulares (os processos da base nos três painéis estão assinalados com setas) . 0 anel capilar do rato com Alport (figura 2B) mostrou uma membrana de base rarefeita com um espessamento focal e uma parte maís fina (característica da doença avançada). Os processos das pedicelas estavam aumentados de volume, parecendo fundidos, uma propriedade

que se crê que 32 6 cta a efi .ciêr icia da fil tração re nal. Na Q 1*1 p J~ a m .UtâÇdO gura 2 C) , a memb mana fadSclX esta va marc a dam .ente menos afectada do que 3 dO ra to com Aipo rt / -Ç 4 n ura 2E) . Urr: íD O T-(à a memora na b asai fos S 0 ma 2_ b 1. d. T: d Li O O ue a de con creio, ora muito men OS Γ aref 8ltd 0 os proces sos d -3 S sdiceias dc ito com s podócitos parecia praticamente normal. Nc oort, cerca de 40 I dos alomérulos escavam 31 fibrosos, enquanto apenas 5 % eram fibrótícos no mutante duplo.

Realizou-se uma análise de imuno-florescência utilizando córtex renal congelado dos animais utilizados na figura 2. Fez-se reagir o tecido com anticorpos específicos para proteínas conhecidas por se acumularem na MBG como uma função da progressão da doença renal de Alport. Os resultados na figura 3 ilustram que a distribuição das cadeias de colagénio COL 4A1 (al (IV)) e 4A2 (α2 (IV)) eram as mesmas tanto para os glomérulos de ratos com Alport como para os dos mutantes duplos. Em ambos os casos, os anéis capilares (assinalados em todos os painéis da figura 3 por setas) e a matriz mesângica eram positivos (figura 33, C). A laminína-1 mostrou uma acumulação marcada na MBG do rato com Alport comparada com o controlo (compare a figura 3D com a figura 3E), contudo, no mutante duplo (figura 3F), a acumulação da laminina-1 foi marcadamente atenuada relativamente à dos glomérulos de ratos com Alport (figura 3E) . A fíbronectina localiza-se normalmente exclusivamente na matriz mesângica, mas verificou-se que também se localizava na MBG assim como ma matriz mesângica nos ratos com Alport (figura 3H) . Surpreendentemente, no rato duplamente mutante, a acumulação de fíbronectina nos anéis capilares não foi observada (figura 31). Este resultado foi altamente reprodutível. Pelo contrário, a coloração para o proteoglicano de sulfato de heparína mostrou uma coloração atenuada na matriz mesângica nos ratos duplamente mutantes (figura 3L) quando comparados com qualquer um dos controles (figura 3J) ou os raros com Alport (figura 3K) . A acumulação de entactína na MBG foi observado tanto nas amostras de Alport como de mutante duplo, sem diferenças discerníveís entre as duas (figuras 3N e 30). 32

Combinados, estes dados ilustram que a mutação nula de al no rnutante duplo resulta num retardamento da progressão da doença renal de Alport. Isto é claro tanto ao nível fisiológico (arranque adiado da proteínúría como se mostra na figura 1) como ao nível estrutural (danos reduzidos na MBG e apagamento do processos das pedicelas como se mostra na figura 2}. Os estudos de imunofluorescência dados na figura 3 ilustram que a eliminação do receptor de integrina αΐβΐ resulta em alterações específicas na acumulação das componentes da matriz extraoelular tanto na MBG como na matriz mesângica. Assim, a presente invenção envolve processos de tratamento em que o sítio da ligação do receptor da integrina αΐβΐ na superfície da célula do rim está bloqueado. Esses processos de tratamento estão descritos com mais detalhe a seguir.

Além disso, a figura 9 mostra que, embora o FCT-βΙ seja induzido por cítocína nos ratos com Alport, não é induzido em ratos com Alport que comportam também uma mutação da integrina al. Assim, na ausência da integrina al, não se observa a indução do FCT-βΙ, o que significa um decréscimo na acumulação da matriz na membrana basal glomerular e assim uma diminuição significativa na taxa à qual a doença renal progride. Este papel do FCT-βΙ na doença renal está descrito com mais detalhe na secção que se segue.

Papel de FCT-βΙ

Os dados estabelecem aqui claramente que o FCT-βΙ é nduzido num tipo de célula glomerular espe cífica (os OdócitOS; í nos modelos de ratos utilizados aqui, , A indução o ARNm do FCT imagem ín versa da indução dos genes que codificam as moléculas da matriz conhecidas 33 por se aglomerarem na membrana basal glomerular em função da glomerulonefrite progressiva no modelo (por exemplo, laminina, fibronectina, entactína e colagér.ío do tipo IV) . Além disso, os dados aqui mostrados mostram que o FCT-βΙ é induzido no córtex renal de seres humanos com doença de Alport. Isto suporta a validade do modelo de animal na sua capacidade para simular o que acontece no rim humano com Alport.

Para demonstrar o papel de FCT-βϊ, isolou-se c ARN total de rins de animais com Alport e sondaram-se com sondas radiomarcadas específicas para cada uma das cadeias de colagénio αΐ (IV) ou a2(TV), entactina, as cadeias βί ou B2 de laminina, fibronectina ou FCT-βϊ. Os resultados na figura 4 ilustram que os ARNms para todas estas proteínas com a excepção da laminina 61. são induzidos no seguimento do início da proteinúria no modelo de rato com Alport. As análises de mancha de Northern para os mesmos períodos foram também realizadas para laminina al, laminina β2, laminin yl, proteínas nucleares dos proteoglicanos de sulfato de heparina e as cadeias a4(IV) e a5(IV) de colagénio. Não foram evidentes diferenças significativas nos níveis de ARNm para estas outras proteínas da membrana basal quando se compara o controlo com o mutante.

Os resultados das análises de mancha de Northern foram analisados para quantificar directamente as alterações relativas na expressão específica de ARNm durante o intervalo de tempo. A figura 5 ilustra que a indução dos níveis de ARNm específicos é pela primeira vez evidente às seis semanas de idade. Às 8 semanas, o pico dos níveis de ARNm, ccm cs ARNms codificando FCI-βΙ e fibronectina induzidas 6,6 e 9,4 vezes em relação aos ratos de controlo, resoectivamente. Os níveis de ARNm para o colagénio al(IV) 34 e a2(IV) s entactina foram rodos induzidos cerca de 3 vezes na semana 8. Ao contrário, não se observaram alterações significativas ncs ARNms que codificam as cadeias Bi e B2 de laminina, conforme determinado pelas mesmas análises de mancha de Northern do ARN total, em qualquer momento da progressão da doença renal.

Os glcmérulos compreendem apenas uma pequena percentagem oa massa total do rim. Tipos de células indivi- dua r s dentro dos glomérulos compreendem uma percentagem ainda menor. Não é provável que as análises de mancha de Northe rn do ARN total do rim detectem a indução de mensagens que possam ser específicas para os glomérulos ou para um tipo de célula glomerular particular. Para examinar se os ARNms codificam FCT-βΙ ou os diferentes componentes da membrana basalforam induzidos num tipo de célula particular dos glomérulos, realizou-se a hibridação in situ utilizando sondas anti-sentido marcadas com dioxigenina específicas para os ARNms. Os resultados estão indicados na figura 6. Em ratos normais, os transcritos para FCT-βΙ (figura 6D), fibronectina (figura 6G) e laminina βΐ (figura 6M) localiza exclusivamente as células mesangiaís, enquanto nos ratos com Alport, estes mesmos transcritos (figuras 6 H e N, respectivamente) localizam claramente os podócitos (o anel das células na parte externa dos glomérulos) ilustrando a activação do gene neste tipo de cérulas dos glomérulos. A activação dos podócitos pelo co^agénio ctl (IV) é também evidente (comparar as figuras 6B cora 6A). A activação dos genes que codificam as proteínas da matriz nos podócitos qiomerulares podem resultar em alterações na composição da MBG.

Os dados sobre as proteicas de FCT-β". com base na cetecção de ímuno-peroxídase utilizando anticorpos especí- 35 activa da _tocina corr 0.00 ram os íbr XCÍ.ciÇciO in si ϋ u par« o qu e se mo stram Tia f i gu ra da do ARN mens âcje iro do pro zeínas elevadas ricos para a isoforma dados obtidos pelas análises da h ARN mensageiro do FCT-βΙ. Os dados 7 ilustram que a expressão eleva FCT-βΙ nos podócitos se traduz em

Dado que os dados para FCT-βΙ foram adquiridos utilizando um modelo de rato, realizou-se a análise de protecção de RNase para determinar se os níveis de ARNm para a citocir.a são também elevados no córtex renal humano de Alport versus os pacientes de controlo. Os dados na figura 8 ilustram um aumento de 3-4 vezes do ARN mensageiro do FCT-βΙ no córtex renal humano de pacientes com Alport relativamente ao controlo. Isto prova que a citocina é também sobre-expressa em rins humanos com Alport. Assim, a inibição da actividade de FCT-βΙ providencia um protocolo de tratamento razoável para o síndroma de Alport, particularmente para a limitação e preferencialmente mesmo para a prevenção da acumulação da matriz na MBG.

Tal como se discutiu antes, a figura 9 mostra que, embora FCT-βΙ esteja induzido no rato com Alport, não está induzido em ratos com duplas mutações que comportam também a mutação da integrina al. Assim, na ausência da integrina αΐβΐ, não se cbserva a indução de FCT-βΙ, o que é responsável por uma diminuição da acumulação da matriz na membrana basal glomerular e assim uma diminuição significativa na taxa à qual a doença progride.

Significativamente, o bloqueio (ou de algum modo a inactivaçãc) tanto do receptor de ϊ integrina αΐβΐ como da inibição de FCT-βΙ é sinérgico na atenuação do inicio, progressão e /ou reversa o da doença renal (parciculamente a doença renal de Alport). hste efeito sinérgico 36 demonstrado utilizando, como exemplos, dois agentes diferentes que bloqueiam a actividade de FCT-βΙ de três maneiras diferentes. Ambos foram estudados para assegurar que os resultanos eram devidos à inibição da actividade de FCT-βΙ, tanto quanto ac efeito colateral do tratamento com fármacos. 0 primeiro exemplo é um fárroaco produzido pela Fujísawa Pharmaceutícal Co., Ltd., Osaka, Japão, referido como tacrolimus ou FK506. Este fármaco é utilizado correntemente como um imuno-supressor para prevenir a rejeição no seguimento da transplantação de um órgão. Funciona por inibição de uma sub-unidade critica do receptor das células T designado por calcineurina, que é uma escrina treonina fosfatase e uma parte crítica da transdução de sinal das células T. Tal como fci revisto recentemente (Crabtree, Cell, 96: 611-614, 1959), a calcineurina é uma sub-unidade de uma variedade de recepcores. Um destes receptores foi recentemente referenciado como sendo o receptor para FCT-βΙ (Wang et ai., Cell, 86: 435-444, 1996). Ensaiou-se o fármaco FK506 como um inibidor de FCT-βΙ. Assim, o tratamento de ratos com a dose apropriada de FK506 irá inibir a transdução do sinal do receptor de FCT-βΙ do tipol/tipo II.

Dado que FK506 tem outros efeitos biológico s para além da inibição de FCT-βΙ ( imuno” supressão potente por vi a da inibição do receptor QgS células T que e a 1118.1 3 ímportant s), avaliou-se IjITl seÇf undo inibidor de F CT-βΙ. Este segundo inibidor é um fármaco experimental em desenvolv: imento pela 3 i o g θ π Inc., Cambrídge, MA. Este íáimaeo é uHj ^nioicjor cc mcorrente da citocina, embeber: 00 3 C í 10 C ΐ Η α activa ccmo um complexo do recept O r- 3 Q J_ Π r-G 1 u V b — IHâCtiVC. É uma proteína de m urino quimérica, ; solúvel I ^ 37 fusão de RII/igGl de FCT-βΙ (ver, publicação da patente de invenção internacional WO 98/48024}

Injectaram-se vin e cinco microgramas do ínibidor em ratos, através da veia da cauda, duas vezes por semana, nas experiências descritas.

Dado que o modo de actividade e os efeitos colaterais potenciais de FK506 e o in.ibídor solúvel de FCT-βΙ da Biogen são tão diferentes, as observações feitas utilizando os sistemas de modelos animais que são consistentes com ambos os fármacos concluíram como sendo devidos ao ínibidor da actividade de FCT-βΙ.

Realizaram-se dois tipos de experiências. Ensaiaram-se ambos os agentes utilizando o modelo de rato 129 Sv/J (o rato Alport) para examinar os efeitos biológicos da própria inibição de FCT-βΙ. Em segundo lugar, ensaiaram-se ambos os agentes no modelo de ratos com uma dupla mutação para examinar os efeitos biológicos da inibição da integrina αΐβΐ combinada com a inibição de FCT-βΙ. Em todos os casos, os dados aqui apresentados foram repetidos pelo menos três vezes com um elevado grau de consistência.

Quando FCT-βΙ é inibido no modelo de rato de Alport, há alguns efeitos benéficos. Há uma melhoria global da morfologia da membrana basal, contudo, ainda se observa um significativo desaparecimento dos processos das pedicelas. Assim, o FCT-βΙ pode melhorar a morfologia da MBG por redução da taxa da acumulação da matriz, mas não tem um efeito sianificativo nos mecanismos subjacentes ao processo de apagamento dos que os inibidores promovam melhorias processos das peaiceras. Isto significa de FCT-βΙ dados isoladamente, embora , não terão provavelmente sucesso na melhoria de todas as característícas do síndroma de Alport na mutaçao ou outros desses distúrbios. Em rasos com o dupl a, com 10 semanas de idade, a maior parte dos proces SOS Cl 3. S pedice las Pcire cem ή ο ττή ^ "i c· i x w x- nto. ij. f contudo há uma relau iva 3. c iim u 1 a ç ã c 0.3. matriz na MBG. Se se tratarem estes mes: mos an ima is com qua z quer um dos í ] OF· i _u r/ _i ^dore: 3 de H J- ut ilizados, c oraeçar do às 4 semanas d Θ 1 oade e colhe ;ita •oe C Θ cídcs às 10 seman 3 S de idade, cerc a de 30 '0 de gloi ΓΘ TU ^ os ΠΗ o se dis ti: agúem es truturalmente d os de r ates normai s. As sim, 3 m elhori 3 signíficariva η o s protocol os de tr atamen to aq ui de s cr ítos pode ser con sego íl da uti. .izan do in ibídor bo Q de FCT- a i F1 em combinação com os inibido res do re ceptor de ir itegri na Qipi.

Os dados das manchas de Northern nos ARNms específicos do rim, retirados quer de ratos com Alport ou ratos com duplas mutações tratados quer com qualquer um dos inibidores de FCT-βΙ, demonstram que há diferenças distintas entre a forma como quer PCT-βΙ, quer a mutação da integrina αΐβΐ afectam a expressão destas mensagens que codificam qualquer uma das moléculas da matriz que se acumulam na MBG. Os ARNms que codificam as metaloproteinases 2(MMP-2)) e os sues correspondents inibidores (incluindo TIMP-2 e 1IMP-3), que se acredita que modulam a taxa de rotação das moléculas que constituem a MBG, também são afectados de forma diferente nos ratos com Alport versus os ratos com duplas mutações tratados com qualquer um dos inibidores de FCT-βί. Especificamente, TIMP- 3 ^ t que e expressa em r lí vei s muit o altos nos ratos norma is, õd S L 3 suprimida H anto r os ratos som Aipo rt corno nos τ 310 S cor i dupl as mutaçõe 3 . o - :r ata mente ; ie ratos com duplas mutaç ões com inibidores de F C Γ-β 1 previne a supres são de ψ T Wj P - 3, T G 313 irando o A RNrn o ca —~ d nível s ráve_ _s aos oh ser oa.de s nos ratos de ontre ,1 O ^ r i c u r 3 21 39

Ao longo destas mesmas linhas, a expressão da laminina a2 é normalmente fortemente restrita à matriz mesângica. A deposição de laminina a2 é a primeira alteração molecular identificada em associação com o inicio da doença de Alport da MBG, mostrando ao mesmo tempo como se detecta primeiro o espessamento da membrana basal. Não se observa a deposição de laminina a2 na MBG de ratos com uma dupla mutação mesmo às 7 semanas de idade (figura 18. Grupo 1D) . A administração de iníbídores de FCT-βΙ aos ratos SV/J com Alport não inibe a deposição da laminina cx2 figura 18. Grupo 1C) . Isto sublinha outra diferença na forma como funciona a integrina αΐβΐ versus FCT-βι no retardamento da progressão da doença, dando conteúdo, com uma forte evidência, à razão pela queal um tratamento de combinação providencia benefícios sinérgicos.

Crê-se que a insuficiência de FCT-βί para inibir o desaparecimento dos processos de pedicelas dos podócitos está ligado directamente às observações respeitantes a laminina «2. As lamininas formam heterotrímeros que consistem em cadeias alfa, beta e gama. Na membrana basal, elas reticulam-se umas com as outras para formar uma superestrutura semelhante a uma folha que faz parte integrante da membrana basal. As lamininas são conhecidas por interagir com os receptores das inteçrinas e desempenham papéis importantes na diferenciação e na manutenção da função do tecido. Nos ratos normais, a MBG contém predominantemente lamínina-11, um heterotrímero das cadeias a5, β2 e γΐ. Esta laminina é conhecida por se ligar com uma elevada afinidade ao receptor da integrina ο3β1 na superfície dos podócitos. Muitos crêem que esta interacçâo arcuitectura do processos das que contêm a desempenha um papel chave na manutenção da complexo cito-esqueletal que forma os oedicelas. Os heterotrímeros de laminina 40 se ligam à integrina α3β1. Assim, a presença da cadeia i -> j.aminina-z na MBG pode resultar no processo de eliTn· - , ^ -sunaçao das pedicelas observado, por meio da inibição da i ngaçao ca integrina αΒβΙ ao seu substrato normal (larr.igpr>â_11 ^ posição Dem com a stirpe de como se mencionou, nos ratos com dupla mutação , ^ ' a deposr de laminina a2 está inibida, o se correlaciona p manutenção dos processos das pedicelas nesta ratos.

Observações adicionais mostram a relação , _ v v eorn a questão da fibrose intersticial. A fibrose intersti o-· i -‘-cj.al ocorre tarde na progressão do síndroma de Alport. kjq mocje20 de ratos 129 SvfJ com Alport, observa-se pouca fíhrnQO -nrQQ das 7 semanas, com uma idade média da morte às 8 semanas Nos ratos com dupla mutação, contudo, o início da fibrose é às 8 a 9 semanas e progride até à idade média da morte às 15 semanas. Assim, o rato com dupla mutação é um excelente modelo para o estudo da fibrose. Há um percurso significativo da fibrose nos ratos com dupla mutação e isto pode ser amplamente prevenido utilizando inibidores de FCT-βΙ.

Utilização de acordo com a presente invenção

Num aspecto, a presente invenção tem por cbjecto a utilização de inibidores (por exemplo, agentes de bloqueie) que bloqueiam ou de alguma forma inactivam a função do receptor de integrina αΐβΐ para a preparação de um medicamento para atrasar o início (conforme medido pelo aparecimento de níveis detectáveis de albumina do soro na urina, utilizando quer um teste de fita disponível comercialmente ou electroforese em gel e um processo de coloração em gel), retardar a progressão (conforme 41 determinado peia medição da taxa à qual os níveis de albumina aumentam na urina em função do tempo, conforme medido antes) ou mesmo a reversão da doença glomerular, particularmente a progressão da nefrite e/ou da fibrose glomerular. Isto inclui, por exemplo, pelo menos péptidos 9-mer de proteínas que se ligam ao receptor de integrina αΐβΐ, tal como, mas não se limitando a laminina, colagénio do tipo IV, fibronectina e entactina. A ligação de moléculas pequenas dentro do sítio do receptor/iigando do receptor αΐβΐ, pode ser criada com base em estudos do receptor de proteína/integrina αΐβΐ. Os anticorpos e os fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente ao sítio de ligação do receptor de integrina αΐβΐ pode ser utilizado na presente invenção. Estes anticorpos e fragmentos de anticorpos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, anti-idiotipo, derivados de animais, humanizados e quiméricos.

Um agente (ligando artificial) que bloqueia o sítio de ligação para o receptor de integrina αΐβΐ, pode ser utilizado nas composições farmacêuticas da presente invenção. Exemplos desses agentes incluem, mas não se limitam a um anticorpo de neutralização, péptidos, fragmentos proteolíticos ou similares. Crê-se que esses agentes bloqueiam a transdução do sinal através do receptor. A eficácia desses tratamentos pode ser determinada avaliando os efeitos a jusante na expressão do gene de, por exemplo, FCT-βΙ, fibronectina, cadeias de alminina, etc. por meio das alterações morfométricas nas membranas basais glomerulares e/ou por melhoria na seiva glomerular comc se evidencia por um decréscimo na taxa de inicie e de progressão da proteínúría 42

Um anticorpo que neutraliza a função da íntegrina αΐβΐ tal como acontece nos exemplos e na figura 10. Come exemplo para ilustrar que um agente solúvel capaz de bloquear a ínteraeção da integrina αΐβΐ com o seu ligando produziria os mesmos efeitos nas patogenias das doenças renais que a mutação {knockcut) do gene al, obtendo-se c anticorpo descrito em Fabbri et ai., Tissue Antigens, 43:47-51, 1996. Injectou-se este anticorpo (400 ng/injecção, três vezes por semana, intraperitonealmente) e mostrou que inibia os danos da base glomerular, no modelo de rato com Alport, praticamente da mesma maneira que se observou nos mutantes duplos.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto a ucilizaçâo de agentes que fazem diminuir o nivel de FCT-βΐ como um meio para retardar a acumulação de matriz na progressão da doença glomerular, particularmente na glomeruionefrite progressiva. Assim, esses agentes podem ser utilizados para tratar pacientes com síndroma de Alport e pacientes com diabetes mellítus dependente de insulina, assim como outros que sofrem de glomeruionefrite particularmente progressiva ou qualquer uma dessas doenças caracterízadas pela expansão da matriz mesângica, a proliferação das células mesangiais, a deposição da matriz na membrana basal glomerular resultando no espessamento, adelgaçamento, seccionamento ou alguma dessa irregularidade, apagamento dos processos das pedicelas dos podócitos ou alguma combinação das manifestações listadas antes, combinando-se todos numa forma comum da fibrose renal (a prevenção para a qual a terapia de combinação dos inibídores de integrina αΐβΐ e os inibidores de FCT-βΙ sâo particularmente eficazes). Com este fim, as terapias anti- paralelas, tal como est ao iscritas técnica, poaem ser utilizadas para bloquear a expressão do

-BI r-ι -q, ad 43 proteína do receptor ae integnna αΐβΐ. Pode-se utilizar una variedade de agentes, sintéticos ou naturais.

Um agente que neutraliza a capacidade da citocina do FCT-βϊ para interagir com o seu receptor pode ser utilizado nas composições farmacêuticas da presente invenção. Exemplos desses agentes incluem, mas não se limitam a um anticorpo de neutralização, um inibidor de calcineurina 'isto é, micrólido) tal como os descritos na patente de invenção norte-americana U.S. No. 5.260.301 (Nakanishi et al.) (por exemplo, FK506 ou tacrolimus e compostos estruturalmente relacionados) , um receptor solúvel tal como o receptor recombínante de FCT-βϊ solúvel descrito na publicação da patente internacional WQ 98/48024 (Biogen Inc.) (por exemplo, uma proteína de fusão solúvel, quimérica FCT-plRII/lgGl) , um fragmento de péptido do receptor ou algum desses fragmentos que têm a capacidade de se ligarem irreversivelmente (ou estavelmente) com a citocina e inibem a sua capacidade para se ligarem com o receptor. Além disso, pode-se utilizar um agente que inibi a capacidade de FCT-βϊ de transduzir os sinais para o núcleo. A eficácia desses tratamentos pode ser determinada per meio da avaliação dos efeitos a jusante na expressão dos genes de, por exemplo, fibronectina, cadeias de laminina, etc., por meio das alterações morfometricas nas membranas glomeruia de início basais glomerulares e/ou por melhoria da seiva como fei evidenciado per una diminuição na taxa e de progressão da proteinúria.

Num exemplo, FK utilizado para inibir • 06 ou a cicloesporina Ά pode ser a porção de calcineurina ao receptor de FCT-βϊ, tal como tem si Q. O dOOD Ç3S CÍO ΙΊΓΓ i (Wang et al Miller et al., Endocrinol, 3 descrito para algum , Cell 86: 435-444 1926-1934, 1989) e ís outraí 1996 e 44 âssim (através de um mecanismo desconhecido) o início da proteinúría, tal como tem sido descrito para as mesmas doenças dc rira (Callis et al., Pediatr. Nephrol, 8: 140-144, 1992). Essas recomendações não foram feitas para o síndroma de Alport, diabetes meilítus ou para as doenças associadas com um aumenro da matriz extracelular nos gloitiérulos renais, antes da presente invenção.

Em particular, a presente invenção ilustra o efeito de uma terapia de combinação da inibição do receptor de integrina αΐβΐ e de FCT-βΙ com um efeito sinérgico na prevenção tanto das doenças glomerulares como na fibrose associada com o síndroma de Alport. Segue-se que outras doenças que envolvem a expansão da matriz mesângica, a proliferação das células mesangiais, os danos da membrana basal glomerular, conforme se pode manifestar por um ou mais de espessamento da MBG, adelgaçamento- da MBG, seccionamento da MBG, desaparecimento dos processos das pedícelas dos podócitos ou qualquer combinação dos anteriores também beneficiará deste tratamento adicional, ilustram a eficácia do tratamento de combinação na prevenção de fibrose do interstício do túbulo no síndroma de Alport. A fibrose é uma via comum, crê-se que o mecanismo é idêntico para todas as doenças renais nas quais a fibrose está envolvida. Por isso a eficácia desta terapia de combinação no tratamento da fibrose deve ser aplicável a todas as formas de fibrose renal, independentemente da causa subjacente que deu início à fibrose.

Os agentes utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administrados em combinação cora um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Os agentes da presente invenção são formulados nas composições farmacêuticas (isto é, formulações) a serem administradas a 45 um mamífero, tal como um. paciente humano, numa variedade de fornas adaptadas à via de administração escolhida. As formulações norma Imer. te incluem os veiculc-s apropriados para administração parentérica (incluindo a administração subcutânea, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa) ou outros processos compatíveis com a estabilidade dos agentes.

Os veículos apropriados, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, podem estar sob a forma de líquidos, semi-sólidos, sólidos finamente divididos ou as suas combinações. As formulações apropriadas para administração parentérica compreendem, de forma conveniente, uma preparação aquosa esterilizada do agente ou dispersões de pós dispersáveis compreendendo o agente, que são preferencial mente isotónicos com o sangue do receptor. Os agentes isotónicos que podem ser incluídos na preparação líquida incluem açúcares, tampões e cloreto de sódio. As soluções do agente podem ser preparadas em água, eventualmente misturadas com um tensioactivo não tóxico. As dispersões do agente podem ser preparadas em água, etanol, um poliol (tal ccmo glicerol, propileno-glicol, poiietileno-glicois líquidos e similares), óleos vegetais, ésteres de glicerol e as suas misturas. Estas últimas formas de dosagem são esterilizadas e estáveis r.as condições de fabrico e de armazenagem. Ά fluidez necessária pode ser conseguida, por exemplo, utilizando iiposomas, utilizando a dimensão de partícula apropriada no caso de dispersões ou utilizando isioactivos. A esterilização uma prepar; processo convencem quida pode ser conseguida por qualquer hioactividade do :e que pr 'eserve Lmente por esteri s pref< eríd os pari ílli v a c u o incluem a secagem daí soluções 46 esterilizadas injectáveis. Pode-se evitar a combinação microbiana subsequente utilizando vários a crentes antimrcrobianos, por exemplo, agentes antibacterianos, itivirais anti- fúngicos incluindo parabéns, clorobu

tanol, tenol, ácido sórbico, timerosal e similares. A absorção dos agentes por um período prolongado pode ser conseguida incluindo agentes para retardar, por exemplo, mono-estearato de alumínio e gelatina.

Para além dos ingredientes mencionados antes, as formulações da presente invenção podem ainda incluir um ou mais ingredientes acessórios incluindo diluentes, tampões, ligantes, desintegrantes, agentes tensioactivos, espes-santes, lubrificantes, conservantes (incluindo anti-oxidantes) e similares. As formulações podem apresentar-se, de forma conveniente, numa forma de dosagem unitária e podem ser preparados por qualquer um dos processos bem conhecidos na técnica de farmácia.

As dosagens úteis (isto é, quantidades efectivas providenciam c efeito desejado) dos agentes aqui descritos, podem ser determinadas por comparação da sua actividade in vitro e a actívidade in vivo em modelos de animais. Os processos para a extrapolação das dosagens efectivas em rates e outros animais para seres humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, doses de cerca de 150 mg por kg até cerca de 300 mg por kg, duas vezes por dia de agente para injecç ão intravenosa. As doses apropriadas para serem admíní stradas são, em geral, as que são suficientes para produz ir um efeito des ejado, tal como por indução de um aument o demonstrável da expressão de enzimas da fase II ou out ras características aqui descri tas. 47

EXEMPLOS

Nos exemplos providencia-se uma descrição de deis modelos de animais diferentes. 0 primeiro é um modelo de rato de "Alport" que não expressa colagénio o/3 (IV) e é normal para a integrina ecl e que está descrito em Cosgrove et al., Genes Dev., 10: 2981-2992, 1996 e o segundo, que é referido como o rato de "mutação (knockout) dupla", que derivou por cruzamento do rato Alport com um rato que era nulo para o gene de integrina al. Há diferenças entre o rato Alport e o de mutação dupla que servem para ilustrar a eficácia do bloqueio da função da integrina αΐβΐ no retardamento de doenças glomerulares. Estes efeitos estão descritos em detalhe. 0 rato de Alport é um rato 129Sv/j com antecedentes geneticamente puros e o rato com dupla mutação tem como antecedentes ratos 129 Sv e é 97,5 % puro. lima excepção a isto diz respeito os animais que foram utilizados para gerar as figuras 4, 5 e 6. Realizaram-se estas experiências no início da história do modelo de rato com Alport e assim foram gerados por cruzamento de machos quiméricos com fêmeas C57 61/6 e cruzando os heterozigotos resultantes para gerar os ratos homozigótícos com Alport que seriam a geração F2. Esta é a mesma geração de animais utilizados na descrição original do modelo de ratos com Alport (Cosgrove et al., Genes Devei., 10: 2981-2992, 1996). Isto é habitual para os primeiros estudos de mutações dos genes, dado que acelera a identificação do fenotipo com rm atação. Os resultados obtidos destes F2', no que respeita 3 indução específica de ARNm são consistentes com os resulrados obtidos pa ra os mutantes 129Sv/j puros. Deve nc )tar-se que t π n -a „ -, „ vUuclO cl O experiências que providenciam um .a análise 48 comparativa dos rates corri Alport versus os ratos com dupla mutação foram res.lizad.as em estirpes congénitas.

Examinou-se o papel de FCT-βΙ na progressão da doença renal, assim como o desenvolvimento da fibrose em ambos os modelos de animais. Isto foi feito examinando dois inibidores diferentes de FCT-βΙ que funcionam de modos muitos diferentes. Utilizando dois inibidores diferentes (FK506 e um receptor de FCT-βΙ solúvel) faz-se prova de que c efeito é devido à inibição deFCT-βΙ miais do que um efeito colateral do agente utilizado. FK506 pode ser terapêutico no tratamento da fibrose progressiva relacionada com a sobre-expressão de FCT-βΙ.

No decurso da análise des diferentes modelos de animais e dos tratamentos de fámacos descritos, há um curso de avaliação específico que permanece constante ao longo do tempo. Avaliaram-se três áreas diferentes. Primeiro examinou-se a função renal o que forneceu uma avaliação da integridade global do filtro glomerular. Isto foi feito examinando o resultado da albumina do soro na urina. Em segundo lugar examinou-se a integridades estrutural do tecido tanto à luz como através de um microscópio electrónico. Utilizaram-se ambos os processos de microscópio de transmissão e de varrimento electrónico. Estes processos foram desenvolvidos para determinar o grau de histopatologia renal nestas diferentes condições. Finalmente, realizaram-se experiências de análise molecular para examinar quais as alterações que tiveram lugar em genes específicos e nas suas correspondentes proteínas, em resultados destas condições diferentes. Examinaram-se olhando para os ARNs específicos utilizando as análises de mancha de Northern, híbridaçio in situ e protecção de RNase e utilizando a detecção imuno-histoquímica para proteínas 49 especificas. Como os processos específicos se repetem para as análises dos diferentes modelos de animais e os diferentes tratamentos com fármacos em diferentes modelos de animais, procurando evitar redundâncias, fixou-se que os processos eram realizados de forma idêntica (como é expectável na prática do dia a dia) em tcdos os casos e por isso descrevem-se só uma vez e depois são referidos nos exemplos específicos posteriores. Há uma variedade de técnicas e processos alternativos disponíveis para os especialistas na matéria, que permitirão, do mesmo modo, uma realização, com sucesso, da presente invenção. Todos os reagentes foram obtidos na Sigma Chemical Ca., St. Lcuis, MO, a menos que seja especificado de outra forma. A STF utilizada em todos os estudos aqui descritos foi comprada sob a forma de comprimidos, cada comprimido foi reconstituído em 200 mL de água para fazer uma STF a pH 7,4, Sigma Chemical Co, St. Louis MO, Produto número P-4417.

Processos I. Função renal A. Análises das proteínas: as medições iniciais das proteínas urinárias fcram realizadas utilizando Aibustix (Miles Laboratories, Elkhart, IN) e lendo as quantidades relativas da car ta de cor fornecida com o kit. As amostras de urina foram colhidas a intervalos semanais 0,5 pL iiTSoCj-onscios dqx~ elect^oforese através da desnaturação em q-0 ί r; de acrilarnída a 10 %. A pr oteína dos géis foi corada com azul de coomassíe e foi fc tografada. 50

Utilizou-se albumina se soro de bovino como um padrão de peso molecular. II, Integridade estrutural A. Microscopia de transmissão electrónica: Picou-se córtex renal externo fresco no seio de parafcrmaldeído a 4 %, deixou-se a fixar durante 2 horas e armazenou-se a 5 °C no seio de STF (pH 7,4). Lavou-se bastante o tecido (5 vezes durante 10 minutos, a 4 °C de cada vez) com tampão de Sorenson 0,1 M (o tampão de Sorenson foi preparado combinando 100 mL de fosfato monobásico de sódio 200 mM e 400 mL de fosfato dibásico de sódio 200 mM com 500 mL de água e ajustou-se para pH 7,4) e fixou-se depois em tetróxido de ósmio a 1 % em tampão de Sorenson durante 1 hora. Depois desidratou-se o tecido em etanol graduado (a 70 % e depois a 80 %, depois a 90 %, depois a 100 % durante 10 minutos de cada vez) e finalmente em óxido de propileno e embebeu-se na resina epoxi Poly/Bed 812 (Polysciences, Inc., Warrington, PA) no seguimento dos processos descritos pelo fabricante. Em resumo, misturou-se 42 ml de polybed 812 com 26 mL de anídrído dodecilsucciníco (DDSA, Polysciences, Inc.) e 24 mL de anidro metílico nádico (Polysciences Inc.). Adicíonou-se um mililitro e mexo de 2,4,6 tri (dimetil-aminometil) fenol corno catalisador e a resina activada congelada em alíquotas de 10 mL até ser necessário para embeber o espécimen. Os glomérulos foram identificados em secções de 1 pm (mícron) coradas com azul de toluidina e cortaram-se secções finas de 70 nin de espessura (manómetro) utilizando um ultramícrocortador Reichert Jung Ultracut E (Cambridge Instrument Co, Viena, Áustria). Montaram-se as secções em redes e coraram-se com acetato de uraníio e citrato de chumbo utilizando processos bem conhecidos. Examinaram-se as secções montadas nas redes 51 e fotografaram-se utilizando um microscópio electróníco Phillips CMl B. Microscopia electrónica de varrimento: Fixaram-se pequenos pedaços ícubos de aproximadamente 2 min) de córtex de rim em glutaraldeído tamponado com fosfato a 3 %, depois voltou a fixar-se em tetróxído de ósmio tamponado com fosfato a 1 %. Desidrataram-se então as amostras em etanóis graduados e secou-se no ponto critico no seio de dióxído de carbono. Craquearam-se então os cubos perssionando-os com a extremidade de uma lâmina de barbear e montaram-se com cola em toros com a superfície craqueada voltada para cima. A superfície foi revestida com ouro/paládio utilizando processos bem conhecidos e visualizou-se com um microscópio de varrimento electróníco. C. Corante de metenamina e prata de Jones: A coloração de Jones foi realizada em rins embebidos em parafina utilizando o processo descrito por 3ums e Bretschschneider,

Thín ís in: plastic embedding of tissue for light micros-copyç Educationai Products Division, American Society of Clinicai Pathologists, Chicago, IL, pp. 24-25, 1981. III. Análise molecular Â. Análise de mancha de Northern: Retíraram-se os rins e foram congelados em azoto líquido e moídos para ficarem sob a forma de pó em azoto líquido utilizando um moinho e um malho. Solubilizou-se o pó no seio de reagente de TRIZOL (Gíb-Co/BBL, Grand Island, NY) utilizando 5 mL de reagente por rim. Extraiu-se o ARN celular total de acordo com as instruções do fabricante. Fraccíonou-se vinte microgramas (20 gg) de ARN em gel de agarose/formaldeídc/MOPS (ácido (3-(N-morfolino)propano-suifónico a 1 % por electroforese a 52 8OV durante 4 horas. Moeram-se os géis em água durante 4 5 minutos e transferiram-se para Hy-bond N (nylon não carregado, New England Nuclear, Inc., Boston, MA) por mancha capilar, durante a noite utilizando acetato de amónio 750 mM (em água) como tampão de transferência. O ARN foi cruzado por UV com o sangue utilizando um Stratalínker (Stratagene, inc., La Jcila, CA). As manchas foram pré-hibridadas numa solução constituída por 50 I de formatnida, ].0X de solução de Denhardt, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM, a pH 7,4, SDS alie 200 pg/inL de esperma de salmão tratado por ultra-sons e desnaturado (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). As sondas (fragmentos de sondas de ADNc marcadas com j2P) foram marcadas por iniciação aleatória até a uma

concentração de 109 cpin/pq utilizando um kit de marcação de ADN para iniciação aleatória (Boeringer Mannheím, Indíanapolis, IN). Os tampões de pré-hibridação e de hibridação consistiram em 5X de tampões salinos de citrato de sódio (SSC), 5X solução de Denhardt, sulfato de dodecílo e sódio (SDS) a 0,5 % e 200 200 pg/mL de esperma de salmão tratado por ultra-sons e desnaturado. Os filtros foram pré-hibridados durante pelo irienos 5 horas e depois hibridaram-se durante a noite utilizando 1 milhão de DOM (desintegrações por minuto) de sonda por mL de solução de hibridação. Lavaram-se então os filtros com uma alta severidade (duas vezes durante 30 minutos de cada vez a 65 °C numa solução constituída por NaCl 300 mM, citrato de sódio 30 mM e sulfato de dodecílo e sódio a 0,2 I em água) e expôs-se a um filme de raios X. A qualidade das preparações de ARN e a consistência da carga foi avaliada por géis de coloração com brometo de etídio e varrimento das bandas ríbosomaís de ARN 18S e 2 8 S utilizando um instrumento com um sistema de produção de imagens digitais Gel Imager 2000 e um package de software (Applied Imagíng, Santa Clara, CA). As relações apropriadas das bandas 53 ríbosomais confirmaram que as preparações de ARN eram de elevada e consistente qualidade. Δ digitalização densitométrica quantitativa confirmou não mais do que 10 % variância no carregamento da amostra. Estes instrumentos foram utilizados em vez de uma sonda de controle pelas preocupações de que as alterações na fisiologia das células concomitantes com a fibrose progressiva tornam essas sondas de controlo não fiáveis. As diferenças quantitativas na expressão foram avaliadas por análise de fósforo-imagem utilizando um produtor de imagens por fósforo BioRad GS-525 (Bio Paa, Inc., Hércules. CA} e subtraiu-se da hibridação inicial.

Isolaram-se as sondas a partir de uma biblioteca de ADNc estirado em 5' de rim de murino (Clonetech) por amplificação por RCP utilizando a sequência publicada para os ADNcs de colagénio de diferentes membrana s basais e as das proteínas associadas. Para as sendas de colagénio da membrana basal, amplificou-se a sequência que codifica o domínio NC I conservado. Os iniciadores e as condições utilizadas foram idênticos aos utilizados por Mirier e Sanes, J. Cell Biol., 127: 879-891, 1994. Para C0L4A1 do colagénio, os iniciadores foram (Muthukumaran et al., J. Biol. Cheia., 264: 6310-6317, 45 1989): num sentido, 5'TCTGTGGACCATGGCTTC3' (SEQ ID NO: 1); em sentido contrário, 5'TTCTCATGCACACTTGGC3' (SEQ ID NO: 2). Para COL4A2 do colagénio, os iniciadores foram (Saus et al., J. Biol. Chem., 264: 6318-6324, 1589): num sentido,

5' GGCTACCTCCTGGTGAAG3' (SEQ ID NO: 3); em sentido contrário, 5' TTCATGCACACTTGGCAG3' (SEQ ID NO: 4). Tanto CQL4A1 como COL4A2 foram amplificados nas mesmas condições. Submeteram-se viríôes (a x IO*5; a 35 ciclos de RCP utilizando um início quente (10 minutos a 95 °Cj, depois 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos e 72 °C 54 durante um minuto. As sondas foram suh-clonadas e verificadas por análise das sequências de ADN.

As sondas para as proteínas associadas com a membrana Dasal foram, amplificadas a partir da mesma biblioteca que a dos eoragémos da membrana basal. Os iniciadores foram retirados da sequência 3' . Para a proteína do núcleo de HSPG, os iniciadores foram (Noonan et al., J. Biol. Chem., 263: 16379-16387, 1988): paralelo, 5'CGGGCCACATTCTCC3' (SEQ ID NO: 5); anti-paralelo, 5'GGAGTGGCCGTTGCATT3' (SEQ ID NO: 6) . Para a lam.in.ina B2, os iniciadores foram (Sasakí e Yamada, J. Biol. Chem., 262: 17111-17117, 1987): paralelo 51ACCAGTÃCCAAGGCGGA3' (SEQ ID NO: 7); anti-paralelo, 51TCATTGAGCTTGTTCAGG3' (SEQ ID NO: 8) . Para a lamínina Bl, os iniciadores foram (Sasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 84: 935-939, 1987): paralelo 5'TAGAGGTTATTTTGCAGCAGA3' (SEQ ID NO: 9); anti-paralelo 5' TTGGATATCCTCATCAGCTTG3' (SEQ ID NO: 10). Para a forentactina, os iniciadores foram (Mann et al., EMBO Journal, 8: 65-72, 1989): paralelo 5'GTGGTTTACTGGACAGACATC3' (SEQ ID NO: 11), anti-paralelo, 5 ’ CCAATCTGTCCAATAAAGG3' (SEQ ID NO: 12). Para a cadeia de laminína A, os iniciadores foram (Duetzmann et al., Eur. J. Biochem., 111: 35-45, 1988): paralelo 5' ACACACTCCAAG000ACAAAAGCMG3' (SEQ ID NO: 13); anti-paralelo 5'GAGGGAAGACTCCTTGTAGGTCAA3' (SEQ ID NO: 14). Para a laminína S, os iniciadores foram (Hunter et al., Nature. 338: 229-234, 1989): paralelo, 5'GCAGAGCGGGCACGGAGC3' (SEQ ID NO: 15), anti-paralelo 5'TGTACCTGCCATCCTCTCCTG3' (SEQ ID NO: 16) . As condições da RCP foram idênticas às utilizadas para as cadeias anteriores de colagénio do tipo IV.

As sondas para MMP-2, Timp2 e Timp3 foram isoladas utilizando o ARN total de embriões de ratos com 13 dias por meio de RCP-TI. O conjunto de iniciadores para MMP-2 55 amplifica um fragmento de 237 pb a partir do ARNm (Reponen et al., J. Biol. Ckem., 267: 7856-7862, 1992) e incluiu um iniciador a montante 5'CCC CTATCT ACA CCTACA CCA3' (SEQ ID NO: 17) e um iniciador a jusante 51TGT OAC TGT CCG CCA AAT AAA3' (SEQ ID NO: 18). 0 conjunto de iniciadores para Timp-2 amplifica um fragmento de 195 pb do ARMm (Shimizu et al., Gene, 114: 291-292, 1992) e incluiu um iniciador a montante 5’CAG AAG AAG AGC CTG AAC CAC A31 (SEQ ID NO: 19) e um iniciador a jusante 5'GTA CCA CGC GCA AGA ACC3' (SEQ ID NO: 20) . 0 conjunto de iniciadores para Timp-3 amplifica um fragmento de 337 pb do ARNm (Apte et al., Developmental Dynamics, 200: 177-197, 1994) e incluiu um iniciador a montante 5'GGTCTA CAC ΤΑΤΤΛΑ GCA GAT GAA G3' (SEQ ID NO: 21) e um iniciador a jusante 5'AAA ATT GGA GAG CAT GTC GGT (SEQ ID NO: 22). Para as três sondas, um mierograma do ARN total foi transcrito reversamente utilizando GibCo Superscrípt mais transcríptase inversa e o iniciador a jusante, de acordo com os protocolos descritos pelo fabricante. Um décimo da reacçâo foi submetido a 40 ciclos de aranque a quente de RCP utilizando PFU polimerase (Stratagene, Inc.). A sonda de FCT-βΙ foi uma oferta de H. L. Moses (Miller et al., Mol. Endocrínol, 3: 1926-1934, 1989), excepto para a protecção de RNase que requer uma sonda humana. Para esta sonda, amplificou-se um fragmento de 24 pares de bases de FCT-βΙ por RCP a partir de uma biblioteca de ADNc de rim humano (Clonetech, Paio Alto, CA) . Os conjuntos de iniciadores utilizados foram GCA GAA GTT GGC ATG GTA G (SEQ ID NO: 23) (inferior) e GGA CAT CAA CGG GTT CAC TA (SEQ ID NO: 24} (superior). 0 fragmento foi novamenre amplificado com PFU polimerase (Stratagene, Inc.) e uma extremidade cega ligada ao plasmido pBluescrípt 3R+. 56 B. Hibridação in si tu: Os rins foram inicialmente fixados por uma perfusâo transcardíaca lenta (utilizando paraiormaldeído a 4 % no seio de STF) . Os animais levaram primeiro uma anestesia profunda utilizando Avertin (2,2,2-tribromoetanol, Aldrích Chemical Co., Miiwalkee, Wl) . a cavidade torácica foi aberta e fez-se um pequeno orifício no ventrículo direito por meio de uma punção com uma agulha de tuberculina para permitir a saída do perfusado. Inseriu-se no ápice do ventrículo esquerdo uma segunda agulha de tuberculina ligada a uma seringa de 30 mL contendo tampão de perfusâo. Perfundiu-se um mililitro de fixador por grama de peso do corpo a uma taxa de cerca de 3 mililitros por minuto. Os rins fixados adequadamente estavam firmes e tinham uma aparência marmoreada. No seguimento da perfusâo, retirou-se a cápsula renal com fórceps de íris, cortaram-se os rins longitudinalmente numa das metades (fazendo a bissectriz da pélvis, medula e córtex) e colocou-se em fixador a 4 °C durante mais uma hora. As metades fixadas foram embebidas em parafina, cortaram-se em pedaços de 6 μιη e transferiram-se para lâminas de microscópio SUPERFROST PLU3 (Fisher Scíentific, Inc., Pittsburg, PA). As lâminas foram aquecidas num equipamento de aquecimento de lâminas a 60 cC durante 20 minutos e armazenaram-se a 4 °C até serem ucilizadas (as lâminas são úteis durante até seis semanas). Os rins da ninhada de controlo e dos ratos com Alport foram embebidos lado a lado para controlar as diferenças subtis que podem ter ocorrido durante o processo de hibridação.

As lâminas foram aquecidas num forno de vácuo a 60 °C durante i hora, depois foram desenceradas por meio de 3 lavagens sucessivas com xilenos de 2 minutos. O tecido foi desidratado no seio de etanol, foi desproteinado por incubação em HC1 0,2 N durante 15 minutos, lavou-se com STF e digerido com 3 ug/mL de proteinase K (Boehringer 57

Mannheiin, Indianapolis, IN) durante 10 minutos a 3? °C.

Parou-se a digestão por lavagem em 2 mg/mL de glicina no seio de STF. No segui.mento da desidratação do tecido em soluções de etanol graduado (70 %, 80 %, 90 %, 100 % durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente), o tecido foi pré-híbridado, hibridado e lavado de acordo com os protocolos descritos, com o kit de híbrídação Genius in situ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) com as modificações que se seguem. Tanto nas soluções de pré-hibridação como nas de híbridação, incluiu-se 10 mg/mL de ARNt de fermento de padeiro extraído de fenol/clorofórmio. Esta etapa reduziu significativamente o sinal não especifico. No seguimento da híbridação, o tecido foi lavado duas vezes em 2x SSC a 50 °C, depois foi digerido com RNase A durante 6 minutos, a temperatura ambiente. Determinou-se a quantidade de RNase A para cada sonda (intervalo de 200 ng/mL a 5 pg/mL) . As sondas de controlo negativo incluem a sequência de codificação para a galactosidase β bacteriana ou a neomicina fosfotransferase. Todas as sondas tinham aproximadamente 200 pares de bases de comprimento, foram clonados no sitio Seal de Blue Script SK+ (Stratagene, Inc., LaJolla, CA) e transcritos (depois da linearização) do lado T3. A única excepção foi o FCT-βΙ, que tinha 974 pares de bases e foi clonado num vector pmT. C. Ensaio de protecção de RNase: Realizaram-se experiências utilizando um kit RPAI1 (Ambion, Inc., Austin, TX) seguindo os protocolos fornecidos com o kit. Para uma sonda, ainplíficou-se um fragmento de 264 pares de bases de FCT-61 por meio de RCP de uma biblioteca de ADNc de rim humano (Clonetech, Paio Alto, CA) , Os conjuntos de iniciadores utilizados foram GCA GAA GTT GGC ATG GTA G (SEQ 1D NO: 25) (inferior) e GGA CAT CAA CGG GTT CAC TA (SEQ 1D NO: 26) (superior). O fragmento foi novamente ampliado com 58 PFU polimerase (Stratagene, Inc.) e a extremidade cega ligada ao plasmido pBluescript SK+ (Stratagene, Inc.). A sonda antí-paraleia foi gerada a partir do promotor T7. D. Análises de imunofluorescência: Retirou-se o rim fresco, cortou-se ein secções transversais com a espessura de 3 mm, embeberam-se no composto aquoso Tissue Tek OCT (inúmero do produto 4583, Miles Laboratories, Elkhart, IN) e congelaram-se colocando num congelador a -150 °C. Corataram-se as secções em cortes de 3 mícrons utilizando um crióstato HM505N do tipo Microm (Zeiss, Inc., Walldorf, Alemanha) e descongelou-se em lâminas revestidas com poli-L~lísina. As lâminas foram fixadas durante 15 minutos, embebendo-as quer em etanol frio (-20 °C) a 95 %, se for para serem utilizadas para corar com anticorpos específicos do colagénío da membrana basal ou com acetona fria (20 °C) para corar com anticorpos específicos para as proteínas associadas à membrana basal. Deixou-se que as lâminas secassem ao ar durante a noite e armazenaram-se exssicadas a -80 °C até serem utilizadas.

Deixou-se que as amostras atingissem a temperatura ambiente, depois lavaram-se três Vezes no seio de STF (a pH 7,4) à temperatura ambiente. Para a coloração com anticorpos contra os colagénios do tipo IV, o tecido foi pré-tratado com glícína 0,1 M e ureia 6M (a pH 3,5) para desnaturar a proteína e expôs-se aos sítios antígénícos. As diluições apropriadas (determinadas empiricamente) dos anticorpos primários foram aplicadas à amostra e deíxou-se reagir durante 3 horas a 5 °C numa caixa humidifiçada. Os anticorpos foram diluídos numa solução de leite em pó desnatado a 5 I no seio de STF (a pH 7,4). A utilização de leite em pó desnatado reduziu substanciaImen t e a fluorescência iniciai. Lavaram-se as amostras quatro vezes 59 no seio de STF (a pH 7,4} durante 10 minutos de cada vez, à temperatura ambiente para eliminar o anticorpo primário e depois reagiram com o reagente secundário apropriado conjugado com FITC. Utilizaram-se todos os reagentes secundários numa diluição de 1:100, utilizando leite em pó desnatado a 7 % em STF coiro o diluente. Deixou-se os reagentes secundários reagirem durante 2 horas a 4 °C. Lavaram-se então as lâminas quatro vezes com STF frio (a pH 7,4), seguido da aplicação de meio de montagem anti-desccloração (Vectcr Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Selaram-se as amostras em tiras estreitas cobertas de vidro utilizando um verniz das unhas claro. As lâminas foram fotografadas com um aumento de 1000X. Realizou-se a coloração com metenamina e prata de Jones em especímenes embebidos em. plástico. 0 antí-soro de cabra contra as cadeias de C0L4A1 e COL4A2 foi comprado na Southern Biotechnology, Inc., Bírmíngham, AL. Este anticorpo foi ensaiado pelo fabricante quanto à reactívidade cruzada e produziu um modelo de coloração nos glomérulos, o que é consistente com o observado para outras preparações de anticorpos contra essas cadeias (Miner e Sanes, J. Cell. Bíol., 127: 879-891, 1994), O anticorpo de proteoglicano de sulfato anti-heparína (HSPG) é um anticorpo monoclonal de rato contra a proteína nuclear de HSPG a partir de tumor de rato EHS. O fabricante ensaiou o anticorpo quanto à reactívidade cruzada com laminina, colagénío do tipo IV, fíbronectína e entactína por ímuno-ensaio de mancha de Western e manchas em pcntos (Chemicon International, Temecula, CA) e conforme está descrito noutro sítio (Horíguchi et ai., J. tíistochem. Cytcchem., 37: 961-970, 1989). Os anticorpos antí-lamínina-1 são um antí-soro de Coelho, ruríficou-se o imunogénio a partir da membrana basal de EHS e comprou-se na Sigma 60

Immune-chemicals (St. Louis. MO). O ímuno-ensaio das manchas de pontos, realizado pelo fabricante (Sigma), confirmou a ausência de reactividade cruzada com o colagénío IV, fibronectína, vítronectina e sulfato de condroítína dos tipos A, B e C. A antí-fíbronectína é um antí-soro de coelho criado contra a fibronectina purificada a partir de plasma humano. Foi testada pelo fabricante (Sigma Immunochemicals) contra a reactividade cruzada com colagénio do tipo IV, laminina, vítronectina e sulfato de condroítína do tipo A, B e C utilizando o ímuno-ensaío de manchas por pontos. A anti-entactina é um anticorpo monoclonal de rato produzido utilizando entactína derivada de EHS como imunogénio. Este reagente foi comprado na [Jpstate Biotechnology Incorporated, Lake Placid, NY e foi ensaiado quanto à imuno-reactividade apropriada assim como para a ausência de reactividade cruzada com outros componentes principais da membrana basal, por meio de análise se mancha de Western (Ljubímov et al. , Exp. Cell Res., 165: 530-540, 1986). A imunofluorescência e as imagens da coloração com corante de Jones foram registadas e tratadas utilizando um microscópio de fluorescência Olympus BH2 RFLA com uma interface com um sistema de análise de imagens Applied Imaging CytoVision Ultra (Applied Imaging Inc.) . As imagens foram captadas utilizando uma câmara de vídeo a preto e branco de elevada resolução. Estas imagens foram modificadas utilizando o software do sistema. No tratamento das imagens, tomou-se cuidado para fazer uma aproximação muito próxima da fluorescência observada dírectaraente no microscópio. E. Detecção de imuno-peroxidase: Utílízou-se o processo de detecção de imuno-peroxidase na imuno-coloração 61 para ο FCT-βΙ nos glomérulos, assim como a fibronectína e o colagénio do tipo I no interstício do iúbulo. 0 anticorpo do colagénio do tipo I é um anticorpo anti-rato de coelho e foi comprado na Biogenesís, Inc. (Sandown, NB). 0 antí-soro foi utilizado numa diluição de 1:100 para a coloração da imuno-peroxidase. O anticorpo de fibronectína utilizado foi o mesmo que para a coloração de imuno-fluorescência (um antí-soro de fibronectína anti-humano de rato da Sigma Chemical Contpany, St. Louis, MO) e foi utilizado a uma diluição de 1:100. Os reagentes secundários foram anticorpos anti-coeiho biotinílados, comprados nos Vector Laboratories (Burlíngame, CA) e foram utilizados numa diluição de 1:100. 0 tecido foi embebido em parafina (utilizando o mesmo processo que foi descrito para a hibridação ín sítu) e seccionou-se era secções de 3 mícrons. Fez-se um pré-tratamento das secções desparafinadas cora 5 pg de proteínase K (Boehrínger, Mannheím, Indianapolís, IN) em Tris-HCl 100 rnM (a pH 7,4) para expor os epítopos. A digestão da proteínase foi parada por incubação em 2 ing/mL de glicína no seio de STF durante 30 segundos. Lavou-se o tecido desencerado, tratado com proteínase K foi lavado três vezes com STF e reagiram com c anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente, lavou-se 3 vezes com STF e depois reagiu com um anticorpo secundário biotinilado durante 1 hora, à temperatura ambiente. Depois de se lavar três vezes com STF (a pH 7,4, íncubaram-se as lâminas com peroxidase de estreptavídína e de rábano (3 pg/mL, Vector Laboratories) durante 30 minutos à temperatura ambiente. No seguimento das três lavagens com STF, desenvolveu-se a ligação do anticorpo com o sistema de substrato de AEC (Vector AEC SK-4200, Vector Laboratories) no seguimento dcs processos descritos pelo fabricante. 62 £9 ’ q f p y '£yp - L u£ : S LI i χοι Q, D ΤΘΓ1 ‘ ’ ^B p 0 J- c Ç Ί S c* o ¥"/"0 'p χιό p xd rr - ua apn SUT sddr J~ *J p * 0' PP 30 UêlipUBP AOJ' qdiiinH οχοα op joa UO 01 X OJ I X) Θ p oePepn UI f. ? 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Exemplo 2

Avaliação da progressão da doença renal de Alport em modelos de ratos

Os ratos estudados neste exemplo incluíram ratos Alport, que não expressam colagénio α3(IV) e são normais para a integrína ctl (disponível nos Jackson Laboratories of Ear Harbor, Mainej, e as mutações duplas (isto é, irritantes duplos) que não expressam colagénio oí3{IV) ou integrína al. Os mutantes duplos, eram 97,5 % 129 Sv e tinham 2,5 % de antecedentes Sv/J.

Fez-se uma colheita de urina dos ratos a intervalos de uma semana e realizou-se a análise das proteínas conforme descrito na secção dos processos. Como se vê na figura 1, para animais que não expressam colagénio a.3(IV) e eram normais para a integrína al, a idade média para o início da doença renal de Alport (com base num estudo de 6 indivíduos), conforme foi medido pelo início da proteinúria, foi de 3,5 semanas a 4 semanas. A proteinúria progrediu rapidamente, atingindo níveis de pico entre as 6 semanas e as 6,5 semanas de idade. A idade média da morte devida a ínsuficiência renal estava entre 8 semanas e 9 semanas de idade. Nenhum, destes animais com este genótípo (testaram-se 9) viveu para além das 9 semanas de idade. Os níveis de azoto na ureia do sangue (AUS) tornaram-se elevados entre as 7 semanas e as 7,5 semanas de idade. Nos mutantes duplos (testaram-se quatro para estas medições), o início da proteinúria foi. entre as 5 semanas e as 5,5 semanas de idade e progrediu mais lentamente, atingindo níveis de pico entre as 9 semanas e as 9,5 semanas de idade. A idade média da morte devida a insuficiência renal estava entre 15 semanas e 16,5 semanas. Os animais 64 desenvolveram níveis elevados de AUS entre as 10 semanas e as 11 semanas de idade.

Exemplo 3

Caracterização do modelo de ratos com uma dupla mutação

Analisaram-se três conjuntos diferentes de animais (controlos normais, animais que não expressam colagénio α3 (IV) e normais para a inteçrirta al (rato Alport) e duplos mutantes) às 4 e 7 semanas de idade utilizando um certo número de técnicas diferentes.

Realizou-se a microscopia de transmissão electrónica para avaliar a integridade da membrana basal. Às 4 semanas de idade (dados não mostrados), a ninhada com Alport mostrou uma rarefacção da membrana basal em 100 % dos anéis capilares dos glomérulos. Os mutantes duplos mostraram alguma rarefacção da membrana basal glomerular (MBG) (isto é, espessarnento irregular, adelgaçamento e seccionamento), contudo foi pouco frequente e pouco extensa. Cerca de 20 % dos glomérulos nos mutantes duplos não apresentaram nenhuma rarefacção da membrana basal. Cerca de 5 I dos glomérulos nos ratos Alport, nesse momento estavam fíbróticos, enquanto que não se encontraram glomérulos fibróticos na ninhada dos mutantes duplos. A figura 2 ilustra o grau de danos da membrana basal glomerular característico destes diferentes ratos, às sete semanas de idade. Ilustra-se um anel capilar glomerular típico. A membrana basal glomerular nos ratos com Alport nesta fase de desenvolvimento está bastante danificada em pratícamente todos os glomérulos. É evidente na figura 18 o espessarnento grosso e irregular e o adelgaçamento e o desaparecimento extensivo dos processos das pedicelas dos podócítos. Nas mutações duplas, contudo 65 (figura 2C;, a MBG está, na sua maior parte, normal na sua ultra-estrutura, com a excepçâo de umas pequenas irregularidades e os processes das pediee]as dos podócitcs mantêm uma arquitectura normal (comparar as regiões assinaladas pelas setas para os ratos normais na figura 2A e os ratos com uma dupla mutação na figura 2C) . Nesse momento, entre 30 I e 50 I aos glomérulos dos ratos com Mport estavam fibróticos, enquanto menos do que 5 I dos tratantes duplos estavam fibróticos. O varrimento com microscópio eiectrónico dos ratos com 7 semanas de idade (dados não mestrados) indicou que os ratos com Alpcrt mostravam um aumento significativo dos processos das pedicelas dos podócitos, destruindo a estrutura destas células normalmente elegante e complexa. A eliminação dos processos das pedicelas dos podócitos tem sido descrita para a giomerulefríte de ratos com Alport. Nos mutantes duplos, embora a arquitectura náo seja perfeita, é muito próxima da observada em glomérulos de ratos de controlo. 0 aumento destes processos das pedicelas dos podócitos é responsável pelo bloqueio dos filtros dos glomérulos e leva à urémia. Por isso, esta verificação tem significado no que respeita à melhoria da função glomerular no mutante duplo, relativamente ao resto da ninhada com Alpcrt.

As montagens de rins completos de ratos com 7 semanas de idade, embebidos em parafina foram corados pelo processo de Joise e contou-se o número total de glomérulos fibróticos (dados não mostrados) . Vírtualmente todos os glomérulos de ratos com Alport estavam afectados nalgum grau. A maior parte mostrava hipercelularidade glomerular e expansão da matriz mesãngíca e cerca de um terço estavam fibróticos. Pelo contrário, os glomérulos dos ratos duplamente mutantes 66 estavam em grande parte normais no que respeita os à matriz mesângica e à celularídade. Cerca de 25 % tinham evidências da proliferação das células mesangiais e 5 % estavam fibróticos. Repetiram-se as análises em dois conjuntos diferentes de ratos com resultados muito semelhantes. A análise de imunofluorescêncía foi realizada utilizando córtex renal congelado retirado dos mesmos animais. 0 tecido reagiu com anticorpos específicos para as proteínas conhecidas por se acumularem na MBG, em função da progressão da doença renal de Alport. Estas incluíam lamínina-1 (Lam-1) (utilizada a uma diluição de 1:200), cadeias de colagénio αΐ (IV) e α2(IV) (COL 4A1,2) (utilizada a uma diluição de 1:15), fibronectína (Fíb) (utilizada a uma diluição de 1:200), proteoglicanos de sulfato de heparina (PSH) (utilizados a uma diluição de 1:100), e entactina (ent) (utilizada a uma diluição de 1:200) . Todos cs anticorpos foram diluídos em leite em pó desnatado no seio de STF a 7 I. Os resulr ados estão indicados na figura 3. Às 7 semanas de idade, todas estas componentes estavam sígníficativamente elevadas na MBG dos ratos com Alport relatívamente aos controlos. Nos glomérulcs fibróticos, todas estas componentes eram abundantes. Nos mutantes duplos, a imuno-colcração pra as cadeias de colagénio cd (IV) e α2(IV), era comparável à dos ratos com Alport nos glomérulos não fibróticos. Isto era expectável, dado que a composição do colagénio dc tipo IV da MBG no mutante duplo é a mesma que a do rato de Alport (isto é, é constituída por todas as cadeias de colagénio od (IV) e a2(IV). A coloração para a laminin.a-1 e para os proteoglicanos de sulfato de heparina estavam significativamente reduzidos na MBG des mutantes duplos relativamenoe soa raros com Alport (comparar a figura 3F com a 3E e a figura 3L com a figura 3K, respectivamente) e 67 não houve coloração aparente para a fíbronectina na MBG dos rautantes duplos (figura 31) , que é abundante na MRG dos rates com Alport (figura 3H) . A imuno-coioração ma matriz mesângica para estas proteínas era comparável entre a dos mutantes duplos e os ratos com Alport, contudo, para os proteoglícanos de sulfato de heparína, a coloração mesângica estava reduzida nos mutantes duplos (figura 3L) relatívamente a qualquer um dos controlos normais (figura 3J) ou os raros com Alport (figura 3K).

Realizou-se a análise de mancha de Northern utilizando ARN isolado do córtex renal toral de ratos normais, com Alport e com mutação dupla com 7 semanas de idade. Fraccionou-se vinte míerogramas de cada amostra de ARN num gel de agarose, transferiram-se para nylon por meio de manchas dos capilares e hibridaram-se com uma sonda radiomarcada correspondendo a uma porção do ADNc de FCT-βΙ. No seguimento de uma série de lavagens de alta severidade, a membrana foi exposta a um filme de raios X. A figura 9 mostra que, embora o FCT-βΙ seja induzido no rato com Alport (quarta coluna da esquerda comparada com a segunda coluna da esquerda, que é um controlo) , não é induzido em ratos com Alport que comportam a mutação da integrina o?l (mutações duplas) (terceira coluna da esquerda comparada com a segunda coluna da esquerda, que é o controlo) . Foram estes dados que levaram os investigadores a especular se o efeito dos iníbídores de al podem ser mediados pela supressão de FCT-βΙ. .Assim, as experiências com o inibidor de FCT-βΙ que se seguem foram realizadas para clarificar este assunto. 68

Exemplo 4

Papel de FCT-pina progressão da doença renal de Alport post-proteinúrica

Os tecidos foram colhidos de animais F-2 com antepassados 129 Sv/j com antecedentes de C57 Bl/6 (ver antes). As experiências foram realizadas pelo menos duas vezes (em especímenes de dois conjuntos diferentes de animais). Os resultados dos dados apresentados aqui são claros e consistentes.

Estas experiências foram realizadas para ilustrar dois pontos. 0 primeiro, é que há uma correlação temporal entre a indução do ARNm de FCI-βΙ e os ARNm que codificam as proteínas da matriz que se acumulam em função da progressão da doença renal de Alport e, segundo, são estes ARNms actualmente induzidos? (Dado que apenas 5 % do peso húmido do rim é glomérulo, a indução dos ARNms específicos no cortez renal total está ma is relacionado com a questão da ííbrose progressiva do que com a glcmerulonefrite). isolou-se o ARN tctal de rins de animais com Alport e ninhadas de controlo com intervalos de duas semanas começando às 6 semanas e terminando às 12 semanas de idade. A proteínúria nos ratos F2 utilizados neste estudo começa quando os ratos têm aproxírnadamente 5,5 a 6 semanas de idade (dados não mostrados). 0 ARN foi fraccíonado em geles de agarose de desnaturação, transferido para suportes de nyion e sondado com sondas radíomarcadas específicas para cada um de cadeias de colagénio al(IV) ou α2{1V), entactina, a cadeia de laminina βΐ ou β2, fibronectína ou FCA-βΙ. Os resultados na figura 4 ilustram que os ARNms para todas estas proteínas com excepçãc tía laminina fâl são 69 induzidos no seguimento do inicio da proteinúria no modelo de rato de Alport.

As análises de mancha de Northern para este mesmo período foram também realizadas para a iamínina al, Iamínina βΐ, Iamínina γΐ, proteína do núcleo de proteoglicano de sulfato de heparina e as cadeias de colagénio «4(IV) e «5(IV) (dados não mostrados). Não houve diferenças significativas nos níveis de ARNm para estas outras proteínas das membranas basais comparando o controlo com o mutante.

Os resultados das análises de Northern foram analisados utilizando aparelhos de imagem por meio de fósforo para quantificar directamente as alterações relativas na expressão do ARNm específico durante esse período. A figura 5 ilustra que a indução dos níveis de ARNm específicos se torna evidente, pela primeira vez, às seis semanas de idade ou numa idade próxima, quando a proteína no espaço urinário atinge os níveis máximos nos ratos F2 (Cosgrcve et al., Genes Dev,, 10:2981-2992, 1996). Às 8 semanas, o pico dos níveis de ARNm, com os ARNms codificando FCT-βΙ e a fíbronectina induziu 6,6 e 9,4 vezes mais do que o dos ratos de controlo, respectivamente. Os níveis de ARNm para o colagénio al(IV), a2(lV) e entactina eram todos eles induzidos cerca de 3 vezes pela 8a semana. Pelo contrário, não houve alterações significativas nos ARNms que codificam as cadeias de Iamínina βΐ e β2, que foi determinado pelas análises de mancha de Northern dos mesmos ARNms, não se observando, em nenhum ponto, da progressão da doença renal.

Para examinar se os ARNms codificam PCT-Bi ou se as diferentes componentes da membrana basal eram induzidas, 70 num tipo de célula glcmerular particular, realizou-se a hxbndaçac m situ utilizariGO sondas anti~paralelas marcadas com digoxígenína para os ARNms. Colheram-se os rins de raros F2 com Alport, de 10 semanas de idade e da ninhada normal de controlo, no seguimento da perfusão com paraiormaldeido a 4 1 no S610 de STF e tra taram-se para a análise de hibridação in a i f π ‘-J - <- - , conforme des criro na secção de Processos. As sondas antr -paralelas e ram especificas para o domínio NC1 do coiagénio ai(IV), FCT-βΙ, fibronectina, entactina ou a cadeia Q0 laminina βΐ. Utilizou-se uma sonda espec ífica par a β-galactosidase bacteríana com o controlo ρ ara a ligação nãc especifica (um controlo negativo), dado que esta sonda não híbridcu com o ARN total do rim de rato segundo as manchas de Northern (dados não mostrados). Hibridou-se a sonda de controlo ao mesmo tempo que a sonda especifica e trataram-se com a mesma concentração de RNase A no seguimento do processo de hibridação, 0 tratamento com RNase A realizou-se a 0,25 pg/mL para al(IV), FCT-βΙ e fibronectina e a 3 pg/rri para a enractín e a laminina βΐ. Os resultados estão indicados r:a figura 6.

Os resultados na figura 6 ilustram que, para todos os ARNms específicos examinados, obser v aram-s θ claramente níveis elevados nas células ep 1 l Θ1 i 3 I s viscerais ípOdóci tos) dos glcmérulos nos ratos com uma mutação de C X) _L 4A3 (ratos cc rr Alport * Pa ra a cadeia al ( IV) de 1 w _L agém o, obse rva - se a expr ea são do ARNm no cor itrol O L 5 4- /-v 11 L U nas cél alas me san Çf í a is com 0 nas cé luxas eriço i i 4 · PZ» \ 0*. do s glo rriérul os (rig ura 6A ) / é con sis “(ζητ-ρ 0 00] 0 SÍ1 10 c nde est P rri rs u. itLtv lécula 0S 6 lo can ítci da no mateοχ a1 madu ro. No mut a expr 0 8 s ã o na matr Γ^7 |p pi n gp gíca pode s er e leva coro c se evidenc ia t ;el a oolo ra ÇãO mu: to ilidis es cura qua ndo cara d a com a co 1 ^ 1 Γ r 3 Çn o da s CO 1 1 1. a s mesanoiais na aiprs s ~i"3 71 de controlo, contudo a diferença mais óbvia entre o controlo e o muiante é o anel das células coradas circundando a circunferência exrerna dcs glomérulos, correspondendo acs podóciros (figura 6fc) . A expressão de fibronectina ncs glomérulos de controlo é observada em primeiro lugar nas células mesangiais(figura 6D) . A expressão de fibronectina nos glomérulos de controlo observa-se primeiramente nas células mesangiais no mutante, os oodócitos estão claramente a expressar niveis significativos de ARN de fibronectina (figura 6E). A expressão de FCT-jll é muito fraca nos glomérulos dos animais de controlo, contudo, observa-se alguma coloração especifica nas células mesangiais dos animais de controlo (figura 6G). No mutante, os níveis de ARNm do FCT-βΙ estão signi fioativamente elevadas nas células mesangiais, nas células endotelíais e novamente nos podócitos (figura 6H). Para a entactina, o ARNm localizado nos podócitos do controlo, o que não é inesperado, dado que esta proteína localiza-se específicamente na MBG. Inesperadamente, observa-se alguma coloração específica das células mesangiais nos animais de controlo. Embora a coloração nas células epitelíais viscerais no mutante pareça indicar a expressão elevada, não se trata de um ensaio quantitativo e a diferença entre o controlo e o mutante é demasiado pequena para ser definitiva (comparar a figuras 6J com a 6K) . A análise de manchas de Northern revelou que os níveis de ARNm para a cadeia [11 de laminína permaneciam inalterados no controlo versus o mutante ao longo de todo o período. A análise da hibridaçáo in sítu para esres mesmos mesângios ilustra a localização específica das células mesângicas nos glomérulos dos rins de controlo (figura 6M) . Nos glomérulos dos ralos muranles, contudo, o ARNm esrá claramente induzido nas células epíteiiais viscerais (figura 6N>.

Colhem-se amostras de tecido ás 3 e 5 semanas de idade e analisaram-se por hibridação ín situ utilizando estas mesmas sondas. 0 modele de coloração neste glomérulos distinguia-se do do resto da ninhada normal {dados não mostrados). Isto sugere que a activação destes genes nos podócitos ocorre depois do início da proteínúría.

Os dados da proteína do FCT-βΙ, com base da detecção de ímuno-peroxidase utilizando anticorpos específicos para a isoforma actíva da citocína corrobora os dados obtidos pela análise de hibridação ín situ para o ARN do mesângio do FCT-βΙ (comparar a imunc-coloraçãc da figura 7B com a da figura 7A).

Realizou-se a análise de protecção da RHase para determinar se os níveis de ARNm para a citocína estão também elevados no córtex renal humano doa ratos com Alport versus os modelos de controlo. Retirou-se o córtex renal com Alport de seres humanos de um rapaz com 15 anos de idade durante uma cirurgia de transplantação. 0 espécimen tinha um nível moderado de sacrificaçâo, com cerca de 50 % dos glomérulos fibróticos. O espécimen foi imediatamente removi do e congela uO em azoto 1 1. Li _l d 0 # Com pro 14 — í ο Θ o ARN de " i m fi 1 imai ro normal ΪΊΒ Clonetech (Palc Alto f A) p p p ^ uma uaostr a agl - -r 4 vs .3 A - Hl CÍ os -U- de uma co lecção de fc nr. OS hums nas j. o rma -i s. Isc luu~se O ARN de espé cimes com A Ipc Y' -f~ u tiliza ndo mes mo pr ocessc rr u ue o utilizado para ri ns de ra L O . x a n i π ou- se o ARN Q janto á s ti- d ínte grída d p por meio A r\ U. UO Y" 3 p p 0 0 Π α men to de li ) micrograrr as nur α ge r ie a garose 0 olora ção Q 0 gel c om brometo de etídíc (10 mi crc >g ramas por iL de duo ia) . Tantc a s amostras normar s corr tO 3 S rm doe 73 dc Alport estavam intactas com base na quantidade xva das bandas rio OSOIttalS G6 ARN 28S e 18S. A experiência da protecção de RN 3 s β Γ 0.1 re alizada de acordo c om os processos. Os dados na fi .quica i 8 ilustram uma eleva v α ^ de q-4 veres d o Aí IN mesângíco GG FCT-βΙ no córtex renal huma P c com Alport, re d.ativamente ao controlo. Isto prova GU0 a citocina está também sobre-espressa nos rins humanos com Alport. Estes dadcs consubstanciam a expeetativa de que esta tecnologia funciona em seres humanos.

Exemplo 5

Utilização de um anticorpo de neutralização para bloquear uma integrina αΐβΐ

Como um exemplo para ilustrar que um agente solúvel capaz de bloquear a interacção de integrina ο:1β1 com o seu ligando vai produzir o mesmo efeito na patogénese da doença renal de Alport tal como na mutação de "knockcut" do gene cá, obteve-se o anticorpo descrito em Fabbri et al., Tíssue Antigens, 48:47-51, 1996. Injectou-se este anticorpo (400 ng/injecção, três vezes por semana, intraperitonealmente) no rato com Alport começando às 2 semanas de idade. Recolheram-se os animais às seis semanas de idade e analisaram-se as membranas basais por microscopia de transmissão electrónica. Corno é evidente da figura 10, as menu: regulares, tendo um aument basais nestes animais tratados eram bastante rêncía trilamínar normal. Observou-se das células endoteliaís devido à

Uc VUlUlLi resposta 1IHU nitári â 3.0 anticorpo. Estes resultados 1 iust ram que bloqueia o re oeptor de In togrina LXlp-L Vdí retardar a progressão das d oenças da K BG dos Ag Π 1 Ήύ rs “j_ 3 1 observou com A]port, m na linha cie i' atos com dupla mut uesma forma que se 74

Exemplo β

Efeitos da inibição isolada de FCT-βΙ no modelo de ratos (129 SvlJ) com Aiport 0 protocolo experimental consistiu em injectar quer com FK506 (2 ug/g de peso do corpo, injectado intraperito-nealmente, Fujisawa Pharmaceuticai Co., Ltd.. Osaka, Japão) ou um receptor solúvel de FCT-βΙ í 2 5 pg/injecção, intravenosamente, através da veia da cauda, Biogen Inc., Cambridge, MA) duas vetes por semana, começando às 3 semanas de idade. Colheram-se os rins às 7 semanas de idade e submeteram-se às análises descritas.

As análises, por microscópio de transmissão electróni-ca, da ultra-estrutura da membrana basal, em várias conduções, estão ilustradas na figura 11. Δ figura 11 A mostra uma ansa capilar glomerular de um animal normal, não tratado. Notar os processos regulares das pedicelas e a coloração trilaminar da membrana basal. A figura 11 B mostra uma ansa capilar glomerular de um rato 129 Svl J típico, com Aiport, de 7 semanas de idade. Note-se que os processos das pedicelas estão aumentados de volume e há um espessamento focal da MBG. A figura 11 C ilustra uma ansa capilar típica de uma animal com Aiport, de 7 semanas de idade, tratados com FK506. Há uma óbvia falta de espessamento da membrana basal, sugerindo que o fármaco reduz a taxa de acumulação da matriz na MBG. Há, contudo, um grau significativo de aumento de volume nos processos das pedicelas r com um .a notável falta da arquítectura dos processos das pedicelas. Faz-se esta mesma observação em ratos ínjectados com o receptor solúvel de FCT-βΙ (figura 11o) . Estes dados ilustram que os inibidores de FCT-βΙ podem pxmvenír as alterações na arquítectura dos processos 75 das pedícelas associadas a doença de Alport avançada das MBG.

Alguns dos especímenes de rins forma tratados por microscopiâ de varrimento elecrónico. Os çlomérulos foram expostos por uma fractura congelada do córtex renal, que remove a cápsula de Bcwman, exponde a camada exterior aos podócrtos dado que eles cobrem as ansas dos capilares des glomérulos. Na figura 12 Ά ilustra-se um glomérulo normal em que a arguitectura do complexo dos podócitcs é muito evidente dado que a ramificação dos processos das pedícelas se enrola à volta das ansas capilares. Num rato típico com Alport, com 7 semanas de idade, a superfície dos podócitos nos glomérulos faltam nemeadamente nos ramos dos filamentos finos, que tinham sido obliterados pelo aumento de volume (figura 12B). Nos animais com Alpor tratados quer com FK506 ou com o receptor solúvel de FCT-βΙ, a superfície dos glomérulos parece-se ruuito com as de ratos com Alport não tratados (figura 12 C) . Esta figura demonstra claramente que o bloqueio de FCT-βΙ, ísoladamente, não protege contra as alterações na arguitectura dos processos das pedícelas associada com a doença cie Alport avançada.

Mediu-se a proteinúria por electroforese em gel de poliacrílamida de urina l.iof il izada colhida várias vezes por semana durante o decurso do tratamento com o fármaco. Tal ccmo se mencionou previamente, a presença e a abund'Aanciâ de albumina na urina dá uma avaliação compreensiva da integridade dos filtros glomerulares. A figura 13 ilustra que, embora a acmínistração oes inibidores de FCT-βΙ atrase o inicio da proteinúria, a progressão para níveis elevados de albumina na urina ocorre muito rapidamente (1 semana). Estes resultados implicam que os inibidores de FCT-β], quando utilizados isoladamente, 76 não melhoram o filtro glcmerular embora retardem o início da proteinúria. É provável que esta propriedade esteja dírectamente relacionada com a incapidade destes iníbídores para prevenir o desaparecimento dos processos das pedícelas dos podócitos descrito antes e ilustrados nas figuras 11 e

Deve notar-se que a administração do fármaco à ninhada de ratos normais resultou em diferenças não discerníreis quando comparadas com ratos normal não injectados.

Exemplo 7

Efeitos dos inibidores de FCT-βΙ em ratos com dupla mutação (DMCJ)

Inieotaram-se os ratos (ratos DMU são nulos tanto para o colagénio a3(IV) e de integrina al) com inibidores de FCT-βΙ FK506 (2 pg/qrama de peso de corpo, duas vezes per semana, ínjecções intraperitoneais) ou o receptor solúvel de FCT-βΙ da Biogen (25 pç por injecçâo, duas vezes por semana, ínjecções intravenosas) começando às quatro semanas de idade. Retiraram-se os rins às 10 semanas de idade e analisaram-se. Escolheu-se as dez semanas porque, nos ratos com mutações duplas, a doença normalmente progride até ao ponto em que se observa um espessamento irregular significativo na MBS e os animais começam a progredir para o estágio final de insuficiência renal. Assim, se os inibidores de FCT-βΙ se destinam a providenciar benefícios protectores adicionais, esses benefícios devem ser evidentes nesse estádio de progressão da doença da M3G. A análise com microscópio de transmissão electrónica mostrou de forma muito clara e consistente as diferenças enare os ratos injectados com inibidores e os ratos com mutação 77 dupla não tratados. Um exemplo típico destas diferenças está ilustrado na figura 14. A figura 14B ilustra o perfil típico de uma ansa capilar dos ylomérulos no rato com duola mutação às 10 semanas de idade. Notam-se as bolsas significativas do espessamento da membrana basal características do tratamento da giomerulonefrite de ratos com Alport. Os processos das pedicelas dos podócitos têm um elevado grau de arquítectura regular com diafragmas de fendas bem desenvolvidos mesmo no estado avançada da doença. Esta earacterística dcs ratos com dupla mutação não é partilhada pelos ratos com Alport (compara os processos das pedicelas com os mostrados na figura 12B).

Quando os ratos com dupla mutação foram tratados com ínibidcres de FCT-βΙ, houve uma marcada redução tanto do espessamento focal da MBG como o apagamento dos processos das pedicelas (figura 14C foram tratados com FK506 e os da figura 14D foram tratados com o receptor solúvel de FCT-βΙ). Embora a MBG da maior parte dos glomérulos não tenha uma estrutura completamente normal (notar a aparente irregularidade moderada da MBG na figura 14D), faltam completamente as bolsas significativas do espessamento da membrana basal na maior parte das ansas dos capilares dos glomérulos cios animais com dupla mutação não tratados (como na figura 14B) neste estádio de desenvolvimento. Em cerca de 25 % dos glomérulos examinados desta forma, os inibidores de FCT-βΙ restauraram a ultra-estrutura glomerular até a um grau em que os glomérulos Din não se distinguem dos dos ratos normais (a figura 15A mostra a MBG de um rato normal com dez semanas de idade; a figura 15B mostra a MBG de um rato com uma dupla mutação, com 10 semanas de idade, tratado FKS06). Considerando que isto se passa 2 semanas depois da idade média do estádio final de insuficiência renal no modelo de animal com Alport não 78 manipulado, uma verificação verdade iram- um

FiOtâ V 61 se recoina se a proteiní iria nestes nes T-p Cp illd s ra .tos fazend o- .a semanalmente no decurso do tra tament . se as amostras (equivalente a apr 'oxirn adamen Γ 0 Cl 8 um micrciiti ό) por electrofores? 5 em géis de :iida . Visualizou- S 8 cl â __ .dH i J-11 d c or c c 1 o r ação c OITi poliacri. azul de coomassie. Os resultados na figura 16 j.lustram que tanto o tratamento com FK506 (figura 160)) ou o receptor solúvel para FCT-βΙ (ficrura 16B) melhora marcadamente o desempenho do filtro glomerular relativamente aos ratos com duplas mutações não tratados (figura 16A). A figura 16C mostra a proteína urinária para um rato normal tratado com FK506. É de notar o grupo difuso de bandas evidente em cada momento tanto nos ratos normais como nos ratos Din (figura 16D) tratados com FK506. Isto foi sempre observado em sratos tratados com o fármaco e está provavelmente relacionado com os efeitos nefrotóxicos relatados nalguns pacientes tratados com o fármaco no seguimento de um transplante (Solez et al., Transplantaiion. 66: 1736-1740,

Exemplo 8

Mecanismos para os efeitos sinérgicos de bloqueadores de integrina al e inibidores de FCT-βΙ no retardamento do inicio e da progressão de glomerulonfrite de Alport

Os dados ilustrados nas figuras 11, 12 e 14 sugerem, coiectívamente, que a razão pela qual os bloqueadores de integrina ccl são sínérigícos com os bloqueadores de FCT.....βΐ, é pelo facto de a inibição de al resultar numa arquítecrura melhorada des processos das pcdicelas dos podócitos, embora 79 a inibição de FCT-βΙ resulte numa redução dos depósitos na matriz da MBG. A figura 17 indica ainda o papel substantivo dos bloqueadores de integrína od na melhoria da arauitectura dos processos das pedicelas dos podccitcs, Preparou-se o córtex renal da mesma mane:ra que se ilustrou na fíg. 12. A figura 17A ilustra a superfície de um glomérulo de um rato normal com 7 semanas de idade. A figura 173 ilustra um glomérulo de um rato com Alport com 7 semanas de idade. Note-se que a perda da arauitectura dos podócitcs devida ao apagamento dos processos das pedicelas. A figura 17C ilustra a superfície de um glomérulo de um rato com dupla mutação com 7 semanas de idade. Note-se que a quase total restauração da arquitectura normal dos processos das pedicelas. Estes dados são consistentes com a vista seccional cruzada dada pelo microscópio de transmissão electrónica mostrados na figura 14B, em que os processos das pedicelas têm uma excelente morfologia nos ratos com uma dupla mutação.

Exemplo 9 O efeito do bloqueio de integrina al

Ao examinar um mecanismo plausíve] para este fenómeno, avaliaram-se as cadeias de laminina. Dado que é conhecido que a laminina primária encontrada na membrana basal glomerular é a laminina 11 (Míner et al., J. Cell Bíol., 137: 65-701, 1997), crê-se que o aparecimento de uma nova laminina da MBG de animal com Alport pode contribuir para a perda da ligação dos podócitos à MBG. Na verdade, após o exame da composição de laminina da GBM do animal com Alport, a cadeia de laminina a2, que normalmente se localiza exclusivamente na matriz mesangíal em raros normais, foi encontrada na MBG dos ratos com Alport. A 80 fi yura 1 8 ii L us 11a Ullld. S é Γ ie d e pain Θ 1 s de gioméru los, Í1T ano- cor a dos ut.il i. zando um protc colo duplo de i TiS 0 C 8 Ç β O por fl 11 f) r*· 0 S Cê ncia Kl 3 3 3 H3. lises cio f e - '3' ha ™ rescência di _j J_. Ci f ei iibebeu-s e o CG rtax re Hâ d- fresco num OIÍip osto aquoso para embeber Ti ssue Te k f C :cnç ;elou .-se e U Ο Γ t, o ϋ.*“3 θ em lâmina s de 4 microns num críóstato. As lâminas foram em seguida fixadas em acetona fria a 100 % (-20 °C), durante 10 minutos e depois secou-se ao ar durante a noite. Re-hidratou-se o tecido com três lavagens em STF durante 10 minutos cada. Os anticorpos primários foram diluídos em conjunto em leite em pó sem gordura a 7 I (BioRad). Utilizou-se um anticorpo antí-entactina (Chemicon Inc.) como um marcador conhecido para a membrane basal glomerular numa diluição de 1:200. 0 anticorpo específico da cadeia a2 de laminina foi uma oferta do Dr. Peter Yurchenco (Robert Wood Johnson Medicai School, Piscataway, NJ) . A especificidade deste anticorpo para a cadeia a2 de laminina foi ilustrada ern Chenq et al. , J. Biol. Chem., 272: 31525-31532, 1997. Utilizou-se o anticorpo a uma concentração de 1:10. Deixou-se cue os anticorpos primários reagissem durante a noite a 4 °C num disco humidificado. Lavaram-se as lâminas três vezes durante 10 minutos de cada vez em STF fria e depois reagiram com anticorpos secundários, que também foram asicíonados em conjunto. Os anticorpos secundários foram um

Qp f- i _ coelho conjugado com verme lho c io Texas para laminina (x 2 c um anti-rato conjugac io com Fi tc para entacrina, ambos utili zadcs numa diluição de 1 : 100 (Vector Laboratories,

Burlíngame, CA). deixou-se os reagentes secundários 'eagirem durar 11Θ 4 b oreis α 4 °C. Lavaram-se d. 3 IdiTLlHdS 1 -ezes durante 1 Q rqo j λ o, 0 r\ CSda vez com STF 0 dp 1 i CDU'" se .ma gota de : meio de : monta gem ai gf Ί — qo 1 V ’ 0 p t ía 3 h 1 0 j rj vector Labora tcries, Burlín game, CA) antes de 3 G selar com 81 umas capas de vidro. As imagens para cada anticorpo foram sobrepostas digitalmente utilizando um microscópio de epífluorescência BH-2 com uma interface com um sistema de análise de imagens Cytovision Ultra (Applied Imaging, Inc.). 0 antigénic específico da membrana basal glomerular (entactina) está a verde, enquanto a cadeia de laminina u2 está a vermelho. Ncs lugares em que a entactina e a laminina a2 estão juntas, a coloração é amarela. Na figura 18, no grupo I, a coluna A representa a imuno-coioração de um gloméruJ o de um rato normal com 7 semanas de idade. Aqui, a laminina «2 localiza-se exclusivamente na matriz mesangial. A coluna B ilustra a coloração na ninhada com Alport com 7 semanas de idade. Indicado pelas setas, as ansas capilares estão principalmente coradas de amarelo, ilustrando que, nos ratos com Alport, a laminina a2 localiza-se tanto na matriz mesangial como na membrana basal glomerular. A coluna C mostra a ímuno-coloração nos glomérulos de um rato 129 Sv/J com Alport tratado com FK506 (retirou-se córtex dos animais utilizados nas experiências descritas antes e representadas nas figuras 11, 12 e 13). Aqui, novamente a maior parte das ansas capilares dos glomérulos são amarelas, indicando que a inibição da activídade de FCT-βΙ não previne a acumulação de laminina a2 na MBG nos ratos com Alport. Num rato com uma dupla mutação, com 7 semanas de idade, contudo, não houve ímuno-coloração da laminina a2 nas ansas capilares dos glomérulos (coluna D, setas}. 0 receptor predominante de íntegrina na superfície dos podócitos é a íntegrina α3β1 (Paley et al,, Cell Âdhesion and Communication, 2: 159-167, 1994). Crê-se que esta íntegrina desempenhe um papei chave na ligação do podócito à MBG e na manutençãod da aqquitectura normal dos processos das pedícelas (Smoyer e Mundel, J. MoL Med., 78: 82 172-183,1998). C orn c ~) exemplo, foi recent emente demonstrado que a mutação do gene de íntegrina a3 resultou numa completa oblít eraç ão da ar quítectura dos processos de peciícelas dos podócítos (Kreidberq et al., Developmen 1, 122: 3537-3547, 1996). Mais recentemente, produzlu-se um receptor solúvel de íntegrina cc3pl que mostrou ligar-se com alta afinidade à cadeia de laminina c*5 contendo iamininas (tal como laminina 11 que é uo heterotríinero constituído pelas cadeias «5, β2 e γΐ (Eble et af., Biochemístry, 37: 10945-10955,1998). Considerada em conjunto com esta informação, os dados apresentados aqui suportam um modelo em que, nos ratos com. Alpcrt, a deposição progressiva de laminina a2 contendo Iamininas na MBG resulta na adesão reduzida por via dos receptores de íntegrina α3β1, resultando no apagamento dos processos das pedicelas. O bloqueio da cadeia de integrina al resulta numa deposição reduzida ou ausente da cadeia a2 de laminina na MBG, prevenindo a perda da arquitectura normal dos processos das pedicelas.

Para melhor consubstanciar este ponto, avaliou-se a distribuição da cadeia «2 de laminina em ratos Sv/J com Alport, com 2 semanas de idade, comparada com a da ninhada normal. Neste estádio muito precoce da progressão da doença da MBG, havia "bolsas" bem notórias de espessamentos na KBG, espaçadamente distribuídas em cerca de metade dos glomérulos. Uma dessas bolsas de espessamento na MBG está ilu strs rj ϋ n 19 Ua Cà 11 d figura 19B. A MBG e os proc 'PSSOS àí as pedícel .as dos pod são normal s, sob o ponto d w ta morfo.lógi co VQQ "j .ões n ão afextada s dos glomérulo s nes te estádio Ιλ Utr envo -IV íííiuH to, cor ' x 1' d o , em regiões de e: 3D8 S nento foca 1, os p r n essos das pe (j q C0 Las aumentam de v olurr 10 e destroe TTj — C p f da mesma f o rma que as alterações Hl α X 3 Ψ- meralizad as rec^ ΟΠ,ίΙβ* X X ó 3 S líid 1 S L arde no desenvolvíim 3Π L >. J ò 3. doença. Bm 83 esumc f se a dep o o i o ã o ie lamii mna a 2 res alta na do ont ciC r\ de adesc Io focal com os po dócitcs, também . se devem q "Γ 0 Q d Θ Dó sitos IOCgIS de .1 âlUÍ π i Π c a a2 r.a IMBG d·3 raros com ! PC I X. r . oin 2 s ei nanas d 6 lClâQe E g +- p 0 ] 'eaimenr :e o c 3. S O oní or me se lius tra na figura 18, grupo II. As secas na olu Πα B mostram a depos içao tocai d0 3 ΓΠ ”8 Γ .ina a2 v-. mrp la a. ι/i D \3 de ato S co m Alport com 2 semanas de idade. L· STB 0 prime ira Ite TB. çã o mclecu. .ar (para além O m .a p 1 +· τ "· r Px —_ a. π i* n ão da compcsi ção do coiagén io do tipo 1' V, que resulta da mutação genética dos recém- Ή d S CidoS) 1 d detectada no modelo de ratos com Alport e corresponde exactamente ao inicio de canos detectávei: s na M5G.

Exemplo 10

Efeito sinérgico dos inibidores de FCT- βΐ com os bloqueadores de integrina al como está ilustrado na figura 3, a matriz que se MBG e no interstício, em função da patogénese da doença renal de Alport, inclui as cadeias al (IV) e a2 (IV) de colagénio, fibronectina e entactína. Tal como está ilustrado na figura 20 (as primeiras duas colunas de cada gel), cs ARNs mensageiros que codificam cada uma dest dS pr oteína s sã o indu zidos no rim Ο.Θ animal com Al port rela ti \7 0 Hl ente aos o o ntrolos norma) s A in j ecç ao de Ί. Π 1 C id r; γ o 5 rj 0 FCT~ βΐ r eduz substan B )_ d mente o g r a i de índu çã 0 ( figura 20, d S úl timas duas c olunas do gel) • Isto pode q p γ V' q v-s i x li cl 701 pela redução CIO espess ame: :to ,j. ci 'PPrf! π r a na basal gic ΊΓιΘ r 1 r observado em ratos Sv ij corn r*. í. pO rt 4- ratado s oc m i r í. t }idorps OP Ff ·> rp βΐ (i 1 . 0 a d: ) na figura 11). 84

Estes conjuntos semelhantes de manchas de Northern, foram realizados utilizando ARN de rins de ratos com uma dupla mutaçâoque ou não eram tratados ou eram injeetados com iníbídores de FCT- βΐ. Tratava-se dos mesmos ratos utilizados para derivar os dados apresentados na figura 14 e assim descreve-se no exemplo 7, o protocolo de ínjecção de íármacos. E evidente dos dados apresentados na figura 21 que a administração de inibidores de FCT- βΐ não altera sígnificativamente os níveis de ARNms que codificam as proteínas da matriz, quando comparados com com o controlo não injectado versus os ratos com mutação dupla. Há, contudo, um efeito marcado na expressão de ARNm que codificam o inibidor de metaloproteínase Timp-3 que será adicionado às sondas (figura 21, fila do fundo) . Tal como se evidencia nas colunas 1 e 2, há uma redução marcada da expressão de Timp~3nos rins de ratos com 10 semanas de idade, cim uma mutação dupla e não tratados, relativamente aos ratos de controlo (uma diferença da ordem de nove vezes com base na análise de imagem por fósforo). Esta redução da expressão em Tímp-3 não se observa nos ratos com dupla mutrção injeetados quer com FK506 (colunas 3 e 4) ou o receptor solúvel de FCT- βΐ(colunas 5 e 6) . Observou-se este mesmo efeito na expressão de Tímp-3 em ratos Sv/J (figura 20, fila do fundo), ilustrando que a capacidade para inibir a supressão do ARNm de Tímp-3 em ratos com Alport é o resultado dos inibidores da inibição de FCT- β-1, maís do que o resultado da inibição dupla de uma integrina al e do FCT- βΐ, A importância funcional desta observação baseia-se no facto de Tímp-3 ser um modulador das metaloproteinases da matriz e tem sido sugerido que é um elemento chave na homeostase da membrana basal renal e na perda de homeostase em doenças (Esposíto et al., Kidney Int., 50; 506-514, 85 ΙΟ: 62-68, 1996; e Elliot et al., J. Am. Soc. Nephrol, 1999). A redução da expressão do íníbidor das metaloprotei-nases da matriz resultará num aumento correspondente na actívidade das metaloproteínases. Esse aumento pode causar danos à membrana basal, resultando na activação de FCT- βΐ com concomitante acumulação da matriz. A quebra deste ciclo vai assim resultar na restauração da homeostase da membrana basal, o que se manifestaria peia restauração da morfologia da MBG, que fcí o que se observou (figuras 11, 14 e 15).

Exemplo 11

Inibição da fibrose intersticial em ratos com mutação dupla tratados com inibidores de FCT- βΐ 0 papel de FCT- βΐ na regulação superior das proteínas da matriz e da fibrose renal já foi bem estabelecido (Yand et al., J. Am. Soc. Nephrol, 5: 1610-1617, 1994; Border e Ruoslahti, J. Clln. Invest., 90: 1-7, 1992). Nos ratos com dupla mutação, a fibrose intersticial renal é retardada, mas espaiha-se completamente às cerca de 10 semanas de idade e progride até ao estádio final de insuficiência renal, aproximadamente às 15 semanas de idade. Os animais injectados com inibidores de FCT- βΐ foram analisados utilizando três marcadores para a fibrose intersticial e compararam-se directamente com animais com uma mutação dupla, com 10 semanas de idade que não foram tratados com inibidores Injectaram-se os animais utilizando o mesmo protocolo que se utilizou para gerar as figuras 14 no exemplo 7. Nas figuras 22, 23 e 24, a coluna A é um controlo, a coluna B representa uma GUpla IFiULGÇa o não tratada, a coluna C representa uma dupla mutação tratada com FK506 e a coluna D representa uma dupla mutação tratada com o receptor solúvel de FCT-β. Todas estas figuras 86 representam vistas com um aumento baixo de 50 X do córtex “enai. A. troará rd representa a co-loraçao corn ner.— : e prata de Jones, o que é um coranre histoquímico a matriz. E evidente que a matriz se acumula no interstício do córtex renal nos ratos nâo traçados ícomparar a coluna B com a coluna A) . 0 córtex renal dos animais tratados com qualquer inibidor de FCT- βΐ, contudo, não se distinguia do dos controlos, indicando pouca ou nenhuma fibrose. Os marcadores moleculares normalmente utilizados para a fibroso do interstício renal incluem colagénío do tipo I e fibonectina (Yarnamoto et al. , Kídney Int. , 45:916-927, 1994). A figura 23 ilustra a imuno-coloração para o colagénio do tipo I. Claramente, o colagénío do tipo I acumula-se no interstício do córtex renal dos animais não tratados (comparar a coluna B com o controlo na coluna A). As colunas B e C da fiaura 23 ilustram uma ausência relativa da acumulação do colagénío do tipo I em rins de ratos com mutação dupla tratados com FK506, ou com o receptor solúvel, respectivamente. 0 mesmo cenário é verdadeiro para a fibronectina, que é abundante no córtex de animais com dupla mutação não tratados (figura 24B) e tal como nos controlos no córtex renal de ratos injectados com os íníbídores de FCT- BI (colunas C e D da figura 24). Colectivamente, estes dados indicam que os ínibidores de , 1 f ; (31, =m como macao 10ΙΠ h olocíueadore: o.e inteorma 1 são efectivos na prevenção (ou intersticial no modelo de rato no retardamento; de Alport.

Lisboa,

Junho de 87

Claims

REIVINDICAÇÕES Utilização de um inibidor do receptor de íntegrína αΐβΐ, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para limitar um distúrbio dos rins. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pele facto de o referido distúrbio renal compreender glomerulonefrite renal, fíbrose renal ou ambas. Utilização, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de a glomerulonefrite renal ou a fibrose renal estarem associadas com o síndroma de Alpcrt, nefrite da DMDl (diabete mellitus dependente de insulina), glomerulonefrite mesangial prolíferativa, glomerulonefrite prolíferativa da membrana, glomerulonefrite crescêntica, nefropatia da diabetes ou fíbrose intersticial renal. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de o inibidor do receptor de íntegrína αΐβΐ ser um agente de bloqueio que se liga ao sitio de ligação do receptor de íntegrína αΐβΐ na superfície de uma célula do rim. Utilização de um agente que bloqueia um sítio de ligação do receptor de íntegrína αιβΐ na superfície de uma célula do rim caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para retardar o início e/ou abrandar a progressão do síndroma de Aiport ou de doenças renais na diabete mellitus dependente de insulina. ut ílização, de acordo c om a reivindi cação 4 ou c; ^ r CctX S cter izada pel o facto de o agente de H ] oqueio ri r. vu. \y rece ptor de í nt gc rina αΐβ 1 c cmp reender um pé ptído, UITí anti corp Γ) Q e neutrali 7 30 O LiUp 3 0 ou um Τ' ,33 fTTQ02"i to proteolítico. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizada pelo facto de o péptido ser pelo menos um fragmento de 9-mer ou uma prt oreína seleccionada no grupo que cons íste e :m lamínína, fíbronectina, entactína e cclagénio do tipo 4. Utilização, de acordo coi: 1 uma qualquer das reivindicações 1 a / f c 8, l â c L o o L z d d ci p θ X o l 3 c c 0 d o ã composição farmacêutica compreender ainda um inibidor do FCT- βΐ (factor de crescimento do tumor pl). Utilização, de acordo com a reivindicação 8, caracterízada pelo facto de o inibidor do receptor de integrina αΐβΐ e o inibidor de FCT- pl serem administrados simultaneamente ou sequencialmente. Utilização, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo facto de o inibidor do FCT- pl se ligar irreversivelmente a FCT-pl e inibir a sua capacidade para se ligar com o seu receptor. Utilização, de acordo com a reivind ícação 8 ou 9, cor acterizada j: jelo fa cto de 0 inibidor do FCT- βΐ ser um ^qprif que inibe cl C d p ct c i dade 00 FCT- βΐ para tra nsduzír os sinais p 3 T 3 0 núcleo de uma célula de rirp d tlildSÇaO, Q0 ;terizada oelo acordo com a ;o de FCT- βΐ ser um inibidor de 1 rervinaicaçao inibidor do recepcor de .neurína. Uti. _iz aça o de um agente c pie inibe a t ransduçao do sinal através de um y- p. fi ç. p "b q y~ de integrina adpi de uma célula de rim, C cl T ci C rerizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para retardar o inicio e/ou para retardar a progressão do síndroma de Alport ou de doenças do rim em pacientes cora diabetes mellítus dependentes de insulina. Utilização de um antagonista irreversível ou de um inibidor de transdução que reduz a actívídade de FCT-Bl, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para limitar a fíbrose renal, em que a referida composição será administrada a um., paciente ao mesmo tempo que os receptores de integrina αΐβΐ das células de rim dos pacientes serão inibidos. Utilização, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de o referido antagonista ou o inibidor se ligarem irreversivelmente a FCT- (31 e inibirem a sua capacidade para se ligar com o seu receptor ou inibirem a capacidade de FCT- SI para transduzrr sinais o a i' a os núcleos de uma celuia de rim. Utilização de um inibidor de calcíneurína, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de urna composição farmacêutica para limitar a fíbrose renal. Utilização de acordo com a reividícação 12 ou 16, caracterizada pelo facto de o íníbídor de calcineuríica ser tacrolímus. Utilização de UII1 HQ0Í rte que redu Z d cl ct i \H cia cie cie FCT™ βΐ, caracte rrzada pelo facto cie se destinar à preparação de uma campos i.ção farmac.ê ut í ca para limitar a acumulação da matrí z na membrana basa z g X ome rurar (MBG) de um. paciente com síndroma de Aiport. Rato, caracterizado pelo facto de não expressar uma composição normal de colagénio do tipo 4 na membrana basal glcmerular e de não expressar o receptor de integrína αΐβΐ. Rato, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o rato não incorporar, na sua membrana basal glomerular, as cadeias α3(IV), α4(IV) e α5 (IV) do colagénio. Processo para o rastreio de um agente para ser utilizado na limitação de um distúrbio do rim, caracterizado pelo facto de o agente ser administrado a um rato de acordo com a reivindicação 19 ou 20. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um iníbidor do receptor de integrína αΐβΐ e um iníbidor de FCT- 31 Coi aposição f arma cêutí wa r de acordo corr a rei vindi- aça o 22, cara cteri zada pel 0 f â c L c de o r i i j„ b r aor do ece pi' ar de ín tegríi .,,1 ia a 1 RI r’ ~ ser um agente de bl oqut íio ue se ííga ao s it í O de r j_ gação do recept or η o integrína αΐβΐ na superfície de uma célula de rim. 4
24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo facto de o agente de bloqueio do receptor de integrina αΐβΐ compreender um péptído, um anticorpo de neutralização ou um fragmento proteolítico.
25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo facto de o péptido ser pelo menos um fragmento 9-mer de uma proteína seleccionada no grupo que consiste ein lamínina, f ibronectina e entactina e colaçénio do cipo 4.
26. Composição farmacêutica, de acordo com uma qualquer das reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo facto de o ínibídor de FCT- βΐ se ligar irreversivelmente a FCT-βΐ e inibir a sua capacidade para se ligar com o seu receptor.
27. Composição farmacêutica, de acordo com uma qualquer das reivindicações 22 a . 25, caracterizada pelo facto de o ínibídor de FCT- f )1 ser um agente que inibe a capacidade de FCT- βΐ para transduzír sinais V"* Pi “V* ps w£ i*. Ot 0 núcleo de uma ceiuid de rum. h.O CD Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada peio facto de o íníbídor de FCT- BI ser um ínibídor de calcineurina. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo facto de o i nihídor de calcineurina ser tacrolimus. risboa, .1 o oe cunho cie zOl) / 5