ES2348862T3 - Toxina botulinica para uso en el tratamiento de lesiones graves de musculos esqueleticos. - Google Patents

Abstract

Una toxina botulínica para uso en el tratamiento de lesiones graves de los músculos esqueléticos mediante la administración local, por inyección intramuscular, que inmoviliza sustancialmente el músculo lesionado.

Description

ANTECEDENTES

La presente invención se refiere a una toxina botulínica para el tratamiento de un músculo esquelético lesionado gravemente mediante administración local. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento de un músculo lesionado mediante la administración de una toxina botulínica al músculo lesionado.

Las lesiones graves del músculo esquelético incluyen contusiones (hematomas), laceraciones, isquemia, distensiones y rupturas completas. Estas lesiones pueden causar mucho dolor y pueden incapacitar a la persona afectada, impidiendo que sea capaz de acudir al trabajo o incluso participar en las actividades cotidianas normales. Entre las lesiones graves de los músculos esqueléticos, las distensiones (también denominadas lesiones producidas por el esfuerzo) son las más habituales. Por ejemplo, las distensiones representan hasta el 30% de todas las lesiones tratadas por profesionales médicos tanto de medicina laboral como de medicina deportiva. Garrett y col. Am J Sports Med, 24 (6): S2-S8, 1996.

Una lesión de distensión muscular se caracteriza por una rotura de la unión entre el músculo y el tendón. La rotura de la unión entre el músculo y el tendón se puede producir en cualquier parte del músculo. Este tipo de lesión se produce más habitualmente cerca de la unión miotendinosa (MTJ) de los músculos superficiales que trabajan entre dos articulaciones, como los músculos recto femoral, semitendinoso y gemelos.

La distensión muscular es el resultado de un ejercicio excéntrico, o uso no habitual del músculo. Por ejemplo, las contracciones excéntricas emplean menos unidades motoras activas para generar fuerzas elevadas. En ese caso, las unidades musculares sobre-extendidas experimentan tensión excesiva durante el alargamiento. La tensión excesiva puede originar daños microscópicos en el elemento contráctil del músculo, centrándose en lo que parecen ser roturas aleatorias de las líneas Z. Cuando el músculo se daña, la persona afectada puede experimentar mialgia de inicio retardado, caracterizada por dolor, debilidad, y limitación en el movimiento. El dolor se intensifica durante aproximadamente 1 a 2 días tras la lesión muscular, y la debilidad, y limitación en el movimiento pueden durar durante una semana o más. Si una distensión leve de los músculos esqueléticos no se trata correctamente, se puede producir una lesión más grave.

Las distensiones musculares se clasifican en tres grupos, según la gravedad de la lesión y la naturaleza del hematoma: (1) distensión leve, (primer grado); rotura de unas pocas fibras musculares; con poca hinchazón y molestia, con poco o nada de pérdida de fuerza y restricción del movimiento; (2) distensión moderada, (segundo grado); mayor daño de las fibras musculares con clara pérdida de fuerza, y (3) distensión grave (tercer grado); rotura que se extiende por todo el haz; dando como resultado una pérdida total de la función muscular.

La rotura de los vasos sanguíneos intramusculares durante la distensión muscular a menudo puede dar como resultado un gran hematoma. Se producen dos tipos diferentes de hematomas en el músculo lesionado: hematomas intramusculares e intermusculares. El primer tipo, hematomas intramusculares, tienen un tamaño limitado dentro de los fascículos musculares. Aquí, la extravasación de la sangre aumenta la presión intramuscular, presionando y limitando el tamaño del hematoma. Este tipo de hematoma causa dolor y pérdida de función del músculo. El segundo tipo, hematomas intermusculares, se desarrolla cuando los fascículos musculares se rompen y la sangre extravasada se esparce en el interior del espacio intermuscular sin aumentar significativamente la presión dentro del músculo. Este tipo de hematoma puede que no cause un dolor significativo si no aumenta la presión dentro del músculo.

En el tratamiento de las lesiones por distensión, es crítico que el músculo lesionado quede inmovilizado, especialmente durante los primeros dos o tres días tras la lesión, ya que la movilización de los músculos lesionados inmediatamente tras la lesión producía a menudo una segunda rotura en el punto de la lesión original. Una segunda rotura puede ocasionar lesiones más graves, retrasar la curación y producir cicatrices en los tejidos. Jarvinen y col., Curr Opin Rheumatol, vol 12: 155-161 (2000).

Se puede evitar una segunda rotura en el sitio lesionado por inmovilización del músculo lesionado, preferiblemente inmediatamente tras la lesión. La inmovilización permite que el tejido de granulación recientemente formado alcance una resistencia a la tracción suficiente para soportar las fuerzas que aparecen al contraer el músculo.

Un procedimiento conocido para inmovilizar un músculo dañado/distendido requiere el uso de una restricción física o escayola. Por ejemplo, se puede usar un collar cervical para inmovilizar un flexor o extensor cervical lesionado. Sin embargo, el uso de una restricción es a menudo incómodo y molesto. Además, en lesiones de determinados grupos musculares, no es práctico o posible usar una restricción física. Por ejemplo, es muy difícil inmovilizar un músculo trapecio o glúteo distendido con una restricción.

Toxina botulínica

La bacteria anaerobia gran positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipeptídica, la toxina botulínica, que origina una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales denominada botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en el suelo y pueden crecer en envases de comida incorrectamente esterilizada y sellada y en conservas domésticas, lo que es la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen habitualmente entre 18 y 36 horas tras ingerir los alimentos infectados con cultivos o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica aparentemente pasa sin atenuar por el revestimiento del intestino y ataca las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de la intoxicación por la toxina botulínica pueden progresar desde dificultades para caminar, tragar y hablar hasta la parálisis de los músculos respiratorios y la muerte.

La toxina botulínica de tipo A ("BoNT/A") es la neurotoxina biológica natural más letal conocida por el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de toxina botulínica (complejo de la neurotoxina purificado) serotipo A tiene una DL50 en ratones. Una unidad (U) se define como la DL50 tras inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster con un peso de 18-20 gramos cada una. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente diferentes, que son respectivamente las neurotoxinas botulínicas serotipos B, C1, D, E, F y G, cada uno de los cuales se distingue por la neutralización de anticuerpos seroespecíficos. Los distintos serotipos de la toxina botulínica varían en la especie animal a la que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que desencadenan. Por ejemplo, se ha determinado que BoNt/A es 500 veces más potente, según se determina por la tasa de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica serotipo B (BoNT/B). Adicionalmente, se ha determinado que BoNt/B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la DL50 en primates para la BoNt/A. La toxina botulínica aparentemente se une con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, se transloca al interior de la neurona y bloquea la liberación de acetilcolina.

Las toxinas botulínicas se han usado en escenarios clínicos para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. BoNt/A fue aprobado por la Oficina Federal Estadounidense para Fármacos y Alimentos (FDA) para el tratamiento del blefarospasmo, estrabismo y espasmo hemifacial. Los serotipos de la toxina botulínica distintos del serotipo A aparentemente tienen una menor potencia y/o duración más corta de la actividad en comparación con la BoNt/A. Los efectos clínicos intramusculares de una toxina botulínica, como BoNt/A, se pueden notar en horas. Así, es importante tener en cuenta que la mayor parte, o todas, las toxinas botulínicas pueden, tras inyección intramuscular, producir una parálisis muscular significativa un día después de la inyección, según se mide por ejemplo, mediante la puntuación de abducción de dígito (DAS). Aoki K. R., Preclinical Update on BOTOX (Botulinum Toxin Type A)-Purified Neurotoxin Complex Relative to Botulinum Toxin Preparations, Eur J. Neur 1999, 6 (supl. 4): S3-S10. La duración típica del alivio sintomático desde una única inyección intramuscular de BoNt/A es de aproximadamente tres meses de promedio. Las toxinas botulínicas, incluyendo la toxina botulínica tipo A, con periodos reducidos de actividad biológica in vivo se establecen en la solicitud de patente de los Estados Unidos en tramitación conjunta con la presente con número de serle 09/620840, cuya solicitud se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad.

Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas aparentemente inhiben la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, también lo hacen afectando distintas proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en diferentes puntos. Por ejemplo, los serotipos botulínicos A y E escinden la proteína de 25 kiloDalton (kD) asociada al sinaptosoma (SNAP-25), pero se dirige a secuencias de aminoácidos diferentes dentro de esta proteína. BoNT/B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada a la vesícula (VAMP, también denominada sinaptobrevina), escindiendo cada serotipo la proteína en diferentes puntos. Finalmente, se ha demostrado que la toxina botulínica serotipo C1 (BoNT/C1) escinde tanto la sintaxina como la SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar la potencia relativa y/o la duración de la acción de los diferentes serotipos de toxina botulínica.

Sin tener en cuenta el serotipo, el mecanismo molecular de la intoxicación por la toxina parece ser similar e implica al menos tres pasos o etapas. En la primera etapa del proceso, la toxina se une con afinidad elevada a la membrana presináptica de la neurona diana mediante una interacción específica entre la cadena H y un receptor de la superficie celular, se cree que el receptor es diferente para cada serotipo de toxina botulínica y para la toxina tetánica. El segmento carboxiterminal de la cadena H, Hc, parece ser importante para dirigir la toxina a la superficie celular.

En el segundo paso, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. La toxina se introduce en la célula mediante endocitosis mediada por receptor, y se forma un endosoma que contiene la toxina. A continuación, la toxina se escapa del endosoma al citoplasma de la célula. Se cree que el último paso está mediado por el segmento aminoterminal de la cadena H, HN, que desencadena un cambio conformacional de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5,5 o inferior. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que disminuye el pH endosomial. El cambio conformación expone los restos hidrófobos de la toxina, lo que permite que la toxina se incluya a sí misma en la membrana endosomial. La toxina a continuación se transloca desde la membrana endosomial en el citosol.

El último paso del mecanismo de la actividad de la toxina botulínica parece implicar la rotura de proteínas críticas por exocitosis intracelular mediante la cadena L. La actividad tóxica completa de las toxinas botulínica y tetánica está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de cinc (Zn++) que rompe selectivamente proteínas esenciales para reconocimiento y unión de vesículas que contienen neurotransmisor con la superficie citoplásmica de la membrana plasmática y fusión de las vesículas con la membrana plasmática. La neurotoxina tetánica, toxina botulínica/B/D,/F, y/G causan la degradación de la sinaptobrevina (también denominada proteína de membrana asociada a la vesícula (VAMP)), una proteína de la membrana sinaptosomial. La mayor parte de VAMP presente en la superficie citosólica de la vesícula sináptica se elimina como resultado de uno cualquiera de estos episodios de rotura. Cada toxina rompe específicamente un enlace diferente.

El peso molecular de la molécula de proteína de la toxina botulínica, para los siete serotipos conocidos de toxina botulínica, es aproximadamente 150 kD. De forma interesante, las toxinas botulínicas se liberan por las bacterias clostrídicas en forma de complejos que comprenden la molécula de proteína de la toxina botulínica de 150 kD junto con proteínas no toxinas asociadas. De esta forma, el complejo BoNt/A se puede producir por la bacteria clostrídica en formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. BoNT/B y Ci se producen aparentemente únicamente como un complejo de 500 kD. BoNT/D se produce en complejos tanto de 300 kD como de 500 kD. Finalmente, BoNT/E y F se producen como sólo en complejos aproximadamente de 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, peso molecular mayor de aproximadamente 150 kD) contienen una proteína hemaglutinina no toxina y una proteína hemaglutinina no toxina y no tóxica. Estas dos proteínas no toxinas (junto con la molécula de toxina botulínica comprenden el complejo de neurotoxina relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización de la molécula de toxina botulínica y protección contra los ácidos digestivos cuando la toxina se ingiere. Adicionalmente, es posible que los complejos de toxina botulínica más grandes (mayores de aproximadamente 150 kD de peso molecular) puedan dar como resultado una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica desde el punto de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica.

Los estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por el catión potasio tanto de acetilcolina como de norepinefrina de cultivos de células primarias del tejido del tronco encefálico. Adicionalmente, se ha informado de que la toxina botulínica inhibe la liberación evocada de glicina y glutamato en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y que en las preparaciones de sinaptosoma, la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y glutamato.

BoNt/A se puede obtener estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador, y cosechando y purificando la mezcla fermentada de acuerdo con procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas de cadena sencilla que se deben escindir o romper mediante proteasas para que se vuelvan neuroactivas. Las cepas bacterianas que producen la toxina botulínica serotipos A y G poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G pueden por tanto recuperarse de los cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa, Por el contrario, los serotipos de toxina botulínica C1, D y E se sintetizan mediante cepas no proteolíticas y por tanto típicamente están inactivadas cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen por cepas tanto proteolíticas como no proteolíticas y por tanto se pueden recuperar en formas tanto activa como inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo BoNt/B sólo escinden una parte de la toxina producida. La proporción exacta entre moléculas escindidas y no escindidas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por tanto, un determinado porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina BoNt/B es probable que sea inactiva, posiblemente lo que representa la potencia significativamente menor conocida de la BoNt/B en comparación con la BoNt/A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactivas en una preparación clínica contribuirá a que la carga de proteína total de la preparación, que se ha relacionado con un aumento en la antigenia sin contribuir a su eficacia clínica. Adicionalmente, se sabe que BoNt/B tiene, tras inyección intramuscular, una duración de la actividad más corta y también menos potente que BoNt/A para el mismo nivel de dosis.

Se ha informado de que BoNt/A se ha usado en escenarios clínicos como sigue:

(1)

aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (músculos múltiples) para tratar la distonia cervical;

(2)

5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar las líneas del entrecejo (arrugas de la frente) (5 unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo procerus y 10 unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo corrugador superciliar);

(3)

aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar el estreñimiento por inyección intraesfínter del músculo puborectal;

(4)

aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado intramuscularmente para tratar el blefaroespasmo por inyección del musculo orbicular pretarsal lateral del ojo del párpado superior y el pretarsal lateral del ojo del párpado inferior.

(5)

para tratar el estrabismo, se han inyectado intramuscularmente con entre aproximadamente 1-5 unidades de BOTOX®, variando la cantidad inyectada en función del tamaño del músculo a inyectar y 1 disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California bajo el nombre comercial de BOTOX® la extensión de la parálisis deseada (es decir, cantidad de corrección dióptera deseada).

(6)

para tratar la espasticidad de las extremidades superiores tras ictus por inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores de las extremidades superiores como sigue:

(a)

músculo flexor común profundo de los dedos: 7,5 U a 30 U

(b)

músculo flexor superficial de los dedos: 7,5 U a 30 U

(c)

flexor ulnar del carpo: 10 U a 40 U

(d)

flexor radial del carpo: 15 U a 60 U

(e)

bíceps braquial: 50 U a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados se inyectó en la misma sesión de tratamiento, de forma que el paciente fue dosificado con de 90 U a 360 U de BOTOX® en el músculo flexor de la extremidad superior mediante inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento.

El éxito de BoNt/A para tratar diferentes dolencias clínicas ha llevado a interesarse por otros serotipos de toxina botulínica. Se ha llevado a cabo un estudio de dos preparaciones de BoNT/A comercialmente disponibles (BOTOX® y Dysport®) y preparaciones de BoNT/B y F (ambas obtenidas de Wako Chemicals, Japón) para determinar la eficacia local de debilitación del músculo, la seguridad y el potencial antigénico. Se inyectaron preparaciones de toxina botulínica en la cabeza del músculo del gastrocnemius derecho (0,5 a 200,0 unidades/kg) y se evaluó la debilidad muscular usando el ensayo de puntuación de abducción del dígito en ratón. Se calcularon los valores de la CE50 a partir de las curvas dosis-respuesta. Se proporcionaron inyecciones intramusculares a más ratones para determinar las dosis DL50. Se calculó el índice terapéutico como DL50/CE50. Grupos diferenciados de ratones recibieron inyecciones de BOTOX® en la extremidad impedida (5,0 a 10,0 unidades/kg) o BoNt/B (50,0 a 400,0 unidades/kg), y se ensayaron la debilidad muscular y el aumento en el consumo de agua, siendo lo último un posible modelo de sequedad bucal. Se evaluó el potencial antigénico por inyecciones intramusculares mensuales en conejos (2,0 u 8,7 unidades/kg para BoNt/B o 3,0 unidades/kg para BOTOX®). La debilidad muscular punta y la duración estuvieron relacionadas con la dosis para todos los serotipos. Los valores DAS de CE50 (unidades/kg) fueron como sigue: BOTOX®: 6,7, Dysport®: 24,7, BoNt/B: 11,8 a 244,0, BoNT/F: 4,3. BOTOX® Tuvo una duración de acción más larga que BoNt/B o BoNt/F. Los valores del índice terapéutico fueron como sigue: BOTOX®: 10,5, Dysport®: 6.3, BoNt/B: 4,8. El consumo de agua fue superior en los ratones inyectados con BoNt/B que en los inyectados con BOTOX® aunque BoNt/B fue menos eficaz como debilitante muscular. Tras cuatro meses de inyecciones 2 de 4 (tratados con 1,5 ng/kg) y 4 de 4 (tratados con 6,5 ng/kg) conejos desarrollaron anticuerpos contra BoNt/B. En un estudio independiente, 0 de 9 conejos tratados con BOTOX® mostraron anticuerpos contra BoNt/A. Los resultados de DAS indican potencias puntas relativas de BoNt/A iguales a BoNt/F, y BoNt/F mayor que BoNt/B. Con respecto a la duración del efecto, BoNt/A fue superior a BoNt/B, y la duración del efecto de BoNt/B fue superior al de BoNt/F. Como se demuestra por los valores de los índices terapéuticos, las dos preparaciones comerciales de BoNt/A (BOTOX® y Dysport®) son diferentes. El aumento en el comportamiento de consumo de agua observado tras inyección en la extremidad impedida de BoNt/B indica que cantidades significativas de este serotipo entraron en la circulación sistémica del murino. Los resultados indican también que para conseguir una eficacia comparable a comparable BoNt/A, es necesario aumentar la dosis del resto de serotipos examinados. El aumento en la dosificación puede comprometer la seguridad. Además, en conejos, el serotipo B fue más antigénico que el BOTOX®, posiblemente debido a la mayor carga de proteína inyectada localmente para conseguir una dosis eficaz de BoNt/B.

La neurotoxina tetánica actúa principalmente en el sistema nervioso central mientras que la neurotoxina botulínica actúa en la unión neuromuscular; ambas actúan inhibiendo la liberación de acetilcolina desde el axón de la neurona afectada en la sinapsis, dando como resultado la parálisis. El efecto de intoxicación de la neurona afectada es de larga duración y hasta fechas recientes se consideraba irreversible. Se sabe que la neurotoxina tetánica existe en un único serotipo inmunológicamente independiente.

Acetilcolina

Normalmente, sólo se libera una molécula de neurotransmisor de pequeño tamaño por cada tipo de neurona del sistema nervioso de los mamíferos. El neurotransmisor acetilcolina se secreta desde neuronas de diferentes áreas del cerebro, pero específicamente, las grandes células piramidales del córtex motor, por varias neuronas diferentes de los ganglios basales, por neuronas motoras que inervan los músculos esqueléticos, por neuronas pregangliónicas del sistema nervioso autónomo (tanto simpático como parasimpático), por neuronas postgangliónicas del sistema nervioso parasimpático y por algunas de las neuronas postgangliónicas del sistema nervioso simpático. Esencialmente, sólo las fibras nerviosas postgangliónicas del sistema nervioso simpático de las glándulas sudoríparas, los músculos piloerectores y unos pocos vasos sanguíneos son colinérgicos y la mayor parte de neuronas postgangliónicas del sistema nervioso simpático liberan el neurotransmisor norepinefrina. En la mayor parte de los casos, la acetilcolina tiene un efecto excitatorio. Sin embargo, se sabe que la acetilcolina tiene efectos inhibitorios en parte de las terminaciones del sistema nervioso parasimpático, tal como la inhibición del corazón por el nervio vago.

Las señales aferentes del sistema nervioso autónomo se transmiten por al cuerpo mediante tanto el sistema nervioso simpático como el sistema nervioso parasimpático. Las neuronas pregangliónicas del sistema nervioso simpático se extienden desde los cuerpos celulares de las células neuronales ubicadas en el cuerno intermediolateral de la médula espinal. Las fibras nerviosas pregangliónicas simpáticas se extienden por el cuerpo celular, hacen sinapsis con las neuronas postgangliónicas ubicadas tanto en el ganglio simpático paravertebral

o en un ganglio prevertebral. Como las neuronas pregangliónicas del sistema nervioso tanto simpático como parasimpático son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a los ganglios excitará las neuronas postgangliónicas tanto simpáticas como simpáticas.

La acetilcolina activa dos tipos de receptores, receptores muscarínico y nicotínico. Los receptores muscarínicos se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por las neuronas postgangliónicas del sistema nervioso parasimpático, así como las estimuladas por las neuronas colinérgicas postgangliónicas del sistema nervioso simpático. Los receptores nicotínicos se encuentran en las sinapsis entre las neuronas pregangliónicas y postgangliónicas tanto del simpático como del parasimpático. Los receptores nicotínicos también están presentes en muchas membranas de las fibras del músculo esquelético en la unión neuromuscular.

La acetilcolina se libera desde las neuronas colinérgicas cuando las vesículas pequeñas transparentes intracelulares se fusionan con la membrana celular de la membrana presináptica. Una amplia variedad de células secretoras no neuronales, tales como médula adrenal (así como la línea celular PC12) y las células de los islotes pancreáticos liberan catecolaminas e insulina, respectivamente desde vesículas grandes de núcleo denso. La línea celular PC12 es un clon de células de feocromocitoma de ratas muy usado como modelo de cultivo tisular para estudios de desarrollo simpatoadrenal. La toxina botulínica inhibe la liberación de ambos tipos de compuestos desde ambos tipos de células in vitro, permeabilizadas (como mediante electroporación) o mediante inyección directa de la toxina en la célula desinervada. También es sabido que la toxina botulínica bloquea la liberación del neurotransmisor glutamato desde cultivos celulares de sinaptosomas.

Una unión neuromuscular se forma en el músculo esquelético en la vecindad entre axones y células musculares. Una señal transmitida por el sistema nervioso da como resultado un potencial de acción en el axón terminal, con activación de los canales de sodio y liberación del neurotransmisor acetilcolina desde las vesículas sinápticas intraneuronales, por ejemplo en la placa final motora de la unión neuromuscular. La acetilcolina cruza el espacio extracelular para unirse a las proteínas del receptor acetilcolina en la superficie de la placa final muscular. Una vez se ha producido una unión suficiente, un potencial de acción en la célula muscular origina cambios específicos en el canal de iones de la membrana, dando como resultado la contracción de la célula muscular. A continuación, la acetilcolina se libera desde las células musculares y se metaboliza por las colinesterasa en el espacio extracelular. Los metabolitos se recirculan al axón terminal para convertirlos de nuevo en acetilcolina.

Como se ha descrito anteriormente, los procedimientos actuales para tratar músculos lesionados siguen siendo inadecuados. Existe necesidad de tener procedimientos mejorados para tratar músculos lesionados.

RESUMEN

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una toxina botulínica para uso según se ha definido en la reivindicación 1. El tratamiento puede incluir la etapa de administrar localmente in vivo una cantidad de toxina botulínica en la proximidad del músculo lesionado. La toxina botulínica funciona proporcionando un quimiodesnervación temporal del músculo lesionado y para reducir las contracciones musculares. Un objeto de la presente invención es la terapia para facilitar la curación y la vuelta rápida a la función de un músculo lesionado. El músculo lesionado puede ser, por ejemplo, un músculo distendido. En una forma de realización, la toxina botulínica neurotoxina se administra intramuscular o subcutáneamente. En otra forma de realización, el paso de administrar la toxina botulínica va precedido por terapia física o cirugía.

Además, de acuerdo con la invención, el paso de administrar la toxina botulínica se realiza inmediatamente después de que el músculo se haya dañado, o tan pronto como sea posible, En una forma de realización, la toxina botulínica es eficaz para inmovilizar o inmovilizar sustancialmente el músculo lesionado durante al menos la fase 1 y/o la fase 2 del proceso de reparación del músculo lesionado.

De acuerdo con la invención, la toxina botulínica puede incluir un componente director, un componente terapéutico y un componente de translocación. El componente director puede unirse a una neurona motora presináptica. En una forma de realización, el componente director puede comprender un fragmento carboxiterminal de una cadena pesada de una toxina butírica, una toxina tetánica o una toxina botulínica tipo A, B, C1, D, E, F, G o una de sus variantes. El componente terapéutico puede interferir o modular la liberación de un neurotransmisor desde una neurona o su proceso. En una forma de realización, el componente terapéutico comprende una cadena ligera de una toxina butírica, una toxina tetánica o de una toxina botulínica tipo A, B, C1, D, E, F, G o una de sus variantes. El componente de translocación puede facilitar la transferencia de al menos parte de la toxina botulínica, por ejemplo el componente terapéutico, al citoplasma de la célula diana. En una forma de realización, el componente de translocación puede comprender un fragmento aminoterminal de una cadena pesada de una toxina butírica, una toxina tetánica o una toxina botulínica tipo A, B, C1, D, E, F, G o sus variantes.

Adicionalmente de acuerdo con la invención, la toxina botulínica es una toxina botulínica tipo A, B, E y/o F. En una forma de realización, preferida, la toxina botulínica usada para tratar un músculo lesionado es una toxina botulínica tipo A. De hecho, el uso de la toxina botulínica tipo A se prefiere debido a su disponibilidad comercial, usos clínicos conocidos y aplicación con éxito para tratar lesiones musculares de acuerdo con la presente invención, según se desvela en el presente documento. El uso de aproximadamente 0,1 U/kg hasta aproximadamente 30 U/kg de una toxina botulínica tipo A y de aproximadamente 1 U/kg hasta aproximadamente 150 U/kg de una toxina botulínica tipo B queda comprendido en el alcance de un procedimiento realizado de acuerdo con la presente invención revelada. Con respecto al resto de serotipos de toxina botulínica (incluyendo los tipos de toxinas E y F) la dosificación en U/kg a usar está comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,1 U/kg a aproximadamente 150 U/kg, como se establecen el presente documento.

Además, de acuerdo con la invención, la toxina botulínica se puede producir de forma recombinante.

Una forma de realización detallada de la presente invención es un procedimiento para tratar (como estimular la curación de) un músculo lesionado mediante administración local in vivo, de una cantidad terapéuticamente eficaz de una toxina botulínica a un músculo lesionado, tratando de esta forma el músculo lesionado. La toxina botulínica puede ser una toxina botulínica tipo A. Significativamente, la presente invención también abarca un procedimiento para tratar el dolor asociado con un músculo lesionado mediante administración local in vivo, de una cantidad terapéuticamente eficaz de una toxina botulínica a un músculo lesionado, reduciendo de esta manera el dolor asociado con un músculo lesionado.

Definiciones

Se proporcionan y aplican las siguientes definiciones al presente documento.

"Aproximadamente" significa aproximado o cerca y en el contexto de un intervalo o rango numérico definido indica el ±10% del valor o rango numérico indicado o reivindicado.

"Cadena pesada" significa la cadena pesada de una neurotoxina clostrídrica. Tiene preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 100 kDa y se puede denominar en el presente documento como cadena H o H.

"HN" significa un fragmento (preferiblemente que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa) derivado de la cadena H de una neurotoxina clostrídrica que es aproximadamente equivalente al segmento aminoterminal de la cadena H, o la porción correspondiente a dicho fragmento en la totalidad de la cadena H. Se cree que contiene la porción de la neurotoxina clostrídrica de tipo natural o salvaje implicada en la translocación de la cadena L por una membrana endosomial intracelular.

"Hc" significa un fragmento (aproximadamente 50 kDa) derivado de la cadena H de una neurotoxina clostrídrica que es aproximadamente equivalente al segmento carboxiterminal de la cadena H, o la porción correspondiente a dicho fragmento en la totalidad de la cadena H. Se cree que es inmunogénico y contiene la porción de la neurotoxina clostrídrica de tipo natural o salvaje implicada en la unión presináptica de alta afinidad a las neuronas motoras.

"Músculo lesionado" incluye un músculo distendido, torsionado o contraído, así como un

músculo con una contusión (hematoma), laceración, isquemia o ruptura.

"Cadena ligera" significa la cadena ligera de una neurotoxina clostrídrica. Tiene preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, y puede denominarse como cadena L, L o como región proteolítica (secuencia de aminoácidos) de una neurotoxina clostrídrica. Se cree que la cadena ligera es eficaz como inhibidor de la liberación del neurotransmisor cuando se libera dentro del citoplasma de una célula diana.

"Administración local" significa administración directa de un compuesto farmacéutico en o en la proximidad de un punto o dentro de un cuerpo animal, en el punto en que se desea la actividad biológica del compuesto farmacéutico. La administración local excluye las rutas sistémicas de administración, como la administración intravenosa o la oral.

"Neurotoxina" significa una toxina botulínica.

"Variante" significa una entidad química que es ligeramente distinta de una entidad química pariente pero que sigue teniendo un efecto biológico. El efecto biológico de la variante puede ser esencialmente el mismo o mejor que el del otro pariente. Por ejemplo, una cadena ligera variante de una toxina botulínica que tiene al menos un aminoácido sustituido, modificado, eliminado o agregado, puede tener la misma o mejor capacidad de evitar la liberación de vesículas de neurotransmisor. Adicionalmente, el efecto biológico de una variante puede estar disminuido. Por ejemplo, una cadena ligera variante de una toxina botulínica tipo A que tiene un motivo basado en leucina eliminado puede tener una persistencia biológica más corta que la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A pariente (o nativa).

Un procedimiento eficaz para tratar un músculo lesionado de acuerdo con la presente invención puede incluir el paso de administrar localmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una neurotoxina en un músculo lesionado. Preferiblemente, el músculo lesionado es un músculo distendido.

Una tensión por distensión del músculo esquelético se puede clasificar como una lesión de cizalladura. En una lesión de cizalladura, no solo se torsionan las miofibrillas, sino también las vainas misiales. Casi inmediatamente después de la lesión muscular, se inicia un proceso de reparación. El proceso de reparación de la lesión de cizalladura se puede dividir en tres fases.

La fase 1 es la fase de destrucción, que se caracteriza por la formación del hematoma, necrosis de las miofibrillas y reacción de las células inflamatorias. El emplazamiento de rotura del por otro lado músculo sano se produce cerca de su unión miotendinosa (MTJ) distal tras una lesión. Las miofibrillas rotas se contraen y se forma una hendidura entre las secciones. Como el músculo esquelético está muy vascularizado, la hemorragia de los vasos torsionados no puede salir y la hendidura se rellena con un hematoma, que posteriormente se rellenará con tejido cicatrizado. En la lesión de cizalladura, la fuerza mecánica rompe la miofibrilla completa, dañando la membrana plasmática de la miofibrilla y dejando el sarcoplasma abierto en los extremos de las secciones. Como las miofibrillas son células tipo cadena muy largas, la necrosis iniciada en ese punto se extiende por toda la longitud de la miofibrilla rota. Los vasos sanguíneos se torsionan también en las lesiones de cizalladura; de esta forma, las células inflamatorias arrastradas por la sangre acceden inmediatamente al sitio lesionado para inducir la inflamación. La fase 1 persiste durante aproximadamente 2 a 3 días tras la lesión.

La fase 2 es la fase de reparación, que consiste en la fagocitosis del tejido necrosado, regeneración de las miofibrillas, producción de cicatriz de tejido conectivo y crecimiento hacia el interior de los capilares. La etapa clave de la regeneración del tejido del músculo lesionado es la vascularización del área lesionada. La restauración del suministro vascular es necesaria para la regeneración de un músculo lesionado. Los nuevos capilares se extienden desde los troncos supervivientes de los vasos sanguíneos y perforan el centro del área lesionada. Los capilares ayudan a proporcionar un suministro de oxígeno adecuado al área en regeneración.

La fase 3 es la fase de remodelación, que consiste en la maduración de las miofibrillas regeneradas, contracción y reorganización del tejido cicatrizado, y la restauración de la capacidad funcional del músculo reparado. Las fases 2 (reparación) y 3 (remodelación) a menudo se producen simultáneamente y persisten durante aproximadamente 2 días hasta aproximadamente seis semanas después de la fase 1.

En una forma de realización de la presente invención, la neurotoxina se administra localmente, preferiblemente intramuscularmente, para inmovilizar el músculo lesionado para facilitar la curación. La administración local de una neurotoxina de acuerdo con la invención dada a conocer aquí puede reducir también el dolor experimentado debido a una lesión muscular. Preferiblemente, la administración de la neurotoxina se realiza inmediatamente en el momento de la lesión o muy cerca de la misma. En una forma de realización preferida, la neurotoxina es eficaz para inmovilizar el músculo lesionado durante la fase de destrucción (fase 1) para evitar que el músculo se vuelva a romper.

Sin desear limitar la invención a ninguna teoría concreta sobre el mecanismo de acción, se cree que la movilización durante las fases de reparación y/o remodelación es beneficiosa porque dicha movilización induce un crecimiento hacia el interior de los capilares más rápido e intenso en la zona lesionada, así como una mejor regeneración y orientación de la fibra muscular. Por tanto, en una forma de realización, el efecto de inmovilización de la toxina botulínica está ausente durante la fase de reparación (fase 2) y/o fase de remodelación (fase 3). En una forma de realización más preferida, la toxina botulínica se administra por ser eficaz para inmovilizar el músculo lesionado durante la fase 1, pero no durante las fases 2 y 3 del proceso de reparación. Por ejemplo, si la toxina botulínica se inyecta, preferiblemente intramuscularmente, inmediatamente en el músculo tras una lesión, es preferible que se inmovilice el músculo lesionado durante aproximadamente 3 días tras el periodo de administración. Alternativamente, la toxina botulínica puede producir únicamente su efecto de inmovilización hasta el punto en que el paciente experimente poco o nada de dolor al usar el músculo lesionado en los movimientos básicos. Cuando se alcanza dicho punto crítico, el paciente debe animarse a iniciar una movilización activa progresiva.

En otra forma de realización de la presente invención, la toxina botulínica es eficaz para inmovilizar el músculo lesionado en todos los periodos de las fases 1-3 y durante un periodo de recuperación de la lesión muscular posterior.

Las toxinas botulínicas puede requerir desde menos de aproximadamente una día a aproximadamente siete días para mostrar un efecto significativo de parálisis clínica y/o en el que el efecto parálisis clínica se mantiene tras la inyección durante un periodo de varios meses, que dan comprendidas en el ámbito de la presente invención, ya que se pueden usar para tratar lesiones musculares relativamente graves o de larga duración o cuando está indicado un periodo prolongado de inmovilización muscular para una curación correcta.

Se usa una toxina botulínica debido a los usos conocidos y seguridad clínica de una toxina botulínica, tal como la toxina botulínica tipo E para tratar trastornos musculares, como espasmos musculares. En una forma de realización de la invención particularmente preferida, especialmente en caso de lesiones musculares graves de tercer grado, la toxina botulínica administrada localmente es una toxina botulínica tipo E. También se puede usar la toxina botulínica tipo A en ambas formas de realización.

Aunque las toxinas botulínicas de la presente invención tratan músculo lesionados por inmovilización de los mismos, la toxina botulínica puede reducir el dolor y/o el espasmo. La toxina botulínica es capaz de inmovilizar el músculo lesionado y reducir el dolor asociado a dicho músculo lesionado. En una forma de realización preferida, se administra una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica tipo E, o lo más preferiblemente tipo A, a un músculo distendido para inmovilizar el músculo y/o reducir el dolor asociado a dicho músculo.

Por supuesto, un profesional sanitario normalmente experto en la técnica sabe determinar la dosis adecuada y la(s) frecuencia(s) de administración (s) para conseguir un resultado clínico óptimo. Esto es, una persona normalmente experta en medicina será capaz de administrar la cantidad adecuada de agente bloqueante neuromuscular en el momento o momentos adecuados para inmovilizar adecuadamente el o los músculo(s) lesionado(s). La dosis de la toxina botulínica a administrar depende de una variedad de factores incluyendo el tamaño del músculo, la gravedad de la lesión muscular. En una forma de realización preferida, la dosis de la toxina botulínica a administrar inmoviliza el o los músculo(s) lesionado(s) durante un tiempo no superior a la duración de la fase 1 del proceso de reparación. En los diferentes procedimientos de la presente invención, se pueden administrar de aproximadamente 0,1 U/kg a aproximadamente 15 U/kg, de toxina botulínica tipo A al músculo lesionado. Preferiblemente, se pueden administrar de aproximadamente 1 U/kg a aproximadamente 20 U/kg de toxina botulínica tipo A al músculo lesionado. El uso de aproximadamente 0,1 U/kg a aproximadamente 30 U/kg de una toxina botulínica tipo A y de aproximadamente 1 U/kg a aproximadamente 150 U/kg de una toxina botulínica tipo B está comprendido en el alcance de un procedimiento practicado de acuerdo con la invención dada a conocer aquí. Con respecto a otros serotipos de toxina botulínica (incluyendo los tipos de toxina E y F), la dosificación en U/kg a usar está comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,1 U/kg a aproximadamente 150 U/kg, como se define en el presente documento.

La inyección intramuscular es la ruta de administración.

En otra forma de realización amplia, el procedimiento de tratar el músculo lesionado de acuerdo con esta invención incluye además otros pasos descritos a continuación. Estos otros pasos pueden realizarse antes de, junto con, o tras la etapa de administrar una toxina botulínica preferiblemente al músculo lesionado. Por ejemplo, el tratamiento actualmente recomendado para un músculo distendido incluye el reposo, aplicación de hielo, compresión y elevación. Estos cuatro pasos (o procedimientos) tienen el mismo objetivo. Minimizan el sangrado desde los vasos sanguíneos rotos hasta el punto de ruptura. Esto va a prevenir la formación de un gran hematoma, lo que tiene un impacto directo sobre el tamaño del tejido cicatrizado al final de la regeneración. Un hematoma pequeño y la limitación de la acumulación de edema intersticial en el punto de ruptura también acortan el periodo isquémico en el tejido de granulación, que a su vez acelera la regeneración.

Se pueden emplear otros pasos adicionales en el tratamiento de músculo lesionado. En una forma de realización, el paso adicional incluye la administración de un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), ultrasonido terapéutico, oxígeno hiperbárico, y en lesiones graves, también se puede emplear la cirugía. Los NSAID deben formar parte del tratamiento temprano, y se debe iniciar inmediatamente tras la lesión, El uso a corto plazo de NSAID en la fase temprana de la curación disminuye la reacción de células inflamatorias y no tiene efectos secundarios sobre las propiedades tensiles o contráctiles del músculo lesionado.

En otra forma de realización, los pasos adicionales incluyen el uso de ultrasonido terapéutico. El ultrasonido terapéutico es ampliamente recomendado y usado en el tratamiento de distensiones musculares. Se piensa que el ultrasonido terapéutico estimula la fase de proliferación en la miorregeneración.

En otra forma de realización, los pasos adicionales incluyen el uso de oxígeno

hiperbárico. Se sabe que la terapia con oxígeno hiperbárico en conejos durante la fase temprana de la reparación mejora sustancialmente el resultado final. Se cree que dicha terapia con oxígeno hiperbárico en otros mamíferos, por ejemplo, seres humanos, puede ser útil para acelerar la regeneración muscular.

En otra forma de realización, los pasos adicionales incluyen la intervención quirúrgica. El tratamiento quirúrgico de las lesiones musculares debe reservarse a las lesiones más graves, porque en la mayor parte de los casos los tratamientos conservativos dan lugar a un buen resultado. El tratamiento quirúrgico se indica únicamente en los casos de (1) grandes hematomas intramusculares, (2) distensiones o rasgados musculares de tercer grado con pocos o ningún músculo agonista, y (3) distensiones de segundo grado, si se ha torcido más de la mitad del paquete muscular.

En otro aspecto amplio de esta invención, se usan técnicas recombinantes para producir al menos uno de los componentes de las toxinas botulínicas. La técnica incluye los pasos de obtener materiales genéticos tanto de ADN clonado a partir de fuentes naturales o secuencias de oligonucleótidos sintéticos, con códigos para uno de los componentes, por ejemplo el componente o componentes terapéuticos, translocación y/o director. Las construcciones genéticas se incorporan a células huésped para amplificación fusionando en primer lugar las construcciones genéticas con un vector de clonación, como fagos o plásmidos. A continuación, los vectores de clonación se insertan en huéspedes, preferiblemente E. coli. Siguiendo las expresiones de los genes recombinantes en células huésped, las proteínas resultantes se pueden usar con técnicas convencionales. La proteína expresada puede comprender los tres componentes de la neurotoxina. Por ejemplo, la proteína expresada puede incluir una cadena ligera de la toxina botulínica tipo E (el componente terapéutico), una cadena pesada, preferiblemente la HN, de una toxina botulínica tipo B (el componente de translocación), y una toxina botulínica tipo A HC, que se une selectivamente a las neuronas motoras. En una forma de realización, la proteína expresada puede incluir menos de los tres componentes de la neurotoxina. En ese caso, los componentes pueden unirse químicamente usando técnicas conocidas en la técnica.

Puede haber muchas ventajas en la producción de estas toxinas botulínicas de forma recombinante. Por ejemplo, la producción de toxina botulínica a partir de cultivos de Clostridium anaerobios es un proceso engorroso que necesita tiempo e incluye un protocolo de purificación multietapa que implica varias etapas de precipitación de la proteína y una cristalización prolongada y repetida de la toxina o varias etapas de cromatografía en columna. Significativamente, la elevada toxicidad del producto determina que el procedimiento debe realizarse bajo confinamiento estricto (BL-3). Durante el proceso de fermentación, las neurotoxinas plegadas de cadena simple se activan mediante las proteasas clostridiales endógenas mediante un procedimiento denominado hender (nicking). Éste implica la eliminación de aproximadamente 10 restos de aminoácido de la cadena simple para crear dicha forma en la que las dos cadenas permanecen unidas covalentemente mediante un puente disulfuro intracatenario.

La toxina botulínica hendida es mucho más activa que la forma no hendida. La cantidad y ubicación precisa de la hendidura varía con los serotipos de la bacteria productora de toxina. La diferencia entre la activación de la toxina botulínica de cadena simple y, por tanto el rendimiento de la toxina hendida, se debe a variaciones en el tipo y cantidades de actividad proteolítica producida por una cadena dada. Por ejemplo, más del 99% de la toxina de Clostridium botulinum de cadena simple de tipo A se activa mediante la cepa Hall A de Clostridium botulinum, mientras que las cepas de tipo B y E producen toxinas con menores cantidades de activación (0 a 75% dependiendo de la línea de fermentación). Por tanto, la elevada toxicidad de la toxina madura juega un papel importante en la fabricación comercial de las neurotoxinas como neurotoxinas terapéuticas.

El grado de activación de las toxinas clostrídricas diseñadas mediante ingeniería genética es, por tanto, una consideración importante en la fabricación de dichos materiales. Sería una importante ventaja si la toxina botulínica pudiera expresarse de forma recombinante, en bacterias de alto rendimiento con crecimiento rápido (como células de E. coli heterólogas) como cadenas simples relativamente no tóxicas (o cadenas simples con actividad tóxica reducida) que son más seguras y fáciles de aislar y simplemente convertirlas en la forma completamente activa.

Siendo la seguridad la primera preocupación, el trabajo anterior se ha centrado en la expresión en E. coli y la purificación de las cadenas H y L individuales del las toxinas tetánica y botulínica; estas cadenas aisladas no son tóxicas por sí mismas; consultar Li y col., Biochemistry

33: 7014-7020 (1994); Zhou y col., Biochemistry 34: 15175-15181 (1995), incorporadas aquí por referencia al presente documento. Tras la producción independiente de estas cadenas peptídicas y en condiciones estrictamente controladas, las subunidades H y L se pueden combinar por enlace oxidativo con disulfuro para formar el dicatenario neuroparalizante.

Los siguientes ejemplos no limitantes proporcionan procedimientos preferidos para tratar músculos lesionados y producir toxinas botulínicas recombinantes. Los procedimientos para producir toxinas botulínicas recombinantes descritos en los Ejemplos 4-8 siguientes se han extraído y son similares a los que describen Dolly y col. Solicitud de Patente Internacional Nº WO 95/32738, cuya memoria descriptiva se incorpora en su totalidad por referencia al presente documento.

Ejemplo 1 Tratamiento de un tendón roto del bíceps

Las roturas del bíceps braquial se producen normalmente en el extremo proximal e implican la cabeza larga del bíceps. El músculo se puede romper en la inserción distal en el radio, pero es raro. Más frecuentemente, las roturas se producen en adultos de más de 40 años de edad con un historial médico prolongado de dolor en el hombro secundario a un síndrome de pinzamiento. Con el tiempo, el tendón se desgasta y debilita, y finalmente se rompe, parcial o totalmente. Sin que sea importante, la rotura se produce a menudo por un evento trivial. Estas roturas están normalmente asociadas con un desgarro del manguito rotador, especialmente entre las personas ancianas.

Un hombre de 45 años de edad acudió a consulta con una protuberancia en el antebrazo tras subir unas cajas pesadas. Informó de un historial de dolor súbito agudo en el brazo, a veces acompañado de un chasquido. El hombre fue diagnosticado de rotura en el tendón del bíceps y se encontraba al inicio de la fase 1 del proceso de reparación. La rotura se clasificó como una distensión leve de segundo grado.

El paciente se trató mediante una inyección en bolo de entre aproximadamente 0,1 U/kg y aproximadamente 25 U/kg de una neurotoxina intramuscularmente en el bíceps. Preferiblemente la neurotoxina es toxina botulínica tipo E y/o F, más preferiblemente tipo A. La dosis particular y frecuencia de las administraciones depende de varios factores, y debe determinarse por el médico a cargo del paciente. Se pidió al paciente que descansara y se aplicara hielo y compresión al bíceps. En aproximadamente tres días tras la administración de la neurotoxina, el paciente era capaz de doblar el brazo. Igualmente, tras aproximadamente tres días, el paciente experimenta una reducción en la inflamación, que es un signo de la entrada del paciente en las fases 2 y 3 del proceso de reparación. El paciente también experimenta una reducción significativa del dolor. La administración de aproximadamente 10 unidades a aproximadamente 200 unidades de toxina botulínica tipo A también puede usarse para una inmovilización y reducción del dolor a largo plazo (2-4 meses) del músculo.

Ejemplo 2 Ruptura del mecanismo extensor

La ruptura del mecanismo extensor de la rodilla se produce en una de dos formas: en pacientes más jóvenes como resultado de una fuerza violenta (como saltar, levantar pesos) y en pacientes mayores por una fuerza relativamente poco importante. En cualquiera de los grupos, puede existir arqueo previo. Esta dolencia afecta a los pacientes mayores que han sido típicamente sedentarios y han aumentado bruscamente su nivel de actividad, o en pacientes con una dolencia anterior o simultánea como diabetes mellitus, artritis reumatoide, y otras dolencias inflamatorias sistémicas, o cirugía anterior en la rodilla.

Una jugadora de fútbol de 22 años de edad acudió a consulta con una incapacidad para extender la rodilla. La paciente también era incapaz de mantener recta la rodilla alzada, pero podía caminar si mantenía una mano en el muslo y mantenía la rodilla en extensión. Una radiografía frontal mostró la rótula en una ubicación baja inusual. Se diagnosticó a la paciente de rotura grave del cuádriceps.

Tras determinar la gravedad de la lesión (tercer grado), la paciente estuvo de acuerdo en someterse a cirugía reparativa. Tras la intervención, la paciente se trató mediante una inyección en bolo de entre aproximadamente 0,1 U/kg y aproximadamente 25 U/kg de una neurotoxina (tal como aproximadamente 10 unidades a aproximadamente 400 unidades de toxina botulínica tipo A) intramuscularmente al cuádriceps. Preferiblemente la neurotoxina es toxina botulínica tipo A. La dosis particular y frecuencia de las administraciones depende de varios factores, y debe determinarse por el médico a cargo del paciente. Se pidió a la paciente que descansara y se aplicara hielo y compresión al bíceps. En aproximadamente 15 días tras la administración de la neurotoxina, es posible el movimiento y actividad gradual del músculo lesionado. Se animó a la paciente a mover suavemente el músculo para reforzarlo junto a la musculatura circundante. A medida que el efecto de la toxina se debilitada, la paciente a continuación tuvo la posibilidad de participar en un programa de fisioterapia o retomar la actividad general y/o deportiva. Si esta paciente fuera deportista profesional, la terapia con toxina botulínica le permitiría una pronta vuelta a la práctica deportiva. La administración local de entre aproximadamente 10 unidades a aproximadamente 200 unidades de toxina botulínica tipo A se puede usar para inmovilización muscular a largo plazo (2-4 meses).

Ejemplo 3 Tratamiento del síndrome de estrés medial de la tibia

Los corredores experimentan habitualmente síndrome de estrés medial de la tibia que es causa de dolor y restricción de la actividad. El dolor en la pierna resultante del síndrome de estrés medial de la tibia está causado por pequeños desgarros del músculo de la pierna en el punto de unión con la tibia. Hay dos tipos: 1. Síndrome de estrés medial de la tibia anterior que se produce en la porción frontal del hueso tibial (tibia). 2. síndrome de estrés medial de la tibia posterior que se produce en la parte interna (medial) de la pantorrilla a lo largo de la tibia.

El síndrome de estrés medial de la tibia se debe a desequilibrios musculares, mala absorción del impacto o pie de corredor. La pronación excesiva contribuye al síndrome de estrés medial de la tibia tanto anterior como posterior.

En el tratamiento del músculo distendido, como en el síndrome de estrés medial de la tibia, se recomiendan cinco pasos: (1) Proteger el músculo lesionado de otras lesiones usando férulas, vendajes o muletas; (2) Restringir la actividad, normalmente durante 48 a 72 horas para permitir que se inicie la curación. La administración de una toxina botulínica de acción corta tipo E

o F o una toxina botulínica tipo A modificada para reducir el periodo de actividad biológica in vivo (es decir, un periodo más corto de parálisis del músculo flácido) de la toxina tipo A. Las toxinas botulínicas adecuadas, incluyendo toxina botulínica tipo A, con periodos reducidos de actividad biológica in vivo para uso en el presente documento se definen en la solicitud de patente de los Estados Unidos de propiedad compartida con número de serie 09/620840, dicha solicitud se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. En las distensiones más graves, la restricción de la actividad puede durar de semana a meses. Con una restricción de la actividad más larga, la administración de una toxina botulínica de acción prolongada, por ejemplo toxina botulínica tipo B (no modificada) o más preferiblemente, toxina tipo A, puede ser adecuada. Sin este tratamiento, los pacientes pueden experimentar semanas de actividad restringida. Cuando comienza el proceso de curación, se recomienda el movimiento suave del músculo afectado; (3) Se debe aplicar hielo durante 15-20 minutos cada hora; (4) Debe mantenerse un vendaje elástico de compresión entre las aplicaciones de hielo; y (5) Elevar la zona lesionada para minimizar la hinchazón.

Ejemplo 4 Subclonación del gen de la cadena L de BoNT/A

Este Ejemplo describe los procedimientos para clonar la secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena L de BoNT/A. La secuencia de ADN que codifica la cadena L de BoNT/A se amplificó mediante un protocolo PCR que emplea oligonucleótidos sintéticos con las secuencias, 5'AAAGGCCTTTTGTTAATAAACAA-3' (SEC DE ID Nº 1) y 5'GGAATTCTTACTTATTGTATCCTTTA-3' (SEC DE ID Nº 2). El uso de estos cebadores permite la introducción de los emplazamientos de restricción Stu 1 y EcoR I en los extremos 5' y 3' del fragmento de la cadena L de BoNT/A, respectivamente. Estos emplazamientos de restricción se utilizan posteriormente para facilitar la subclonación unidireccional de los productos de amplificación. Adicionalmente, estos cebadores introducen un codón de detención al extremo C de la secuencia de codificación de la cadena L. El ADN cromosómico procedente de C. botulinum (cepa 63 A) sirve como plantilla en la reacción de amplificación.

La amplificación mediante la PCR se realiza en un volumen de 100 µl conteniendo Tris-HCI 10 mM (pH 8.3), KCI 50 mM, MgCI2 1,5 mM, 0,2 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 50 pmol de cada cebador, 200 ng de ADN genómico y 2,5 unidades de Taq-polimerasa (Promega). La mezcla de reacción se sometió a 35 ciclos de desnaturalización (1 minuto a 94ºC), hibridación (2 minutos a 37ºC) y polimerización (2 minutos a 72ºC). Finalmente, la reacción se extendió durante 5 minutos más a 72ºC.

El producto de la amplificación mediante la PCR se digirió mediante Stu y EcoR I, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligó en pBluescript II SK*digerido mediante Sma I y EcoR I para producir el plásmido, pSAL. Los transformantes bacterianos que albergaban el plásmido se aíslan mediante procedimientos estándar. La identidad del polinucleótido de la cadena L clonada se confirmó por secuenciación del plásmido bicatenario mediante SEQUENASE (United States Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de secuenciación del polinucleótido sintético se prepararon según necesidad para conseguir ciclos de secuenciación solapante. La secuencia clonada se encontró idéntica a la secuencia descrita por Binz, y col., en J. Biol. Chem. 265: 9153 (1990), y en Thompson y col., en Eur. J. Biochem. 189: 73 (1990). También se crearon mutantes dirigidos al emplazamiento diseñados para comprometer la actividad enzimática de la cadena L de BoNT/A.

Ejemplo 5 Expresión de las proteínas de fusión de cadena de la toxina botulínica Tipo A-L (BoNt/A-L) Este Ejemplo describe los métodos para verificar la expresión de las cadenas L de tipo natural, que pueden servir como componente terapéutico, en bacterias que albergan los plásmidos pCA-

L. Se usaron colonias bacterianas bien aisladas que albergaban pCAL para inocular caldo L conteniendo 100 µg/ml de ampicilina y un 2% (p/v) de glucosa, y crecieron toda la noche con agitación a 30ºC. Los cultivos nocturnos se diluyeron 1:10 en caldo L fresco que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se incubaron durante 2 horas. Se indujo la expresión de las proteínas de fusión por adición de IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM. Tras 4 horas de incubación adicional a 30ºC, las bacterias se recogieron por centrifugación a 6.000 x g durante 10 minutos.

Un análisis SDS-PAGE a pequeña escala confirmó la presencia de una banda de proteína de 90 kDa en muestras derivadas de bacterias inducidas por IPTG. Este Mr es consistente con el tamaño predicho de una proteína de fusión con los componentes MBP (-40 kDa) y cadena L de BoNT/A (-50 kDa). Adicionalmente, cuando se compararon con muestras aisladas de los cultivos de control, los clones inducidos por IPTG contenían cantidades sustancialmente mayores de la proteína de fusión.

La presencia de las proteínas de fusión deseadas en los extractos bacterianos inducidos por IPTG también se confirmó mediante transferencia Western usando la sonda anticlonal dirigida contra la cadena L descrita por Cenci di Bello y col., en Eur. J. Biochem. 219: 161 (1993).

Las bandas reactivas en membranas PVDF (Pharmacia; Milton Keynes, Reino Unido) se visualizaron usando una inmunoglobulina contra conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad; Hemel Hempstead, Reino Unido) y el sistema de detección ECL (Amersham, Reino Unido). Los resultados de la transferencia Western confirmaron la presencia de la proteína de fusión dominante junto con varias bandas débiles correspondientes a proteínas de un Mr inferior al de la proteína de tamaño completo. Esta observación sugiere que se produjo la degradación limitada de la proteína de fusión en la bacteria o durante el procedimiento de aislado. Ni el uso de benzamidina 1 mM ni 10 mM (Sigma; Poole, Reino Unido) durante el procedimiento de aislado eliminó esta rotura proteolítica.

El rendimiento de la proteína de fusión intacta aislada mediante el procedimiento anterior resultó completamente adecuado para los procedimientos celulares descritos en el presente documento. Basándose en estimaciones a partir de geles SDS-PAGE teñidos, los clones bacterianos inducidos con IPTG produjeron 5-10 mg de proteína de fusión de cadena L MBP de tipo natural o mutante por litro de cultivo. Así, el procedimiento para producir proteínas de fusión de cadena L de BoNT/A dado a conocer en el presente documento es completamente eficaz, a pesar de que se produce cierta proteolisis.

Las proteínas de fusión de cadena L MBP codificadas por los plásmidos de expresión pCAL y pCAL-TyrU7 se purificaron a partir de las bacterias mediante cromatografía con amilosa. Las cadenas L recombinantes de tipo natural o mutante se separaron de las regiones de unión del azúcar mediante escisión específica del emplazamiento con Factor X2. Esta escisión produjo cadenas L sin MBP y una pequeña cantidad de proteína de fusión no escindida. Aunque las cadenas L resultantes presentes en dichas mezclas mostraron poseer la actividad deseada, los inventores también usaron una etapa de purificación adicional. De acuerdo con ello, la mezcla de productos de escisión se aplicó a una segunda columna de afinidad de amilosa que unió tanto MBP como la proteína de fusión no escindida. Las cadenas L libres no fueron retenidas por la columna de afinidad, y se aislaron para uso en los experimentos descritos a continuación.

Ejemplo 6 Purificación de proteínas de fusión y aislamiento de las cadenas BoNT/A-L recombinantes Este Ejemplo describe a un procedimiento para producir y purificar cadenas BoNT/A ligeras procedentes de clones bacterianos. Restos procedentes de 1 l de cultivos bacterianos que expresaban las proteínas de la cadena L de BoNT/A de tipo natural se volvieron a suspender en tampón de columna [Tris-HCI 10 mM (pH 8,0), NaCI 200 mM, EGTA 1 mM y DTT 1 mM] que contenían fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1 mM y 10 mM de benzamidina,y se lisaron por sonicación. Los lisados se clarificaron por centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se aplicaron a una columna de afinidad de amilosa [2x10 cm, 30 ml de resina] (New England BioLabs; Hitchin, Reino Unido). Las proteínas no unidas se lavaron de la resina con tampón de columna hasta que el eluato quedó libre de proteína según lectura estable de la absorbancia a 280 nm. La proteína de fusión MBP-cadena L unida se eluyó posteriormente con tampón de columna que contenía maltosa 10 mM. Las fracciones que contenían la proteína de fusión se combinaron y dializaron contra Tris-HCI 20 mM (pH 8,0) suplementado con NaCI 150 mM, CaCl2 2 mM, y DTT 1 mM durante 72 horas a 4ºC.

Las proteínas de fusión se escindieron con Factor X2 (Promega; Southampton, Reino Unido) a una relación enzima:sustrato de 1: 100 mientras se dializaba contra un tampón de 20 mM Tris-HCI (pH 8,0) suplementado con NaCI 150 mM, CaCl2 2 mM, y DTT 1 mM. La diálisis se llevó a cabo durante 24 horas a 4ºC. La mezcla de MBP y cadena L tanto natural como mutante resultado de la etapa de escisión se introdujo en una columna con 10 ml de amilosa equilibrada con tampón de columna. Las alícuotas de las fracciones del flujo pistón se prepararon para análisis SDS-PAGE para identificar las muestras que contenían las cadenas L. Las restantes porciones de las fracciones del flujo pistón se almacenaron a 20ºC. El extracto total de E. coli o las proteínas purificadas se solubilizaron en tampón de muestra SDS y se sometieron a PAGE de acuerdo con los procedimientos estandarizados. Los resultados de este procedimiento indicaron que el fragmento de toxina recombinante representaba aproximadamente el 90% del contenido de proteína de la muestra.

Los anteriores resultados indican que la hipótesis de crear proteínas de fusión MBP-cadena L descritas en el presente documento puede usarse para producir eficazmente cadenas L de BoNT/A recombinantes de tipo natural y mutante. Además, los resultados demuestran que las cadenas L recombinantes se pueden separar de las regiones de unión a maltosa de las proteínas de fusión y purificarse posteriormente.

Se desarrolló un ensayo sensible basado en anticuerpos para comparar las actividades enzimáticas de los productos de cadena L recombinante y sus contrapartes naturales. El ensayo empleó un anticuerpo específico de la región C-terminal intacta de SNAP-25 que correspondía al emplazamiento de escisión BoNT/A. La hibridación mediante transferencia Western de los productos de reacción de escisión de BoNT/A de SNAP-25 indicó una incapacidad del anticuerpo para unirse a los fragmentos SNAP-25. De esta forma, la reneurotoxina de anticuerpo empleada en el siguiente Ejemplo detectó solo SNAP-25 intacto. La pérdida de unión del anticuerpo sirvió como un indicador de la proteólisis de SNAP-25 mediada por la cadena BoNT/A ligera agregada

o sus variedades recombinantes.

Ejemplo 7 Evaluación de las propiedades proteolíticas de las cadenas L recombinantes frente al sustrato SNAP-25 Este Ejemplo describe un procedimiento para demostrar que las cadenas L de BoNT/A tanto nativas como recombinantes pueden proteolizar un sustrato SNAP-25. Se empleó un ensayo cuantitativo para comparar las capacidades del tipo natural y sus análogos recombinantes para escindir un sustrato SNAP-25. El sustrato utilizado en este ensayo se obtuvo preparando una proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST)-SNAP-25, que contenía un emplazamiento de escisión para trombina, expresado usando el vector pGEX-2T y purificado por cromatografía de afinidad en glutatión agarosa. A continuación, el SNAP-25 se escindió de la proteína de fusión usando trombina en Tris-HCI 50 mM (pH 7,5) que contenía NaCI 150 mM y CaCI2 2,5 mM (Smith y col., Gene 67: 31 (1988)) en una relación enzima:sustrato de 1:100. La proteína de fusión no escindida y la región de unión a glutatión escindida se unieron al gel. La proteína recombinante SNAP-25 se eluyó con el último tampón y se dializó contra HEPES 100 mM (pH 7,5) durante 24 horas a 4ºC. La concentración total de proteína se determinó mediante procedimientos rutinarios.

Se estimularon anticuerpos policlonales de conejo específicos de la región C-terminal de SNAP-25 frente a un péptido sintético que tenía la secuencia de aminoácidos, CANQRATKMLGSG (SEC. DE ID Nº 3). Este péptido corresponde a los restos 195 a 206 de la de la proteína sináptica de la membrana plasmática y un resto de cisteína N-terminal que no aparece en el SNAP-25 natural. El péptido sintético se conjugó con albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma; Poole, Reino Unido) con éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) como neurotoxina de reticulación (Sigma; Poole, Reino Unido) para potenciar la antigenia (Liu y col., Biochemistry 18: 690 (1979) 1. La purificación por afinidad de los anticuerpos dirigidos contra el péptido se llevó a cabo mediante el péptido antigénico conjugado por su resto cisteína N-terminal en una resina de aminoalquil agarosa (Bio-Rad; Hemel Hempstead, Reino Unido), activada con ácido yodoacético usando el reticulante etil 3-(3-dimetilpropil) carbodiimida. Tras lavados sucesivos de la columna con un tampón que contenía Tris-HCI 25 mM (pH 7.4) y NaCI 150 mM, los anticuerpos específicos del péptido se eluyeron con una disolución de glicina 100 mM (pH 2,5) y NaCI 200 mM, y se recogieron en tubos que contenía 0,2 ml de tampón neutralizante Tris-HCI 1 M (pH 8,0).

Todas las preparaciones recombinantes que contenían la cadena L de tipo natural se dializaron durante toda la noche a 4ºC en HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía Lubrol al 0,02% y acetato de cinc 10 µM antes de evaluar sus actividades enzimáticas. BoNT/A, previamente reducido con DTT 20 mM durante 30 minutos a 37ºC, así como estas muestras dializadas, se diluyeron a continuación a diferentes concentraciones en el último tampón HEPES suplementado

con DTT 1 mM.

Las mezclas de reacción incluyen 5 µl de sustrato SNAP-25 recombinante (concentración final, 8,5 µM) y 20 µl de cualquier cadena L BoNT/A o de tipo natural recombinante reducidas. Todas las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora antes de detener rápidamente las reacciones con 25 µl de ácido trifluoroacético (TFA) acuoso al 2% y EDTA 5 mM (Foran y col., Biochemistry 33: 15365 (1994)). Se prepararon alícuotas de cada muestra para SDS-PAGE e hibridación por transferencia Western con el anticuerpo policlonal SNAP-25 por adición de tampón de muestra de SDS-PAGE e hirviendo. La reactividad del anticuerpo dirigido contra SNAP-25 se controló usando un sistema de detección ECL y se cuantificó mediante barrido densitométrico.

Los resultados de la hibridación por transferencia Western indican diferencias claras entre las actividades proteolíticas de la cadena L mutante purificada y la cadena L de BoNT/A natural o recombinante. De manera específica, la cadena L recombinante de tipo natural escinde el sustrato SNAP-25, aunque algo menos eficazmente que la cadena L natural BoNT/A lo que sirve como control positivo del procedimiento. De esta forma, una forma enzimáticamente activa de la cadena L de BoNT/A se produce por medios recombinantes, y posteriormente se aísla. Adicionalmente, la sustitución de un único aminoácido en la proteína de la cadena L abroga la capacidad de la proteína recombinante para degradar la proteína sináptica terminal.

Como ensayo preliminar de la actividad biológica de la cadena L de BoNT/A recombinante de tipo natural, se examinó la capacidad proteína de fusión MBP-cadena L para disminuir la liberación de catecolamina evocada por Ca2+ a partir de células de adrenocromafina bovinas permeabilizadas con digitonina. Consistentemente, la proteína de fusión de cadena L recombinante de tipo natural, tanto intacta como escindida mediante Factor X2 para producir una mezcla que contenía cadena L libre de MBP y recombinante, indujo una inhibición dependiente de la dosis de la liberación estimulada por Ca2+ equivalente a la inhibición causada por la BoNT/A natural.

Ejemplo 8 Reconstitución de la cadena L natural, cadena L natural recombinante con cadena H purificada

Las cadenas L y H purificadas se disociaron de BoNT/A (List Biologicals Inc.; Campbell, USA) con urea 2 M, se redujeron con DTT 100 mM y a continuación se purificaron de acuerdo con procedimientos cromatográficos establecidos (Kozaki y col., Japan J. Med. Sci. Biol. 34: 61 (1981); Maisey y col., Eur. J. Biochem. 177: 683 (1988)). La cadena H purificada se combinó en cantidad equimolar con cualquiera de cadena L natural o cadena L natural recombinante. La reconstitución se llevó a cabo dializando las muestras contra un tampón constituido por Tris 25 mM (pH 8,0), acetato de cinc 50 µM y NaCI 150 mM durante 4 días a 4º C. Tras la diálisis, la asociación de la cadena L recombinante y de la cadena H natural para formar dicatenarios de 150 kDa unidos por disulfuro se controló mediante SDS-PAGE y se cuantificó mediante barrido densitométrico. La proporción de moléculas dicatenarias formadas con las cadenas L

5 recombinantes es inferior al obtenido cuando se emplea la cadena L natural. Así, solo aproximadamente el 30% de las cadenas L de tipo natural o mutante recombinante se reconstituye mientras que > 90% de la cadena L natural reasociada con la cadena H. A pesar de su menor eficacia de reconstitución, se produce con facilidad material suficiente que incorpora las cadenas L recombinantes para usar en los estudios funcionales posteriores.

10 Aunque esta invención se ha descrito con respecto a varios ejemplos y formas de realización específicos, debe entenderse que la invención no se limita a los anteriores y puede practicarse con variaciones comprendidas en el alcance de las siguientes reivindicaciones. Otras formas de realización, versiones, y modificaciones comprendidas en el alcance de la presente invención son posibles. Por ejemplo, se pueden utilizar de aproximadamente 500 unidades a

15 aproximadamente 4.000 unidades de una toxina botulínica tipo B para tratar un músculo lesionado de acuerdo con la presente invención que se ha dado a conocer.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una toxina botulínica para uso en el tratamiento de lesiones graves de los músculos esqueléticos mediante la administración local, por inyección intramuscular, que inmoviliza sustancialmente el músculo lesionado.

2. 2.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que es eficaz para inmovilizar el músculo lesionado durante la fase 1 y la fase 2 de un proceso de reparación del músculo lesionado.

3. 3.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es eficaz para inmovilizar el músculo lesionado durante la fase 1 de un proceso de reparación del músculo lesionado.

4. 4.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una toxina botulínica tipo A, B, C1, D, E, F o G.

5. 5.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se fabrica de forma recombinante.

6. 6.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es para administración adicional a la fisioterapia y/o cirugía.

7. 7.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una toxina botulínica de tipo A.

8. 8.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con la reivindicación 7, que se administra de forma que estimula la curación del músculo lesionado.

9. 9.

   Una toxina botulínica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también alivia el dolor asociado con el músculo lesionado.