CN102078597A - 用于治疗肌肉损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于治疗受损肌肉的方法，通过神经毒素的局部给药来促进受损肌肉的愈合和/或减少与受损的肌肉有关的疼痛，其中所说的神经毒素如肉毒杆菌毒素。

Description

用于治疗肌肉损伤的方法
本申请是申请号为“01819946.1”，发明名称为“用于治疗肌肉损伤的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
本发明涉及用于治疗肌肉损伤的方法。本发明特别涉及通过给受损的肌肉施用神经毒素而对该受损的肌肉进行治疗的方法。
肌肉损伤包括骨骼肌的急性损伤如挫伤(撞伤)、裂伤、局部缺血、扭伤、以及完全破裂。这些损伤可造成巨痛并且可以使患者丧失能力，使之不能工作或甚至使之不能进行正常的日常活动。在骨骼肌的急性损伤中，最常见的是扭伤(也被称为拉伸而产生的损伤)。例如，在由职业或运动医学专职人员所治疗的所有损伤中，扭伤占到高至30％的水平。Garrett等人，Am J Sports Med，24(6)：S2-S8，1996。
肌肉扭伤性损伤的特征为肌-腱单元的破坏。该肌-腱单元的破坏可以发生在肌肉的任何部分。这种类型的损伤最常见地发生在环绕着两个关节运转的浅层肌肉的肌腱接点(MTJ)附近，如大腿直肌、半腱肌和腓肠肌。
离奇的运动、或肌肉的异常应用都可以导致肌肉扭伤。例如，离心收缩使用较少的活性运动单元来产生较高的力量。在该类情况中，在拉伸期间，过度延伸的肌肉单元经受了过度的拉力。该过度的拉力可以造成该肌肉收缩部件微观上的损害，集中表现为Z-线的随机破坏。当肌肉受到损害时，患者可能会经受一种延迟发作的肌肉痛苦，其特征为疼痛、无力以及活动范围受到限制。该疼痛在肌肉损伤后约1至2天最为强烈，而活动范围受到限制的情况可持续一周或更长的时间。如果对骨骼肌的轻微扭伤进行了不恰当的处理，则可能会发生更为严重的损伤。
以损伤的严重程度和血肿的性质为基础，有三种类别的肌肉扭伤：(1)轻度(一度)扭伤；少数肌肉纤维撕裂；不丧失力量或最低程度的丧失力量和限制活动的轻微肿胀和不适；(2)中度(二度)扭伤；力量明显丧失的肌肉纤维的更大损害，和(3)严重(三度)扭伤；横跨整个肌腹的撕裂，使得肌肉功能全部丧失。
在肌肉扭伤期间肌内血管的撕裂常常可以导致大量的血肿。在受损肌肉中存在两种不同类型的血肿：肌内的和肌间的血肿。第一种类型，肌内的血肿，在规模上被限制于完整的肌肉筋膜内。其中血液的外渗增加了肌内的压力，压缩并限制了该血肿的大小。该类血肿产生疼痛并使肌肉丧失功能。第二种类型，肌间的血肿，当肌肉筋膜破裂时形成，并且外渗的血液散布到肌间的空间中而不会显著增加肌肉内的压力。如果肌肉内的压力不增加，则这种类型的血肿不会造成明显的疼痛。
对于扭伤性损伤的治疗而言，关键在于将受损的肌肉进行固定，尤其是在损伤后的前两至三天内要对受损的肌肉进行固定，这是因为在损伤后受损肌肉的立即活动常常会造成最初损伤部位的再破裂。再破裂可以导致更严重的损伤、延迟愈合并使组织形成瘢痕。Jarvinen等人，Curr Opin Rheumatol，第12卷：155-161(2000)。
通过对受损肌肉进行固定可以避免被损害部位的再破裂，优选在损伤后立即进行固定。固定可以使得新形成的肉芽组织获得足够的拉力以抵制由可收缩的肌肉所产生的力量。
用于固定受损/扭伤肌肉的一种公知的方法需要使用物理学上的约束物或管状物。例如，可以使用一种颈圈来固定受损颈部的屈肌或伸肌。但是，约束物的应用常常很麻烦并且不舒服。此外，对于某些肌肉群的损伤而言，使用物理学上的约束物是不实际或不可能的。例如，很难用一种约束物来固定扭伤的上斜方肌或最大的臀肌。
肉毒杆菌毒素
厌氧的、革兰氏阳性菌肉毒梭菌可产生一种有效的多肽神经毒素--肉毒杆菌毒素，其在人和动物中可造成一种被称为肉毒中毒的神经性麻痹疾病。在土壤中发现了肉毒梭菌的芽孢并且其可以在灭菌和密封不当的家用罐头食品容器中进行生长，其为很多肉毒中毒事件的原因。肉毒中毒的结果一般在食用了被肉毒梭菌培养物或芽孢所感染的食品后18至36小时显现出来。该肉毒杆菌毒素显然可不被减弱的通过肠的内层并攻击外周的运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从行走、吞咽、以及说话困难发展为呼吸肌麻痹和死亡。
对于人而言，A型肉毒杆菌毒素(“BoNT/A”)是已知的最致命的天然生物学神经毒素。肉毒杆菌毒素(精制的神经毒素复合体)血清型A在小鼠中的LD50约为50皮克。肉毒杆菌毒素的一个单位(U)被定义为在给体重分别为18-20克的雌性Swiss Webster小鼠进行腹腔内注射后的LD50。已经对七种免疫学上不同的肉毒神经毒素的特性进行了描述，这些毒素分别为肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，其通过与血清型特异性抗体中和而被区别开。肉毒杆菌毒素的不同血清型随着它们所影响的动物种属以及它们所诱发的麻痹的严重程度和持续时间而变化。例如，当对大鼠中所产生的麻痹速度进行测定时，已经测得BoNt/A比肉毒杆菌毒素血清型B(BoNT/B)的效力强500倍。此外，已经测得BoNt/B在480U/kg的剂量下对灵长类动物无毒，该剂量12倍于BoNt/A对灵长类动物的LD50值。以高亲和力与胆碱能运动神经元显著结合的肉毒杆菌毒素被转运到该神经元中并阻断乙酰胆碱的释放。
肉毒杆菌毒素在临床中已经被用于以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉病症的治疗。BoNt/A已经被美国食品和药品管理局批准用于治疗睑痉挛、斜视和一侧面痉挛。很显然，与BoNt/A相比，非-血清型A的肉毒杆菌毒素血清型的效力更低和/或活性持续时间更短。在几个小时之内可注意到肉毒杆菌毒素如BoNt/A的肌内的临床作用。因此，正如所测定的那样，在肌内注射时，注意到大多数(如果不是所有的)肉毒杆菌毒素都能在注射后的一天之内产生显著的肌肉麻痹作用是十分重要的(通过小鼠趾外展评分(DAS)进行测定)。Aoki K.R.，Preclinical Update on BOTOX(A型肉毒杆菌毒素)——相对于其它的肉毒杆菌毒素制剂的精制神经毒素复合物，Eur J.Neur 1999，6(suppl 4)：S3-S10。BoNt/A进行单次肌内注射而获得症状缓解的持续时间一般平均约为3个月。在同样待审的序列号为09/620840的美国专利申请中陈述了具有缩短的体内生物活性周期的包括A型肉毒杆菌毒素在内的肉毒杆菌毒素，该申请在这里被全文引入作为参考。
虽然所有的肉毒杆菌毒素血清型都显著地抑制在神经肌肉结合处的神经递质乙酰胆碱的释放，但是它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点对这些蛋白进行裂解而发挥作用的。例如，肉毒杆菌血清型A和E都裂解25千道尔顿(kD)的突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但是它们靶向于这种蛋白内的不同氨基酸序列。BoNT/B、D、F和G作用于小泡相关蛋白(VAMP，也被称为小突触泡蛋白)，其中各血清型在不同的位点对蛋白进行裂解。最后，已经表明肉毒杆菌毒素血清型C1(BoNT/C1)能够裂解突触融合蛋白和SNAP-25。这些作用机理上的差异可以影响各种肉毒杆菌毒素血清型作用的相对强度和/或持续时间。
无论是何种血清型，毒素中毒的分子机理看起来是相似的并且包括至少三个步骤或阶段。在该过程的第一步中，毒素以高亲和力与靶神经元的突触前膜通过H链和细胞表面受体之间特定的相互作用结合；认为该受体对于肉毒杆菌毒素的各血清型和破伤风毒素而言是不同的。H链的羧基末端片段——Hc看起来对该毒素对细胞表面的靶向是十分重要的。
在第二步中，该毒素通过被毒害细胞的浆膜。该毒素首先通过受体介导的内吞作用被细胞吞没，并形成包含该毒素的核内体。然后，该毒素从该核内体中脱逸进入到该细胞的细胞浆中。认为最后一步是被该H链的氨基末端片段——HN所介导的，在接触约5.5或更低的pH值时，其可以触发该毒素形态上的改变。已知核内体具有一种可降低核内体内pH值的质子泵。该形态上的变化暴露出毒素中的疏水残基，这使得该毒素自身包埋到该核内体的膜中。然后，该毒素通过该核内体的膜被转运到细胞质中。
该肉毒杆菌毒素活性机理中的最后一步似乎包括通过L链所进行的关键的细胞内胞吐蛋白的裂解。肉毒杆菌和破伤风毒素的全部毒性活性都包含于全毒素的L链中；该L链是一种锌(Zn++)肽链内切酶，其可选择性地裂解识别所必须的蛋白并能使包含神经递质的小泡与浆膜的胞浆表面进行对接，并且该小泡与该浆膜进行融合。破伤风神经毒素、肉毒杆菌毒素/B、/D、/F、和/G可造成小突触泡蛋白(也被称为小泡相关膜蛋白(VAMP))——一种突触小体膜蛋白的降解。作为这些裂解结果中的任何一种结果存在于该突触小泡的细胞质表面上的大多数VAMP都可以被除去。各毒素可以特异性地裂解不同的键。
对于所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型而言，该肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量约为150kD。有趣的是，该肉毒杆菌毒素由梭状芽孢杆菌释放，其是包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子以及与其相结合的非毒素蛋白的复合体形式。因此，该BoNt/A复合体可以由梭状芽孢杆菌产生，如900kD、500kD和300kD的形式。BoNT/B和C1似乎仅仅可以以500kD复合体的形式被产生。BoNT/D可以以300kD和500kD复合体的形式被产生。最后，BoNT/E和F仅仅可以以约300kD复合体的形式被产生。最后，BoNT/E和F仅仅可以以约300kD复合体的形式被产生。认为该复合体(即分子量高于约150kD)包含一种非毒素的血细胞凝集素蛋白和一种非毒素以及一种非毒素的非血细胞凝集素蛋白。这两种非毒素蛋白(其与该肉毒杆菌毒素分子一起构成相关的神经毒素复合体)可以提供稳定性以对抗肉毒杆菌毒素分子的变性作用并且当毒素被摄取时可以使其免受消化道酸的影响。此外，有可能较大的(分子量高于约150kD)肉毒杆菌毒素复合体可以使得该肉毒杆菌毒素以较慢的扩散速率离开肉毒杆菌毒素复合体的肌内注射部位。
在体外研究中已经证实了肉毒杆菌毒素能抑制钾阳离子所诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织主要细胞培养物中的释放。此外，已经有报道称肉毒杆菌毒素能抑制在脊髓神经元的主要培养物中所诱发的甘氨酸和谷氨酸盐的释放，并且还已经有关于在脑突触体制品内肉毒杆菌毒素可抑制各种神经递质——乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸盐释放的报道。
BoNt/A是通过在发酵器内植入肉毒梭菌并使其培养物进行生长，然后对其进行捕获并用已知的方法对该发酵了的混合物进行纯化而获得的。所有的肉毒杆菌毒素血清型在开始时都作为无活性的单链蛋白而被合成，其必须被蛋白酶裂解或切断从而变为具有神经活性的物质。能生成肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此可以从细菌培养物中以具有显著活性的形式回收血清型A和G。相反，肉毒杆菌毒素血清型C1、D和E是通过用无蛋白水解作用的菌株来合成的，因此当从培养物中被回收时其一般没有活性。血清型B和F是用具有蛋白水解性和无蛋白水解性的菌株一起来进行合成的，因此其可以以活性形式被回收或者可以以无活性的形式被回收。但是，即使能产生例如BoNt/B血清型的蛋白水解性的菌株，也仅仅能裂解所产生毒素的一部分。切断与未切断分子的确切比例取决于培养的时间以及培养的温度。因此，一定百分比的任何一种制剂，例如BoNt/B毒素可能是没有活性的，这可能是已知的BoNt/B的功效远远低于BoNt/A的原因。在临床制剂中存在的没有活性的肉毒杆菌毒素分子对该制剂的总蛋白负荷有贡献，其与抗原性的增加有关，但对于其临床功效没有帮助。此外，已知在肌内注射时，BoNt/B具有较短的活性作用持续时间并且在相同剂量水平下其效力也比BoNt/A低。
已经有报道称BoNt/A已经被用于临床中，其应用如下：
(1)每次肌注(多种肌肉)约75-125个单位的
Figure BSA00000408226000061
，用于治疗颈肌张力障碍；(1由Allergan，Inc.，of Irvine，California得到，注册商标
Figure BSA00000408226000062
)
(2)每次肌注5-10个单位的，用于治疗眉间线(眉沟)(向降眉间肌内肌注5个单位，向各皱眉肌眉肌内肌注10个单位)；
(3)通过向耻骨直肠肌肌内注射约30-80个单位的
Figure BSA00000408226000064
治疗便秘；
(4)通过向上眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌和下眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌每次肌内注射约1-5个单位的治疗睑痉挛。
(5)为了治疗斜视，用约1-5个单位的
Figure BSA00000408226000066
对眼外的肌肉进行肌注，注射量可以随着所注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹程度(即所需屈光度校正数的量)而进行变化。
(6)为了治疗中风后的上肢痉挛，可以向五种如下的不同上肢屈肌中肌注
Figure BSA00000408226000067
(a)指深屈肌(flexor digitorum profundus)：7.5U至30U
(b)指浅屈肌(flexor digitorum sublimus)：7.5U至30U
(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris)：10U至40U
(d)腕桡骨屈肌(flexor carpi radialis)：15U至60U
(e)肱二头肌：50U至200U。所列出的五种肌肉中的每一种都在相同的治疗期间进行注射，以便于该患者在每次治疗期间通过肌注，上肢屈肌可接受90U至360U的
Figure BSA00000408226000068
BoNt/A对各种临床疾病的成功治疗已经导致了对其它的肉毒杆菌毒素血清型的兴趣。已经对两种商业上可获得的BoNT/A制剂(
Figure BSA00000408226000069
和
Figure BSA000004082260000610
)以及BoNT/B和F制剂(都得自Wako Chemicals，日本)进行了研究，以便于测定其临床前的局部肌无力功效、安全性和潜在的抗原性。将肉毒杆菌毒素制剂注射到右侧腓肠肌的顶部(0.5至200.0个单位/kg)，并用小鼠趾外展记分试验(DAS)来对肌无力进行评估。由剂量响应曲线来计算ED50值。另外再用一些小鼠通过肌注来测定LD50剂量。通过LD50/ED50来计算出治疗指数。各组小鼠可以在后肢上注射
Figure BSA00000408226000071
(5.0至10.0个单位/kg)或BoNt/B(50.0至400.0个单位/kg)，然后对肌无力和增加的水消耗量进行试验，后者是一种公认的用于干燥口腔的模型。通过用兔子进行的每月肌注一次的试验来对潜在的抗原性进行评估(2.0或8.7个单位/kg的BoNt/B或3.0个单位/kg的
Figure BSA00000408226000072
)。最大的肌无力程度和持续时间与所有的血清型剂量相关。DAS ED50值(单位/kg)如下：
Figure BSA00000408226000073
：6.7，
Figure BSA00000408226000074
：24.7，BoNt/B：11.8至244.0，BoNT/F：4.3。
Figure BSA00000408226000075
的作用持续时间比BoNt/B或BoNt/F长。治疗指数值如下：
Figure BSA00000408226000076
：10.5，6.3，BoNt/B：4.8。虽然BoNt/B在使肌无力时作用较弱，但是用BoNt/B进行注射的小鼠的水消耗量高于用
Figure BSA00000408226000078
进行注射的小鼠。在注射四个月后，四只兔子中的两只(用1.5ng/kg进行处理的情况)和四只兔子中的四只(用6.5ng/kg进行处理的情况)对BoNt/B产生了抗体。在一种独立的研究中，9只用
Figure BSA00000408226000079
进行了处理的兔子没有一只对BoNt/A产生抗体。DAS结果表明BoNt/A的相对峰强度等于BoNt/F，而BoNt/F比BoNt/B强。至于作用的持续时间而言，BoNt/A比BoNt/B的持续时间长，而BoNt/B的作用持续时间比BoNt/F长。正如由治疗指数值所表明的那样，BoNt/A的两种商品化制剂(
Figure BSA000004082260000710
和
Figure BSA000004082260000711
)是不同的。在后肢注射BoNt/B后所观察到的水消耗行为增加表明在临床上，相当数量的这种血清型进入了鼠科动物的体循环。该结果还表明为了获得与BoNt/A相当的功效，必须增加所检验的其它血清型的剂量。增加剂量可能会涉及安全性问题。此外，在兔子中，血清型B比
Figure BSA000004082260000712
具有更强的抗原性，这可能是因为为达到BoNt/B的有效剂量注射了较高的蛋白负荷。
破伤风神经毒素主要在中枢神经系统中起作用，而肉毒杆菌神经毒素在神经肌肉结合处起作用；二者都可以通过抑制乙酰胆碱从受影响的神经元的轴突中释放到突触中，导致麻痹而起作用。受影响的神经元的中毒作用是长期的并且到目前为止，认为其是不可逆的。已知破伤风神经毒素是以一种免疫学上独特的血清型存在的。
乙酰胆碱
一般仅仅是在哺乳动物神经系统内由各种类型的神经元释放一种单一类型的小分子神经递质。该神经递质乙酰胆碱是由脑的许多区域内的神经元所分泌的，但是具体地是由运动原皮层的大锥体细胞、基底神经节内的数种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统(交感神经和副交感神经)的节前神经元、副交感神经系统的节后神经元、以及交感神经系统的一些节后神经元所分泌的。从本质上来讲，仅汗腺、立毛(priloerector)肌肉以及一些血管的节后交感神经纤维是胆碱能的，而交感神经系统的大多数节后神经元都释放神经递质——去甲肾上腺素。在大多数情况中，乙酰胆碱具有兴奋作用。但是，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用，如通过迷走神经而抑制心脏。
自主神经系统的输出信号是通过交感神经系统或副交感神经系统而被传送到机体中的。交感神经系统的节前神经元从位于脊髓中侧角中的节前交感神经神经元细胞体中延伸出去。该从细胞体延伸出来的节前交感神经纤维、具有节后神经元的突触位于椎旁(paravertebral)的交感神经节中或椎骨(prevertebral)前的神经节中。因为交感神经和副交感神经系统的节前神经元都是胆碱能的，所以对该神经节使用乙酰胆碱会同时兴奋交感神经和副交感神经的节后神经元。
乙酰胆碱可激活两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。在由副交感神经系统的节后神经元所刺激的所有效应器细胞中以及由交感神经系统的节后胆碱能神经元所刺激的这些效应器细胞中都发现了毒蕈碱受体。在交感神经和副交感神经的节前和节后神经元间的突触中都发现了烟碱受体。该烟碱受体还存在于神经肌肉结合处的骨骼肌纤维的许多膜上。
当小的、澄明的细胞内小泡与突触前的神经元细胞膜融合时，从胆碱能神经元中释放出乙酰胆碱。许多非神经元的分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞可分别从大量的密核小泡中释放儿茶酚胺和胰岛素。PC12细胞系是一种被广泛用作交感肾上腺的研发所需的组织培养模型中的大鼠嗜铬细胞瘤细胞的纯系细胞。在体外，通过渗透作用(如通过电穿孔)或通过向去神经细胞中直接注射肉毒杆菌毒素，该毒素抑制两类化合物从两种类型的细胞中的释放。还已知肉毒杆菌毒素可以阻断神经递质——谷氨酸从皮层突触体细胞培养物中的释放。
神经肌肉结合处是在骨骼肌中通过轴突与肌细胞的接近而形成的。通过神经系统传递的信号在该末端轴突产生动作电位，激活离子通道并导致了神经递质——乙酰胆碱从神经内突触小泡中释放，例如在神经肌肉结合处的运动终板处。该乙酰胆碱通过细胞外间隙与肌肉终板的表面上的乙酰胆碱受体蛋白进行结合。一旦进行了足够的结合，则该肌细胞的动作电位可引起特定的膜离子通道改变，产生肌细胞收缩。然后，乙酰胆碱从该肌细胞中释放出来并被细胞外间隙中的胆碱酯酶所代谢。该代谢产物重新循环回到末端轴突中被再加工成另外的乙酰胆碱。
正如上面所讨论的那样，目前治疗受损肌肉的方法仍然很不够。需要一种改良的治疗受损肌肉的方法。
发明概述
根据本发明，一种用于治疗受损肌肉的有效方法包括在体内局部地将治疗有效量的神经毒素给药到该受损肌肉中或周围的步骤。该神经毒素能为受损的肌肉提供一种暂时的化学去神经作用并能减少该肌肉的收缩。本发明的目的是要促进受损肌肉的愈合并迅速恢复其功能。受损肌肉可以是例如扭伤的肌肉。在一个实施方案中，该神经毒素是通过肌内或皮下的方式来进行给药的。在另一个实施方案中，神经毒素的给药步骤是在物理治疗和/或手术之前和/或之后进行的。
还是根据本发明，神经毒素的给药步骤是在肌肉被损伤后立即进行的，或是在其后切实可行时立即进行的。在一个实施方案中，至少在该受损的肌肉修复过程的第1阶段和/或第2阶段期间该神经毒素可以有效的固定或基本固定该受损的肌肉。
根据本发明，该神经毒素可以包含靶向组分、治疗组分和转运组分。该靶向组分可以与一种突触前的运动神经元相结合。在一个实施方案中，该靶向组分可以包含丁酸杆菌(butyricum)毒素、破伤风毒素、或A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的重链的羧基末端片段。治疗组分可以干扰或调节神经递质从神经元中的释放或其加工。在一个实施方案中，该治疗组分包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、或A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的轻链。转运组分可促进该神经毒素的至少一部分，例如治疗组分，转运到靶细胞的细胞浆内。在一个实施方案中，该转运组分可包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、或A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的重链的氨基末端片段。
还是根据本发明，该神经毒素是一种A、B、E和/或F型的肉毒杆菌毒素。在优选的实施方案中，治疗受损的肌肉所用的神经毒素是A型肉毒杆菌毒素。实际上，优选使用A型肉毒杆菌毒素是因为其在商业上可以获得、其已知的临床应用、以及正如这里所公开的，根据本发明，可成功的用其进行肌肉损伤的治疗。使用约0.1U/kg至约30U/kg的A型肉毒杆菌毒素和约1U/kg至约150U/kg的B型肉毒杆菌毒素属于本发明所公开的实际方法的范畴。关于其它的肉毒杆菌毒素血清型(包括E型和F型毒素)，正如这里所叙述的那样，所用的U/kg剂量范围为约0.1U/kg至约150U/kg。
还是根据本发明，该神经毒素可以重组进行生产。
本发明的详细实施方案是一种通过给受损肌肉经体内、局部给予治疗有效量的肉毒杆菌毒素而对受损的肌肉进行治疗的方法(如促进痊愈)，从而对受损的肌肉进行治疗。该肉毒杆菌毒素可以是A型肉毒杆菌毒素。值得注意的是，本发明还包含了一种治疗与受损肌肉有关的疼痛的方法，该方法是通过给受损肌肉经体内、局部的施用治疗有效量的肉毒杆菌毒素，从而减轻与受损肌肉有关的疼痛。
这里所描述的各种和每一种特征、以及该类特征中两个或更多特征的各种和每一种组合都属于本发明的范畴，前提条件是在该类组合中所包含的这些特征不会互相矛盾。
定义
提供如下的定义并在这里对其进行应用。
“约”指的是大约或接近，并且本文涉及所述的数值或范围时指的是所叙述或所要求的数值或范围的±10％。
“重链”指的是梭状芽孢杆菌神经毒素的重链。其优选具有约100kDa的分子量并且在这里被称为H链或H。
“HN”指的是得自梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的大约相当于该H链的氨基末端片段的片段(优选具有约50kDa的分子量)，或对应于完整H链中的该片段的部分。认为其包含在穿越细胞内核内体膜的L链的转运作用中所涉及的天然或野生型梭状芽孢杆菌神经毒素的部分。
“Hc”指的是得自梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的大约相当于该H链的羧基末端片段的片段(约50kDa)，或对应于完整H链中的该片段的部分。认为其是致免疫性的并且包含以高亲和力与运动神经元进行突触前结合时所涉及的天然或野生型梭状芽孢杆菌神经毒素的部分。
“受损肌肉”包括扭伤、撕裂或撕开的肌肉，以及带有挫伤(撞伤)、裂伤、局部缺血或破裂的肌肉。
“轻链”指的是梭状芽孢杆菌神经毒素的轻链。其优选具有约50kDa的分子量，并且被称为L链、L或梭状芽孢杆菌神经毒素的蛋白水解区域(氨基酸序列)。认为当被释放到靶细胞的细胞浆中时，该轻链是一种有效的神经递质释放的抑制剂。
“局部给药”指的是将药物直接给药于动物体表或体内的需要药物在该部位上发挥某种生物作用的部位上或该部位附近。局部给药排除系统途径的给药，如静脉内给药或口服给药。
“神经毒素”指的是能干扰或调节神经元的至少一种功能的化学实体。“神经毒素”可以是天然存在的或可以是人造的。此外，该“神经毒素”可以是一种小分子、大分子、多肽、共轭的多肽或它们的混合物。
“变异体”指的是与母体化学实体有略微的差别但是仍然具有生物学作用的化学实体。变异体的生物学作用可以与母体的生物学作用基本相同或优于母体的作用。例如，至少有一个氨基酸被置换、修饰、缺失或增加的肉毒杆菌毒素的变异轻链可具有相同的或更强的阻止神经递质小泡释放的能力。此外，变异体的生物学作用也可降低。例如，除去了亮氨酸基元的A型肉毒杆菌毒素的变异轻链可比母体的(或天然的)A型肉毒杆菌毒素轻链具有更短的生物学持续性。
发明描述
在主要实施方案中，本发明治疗受损的肌肉的一种有效方法可包括将治疗有效量的神经毒素局部给药于受损的肌肉的步骤。优选地，该受损的肌肉是被扭伤的肌肉。
骨骼肌的扭伤性损害可被划分为剪切性损伤。在剪切性损伤中，不仅肌纤维被撕裂，而且mysial鞘也被撕裂。在肌肉损伤后几乎马上就开始了肌肉的修复过程。剪切性损伤的修复过程可以被分为三个阶段。
第1阶段是破坏阶段，其特征为形成血肿、肌纤维坏死、以及炎性细胞反应。在扭伤后，在靠近于其末梢肌腱结合处(MTJ)的部位常常会出现其它健康肌肉的破裂部位。破裂的肌纤维收缩并在残余部分之间形成一个缺口。因为骨骼肌的血管丰富，所以从被撕裂的血管中出血是不可避免的，所以该缺口被血肿所填充，随后被瘢痕组织所取代。在剪切性损伤中，机械力撕裂了整个肌纤维，损害了肌纤维的浆膜并且在残余部分的末端留下了肌浆开口。因为肌纤维是很长的、串状细胞，该坏死从这种部位开始延伸到该破裂的肌纤维的整个长度上。在剪切性损伤中血管也被撕裂；因此，血液所运载的炎性细胞立即进入到该损伤部位并诱导炎症。在损伤后，第1个阶段会持续约2至3天。
第2个阶段是修复阶段，其由坏死组织的吞噬细胞溶解、肌纤维的再生、结缔组织瘢痕的产生、以及毛细管的内向成长所组成。在受损肌肉组织再生中的关键步骤是受损伤区域的血管形成。血管补充的修复对于受损肌肉的再生而言是必须的。新的毛细管从存活的大血管上伸出，向着损伤区域的中心生长。这些新的毛细血管帮助向再生区域提供足够的氧供应。
第3个阶段是改型阶段，其由再生肌纤维的成熟、瘢痕组织的收缩和整理、以及被修复肌肉的功能恢复所组成。在第1个阶段后，第2个阶段(修复)和第3个阶段(改型)常常同时发生，并且持续约2天至约6个星期。
在本发明的一个实施方案中，该神经毒素被局部给药以固定受损肌肉而促进愈合，优选地通过肌内给药。本发明所公开的神经毒素的局部给药还能减少由于肌肉损伤而产生的疼痛。优选地，在损伤时或损伤后立即进行该神经毒素的给药。在一个优选的实施方案中，在破坏阶段(第1阶段)中，该神经毒素能有效的固定受损的肌肉以防止该肌肉的再次破裂。
不希望用任何特定作用机理的理论对本发明进行限制，认为在修复和/或改型阶段期间的固定是有益的，这是因为这种固定可以使得受损伤区域中毛细管更快更强的向内生长，并且可以使得肌肉纤维更好的再生和定向。因此，在一个实施方案中，在修复阶段(第2阶段)和/或改型阶段(第3阶段)中不具有神经毒素的固定作用。在更优选的实施方案中，在第1阶段期间施用神经毒素，其能有效的固定受损的肌肉，但是在该修复过程的第2和3个阶段中不施用神经毒素。例如，如果在损伤后立即注射该神经毒素，优选肌内注射，优选地在给药后约3天的时间内该神经毒素固定该受损的肌肉。或者该神经毒素仅仅在这种程度下具有固定作用，在这种程度中，在对受损的肌肉进行应用后，病人在基础活动中只经受很小的痛苦或不会经受痛苦。当达到这种临界点时，应当鼓励病人开始积极的渐进的进行活动。
在本发明的另外一个实施方案中，在第1-3个阶段的所有阶段以及在其随后的肌肉损伤恢复期中，该神经毒素都可有效的固定受损肌肉。
神经毒素，如某些肉毒杆菌毒素，其需要少于约一天至约七天的时间来表现出显著的临床肌肉麻痹作用和/或其中的肌肉麻痹作用在注射后可持续几个月的时间，这样的神经毒素在本发明的范围之内，这样的神经毒素可被用于治疗相对严重或持续时间较长的肌肉损伤或为了治愈的目的而需要进行长期的肌肉固定的情况。
在主要实施方案中，该神经毒素是一种神经肌肉阻滞剂。表1非限制性地列出了一些神经肌肉阻滞剂以及其可能的作用部位。在一个实施方案中，将具有能将肌肉，优选受损的肌肉固定至少约5天，优选至少约3天的能力的神经肌肉阻滞剂进行给药来对受损肌肉进行治疗。在本发明的一个优选实施方案中，该神经毒素是一种肉毒杆菌毒素，这是因为肉毒杆菌毒素的已知应用和临床安全性所导致的，如E型肉毒杆菌毒素可用于治疗肌肉疾病如肌肉痉挛。在本发明特别优选的一个实施方案中，特别是对于严重的，或三度肌肉损伤而言，局部给药的肉毒杆菌毒素是一种E型肉毒杆菌毒素。在这些实施方案中也可以使用A型肉毒杆菌毒素。
表1
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在一个主要的实施方案中，该神经毒素可以包含靶向组分、治疗组分以及转运组分。该靶向组分可以与突触前运动神经元进行结合。在一个实施方案中，该靶向组分可以包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的重链的羧基末端片段。在优选的实施方案中，该靶向组分可以包括A型肉毒杆菌毒素的羧基末端片段。
该治疗组分可以直接干扰或调控神经递质从细胞中的释放或其加工。在一个实施方案中，该治疗组分包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的轻链。在优选的实施方案中，该治疗组分可包含具有短期的生物学持续期如少于约5天，优选少于约3天的肉毒杆菌毒素型的轻链。优选地，该类轻链可是E或F型肉毒杆菌毒素的轻链。或者，该轻链可是A型肉毒杆菌毒素的轻链。
该转运组分可以促进该神经毒素的至少一部分，例如治疗组分转移到靶细胞的细胞浆中。在一个实施方案中，该转运组分包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的重链的氨基末端片段。在优选的实施方案中，该转运组分包含A型肉毒杆菌毒素的重链的氨基末端片段。
在一个实施方案中，该靶向组分包含E或F型肉毒杆菌毒素的重链的羧基末端片段，该治疗组分包含E或F型肉毒杆菌毒素的轻链并且该转运组分包含E或F型肉毒杆菌毒素的重链的胺末端片段。在优选的实施方案中，该神经毒素包含E型肉毒杆菌毒素。在另一个优选的实施方案中，该神经毒素包含F型肉毒杆菌毒素。还是在另一个实施方案中，该神经毒素包含E型和F型肉毒杆菌毒素的混合物。
在一个实施方案中，该靶向组分包含A型肉毒杆菌毒素的重链的羧基末端片段，该治疗组分包含A型肉毒杆菌毒素的轻链并且该转运组分包含A型肉毒杆菌毒素的重链的胺末端片段。在优选的实施方案中，本发明的神经毒素包含A型肉毒杆菌毒素。这里所用的一种适宜的A型肉毒杆菌毒素是(Allergan，Inc.，Irvine，California.)
虽然在一个实施方案中，本发明的神经毒素是通过对受损肌肉进行固定而对其进行治疗的，但是，可以将该神经毒素施用于受损的肌肉以减少疼痛和/或痉挛。在另一个实施方案中，该神经毒素能固定受损的肌肉并且能减少与受损的肌肉有关的疼痛。在优选的实施方案中，将神经毒素，例如E型肉毒杆菌毒素，或更优选的A型肉毒杆菌毒素，施用于扭伤的肌肉以对该肌肉进行固定和/或减少与该肌肉有关的疼痛。
当然，普通专业医药供应者可决定适宜的给药剂量和给药频率以获得最优的临床效果。即，在医药领域内的一名普通技术人员能够在适合的时间给予适宜量的神经肌肉阻滞剂以便于有效地固定受损的肌肉。该神经毒素的给药剂量取决于各种因素，包括该肌肉的大小、肌肉损伤的严重程度。在一个优选的实施方案中，所使用的神经毒素的剂量可以在不超过修复过程的第1阶段的时间内固定该受损的肌肉。在本发明的各种方法中，可以将约0.1U/kg至约15U/kg的A型肉毒杆菌毒素给药于该受损的肌肉。优选地，可以将约1U/kg至约20U/kg的A型肉毒杆菌毒素给药于该受损的肌肉。约0.1U/kg至约30U/kg的A型肉毒杆菌毒素和约1U/kg至约150U/kg的B型肉毒杆菌毒素的应用也在本发明所公开的实施方法的范围内。至于其它的肉毒杆菌毒素血清型而言(包括E和F型毒素)，正如这里所述的这样，可使用的剂量在约0.1U/kg至约150U/kg的范围内。
虽然肌内注射是优选的给药途径，但是也可以使用其它的局部给药途径，如皮下给药。
在另一个主要的实施方案中，根据本发明的治疗受损肌肉的方法还进一步包含如下所述的其它步骤。这些其它步骤可以在神经毒素的给药之前进行、与其一起进行给药或在神经毒素的给药之后进行，优选将神经毒素给药于受损的肌肉。例如，本发明所推荐的用于扭伤肌肉的治疗方法包括休息、冰敷、加压和抬高。这四个步骤(或过程)具有相同的目的。它们使从破裂的血管向破裂部位的出血减到了最少。这样做将防止形成大范围的血肿，这将直接影响再生作用末期时瘢痕组织的大小。在破裂部位小的血肿和有限的间隙内水肿蓄积还可缩短肉芽组织中的局部缺血期，这反过来又可促进再生作用。
在受损肌肉的治疗中还可以使用其它的附加步骤。在一个实施方案中，该附加的步骤包括使用非甾体抗炎药(NSAIDs)、超声治疗、高压的氧，并且在严重的损伤中，还可以进行手术。NSAIDs应当是早期治疗的一部分，并且应当在损伤后立即使用。在愈合的早期阶段短期使用NSAIDs可以降低炎性细胞反应，并且对于受损肌肉的伸长和收缩性没有不良影响。
在另一个实施方案中，该附加步骤包括使用超声治疗。超声治疗被广泛地推荐并被用于肌肉扭伤的治疗。认为超声治疗可促进增生阶段的肌肉再生。
在另一个实施方案中，该附加的步骤包括使用高压的氧。已知在修复的早期，对兔子进行高压氧治疗可显著改善最后的结果。认为对其它的哺乳动物例如人类进行该类高压氧治疗是有帮助的，例如可以加速肌肉的再生。
在另一个实施方案中，该附加的步骤包括手术介入。肌肉损伤的手术治疗应当用于最严重的损伤，因为在大多数情况中保守治疗就能够获得良好的效果。则手术治疗仅仅建议用于如下的情况：(1)大面积的肌内血肿，(2)伴有轻微的或不伴有肌肉不适的三度扭伤或撕裂，以及(3)二度扭伤如果一半以上的肌腹被撕裂。
在本发明的另一个主要方面，可使用重组技术来制备至少一种神经毒素的组分。该技术包括从得自天然物质的纯系DNA获得遗传物质或获得合成的寡核苷酸序列的步骤，所述遗传物质或寡核苷酸序列可编码组分中的一种，例如治疗、转运和/或靶向组分。该遗传性构造首先可以通过该遗传构造与克隆载体，如噬菌体或质粒的融合而被结合到宿主细胞中进行放大。然后，将该克隆载体播入到宿主中，优选大肠杆菌(E.coli’s)。重组的基因在宿主细胞内进行表达后，将生成的蛋白质用常规的技术分离出来。所表达的蛋白质可包含该神经毒素的全部三种组分。例如，所表达的蛋白质可包含E型肉毒杆菌毒素的轻链(治疗组分)、B型肉毒杆菌毒素的重链，优选HN(转运组分)、以及A型肉毒杆菌毒素的Hc，其可以选择性地与运动神经元进行结合。在一个实施方案中，所表达的蛋白质可以包含该神经毒素全部三种组分中的一部分。在这种情况中，这些组分可以用现有技术中所公知的技术来进行化学连接。
重组制备这些神经毒素具有许多优点。例如，用厌氧的梭状芽孢杆菌培养物制备神经毒素是一种麻烦并且费时的过程，其包括多步纯化方案，其中包括数次蛋白沉淀步骤，以及毒素的长时间的或重复的结晶或数个步骤的柱色谱。值得注意的是，该产物的高毒性使得该过程必须在严格密封的条件下来完成(BL-3)。在发酵过程中，折叠的单链神经毒素通过被称为切口的过程被内源性的梭状芽孢杆菌蛋白酶所激活。这包括从单链中除去大约10个氨基酸残基以形成双链的形式，在该种形式中，两个链仍然通过链内二硫键共价连接。
被切口的神经毒素比未被切口的形式更具活性。切口的量和精确位置随着产生毒素的细菌的血清型而变化。因此，在单链神经毒素激活作用中的差异和被切口的毒素的产率上的差异是由所给出的菌株所产生的水解蛋白活性的类型和量的差异而造成的。例如，99％以上的A型梭状芽孢杆菌肉毒杆菌单链神经毒素是由Hall A梭状芽孢杆菌肉毒杆菌的菌株所激活的，而B型和E型菌株产生具有较低活化量的毒素(0至75％，取决于发酵时间)。因此，高毒性的成熟神经毒素在作为治疗性神经毒素的商业制造的神经毒素中占主要部分。
因此，工程梭状芽孢杆菌毒素的活化程度是进行这些物质的制造时所需要着重考虑的。如果神经毒素如肉毒杆菌毒素和破伤风毒素可以在生长迅速的细菌(如异系的大肠杆菌细胞)中以相对无毒的单链(或具有降低的毒性的单链)形式高产率地重组表达，则这将成为一个主要的优点，其中所说的单链是安全的，易于被分离出来并且可以很容易的被转化成全活性的形式。
因为安全性是最基本的考虑，所以以前的工作集中于破伤风毒素和肉毒杆菌毒素的各H和L链在大肠杆菌中的表达和提纯上；这些被分离出来的链本身就是无毒的；参见Li等人，Biochemistry33：7014-7020(1994)；Zhou等人，Biochemistry34：15175-15181(1995)，其在这里被引入作为参考。在分别制造出这些肽链后并且在进行严格控制的条件下，可以通过氧化的二硫键使该H和L亚基结合起来形成神经麻痹的双链。
下面这些非限制性的实施例提供了治疗受损肌肉以及制造重组的神经毒素，优选肉毒杆菌毒素的优选方法。下面的实施例4-8中描述了制造重组的肉毒杆菌毒素的方法并且其与Dolly等人在国际专利申请WO 95/32738中所描述的方法相同，其所公开的内容在这里被全部引入作为参考。
实施例1
破裂的二头肌腱的治疗
肱二头肌的破裂一般发生于二头肌的近端并且涉及该二头肌的远端(longhead)。该肌肉可以在桡骨上的远端附着处上破裂，但这种情况很少见。最常见的是，破裂发生于有在碰撞综合征后继发肩膀痛的长期病史的40岁以上的成年人。长期以来，该腱受到磨损并变得很脆弱，并且最终部分或全部破裂。无论如何，该破裂常常是由一些轻微的事情所引起的。这些破裂通常与回旋肌套撕裂有关，尤其是年纪较大的人。
在提拎一些重物盒后，一名45岁的男子在下臂上出现膨出。他报告在上臂曾有过突然锐痛的历史，并且常常伴有可听见的拍击。诊断该男子二头肌腱破裂并且其处于修复过程的第1个阶段中。该破裂可被划分为轻度二度扭伤。
通过向该二头肌肌内推注约0.1U/kg至约25U/kg的神经毒素来对该患者进行治疗。优选该神经毒素是E型和/或F型肉毒杆菌毒素，更优选地是A型肉毒杆菌毒素。特定的给药剂量和给药频率取决于许多因素，并且由治疗医生来决定。还指导该患者进行休息并且对该二头肌用冰敷压。在给药神经毒素后大约三天内，该患者能够屈臂。在大约又过了三天后，该患者经历了炎症减少的过程，这是患者进入修复过程的第2和3个阶段的迹象。并且该患者所经受的疼痛明显降低。还可以局部施用约10个单位至约200个单位的A型肉毒杆菌毒素来进行长期(2-4个月)治疗，用于肌肉固定和疼痛减少。
实施例2
伸肌结构(mechanism)破裂
膝伸肌结构的破裂以两种方式发生：对于较年轻的患者而言，是突然的或猛烈的力(如跳、举重)的结果；对于年长的患者而言，是相对轻微的力的结果。在两种情况中，可能在以前都曾经有一些初始原因(arching)。这种情况会影响一般久坐并突然增加他们的活动水平的年长患者，或有一些先前存在或共存疾病如糖尿病、类风湿性关节炎、以及其它全身的炎症性疾病的患者或在以前进行过膝盖手术的患者。
一名22岁的女性英式足球队员不能伸展其膝盖。该患者还不能作直腿抬高，但是如果她将手放在她的大腿上并且使其膝盖保持伸展的话她还能够走路。普通的放射照相表明其髌骨的位置比正常的位置低。诊断该患者的四头肌严重破裂。
在查明该损伤很严重(三度)后，该患者同意进行修复性手术。在手术后，该患者通过向该四头肌肌内推注约0.1U/kg至约25U/kg的神经毒素(如约10个单位至约400个单位的A型肉毒杆菌毒素)来进行治疗。优选地该神经毒素是A型肉毒杆菌毒素。特定的给药剂量和给药频率取决于许多因素，并且由治疗医生来决定。还指导该患者进行休息并且对该四头肌用冰敷压。在进行神经毒素给药后约15天内，受损的肌肉可逐渐的运动和活动。然后鼓励该患者轻轻地运动正在恢复的肌肉以增强它和周围肌肉的力量。随着该毒素作用逐渐消失，该患者然后可很快的参加物理治疗方案或恢复常规活动和/或运动。如果这名患者以这种运动为生，则肉毒杆菌毒素治疗将帮助她早日回到这种活动中去。还可局部使用约10个单位至约200个单位的A型肉毒杆菌毒素来进行长期(2-4个月)的肌肉固定。
实施例3
外胫夹的治疗
跑步者常见于在下肢出现胫部裂缝，其可造成疼痛并会对这种活动造成限制。由胫部裂缝所导致的小腿疼痛是由腿部肌肉中在其与胫部的接触点上的微小撕裂造成的。有两种类型：1.发生于胫骨前部的前外胫夹。2.发生在沿着胫骨的腿内部(内侧)的后外胫夹。
前外胫夹是由于肌肉失调、减震不足或用脚尖跑动而造成的。过度的俯卧对前和后外胫夹都有影响。
在治疗扭伤的肌肉，如外胫夹时，建议使用五个步骤：(1)通过使用夹板、衬垫和/或拐杖来保护受损的肌肉不会受到进一步的损伤；(2)对活动进行限制，通常在48至72小时内对活动进行限制以使之开始进行愈合过程。可以给予短期作用的E或F型肉毒杆菌毒素或改性的A型肉毒杆菌毒素以减少A型毒素的体内生物学活性时间(即使之具有较短的弛缓肌肉麻痹期)。在同样待审的专利申请序号为09/620,840的美国专利申请中描述了适用于本发明的具有缩短的体内生物活性时间的适宜的肉毒杆菌毒素，包括A型肉毒杆菌毒素，该申请在这里全部被引入作为参考。对于更严重的扭伤而言，对活动的限制可能持续几星期至几个月。因为需要对活动进行长期的限制，所以适合给予一种作用期较长的肉毒杆菌毒素，例如(未改性的)B型肉毒杆菌毒素，或更优选A型肉毒杆菌毒素。不进行这种治疗，则病人可能要经历数周的活动限制。随着愈合过程的开始，可考虑使受影响的肌肉进行温和的动作和运动；(3)每小时应使用15-20分钟的冰敷；(4)在冰敷间可保持压缩如弹性绷带；和(5)升高受损的区域以将肿胀减到最少。
实施例4
BoNT/A-L链基因的亚克隆
这一实施例描述了克隆编码BoNT/A-L链的多核苷酸序列的方法。编码BoNT/A-L链的DNA序列是通过一种使用合成的具有5′-AAAGGCCTTTTGTTAATAAACAA-3′(SEQ ID#1)和5′-GGAATTCTTACTTATTGTATCCTTTA-3′(SEQ ID#2)序列的寡核苷酸的PCR方案来进行放大的。这些引物的应用使之分别将Stu I和EcoR I限定位点引入到BoNT/A-L链基因片段的5′和3′末端上。这些限制位点随后被用于促进该放大产物的单向亚克隆。此外，这些引物在该L链编码序列的C-末端引入终止密码子。在放大反应中，用得自C.Botulinum(菌株63A)的染色体DNA作为模板。
该PCR放大是以一个包含10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM的各种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、50pmol的各种引物、200ng的基因组DNA和2.5个单位的Taq-聚合酶(Promega)的100μl的容积进行的。使该反应混合物进行35次变性作用(在94℃下1分钟)、退火(在37℃下2分钟)和聚合反应(在72℃下2分钟)的循环。最后，将该反应在72℃下再延长另外5分钟。
将该PCR放大产物用Stu I和EcoR I进行消化，用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并且将其连接到Sma I和EcoR I消化的pBluescriptII SK*中，得到质粒，pSAL。用标准的操作将隐匿这种质粒的细菌转化体分离出来。根据制造商的说明，用SEQUENASE(United StatesBiochemicals)通过双链质粒序列分析证实该克隆的L链多核苷酸的同一性。按需制备合成的寡核苷酸排序的引物以获得重叠的排序流程。发现该克隆的序列与Binz等人在J.Biol.Chem.265：9153(1990)以及Thompson等人在Eur.J.Biochem.189：73(1990)中所公开的序列相同。
还可以制造出所设计的定点突变体来调和该BoNT/A-L链的酶活性。
实施例5
A-L型肉毒杆菌毒素(BoNt/A-L)链融合蛋白的表达
本实施例描述了验证可作为治疗组分的野生型L链在藏匿pCA-L质粒的细菌中的表达的方法。将藏匿有任一的pCAL的分离良好的细菌菌丛接种到包含100μg/ml氨苄西林和2％(w/v)葡萄糖的L-肉汤中，并将其在30℃下振荡过夜培养。将该培养了一夜的培养物用包含100μg/ml氨苄西林的新鲜的L-肉汤以1∶10的比例进行稀释并将其培养2小时。通过向其中加入IPTG至0.1mM的最终浓度来诱导融合蛋白表达。在30℃下又进行了4小时的培养后，通过在6,000×g下离心10分钟来收集细菌。
小规模的SDS-PAGE分析证实，在得自IPTG-诱导的细菌样品中存在90kDa的蛋白质谱带。这种Mr与所预测的具有MBP(～40kDa)和BoNT/A-L链(～50kDa)组分的融合蛋白的大小相一致。此外，当与由对照培养物中所分离出来的样品进行比较时，该IPTG-诱导的克隆物实质上包含更大量的融合蛋白。
在IPTG-诱导的细菌提取物中存在所需的融合蛋白还可以使用Cenci di Bello等人在Eur.J.Biochem.219：161(1993)中所描述的多克隆抗-L链探针通过蛋白质印迹法来进行确证。用结合于辣根过氧化物酶的抗-兔免疫球蛋白(Bio-Rad；Hemel Hempstead，UK)和ECL检测系统(Amersham，UK)来对在PVDF膜(Pharmacia；Milton Keynes，UK)上的反应带进行目测检验。蛋白印迹法的结果证实了占优势的融合蛋白和一些弱带的存在，这些弱带对应于比大小完好的融合蛋白的Mr低的蛋白。这种观测结果暗示该融合蛋白在细菌中或分离过程中发生了有限的降解。在分离期间不使用1mM或10mM的苄脒(Sigma；Poole，UK)可以消除这种水解蛋白的分解。
通过上述方法分离出来的完整融合蛋白的产量仍然可完全满足这里所述的所有操作。在对污染的SDS-PAGE凝胶进行评估的基础上，用IPTG所诱导的细菌克隆物每升培养物可产生5-10mg的总MBP-野生型或突变的L链融合蛋白。因此，尽管确定发生任何有限的蛋白水解作用，但这里所描述的制造BoNT/A-L链融合蛋白的方法的效率仍然很高。
通过直链淀粉亲和色谱，将由pCAL和pCAL-TyrU7表达质粒编码的MBP-L链融合蛋白从细菌中进行纯化。然后，将重组的野生型或突变的L链从该融合蛋白的糖结合区通过使用因子X2进行特异性裂解来分离。这种裂解过程可产生游离的MBP、游离的L链和少量的未裂解的融合蛋白。虽然已经表明存在于该类混合物中的所得的L链具有所需的活性，但是我们还进行了另外的纯化步骤。因此，将该裂解产物的混合物应用到第二个直链淀粉亲合柱上，该柱结合MBP和未裂解的融合蛋白。游离L链不会被保留在该亲合柱上，因此可以被分离下来，用于下面所描述的实验中。
实施例6
融合蛋白的纯化和重组的BoNT/A-L链的分离
这一实施例描述了一种从细菌克隆物中制备和纯化野生型重组BoNT/A轻链的方法。将得自1升表达野生型BoNT/A-L链蛋白的细菌培养物的颗粒重新混悬于包含1mM苯基-甲磺酰氟(PMSF)和10mM苄脒的柱缓冲物[10mM Tris-HCl(pH 8.0)、200mM NaCl、1mM EGTA和1mM DTT]中，并且通过超声处理来使之溶解。通过在4℃下15,000×g下离心15分钟来使该溶解产物变得清澈。将上清液加到一根直链淀粉亲合柱上[2×10cm，30ml树脂](New England BioLabs；Hitchin，UK)。用柱缓冲物将未结合的蛋白从该树脂上洗下来，直至洗脱液不含蛋白，这一点可以通过在280nm下稳定的吸收读数来进行判断。随后，用包含10mM麦芽糖的柱缓冲物对结合的MBP-L链融合蛋白进行洗脱。将包含融合蛋白的部分进行合并，然后将其用另外加入了150mM NaCl、2mM CaCl2和1mM DTT的20mM Tris-HCl(pH 8.0)在4℃下透析72小时。
在用另外加入了150mM Na Cl、2mM CaCl2和1mM DTT的20mMTris-HCl(pH 8.0)的缓冲液进行透析时，在酶∶底物的比例为1∶100的条件下用因子X2(Promega；Southampton，UK)对融合蛋白进行裂解。在4℃下透析24小时。将得自该裂解步骤的MBP和野生型或突变的L链的混合物填充到用柱缓冲物进行了平衡的10ml直链淀粉柱上。制备该流过馏分的等分试样，将其用于SDS-PAGE分析以鉴定包含L链的样品。将该流过馏分的剩余部分存储在-20℃下。将全部的大肠杆菌提取物或纯化的蛋白溶解于SDS样本缓冲物中，并且根据标准方法来进行PAGE。这种方法的结果表明重组的毒素片段约占该样本蛋白含量的90％。
上述结果表明这里所描述的制备MBP-L链融合蛋白的方法可用于有效的制备野生型和变异的重组BoNT/A-L链。此外，该结果还证明该重组的L链可以从该融合蛋白的麦芽糖结合区被分离出来并且之后纯化。
建立敏感的以抗体为基础的试验来对重组L链产物和它们的天然配对物的酶活性进行比较。该试验使用对SNAP-25的完整C-末端区域具有特异性的抗体，其中所说的SNAP-25的完整C-末端区域相当于BoNT/A的裂解部分。SNAP-25的BoNT/A裂解反应产物的蛋白印迹法表明该抗体不能与SNAP-25亚-片段进行结合。因此，在下面的实施例中所用的抗体重神经毒素(reneurotoxin)仅仅可探测完整的SNAP-25。抗体结合的损失可作为通过加入BoNT/A轻链或它们的重组衍生物所介导的SNAP-25蛋白水解作用的指示剂。
实施例7
重组L链对SNAP-25底物的蛋白水解活性的评估
这一实施例描述了一种证明天然和重组的BoNT/A-L链都可以蛋白水解SNAP-25底物的方法。用一种定量试验来比较野生型和它们的重组类似物裂解SNAP-25底物的能力。用于本试验的底物是通过制备一种谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-SNAP-25融合蛋白来获得的，其包含凝血酶的裂解位点，用pGEX-2T载体来进行表达并且通过使用谷胱甘肽琼脂糖的亲合柱色谱来进行纯化。然后，在酶∶底物的比例为1∶100的条件下，在包含150mM NaCl和2.5mM CaCl2的50mM Tris-HCl(pH7.5)中，使用凝血酶将SNAP-25从该融合蛋白上裂解下来(Smith等人，Gene 67：31(1988))。未被裂解的融合蛋白和裂解的谷胱甘肽结合区域结合到该凝胶上。用后一种缓冲物对该重组的SNAP-25蛋白进行洗脱并且用100mM HEPES(pH 7.5)在4℃下透析24小时。用常规的方法来对总的蛋白浓度进行测定。
培养对SNAP-25的C-末端区域具特异性的兔多克隆抗体来对抗具有氨基酸序列——CANQRATKMLGSG(SEQ ID#3)的合成肽。这种肽相当于突触浆膜蛋白的残基195至206，并且在天然SNAP-25中没有发现N-末端的半胱氨酸残基。用马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)作为交联的神经毒素(Sigma；Poole，UK)，将合成的肽连接到牛血清白蛋白(BSA)(Sigma；Poole，UK)上以改善抗原性(Liu等人，Biochemistry 18：690(1979)1。使用一种柱来进行抗-肽抗体的亲合纯化，其中所说的柱具有通过其N-末端半胱氨酸残基连接到氨基烷基琼脂糖树脂上的抗原性的肽(Bio-Rad；Hemel Hempstead，UK)，使用交联的乙基3-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺，用碘乙酸来进行活化。在用包含25mM Tris-HCl(pH 7.4)和150mM NaCl的缓冲液对该柱进行连续的冲洗后，将肽特异性抗体用100mM甘氨酸(pH 2.5)和200mM NaCl的溶液进行洗脱，并将其收集于包含0.2ml的1MTris-HCl(pH 8.0)中和缓冲液的管中。
在对其酶活性进行评估前，将包含野生型L链的所有重组物制品在4℃下透析一整夜，将其透析到包含0.02％ Lubrol和10μM醋酸锌的100mM HEPES(pH 7.5)中。然后，将预先用20mM DTT在37℃下还原了30分钟的BoNT/A和这些透析样品用另外加入了1mM DTT的后一种HEPES缓冲液稀释至不同的浓度。
该反应混合物包括5μl重组SNAP-25底物(最终浓度为8.5μM)和20μl被还原的BoNT/A或重组野生型L链。在用25μl 2％三氟醋酸水溶液(TFA)和5mM的EDTA来处理该反应前，将所有的样品在37℃下培养1小时(Foran等人，Biochemistry 33：15365(1994))。用多克隆SNAP-25抗体，通过加入SDS-PAGE样本缓冲液并进行煮沸来制备用于SDS-PAGE和蛋白印迹法的各样品的等分试样。用ECL检测系统来监测抗-SNAP-25抗体的反应活性并通过光密度扫描来进行定量。
蛋白印迹法结果清楚的表明了精制的突变L链和天然或重组的野生型BoNT/A-L链间的蛋白水解活性的差异。特定地，虽然其效力多少会低于在该方法中作为阳性对照的还原的BoNT/A天然L链，但是重组的野生型L链可裂解SNAP-25底物。因此，通过重组的方法并通过随后的分离可以制造出酶活性形式的BoNT/A-L链。此外，在L链蛋白中的单个氨基酸取代可消除该重组蛋白降解突触末端蛋白的能力。
正如前面的野生型重组BoNT/A-L链的生物学活性试验一样，测定了MBP-L链融合蛋白减少Ga2+-激活的儿茶酚胺从洋地黄皂甙-预渗透的牛嗜铬肾上腺细胞释放的能力。相一致地是，完整的野生型重组的L链融合蛋白或被因子X2所裂解而产生包含游离MBP和重组L链的混合物形式的野生型重组的L链融合蛋白所产生的Ga2+刺激释放的剂量依赖性抑制作用等于由天然BoNT/A所产生的抑制作用。
实施例8
天然L链、重组的野生型L链与精制H链的重建
用2M的脲将天然的H和L链从BoNT/A(List Biologicals Inc.；Campbell，U.S.A.)中分离出来，用100mM DTT进行还原，然后根据所建立起来的色谱方法进行纯化(Kozaki等人，Japan J.Med.Sci.Biol.34：61(1981)；Maisey等人，Eur.J.Biochem.177：683(1988))。将纯化的H链与等克分子量的天然L链或重组野生型L链进行结合。重建是在4℃下，通过将该样品用由25mM Tris(pH 8.0)、50μM醋酸锌和150mM NaCl所组成的缓冲液透析4天来进行的。在进行透析后，通过SDS-PAGE来对重组L链和天然H链的缔合作用进行监测并通过光密度扫描来进行定量，其中所说的重组L链和天然H链的缔合作用形成二硫键连接的150kDa的双链。与重组L链所形成的双链分子的比例低于使用天然L链时所获得的比例。的确，仅有约30％的重组野生型或突变的L链与H链进行了重建，而90％以上的天然L链与H链进行了重建。尽管重建的效率较低，但是可以很容易的制造出随后功能性研究中所用的结合了足够该重组L链的物质。
虽然用各种特定的实施例和实施方案对本发明进行了描述，但是应当清楚，本发明并不会因此而受到限制，并且在如下的权利要求的范围内其可以有多种变化形式。其它的实施方案、变型和修改都可能会落在本发明的范围内。例如，根据本发明所公开的内容，可以用约500个单位至约4,000个单位的B型肉毒杆菌毒素来治疗受损的肌肉。

Claims (12)

1.神经毒素在制备用于治疗损伤肌肉的局部给药的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所说的局部给药是肌内注射。
3.如权利要求1所述的用途，其中该神经毒素基本固定受损的肌肉。
4.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素在受损肌肉的修复过程的第1和第2个阶段可以有效的固定该受损的肌肉。
5.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素在受损肌肉的修复过程的第1个阶段中可以有效的固定该受损的肌肉。
6.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素是A、B、C1、D、E、F、或G型肉毒杆菌毒素。
7.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素是通过重组制备的神经毒素。
8.肉毒杆菌毒素在制备用于治疗损伤肌肉的局部给药的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中所说的肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
10.A型肉毒杆菌毒素在制备用于促进损伤肌肉愈合的局部给药的药物中的用途。
11.肉毒杆菌毒素在制备用于治疗损伤肌肉有关的疼痛的局部给药的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所说的肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
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