KR100873819B1

KR100873819B1 - 근육 손상의 처치방법

Info

Publication number: KR100873819B1
Application number: KR1020037004676A
Authority: KR
Inventors: 그레고리에프. 브룩스; 케이로져 아오키
Original assignee: 알러간, 인코포레이티드
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2008-12-11
Also published as: DK1322324T3; CA2424242C; CA2424242A1; MXPA03002576A; EP1322324B1; US7108857B2; US6423319B1; US7468188B2; KR20030043981A; CN102078597A; TWI292713B; US20050281846A1; WO2002028425A3; WO2002028425A2; ATE477816T1; BR0114440A; EP1322324A2; NZ524793A; JP2012229263A; US20020192240A1

Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소와 같은 신경독을 국소 투여하여, 치유를 촉진하고 및/또는 손상된 근육과 관련된 동통을 감소시키는 손상 근육의 처치방법에 관한 것이다.

Description

근육 손상의 처치방법{METHODS FOR TREATING MUSCLE INJURIES}

본 발명은 근육손상의 처치방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 손상된 근육에 신경독을 투여하여 손상된 근육을 처치하는 방법에 관한 것이다.

근육 손상에는 타박상(멍), 열상, 국소빈혈, 좌상(strain) 및 완전 파열과 같은 골격근에 대한 심각한 손상이 포함된다. 이러한 손상은 굉장한 동통을 유발하여, 손상을 입은 사람이 작업을 하거나, 정상적인 일상 활동조차 할 수 없도록 하여, 그를 무능력하게 만들 수 있다. 골격근에 심각한 손상이 있는 경우, 좌상(신장-유도 손상이라고도 알려져 있음)이 가장 흔하다. 예를 들어, 좌상은 직업적으로 또는 스포츠 의학 전문가에 의해 처치되는 모든 손상의 30% 이상을 차지한다[Garrett 등. Am J Sports Med.,24(6):S2-S8,1996.

근육 좌상 손상은 근육-건 유닛의 파괴를 특징으로 한다. 근육-건 유닛의 파괴는 근육의 어느 부위에서나 발생할 수 있다. 이러한 종류의 손상은 흔히 대퇴직근, 반건양근 및 비복근과 같이, 두개의 관절을 교차하여 작용하는 표면 근육의 근힘줄 접합부(myotendinous junction; MTJ)에서 발생한다.

근육 좌상은 한쪽으로 치우친 운동, 또는 근육의 흔치 않은 사용에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 수축이 한쪽으로 치우치면 더 적은 활성 운동 유닛을 사 용하여 더 큰 힘을 발생시킨다. 이러한 경우, 늘어나는 동안, 지나치게 신장된 근육 유닛이 과도하게 긴장된다. 과도한 긴장은 Z-라인의 랜덤한 파괴로 여겨지는 것을 중심으로 하여, 근육의 수축 요소에 미세한 손상을 일으킬 수 있다. 근육이 손상되면, 손상을 입은 사람은 동통, 허약 및 제한된 움직임을 특징으로 하는 지연발병근육통을 겪게 된다. 동통은 대부분 근육 손상 후 약 1 내지 2일동안이 격렬하고, 허약 및 제한된 움직임은 일주일 이상 지속될 수 있다. 골격근의 경미한 좌상을 부적절하게 치료하는 경우, 더욱 심각한 손상을 야기할 수 있다.

근육 좌상은 손상의 경중 및 혈종의 성질에 기초하여 3가지로 분류한다.: (1) 가벼운,(1도) 좌상; 몇몇 근육 섬유의 찢김; 경미한 팽창 및 불쾌감, 힘은 감소하지 않거나 최소한으로만 감소하고, 운동이 제한되는 것을 수반함; (2) 중간정도의,(2도) 좌상; 근육 섬유가 더욱 크게 손상되어, 힘이 확실하게 감소됨; (3) 심각한 (3도) 좌상; 전체 근팽대부를 가로질러 파열이 확장되어, 근육 기능이 완전히 상실됨.

근육의 좌상 주에 근육내 혈관이 파열되면 종종 거대한 혈종이 일어난다. 손상된 근육에서는 두가지 상이한 형태의 혈종이 나타난다: 근육내 혈종 및 근육간 혈종. 첫번째 형태인 근육내 혈종은 손상되지 않은 근막에 의해서 그 크기가 제한된다. 여기에서, 혈액의 관외유출은 근육내 압력을 증가시켜, 혈종을 압박하고 그 크기를 제한한다. 이러한 형태의 혈종은 동통 및 근육 기능의 상실을 유발한다. 두번째 형태인, 근육간 혈종은 근막이 파열되어 관외유출된 혈액이 근육사이의 공간으로 퍼져서, 근육내의 압력이 크게 증가하지 않는 경우에 발생한다. 근육내 압 력이 증가하지 않는 한, 이러한 형태의 혈종은 심한 동통을 유발하지 않는다.

좌상 손상의 처치에 있어서는, 손상 직후에 손상된 근육을 움직이면 원래의 손상 부위가 종종 재-파열되기 때문에, 특히, 손상후 초기 2 내지 3일 동안, 손상된 근육을 움직이지 못하게 하는 것이 중요하다. 재-파열되면 더욱 심각하게 손상되어, 치료가 지연되고, 조직에 흉터를 남길 수 있다[Javinen 등, Curr Opin Rheumatol, vol 12:155-161(2000)].

손상 부위의 재-파열은, 바람직하게는 손상 직후에, 손상된 근육을 움직이지 못하게 고정함으로써 예방할 수 있다. 고정은 새로 형성된 육아 조직이 근육 수축시 발생되는 힘을 견딜만큼 충분한 인장강도에 도달할 수 있도록 해준다.

손상된/좌상을 입은 근육을 고정하는 공지된 방법은 물리적인 구속장치 또는 캐스트의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 경추 칼라는 손상된 경추 굴근 또는 신근을 고정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 구속장치를 사용하는 경우에는 종종 귀찮고 불편하다. 더욱이, 특정한 근육군의 손상에 대해서는, 물리적인 구속장치를 사용하는 것이 실용적이지 못하거나, 물리적인 구속장치를 사용할 수 없다. 예를 들어, 이러한 구속장치를 사용하여 좌상을 입은 상측 승모근 또는 대둔근을 고정하는 것은 매우 어렵다.

보툴리눔 독소

혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독소를 제공한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포 자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과하여 말초 운동 뉴런을 공격할 수 있는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 죽음으로 증상이 진행될 수 있다.

보툴리눔 독소 타입 A("BoNT/A")은 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물 신경독이다. 마우스에서 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소(정제된 신경독 복합체) 세로타입 A의 LD₅₀은 약 50 피코그램이다. 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD₅₀로서 정의할 수 있다. 7개의 면역학적으로 구별되는 보툴리눔 신경독은, 세로타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C₁, D, E, F 및 G로 특징지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 일으키는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 래트에서 발생하는 마비율로 측정할 때, BoNT/A는 보툴리눔 독소 타입 B(BoNT/B)에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, BoNT/B는, BoNT/A에 대한 영장류 LD₅₀의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화 도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다.

보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근 장애의 치료를 위해 임상 세팅에 사용되고 있다. BoNT/A는 미국 식품의약청에 의해서, 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 허가되었다. 독소 타입 A 이외의 보툴리눔 세로타입들은 BoNT/A와 비교할때, 활성에 있어서 더 낮은 효력 및/또는 더 짧은 지속시간을 가지는 것으로 보인다. 근육내 주사된 보툴리눔 독소(BoNT/A와 같은)의 임상 효과는 대략 수시간 내에 나타난다. 그러므로, 전부는 아니지만 대부분의 보툴리눔 신경독을 근육내 주사하는 경우, 예를 들어, 마우스 지 외전 채점 검사법(mous digit abduction scoring assay; DAS)으로 측정할 때, 주사후 1일 이내에 상당한 근육 마비를 제공한다는 것에 주의하는 것이 중요하다. Aoki K. R., reclinical Update on BOTOX(Botulinum toxin type A)-Purified Neurotoxin Complex Relative to Other Botulinum Toxin Preparations, Eur J. Neur 1999, 6(suppl 4):S3-S10. 일회 BoNT/A의 근육내 주사에 의한 증상 구제의 전형적인 지속시간은 약 3개월이다. in vivo에서 생물학적 활성 기간이 감소된, 보툴리눔 독소 타입 A를 포함하는, 보툴리눔 독소가 미합중국 특허출원 제09/620840에 개시되어 있으며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 병합되어 있다.

모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 보인다 하더라도, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 및/또는 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 예를 들어, 보툴리 눔 타입 A 및 E는 모두 25kD 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. BoNT/B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C₁(BoNT/C₁)은 신택신 및 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다.

세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫번째 단계에서는, 중쇄(H 사슬)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스전 막에 결합한다; 이 수용체는 보툴리눔 독소의 각 세로타입 및 테타니 독소에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 H 사슬의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.

두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 마지막 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 H 사슬의 아미노 말단 단편, H_N에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조 적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다 .

보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 L 사슬에 의해서 결정적인 세포내 엑소사이토시스 단백질이 절단되는 것을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 및 테타니 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 L 사슬에 포함되며; L 사슬은 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 테타니 신경독, 보툴리눔독소/B,/D,/F 및 /G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 시토졸 표면에 존재하는 VAMP은 대부분, 이러한 분해작용 중 하나의 결과로서 제거된다. 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다.

보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 흥미롭게도, 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 관련된 비독성 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, BoNT/A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900k, 500Dk 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. BoNT/B 및 C₁은 500kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. BoNT/D는 300kD 및 500kD 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kD 이상), 보툴리눔 독소 복합체의 근육 주사 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다.

in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가, 뇌 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다.

BoNT/A는 발효조에서 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 만들어 배양한 다음, 발효 혼합물을 공지의 방법으로 수확 및 정제하여 얻을 수 있다. 처음에는 모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는, 비활성 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이 와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C₁, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, BoNT/B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 아마도 알려진대로 BoNT/A에 비해 BoNT/B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 BoNT/B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 동일한 투여량 레벨에서 BoNT/B는 BoNT/A에 비하여, 근육 주사시, 활성의 지속시간이 더 짧고 또한 효력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

하기와 같이, 임상 세팅에서 BoNT/A를 사용하는 것이 보고되었다:

(1) 여러 근육부위에 1회 근육내 주사당 약 75-125 유닛의 BOTOX®(캘리포니아 소재, Allergan, Inc.로부터 입수가능, 상표명 BOTOX®)를 사용하여, 경부 디스토니아(cervical dystonia)를 처치;

(2) 1회 근육내 주사당 5-10 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 미간 주름(이마 주름)을 처치(5 유닛을 비근근에 근육내 주사하고, 10 유닛을 각각의 추미근에 근육내 주사)

(3) 치골직장근에 약 30-80 유닛의 BOTOX®를 괄약근내 주사하여 변비를 처치

(4) 윗눈꺼풀의 측면연골전 안윤근 및 아래 눈꺼풀의 측면연골전 안윤근에, 근육당 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 안검경련을 처치

(5) 외안근에 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 사시를 치료, 주사량은 주사하는 근육의 크기 및 원하는 근육마비 정도(즉, 원하는 디옵터 교정 정도)에 따라 달라짐.

(6) 하기와 같이, 상이한 5부위의 상지 굴근에 BOTOX®를 근육내 주사하여 졸중 후의 상지 경련을 처치

(a) 심지굴근 : 7.5 U 내지 30 U

(b) 천지굴근 : 7.5 U 내지 30 U

(c) 척측수근굴근 : 10 U 내지 40 U

(d) 요측수근굴근 : 15 U 내지 60 U

(e) 상완이두근 : 50 U 내지 200 U

한번에 각각 상기한 5가지 근육에 주사하여, 각 처치 때마다 환자의 상지 굴근에 90 U 내지 360 U의 BOTOX®를 근육내 주사.

다양한 임상 조건에서 BoNT/A가 성공을 이루자, 다른 보툴리눔 독소 세로타입들도 관심을 끌었다. 상업적으로 입수가능한 두가지 BoNT/A 제제(BOTOX® 및 Dysport®) 및 BoNT/B 및 F 제제(두가지 모두 Wako Chemical, Japan에서 입수)에 대한 연구가 행하여졌고, 국소 근육 약화 효능, 안정성 및 항원 가능성이 결정되었 다. 보툴리눔 독소 제제를 우측 비복근의 상부에 주사(0.5 내지 200.0 유닛/kg)하고, 마우스 지 외전 채점 검사법(DAS)을 사용하여 근육 약화를 평가하였다. 투여량 반응 곡선으로부터 ED₅₀값을 계산하였다. 또다른 마우스들에 근육내 주사하여 LD₅₀투여량을 결정하였다. LD₅₀/ED₅₀으로서 치료 지수를 계산하였다. 별도 그룹의 마우스들에서, 뒷다리에 BOTOX®(5.0 내지 10.0 유닛/kg) 또는 BoNT/B (50.0 내지 400.0 유닛/kg)을 주사하고, 근육 약화 및 물 소비(입이 마르는 것으로 추정되는 모델)에 대하여 시험하였다. 항원 가능성은 래빗에 매월 근육내 주사(BoNT/B를 2.0 내지 8.7 U/kg 또는 BOTOX®를 3.0 U/kg)하여 평가하였다. 근육 약화 피크 및 지속시간은 모든 세로타입에서 투여량과 관련이 있었다. DAS ED₅₀값(유닛/kg)은 다음과 같았다: BOTOX® : 6.7, Dysport® : 24.7, BoNT/ B : 11.8 내지 244.0, BoNT/F : 4.3. BOTOX®는 BoNT/B 또는 BoNT/F보다 작용의 지속시간이 더 길었다. 치료 지수는 다음과 같았다: BOTOX® : 10.5, Dysport® : 6.3, BoNT/B : 4.8. BoNT/B가 근육 약화에는 덜 효과적임에도 불구하고, 물 소비는 BoNT/B를 주사한 마우스가 BOTOX®를 주사한 것에서 보다 더 많았다. 주사한지 4개월 후에, 래빗 4마리중 2마리(1.5ng/kg으로 처치한 경우) 및 4마리 중 4마리(6.5ng/kg으로 처치한 경우)에서 BoNT/B에 대한 항체가 발현되었다. 또다른 연구에서, BOTOX® 처치 래빗 9마리중 0마리에서 BoNT/A에 대한 항체가 나타났다. DAS 결과에서는 BoNT/A가 BoNT/F와 동일한 상대적 최대 효력을 나타내며, BoNT/F는 BoNT/B보다 값이 더 크게 나타났다. 효과의 지속시간에 있어서는, BoNT/A가 BoNT/B보다 크며, BoNT/B의 효 과 지속시간은 BoNT/F보다 더 크게 나타났다. 상업적인 BoNT/A 제제 두가지(BOTOX® 및 Dysport® )은 치료 지수에 있어서 서로 달랐다. BoNT/B의 뒷다리 주사 후에 관찰되는 물 소비행동 증가는, 임상적으로 상당한 양의 BoNT/B가 쥐의 대순환으로 들어간다는 것을 나타낸다. 또한, 이 결과는 BoNT/A에 상당하는 효과를 얻기 위해서, 실험된 다른 세로타입들에서는 투여량을 증가시켜야만 한다는 것을 나타낸다. 투여량의 증가는 안전성 문제를 수반할 수 있다. 또한, 래빗에서, 세로타입 B는 BOTOX®보다 더욱 항원적이었고, 이는 아마도 BoNT/B의 유효량에서 단백질 부하가 더 크기 때문일 것이다.

보툴리눔 신경독은 신경근 접합부에서 작용하는 반면에, 테타니 신경독은 주로 중추신경계에서 작용한다; 두가지 모두 영향을 받은 뉴런의 액손으로부터 시냅스로 아세틸콜린이 방출되는 것을 억제하여 마비를 일으킴으로써 작용한다. 영향을 받은 뉴런의 중독 효과는 장기간 지속되며, 최근까지 비가역적인 것으로 여겨졌다. 테타니 신경독은 하나의 면역학적으로 구별되는 세로타입으로 존재하는 것으로 알려져 있다.

아세틸콜린

전형적으로, 포유류 신경계에서는 단일 형태의 작은 분자 신경전달물질만이 각각의 형태의 뉴런에 의해서 방출된다. 이 신경전달물질 아세틸콜린은 뇌의 여러 부위의 뉴런, 특히, 운동피질의 큰 피라미드 세포, 대뇌핵의 몇가지 상이한 뉴런, 골격근에 분포하는 운동 뉴런, 자율신경계(교감신경계 및 부교감신경계 모두)의 신경절이전 뉴런, 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 뉴런 몇가지에 의해서 분비된다. 본래, 대부분의 교감신경계의 신경절이후 뉴런은 신경전달물질인 노르에피네프린을 분비하는데 비하여, 땀샘, 기모근 및 몇몇 혈관으로의 신경절이후 교감신경 섬유만이 콜린성이다. 대부분의 경우, 아세틸콜린은 흥분효과를 나타낸다. 그러나, 아세틸콜린이 몇몇 말초 부교감신경 말단에서는 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 미주신경에 의한 심장박동의 억제).

자율신경계의 원심성 신호는 교감신경계 또는 부교감신경계를 통하여 몸에 전달된다. 교감신경계의 신경절이전 뉴런은 척수의 중간외측각에 위치하는 신경절이전 교감 뉴런 세포체로부터 뻗어나온다. 세포체로부터 뻗어나온 신경절이전 교감신경 섬유는, 척추주위 교감 신경절 또는 척추전 신경절에 위치하는 신경절이후 뉴런과 시냅스를 이룬다. 교감신경계 및 부교감신경계의 신경절이전 뉴런은 모두 콜린성이므로, 신경절에 아세틸콜린을 적용하면 교감 및 부교감 신경절이후 뉴런을 흥분시킬 것이다.

아세틸콜린은 두가지 형태의 수용체, 무스카린성 수용체 및 니코틴성 수용체를 활성화시킨다. 무스카린성 수용체는 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 콜린성 뉴런에 의해서 자극된 모든 효과기(effector) 세포에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 교감신경계 및 부교감신경계 모두에서 신경절이전 및 신경절이후 뉴런의 시냅스에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 또한 골격근 섬유의 여러 막들의 신경근 접합부에서 발견된다.

아세틸콜린은, 작은, 매끈한, 세포내 소포가 시냅스전 뉴런성 세포막과 융합될 때, 콜린성 뉴런으로부터 방출된다. 부신수질(또한, PC12 세포라인) 및 췌장의 섬세포과 같은, 광범위한 비-뉴런성 분비 세포는 큰 고밀도 중심 소포(large dense-core vesicle)로부터 각각 카테콜아민 및 부갑상선 호르몬을 방출한다. PC12 세포라인은 교감신경부신 발달(sympathoadrenal develpoment) 연구를 위한 조직 배양 모델로서 광범위하게 사용되는 래트 크롬친화성세포종 세포의 클론이다. 탈신경된 세포로 독소가 투과가능하게 하거나(전기충격법 등에 의해서), 독소를 직접주사하면, 보툴리눔 독소는 in vitro에서 두가지 세포종류 모두에서 두가지 화합물 종류의 방출을 모두 억제한다. 보툴리눔 독소는 또한 피질의 시냅토솜 세포 배양물로부터 신경전달물질인 글루타메이트가 방출되는 것을 억제하는 것으로 알려져 있다.

신경근 접합부는 근육세포의 주변 액손에 의해서 골격근에서 형성된다. 신경계를 통하여 전달된 신호는 말단 액손에서 작용 포텐셜이 되고, 이온 채널을 활성화하며, 그 결과로 예를 들어, 신경근 접합부의 운동 종판에서, 뉴런내 시냅스성 소포로부터 신경전달물질인 아세틸콜린이 방출된다. 아세틸콜린은 세포외 공간을 가로질러 근육 종판 표면의 아세틸콜린 수용체 단백질과 결합한다. 일단 충분하게 결합되면, 근육 세포의 작용 포텐셜이 특이적인 막 이온 채널 변화를 일으키고, 그 결과로 근육세포가 수축한다. 그리고 나서, 아세틸콜린은 근육세포로부터 방출되어, 세포외 공간에서 콜린에스테라아제에 의해서 대사된다. 대사생성물은 다른 아세틸콜린으로의 재생을 위해서 말단 액손으로 다시 회수된다.

상기한 바와 같이, 현재의 손상 근육 처치 방법은 여전히 불충분하다. 향상된 손상 근육 처치 방법이 요구된다.

개요

본 발명에 따르면, 손상 근육을 처치하는 효과적인 방법은 in vivo에서 치료유효량의 신경독을 손상근육에, 또는 그 근처에 국소 투여하는 단계를 포함하여 이루어진다. 신경독은 손상된 근육의 일시적인 화학탈신경을 제공하여, 근육의 수축을 감소시키는 기능을 한다. 본 발명의 목적은 치료를 용이하게 하고, 손상된 근육의 기능을 신속히 회복시키는 치료법을 제공하는 것이다. 손상된 근육은 예를 들어, 좌상을 입은 근육일 수 있다. 일 실시형태에서, 신경독은 근육내 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 신경독을 투여하는 단계는 물리적인 치료법 및/또는 외과 수술 전 또는 후에 실시된다.

또한, 본 발명에 따르면, 신경독을 투여하는 단계는 근육이 손상된 직후 또는 그후 실제로 가능한 빠른 때이다. 일 실시형태에서, 신경독은 손상 근육 회복 프로세스의 적어도 1 단계 및/또는 2 단계 동안, 손상된 근육을 고정 또는 실질적으로 고정시키는 데에 효과적이다.

본 발명에 따르면, 신경독은 표적 컴포넌트(targeting component), 치료 컴포넌트 및 전위 컴포넌트(translocation component)를 포함할 수 있다. 표적 컴포넌트는 시냅스전 운동 뉴런에 결합될 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 컴포넌트는 부티리쿰 독소, 테타니 독소, 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F, G 또는 이의 변형의 중쇄의 카르복실 말단 단편을 포함하여 이루어질 수 있다. 치료 컴포넌트 는 뉴런으로부터의 신경전달물질 방출 또는 그 프로세스를 방해하거나 조절할 수 있다. 일 실시형태에서, 치료 컴포넌트는 부티리쿰 독소, 테타니 독소, 또는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F, G 또는 이의 변형의 경쇄를 포함하여 이루어진다. 전위 컴포넌트는 신경독의 적어도 일부, 예를 들어, 치료 컴포넌트가 표적 세포의 세포질로 이동하는 것을 용이하게 할 수 있다. 일 실시형태에서, 전위 컴포넌트는 부티리쿰 독소, 테타니 독소, 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F, G 또는 이의 변형의 중쇄의 아미노 말단 단편을 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또다른 일 실시형태에서, 신경독은 보툴리눔 독소 타입 A, B, E 및/또는 F이다. 바람직한 실시형태에서, 손상 근육 처치에 사용되는 신경독은 보툴리눔 독소 타입 A이다. 실제로, 상업적 입수가능성, 공지의 임상 용법, 및 본 명세서에 개시한 바와 같은, 본 발명에 따른 근육 손상을 처치하는 데 대한 성공적인 응용 때문에, 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하는 것이 바람직하다. 약 0.1 U/kg 내지 약 30 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 A 및 약 1 U/kg 내지 약 150 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 B를 사용하는 것이 개시된 본 발명에 따라 실시되는 방법의 범주에 속한다. 다른 보툴리눔 독소 세포타입(독소 타입 E 및 F를 포함)에 대해서는, 상기한 바와 같이, 사용되는 U/kg 투여량이 약 0.1 U/kg 내지 약 150 U/kg의 범위 이내이다.

또한, 본 발명에 따르면, 신경독은 재조합적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 상세한 실시형태는 in vivo에서 치료 유효량의 보툴리눔 독소를 손상된 근육에 국소 투여하여 (손상된 근육의 치료를 촉진함으로써) 손상된 근육을 처치하는, 손상 근육 처치방법이다. 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A일 수 있다. 특히, 본 발명은 또한 in vivo에서 치료 유효량의 보툴리눔 독소를 손상된 근육에 국소 투여하여, 손상된 근육과 관련된 통통을 감소시키는, 손상 근육 관련된 동통의 처치방법을 포함한다.

본 명세서에 개시된 특성, 및 이러한 특성 2가지 이상의 조합은, 이러한 조합에 포함된 특성이 서로 모순되지 않는 경우라면, 각각 및 모두 본 발명의 범주에 포함된다.

정의

하기의 정의들을 제공하며, 이들은 본 명세서에서 적용된다.

"약"은 대략 또는 거의를 의미하며, 본 명세서에 설명된 수치 또는 범위에 있어서는, 기술한 또는 청구한 수치 또는 범위의 ±10%를 의미한다.

"중쇄"는 클로스트리디움계 신경독의 무거운 사슬을 의미한다. 중쇄의 분자량은 약 100kDa이 바람직하고, 중쇄 또는 H로 칭할 수 있다.

"H_N"은 (분자량이 약 50kDa인 것이 바람직하다) 클로스트리디움계 신경독의 중쇄로부터 유래하고, 중쇄의 아미노 말단 단편과 거의 동등한 단편 또는 변형되지 않은 중쇄의 그 단편에 상응하는 부분을 의미한다. 세포내 엔도솜 막을 가로지르는 L 사슬의 전위(translocation)를 포함하는, 천연 또는 와일드형 클로스트리디움계 신경독 부분을 포함하는 것으로 여겨진다.

"Hc"는 (약 50kDa) 클로스트리디움계 신경독의 중쇄로부터 유래하고, 중쇄의 카르복실 말단 단편과 거의 동등한 단편, 또는 변형되지 않은 중쇄의 그 단편에 상응하는 부분을 의미한다. 면역성이 있으며, 높은 친화도로 운동 뉴런과 시냅스전 결합하는 천연 또는 와일드형 클로스트리디움계 신경독 부분을 포함하는 것으로 여겨진다.

"손상된 근육"은 좌상을 입거나, 찢어지거나, 무리하게 사용된 근육을 포함하며, 또한 타박상(멍), 열상, 국소빈혈이 있거나 파열된 근육을 포함한다.

"경쇄"는 클로스트리디움계 신경독의 가벼운 사슬을 의미한다. 경쇄의 분자량은 약 50kDa이 바람직하고, L 사슬, L 또는 클로스트리디움계 신경독의 단백분해성 도메인(아미노산 서열)으로 칭할 수 있다. 신경전달물질이 표적 세포의 세포질로 방출될 때, 경쇄는 신경전달물질 방출의 저해제로서 효과가 있는 것으로 여겨진다.

"국소 투여(local administration)"는 약물의 생물학적 효과를 필요로하는 부위에, 또는 그 부근에, 또는 동물 체내에 약물을 직접 투여하는 것을 의미한다. 국소 투여는 정맥투여 또는 경구투여와 같은 전신적 경로의 투여는 배제한다.

"신경독"은 뉴런의 기능을 적어도 하나 방해하거나 조절할 수 있는 화학물질을 의미한다. "신경독"은 자연발생적이거나 인공적으로 제조할 수 있다. 또한, "신경독"은 작은 분자, 큰 분자, 폴리펩티드, 컨쥬게이티드-폴리펩티드 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

"변형체"는 부모 화학물질과는 약간 상이하지만, 여전히 생물학적 효과를 나 타내는 화학물질이다. 변형체의 생물학적 효과는 부모의 효과와 동일하거나 더 향상될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산이 치환, 변경, 삭제 또는 추가된 보툴리눔 독소의 변형 경쇄는 신경전달물질 소포의 방출을 억제하는 능력이 동일하거나 향상될 수 있다. 또한, 변형체의 생물학적 효과는 감소될 수도 있다. 예를 들어, 류신계 모체가 제거된 보툴리눔 독소 타입 A의 변형 경쇄는 부모(또는 천연) 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄보다 생물학적 존속성이 더 짧을 수 있다.

상세한 설명

광범위한 실시형태에서, 본 발명에 따라 손상된 근육을 처치하는 효과적인 방법은 치료 유효량의 신경독을 손상된 근육에 국소 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 손상된 근육은 좌상을 입은 근육이다.

골격근의 좌상은 창상(shearing injury)으로서 분류될 수 있다. 창상에는, 근섬유뿐아니라 마이시알 시스(mysial sheath)도 찢어진다. 거의 근육 손상 직후에, 근육 회복 프로세스가 시작된다. 창상의 회복 프로세스는 3가지 단계로 나눌 수 있다.

제 1 단계는 파괴 단계로, 혈종의 형성, 근섬유 괴사 및 염증 세포 반응을 특징으로 한다. 좌상후 다른 건강한 근육의 파열이 종종 이의 말단 근힘줄 접합부(MTJ) 가까이에 발생한다. 파열된 근섬유는 수축하고, 절단부 사이에 틈이 벌어진다. 골격근은 혈관이 풍부하게 형성되기 때문에, 찢어진 혈관으로부터 출혈이 불가피하므로, 이 틈이 혈종으로 채워지고, 나중에는 흉터 조직으로 대체된다. 창상에서는, 기계적 힘이 전체 근섬유를 찢고, 근섬유 원형질 막을 손상시키며, 근 형질이 절단부 말단에서 개방된 채로 있게 된다. 근섬유는 매우 긴, 끈모양 세포이기 때문에, 이러한 부위에서 개시된 괴사는 파열된 근섬유의 전체 길이를 따라서 확장된다. 창상에서는 또한 혈관이 찢어지므로; 혈액을 품은 염증 세포가 손상 부위에 즉각적으로 발생하여 염증을 유발한다. 제 1 단계는 손상 후에 약 2 내지 3일동안 지속된다.

제 2 단계는 회복 단계로, 괴사된 조직에 대한 식세포 작용, 근섬유의 재생, 연접 조직 흉터의 생성, 및 모세혈관의 내향 성장(ingrowth)으로 이루어진다. 손상된 근육 조직의 재생 단계에 있어서 중요한 것은 손상된 영역의 혈관형성이다. 손상된 근육의 재생을 위해서는 혈관을 통한 공급이 복구되어야 한다. 혈관의 살아남은 간선(trunck)으로부터 새로운 모세혈관이 싹터서, 손상된 영역의 중심을 향하여 뚫고 들어간다. 이러한 새로운 모세혈관은 재생 영역에 충분한 산소를 제공하는데 도움이 된다.

제 3 단계는 리모델링 단계로, 재생된 근섬유의 성숙, 흉터 조직의 수축 및 재조직, 및 회복된 근육의 기능적 능력의 복구로 이루어진다. 제 2 (회복)단계 및 제 3 (리모델링) 단계는 종종 동시에 진행되며, 제 1 단계에 이어서 약 2일 내지 약 6주 동안 계속된다.

본 발명의 일 실시형태에서, 신경독은 국소, 바람직하게는 근육내 투여되어, 손상 근육을 고정하므로, 치료를 용이하게 해준다. 본 발명에 따른 신경독의 국소 투여는 또한 근육 손상으로 인해 나타나는 동통을 감소시킬 수 있다. 신경독은 손상 즉시, 또는 직후에 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 일 실시형태에서, 신 경독은 파괴 단계동안 (제 1 단계)손상 근육을 고정하여 근육이 재파열되는 것을 방지하는 데 효과적이다.

본 발명을 특정 이론의 작용 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 회복 및/또는 리모델링 단계 동안에는 고정하지 않는 것이, 손상된 영역의 더욱 빠르고 집중적인 혈관 내향 성장뿐아니라 근섬유 재생 및 배향에도 좋다는 점에서 유익할 것으로 여겨진다. 그러므로, 일 실시형태에서, 신경독의 고정 효과는 회복 단계(제2단계) 및/또는 리모델링 단계(제3단계)에서는 나타나지 않는다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 신경독은 제 1 단계동안 손상 근육을 고정하는 데 효과적이지만, 회복 프로세스의 제 2 단계 및 제 3 단계동안에는 효과를 나타내지 않도록 투여한다. 예를 들어, 손상 직후 근육에, 바람직하게, 근육내로 신경독을 주사하면, 신경독이 손상 근육을 투여후 약 3일동안 고정하는 것이 바람직하다. 이와 달리, 간단히 움직여서 손상 근육을 사용할 때 동통이 거의 없거나 전혀 없는 부위까지만 신경독의 고정 효과가 나타나게 할 수 있다. 환자가 이러한 임계 부위를 뻗을 수 있게 되면, 환자를 격려하여 활동적이고, 점진적으로 움직이기 시작하도록 해야한다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 신경독은 제1~3단계 동안 내내 그리고 그후에 이어지는 근육 손상 회복 단계동안 손상 근육을 고정하는데 효과적이다.

약 1일 이하 내지 약 7일동안 심각한 임상 근육 마비 효과를 나타내는데 필요한(여기서, 근육 마비 효과는 손상후 몇 개월동안 지속된다) 보툴리눔 독소와 같은 신경독이 본 발명의 범주에 속하며, 이러한 신경독은 비교적 심각하거나 또는 오래 지속되는 근육 손상을 처치하는 데 사용될 수 있다(여기서, 장기간의 근육 고정은 적절한 치료를 나타낸다).

광범위한 실시형태에서, 신경독은 신경근 차단제이다. 표 1은 신경근 차단제 및 이들의 작용 가능한 부위에 대한 리스트를 나타낸다(그러나, 이에 제한되는 것은 아니다). 일 실시형태에서는, 근육, 바람직하게는 손상 근육을 적어도 약 5일동안, 바람직하게는 적어도 약 3일 동안 고정할 수 있는 신경근 차단제를 손상 근육을 처치하는데 투여한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 보툴리눔 독소 타입 E와 같은 보툴리눔 신경독을 근육 경직과 같은 근육 질환을 처치하는데 대한 임상적 안정성과 사용방법이 공지되어 있기 때문에, 신경독으로는 보툴리눔 신경독을 사용한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 심한, 또는 3도 근육 손상에 대해서, 국소 투여하는 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 E이다. 보툴리눔 독소 타입 A를 또한 이러한 실시형태들에서 사용할 수 있다.

화합물	NMJ와 관련된 작용부위	약제학적 분류
아세틸콜린 에스테라아제 유도인자 아코니틴 아데노레굴린 (개구리 필로메데우사 비칼라에서 유래) 아데노신 작용물질 아데노신 길항제 아데노신 조절제 아드레날린제 아나톡신-A 항간질제	시냅스 시냅스전 시냅스전 시냅스 전 및 후 시냅스 전 및 후 시냅스 전 및 후 시냅스전 시냅스후 CNS	ACh 에스테아라제 유도인자 나트륨 채널 활성화제 아데노신 수용체 조절인자 아데노신 아데노신 아데노신 알파 아드레날린제 Ach 작용물질 항간질제

안티센스 항불안제 아타쿠리움 아트라쿠리움 베실레이트 (Tracurium) 바크로펜 (Lioresal.RTM., Intrathecal, Medtronic Neurological; generic, Athena, Biocrage, Watner Chilcott) 박테리아, 식물 및 균류 생성물 바트라코톡신 벤질피페리딘류 식물성 신경독 붕가로톡신-β (β-BuTX) 부피바카인 카프토프릴 (Captopen .RTM., Squibb; Capzide .RTM., (Squibb) 콜린+아세틸 트렌스페라아제 억제제 콜린에스테라아제 억제제 시구아톡신류 코노톡신 MI (알파 코노톡신)

시냅스 전 및 후 CNS 시냅스후 시냅스후 시냅스전 시냅스전 시냅스 간극 전 및 후 시냅스 및 시냅스 간극 시냅스전 시냅스 전 및 후 시냅스전 시냅스전 시냅스 간극 시냅스전 시냅스후

특이적인 단백질 또는 신경전달 방출에 중요한 메세지, 수용체 생성을 위한 안티센스 기술 항불안제 항간질제 AchR 길항제 비탈분극 근육 이완제 AchR 길항제 비탈분극 근육 이완제 GABA 유사물질 나트륨 채널 활성화제 Ach 에스테라아제 억제제 (비전통적) 다양 PLA2 및 전압 민감성 칼륨 채널 차단제 붕가루스 멀티싱크투스로부터 유래한 뱀 독 국소 마취제 미오톡신 항고혈압제 ACE 억제제 아연 엔도펩티다아제 억제제 CAT 억제제 Ach 에스테라아제 억제제 나트륨 채널 AChR 길항제

코노톡신-.mu. GIIIA (mu-CT) 코노톡신-.OMEGA. GVIA (omega-CT) 큐라레 댄크롤렌 소디움 (Dantrium, P&G) 다우리신 데카메토니움 브로마이드 덴드로톡신 디아미노피리딘 (3-DAP) 디아제팜 독사쿠리움 클로라이드 (Nuromax .RTM., Burroughs Wellcome) 독소루비신 (Adriamyocin, Adria; Rubex, Immunex; Cetus Onoclogy) 에피바티딘 디하이드로클로라이드 휄바메이트 (Felvatol, Carter- CNS Wallace lic to Schering-Plough) 호록시미틴 가바펜틴 (Neurontin, Parke- Davis) 갈라민 그레이안톡신 헥사하이드로아제피닐 아세트아미드류 및 다른 화학 분류 후페르진 A 곤충 독 이온 채널 차단제 이온 채널 자극제

시냅스후 시냅스후 시냅스후 시냅스전 시냅스 전 및 후 시냅스전 CNS 시냅스후 시냅스후 시냅스후 시냅스전 시냅스전 시냅스전 CNS 시냅스후 시냅스전 시냅스전 시냅스 간극 시냅스 전 및 후 시냅스 전 및 후

Na+ 채널 차단제 Ca2+ 채널 차단제 뉴트론에서만 AChR 길항제 비탈분극 골격근 이완제 AChR 길항제 신경절 차단제 칼륨 채널 차단제 보툴리눔 독소 중독 복귀 항불안제 AChR 길항제 탈분극 근육 이완제 미오톡신 화학적 근부분절제술 AChR 작용물질 항간질제 안지오텐신 I 전환 효소 억제제 항간질제 GABA 유사물질 AChR 길항제 나트륨 채널 활성화제 Ach 방출제 ACh 에스테라아제 억제제 채널 차단제 채널 자극제

라트로톡신-α 리도카인, 프로카인, 메피바카인, 등 리노피르딘 (Dup 996, Dupont Merck) 로포톡신 및 유사물질 해양 천연 생성물 메토카르바몰 (Rabaxin, Robins Co.) 메틸리카코니틴 미바쿠리움 클로라이드 (Mivacro .RTM., BW- BW1090U, Burroughs Wellcome) 변형된 클로스트리디움계 독소류 단클론성 NMJ 컴포넌트에 대한 항체 무스카린성 작용물질 및 길항제 네오삭시톡신 네오수루가톡신 신경근 차단제 파충류, 곤충, 및 다른 소스로부터의 신경독 판쿠로니움 브로마이드 (organon) 판쿠로니움-3-OH 대사산물 (organon)

시냅스전 시냅스전 시냅스전 시냅스후 시냅스후 시냅스전 시냅스 전 및 후 시냅스전 시냅스후 시냅스 전 및 후 및 시냅스 간극 시냅스후 시냅스후

칼슘 이온운반체 블랙 위도우 거미 독 컴포넌트 국소마취제 ACh 방출 강화제 AChR 길항제 비가역적 CNS 억압, 근육 이완제 AChR 길항제 비탈분극 근육 이완제 ACh 방출 억제제 수용체, 아그린, 신경전달물질, 원형질막 구성성분, 효소 비활성화 등. 무스카린성제 CNS 작용물질 길항제 나트륨 채널 차단제 자율신경계 신경절 AChR 차단제 (NMJ에서는 효과없음) AchR 길항제 AChR 분극화 다양 AChR 길항제 비탈분극 근육 이완제 AChR 길항제 비탈분극 근육 이완제

팝베린 HCl (30mg/ml) 피소스티그민 및 유사물질 피페르쿠로니움 (Arduan, Organon) 시냅스전 신경 말단 수용체 단기 신경독 알파 β-붕가로톡신 (β-BuTX) 숙시닐콜린 클로라이드 (Anectine, Burroughs Wellcome) 테타니 독소 테나니 독소 운반체 테트라하이드로아미노- 아크리딘(THA) 테트로도톡신 티아가빈 (Novo Nordisk) 트랜스글루타미나아제 억제제 또는 유도 방지 발리움 베쿠로니움 (Norcuron, Organon) 베쿠로니움-3-OH 대사산물 (organon) 베라트리딘 비가바트린 (Sabril, Marion Merrell Dow) 베사미콜 및 동일 메카니즘의 다른 약물 아연 엔도펩티다아제 및 보툴리눔 독소 또는 테타니 독소 운반체에서 유래하는 다른 프로테아제

시냅스 간극 시냅스후 시냅스전 시냅스후 시냅스전 시냅스후 시냅스전 시냅스전 시냅스 간극 시냅스 전 및 후 CNS 시냅스 전 및 후 시냅스후 시냅스후 시냅스전 시냅스전 CNS 시냅스전 시냅스전

평활근 이완제 ACh 에스테라아제 억제제 AChR 길항제 비탈분극 근육 이완제 신경말단의 뉴런외 또는 뉴런간 수용체 AChR 길항제 붕가루스 멀티싱크투스로부터 유래한 뱀 독 AChR 수용체 작용물질 탈분극 골격근 이완제 EAA 방출 억제제 Ach 에스테라아제 억제제 나트륨 채널 차단제 항간질제 GABA 흡수 억제제 효소 디아제팜 CNS 항불안제 AChR 길항제 비탈분극 근육 이완제 AChR 길항제 비탈분극 근육 이완제 나트륨 채널 활성화제 항간질제 GABA 대사 억제제 (비가역적) ACh 소포 수송 억제제 효소 신경전달물질 방출 감소

광범위한 실시형태에서, 신경독은 표적 컴포넌트, 치료 컴포넌트 및 전위 컴포넌트를 포함하여 이루어질 수 있다. 표적 컴포넌트는 시냅스전 운동 뉴런에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 컴포넌트는 부티리쿰 독소, 테타니 독소, 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F, G 또는 이의 변형의 중쇄의 카르복실 말단 단편을 포함하여 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 표적 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 A의 카르복실 말단 단편을 포함할 수 있다.

치료 컴포넌트는 세포로부터의 신경전달물질 방출 또는 그 프로세스를 방해하거나 조절할 수 있다. 일 실시형태에서, 치료 컴포넌트는 부티리쿰 독소, 테타니 독소, 또는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F, G 또는 이의 변형의 경쇄를 포함하여 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 치료 컴포넌트는 생물학적 존속성이, 예를 들어, 약 5일 이하, 바람직하게는 약 3ㅇ리 이하로 짧은 보툴리눔 독소 타입의 경쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 E 또는 F의 경쇄일 수 있다. 이와 달이, 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A의 경쇄일 수 있다.

전위 컴포넌트는 신경독의 적어도 일부, 예를 들어, 치료 컴포넌트가 표적 세포의 세포질로 이동하는 것을 용이하게 할 수 있다. 일 실시형태에서, 전위 컴포넌트는 부티리쿰 독소, 테타니 독소, 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F, G 또는 이의 변형의 중쇄의 아미노 말단 단편을 포함하여 이루어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 전위 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 A의 중쇄의 아미노 말단 단 편을 포함한다.

일 실시형태에서, 표적 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 E 또는 F의 중쇄의 카르복실 말단 단편을 포함하며, 치료 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 E 또는 F의 경쇄를 포함하고, 전위 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 E 또는 F의 중쇄의 아미노 말단 단편을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 신경독은 보툴리눔 독소 타입 E를 포함한다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 신경독은 보툴리눔 독소 타입 F를 포함한다. 역시 또다른 실시형태에서, 신경독은 보툴리눔 독소 타입 E 및 F의 혼합물을 포함한다.

일 실시형태에서, 표적 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 A의 중쇄의 카르복실 말단 단편을 포함하며, 치료 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 A의 경쇄를 포함하고, 전위 컴포넌트는 보툴리눔 독소 타입 A의 중쇄의 아미노 말단 단편을 한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 신경독은 보툴리눔 독소 타입 A를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 보툴리눔 독소 타입 A는 BOTOX^®(캘리포니아, 이르빈 소재, 알러간사제)이다.

본 발명의 신경독은 손상 근육을 고정하여 처치하지만, 일 실시형태에서는, 신경을 또한 동통 및/또는 경련을 감소시키기 위해서 손상 근육에 투여할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 신경독은 손상 근육을 고정하면서, 손상 근육과 관련된 동통을 감소시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 신경독, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 E, 가장 바람직하게는 타입 A를 좌상을 입은 근육에 투여하여 근육을 고정하 고, 및/또는 이 근육과 관련된 동통을 감소시킨다.

물론, 통상의 숙련된 의료제공자는 최적의 임상 결과를 얻기 위한 적당한 투여량 및 투여횟수를 결정할 수 있다. 즉, 의료분야의 통상의 숙련자는 적당량의 신경근 차단제를 적당한 횟수 투여하여 손상 근육(들)을 효과적으로 고정할 수 있을 것이다. 신경독의 투여량은 근육의 크기, 근육 손상의 경중을 포함하는 다양한 인자들에 따라 다르다. 바람직한 실시형태에서, 신경독의 투여량은 회복 프로세스의 제 1 단계의 지속기간보다 길지 않은 기간동안 손상 근육을 고정하는 정도이다. 본 발명에 따른 다양한 방법에서, 약 0.1 U/kg 내지 약 15 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 A가 손상 근육에 투여될 수 있다. 바람직하게, 약 1 U/kg 내지 약 20 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 A가 손상 근육에 투여될 수 있다. 약 0.1 U/kg 내지 약 30 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 A 및 약 약 1 U/kg 내지 약 150 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 B를 사용하는 것이 상술한 본 발명에 따라 실시하는 방법의 범주에 속한다. 다른 보툴리눔 세로타입들(독소 타입 E 및 F를 포함하는)에 대해서는, 사용되는 U/kg 투여량이 상술한 바와 같이 약 0.1 U/kg 내지 약 150 U/kg의 범위 이내이다.

근육내 주사가 바람직한 투여경로이긴 하지만, 피하투여와 같은 다른 경로의 국소 투여도 가능한다.

또다른 광범위한 실시형태에서, 본 발명에 따라 손상 근육을 처치하는 방법은 또한 하기에 설명한 다른 단계들을 포함한다. 이러한 다른 단계들은 신경독을 바람직하게는 손상 근육에 투여하는 단계 전에, 그와 함께, 또는 그 후에 이루질 수 있다. 예를 들어, 현재 좌상을 입은 근육에 대해 추천되는 처치는 휴식, 얼음 찜질, 압박 및 거상(elevating)을 포함한다. 이러한 4가지 단계(또는 방법)은 동일한 목적으로 행하여진다. 이들은 파열된 혈관으로부터 파열 부위로 출혈되는 것을 최소화한다. 이는 재생의 마직막 단계에서 흉터조직의 크기에 직접적인 영향을 주는 거대한 혈종이 형성되는 것을 방지할 것이다. 파열 조직에서 혈종이 작고, 간질성 부종의 증대가 제한되면 또한 육아 조직의 국소빈혈 기간이 줄어들어, 재생을 가속화한다.

다른 부가적인 단계들이 손상 근육을 처치하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서는, 부가적인 단계로서 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs) 투여, 치료 초음파, 고압 산소를 포함하며, 심각한 손상의 경우, 외과적 수술이 또한 사용될 수 있다. NSAIDs는 초기 치료의 일부로서, 손상 직후에 투여하기 시작하여야 한다. 치료의 초기 단계에서 NSAIDs를 단기간 사용하면, 염증 세포 반응이 감소되며, 손상 근육의 인장 또는 수축 성질에 대한 역작용은 없다.

또다른 실시형태에서는, 부가적인 단계로서 치료 초음파가 사용된다. 치료 초음파는 광범위하게 추천되며, 근육 좌상의 치료에 사용된다. 치료 초음파가 근재생(myogeneration)의 증식 단계를 촉진하는 것으로 여겨지다.

또다른 실시형태에서는, 부가적인 단계로서 고압 산소를 사용한다. 래빗에 있어서, 회복의 초기 단계동안의 고압 산소 요법이 최종 결과를 실질적으로 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 고압 산소 요법이 다른 포유류, 예를 들어, 사람에서도 근육 재생을 촉진하는 등 도움이 될 것으로 여겨진다.

또 다른 실시형태에서는, 부가적인 단계로서 외과적 개입이 이루어진다. 대 부분의 경우에는 보존 치료로도 좋은 결과를 얻을 수 있기 때문에, 근육 손상의 외과적 처치는 가장 심각한 손상에만 사용하는 것으로 제한된다. 외과적 처치는 다음과 같은 경우에만 실시한다. (1) 거대한 근육내 혈종, (2) 아고나이즈(agonise) 근육이 거의 또는 전혀 없는 3도 좌상 또는 근육의 찢김, (3) 2도 좌상, 근팽대부의 절반 이상이 찢어진 경우.

본 발명의 또다른 광범위한 실시형태에서는, 적어도 하나의 신경독 컴포넌트를 제공하는데 있어서 재조합 기술이 사용된다. 이러한 기술은 천연 소스로부터 클론된 DNA 또는 합성 올리고뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터, 예를 들어, 치료, 전위 및/또는 표적 컴포넌트(들) 중의 하나에 대한 코드를 가지는 유전 물질을 얻는 단계를 포함하여 이루어진다. 파아지나 플라스미드와 같은 클로닝 벡터와 유전 구조체를 일차 융합시켜 증폭하기 위해서, 유전 구조체를 숙주 세포에 넣는다. 그리고 나서, 클로닝 벡터를 숙주 세포, 바람직하게는 E. Coli에 삽입한다. 숙주 세포에서 재조합 유전자가 발현한 후에, 결과로서 얻어진 단백질을 통상의 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 발현된 단백질은 신경독의 세가지 컴포넌트를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현된 단백질은 보툴리눔 독소 타입 E의 경쇄(치료 컴포넌트), 보툴리눔 독소 타입 B의 중쇄, 바람직하게는 H_N(전위 컴포넌트), 및 운동 뉴런에 선택적으로 결합하는 보툴리눔 독소 타입 A의 Hc를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 발현된 단백질은 신경독의 세가지 컴포넌트를 모두 포함하지는 않을 수 있다. 이러한 경우, 당해 기술분야의 공지된 기술을 사용하여 컴포넌트들 을 화학적으로 결합할 수 있다.

신경독을 이렇게 재조합적으로 제조하면 많은 이점이 있다. 예를 들어, 혐기성 클로스트리디움 배양물로부터 신경독을 제조하는 것은 몇번의 단백질 침전 단계 및 길고 반복되는 독소의 결정화 또는 몇 단계의 컬럼 크로마토그래피를 수반하는 다단계의 정제작업을 포함하는 귀찮고 시간이 많이 걸리는 공정이다. 특히, 생성물은 독성이 높기 때문에, 공정은 엄격한 봉쇄 상태 하에서 실시되어야만 한다(BL-3). 발효 공정 동안, 접혀진 단일사슬 신경독은 닉킹(nicking)이라는 공정을 통하여 내재성 클로스트리디움계 프로테아제에 의해서 활성화된다. 이 닉킹 공정은 약 10개의 아미노산 잔기를 단일사슬로부터 제거하여, 사슬간의 디설파이드 결합을 통해 두개의 사슬이 공유결합되는 이중사슬 형태를 형성하는 것을 포함한다.

닉을 낸 신경독(nicked neurotoxin)은 닉을 내지 않은 형태에 비해서 훨씬 더 활성이 있다. 닉킹하는 양 및 정확한 위치는 독소를 생성하는 박테리아의 세로타입에 따라 다르다. 단일사슬 신경독 활성화, 즉, 닉을 낸 독소의 수득율이 다른 이유는, 소정 균주(strain)의해 제공되는 세로타입 및 단백분해 활성의 양이 다르기 때문이다. 예를 들어, 클로스트리디움 보톨리눔 세로타입 A 단일사슬 신경독은 99% 이상이 홀 A(Hall A) 클로스트리디움 보톨리눔 균주에 의해서 활성화되며, 반면에 세로타입 B 및 E 균주는 활성화 정도가 낮은 독소를 생성한다(발효시간에 따라 0 내지 75%). 그러므로, 신경독을 치료제로서 상업적으로 제조함에 있어서는, 독성이 높은 성숙된 신경독이 주요한 역할을 한다.

따라서, 가공된 클로스트리디움 독소의 활성화 정도는, 이러한 물질의 제조에서 중요한 고려사항이다. 보툴리눔 독소 및 테타니 독소와 같은 신경독을, 재조합으로, 급속성장 박테리아(이형 E. 콜라이 세포 등)에서, 안전하고 분리가 쉬우며 완전한 활성형으로 전환하기 쉬운 비교적 무독성인 단일사슬(또는 독소 활성이 감소된 단일사슬)로서, 고수율로 발현시킬 수 있다면 큰 이점이 있을 것이다.

안전성을 최우선으로 고려하면서, 앞선 작업은 E. 콜라이에서의 발현 및 테타니 및 보툴리눔 독소의 중쇄 및 경쇄 각각의 정제에 중점을 둔다; 이러한 분리된 사슬은 그 자체로는 무독성이다. 문헌[Li 등, Biochemistry 33:7014-7020(1994); Zhou 등, Biochemistry 34:15175-15181(1995)]이 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 이렇게 펩티드 사슬을 개별적으로 제조한 다음, 엄격하게 통제된 조건 하에서 중쇄 및 경쇄 서브유닛을 산화력이 있는 디설파이드 결합으로 연결하여 신경마비성 이중사슬을 형성할 수 있다.

하기의 제한되지 않은 실시예는 손상 근육을 처치하는 바람직한 방법 및 재조합 신경독, 바람직하게 보툴리눔 독소를 제조하는 바람직한 방법을 제공한다. 하기 실시예 4-8에 설명한 재조합 보툴리눔 독소의 제조방법은 Dolly 등의 국제특허 출원 WO 95/32738에 개시된 것과 유사하며, 이는 본 명세서에서 참조로 병합되어 있다.

실시예 1

파열된 이두근건의 처치

상완 이두근의 파열은 흔히 근위 종단에서 발생하며, 이두근의 장두를 포함한다. 이 근육은 요골 상의 원위 종지부에서 파열될 수도 있으나, 흔하지 않다. 충돌 증후군에 수반되는 장기간의 어깨 동통 병력이 있는 40세 이상의 어른에서 파열이 발생하는 것이 가장 흔하다. 시간이 지날수록, 건이 닳고 약해져서, 결국에는 부분적으로 또는 전체적으로 파열된다. 이와 달리, 파열은 종종 사소한 사건에 의해서 야기된다. 이러한 파열은 보통 특히, 중장년층에서, 회선건판이 찢어지는 것과 관련된다.

무거운 상자를 들어 올린 후에 하완이 부풀어 오른 45세 남자 환자가 있다. 이 환자는 상완에서 삐걱대는 소리와 함께 갑작스런 날카로운 통증을 경험한 적이 있다고 한다. 이 남자는 이두근 건이 파열된 것으로 진단되었고, 회복 프로세스의 제 1 단계 초기이었다. 이러한 파열은 가벼운 2도 좌상으로 분류할 수 있다.

약 0.1 U/Kg 내지 약 25 U/Kg의 신경독을 이두근에 근육내로 농축괴 주사하여 환자를 처치한다. 바람직하게, 신경독은 보툴리눔 독소 타입 E 및/또는 F이고, 더욱 바람직하게는 타입 A이다. 특정한 투여량 및 투여 빈도는 다양한 인자에 따라 달라지며, 주치의에 의해서 결정될 수 있다. 환자에게는 또한 이두근의 휴식 및 얼음찜질 및 압박을 지시하였다. 신경독을 투여하고 3일 이내에, 환자가 팔을 구부릴 수 있다. 또한, 약 3일 후에, 환자의 염증이 감소되며, 이는 환자가 회복 프로세스의 제 2 단계 및 제 3단계로 진입하였음을 의미한다. 환자의 동통이 또한 상당히 감소된다. 또한, 약 10 유닛 내지 약 200 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A를 국소 투여하여 장기간(2-4 개월)의 근육 고정 및 동통 감소에 사용할 수 있다.

실시예 2

신근 기구 파열

무릎 신근 기구의 파열은 두가지 중의 하나로 발생한다: 젊은 환자에서는 갑작스런 또는 강렬한 힘(뛰어오르기, 또는 무거운 것 들어올리기와 같은)의 결과로서; 그리고, 나이든 환자에서는 비교적 사소한 힘의 결과로서 발생한다. 각각의 그룹에서, 그 전에 약간의 아칭(arching)이 있었을 수 있다. 이러한 질환은, 전형적으로 얼마간 앉아있었가다, 갑자기 활동 수준을 높인 나이든 환자나, 또는 당뇨병, 류마티스성 관절염, 및 다른 전신성 염증성 질환, 또는 이전의 무릎 수술과 같은, 선재하거나 공재하는 몇가지 질환이 있었던 환자에서 나타난다.

무릎을 뻗지 못하는 축구선수인 22세 여자가 있다. 이 환자는 또한 똑바로 다리 올리기(straight leg raise)를 하지 못하고, 넓적다리에 손을 짚고서 무릎을 뻗은 채로만 걸을 수 있다. 단순 X선 촬영 결과, 슬개골이 보통의 위치보다 아래쪽에 있는 것으로 나타났다. 환자는 심각한 사두근 파열로 진단되었다.

손상이 심각한 것(3도)으로 판단된 후에, 환자는 회복 수술에 동의하였다. 수술 후에, 약 0.1 U/Kg 내지 약 25 U/Kg의 신경독(약 10 유닛 내지 약 400 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A)을 근육내로 사두근에 농축괴 주사하여 환자를 처치한다. 바람직하게, 신경독은 보툴리눔 독소 타입 A이다. 특정한 투여량 및 투여 빈도는 다양한 인자에 따라 달라지며, 주치의에 의해서 결정될 수 있다. 환자에게는 또한 사두근의 휴식 및 얼음찜질 및 압박을 지시한다. 신경독 투여후 약 15일 이내에, 점진적인 운동 및 손상 근육의 활동이 가능해졌다. 그리고 나서, 환자에게는 회복 중인 근육을 가볍게 움직여 회복중인 근육 및 주변 근육을 튼튼하게 하도록 하였다. 독소의 효과가 좀더 사라지면, 이때는 환자가 신속히 물리 치료 프로그램에 참여하거나, 일상 활동 및/또는 스포츠를 다시 시작할 수 있을 것이다. 이 환자의 생계가 스포츠에 달려 있는 경우, 보툴리눔 독소 요법은 환자가 이러한 활동에 빠르게 복귀하는데 도움이 될 것이다. 약 10 유닛 내지 약 200 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A를 국소 투여하여 장기간(2-4 개월)의 근육 고정에 사용할 수 있다.

실시예 3

정강이 통증(shin splints)의 처치

달리는 사람들에게는 동통을 일으키며, 활동을 제한하는 하지에서의 정강이 통증이 흔히 나타난다. 정강이 통증으로 인한 아래쪽 다리의 동통은 정각이에 부착된 지점에서 다리 근육이 매우 작게 찢어져서 야기된다. 두가지 형태가 있는데, 1. 전측 정강이 통증은 정강이뼈(경골)의 앞쪽 부분에서 발생하며, 2. 후측 정강이 통증은 경골을 따라 다리의 안쪽(중간) 부분에서 발생한다.

전측 정강이 통증은 근육의 불균형, 불충분한 충격흡수 또는 발가락 뛰기로 인한 것이다. 과도한 회내운동(pronation)이 전측 및 후측 정강이 통증 모두에서 원인이 될 수 있다.

정강이 통증과 같은, 좌상을 입은 근육을 처치할 때, 다음 다섯 단계가 추천된다: (1) 부목, 패드 및/또는 크러치를 사용하여 더이상의 손상이 발생하지 않도록 손상 근육을 보호한다; (2) 보통 48시간 내지 72시간동안 활동을 제한하여 치료 프로세스가 시작되도록 한다. 단기간 작용하는 보툴리눔 독소 타입 E 또는 F 또는 in vivo에서의 생물학적 활성 기간이 감소(즉, 단기간의 이완 근육 마비)되도록 변형된 보툴리눔 독소 타입 A를 투여한다. 여기에 사용하기 위해서 in vivo에서의 생물학적 활성 기간이 감소된 보툴리눔 독소 타입 A를 포함하는 적합한 보툴리눔 독소로가, 함께 계류중인 미합중국 특허 출원 09/620840호에 개시되어 있으며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 더욱 심각한 좌상에서는 몇주 내지 몇개월동안 계속해서 활동을 제한할 수 있다. 장기간 활동을 제한할 필요가 있는 경우, 장기간 작용하는 보투리눔 독소, 예를 들어, (변형되지 않은) 보툴리눔 독소 타입 B, 또는 더욱 바람직하게, 타입 A 독소를 투여하는 것이 적합할 수 있다. 이러한 처치를 하지 않고, 환자에게 몇주간 활동을 제한하도록 할 수 있다. 치유 프로세스가 시작되면, 해당 근육을 가볍게 움직이고 운동할 것을 조언한다.; (3) 매시간 15-20분간 얼음찜질을 해야한다; (4) 얼음찜질 사이에는 탄력 붕대 등으로 계속해서 압박하고 있어야 한다; (5) 부풀어오르는 것을 최소화 하기 위해서 손상 부위를 높게 한다.

실시예 4

BoNT/A-L 사슬 유전자의 서브클로닝

본 실시예는 BoNT/A-L 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 클론하는 방법을 설명한다. BoNT/A-L 사슬을 암호화하는 DNA 서열은 5'-AAAGGCCTTTTGTTAATAAACAA-3'(SEQ ID#1) 및 5'-GGAATTCTTACTTATTGTATCCTTTA-3'(SEQ ID#2)서열을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 프로토콜에 의해서 증폭될 수 있다. 이러한 프리머를 사용하여 Stu I 및 EcoR I 제한부위를 각각 BoNT/A-L 사슬 유전자 단편의 5' 및 3' 말단으로 도입할 수 있다. 이러한 제한 부위는 증폭된 생성물의 단일방향성 서브클로닝을 용이하게 하는데 이어서 사용될 수 있다. 또한, 이러한 프리머는 L 사슬 코딩 서열의 C-말단에 종료 코돈을 도입한다. C. 보툴리눔(균주 63 A)으로부터 유래한 염색체 DNA가 증폭 반응에서 템플릿으로서 제공될 수 있다.

PCR 증폭은 10mM Tris-Hcl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 50pmol의 각 프리머, 200ng의 지놈 DNA 및 2.5 유닛의 Taq-폴리머라아제(Promega)를 함유하는 100㎕ 부피에서 실시할 수 있다. 반응 혼합물을 35 사이클동안 변성(94℃에서 1분), 어닐링(37℃에서 2분) 및 중합반응(72℃에서 2분)시킨다. 마지막으로, 72℃에서 추가로 5분 동안 반응을 연장한다.

PCR 증폭 생성물은 Stu I 및 EcoR I를 사용하여 소화시켜, 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고, 예를 들어, Sma I 및 EcoR I 소화된 pBluescript II SK*에 연결(ligate)하여, 플라스미드, pSAL을 얻는다. 이러한 플라스미드가 들어있는 박테리아성 형질전환체(transformant)를 표준 방법으로 분리한다. 클로닝된 L 사슬 폴리뉴클레오티드는, 제조회사의 지시에 따라 SEQUENASE(미국, 바이오케미칼스사제)를 사용한 더블 스트레인드 플라스미드 서열화에 의해서 확인할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드 서열화 프리머는 오버랩핑 서열화를 진행하는데 필요한 대로 제조한다. 클로닝된 서열은 Binz 등, in J. Biol. Chem. 265,9153 (1990) 및 Thompson 등, in Eur. J. Biochem. 189,73 (1990)에 개시된 서열과 동일한 것으로 밝혀졌다.

BoNT/A-L 사슬의 효소 활성을 떨어뜨리도록 디자인된 부위-규제된 돌연변이를 또한 생성할 수 있다.

실시예 5

보툴리눔 독소 타입 A-L(BoNt/A-L)사슬 융합 단백질의 발현

본 실시예에서는 pCA-L 플라스미드가 들어있는 박테리아 내에서, 치료 컴포넌트로서 제공될 수 있는, 와일드형 L 사슬의 발현을 입증하는 방법을 설명한다. pCAL이 들어있는 잘 분리된 박테리아성 콜로니를 사용하여, 100㎍/ml 암피실린 및 2%(w/v) 글루코오스를 함유하는 L-브로스에 접종하고, 30℃에서 흔들면서 밤새 배양한다. 밤새 배양한 배양물을 1:10으로 0.1mg/ml 암피실린을 함유하는 새로운 L-브로스에 희석하고, 2시간 동안 배양한다. 밤새 배양한 배양물을 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 신선한 L-브로스에 1:10으로 희석하고, 2시간동안 배양한다. 최종 농도가 0.1mM가 되도록 IPTG를 첨가하여 융합 단백질 발현을 유도한다. 30℃에서 추가로 4시간 더 배양한 다음, 6,000 x g로 10분간 원심분리하여 박테리아를 수집한다.

소규모 SDS-PAGE 분석을 실시하여, IPTG-유도된 박테리아로부터 유래하는 샘플에서 90 kDa 단백질 띠의 존재를 확인할 수 있다. 이러한 Mr는 MBP(~40 kDa) 및BoNT/A-L사슬(~50 kDa) 컴포넌트를 가지는 융합 단백질의 예상 크기와 일치한다. 또한, 대조구 배양물로부터 분리된 샘플과 비교할 때, IPTG-유도된 클론이 실질적 으로 더 많은 양의 융합 단백질을 함유한다.

IPTG-유도된 박테리아 추출물에서, 원하는 융합 단백질의 존재는 또한 Cenci di Bello et al., in Eur. J. Biochem. 2191:61 (1993)에 개시된 다클론성 항-L 사슬 프로브를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해서 확인될 수 있다. PVDF 막(Pharmacia ; Milton Keynes, UK)의 반응성 띠는 양고추냉이 퍼옥시다아제(BioRad ; Hemel Hempstead, UK)에 컨쥬게이트된 항-래빗 면역글로불린 및 ECL 삭제 시스템(Amersham, UK)을 사용하여 가시화할 수 있다. 웨스턴 블럿 결과는 완전한 크기의 융합 단백질보다 낮은 Mr의 단백질에 상응하는 몇개의 가짜 띠와 함께 우세한 융합 단백질의 존재를 확인시켜준다. 이러한 관찰결과는 박테리아에서 또는 분리 과정동안 융합 단백질의 제한적인 분해가 일어난다는 것을 제안한다. 분리 과정동안 1mM 또는 10mM의 벤즈아미딘(시그마사제, 풀리, 영국)을 사용하여도, 이러한 단백가수분해가 제거되지 않는다.

상기 공정에 의해서 얻어진 분해되지 않은 융합 단백질 수득물은 여기에 설명한 방법에 사용하기에 충분한 정도로 남는다. 염새된 SDS-PAGE 겔로 측정한 것에 기초하여, IPTG로 유도된 박테리아 클론은 배양물 1 리터당 5-10 mg의 전체 MBP-와일드형 또는 돌연변이 L 사슬 융합 단백질을 수득하였다. 그러므로, 제한된 단백가수분해가 일어났음에도 불구하고, 여기에 설명하는 BoNT/A-L 사슬 융합 단백질을 제조하는 방법은 매우 효과적이다.

pCAL 및 pCAL-TyrU7 발현 플라스미드에 의해 암호화된 MBP-L 사슬 융합 단백질을 아밀로오스 친화 크로마토그래피를 사용하여 박테리아로부터 정제한다. 그리 고 나서, 재조합 와일드형 또는 돌연변이 L 사슬을 인자 X₂를 사용한 부위-특이적 절단에 의해서 융합단백질의 당 결합 도메인으로부터 분리한다. 이러한 절단 방법으로 유리 MBP, 유리 L 사슬 및 소량의 절단되지 않은 융합 단백질을 얻는다. 이러한 혼합물에 존재하는, 얻어진 L 사슬은 원하는 활성을 가지는 것으로 보이지만, 추가적인 정제 단계를 또한 사용할 수 있다. 따라서, 절단 생성물의 혼합물을 MBP 및 절단되지 않은 융합 단백질 모두와 결합하는 두번째 아밀로오스 친화 컬럼에 적용한다. 유리 L 사슬은 친화 컬럼에 남아있지 않으며, 하기의 실험에 사용하기 위하여 분리한다.

실시예 6

융합 단백질의 정제 및 재조합 BoNT/A-L사슬의 분리

본 실시예에서는 박테리아성 클론으로부터 와일드형 재조합 BoNT/A 경쇄를 제조 및 정제하는 방법을 설명한다. 와일드형 BoNT/A-L 사슬 단백질을 발현하는 박테리아 배양물 1 리터로부터의 펠렛을, 1mM의 페닐메탄술포닐 플로라이드(PMSF) 및 10mM 벤즈아미딘을 함유하는 컬럼 완충용액[10mM Tris-HCl(pH 8.0), 200mM NaCl, 1mM EGTA 및 1mM DTT] 중에 재현탁하고, 초음파로 용해한다. 용해물을 4℃ 15,000 x g에서 15분간 원심분리하여 맑게 한다. 상청액을 아밀로오스 친화 컬럼[2x10cm, 30ml 수지]에 적용한다(New England BioLabs; Hitchin, UK). 280nm에서 안정한 흡광도 기록으로 판단하여 용리액에 단백질이 없어질 때까지, 컬럼 완충용액을 사용하여 결합되지 않은 단백질을 수지로부터 씻어내다. 이어서, 결합된 MBP-L 사슬 융합 단백질은 10mM 말토오스를 함유하는 컬럼 완충용액으로 용리시킨다. 융합 단백질을 함유하는 분액을 합하고, 150mM NaCl, 2mM CaCl₂ 및 1mM DTT로 보충된 20mM Tris-HCl(pH 8.0)에 대하여 4℃에서 72시간동안 투석하였다.

150mM NaCl, 2mM CaCl₂ 및 1mM DTT로 보충된 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 대하여 투석하면서, 융합 단백질을 효소:기질 비 1:100으로 인자 X₂(Promega, Southampton, UK)로 절단한다. 4℃에서 24시간동안 투석한다. 절단 단계로부터 얻은, MBP 및 와일드형 또는 돌연변이 L 사슬의 혼합물을 컬럼 완충용액으로 평형을 유지한 10ml 아밀로오스 컬럼에 넣는다. L 사슬을 함유하는 샘플을 확인하는 SDS-PAGE 분석을 위해서 분획을 통과한 유출액의 분취량을 준비한다. 분획을 통과한 유출액의 나머지 부분은 -20℃에서 보관한다. 전체 E.coli 추출물 또는 정제된 단백질을 SDS 샘플 완충용액 중에 고체화하고, 표준 방법에 따라 PAGE시킨다. 이러한 방법의 결과, 재조합 독소 단편이 샘플 중에 대략 90%의 단백질 함량을 차지하는 것으로 나타났다.

앞선 결과는 여기서 설명하는 MBP-L 사슬 융합 단백질을 제조하는 접근방법이 와일드형 및 돌연변이 재조합 BoNT/A-L 사슬을 제조하는데 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 이 결과는 재조합 L 사슬을 융합 단백질의 말토오스 결합 도메인으로부터 분리한 후, 정제할 수 있다는 것을 입증해 준다.

민감한 항체-계 검정을 실시하여, 재조합 L 사슬 생성물의 효소 활성을 천연 대조구와 비교하였다. 이 검정은 BoNT/A 절단 부위에 상응하는, SNAP25의 변형되 지 않은 C-말단 영역에 대해 특이성을 가지는 항체를 사용하였다. SNAP25의 BoNT/A 절단에 대한 반응 생성물을 웨스턴 블럿한 결과, 항체가 SNAP25 서브-단편에 결합할 수 없는 것으로 나타났다. 즉, 하기 실시예에서 사용되는 항체 재신경독은 변형되지 않은 SNAP-25만 인지하였다. 항체 결합이 없어졌다는 것은 추가된 BoNT/A 경쇄 또는 이의 재조합 유도체에 의해 매개되는 SNAP-25 단백가수분해가 일어났다는 것을 나타낸다.

실시예 7

SNAP-25에 대한 재조합 L 사슬의 단백가수분해 활성 평가

본 실시예는 천연 및 재조합 BoNT/A-L 사슬이 모두 SNAP-25 기질을 단백가수분해할 수 있다는 것을 입증하는 방법을 설명한다. 정량 검정을 사용하여, 와일드형 및 이의 재조합 유사체가 SNAP-25 기질을 절단하는 능력을 비교한다. 이 검정에 사용된 기질은, pGEX-2T 벡터를 사용하여 발현시키고, 글루타티온 아가로오스에서 친화 크로마토그래피로 정제된, 트롬빈에대한 절단 부위를 포함하는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)-SNAP-25 융합 단백질을 제조하여 얻는다. 그리고 나서, 150mM NaCl, 2mM CaCl₂을 함유하는 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 중에서 트롬빈을 사용하여 효소: 기질비 1:100으로 SNAP-25를 융합 단백질로부터 분리한다(Smith 등, Gene 67:31(1988)). 분리되지 않은 융합 단백질 및 분리된 글루타티온-결합 도메인은 겔에 결합한다. 재조합 SNAP-25 단백질은 나중의 완충용액과 함께 용리되며, 이를 100mM HEPES (pH 7.5)에 대하여 4℃에서 24시간동안 투석한다. 전체 단백질 농도는 통상의 방법으로 결정한다.

아미노산 서열, CANQRATKMLGSG (SEQ ID#3)를 가지는 합성 펩티드에 대하여 SNAP-25의 C-말단 영역에 특이적인 래빗 다클론성 항체를 생성시켰다. 이 펩티드는 시냅스 원형질막 단백질의 잔기 195 및 206에 상응하며, N-말단 시스테인 잔기는 천연 SNAP-25에서는 발견되지 않았다. 합성 펩티드는 항원성을 향상시키기 위하여 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)(시그마사제, 풀리, 영국)를 교차-연결 신경독으로서 사용하여 소혈청 알부민(BSA)(시그마사제, 풀리, 영국)에 컨쥬게이트시킨다(Liu 등, Biochemistry 18:690 (1979) 1). 교차-링커 에틸 3-(3-디메틸프로필)카르보디이미드를 사용하여 요오드아세트산으로 활성화된, 아미노알킬 아가로오스 수지(Bio-Rad사제, 헤멜 헴프스테드, 영국)에 N-말단 시스테인 잔기를 통하여 컨쥬게이트된 항원성 펩티드를 포함하는 컬럼을 사용하여 항-펩티드 항체의 친화 정제를 실시한다. 컬럼을 25mM Tris-HCl(pH 7.4) 및 150 mM NaCl로 연속해서 씻어낸 다음, 100mM 글리신(pH 2.5) 및 200mM NaCl 용액을 사용하여 펩티드 특이적인 항체를 용리시키고, 0.2ml의 1M Tris-HCl(pH 8.0) 중화 완충용액을 함유하는 시험관에 수집한다.

효소 활성을 결정하기 전에, 와일드형 L 사슬을 함유하는 모든 재조합 시료를 4℃에서 0.02% 루브롤 및 10μM 아연 아세테이트를 함유하는 100mM HEPES(pH 7.5) 중에 밤새 투석한다. 그리고 나서, 미리 20mM DTT를 사용하여 37℃에서 30분간 환원된 BoNT/A, 및 상기 투석 샘플을 1mM DTT로 보충된 나중의 HEPES 완충용액 중에 상이한 농도로 희석한다.

반응 혼합물은 5㎕ 재조합 SNAP-25 기질(최종 농도 8.5μM) 및 20㎕ 환원 BoNT/A 또는 재조합 와일드형 L 사슬을 포함한다. 모든 샘플을 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 25㎕ 2% 트리플루오로아세트산(TFA) 수용액 및 5mM EDTA를 사용하여 반응을 퀀칭한다(Foran 등, Biochemistry 33:15365(1994)). SDS-PAGE 샘플 완충용액을 가하고, 끓여서, SDS-PAGE 및 다클론성 SNAP-25 항체를 사용한웨스턴 블럿를 위한 각 샘플의 분취량을 준비한다. ECL 감지 시스템을 사용하여 항-SNAP-25 항체 반응성을 모니터링하고, 밀도측정 스캐닝으로 정량한다.

웨스턴 블럿 결과, 정제된 돌연변이 L 사슬과, 천연 또는 재조합 와일드형 BoNT/A-L 사슬의 단백가수분해 활성 사이에는 분명한 차이가 있었다. 특히, 재조합 와일드형 L 사슬은, 본 방법의 양성 대조구로서 제공되는 환원된 BoNT/A 천연 L 사슬에 비해서 효력이 다소 떨어지기는 하지만, SNAP-25 기질을 절단한다. 즉, 효소적 활성 형태의 BoNT/A-L 사슬이 재조합 방법에 의해서 제공되며, 실질적으로 분리된다. 더욱이, L 사슬 단백질 중에서 단 하나의 아미노산을 치환하면, 재조합 단백질이 시냅스 말단 단백질을 분해할 수 없게 된다.

와일드형 재조합 BoNT/A-L 사슬의 생물학적 활성에 대한 예비 실험으로서, MBP-L 사슬 융합 단백질이 디지토닌-투과성 소 부신크롬친화성 세포로부터 Ca²⁺-유발 카테콜아민의 방출을 감소시키는 능력을 시험하였다. 일관되게, 변형되지 않은 또는 유리 MBP 및 재조합 L 사슬을 함유하는 혼합물을 제조하기 위해 인자 X₂로 절단된 와일드형 재조합 L 사슬 융합 단백질은, 천연 BoNT/A에 의해 야기되는 억제와 동등한, Ca²⁺-자극 방출의 투여량-의존적 억제를 유도하였다.

실시예 8

정제된 H 사슬과 천연 L 사슬, 재조합 와일드형 L 사슬을 재구성

2M 요소를 사용하여 천연 H 및 L 사슬을 BoNT/A(List Biological Inc.사제, 캠벨, 미국)로부터 분리하고, 100mM DTT로 환원시킨 후, 확인된 크로마토그래피 방법으로 정제한다(Kozaki 등., Japan J. Med. Sci. Biol. 34:61 (1981)); Maisey 등., Eur. J. Biochem. 177:683 (1988)). 정제된 H 사슬은 동일한 몰량의 천연 L 사슬 또는 재조합 와일드형 L 사슬과 결합된다. 샘플을 25mM Tris(pH 8.0), 50μM 아연 아세테이트 및 150mM NaCl로 구성된 완충용액에 대하여 4℃에서 4일간 투석하여 재구성을 실시할 수 있다. 투석 후에, 재조합 L 사슬와 천연 H 사슬이 결합하여 디설파이드 연결된 150kDa 이중사슬을 형성하였는지 SDS-PAGE로 모니터링하고, 밀도측정 스캐닝하여 정량한다. 재조합 L 사슬의 경우 형성된 이중사슬 분자의 비율은 천연 L 사슬이 사용되는 경우 얻어지는 것보다 더 낮다. 실제로, 천연 L 사슬은 90% 이상이 H 사슬과 재구성되는 반면에, 재조합 와일드형 또는 돌연변이 L 사슬은 약 30%만이 재결합된다. 재구성 효율이 이렇게 낮음에도 불구하고, 이어지는 기능 연구에 사용하기에 충분한 재조합 L 사슬을 포함하는 물질이 쉽게 제조된다.

본 발명을 다양한 특정 실시예 및 실시형태를 들어 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 청구범위의 범주 내에서 다양하게 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내에서 다른 실시형태, 변형, 및 수정이 가능하다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 방법에 따라 손상 근육을 처치하기 위해서 약 500 유닛 내지 약 400 유닛의 보툴리눔 독소 타입 B를 사용할 수 있다.

Claims

타박상, 열상, 국소빈혈, 좌상(strain) 및 완전 파열을 포함하는 손상 근육에서 2 내지 4개월간 근육 고정을 나타내는 보툴리눔 독소를 포함하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 근육내 주사가 가능한 것임을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 상기 손상 근육의 회복 프로세스의 제 1 단계인 파괴단계 및 제 2 단계인 회복단계 동안 상기 손상 근육을 고정하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 상기 손상 근육의 회복 프로세스의 제 1 단계인 파괴단계 동안 상기 손상 근육을 고정하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A, B, C 1 , D, E, F 또는 G인 것을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소임을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 물리 치료, 외과 수술 또는 물리 치료와 외과수술의 조합의 전 또는 후에 투여가능한 것임을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
in vivo 국소 투여 가능한 제형의 보툴리눔 독소를 포함하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
제 9 항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A임을 특징으로 하는 손상 근육 치료용 약학 조성물.
타박상, 열상, 국소빈혈, 좌상(strain) 및 완전 파열을 포함하는 손상 근육의 치유를 촉진하는 in vivo 국소 투여 가능한 제형의 보툴리눔 독소 타입 A를 포함하는 손상 근육 치유 촉진용 약학 조성물.
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