TWI292713B - Pharmaceutical compositions for treating muscle injuries - Google Patents

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TWI292713B
TWI292713B TW090122250A TW90122250A TWI292713B TW I292713 B TWI292713 B TW I292713B TW 090122250 A TW090122250 A TW 090122250A TW 90122250 A TW90122250 A TW 90122250A TW I292713 B TWI292713 B TW I292713B
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Roger Aoki Kei
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1292713 * A7 B7 五、發明説明（1 發明背景 本發明係關於治療肌肉傷害之方法，特定言之，本發明 係關於局邵施用神經毒素於受傷害之肌肉，以治療肌肉傷 害之方法。 肌肉傷害包括骨骼肌之急性傷害，如挫傷、裂傷、局部 缺血、使用過度及完全破裂。這些傷害可能會引起劇烈疼 痛’使患者無法工作或甚至影響正常生活之活動。在這些 急性骨骼肌傷害中，使用過度（亦被認爲拉傷引起之傷害） 最爲普遍。舉例言之，使用過度接近佔所有職業或職業運 動選手傷害治療的30%，Garrett等人，Am J Sports Med，24 (6) : S2-S8，1996 〇 肌肉使用過度傷害特徵在於肌肉-肌腱單位的斷裂。此 種肌肉-肌腱單位的斷裂可能發生於肌肉的任何地方。此 型傷害最常發生在靠近肌肉肌腱接合點（my〇tendin〇us junction，MTJ)，其係作用於兩關節間表的皮肌肉，如直股 肌（femoris)、半腱肌（semitendinousus)及比目魚肌 (gastroenemius) ° 肌肉傷害可能肇因於反常之運動或不尋常之使用肌肉， 舉例言之，不尋常使用少許活動運動肌單位以產生較高之 力量。在此情況中，過度延伸肌肉單位在拉長時會經歷過 度緊張。此過度緊張可引起肌肉收縮單位微小的傷害，其 集中發生在Z-線的隨意斷裂。當肌肉受到傷害時，患者可 能會經歷肌肉疼痛之遲滯發作，其特徵在於疼痛、虛弱及 運動範圍之限制。此疼痛最常在肌肉受傷害後劇烈約一至 -4-
1292713 ' A7 _______B7 五、明説明（2 ) " ^--~| 二日’接著虛弱及限制運動範圍可持續一周或更久。若輕 微之骨骼肌使用過度未被適當治療，則可能產生更嚴重^ 傷害。 肌肉使用過度根據其傷害之劇烈程度及血腫性質可分三 種形式：⑴輕微的（第一級）過度使用，少、許肌肉纖維^ ，輕微腫大及不舒適感，伴隨無或只有極少力量之減少及 運動卩良制’（2)中度的（第二級）過度使用，肌肉纖維較大之 傷害及明顯力量之損失，及；（3)劇烈的（第三級）過度使用 ，斷裂延伸跨越至整個肌肉腫脹，引起肌肉功能完全喪失 〇 .當肌肉使用過度時，肌肉内血管之斷裂常可引起大量之 血腫。有二種不同形式之血腫會發生於受傷害之肌肉：肌 肉内及肌肉間血腫。第一種形式，肌肉内血腫，因接觸了 肌肉筋膜，而有其尺寸上之限制。於此，血液外滲增加了 肌肉内的壓力，壓迫及限制其血腫之尺寸。此型的血腫會 引起疼痛及肌肉功能之喪失。第二種形式，肌肉間血腫， 發展於當肌肉肋膜破裂及血液外滲散佈到肌肉間空間，但 肌肉内壓力則無明顯增加時。此型的血腫當肌肉中的壓力 不增加時，也許不引起明顯地疼痛。 治療使用過度傷害時，固定受傷害的肌肉是必要的，特 別是在受傷的第二或三天内，受傷害的肌肉在受傷後立即 地移動’常會引起在原受傷害部位再次破裂。再次破裂可 月匕會引起更嚴重的傷害、延緩痊癒及組織瘢。jarvinen等人 ，Curr Opin Rheumatol，v〇l 12:155-161 (2000) 〇 _— ____ -5- 本紙張尺度適用中關家標準(CN〖）Μ規格(⑽項公爱) 1292713 A7 B7 五、發明説明（3 ) 受損傷部位的再次破裂可因受傷肌肉的固定而避免，較 佳係在受傷後立即固定。固定作用可使新生成的淋巴組織 到達足夠伸長的長度，以抵抗因收縮肌肉所產生的力量。 已知的固定受傷害/使用過度肌肉的方法，需要使用物理 性的束縛或模具。舉例言之，頸圈可用於固定受傷害的頸 屈肌或伸肌。然而使用此束缚通常是笨重且不舒適的。此 外，桌些肌肉傷害群，要使用物理性束縛是無法實行或是 不可能的。舉例言之，要使用束縛固定上斜方肌（trapezius) 或臀大肌（gluteus maximus)是非常困難的。 肉毒桿菌毒素 厭氧性、格蘭氏陽性細菌肉毒桿菌（Cl〇strid}um botulinum)製造一種有效的多肽神經毒素，肉毒桿菌毒素 (botulinum toxin)，可在人類及動物中引起神經麻痺，而稱 爲肉毒桿菌病。肉毒桿菌的孢子可在土壤中發現，並且可 在不適當滅菌及家用罐頭封裝食物容器中生長，其引起許 多案例的肉毒桿菌病。肉毒桿菌的影響，典型會在食用被 肉毒桿菌群落或孢子所感染的食物1 8至3 6小時後顯現。此 肉毒桿菌毒素可明顯不減弱地通過腸襯裡，而攻擊周圍運 動神經。肉毒桿菌毒素之麻醉症狀病程可由行走、呑喘、 言語困難，及因呼吸肌肉困難而死亡。 肉毒桿菌 A型毒素（botulinum toxin type a， 是對人類已知最致死之自然生物性神經毒素。在小氣中内 毒桿菌Α型血清型毒素（純化自神經毒素複合物）之ld〗約 50兆分之一克。一單位（U)的肉毒桿菌毒素係定義爲腹^内
1292713 A7 B7 五、發明説明（4 ) 注射至每18-20克之母Swiss Webster小鼠中的LD5G。有七種 免疫特異性的肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C i、D、E 、F、G之特徵已被描述，每一種都可被血清型特異的抗體 中和而辨識。不同血清型的肉毒桿菌毒素在其攻擊的不同 動物種間，其嚴重程度及引起的麻痺.時間亦不同。舉例言 之，B oNt/A已被認定在大鼠中量測其麻醉有效率是肉毒桿 菌B型毒素（BoNT/B)的5〇0倍。此外，BoNt/B已被認定在靈 長類中劑量爲480 U/kg時尚爲非毒素，此約爲B〇Nt/A LD50 的12倍。肉毒桿菌毒素明顯和膽驗激素性（cholinergic)運動 神經結合具高親合力，可移位至神經而阻斷乙醯膽鹼的釋 放。 肉毒桿菌毒素已被臨床使用於治療特徵爲骨骼肌過動之 神經肌肉疾病。BoNt/A已被美國食物與藥品管理准許用於 治療臉痙攣、斜視及半臉痙攣。非A血清型之肉毒桿菌毒 素血清型明顯具較低功效，及/或與B〇Nt/A相比活性期較短 。肉毒桿菌毒素，如BoNt/A對肌肉内的臨床功效可被紀綠 持續數小時。因此，大多數，若非全部，的肉毒桿菌毒素 經肌肉内注射，在注射的一天内可產生顯著的肌肉麻痺， 如由小鼠數位謗拐紀錄（Digit Abduction Score，（DAS))所 量測得的現象是重要被注意的。Aoki K. R.，Preclinical
Update on BOTOX (Botulinum Toxin Type A)-Purified Neurotoxin Complex Relative to Other Botulinum Toxin Preparations, Eur J_ Neur 1999, 6 (suppl 4) : S3-S10。典型自肌肉内單一 注射BoNt/A症狀緩解的時程平均約3個月。肉毒桿菌毒素， 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（5 ) 包含肉毒桿菌A型毒素，在活體内生物活性具減少之週期 者正申請專利中，其專利案號爲09/620840，此申請案併於 此，作爲參考。 雖然所有血清型的肉毒桿菌毒素都明顯抑制神經傳導物 質乙醯膽鹼於神經肌肉接合點的釋放，但它們藉著影響不 同之神經分泌蛋白質及/或在不同部位切裂這些蛋白質。舉 例言之，肉毒桿菌A及E型毒素切裂25千道耳呑（kD)突觸相 關蛋白(25 kiloDalton synaptosomal associated protein， (SNAP-25))，但它們的對此蛋白質的目標乃爲不同的胺基 酸序歹|J。BoNT/B、D、F及G作用於胞囊相關蛋白（vesicle associated protein，VAMP，亦稱爲辛納普托布凡（synaptobrevin) ，而每種血清型都於不同位置切列此蛋白。最後，肉毒桿 菌C!型毒素（BoNT/C〗）已被證實可同時切裂辛泰素 (syntaxin)及SNAP-25。這些活性機制上的不同，可能會影 響其相關之效力及/或不同肉毒桿菌毒素血清型的活性時 程。 無論何種血清型，麻醉毒素的分子機制顯示爲相似的， 且與至少三個步驟或階段相關。在方法的第一個步驟中， 毒素經由Η鏈與細胞表面接受子的特異性交互作用，高親 合力地結合至目標神經的前突觸（presynaptic)膜：此接受子 被認爲對不同血清型的肉毒桿菌毒素或破傷風毒素爲不同 的。此Η鏈的羧端段，He，顯示出毒素對鎖定細胞表面目 標是重要的。 在第二個步驟中，毒素跨越中毒細胞的細胞膜。毒素首 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1292713 A7 B7 五、發明説明（6 先經由接受子調節的細胞内攝作用而自細胞吸入，及形成 一包含毒素的内胞囊（encl〇sorne)。此毒素接著自内胞囊逸 出至細胞質。最後一個步驟被認爲由Η鏈的胺基端段，hn ’所調節，其觸發毒素因應pH約5.5或更低時，構形上的改 變。内胞囊已知可控制質子幫浦，其會降低内胞囊内的pH 値。此構形上的轉換在毒素中可暴露出水性殘基，而允許 毒素嵌入在内胞囊膜裡，然後毒素再從内胞囊膜位移至細 胞内膜。 肉毒桿菌毒素活性機構的最後步驟，顯示出其與L鏈裂解 關鍵性細胞内外泌作用之蛋白質相關。整體肉毒桿菌與破 傷風毒素的活性包含於全毒素（h〇i〇toxin)的l鏈裡：此L鏈 疋一鋅（Zn++)内胜肽酶（end〇peptidase)，此胜肽酶係選擇性 切裂和辨識及停靠包含神經傳導之胞囊與細胞膜的細胞質 表面必要蛋白質，並使此胞囊與細胞膜融合。破傷風神經 母素、肉毒桿菌毒素B、D、F及Θ可引起一種突觸膜 (synaptosomal membrane)蛋白質，辛納普托布凡（亦稱爲胞 囊相關蛋白，VAMP)的分解。大部分呈現在突觸胞囊的細 胞質表面VAMP會被這些切裂事件中的任何一個所移除。 每一個毒素可特異性切裂不同鍵結。 所有已知的七種肉毒桿菌毒素血清型而言，肉毒桿菌毒 素蛋白質的分子量約爲1 50 kD。有趣的是肉毒桿菌毒素是 以包含1 50 kD肉毒桿菌毒素與非毒性蛋白質所成的複合物 形式，而自肉毒桿菌中釋放。因此，BoNt/Α複合物可被肉 毒桿菌以900 kD、500 kD與300 kD形式製造。]6〇1^17：6與(：：1 家㈣(CNS) A4規格(21Gx29^釐)----—-- 1292713 . A7 「 --____ B7 五、發明説明（7 ) 顯示出只以500 kD複合物形式製造。BoNT/D則可以300 kD 與500 kD複合物形式製造。最後，B〇NT/]^F只接近以3〇〇 kD 複合物形式製造。此複合物（亦即分子量大於15〇 kD)據信 爲包含非毒性血球凝集素（hemaglutinin)蛋白質及非毒性非 血球凝集素（11〇111^11^§1111:丨11丨11)蛋白質。此兩種非毒性蛋白質 (與包含肉毒桿菌毒素分子相關的神經毒素複合物一起）可 提供穩定性並抵抗肉毒桿菌毒素分子的變性作用，及當毒 素被攝取時，保護其抵抗消化性酸。此外，較大的（大於 150 kD分子量）肉毒桿菌毒素複合物，可能引起肉毒桿菌毒 素自肌肉内注射肉毒桿菌毒素複合物時，較慢速率的擴散 〇 在體外的研究已指出，肉毒桿菌毒素可在腦幹組織的初 級細胞培養中’抑制由鉀陽離子謗導之釋放乙醯膽鹼及正 腎上腺素。此外’肉毒桿菌毒素可在脊髓神經細胞初級細 胞培養中’抑制唤起釋放甘胺酸及麩胺酸之作用，已被報 導’以及在腦突觸中，製備之肉毒桿菌毒素皆抑制神經傳 導物質乙醯膽鹼、多巴胺、正腎上腺素，CGRP及麩胺酸的 釋放。
BoNt/A可由在醱酵器中建立及培養肉毒桿菌，再依已知 程序收穫及純化醱酵混合物而獲得。所有的肉毒桿菌毒素 血清型首先以無活性單一鏈蛋白質合成，其必須被蛋白酶 切裂或切刻成神經活性。製造肉毒桿菌A及g型毒素的細菌 株擁有内生性蛋白酶，血清型A及g因此可自細胞培養中主 要地獲得其活性型式。相反的，肉毒桿菌c !、〇及E型毒素 —_____ _- 10 - 本紙張尺度適用中國國冢標準(CNS) A4規格(210X297公釐Γ---—-' 1292713 A7 B7 五、發明説明（8 由非蛋白分解（n〇npr〇te〇lytic)株所合成，故當其從培養中 獲得時典型爲非活性。血清型B及F皆可由蛋白分解及非蛋 白分解株所製造，因此其可以活性或非活性型式而獲得。 然而’即使由蛋白分解株所製造，舉例言之，BoNt/B血清 型只切裂毒素產物的一部份。精確的切刻比未切刻分子比 例依罪著培養長度及溫度。因此，舉例言之，任何製備 BoNt/β毒素的某些比例可能爲非活性，擔負了已知 和BoNt/A相比爲顯著較低效力的責任。臨床製備中，非活 性肉毒桿菌毒素分子的存在，貢獻了製備中蛋白質總量， 其已被連結以增加抗體反應，但不幫助其臨床效能。此外 ’經肌肉内注射，在相同劑量層次B〇Nt/B已知比BoNt/A活 性具較短時程及效力較小。
BoNt/A已被報導用於以下的臨床配置： (1) 每肌肉（複數肌）内注射約75-125單位的BOTOX®1以 治療斜頸症（cervical dystonia)(l :自 Allergan，Inc， of Irvine，California之下的商標名 BOTOX®獲得）； (2) 每肌肉内注射5-10單位的BOTOX®以治療眉間紋 (glabellar lines)(額皺紋）[肌肉内注射入鼻眉肌 (procerus muscle) 5單位，及肌肉内注射入皺眉肌 (corrugator supercilii muscle) 10單位]; (3) 括約肌内（intrasphincter)注射入耳心骨直腸肌 (puborectalis muscle)約 30_80單位的 BOTOX® 以治療 便秘； , (4) 靠於上眼險側駙骨眼輪匝肌（lateral pre-tarsal -11- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（9 orbicularis oculi)及下眼驗的側甜骨眼輪匝肌的每條 肌肉中肌肉内注射約1-5單位的BOTOX®以治療眼痙 攣症（blepharospasm); (5) 於眼外肌（extraocular muscle)中肌肉内注射介於約 1 -5單位的BOTOX®以治療斜視（strabismus)，此注射 量的變化決定於被注射肌肉的尺寸及欲被麻醉的肌 肉大小（亦即欲屈光校正量） (6) 爲治療上肢痙攣產生的中風（Spasticity following stroke)而肌肉内注射BOTOX®入五條不同上肢屈肌：
(a) 屈指深肌（flexor digitorum profundus) : 7.5 U至 30 U
(b) 屈指淺肌（flexor digitorum sublimes): 7·5 U至 30 U
(c) 尺側曲腕肌（flexor carpi ulnaris): 10U至 40 U
(d) 橈側曲腕肌（flex0I· carpi radialis) : 1 5 U至 60 U (e) 肱二頭肌（biceps brachii) : 50 U至 200 U。 指出的五條肌肉在相同療程中皆已被注射，故病人在每 個療程裡，上肢屈肌接受了 90 U至360U肌肉内注射的 BOTOX® 〇
BoNt/A治療多種臨床狀態的成功，引起了對其它肉毒桿 菌毒素血清型的興趣。對兩種商業上可獲得的b〇nt/a製備 (BOTOX⑧及DySport⑧）及BoNT/B與f製備（皆可自Wak〇 Chemicals ’曰本獲得）的研究已完成了測定前臨床 (prechnical)局邵肌肉衰弱之效力、安全性及抗體力。注射 肉毒桿菌毒素製備入右腓腸肌頭部（head 〇f the Hght -12-
1292713 A7 B7 五、發明説明（10 ) gastrocnemius muscle)(0.5 至 200.0 units/kg)，且使用小鼠數 位謗拐紀錄分析（mouse digit abduction scoring assay, DAS)肌肉衰弱。自劑量反應曲線計算ED5G値。給予外加的 小氣肌肉内注射以測定LD50値。計算LD50/ED50値作爲治療 索引。分群小鼠的後肢分別接受BOTOX®的注射（5.0至 10.0 units/kg)或 BoNt/B (50.0 至 400.0 units/kg)，再測定其 肌肉衰弱及水消耗之增加，後者作爲假定乾口模型。依每 月肌肉内注射入兔子内（BoNt/Β爲2.0或8·7 Units/kg及 BOTOX⑧爲3.0 Units/kg)估計其抗體力。全部血清型的肌肉 衰弱尖峰値及時程爲劑量相關性。DAS的ED5G値（units/kg) 如下：BOTOX® : 6.7，Dysport® : 24.7，BoNt/B : 11.8至 244.0，BoNT/F : 4.3 〇 ΒΟΊΌΧ® 比 BoNt/B 或 BoNt/F 具有較 長之活性期。在小鼠中，即使BoNt/B在肌肉衰弱上效力較 低，注射BoNt/B比BOTOX®具較大的水消耗度。在四個月 的注射中，4隻中有2隻（當處理1.5 ng/kg)及4隻中有4隻（當 處理6.5 ng/kg)兔子產生抗BoNt/B的抗體。在分開的研究中 ，9隻中有0隻以BOTOX®處理的兔子顯示出抗BoNt/A的抗 體。DAS的結果指出BoNt/A之相對尖峰效力與BoNt/F相當 ，且BoNt/F大於BoNt/B。考慮效力的時程，BoNt/A大於 BoNt/B，且BoNt/B效力的時程大於BoNt/F。如治療索引値 所示，此兩種BoNt/A商業製備（BOTOX®與Dysport®)是不同 的。在後肢注射BoNt/B觀察到水消耗行爲的增加，指出了 此種血清型進入小鼠系統循環的臨床顯著値。本結果亦指 出了爲達與BoNt/A相同效力，必須增加被測試的其他血清 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1292713 A7
型的劑量。增加的劑量包含安全性。更進一步，在兔子中 ，血清型B比BOTOX®更具抗體性，可能因爲欲達有效劑量 而注射了較高的BoNt/B蛋白量。 破傷風神經毒素主要作用在中央神經系統，而肉毒桿菌 母素作用在神經肌肉接合點··兩者都靠抑制乙醯膽鹼自被 影響神經的軸突釋放至突觸，而引起麻醉。被影響神經的 麻醉效力是長效的，且直到最近才被認爲是不可回復的。 破傷風神經毒素已知存在一種免疫獨特血清型。 乙醯膽鹼 哺乳動物神經系統典型上，每種神經只釋放單一種型式 的小分子神經傳導物質。此神經傳導物質乙醯膽鹼由腦中 許多區域的神經所分泌，但特別是由運動皮質的大錐狀細 胞’由基底核的許多不同神經，由支配骨骼肌的運動神經 ’由自律神經系統（交感與副交感皆有）的結前 (preganglionic)神經，由副交感神經系統的結後 (Postganglionic)神經，及由一些交感神經系統的結後神經 所分泌。本質上，只有毛髮豎立肌（pil〇erect〇r muscle)汗腺 的結後交感神經纖維，及一些血管是膽鹼性，且大多數交 感神經的結後神經乃釋放神經傳導物質正腎上腺素。在絕 大多數的例子中，乙醯膽鹼具興奮效力。然而，乙醯膽鹼 亦已知爲在某些周圍副交感神經末端具抑制效力，如迷走 神經抑制心臟。 交感神經系統或副交感神經系統，擇一將自律神經系統 之訊號傳遞至身體。交感神經系統的結前神經從位於脊柱 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（12 ) 中間偏側間（intermediolateral horn)的結前交感神經細胞體 延伸。結前交感神經纖維，自細胞體延伸，與位於椎後 (paravertebral)交感神經結或椎前（prevertebral)神經結择一 之結後神經形成突觸。既然交感與副交感神經系統的結前 神經皆爲膽鹼性，應用乙醯膽鹼於神經結將同時興奮交感 與副交感結後神經。 乙醯膽驗活化兩種接受子，繩蕈驗性（muscarinic)及膽驗 性（nicotinic)接受子。蠅蕈鹼性接受子可在所有被副交感神 經系統的結後神經影響細胞中發現，同時也在被交感神經 系統結後膽鹼性神經刺激的細胞中發現。膽鹼性接受子在 交感與副交感的結前及結後間突觸中發現。膽鹼性接受子 亦在許多骨骼肌肉纖維的神經肌肉接合點的膜中發現。 當小，清楚，細胞内胞囊和前突觸神經細胞膜融合時， 乙醯膽鹼自膽鹼性神經中釋放。廣大多樣性的非神經分泌 細胞，如腎上腺髓質（亦爲PC 12細胞株）及胰島細胞分別自 大的緊核胞囊釋放兒茶驗胺（catecholamines)及胰島素。 PC12細胞株是複製自大鼠嗜鉻性細胞瘤 (pheochromocytoma)細胞，其廣泛使用於研究交感神經及腎 上腺（sympathoadrenal)發育的組織培養模型。肉毒桿菌毒 素在體外抑制兩種型式的化合物自兩種細胞型式的釋放， 經通透（如電穿孔）或直接注射毒素進入切除神經 (denervated)細胞。肉毒桿菌毒素已知可阻斷神經傳導物質 麩胺酸自皮層突觸細胞培養的釋放。 神經肌肉突觸在骨骼肌中由軸突延伸到肌肉細胞而形成 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(2i〇X297公釐） 1292713 A7 B7 五、發明説明（13 ) 。經神經統的訊號，傳遞源於末端軸突的活動勢（action potential)，其靠著活化離子通道並引起神經傳導物質乙醯 膽鹼自神經内突觸胞囊的釋放，舉例言之，如於神經肌肉 接合點的運動端平面（endplate)。乙醯膽鹼穿越胞外空間， 並與肌肉端平面表面的乙醯膽鹼接受子結合。當足夠的結 合一發生，肌肉細胞的活動勢便引起特異膜離子通道改變 ，而引'起肌肉收縮。乙醯膽鹼接著自肌肉細胞釋放並被 胞外空間的膽鹼酯酶（cholinesterases)代謝。此代謝物可循 %回端轴突以製造更多乙g盔膽驗。 如上所討論，治療受傷害肌肉的方法仍不足。而需要進 步的方法以治療肌肉傷害。 發明概要 依照本發明，一種有效治療受傷害肌肉之方法包含在體 内步驟局部施予治療有效量的神經毒素或受至傷害肌肉附 近。此神經毒素的作用在於提供受傷害肌肉暫時性的化學 性切除神經（chemodenervation)，並減少肌肉收縮。本發明 的目的在於治療且容易痊癒，並加速受傷害肌肉功能的回 復。此受傷害的肌肉，舉例言之，可能爲使用過度的肌肉 .。在一實施例中，施予神經毒素於肌肉内或皮下。在另一 實施例中，在進行施予神經毒素及/或接著物理治療及/或外 科手術。 進一步根據本發明，在肌肉受傷後立即或於可施行時立 刻％予神經毒素。在一實施例中，神經毒素係至少在受傷 害肌肉修復過程時期1及/或時期2有效固定或實質上固定 — —— _ "16~ 本紙張尺度適财8时規格(2i0X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（14 ) 受傷害之肌肉。 根據本發明，神經毒素包括一目標成分，一治療成分， 及一移位成分。該目標成分可結合一前突觸運動神經。在 一實施例中，該目標成分可包含一酶酸菌（butyricum)毒素 、破傷風毒素或肉毒桿菌A、B、Ci、D、E、F、G型毒素 或其變化物之重鏈羧端段。該治療成分可干擾或調節神經 傳導物質自神經的釋放或過程。在一實施例中，該治療成 分包含一酪酸菌毒素、破傷風毒素或肉毒桿菌A、B、、 D、E、F、G型毒素或其變化物之輕鏈。該移位成分可調節 轉換至少一部份的神經毒素，如該治療成分，進入目標細 胞的細胞質。在一實施例中，該移位成分可包含一絡酸菌 毒素、破傷風毒素或肉毒桿菌A、B、Ci、D、E、F、G型 毒素或其變化物之胺基端段。 更進一步根據本發明，此神經毒素係爲肉毒桿菌A、B、 E及/或F型毒素。在一較佳實施例中，此用於治療受傷害肌 肉的神經毒素係爲肉毒桿菌A型毒素。事實上，使用肉毒 桿菌A型毒素爲較佳係因其爲商業上可獲得，並已知爲臨 床使用，且依此討論的，根據本發明可成功應用於治療受 傷害之肌肉。使用約0.1 U/kg至約30 U/kg的肉毒桿菌A型毒 素及從約1 U/kg至約150 U/kg的肉毒桿菌B型毒素係於根 據本發明所揭露之方法實行範圍内。考慮其它肉毒桿菌毒 素血清型（包括E及F型毒素），如於此所建立的，其所使用 之U/kg劑量係落於約0.1 U/kg至約150 U/kg的範圍内。 更進一步根據本發明，該神經毒素可爲重組製造之。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1292713
本發明詳細之實施例爲一用於在體内治療（如促進疾癒） 受傷害肌肉的方法，其係局部施治療有效量之肉毒桿 菌毒素於受傷害之肌肉，並由此治療受傷害之肌肉。該肉 毒桿菌毒素可爲肉毒桿菌A型毒素。顯著地，本發明亦包 含用於在體内治療因受傷害肌肉的疼痛，其係局部施予一 治療有效量之肉毒桿菌毒素於受傷害之肌肉，並由此減輕 因肌肉傷害所引起的疼痛。 在此所描述的每個特徵及兩個或更多特徵之每個組合， 係包含於本發明所提供之範圍内，其特徵包含不互相矛盾 之組合。 定義 以下提供及應用於此發明之.定義。 '•約”指近似或接近並列於此之上下文關係數字値或範圍 ，意味列或請求於此之數字値或範圍的土 1 〇%。 π重鏈π指桿菌（clostridial)神經毒素之重鏈。其較佳具約 100 kDa之分子量，可能在此以Η鏈或Η代表。 ΠΗΝ”指一自肉毒桿菌毒素Η鏈衍生之片段（較佳具約5〇 kDa之分子量），其近似相等於Η鏈的胺基端段，或在完整η 鏈中之相應部份。據信包含天然或野生桿菌神經毒素部份 與L鏈穿越細胞内細胞内膜相關。 ”HC”指一自肉毒桿菌毒素Η鏈衍生之片段（約50 kDa之分 子量），其近似相等於Η鏈的羧端段，或在完整Η鏈中之相 應部份。據信其爲免疫性，並包含天然或野生桿菌神經毒 素部份，與高親合力結合至前突觸運動神經相關。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1292713
f’受傷害之肌肉，，包括一使用過度、破裂或拉張肌肉，亦 即肌肉挫傷、裂傷、局部缺血或破裂。 曰輕鏈|指捍菌神經毒素之輕鏈。其較佳具約5〇 kDa之分 子量，可能在此以L鏈、L或桿菌神經毒素之蛋白分解區域 (胺基酸序列）代表。該輕鏈據信爲當其釋放至目標細胞的 細胞質時爲有效之神經傳導物質釋放抑制子。 局部施予”指直接於一動物體施予一醫藥在或至鄰近位 置’該位置爲需要醫藥生物效能者。 ’’神經毒素”指一化學實體，其可干擾或調節至少神經之 個功能。該”神經毒素”可自然發生或人工製造。進一步 的，該”神經毒素”可爲-小分子，一大分子，—多胜^ ，一偶合多胜肽酶或其混合物。· /·變化物’，指一化學實體，其係細微不同於其根源化學實 彳一仍具生物活性。此變化物之生物活性可爲實質上相 同或較其根源更加。舉例言之，一肉毒桿菌毒素輕鏈之變 化物具至少一胺基酸被取代，修改，刪除或加入，可能具 有相同或較佳防止神經傳導物質自胞囊中釋放。此外，變 化物的生物活性可能會減低。舉例言之，一肉毒桿菌Α型 母素之輕鏈變化物具有一白胺酸爲基礎區域移除，可能比 其根源（或原生）肉毒桿菌A型毒素輕鏈具較短的生物持續 性0 、 發明描述 在廣文的貫施例中，根據本發明之一有效治療受傷害肌 肉之方法可包含局邵施予一治療有效量之肉毒桿菌毒素至 -19-
¥紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210\297公|) 1292713 A7 B7 五、發明説明（17 ) 受傷害肌肉的步驟。較佳的，該受傷害之肌肉係爲一使用 過度肌肉。 一過度使用之骨骼肌傷害可分類爲變形（shearing)傷害 。在變形傷害中，不只肌肉纖維，連肌鞘（mysU1 sheaths) 亦破裂。幾乎立即就在肌肉傷害後，肌肉修復步驟便開始 。此修復變形傷害步驟可分爲三時期。 時期1爲破壞期，其特徵爲血腫的形成，肌纖維壞死及發 炎細胞反應。在使用過度後，相反爲健康肌肉的破裂位置 常發生於靠近其遠端肌肉肌腱接合點（MTJ)。此破裂的肌纖 維收縮，並在殘枝形成一隙縫。因骨骼肌富含血管，自破 裂血管出血係不可逸出的，而其隙縫變成被血腫填滿，並 在其後被瘢組織移除。在機械力破裂整個肌纖維的變形傷 害中’損害了肌纖維的細胞膜，並使殘枝端的肌質漿 (sarcoplasm)打開。因爲肌纖維是非常長且弦狀之細胞，壞 死位置沿著破裂肌纖維的全長延伸。血管亦在變形傷害破 裂：因此，帶血發炎細胞立刻增加接近受傷位置並引起發 炎。時期1自受傷後持續約2至3天。 時期2爲修復期’其由壞死組織的巨噬作用，肌纖維的再 生，瘢結缔組織的產生，及微血管向内生長所組成。受傷 害肌肉組織再生作用的關鍵步驟在於受傷區域的血管生成 作用。血管供應的回復對受傷肌肉的再生作用是必須的。 新的微血管自殘存的大血管中長出，並小心穿透受傷害區 域的中間。這些新的微血管幫助提供再生區域足夠的氧氣 供應。 -20-
18 1292713 五、發明説明（ 時期3爲改型期，其由再生肌纖維的成熟作用，瘢組織的 收、、宿及重新組織’及修復肌肉功能的回復所組成。時期2( 修復）及3(改型）通常同時發生且在時期1後持續約2天至約6 星期。 在本發明之一實施例中，神經毒素係局部施予，較佳係 ^肉内注射，以固定受傷害的肌肉以促進痊癒。根據本發 明所揭露之局部施予一神經毒素亦可減少因肌肉傷害所引 ，的蹋覺。較佳的，係在受傷後立即或靠近其後施予神經 母素。在一較佳實施例中，神經毒素係在破壞期（時期U有 效固足党傷害的肌肉以預防肌肉的再次破裂。 爲不希望限制實施本發明於任何特定的理論機構，據信 ，復，的移動及/或此移動幫助改型期引起更快速及強‘ '笞向内生長至受傷害區域，如更好的肌肉纖維再生及 辨位。因此，在一實施例中，在修復期（時期2)及/或改型期 (時期3)時，缺乏神經毒素的固定作用。在一更佳實施例中 ,，在時期1施予神經毒素並有效固定受傷害的肌肉，但在修 復作用的時期2及3並不施予。舉例言之，若在受傷後立即 注射神經毒素，較佳爲肌肉内，神經毒素於施予後的約3 天内固足文傷害肌肉係較佳的。另，神經毒素可只在病人 在^礎運動受傷害肌肉感到些微或不痛時，具其固定=用 。當達到此臨界點，病人可鼓勵其開始活動，並進行移動 ^在本發明之另一實施例中，神經毒素係全在時期丨_3及其 後的肌肉受傷恢復期皆有效固定受傷害的肌肉。 一 -21 - 本紙張尺度咖中國國家標準(CNS) A4規格(21()X297公复） 1292713 A7 B7 五、發明説明（ . 禾=⑺母秤菌毒素，需要 約—天至 七天以顯現顯著的睦由、 此六、、、 ^ 肉麻痺功能，及/或該肌肉麻醉功 :素可：持續數2，皆在本發明之範圍内，如此神經 :期肌内二療相對嚴重或長期肌肉傷害或爲適當痊癒的 長期肌肉固定作用。 4 在一廣泛的實施例中，神妹主作> 皂】跆- 丄 甲、、、工母素係馬一神經肌肉阻斷劑 。表1顯不一神經肌肉阻斷 辦剎 。在-實㈣n 動潛力位置之非限定表 佳爲典傷堂的？ I肌肉阻斷劑具固定肌肉的能力，較 佳馬爻傷害的肌肉，施予 ^ 权 以治療受傷害的肌肉。在二：5天，且較佳爲至少約3天 母素係馬肉毒捍菌毒素， 、，工 的臨虔忠人从 M，、自知的使用及肉毒桿菌毒素 的^床女全性，如肉毒捍菌_ 、，因母京 肉痙攣。在本發明一特別 &療肌肉疾病，如肌 符別較佳貫施例中 斗、 第三及肌肉傷害，局部施 ？』疋嚴重的或
型毒素。肉毒桿菌A型毒+ ^囷母素爲肉毒桿菌E 母素吓可用於這些實施例中。 本纸張尺纽财國圈豕賴cns)域 -22- 1292713 A7 B7 五、發明説明（20 ) 表1 化合物 相應於NMJ的活性位置 醫藥分類 乙醯膽鹼脂酶謗導子 突觸 ACh脂酶謗導子 烏頭素(Aconitine) 前突觸 鈉通道活化子 腺調節素(自蛙 Phyllomedeusa Bicolor 而來） 前突觸 腺甞酸接受子調節子 腺甞酸激動劑 前及後突觸 腺甞酸 腺甞酸拮抗劑 前及後突觸 腺甞酸 腺甞酸 前及後突觸 腺荅酸 腎上腺素激導素 前突觸 Alpha型腎上腺素激導素 類毒素-A 後突觸 AChR激動劑 抗痛瘤素 CNS 抗癲癇素 反意識 前及後突觸 特異蛋白質之 反意識技術 釋放神經傳導 物質之重要訊息 接受子製造 抗焦慮藥 CNS 抗焦慮藥 抗癲癇素 阿塔寇寧(Atacurim) 後突觸 AChR拮抗劑 非極性肌肉放鬆劑 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（21 ) 阿塔寇寧必司雷特 (Atacurim besylate) (Tracurium) 後突觸 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 巴客洛芬(Baclofen) (Lioresal .RTM.? Geigy; Intrathecal, Medtronic; Neurological; generic, Athena，Biocraft, Warner Chilcott) 細菌，植物及眞菌 產物 前突觸 GABA類似物 娃毒 前突觸 鋼通道活化子 苯甲基喊淀 突觸溝 ACh酯酶抑制 子(非傳統性） 植物性神經毒素 前及後突觸與突觸溝 多樣性 蛇毒-β (β-BuTX) 前突觸 PLA2及電壓敏感 性奸通道阻斷子 蛇毒來自Bungarus multicinctus 標辟菲坎(Bupivacain)前及後突觸 局部麻醉肌肉毒素 卡普脱皮歐 (Captopril)(Capoten •RTM·，Squibb; Capzide .RTM·， Squibb) 前突觸 抗血管緊張 ACE抑制子 鋅内胜肽酶抑制子 膽鹼+乙烯轉移 酶抑制子 前突觸 CAT抑制子 膽驗S旨酶抑制子 突觸溝 ACh酯酶抑制子 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（22 ) 甲藻毒素 前突觸 鋼通道 椎毒素MI (alpha椎毒素） 後突觸 AChR拮抗劑 椎毒素-.mu. GIIIA (mu-CT) Na+通道阻斷子 椎毒素-.OMEGA. 只在神經的Ca2+通 GVIA (omega-CT) 道阻斷子 寇瑞爾(Curare) 後突觸 AChR拮抗劑 丹綽連(Dantrolene) 鈉(Dantrium，P&G) 後突觸 非極性骨骼肌鬆弛劑 编虫S葛驗 後突觸 AChR拮抗劑 溴化十甲季銨 前突觸 神經結阻斷子 樹狀毒素 前及後突觸 钟離子通道阻斷子 二胺基哌啶 (3-DAP) 前突觸 肉毒桿菌麻醉逆轉 安定(diazepam) CNS Anxiolytic 堇撒寇寧 (Doxacurim)氣 (Nuromax .RTM., Burroughs Wellcome) 後突觸 AChR拮抗劑 莖索茹比新 後突觸 肌毒素 (Doxorubicin) (Adriamyocin，Adria; Rubex, immunex; Cetus Onoclogy) -25- 化學性肌切除 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（23 ) 耶比蓓提啶 (Epibatidine)二氫化氯 後突觸 AChR激動劑 菲而貝美特 (F elbamate)(F elbatol, Carter-Wallace lie to Schering-Plough) 前突觸 CNS 抗癲癇劑 佛落撒麥新 (foroxymithine) 前突觸 血管緊縮素I轉變 酵素抑制子 卡八賓停(Gabapentin)前突觸 (Neurontin, CNS Parke-Davis) GAB A類似物 沒食子醯胺 後突觸 AChR拮抗劑 格瑞毒素 (Grayantoxin) 前突觸 鈉通道活化子 六氫化吖庚因乙醯 胺及其他化學類 前突觸 ACh釋放子 修伯新(Huperzine)A 突觸溝 ACh@旨酶抑制子 昆蟲毒 離子通道阻斷子 前及後突觸 通道阻斷子 離子通道刺激物 前及後突觸 通道刺激物 蛛毒素-α 前突觸 鉀紫幻視 黑寡婦*知蛛毒素 里斗嵌(Lidocaine)、 普魯卡因(procaine)、 美比卡嵌(mepivacain) .等 前突觸 局部麻醉 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（24 ) 李#皮淀(Linopirdine)前突觸 (DuP 996， Dupont Merck) ACh釋放促進子 李佛毒素(Lophotoxin)後突觸 及其類似物 AChR拮抗劑 不可回復的 海洋自然產物 美索卡貝摩 (Methocarbamol) (Robaxin，Robins co.) CNS降低 美西里卡寇呢啶 (Methyllycaconitine) 肌肉鬆弛劑 麥菲寇寧 (Mivacurium)氯 (Mivacro .RTM·， BW-BW1090U， Burroughs Wellcome) 後突觸 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 修飾之桿菌毒素 前突觸 ACh釋放抑制子 抗NMJ物單株抗體 接受子，agrin，神經 傳導物質，細胞膜物， 未活化酵素等 蕈毒素激動劑及 拮抗劑 前及後突觸 蕈毒素 CNS激動劑及拮抗劑 泥歐撒西毒素 (Neosaxitoxin) 前突觸 鈉通道阻斷子 泥歐蘇如卡毒素 (Neosurugatoxin) 自主結AChR阻斷子 (對NMJ無效） 神經肌肉阻斷劑 後突觸 AChR拮抗劑 AChR去極性 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1292713 A7
B7 五、發明説明（25 ) 自爬蟲類，昆蟲及 其他來源的神經毒素 前及後突觸與突觸溝 攀扣柔寧 (Pancuronium) 濃(Organon) 後突觸 攀扣柔寧 (Pancuronium)-3 -OH 代謝4匆 (Organon)Papverine HC1 (30 mg/ml) 後突觸 飛蘇司提格寧 (Physostigmine)及 類似物 突觸溝 喊特扣柔寧 (Pipercuronium) (Arduan, Organon) 後突觸 前突觸神經端接受子 前突觸 短神經毒素alpha 後突觸 β-蛇毒 (β-BuTX) 前突觸 琥珀酸氣 (Anectine, Burroughs Wellcome) 後突觸 破傷風毒素 前突觸 破傷風毒素傳送子 前突觸 四氫胺基吖啶(THA) 突觸溝 多樣性 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 平滑肌鬆弛劑 AChS旨酶抑制子 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 在神經端任何外加或 神經内接受子 AChR拮抗劑 蛇毒來自
Bungarus multicinctus AChR抬抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 EAA釋放抑制子 ACh釋放抑制子 -28-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（26 ) 四達克斯毒素 (Tetrodoxtoxin) 前及後突觸 鋼通道阻斷子 提阿卡賓(Tiagabine) (Novo Nordisk) CNS 抗癲癇 GAB A攝取抑制子 轉越胺酸酶抑制子 或防止謗導 前及後突觸 酵素 非力寧(Valium) diazepam CNS Anxiolytic 非扣柔寧 (Vecuronium) (Norcuron, Organon) 後突觸 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 非扣柔寧 (V ecuronium)-3 -OH 代謝物(Organon) 後突觸 AChR拮抗劑 非極性肌肉鬆弛劑 非若特瑞定 (Veratridine) 前突觸 鈉通道活化子 非卡貝淀(Vigabatrin) 前突觸 抗癲癇 (Sabril, Marion Merrell CNS Dow) GAB A代謝抑制子（不可 回復性） 非撒迷扣(Vesamicol) 及具有相同機制的 其他藥 前突觸 ACh胞囊傳送抑制子 鋅内胜肽酶酶及其他 靠肉毒桿菌毒素或 破傷風毒素運送子 傳遞的蛋白酶 前突觸 酵素減少神經 傳導物質釋放 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1292713 A7 B7
五、發明説明（27 ) 在一廣泛之實施例中，神經毒素可包含一目標成分，— 治療成分，及一移位成分。該目標成分可結合一前突觸運 動神經。在一實施例中，該目標成分可包含一路駿菌 (butyricum)毒素、破傷風毒素或肉毒桿菌A、B、q、：Q、p 、F、G型毒素或其變化物之重鏈羧端段。在一較佳的實施 例中，該目標成分可包含肉毒桿菌A型毒素的羧端段。 該治療成分本質上可干擾或調節神經傳導物質自神經的 釋放或過程。在一實施例中，該治療成分包含一酪酸菌毒 素、破傷風毒素或肉毒桿菌A、B、Ci、D、E、F、G型毒 素或其變化物之輕鏈。在一較佳實施例中，該治療成分可 包含具短生物持續，如小於約5天，較佳爲小於約3天，之 肉毒桿菌毒素型之輕鏈。較佳地，該輕鏈可爲肉毒桿菌E 或F型毒素之輕鏈。可選擇地，該輕鏈可爲肉毒桿菌a型毒 素之輕鏈。 該移位成分可調節轉換至少一部份的神經毒素，如該治 療成分，進入目標細胞的細胞質。在一實施例中，該移位 成分可包含一絡酸菌毒素、破傷風毒素或肉毒桿菌A、B、 Ci、D、E、F、G型毒素或其變化物之胺基端段。在一較佳 實施例中，該移位成分包含肉毒桿菌A型毒素重鏈的胺基 端段。 在一實施例中，該目標成分包含一肉毒桿菌E或F型毒素 重鏈之羧端段，該治療成分包含肉毒桿菌E或F毒素之輕鏈 ，及該移位成分包含肉毒桿菌E或F毒素重鏈之胺基端段。 在一較佳實施例中，此神經毒素包含一肉毒桿菌E型毒素。 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1292713 A7 _______ B7 五、發明説明（28 ) 在另一較佳實施例中，神經毒素胞和一肉毒桿菌F型毒素。 在另一個實施例中，該神經毒素包含肉毒桿菌E或F型毒素 〇 在一實施例中，該目標成分包含肉毒桿菌A型毒素的重 鏈複端段，而該治療成分包含肉毒桿菌A型毒素之輕鏈， 及该移位成分包含肉毒桿菌A型毒素重鏈的胺基端段。在 一較佳貫施例中，本發明的該神經毒素包含肉毒桿菌A型 毒素。一適合在此使用的肉毒样菌A型毒素爲Βοτοχ® (Allergan，Inc·，Irvine，California)。 雖然本發明的神經毒素以固定而治療受傷害的肌肉，在 一實施例中，該神經毒素也可施予至受傷害的肌肉以減輕 疼痛及/或痙攣。在另一實施例中，該神經毒素也可固定受 傷害的肌肉以減輕因受傷害的肌肉的疼痛。在一較佳實施 例中，一神經毒素，舉例言之爲肉毒桿菌E型毒素，或最佳 爲A型毒素被施予至使用過度之肌肉以固定該肌肉，及/或 減輕因該肌肉的疼痛。 當然，一普遍熟悉醫藥之供應者可測定適宜的劑量及施 予頻率以達到最適宜的臨床效果。此即，一普遍熟悉醫藥 之人士可在適當時機施予適當量之神經肌肉阻斷劑，以有 效固定受傷害之肌肉。該用於施用之神經毒素劑量視許多 不同的因子而定，包含肌肉尺寸，及肌肉受傷的嚴重度。 在一較佳實施例中，施予固定受傷害肌肉神經毒素的劑量 不長於修復過程時期1之時程。在本發明的許多方法中，從 約0.1 u/kg至約15 U/kg的肉毒桿菌A型毒素可施予至受ς -31 -
1292713 A7 ____ B7 五、發明説明（29 ) 害之肌肉。較佳地，約1 U/kg至約20 U/kg之肉毒桿菌A型 毒素可被施予至受傷害的肌肉。使用自約〇. 1 U/kg至約3 0 U/kg之肉毒桿菌a型毒素及自約1 u/kg至約150 U/kg的肉 毒桿菌B型毒素，皆在本發明揭露之施行方法的範圍内。考 量其它肉毒桿菌血清型（包含E及F型毒素），其u/kg之使用 劑量如於此所建立的，落於自約〇· 1 u/kg至約15〇 u/kg之範 圍内^ 雖然肌肉内注射是施予之較佳途徑，其它局部施用之路 徑是可獲得的，如皮下施予。 在另一廣泛之實施例中，根據本發明治療受傷害肌肉之 方法進一步包含以下描述之其它步驟。採用這些其它步驟 可在施用神經毒素步驟前、一起或後，較佳地於受傷害肌 肉。舉例e之’本建議之治療使用過度肌肉包含使休息， 冰敷敷，壓迫及高舉。此四步驟（或程序）具有相同的目標 。其減低破裂位置自破裂血管的出血。此將預防大型血腫 的形成，大型血腫對再生的端瘢組織的尺寸有直接衝擊。 一小型血腫及細胞組織間水腫在破裂位置累積的限制，亦 縮短肉芽組織（granulation tissue)局部缺血時程，此將依序 加速再生作用。 其它加入的步驟可包含使用受傷害肌肉之治療。在一實 施例中，該加入的步驟包括施予非類固醇抗發炎藥 (nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAms)、治療性超 音波、高比重氧、及在嚴重的傷害中，外科手術也可施予° 。NSAIDs應可作爲一早期治療即應在受傷後立即開始。在 -32-
1292713* A7 s----— _____ 五、發明説明（30 ) 復原早期短程使用NSAIDs可減少細胞發炎反應，並對受傷 害肌肉的伸張或收縮無不利之影響。 在另一個實施例中，此加入的步驟包含使用治療性超音 波。治療性超音波係廣泛被建議使用於治療肌肉使用過度 。治療性超音波被視爲可促進肌肉再生作用的增殖期。 在另一個實施例中，此加入的步驟包含使用高比重氧 (hyperbaric oxygen)，在兔子中於修復早期使用高比重氧治 療貫貝上可促進最後之結果。據信在其他哺乳動物中高比 重氧治療，舉例如人類，可能有效於加速肌肉再生作用。 在另一個實施例中，此加入的步驟包含外科手術干涉。 外科手術治療肌肉傷害應保留至最嚴重的病例，因爲大部 分的病例中，保守的治療已可達到良好的結果。外科手術 治療只用在（1)大型肌肉内血腫，（2)很少或無催動肌 (agonise)之第三級肌肉使用過度或破裂，及（3)第二級使用 過度，若多於一半的肌肉鼓脹破裂。 本發明之另一個廣泛觀點，重組技術可用於製造至少一 個神經毒素物。該技術包含自自然來源的DNa複製或合成 之核茹酸序列獲得遺傳物質，其具一物，如治療、移位及/ 或目標成分之密碼。該遺傳構成物靠首先融合遺傳構成物 與複製載體’如嗟菌體或質體，而編入宿主細胞用以放 大。然後該複製載體插入至宿主内，較佳爲大腸桿菌。接 著該重組基因在宿主内之表現所產生的蛋白質可使用普遍 的技術分離。該表現蛋白質可包含神經毒素全部三物。舉 例言之，此表現蛋白質可包括肉毒样菌E型毒素的輕鏈（該治 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1292713
療成分），肉毒桿菌B型毒素之一重鏈，較佳係^^(該移位成 刀）及肉母和'菌八型毒素之Hc，其係選擇性結合至運動神 經。在一實施例中，此表現蛋白質可包括少於神經毒素的 全部三物。在此例中，該物可使用此技藝中已知之技術化 學性連結。 重組製造這些神經毒素有許多優點。舉例言之，自無氧 桿菌族群中製造神經毒素之方法是累贅且耗時的，包括多 步驟的純化程序，與許多蛋白質沉澱步驟、與延長及重複 結晶毒素或層析管柱的許多階段其中之一相關。顯然地， 產物的咼毒性指定了此程序必須在嚴格的承載物（BL-3)中 進行。在此醱酵作用中，此摺疊的單鏈神經毒素被内生性 桿菌蛋白酶經一稱爲切裂之步驟所活化。此關聯於自單鏈 中移除近1 0個胺基酸殘基，以創造出一雙鏈型式，其中兩 個鏈係經鏈内雙硫鍵共價連結。 此被切裂的神經毒素比位切裂型式具更多活性。切裂的 量及精確位置隨細菌製造的毒素血清型而變化。單鏈神經 毒素的不同，因此，切裂毒素的生產，導因於型的變化及 由給予之Η株所產生蛋白裂解活性的量。舉例言之，大於 99%之肉毒桿菌Α型單鏈神經毒素被Hall Α肉毒桿菌株所 活化，而B及E型菌株產生之毒素則具較低量活性（0至75〇/(> 依酸酵作用時間而定）。因此，高毒性之成熟神經毒素在商 業製造神經毒素作爲治療性神經毒素扮演重要之角色。 故，工程化的桿菌毒素的活性程度在製造這些材料時， 是一重要之考量點。若神經毒素，如肉毒桿菌毒素及破傷 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公寶) 1292713 A7 _— —_B7 五、發明説明（32 ) 風毒素可被表現、重組、在快速成長的細菌（如異質化之大 腸桿菌細胞）具高生產之相對無毒性之單鏈（或具減低毒素 之單鏈）’而可被安全、容易的分離並簡單轉化成全活性型 式，將是一主要之進步。 當安全性爲一最主要之考量，之前的工作集中在大腸桿 菌表現及純化個別的破傷風毒素及肉毒桿菌毒素Η及L鏈 ，這些個別的鏈本身爲無毒性的，參看Li等人，Biochemistry 33:7014-7020 (1994) ·· Zhou等人，81〇。116111151：7 34:15175- 15 181 (1995)，併於此作爲參考。接下來的分開製造這些胜 肽酶鏈，及在嚴格控制條件下Η及L次單位可被氧化雙硫鍵 結而結合，以形成神經麻痒性之雙鏈。 以下非限定的實例，係提供受傷害肌肉較佳地治療方法 ，及製造重組神經毒素，較佳係肉毒桿菌毒素。描述於實 例4至8之製造重組肉毒桿菌毒素方法係由Dolly等人所揭 示之國際專利申請號WO 95/3273 8所引起並相類似，併於此 作爲參考。 實例1 遵:療破裂的二頭腱（Biceps Tendon^ 肱二頭肌的破裂普遍發生於近端且與二頭之長頭相關。 該肌肉可能在遠端插入橈骨觸破裂，但很少發生。最常的 ，破裂發生於年齡大於40歲的成人，其有肩膀痛之長病史 及次要的衝擊症狀。此時，肌腱變得磨損且虚弱，而終究 局部或全部破裂。雖然，此破裂常因輕微的事件所引起。 這些破裂通常與轉肌環帶（rotator cuff)破裂相關，特別在成 -35- 本紙張尺度適财0 S家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) '' -- 1292713 A7 B7 五、發明説明（33 ) 人中。 一45歲男士在舉重盒後顯示出下臂腫脹。他報告了上臂 突然的尖銳痛之病例，通常伴隨清晰可聞之折斷聲。這男 士被診斷爲肱二頭肌腱斷裂，並開始時期1之修復作用。該 斷裂可被分類爲中度第二級的使用過度。 以團塊（bolus)肌肉内注射自約〇.1 u/kg至約25 U/kg之神 經毒素入二頭肌以治療此病人。較佳此神經毒素係肉毒桿 菌E及F型毒素，更佳係A型。施用獨特的劑量及頻率依不 同因子而定，並由治療的醫生決定。進一步指示此病人休 息及使用冰敷及壓迫二頭肌。在施予神經毒素約三天後， 此病人可彎曲他的手臂。同時在約三天後，此病人感到發 炎的減少，此係爲病人進入修復作用時期2及3之信號。病 人也感到顯著的疼痛減輕。局部施予自約1 〇單位至約2〇〇 單位之肉毒桿菌A型毒素也可使用於長效（2至4月）的肌肉 固定及疼痛減輕。 實例2
伸肌破裂機舍I 膝蓋的伸肌破裂機制以兩種方式之一發生：在年輕病人 中導因於犬然或猛烈之力量（如跳躍、舉重），及在較年長 的病人中導因於相對輕微的力量。在每一個族群中，有可 能已有先前的彎曲。影響較年長之病人典型係略爲少活動 及突然增加他們的活動量，或是具有已存在或共同存在如 糖尿病、風濕性關節炎及其他系統性發炎疾病，或之前的 膝蓋手術。 -36-
1292713 A7 B7 五、發明説明（34 ) 22歲女性足球運動員顯出無法伸長他的膝蓋。此病人 也操法將伸長的腿舉起，但若她保持放一隻手在大腿上以 保持膝盍伸直，是可行走的。平面射線攝影顯出其膝蓋骨 車乂正$位置爲低。此病人被診斷爲嚴重的四頭肌斷裂。 田測走此傷害係爲嚴重（第三級）後，此病人同意進行修 復性外科手術。在手術後，以團塊肌肉内注射自約0.1 U/kg 至約25 U/kg之神經毒素（如約1〇至約4〇〇單位的肉毒桿菌A 型母素）入四頭肌以治療此病人。較佳此神經毒素係肉毒桿 菌A型毒素。施用獨特的劑量及頻率依不同因子而定，並 由治療的醫生決定。進一步指示此病人休息及使用冰敷及 壓迫二頭肌。在施予神經毒素約15天後，可以經常性的運 動及活動受傷害之肌肉。此病人在來被鼓勵輕微的移動並 恢復伸長該肌肉及周圍的肌肉。當毒素之功效漸漸消去， 此病人可以有能力快速參與物理治療療程或恢復一般功能 及/或運動。若此病人依靠運動營生，肉毒桿菌毒素治療可 促使她早日回到此活動中。局部施用自約i 〇單位至約2〇〇 單位之肉毒桿菌A型毒素亦可施用於長效（2至4月）肌肉固 定0 實例3
治療脛骨夾板（Shin SplintO 跑步者通常經歷下肢脛骨夾板，其會引起疼痛並限制活 動。較低腿導因於脛骨夾板的疼痛，在連接至脛骨的部位 引起腿肌肉非常小的破裂。有兩種形式：丨·前脛骨夹板發 生於脛骨（tibia)的前部：2·後脛骨夾板發生於沿著脛骨的内 -37-
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部（中間）。 前脛骨夹板導因於肌肉不平衡，不足夠的吸震或腳趾跑 動。過度的反轉皆貢獻於前及後脛骨夾板。 於治療使用過度肌肉，如脛骨夾板，建議有五個步驟： (1)保護受傷害肌肉以防止因使用夾板、墊及/或擔架之更進 一步傷害：（2)限制活動，通常有48至72小時可使痊癒步驟 開始。施用短效肉毒桿菌E*F型毒素或肉毒桿菌A型毒素 修飾物，此可減少A型毒素在體内生物活性期（即較短期之 遲緩肌肉麻痒）。適合的肉毒桿菌毒素，包括在體内適合使 用生物活性較短之肉毒桿菌A型毒素，被建立並共同申請 爲美國專利申請案第09/620840號，此申請案併於此作爲參 考。在更嚴重的肌肉過度使用·可限制活動力至少持續數週 至數月。因需要較長的限制活動，局部施用長效肉毒桿菌 ，舉例言之，（未修飾的）肉毒桿菌B型毒素，或更佳地，a 型毒素，是適用的。無此治療，病人可能經歷數週的限制 活動。當痊癒步驟開始時，建議輕微的運動及移動受傷害 的肌肉：（3)冰敷可於每小時使用15至20分鐘：（4)壓迫，如 彈性繃帶可在冰敷間保持：及（5)高舉受傷部位以減少腫脹 〇 實例4 次複製（Subcloning) BoNT/A鐘基因 此實例描述複製編碼BoNT/A-L聚核苷酸序列的方法。此 DNA序列編碼BoNT/A-L鏈以PCR方法放大，其使用寡核甞 序歹》J 5f-AAAGGCCTTTTGTTAATAAACAA-3f (SEQ ID#1) -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（36 ) 及 5，-GGAATTCTTACTTATTGTATCCTTT-3 (SEQ ID#2)。 使用這些引子可分別導入Stu I及EcoR I限制位置於 BoNT/A-L鏈基因片段的5f及1端。這些限制位置接著可用 於促進放大產品的單方向次複製。此外，這些引子導入一 停止密碼於L鏈編碼序列的C端。自肉毒桿菌（63 A株）而來 的染色體DNA在此放大反應中作爲模版。 此PCR放大反應在100 μΐ體積中進行，包含有10 mM Tris-HCl (pH 8.3)，50 mM KC1，1.5 mM MgCl2，每一去氧 核甞三磷酸（dNTP) 0.2 mM，每一引子50 pmo卜200 ng基因 體DNA及2.5單位的Taq-聚合酶（Promega)。此反應混合物被 置於35循環的變性作用（94°C 1分鐘），黏接作用（37°C 2分 鐘），及聚合作用（72°C 2分鐘）。最後，此反應再延長外加 的72°C 5分鐘。 此PCR放大產物以Stu I及EcoR I消化，以洋菜膠電解純 化，及連接至以Sma I及EcoR I消化的pBluescript II SK*以 產生pSAL質體。包含此質體的細菌轉型物再依標準程序分 離。鑑定此複製的L鏈聚核甞酸乃以雙股質體定序而確認， 此定序以 SEQUENASE (United States Biochemicals)之使用 指示進行。若需要，則準備合成的寡核甞序列引子以達到 重疊序列進行。此複製序列被發現與Binz等人在J· Biol· Chem. 265:9153 (1990)及 Thompson 等人在 Eur. J. Biochem. 189:73 (1990)所揭示的序列相同。 設計針對位置的突變作用以中和BoNT/A-L鏈的酵素活 性亦被製造。 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
裝 訂
1292713 A7 _______ B7 五、發明説明（37 ) 實例5 盘..現肉毒桿菌A型I素-L (BoNt/A-L)鏈融合蛋白 此實例描述鑑定含PCA-L質體之細菌中，野生型L鏈的表 現’其可作爲一治療成分。包含pCAL之已分離細菌菌落用 於接種含100 pg/ml氨爷青黴素（anipicillin)及2% (w/v)葡萄 糖的L-broth中，並在37°C震盪培養。此隔夜培養液以1:10 稀釋圭新鮮的含1〇〇 pg/ml氨苄青黴素L.broth中，再培養2 小時。加入最終濃度爲〇·1 的IPTG以謗導融合蛋白表現 。在外加4小時在30°C培養4小時後，以離心6,000 X g 10分 鐘收集細菌。 小規模的SDS_PAGE分析確認經IPTG謗導細菌90 kDa蛋 白質帶的表現。此Mr値是與預估具MBP (〜40 kDa)及BoNT/ A-L鏈（〜5 0 kDa)的融合蛋白大小是一致的。更進一步的， 當比較自控制培養物所分離的樣品，此IPTG謗導的菌落本 質上包含較大量的融合蛋白。 在IPTG謗導的細菌萃取物中所欲融合蛋白的表現亦以
使用描述於Cenci di Bello等人在 Eur. J. Biochem. 219 : 161 (1993)的多株抗L鏈探針的西方墨點法所確認。在pvoF膜 (Pharmacia; Milton Keynes，UK)的反應帶以偶合至辣根過 氫化酶（Bio-Rad; Hemel Hempstead UK)的抗兔子免疫原及 ECL檢視系統（Amersham，UK)顯現。西方墨點結果確認了 顯著的融合蛋白與許多相應於與全尺寸融合蛋白相比較低 Mr蛋白質模糊的表現。此觀察推定有限的融合蛋白退化作 用在細菌或在分離程序中發生。在分離程序中既不使用1 mM ________-40- 本紙張尺度適用巾@ @家標準(CNS) A4規格( X 297公寶)'·~' " 1292713 A7 B7 五、發明説明（38 ) 也不使用 1 〇 mM的苯 g盛胺淀（benzamidine，Sigma; Poole，UK) 以減低蛋白質分解的打破。 依以上程序分離生產的完整的融合蛋白在此所描述的方 法中保持全水溶性。依染色的SDS-PAGE膠估計，以IPTG 謗導的細菌菌落每公升培養液生產5-10 mg的全MBP野生 型或突變L鏈蛋白。因此，在此揭示的製造BoNT/A-L鏈融 合蛋白的方法係爲高效率的，縱使有限的蛋白質分解確實 發生。 此由pCAL及pCAL-TyrU7表現質體所編碼的MBP-L鏈融 合蛋白由澱粉酶親和性層析管柱而自細菌中純化。重組野 生型或突變型L鏈再由以X2因子特異位置切裂融合蛋白的 糖結合區域而分離。此切裂的程序生產自由的MBP，自由 的L鏈及小量未切裂的融合蛋白。當產生表現在該混合物中 的L鏈顯現出可進行所欲的活性，我們也可應用外加的純化 程序。如前所述，切裂產物的混合物應用於第二個澱粉酶 親和層析管柱以同時結合MBP及未切裂的融合蛋白。自由 的L鏈不在停留於親和管柱中，而可使用以下描述的實驗而 分離。 實例ό 純4匕融合蛋白及分離重、组BoNT/A-L鍵 此實驗描述自細菌菌落中生產及純化野生型重組 BoNT/A輕鏈之方法。將從1升表現野生型BoNT/A-L鏈蛋白 質細菌培養液的沉澱物溶解於包含1 mM苯基-甲烷磺醯氣 (phenyl-methanesulfonyl fluoride，PMSF)及 10 mM苯醯胺淀 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1292713 A7 B7 五、發明説明（39 ) 的管柱緩衝液中[10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，200 mM NaCl ，1 mM EGTA及1 mM DTT]，再以超音波震盪打碎。此打 碎物以在4 °C離心1 5，0 0 0 x g 1 5分鐘而澄清。其上清液加入 至澱粉酶層析管柱[2 X 10 cm，30 ml樹脂](New England BioLabs; Hitchin，UK)。自樹脂中未結合的蛋白質以管柱缓 衝液沖洗直到洗脱液不含蛋白質，即爲判斷280 nm的穩定 吸收度。此結合的MBP-L鏈融合蛋白接著以包含10 mM麥 芽糖的管柱緩衝液洗脱。集合及對溶解在20 mM Tds-HCl (pH 8.0)的 150 mM NaCl，2 mM CaCh，及 1 mM DTT於 4°C 透析72小時包含融合蛋白的分液。 當溶解於 1 50 mM NaCl，2 mM CaCl2，及 1 mM DTT時， 融合蛋白以酵素：受質比例爲1:100之X2因子（？^〇11^§&; Southampton，UK)切裂。在4°C透析24小時。MBP及由切裂 步驟而來的野生型或突變L鏈其中之一之混合物置入以管 柱緩衝液平衡的10 ml澱粉酶管柱中。爲SDS-PAGE分析準 備分開收集的流經之分液，以鑑定含L鏈的樣品。剩餘的流 經分液部分儲藏在-20°C中。全部大腸桿菌萃取物或以純化 的蛋白質溶解於SDS樣品緩衝液中，並應用於標準的PAGE 程序。此程序的結果指出重組毒素片段粗略佔樣品中蛋白 質量的90%。 前述的結果指出創造描述於此之MBP-L鏈融合蛋白的方 法可用於有效率地製造野生型及重組BoNT/A-L鏈。進一步 地，此結果顯示重組L鏈可自融合蛋白地麥芽糖結合位置所 分離，並在其後純化。 _ -42- 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1292713 A7 B7 五、發明説明（4Q ) 建立敏感的以抗體爲基礎分析以比較重組L鏈產物的酵 素活性與天然副本。此分析應用對相應於BoNT/A切裂位置 的完整SNAP-25的C端區域具特異性之抗體。SNAP-25的 BoNT/A切裂反應產物的西方墨點指出該抗體不能結合至 SMAP-25次片段。因此，抗體逆神經毒素應用於下列實例 只偵測完整的SNAP-25。抗體結合的喪失可作爲由加入 BoNT/'A輕鏈或其重組衍生物所調節的SNAP-25蛋白裂解 指示。 實例7 重組L鏈對SNAP-25受質蛋白分解活性評估 此實例描述證明天然及重組BoNT/A-L鏈皆可蛋白分解 SNAP-25受質。使用定量分析以比較野生型及他們的重組 類似物切裂SNAP-25受質的能力。使用於此分析中的受質 由製備榖胱嘗肽·S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST) 融合蛋白而獲得，該融合蛋白包括凝血酵素的切裂位置， 以使用pgex-2t載體表現及由榖胱:y：肽洋菜親和層析管柱 純化。該 SNAP-25再被包含50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl及 2.5 mM CaCl2 (Smith等人，Gene 67 : 31 (1988)) 的凝血酵素自融合蛋白中切裂出來，其中酵素：受質比例 爲1 : 100。未切裂的融合蛋白及被切下的榖胱甞肽結合區 域則結合在膠體中。該重組SNAP-25蛋白則以後者的緩衝 液洗脱而出，並對100 mM HEPES (pH 7.5)在4°C透析24小 時。該全部蛋白質濃度以習用之方法測定。 對SNAP-25之C端區域特異的兔子多株抗體，被針對合成 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1292713 A7 B7 五、發明説明（41 ) 的具胺基酸序列CANQRATKMLGSG (SEQ ID#3)之胜肽酶 所引起。此胜肽酶相應於突觸細胞膜蛋白的195至206殘基 ，且N端的脱胺酸不在天然的SNAP-25中發現。此合成的胜 肽酶使用馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺醋（MBS) 作爲交叉反應的神經毒素（siSma : po〇le，UK)交聯至牛血清 蛋白素（bovine serum albumin ’ BSA)(Sigma : Poole，UK)以 增進杬原性（Liu等人：Biochemistry 18:690 (1979) 1)。抗胜 肽酶抗體的親和性純化，使用具由抗原性胜肽酶的N端的 胱胺酸殘基交聯至胺基烷基洋菜樹脂（amino agarose resin)(BioRad : Hemel Hempstead ’ UK) ’ 並以乙基 3·(3-二 甲基丙基）碳二醯胺交互反應的碘乙酸活化。在成功的以含 25mMTris-HCl(pH7.4)及150mMNaCl之缓衝液洗清管 柱後，使用1〇〇1111^甘胺酸（？1'12.5)及20〇1111^^(：1以洗脱胜 肽酶特異之抗體，並收集於含0·2 ml的1 M Tris_HC1 (pH8.0)中和緩衝液的管中。 包含野生型L鏈的全部重組製備於進行他們的酵素活型 前，在4°C對包含0.02% Lubrol及1〇 μΜ乙酸鋅的1〇〇 mM HEPES (pH 7.5)透析隔夜。之前以20 mM DTT在37C還原 30分鐘的BoNT/A也和這些透析樣品一樣，接著以後者的溶 有1 mM DTT的HEPES緩衝液稀釋成不同濃度。 反應混合物包含5 μΐ重組SNAP-25受質（最終濃度爲8·5 μΜ)及20 μΐ還原的BoNT/A或重組野生型L鏈。全部的樣品 在以 25 μΐ水溶性 2%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，丁FA)及 5 mM EDTA (Foran等人，Biochemistry 33 : 15365 (1994))淬 _-44-____ 本紙張尺度適用中關家標準(CNS) A4規格(210><297公董) 1292713 A7 B7 五、發明説明（42 ) 滅（quenching)前先在37°C靜置1小時。爲SDS-PAGE及以 SNAP-25多株抗體的西方墨點分析準備每一樣品的分液， 其係加入SDS-PAGE樣品缓衝液及煮沸。抗-SNAP-25抗體 反應力以ECL監測系統監看，並以照片黑度掃描量化。 西方墨點結果指出純化的突變L鏈及天然或重組野生型 BoNT/A-L鏈在蛋白分解活性上清楚的區別。特別的，重組 野生型L鏈較還原性BoNT/A天然L鏈（在此方法中作爲正向 控制組）具略低之效率切裂SNAP-25受質。因此，BoNT/A-L 鏈的酵素活性型式可用重組方法製造並在其後分離。更進 一步的，在L鏈蛋白的單一胺基酸取代取消了重組蛋白退化 突觸端蛋白的能力。 經由此野生型重組BoNT/A-L鏈生物活性的初步測試中 ，測試MBP-L鏈融合蛋白減小自毛地黃皂甞可通透牛腎上 腺色素細胞中Ca2+引起的兒茶胺酚的釋放。接著，野生型 重組L鏈融合蛋白，完整或以X2因子切裂型式產生包括自由 MBP及重組L鏈的混合物，謗導了與天然BoNT/A導致的抑 制作用相當的Ca2+刺激釋放的劑量倚靠抑制。 實例8 重構天然L鏈、以純化的Η鏈重組野生型L鏈 天然的Η及L鏈可以2 Μ尿素自BoNT/A中分離（List Biologicals Inc· : Campbell，USA)，以 100 mM DTT還原， 再依已建立的岑析分析步驟純化（Kpzaki等人，Japan J. Med. Sci. Biol. 34:61 (198 1):Maisey 等人，Eur. J· Biochem. 177 ·· 6 83 (198 8))。純化後的H鏈和相當莫耳量的天然L鏈 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1292713 A7 B7 五、發明説明（43 ) 或重組野生型L鏈其中之一結合。重構作用在對由25 mM Tris (pH 8·0)，50 mM乙酸鋅及150 mM NaCl所構成的缓衝 液在4 °C透析樣品4天時進行。接下的透析，重組L鏈及天然 Η鏈的結合以形成雙硫鍵結的150 kDa雙鏈可由SDS-PAGE 監看及以照片黑度掃描量化。雙鏈分子與重組L鏈形成部分 較當使用天然L鏈時爲低。事實上，只有約30%的重組野生 型或突變型L鏈可重構，而>90%的天然L鏈可和Η鏈重新結 合。雖然重構的效率低，足夠的合併重組L鏈材料可輕易製 造，以使用於接下的功能性分析。 當本發明以許多特異的例子及實施例所描述，須被了解 的是本發明並不限定於此，並可在以下的申請專利範圍内 不同地實行。其它位於本發明範圍内之實施例，敘述及修 飾是可能的。舉例言之，自約500單位至約4,000單位的肉 毒桿菌Β型毒素，可被用於治療根據本發明所揭示的肌肉傷 害。 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐)
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1292
0122250號專利申請案 中文申請專利範圍替換本03年6月）里鲁 A8 B8 申請專利範圍 1. -種用於治療肌肉傷害之醫藥組合物，其包含治療有效 量之肉毒桿菌毒素。 " 2. 根據申請專利範圍第μ之醫藥組合物，其係經肌肉内注 射作局部施用。 3. 根據"專利範圍第β之醫藥組合物，其中該肉毒桿菌 毒素係實質上固定該受傷害之肌肉。 4. 根據中請專利範圍第^之醫藥組合物，其中該肉毒桿菌 毒素係在受傷害之肌肉修復過程的時期i與時期2時有效 地固定受傷害之肌肉。 5. 根據申請專利範圍第丨項之醫藥组合物，其中該肉毒桿菌 毒素係在受傷害之肌肉修復過程的時期丨時有效地固定 受傷害之肌肉。 6_根據申請專利範圍第丨項之醫藥組合物’其中該肉毒桿菌 毒素係為肉毒桿菌A、B ' C丨、D、E、FiG型毒素。 7. 根據申請專利範圍第丨項之醫藥組合物，其中1亥#肉毒桿菌 毒素係重組製造之肉毒桿菌毒素。 8. 根據申請專利範圍第丨項之醫藥组合物，其係用於與物理 治療及/或外科手術治療受傷害肌肉作組合。 9. 一種用於活體内治療受傷害肌肉之醫藥组合物，其包含 治療有效量之肉毒桿菌毒素。 " 10·根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其中該肉毒桿菌 毒素係為肉毒桿菌A型毒素。 11. 一種用於活體内促進受傷害之肌肉痊癒之醫藥組合物’ 其包含治療有效量之肉毒桿菌A型毒素。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A B c D 1292713 六、申請專利範圍 12. —種用於活體内治療與受傷害肌肉有關疼痛之醫藥組合 物，其包含治療有效量之肉毒桿菌毒素。 13. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該肉毒桿 菌毒素係為肉毒桿菌A型毒素。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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