ES2342396T3 - Metodos para inhibir la permeabilidad vascular y la apoptosis. - Google Patents
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Abstract
El uso de un agonista del receptor endotelial vascular de esfingosina-1-fosfato, una forma aceptable farmacéuticamente del mismo, o una forma fosforilada del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la apoptosis no deseada de células endoteliales vasculares, relacionada con un trastorno relacionado con la apoptosis, en el que el agonista del receptor endotelial vascular de esfingosina-1-fosfato es un 1,2-aminoalcohol, una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, o una forma fosforilada del mismo, que tiene la fórmula **(Ver fórmula)** en la que R1 es una cadena carbonada sustituida o no sustituida, lineal o ramificada, que tiene de 12 a 22 átomos de carbono, y cada uno de los grupos R2, R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-6, y n es 0 o 1, y en donde la apoptosis no deseada de las células endoteliales vasculares no está relacionada con el rechazo de trasplantes.
Description
Métodos para inhibir la permeabilidad vascular y
la apoptosis.
El proceso de formación de nuevos vasos
sanguíneos se denomina angiogénesis. Durante la angiogénesis, las
células endoteliales vasculares experimentan una proliferación,
migración, y morfogénesis ordenadas, para formar nuevas redes de
capilares. Bajo condiciones normales o no patológicas, la
angiogénesis tiene lugar bajo unas condiciones bien definidas,
tales como en la cicatrización de heridas, en respuesta a la
isquemia, y durante el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo,
una angiogénesis persistente o descontrolada puede dar lugar a una
diversidad de estados o condiciones patológicas y, en el caso de los
tumores sólidos, puede ser una condición necesaria para mantener el
estado patológico.
Muchas moléculas señalizadoras extracelulares e
intracelulares interaccionan con los receptores celulares y regulan
efectos en el sistema vascular, incluyendo procesos relacionados con
la angiogénesis. La
esfingosina-1-fosfato (S1P) es un
esfingolípido bioactivo que media una amplia variedad de respuestas
celulares a través de la interacción con los miembros de la familia
de genes de diferenciación de las células endoteliales (EDG, también
conocidos como receptores S1P_{n}) de receptores acoplados a la
proteína G localizados en la membrana plasmática. Hasta la fecha se
han identificado cinco miembros de esta familia como receptores S1P
en distintos tipos de células, S1P_{1}/EDG-1,
S1P_{2}/EDG-5, S1P_{3}/EDG-3,
S1P_{4}/EDG-6 y S1P_{5}/EDG-8.
En particular, se ha demostrado que la interacción de S1P con los
receptores S1P_{1} y S1P_{3} desempeña un importante papel en
la supervivencia y morfogénesis de las células endoteliales in
vitro y que S1P_{1} es necesario para la maduración vascular
in vivo. No obstante, la S1P ejerce también potentes efectos
en otros sistemas de órganos, tales como el sistema inmunitario y
el sistema reproductor, lo que indica que es un mediador lipídico
multifuncional.
La S1P y sus receptores están implicados en la
regulación de la vascularidad. Por tanto es de desear manipular los
receptores S1P, en particular en el tratamiento de enfermedades del
sistema vascular.
La invención proporciona el uso de un agonista
del receptor de la
esfingosina-1-fosfato endotelial
vascular, una forma aceptable farmacéuticamente del mismo, o una
forma fosforilada del mismo, para la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de la apoptosis no deseada de células
endoteliales vasculares, relacionado con un trastorno relacionado
con la apoptosis, en donde el agonista del receptor de
esfingosina-1-fosfato endotelial
vascular se define en la reivindicación 1ª, y en donde la apoptosis
de células endoteliales vasculares no deseada no está relacionada
con el rechazo de trasplantes.
Haciendo ahora referencia a los dibujos, en los
que los elementos iguales están numerados de igual forma en varias
Figuras:
La Figura 1 es una gráfica de los resultados de
un ensayo de migración celular para HUVECs expuestas a FTY720 y
(R)-AAL con y sin incubación de células.
La Figura 2 es una gráfica de los resultados de
un ensayo de migración celular que demuestra que la capacidad de
las células endoteliales para activar el FTY720 y el
(R)-AAL es bloqueada por el inhibidor de la
esfingosina cinasa (SK) dimetilesfingosina (DMS).
La Figura 3 es una cromatografía en capa fina
(TLC)-autorradiografía de un ensayo de cinasa in
vitro con medio acondicionado (CM) y extracto celular total
(TCE) de HUVECs.
La Figura 4 es una
TLC-autorradiografía de un ensayo de cinasa in
vitro realizado con extractos de células 293T testigo Vector
(293T), células 293T que sobreexpresan SKI
(SK1-293T) y células 293T que sobreexpresan SK2
(SK2-293T). El número de veces de la inducción de la
actividad específica de SK1-293T (barras blancas) y
SK2-293T (barras negras) frente a 293T transfectadas
con vector se muestra en el panel del fondo.
Figura 5 es un experimento de migración con
HUVECs (barras blancas: testigo, barras negras: tratamientos con
toxina de Pertussis) usando: S1P (100 nM), FTY720-P
(FTY720-P) o (R)-AFD (la forma
fosforilada de (R)-AAL) a las concentraciones
indicadas.
La Figura 6 muestra una transferencia Western de
los niveles de fosfo-Akt, Akt total,
fosfo-ERK-½ y ERK-½ total en HUVEC después de 5
minutos de estimulación con S1P, FTY720-P
(FTY720-P), FTY720 (FTY), (R)-AFD o
(R)-AAL a las concentraciones indicadas.
La Figura 7 muestra una transferencia Western
que demuestra que el tratamiento con toxina de Pertussis previene
la fosforilación de Akt y de ERK-½ por S1P, FTY720-P
(FTY720-P) y (R)-AFD.
La Figura 8 muestra un estudio de los efectos de
FTY720-P sobre la apoptosis midiendo el porcentaje
de fragmentación del DNA después de la incorporación de
{metil-^{3}H}-timidina en células HUVEC.
La Figura 9 es un ensayo de fragmentación de DNA
que muestra que el tratamiento con toxina de Pertussis anula el
efecto protector de S1P, FTY720-P y
(R)-AFD sobre la apoptosis.
La Figura 10 es un ensayo de inmunofluorescencia
en el que C: testigo de vehículo, S1P: S1P 100 nM, FTY: FTY720 10
nM, FTY720-P: FTY720-P 10 nM, AAL:
(R)-AAL 10 nM, AFD: (R)-AFD 10 nM.
Barra de escala = 50 \mum.
La Figura 11 es una gráfica del curso de la
variación a lo largo del tiempo de la permeabilidad paracelular
inducida por VEGF: VEGF: 20 ng/mL, FTY720-P:
FTY720-P 100 nM.
La Figura 12 es una gráfica que demuestra que
S1P 100 nM (S1P), FTY720-P 100 nM
(FTY720-P) y (R)-AFD 100 nM
((R)-AFD) inhiben la permeabilidad paracelular
inducida por VEGF.
La Figura 13 muestra imágenes de fluorescencia
de un ensayo de permeabilidad vascular del oído de ratón.
La Figura 14 muestra la cuantificación de la
fluorescencia extravascular en el oído.
\vskip1.000000\baselineskip
El FTY720 es un potente inmunomodulador que ha
mostrado efectos en modelos animales de trasplante de órganos, como
se indica en las patentes de EE.UU. nº 6.486.209, 6.476.004,
6.471.980, 6.372.800, 6.274.629, 6.187.821, 6.004.565 y 5.948.820,
que se incorporan en el presente texto como referencia. Se ha
demostrado recientemente que el mecanismo de acción de este
compuesto incluye la fosforilación para dar
FTY720-P, que es un agonista para cuatro de los
cinco receptores S1P en los linfocitos T. Con anterioridad se había
demostrado que FTY720 es un potente modulador del tráfico de
linfocitos, sin embrago el efecto de FTY720 sobre elementos
vasculares era anteriormente desconocido.
Se demuestra en el presente texto que las
células endoteliales vasculares contienen sistemas de enzimas para
"activar" el FTY720 y sus análogos. Las células endoteliales
cultivadas, tales como las células endoteliales de la vena
umbilical humana (HUVEC), son sistemas modelo in vitro
aceptados para el estudio de la angiogénesis. En la incubación con
medio acondicionado de HUVEC o extractos de células, el FTY720 es
fosforilado y es capaz de activar las células endoteliales para que
migren de una manera sensible a la toxina de Pertussis, lo que
sugiere que está activando los receptores S1P acoplados a G_{i}.
Se demuestra aquí que la esfingosina cinasa-2 (SK2)
derivada de las células endoteliales está implicada en el
metabolismo de FTY720 a FTY720-P.
También se demuestra en el presente texto que
FTY720-P y su análogo (R)-AFD
activan los receptores vasculares S1P y estimulan rutas de
señalización de una manera similar a S1P. Estos eventos tienen por
resultado la inhibición de la apoptosis de las células
endoteliales, que ocurre en varias condiciones patológicas en las
que el sistema vascular es sometido a tensión. Otro efecto
fisiológicamente relevante de los agonistas del receptor S1P es la
inducción del conjunto de unión adherente en las células
endoteliales. Se demuestra también que la translocación de
VE-cadherina es inducida después de la estimulación
de S1P, FTY720-P y (R)-AFD. Las
moléculas de unión de célula con célula son un objetivo importante
de mediadores que regulan la permeabilidad vascular. S1P,
FTY720-P y (R)-AFD pueden bloquear
la permeabilidad paracelular inducida por VEGF in vitro y la
permeabilidad vascular inducida por VEGF in vivo. La
inducción del conjunto de unión adherente en células endoteliales
mediante FTY720-P y (R)-AFD puede
tener dos importantes aplicaciones in vivo. Por una parte,
puede ser parte del mecanismo de acción del FTY720. El FTY720
podría evitar la salida de linfocitos al seno linfático regulando
las uniones célula con célula en el endotelio que reviste el seno.
De hecho, el FTY720-P inhibe la migración inducida
por quimiocina de linfocitos T a través de una monocapa de células
endoteliales in vitro. Por otra parte, el FTY720 podría ser
capaz de inhibir la permeabilidad vascular en situaciones de
vasculopatía aguda, tales como en el síndrome disneico agudo que se
presenta como una complicación de la septicemia. Además, los
cambios a largo plazo en la permeabilidad vascular son una marca
característica de la lesión de células endoteliales y pueden
conducir a enfermedades crónicas comunes a la enfermedad
cardiovascular isquémica y trastornos vasculares periféricos
asociados con la diabetes. El FTY720-P es un potente
modificador del sistema vascular que puede ser usado como protector
de la integridad de las células endoteliales en situaciones en las
que estén comprometidas.
La presente invención se refiere entonces al uso
de 1,2-aminoalcoholes particulares en la preparación
de un medicamento para la inhibición de la apoptosis de las células
endoteliales vasculares. Estos agonistas de los receptores S1P
endoteliales vasculares, o una forma de los mismos aceptable
farmacéuticamente, pueden ser usados para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o
estado de respuesta a un agonista de un receptor S1P endotelial
vascular. Los receptores S1P endoteliales vasculares adecuados
incluyen, por ejemplo, S1P_{1}, S1P_{2}, S1P_{3}, S1P_{4},
S1P_{5}, y combinaciones que comprenden uno o más de los
receptores anteriores. En una realización, los receptores S1P
incluyen S1P_{1}, S1P_{3}, y combinaciones de los mismos. El
agonista de un receptor S1P endotelial vascular puede ser una sal
aceptable farmacéuticamente y/o estar fosforilado por la enzima
esfingosina-cinasa 2.
Los agonistas de los receptores S1P endoteliales
vasculares son 1,2 aminoalcoholes particulares (definidos más
adelante en la fórmula (I)), la sal aceptable farmacéuticamente de
los mismos, las formas fosforilades de los mismos, y combinaciones
que comprenden uno o más de las anteriores agonistas.
Las "formas aceptables farmacéuticamente"
de los agonistas de los receptores S1P endoteliales vasculares
citados en el presente texto incluyen sales aceptables
farmacéuticamente, hidratos, solvatos, formas cristalinas, formas
polimórficas, quelatos, complejos no covalentes, ésteres, clatratos,
profármacos, y mezclas de tales compuestos. Las sales aceptables
farmacéuticamente son una forma adecuada aceptable
farmacéuticamente.
Las "sales aceptables farmacéuticamente"
incluyen derivados de los agonistas de receptores S1P endoteliales
vasculares en los que el compuesto progenitor es modificado haciendo
sales de ácidos o bases de los mismos no tóxicas, y se refieren
además a solvatos aceptables farmacéuticamente de tales compuestos y
tales sales. Los ejemplos de sales aceptables farmacéuticamente
incluyen, pero sin limitarse a ellas, sales de ácido mineral u
orgánico de restos básicos tales como aminas; sales alcalinas u
orgánicas de restos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y
similares. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen las sales
no tóxicas convencionales y las sales de amonio cuaternario del
compuesto progenitor formado, por ejemplo, de ácidos no tóxicos
inorgánicos u orgánicos. Por ejemplo, las sales de ácido no tóxico
convencionales incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tales
como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico,
fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de
ácidos orgánicos tales como ácido acético, propiónico, succínico,
glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico,
ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético,
glutámico, benzoico, salicílico, mesílico, esílico, besílico,
sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico,
toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico,
isetiónico, HOOC-(CH_{2})_{n}-COOH en
donde n es de 0 a 4, y similares. Las sales aceptables
farmacéuticamente pueden ser sintetizadas a partir de un compuesto
progenitor, un resto básico o ácido, por métodos químicos
convencionales. Generalmente, tales sales pueden ser preparadas
haciendo reaccionar formas de ácido libre de estos compuestos con
una cantidad estequiométrica de la base apropiada (tal como
hidróxido, carbonato, bicarbonato, o similares, de Na, Ca, Mg, o K),
o haciendo reaccionar formas de base libre de estos compuestos con
una cantidad estequiométrica del ácido apropiado. Tales reacciones
se llevan a cabo típicamente en agua o en un disolvente orgánico, o
en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no
acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o
acetonitrilo, cuando es posible. Pueden encontrarse listas de otras
sales adecuadas, p. ej., en Remington's Pharmaceutical Sciences,
17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., p. 1418 (1985).
Los 1,2-aminoalcoholes tienen la
fórmula
en la que R_{1} es una cadena
carbonada sustituida o no sustituida, lineal o ramificada, que tiene
de 12 a 22 átomos de carbono, que puede estar opcionalmente
interrumpida por un grupo fenileno o fenoxi sustituido o no
sustituido; cada uno de los grupos R_{2}, R_{3}, R_{4} y
R_{5}, independientemente, es hidrógeno o alquilo
C_{1-6}; y n es 0 o 1. En una realización, los
compuestos de fórmula I son aquellos en los que R_{1} es una
cadena alquilo lineal o ramificada que tiene de 13 a 20 átomos de
carbono, opcionalmente sustituido con un grupo nitro, halógeno,
amino, hidroxi o ácido carboxílico, y más preferentemente aquellos
en los que R_{1} es (fenil)alquilo, en el que el fenilo
está sustituido con una cadena alquilo C_{6-14} o
alcoxi C_{6-14} lineal o ramificada opcionalmente
sustituida con halógeno, y el resto alquilo es un alquilo
C_{1-6} opcionalmente sustituido con hidroxi. En
una realización, R_{1} es (fenil) alquilo
C_{1-6} sustituido en el fenilo con una cadena
alquilo C_{6-14} o alkoxi
C_{6-14} lineal o ramificada. La cadena alquilo
C_{6-14} puede estar en posición orto, meta o
para. En una realización, cada uno de los grupos R_{2} a R_{5}
es
hidrógeno.
Como se usa en el presente texto, opcionalmente
interrumpido significa que una cadena alquilo puede estar
interpuesta en cualquier punto dentro de la cadena alquilo. Véase,
por ejemplo, la fórmula 2. Se usa un guión ("-") que no está
entre dos letras o símbolos, para indicar un punto de unión para un
sustituyente. Por ejemplo, (fenil)alquilo- está unido
mediante el átomo de carbono del grupo alquilo.
Como se usa en el presente texto, se entiende
que "alquilo" incluye grupos hidrocarburo alifáticos saturados,
tanto lineales como ramificados, que tienen el número de átomos de
carbono especificado. Así pues, la expresión alquilo
C_{1}-C_{6} como se usa en el presente texto
incluye grupos alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono.
Cuando se usa en el presente texto alquilo
C_{0}-C_{n} junto con otro grupo, por ejemplo,
(fenil) alquilo C_{0}-C_{4}, el grupo indicado,
en este caso el fenilo, está unido directamente por un enlace
covalente simple (C0), o bien está unido por una cadena alquilo que
tiene el número de átomos de carbono especificado, en este caso de
1 a aproximadamente 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupo
alquilo incluyen, pero sin limitarse a ellos, metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo, n-butilo,
t-butilo, n-pentilo, y
sec-pentilo. Los grupos alquilo preferidos son los
grupos alquilo inferior, aquellos grupos alquilo que tienen de 1 a
aproximadamente 8 átomos de carbono, p. ej. grupos alquilo
C_{1}-C_{8} y
C_{1}-C_{6}.
Los derivados 1,2-aminoalcohol
pueden tener uno o más centros quirales. Como resultado, se puede
preparar selectivamente un isómero óptico, incluyendo
diastereómeros y enantiómeros, sobre otro, por ejemplo mediante
materiales de partida quirales, catalizadores o disolventes, o se
pueden preparar ambos estereoisómeros o ambos isómeros ópticos,
incluyendo diastereómeros y enantiómeros a la vez (una mezcla
racémica). Como los compuestos pueden existir como mezclas
racémicas, las mezclas de isómeros ópticos, incluyendo
diastereómeros enantiómeros, o estereoisómeros, pueden ser
separadas usando métodos conocidos, tales como mediante el uso, por
ejemplo, de sales quirales y de cromatografía quiral.
Además, se reconoce que un isómero óptico,
incluyendo un diastereómero y un enantiómero, o un estereoisómero,
puede tener propiedades favorables sobre los otros. Cuando se
discute en el presente texto una mezcla racémica, se contempla
claramente que incluye ambos isómeros ópticos, incluyendo
diastereómeros y enantiómeros, o un estereoisómero sustancialmente
libre del otro.
Los compuestos de Fórmula 1 adecuados incluyen
2-amino-2-[2-(4-octafenil)etil]propano-1,3-diol,
conocido también como FTY720 (Fórmula II) y un derivado de FTY720
en el que un sustituyente de hidroximetileno es reemplazado por un
grupo metilo, también conocido como AAL o
2-amino-2-metil-4-[4-heptoxi-fenil]butano-1-ol
(Fórmula III).
In vivo, FTY-720 y AAL
pueden ser fosforilados por cinasas endógenas tales como, por
ejemplo, la SK2 cinasa, para producir compuestos de fórmulas (IV)
(FTY720-P o
2-amino-3-fosfato-2-[2-4-octafenil)etil]propano-1-ol)
y (V) ((R)-AFD o ácido
2-amino-2-metil-4-[4-heptoxi-fenil]-1-difosfórico),
respectivamente.
El agonista del receptor endotelial vascular de
esfingosina-1-fosfato puede ser
2-amino-2-[2-(4-octafenil)etil]propano-1,3-diol;
2-amino-2-metil-4-[4-heptoxi-fenil]butano-1-ol;
2-amino-3-fosfato-2-[2-4-octafenil)etil]propano-1-ol;
ácido
2-amino-2-metil-4-[4-heptoxi-fenil]1-difosfórico;
o una combinación que comprende uno o más de los agonistas
anteriores.
La invención también incluye usos de tales
1,2-aminoalcoholes en la elaboración de un
medicamento para el de tratamiento de la apoptosis no deseada de
células endoteliales vasculares, tal como un trastorno relacionado
con la apoptosis. Puede administrarse un agonista de un receptor S1P
endotelial vascular en una cantidad efectiva. La apoptosis no
deseada no está relacionada con el rechazo de trasplantes. La
apoptosis es una serie cuidadosamente controlada de acontecimientos
celulares que finalmente conduce a la muerte de la célula. Las
características morfológicas de la apoptosis incluye el
encogimiento de la célula y la pérdida del contacto célula con
célula, la condensación de la cromatina nuclear seguida por
fragmentación, la aparición del arrugamiento de la membrana, la
formación de ampollas en la membrana, y los cuerpos apoptóticos. Al
final del proceso, las células próximas y los macrófagos fagocitan
los fragmentos procedentes de la célula apoptósica. El
acontecimiento bioquímico de la apoptosis mejor definido implica la
destrucción ordenada del DNA nuclear. Las señales para la apoptosis
promueven la activación de endonucleasas específicas dependientes
del calcio y del magnesio que segmentan el DNA bicatenario en
regiones de enlazador entre nucleosomas. Este proceso tiene por
resultado la producción de fragmentos de DNA que son múltiplos de
aproximadamente 180 a aproximadamente 200 fragmentos de pares de
bases.
El descontrol de la apoptosis puede desempeñar
un importante papel en estados patológicos, y pueden producirse
enfermedades por la aparición de una apoptosis excesiva o demasiado
pequeña. Un ejemplo de una enfermedad asociada con una apoptosis
demasiado pequeña serían ciertos cánceres. Los ejemplos de
enfermedades relacionadas con la apoptosis por causa de una
apoptosis excesiva o inapropiada incluyen la enfermedad isquémica
(excluyendo la lesión por reperfusión), trombosis periférica,
enfermedad neurodegenerativa, lesión nerviosa periférica, anemia
aplásica, lesión hepática, e infección por HIV. Además, la apoptosis
endotelial es una marca característica de la terapia de radiación
que se utiliza para tratar tumores. Los agonistas del receptor S1P
pueden ser útiles para el tratamiento de pacientes que están
sometidos a terapia de radiación para proteger la función
vascular.
La apoptosis es una de las principales causas
subyacentes de la muerte de las células en la insuficiencia
cardíaca. Los ejemplos de enfermedades isquémicas incluyen
enfermedades cardíacas tales como la cardiomiopatía idiopática,
cardiomiopatía inducida por drogas (p. ej. adriamicina) o por el
alcoholismo crónico, la cardiomiopatía familiar, miocarditis o
cardiomiopatía viral, infarto cardíaco, angina cardíaca,
insuficiencia cardíaca y arritmia congestiva, y enfermedades
cerebrovasculares tales como ataque cerebral, hemorragia
subaracnoidea, infarto cerebral, y trombosis cerebral.
La apoptosis está también relacionada con varias
enfermedades neurodegenerativas. Los ejemplos de tales enfermedades
neurodegenerativas incluyen la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, esclerosis
lateral amiotrófica, y retinitis pigmentosa. El uso de un agonista
del receptor S1P endotelial vascular puede permitir la reparación
de la lesión vascular que induce daños neuronales.
Las dosis diarias para la administración de los
agonistas del receptor S1P endotelial vascular variará dependiendo,
por ejemplo, del agonista empleado, el hospedador, el modo de
administración, y la gravedad de la condición que se ha de tratar.
Una dosis diaria adecuada es de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 10 miligramos por kilogramo (mg/kg) al día, o de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 mg/kg al día, como dosis
única o en dosis divididas. Las formas de dosificación unitaria
adecuadas para administración oral comprenden de aproximadamente 1
a aproximadamente 100 mg, o de aproximadamente 5 a aproximadamente
50 mg de ingrediente activo, p. ej. de FTY720, junto con uno o más
diluyentes o vehículos aceptables farmacéuticamente. Como
alternativa, el agonista puede ser administrado en forma libre o en
forma de sal aceptable farmacéuticamente, y también puede ser
administrado dos o tres veces por semana, p. ej. en una dosis como
las indicadas anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
los agonistas del receptor S1P endotelial vascular pueden comprender
otros agentes farmacológicos adicionales que se usan en el
tratamiento de trastornos relacionados con la permeabilidad
vascular y la apoptosis de las células endoteliales vasculares. Los
agentes farmacológicos adicionales adecuados incluyen, por ejemplo,
agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, hormonas, fármacos
antiinflamatorios esteroides (p. ej. prednisona, corticoesteroides,
y similares), fármacos antiinflamatorios no esteroides (p. ej.,
NSAIDs, aspirina, acetaminofén, y similares); y combinaciones que
comprenden uno o más de los agentes farmacológicos adicionales
anteriormente citados.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser
formuladas usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente
aceptables. Así pues, los compuestos y sus sales o solvatos
aceptables fisiológicamente pueden ser formulados para
administración por inhalación o insuflación (bien sea por la boca o
por la nariz) o administración oral, bucal, parenteral o
rectal.
Para administración oral, las composiciones
farmacéuticas pueden tomar la forma, por ejemplo, de comprimidos o
cápsulas que se preparan por medios conocidos en la técnica con
excipientes aceptables farmacéuticamente tales como agentes
aglutinantes (p. ej. almidón de maíz pregelatinizado,
polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (p. ej.
lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato cálcico);
lubricantes (p. ej. estearato de magnesio, talco o sílice); agentes
desintegrantes (p. ej. almidón de patata o glicolato de almidón
sódico); agentes humectantes (p. ej. lauril sulfato sódico); y
combinaciones que comprenden uno o más de los excipientes
mencionados anteriormente. Los comprimidos pueden ser recubiertos
por métodos bien conocidos en la técnica. Los preparados líquidos
para administración oral pueden adoptar la forma, por ejemplo, de
soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un
producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo
adecuado antes de usarlo. Tales preparados líquidos pueden obtenerse
por medios convencionales con aditivos aceptables farmacéuticamente
tales como agentes de suspensión (p. ej. jarabe de sorbitol,
derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes
emulsionantes (p. ej. lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p.
ej. aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites
vegetales fraccionados); conservantes (p. ej.
p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido
sórbico); y combinaciones que comprenden uno o más de los aditivos
mencionados anteriormente. Los preparados pueden también contener
sales tampón, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes según
sea lo más apropiado.
Los preparados para administración oral pueden
ser formulados adecuadamente para dar la liberación controlada del
compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones
pueden adoptar la forma de comprimidos o tabletas formuladas
mediante técnicas conocidas en este campo. Para la administración
por inhalación, los compuestos se suministran convenientemente en
forma de una presentación en aerosol para pulverizar desde envases
presurizados o un nebulizador, con el empleo de un propulsor
adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede
determinarse proporcionando una válvula que suministre una cantidad
medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para ser
usados en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo
una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal
como lactosa o almidón. Los compuestos pueden ser formulados para
administración parenteral mediante inyección, por ejemplo mediante
inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para
inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria, por
ejemplo en ampollas, o en recipientes multidosis, con un agente
conservante incorporado. Las composiciones pueden tomar formas
tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos
oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales
como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de
polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua
estéril libre de agentes pirógenos, antes de ser usado. Los
compuestos pueden también ser formulados en composiciones rectales
tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que
contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de
cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas
anteriormente, los compuestos pueden también ser formulados como
preparado de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada
pueden ser administradas por implantación (por ejemplo subcutánea o
intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los
compuestos pueden ser formulados con materiales polímeros o
hidrófobos adecuados (por ejemplo como en una emulsión en un aceite
aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados
escasamente solubles, por ejemplo como una sal escasamente
soluble.
Como la cinasa SK2 fosforila FTY720 in
vitro e in vivo, la medida del nivel de cinasa SK2 de un
individuo puede ser usada para predecir la efectividad de un
agonista del receptor S1P endotelial vascular en el tratamiento de
la enfermedad. Por ejemplo, esta prueba puede usarse para predecir
si un individuo concreto es candidato para una terapia con FTY720.
Alternativamente, si un individuo tiene un bajo nivel de cinasa SK2,
los compuestos preferidos para administración pueden estar en una
forma fosforilada de un agonista del receptor S1P endotelial
vascular u otro agonista del receptor S1P con una estructura química
diferente.
La invención se ilustra con más detalle mediante
los siguientes ejemplos no limitantes.
Rectivos. La albúmina de suero libre de ácidos
grasos (fatty acid-free serum albumin:
ffa-BSA), la 4-desoxipiridoxina y
el \beta-glicerofosfato, el isotiocianato de
fluoresceína (FITC)-dextrano (Pm medio = 2.000
kilodaltons (kDa) y 165 kDa) fueron adquiridos en Sigma Chemical
Co. La esfingosina, N,N-dimetilesfingosina (DMS) y
S1P fueron adquiridos de Biomol Research Laboratories, Inc.
(Plymouth Meeting, Pa.). El {\gamma-^{32}P}ATP
(actividad específica 6.000 Ci/mmol) y la
{metil-^{3}H}-timidina (actividad específica 86
Ci/mmol) eran de Amersham. El FTY720, fosfo FTY720,
(S)-AAL, (R)-AAL y
fosfo-(R)-AAL fueron proporcionados por el Dr. V.
Brinkmann, Novartis. Fosfo-Akt, Akt,
fosfo-ERK½ anticuerpos ERK-½ eran de Cell Signaling
Tech., y el anticuerpo VE-cadherina era de Santa
Cruz Biotech.
Clonación de cDNA de SK1 y SK2 murina. Se usó
RNA de hígado de ratón (Ambion) para amplificar (multiplicar) el
cDNA de la espingosina cinasa murina (SK1 y SK2) mediante
transcripción inversa-PCR con los cebadores 5' SEQ
ID NO:1 (AGC CCC ATG TGG TGG TGT TGT) y SEQ ID NO:2 (ATT ATG GCC CCA
CCA CCA CTA CT), respectivamente, y los cebadores inversos SEQ ID
NO:3 (GGC ACA GAG TTA TGG TTC TTC) y SEQ ID NO:4 (AGG TCA GGC TTG
TGG CTT TTG AC), respectivamente. El producto de la PCR resultante
fue clonado en vector TOPO pcDNA3.1 (Invitrogen), y la secuencia de
DNA fue confirmada. Los cDNAs de SK1 y SK2 fueron clonados después
en vector de expresión eucariótica pcDNA3.1 (Invitrogen).
Cultivo de células y transfección. Se cultivaron
HUVEC (Clonetics, p4-11) en medio M199 suplementado
con 10% de suero bovino fetal (FBS) y factor de crecimiento de
células endoteliales estabilizado con heparina. Las células 293T en
placas de 60 mm fueron transfectadas con 4 microgramos (\mug) de
vector solo o con vectores que contienen construcciones SK por el
método del fosfato cálcico. 24 horas después de la transfección, las
células fueron recolectadas por raspado a 4ºC con 400 microlitros
(\mul) de HEPES 25 milimolar (mM) pH 7,5, MgCl_{2} 5 mM, 1
\times mezcla de inhibidor de proteasa (Calbiochem), y se
rompieron mediante un breve tratamiento de sonicación. Los
homogeneizados celulares fueron centrifugados durante 10 minutos, a
4ºC a 20.000 \times g.
Análisis estadístico. Todos los experimentos se
llevaron a cabo de dos a cinco veces, y se muestra un experimento
representativo. En los experimentos de migración y apoptosis, los
resultados representan los valores medios de triplicados. Los
valores de p fueron calculados mediante el test de la t de Student
usando software de Microsoft Excel.
\vskip1.000000\baselineskip
Como S1P es un potente inductor de la
quimiotaxis de las células endoteliales, se ensayó el efecto de
FTY720 y sus análogos sobre la migración de las células
endoteliales. La migración de HUVEC fue ensayada usando una
microcámara de quimiotaxis de 96 pocillos (Neuro Probe, Inc.) (Paik,
J. H. et al. J Biol Chem 276:11830-11837
(2001)). En forma resumida, se recubrieron filtros de policarbonato
con un tamaño de poro de 8 micrómetros (\mum) con 5 microgramos
por mililitro (\mug/ml) de fibronectina. Se diluyeron S1P, FTY720,
AAL, FTY720-P o (R)-AFD en
ffa-BSA al 0,1% a la concentración apropiada. Se
añadieron 85 \mul de las soluciones o medio acondicionado
procedente de HUVEC en la cámara inferior. Aproximadamente 5
\times 10^{4} células suspendidas en M199 con albúmina de suero
bovino al 0,1% se pusieron en el compartimiento superior. Las
células se dejaron migrar durante 4 horas a 37ºC en una cámara
humidificada con 5% de CO_{2}. Después del periodo de incubación,
el filtro fue retirado y las células se tiñeron en violeta cristal
al 0,1% y se eluyeron con ácido acético al 10%, en placas de 96
pocillos. La cuantificación se hizo basándose en la absorbancia a
575 nanómetros (nm) mediante un lector de placas Spectramax 340
(Molecular Devices).
La activación de FTY720 y
(R)-AAL por las células endoteliales se llevó a cabo
lavando las células tres veces con medio plano M199 e incubando con
BSA libre de ácidos grasos al 0,1% que contiene concentraciones
diferentes de FTY720 o (R)-AAL, durante tres
horas.
Después de la incubación, se retiró el medio
acondicionado, se centrifugó a 1.000 \times g durante 10 minutos,
y se usó en el ensayo de migración.
La Figura 1 muestra los resultados de un
experimento de migración con HUVECs (barras blancas: testigo, barras
negras: tratamiento con toxina de Pertussis) usando los siguientes
quimioatrayentes: S1P (100 nanomolar (nM)), concentraciones
variables de FTY720 (FTY) y AAL, medio acondicionado de células
endoteliales después de una incubación de 3 horas con las
concentraciones indicadas de FTY720 (FTY), (R)-AAL o
(S)-AAL. Datos = media \pm SE de valores
triplicados de un experimento representativo repetido tres veces (N
= 3). ^{*}p < 0,01 frente a testigo de vehículo, ^{#}p <
0,01 frente a células sin toxina de Pertussis.
Ni FTY720 ni su análogo estructural
(R)-AAL indujeron la migración de células
endoteliales en un amplio margen de concentración (Figura 1). Sin
embargo, cuando se incubó FTY720 o (R)-AAL con HUVEC
durante 3 horas, se activaron a potentes quimioatrayentes para las
células endoteliales. Esta migración condicionada por el medio era
dependiente de la dosis y sensible a la toxina de Pertussis, lo que
indica la implicación de un receptor acoplado a G_{i}. En cambio,
el enantiómero (S)-AAL, que no puede ser fosforilado
por la esfingosina cinasa (SK), no indujo migración después de la
incubación con células endoteliales. Estos datos son consistentes
con la hipótesis de que las células endoteliales fosforilan y
activan FTY720 y (R)-AAL a los derivados
fosforilados, que son quimioatrayentes para las células
endoteliales. La presencia de los transcriptos de la SK1 y SK2 fue
detectada en células HUVEC mediante RT-PCR usando
cebadores SEQ ID NOs: 1-4; TGGAGTATGAATGCCCCTAC,
CGCTAACCATCAATTCCCC, para SK1 y GATCACCCCTGACCTGCTAC,
GGCATCTTCACAGCTTCCTC para SK2 (datos no mostrados).
Con el fin de explorar más profundamente la
posibilidad de que SK1 y SK2 estén implicados en la fosforilación
de FTY720, se ensayó DMS, un inhibidor de SK, en relación con el
bloqueo de la conversión de FTY720 y (R)-AAL en
formas activas. La Figura 2 muestra los resultados de un experimento
de migración con HUVECs usando: S1P (100 nM) o medio acondicionado
de células endoteliales después de 3 horas de incubación con FTY720
100 nM (FTY) o (R)-AAL 100 nM en ausencia (barras
blancas) o en presencia (barras negras) de DMS 10 \muM. ^{*}p
< 0,01, DMS frente a testigo de vehículo. El tratamiento con DMS
(10 \muM inhibió de forma poderosa la capacidad de las células
endoteliales para activar FTY720 y (R)-AAL (Figura
2). Estos resultados sugieren que la actividad de SK presente en
HUVEC era capaz de fosforilar y activar tanto FTY720 como
(R)-AAL.
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar que FTY720 y
(R)-AAL son fosforilados por las células
endoteliales, se llevó a cabo un ensayo de cinasa in vitro
tanto con extracto total de células como con medio acondicionado de
HUVEC. Las células se lavaron tres veces con medio plano M199 y se
incubaron con ffa-BSA al 0,1% las veces indicadas.
Después de la incubación, el medio acondicionado se retiró, se
centrifugó a 1.000 \times g durante 10 minutos, y se usó para el
ensayo de actividad de cinasa. Las células se rasparon a 4ºC con 400
\mul de HEPES 25 mM pH 7,5, MgCl_{2} 5 nM, 1 \times mezcla
de inhibidor de proteasa, y se rompieron mediante un breve
tratamiento de sonicación. Los homogeneizados celulares se
centrifugaron durante 10 minutos a 4ºC, a 20.000 \times g. En el
ensayo de cinasa, se usaron 300 \mul de medio acondicionado
(derivado de 5 \times 10^{5} células durante 3 horas de
incubación) o 10 \mug de extracto total de células de HUVEC, como
fuente de actividad de cinasa. Las reacciones contenían esfingosina
20 \muM, o FTY720 o AAL 100 \muM,
[\gamma-^{32}P]ATP (10 \muCi),
MgCl_{2} 5 mM, NaF 15 mM, 4-desoxipiridoxina 0,5
mM, glicerofosfato 40 mM y 300 \mul de M199, y fueron incubadas a
37ºC durante 30 minutos. Los lípidos se extrajeron y las muestras se
resuspendieron en 50 \mul de cloroformo. Los lípidos fueron
resueltos mediante TLC sobre gel de sílice G60 usando tampón de
1-butanol/ácido acético/agua (60/20/20
volumen/volumen) y se cuantificaron con un aparato FosforImager
(Molecular Dynamics).
Como se muestra en la Figura 3, FTY720 y
(R)-AAL fueron fosforilados por la actividad de
cinasa presente en HUVEC (Figura 3 panel superior, actividad
específica 3,85 \pm 0,75 y 15 \pm 0,93 picomoles por miligramo
por minuto, respectivamente). Como se predijo, la esfingosina fue un
sustrato eficaz para esta actividad de cinasa (actividad específica
75,7 \pm 6 (picomoles por miligramo por minuto (pmol/mg/min)). En
cambio, la fosforilación de (S)-AAL fue
indetectable, de acuerdo con los resultados obtenidos con el ensayo
de migración. La fosforilación tanto de FTY720 como de
(R)-AAL fue inhibida por DMS (50 \muM). Del mismo
modo, se detectó actividad de cinasa en el medio acondicionado a
partir de HUVECs (Figura 3, panel inferior) y fue inhibida por
Triton X-100 y aumentada por KCl (200 mM) (datos no
mostrados), que son condiciones que favorecen la actividad
enzimática de SK.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de confirmar el papel de SK2 en la
fosforilación de FTY720 y (R)-AAL, células HEK293T
fueron transfectadas transitoriamente con un vector de expresión
pcDNA3.1/Neo que contiene cDNA de SK1 o bien de SK2, y se comprobó
la fosforilación de FTY720, (R)-AAL y
(S)-AAL. La Figura 4 muestra
TLC-autorradiografía de un ensayo de cinasa in
vitro realizado con extractos de células 293T testigo de Vector
(293T), células 293T que sobreexpresan SK1
(SK1-293T) y células 293T que sobreexpresan SK2
(SK2-293T). Testigo de vehículo = (C), FTY720 100
\muM = (F), (R)-AAL 100 \muM = (R),
(S)-AAL 100 \muM = (S) o esfingosina 20 \muM =
(SG) se usan como sustratos. Se incluyó DMS 50 \muM cuando se
indica (+). Se muestra un experimento representativo de N =
3-5. El número de veces de la inducción de
actividad específica de SK1-293T (barras blancas) y
SK2-293T (barras negras) frente a 293T transfectado
con vector se muestra en el panel inferior. Las flechas indican el
compuesto fosforilado.
Se detectaron niveles modestos de actividad de
esfingosina cinasa endógena en las células transfectadas con vector
(Figura 4). Los extractos celulares SK1 presentaron actividad de
cinasa FTY720 o (R)-AAL similar a las células 293T
testigo, mientras que la fosforilación de la esfingosina aumentó de
forma significativa en las células 293T-SK1
(actividad específica 48,1 pmol/mg/min frente a 10,5 en 293T, Figura
4). Sin embargo las células SK2-293T mostraron una
mayor actividad de cinasa FTY720 y (R)-AAL frente a
las células 293T testigo (3,7 y 7 veces más de inducción,
respectivamente). La actividad específica en
SK2-293T fue 41,6, 199,5 y 319,9 pmol/min/mg para
FTY720, (R)-AAL y esfingosina, respectivamente. La
fosforilación de (S)-AAL por las células 293T,
SK1-293T y SK2-293T fue apenas
detectable. La actividad de FTY720, (R)-AAL y
esfingosina cinasa fue bloqueda por incubación con DMS (50 \muM).
Estos resultados sugieren un papel para SK2 en la fosforilación de
FTY720y (R)-AAL, y así en la activación de estos
compuestos en agonistas del receptor S1P. Además, los resultados
indican que las HUVEC eran capaces de fosforilar y activar tanto
FTY720 como (R)-AAL presentes en el medio
extracelular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos de FTY720-P y de su
análogo (R)-AFD fueron estudiados en HUVEC. En la
Figura 5, Datos = media \pm SE de triplicados. N = 3. ^{*}p
< 0,01, tratamientos frente a testigo de vehículo, ^{#}p <
0,01 frente a células sin toxina de Pertussis. Tanto
FTY720-P como (R)-AFD eran potentes
quimioatrayentes para HUVEC (Figura 5). Ambos tenían su efecto
máximo a 10 nM (13 y 9 veces más de inducción, respectivamente),
aunque S1P era ligeramente más potente (14 veces más de inducción).
La migración inducida por FTY720-P y
(R)-AFD fue bloqueada por la toxina de Pertussis
(200 ng/mL), lo que indica que es un efecto mediado por la ruta de
la proteína G_{i} heterotrimérica.
La morfogénesis de las células endoteliales, un
fenómeno que requiere la migración, la supervivencia y la formación
del conjunto de unión adherente de las células endoteliales, está
mediada por la activación dependiente del ligando, de los
receptores S1P_{1} y S1P_{3}. Se ha demostrado que S1P induce la
fosforilación de la proteína cinasa Akt y de la proteína cinasa ERK
en las células endoteliales, y la fosforilación mediada por Akt del
receptor S1P_{1}/EDG-1 se requiere para la
migración inducida por S1P. Los efectos de FTY720-P
y análogos sobre la fosforilación de Akt y ERK en HUVEC fueron
estudiados en un análisis de transferencia Western. Cultivos
confluentes de células HUVEC fueron privadao de suero durante dos
horas en 0,1% de ffa-BSA M199 antes de los
tratamientos. Después, se lavaron con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) enfriada en hielo, que contiene fluoruro sódico 1 mM
y ortovanadato sódico 1 mM, y se homogeneizaron en tampón para
ensayos de radioinmunoprecipitación (0,1% de dodecil sulfato sódico
(SDS), 0,5% de desoxicolato sódico, 1% de NP-40,
ortovanadato sódico 1 mM, \beta-glicerofosfato 50
mM y 1 \times cóctel de inhibidor de proteasa). Las muestras
fueron centrifugadas 10.000 \times g durante 10 minutos, y se
determinó la concentración de proteína de los sobrenadantes
mediante el ensayo de Bradford (BioRad Protein Dye Reagent).
Cantidades iguales de proteína fueron separadas en un gel de 10%
de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulose. El análisis de inmunotransferencia se realizó usando
anticuerpos Fosfo-Akt, Akt,
fosfo-ERK½ o ERK-½.
Tanto FTY720-P como
(R)-AFD indujeron un aumento en los niveles de
fosforilación de Akt (3,7 y 4,5 veces más a 100 nM,
respectivamente, Figura 6) y ERK-½ (9,3 y 8,2 veces más a 100 nM,
respectivamente Figura 6) al cabo de 5 minutos. La variación con el
tiempo de esta fosforilación fue similar para
FTY720-P, (R)-AFD y S1P,
consiguiéndose los niveles máximos de fosforilación al cabo de 5
minutos de estimulación (datos no mostrados). El efecto de
FTY720-P y (R)-AFD sobre la
fosforilación de Akt y ERIC era dependiente de la dosis (datos no
mostrados) y la cuantía de la fosforilación inducida por
FTY720-P y (R)-AFD fue mayor que la
de la inducida por S1P. Sin embargo, los derivados no fosforilados,
FTY720 o AAL, no indujeron niveles de fosfo-Akt o de
fosfo-ERK-½ en las células endoteliales. La
fosforilación de Akt y ERK-1 y ERK-2
por S1P, FTY720-P y (R)-AFD fue
bloqueada por incubación con toxina de Pertussis (Figura 7), lo que
indica la implicación de un receptor acoplado a G_{i}.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que la activación de ERK-1
y ERK-2 es necesaria para el efecto de
superviviencia de S1P en las células endoteliales, se ensayó si
FTY720-P y su análogo (R)-AFD podría
evitar la apoptosis inducida por la privación de suero en HUVEC. En
esta prueba, las células HUVEC fueron marcadas con
{metil-^{3}H}-timidina (1 \muCi/ml) durante 16
horas. Después, se lavaron y se añadió ffa-BSA M199
al 0,1% que contiene los distintos tratamientos. Al cabo de 8
horas, el DNA fragmentado fue solubilizado y cuantificado como se ha
descrito.
Los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9.
FTY720-P y (R)-AFD protegieron las
células de forma significativa frente a la apoptosis de una manera
dependiente de la dosis (Figura 8), con un efecto máximo a
concentraciones extremadamente bajas - 10 nM (\sim70% de
inhibición de la fragmentación del DNA). Se observó una similar
inhibición de la fragmentación del DNA con el tratamiento de S1P
pero a una concentración más alta (1 \muM). Los efectos
anti-apoptósicos de S1P, FTY720-P y
(R)-AFD fueron también bloqueados por tratamiento
con toxina de Pertussis (Figura 9), lo que indica que la
señalización por medio de G_{i} era crucial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó el efecto de FTY720-P
y (R)-AFD sobre el conjunto
VE-cadherina, que se requiere para formar uniones
adherentes, estructuras subcelulares críticas en la morfogénesis y
la permeabilidad de las células endoteliales. Las cadherinas son
una familia de moléculas de adhesión de las células que están
implicadas en la formación de contactos de célula con célula
específicos. Se ha demostrado que la VE-cadherina (o
cadherina-5) está localizada en uniones
intercelulares (uniones adherentes) en contactos de célula a célula.
Algunas observaciones experimentales sugieren que esta cadherina
está implicada en varios aspectos de biología vascular relacionados
con la angiogénesis, incluyendo el la formación del conjunto de
células endoteliales formando estructuras tubulares.
Los efectos de FTY720-P y
(R)-AFD sobre la localización de la
VE-cadherina fueron estudiados usando análisis de
inmunofluorescencia. En este estudio, 2 \times 10^{5} células se
pusieron en placas petri inferiores de vidrio, de 35 milímetros,.
Tres días más tarde, las células se lavaron y se privaron de suero
durante 3 horas antes de los tratamientos. Después, las células se
lavaron con PBS enfriada en hielo, se fijaron, y se realizó
análisis de inmunofluorescencia con anticuerpo
VE-cadherina (1 \mug/ml Santa Cruz). La tinción
del anticuerpo primario fue visualizada con IgG
anti-ratón de cabra, conjugada con rodamina (1:1000,
Cappel). Se llevó a cabo microscopía confocal en un microscopio
confocal de barrido de láser Zeiss LSM 510. La fluorescencia de la
rodamina fue excitada usando un láser de Helio/Neón de 543 nm y la
fluorescencia emitida fue detectada con un filtro de paso largo de
530 nm.
El tratamiento de HUVEC con
FTY720-P y (R)-AFD durante 30
minutos tuvo por resultado un aumento en la localización de
VE-cadherina en las regiones de contacto de célula
con célula (Figura 10). Este efecto fue comparable con el observado
para S1P. Sin embargo, los precursores no fosforilados FTY y
(R)-AAL no indujeron translocación de
VE-cadherina a las uniones adherentes. Estos
resultados indican que FTY720-P y
(R)-AFD actúan sobre los receptores S1P vasculares
induciendo el conjunto de unión adherente en las células
endoteliales.
Diversos estudios han indicado que la
VE-cadherina podría ser un importante determinante
de la permeabilidad vascular. La fosforilación de tirosina inducida
por VEGF de VE-cadherina tuvo por resultado un
aumento de la permeabilidad vascular in vitro. Además, se
demostró que el S1P inhibe la permeabilidad paracelular inducida
por la trombina a través de un proceso dependiente de
S1P_{1}/G_{i}/Rac. Se usó un sistema celular para evaluar los
efectos de S1P, FTY720-P y (R)-AFD
sobre la permeabilidad vascular. Células endoteliales embrionarias
de ratón (5 \times 10^{4}) fueron cultivadas durante 2 días en
filtros de policarbonato Transwell (6,5 mm de diámetro, poros de
0,4 \mum; Costar). El medio de cultivo fue reemplazado con DMEM
libre de suero/rojo de fenol (tampón HEPES,
L-glutamina, e hidrocloruro de piridoxina) (0,1 mL
en la cámara superior y 0,6 mL en la cámara inferior). Las células
fueron pretratadas con FTY720, derivados o S1P durante 1 hr. Se
añadió FITC-dextrano (Pm medio = 2.000 kDa) al
compartimiento superior, en ausencia o bien en presencia de VEGF
recombinante murino (50 ng/ml). Los medios de los pocillos
inferiores se tomaron después de los periodos de tiempo indicados
(5-45 minutos). Las muestras se pusieron en placas
de 96 pocillos de fondo sólido negro (Costar) y se midieron los
valores de la intensidad de fluorescencia usando un lector de
fluorescencia de placas multi-pozos
CytoFluor(R) (Applied Biosystems) a 488 nm de excitación.
Datos = media \pm SE de duplicados. N = 2. ^{*}p < 0,01 VEGF
frente a no tratado. ^{#}p < 0,01 tratamiento + VEGF frente a
VEGF solo.
Los resultados del ensayo de permeabilidad
paracelular se muestran en las Figuras 11 y 12. Sin VEGF la
fluorescencia en el compartimiento inferior aumentó a lo largo del
tiempo (Figura 11). Sin embargo, cuando las células fueron tratadas
con VEGF, se observó un aumento significativo de la fluorescencia en
el compartimiento inferior, que era intensamente inhibida por S1P,
FTY720-P y (R)-AFD (Figura 12, se
muestra el dato correspondiente a un tiempo de 45 minutos). Estos
resultados indican que la permeabilidad paracelular inducida por
VEGF es antagonizada por los agonistas del receptor de S1P, S1P,
FTY720-P y (R)-AFD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó in vivo el papel de
FTY720-P o (R)-AFD transmitido en el
plasma, en la regulación de la permeabilidad vascular. Con el fin
de ensayar esta posibilidad, se usó un modelo de permeabilidad
vascular in vivo en ratones pretratados con FTY720,
(R)-AFD o (S)-AAL. Los ratones macho
o hembra FVB/N normales fueron tratados mediante ingestión forzada
con FTY720 (50 \mug), enantiómero S-AAL (50
\mug), enantiómero R-AAL (50 \mug) y agua como
testigo del vehículo. Cinco horas después de la ingestión forzada,
los animales fueron anestesiados con 2% de Avertin^{TM} (0,5
cc/20 g) e infundidos a través de la vena de la cola con 100 \mul
de FITC-dextrano (5 mg/ml, 165 kDa). Los animales
se pusieron en una mesa de calefacción bajo un microscopio de
disección fluorescente (Zeiss STV11, Zeiss, Inc.) y se visualizaron
los vasos centrales de los oídos. Se inyectó por vía subdérmica
solución salina testigo o factor de crecimiento endotelial vascular
de ratón (mVEGF, 10 ng/ml) en el oído medio usando una aguja de
calibre 30 (30 \mul). Después se obtuvo la imagen de la
vasculatura del oído con tiempos de exposición fijados en una
posición estacionaria de 5 minutos a 120 minutos después de la
inyección. Las imágenes de fluorescencia fueron después
cuantificadas usando el umbral basado en pixels ImageProPlus (Media
Cybernetics, Inc.) y evaluadas.
Los resultados se muestran en las Figuras 13 y
14. El pretratamiento de los ratones con una única administración
oral 5 horas antes del análisis indicó que el FTY720 suprimía
intensamente la permeabilidad vascular inducida por VEGF (Figuras
13 y 14). (R)-AAL, pero no (S)-AAL,
también inhibió poderosamente la permeabilidad vascular in
vivo. Estos datos sugieren que la fosforilación de
FTY-720 y (R)-AAL por esfingosina
cinasa in vivo y la activación de receptores S1P en las
células endoteliales tienen por resultado la inhibición de la
permeabilidad vascular inducida por VEGF.
Se ha demostrado que los agonistas de los
receptores endoteliales vasculares S1P tienen efectos sobre la
permeabilidad vascular, la apoptosis y la angiogénesis. En
particular, se ha demostrado que el FTY 720 y sus análogos son
fosforilados in vivo en formas (p. ej.
FTY720-P) capaces de unir receptores S1P
endoteliales vasculares. Los agonistas del receptor S1P endotelial
vascular pueden ser empleados en el tratamiento de los trastornos
de la permeabilidad vascular, trastornos relacionados con una
apoptosis endotelial vascular excesiva, y en el desarrollo de
nuevos vasos sanguíneos.
Aunque la invención ha sido descrita con
referencia a una realización preferida, los expertos en la técnica
han de entender que pueden realizarse varios cambios y que pueden
sustituirse equivalentes por elementos de los mismos sin apartarse
del alcance de la invención. Además, pueden hacerse muchas
modificaciones para adaptar una situación o material en particular
a las enseñanzas de la invención sin apartarse del alcance esencial
de la misma. Por consiguiente, se entiende que la invención no se
limita a la realización particular descrita como el modo mejor
contemplado para llevar a cabo esta invención, sino que la invención
incluirá todas las realizaciones que caen dentro de las
reivindicaciones anexas.
Claims (10)
1. El uso de un agonista del receptor endotelial
vascular de esfingosina-1-fosfato,
una forma aceptable farmacéuticamente del mismo, o una forma
fosforilada del mismo, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la apoptosis no deseada de células endoteliales
vasculares, relacionada con un trastorno relacionado con la
apoptosis, en el que el agonista del receptor endotelial vascular de
esfingosina-1-fosfato es un
1,2-aminoalcohol, una sal aceptable
farmacéuticamente del mismo, o una forma fosforilada del mismo, que
tiene la fórmula
en la que R_{1} es una cadena
carbonada sustituida o no sustituida, lineal o ramificada, que tiene
de 12 a 22 átomos de carbono, y cada uno de los grupos R_{2},
R_{3}, R_{4} y R_{5} son independientemente hidrógeno o
alquilo C_{1-6}, y n es 0 o 1, y en donde la
apoptosis no deseada de las células endoteliales vasculares no está
relacionada con el rechazo de
trasplantes.
2. El uso según la reivindicación 1ª, en el que
R_{1} está interrumpido por un grupo fenileno sustituido o no
sustituido.
3. El uso según la reivindicación 2ª, en el que
el agonista del receptor endotelial vascular de
esfingosina-1-fosfato es
2-amino-2-[2-(4-octafenil)etil]propano-1,3-diol;
2-amino-2-metil-4-[4-heptoxi-fenil]butano-1-ol;
2-amino-3-fosfato-2-[2-4-octafenil)etil]propano-1-ol;
ácido
2-amino-2-metil-4-[4-heptoxi-fenil]-1-difosfórico;
o una combinación que comprende uno o más de los agonistas
anteriores, o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente, o una
forma fosforilada del mismo.
4. El uso según la reivindicación 2ª, en el que
el agonista del receptor endotelial vascular de
esfingosina-1-fosfato es
fosforilado por la esfingosina cinasa-2.
5. El uso según la reivindicación 2ª, en el que
el agonista del receptor endotelial vascular de
esfingosina-1-fosfato estimula la
fosforilación de una proteína cinasa Akt, una proteína cinasa ERK o
una combinación que comprende una o más de las cinasas
anteriores.
6. El uso según la reivindicación 1ª, en el que
el receptor endotelial vascular de
esfingosina-1-fosfato es S1P_{1},
S1P_{2}, S1P_{3}, S1P_{4}, S1P_{5}, o una combinación que
comprende uno o más de los receptores anteriores.
7. El uso según la reivindicación 1ª, en el que
el trastorno relacionado con la apoptosis es cardiomiopatía
idiopática, cardiomiopatía inducida por drogas (p. ej.,
adriamicina), cardiomiopatía inducida por el alcoholismo crónico,
cardiomiopatía familiar, miocarditis viral, cardiomiopatía viral,
infarto cardíaco, angina cardíaca, trombosis periférica,
insuficiencia cardíaca congestiva, arritmia, ataque cerebral,
hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, trombosis cerebral, o
una combinación que comprende uno o más de los trastornos
anteriores.
8. El uso según la reivindicación 1ª, en el que
el trastorno relacionado con la apoptosis es la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington,
la esclerosis lateral amiotrófica, o la retinitis pigmentosa.
9. El uso según la reivindicación 3ª, en el que
el trastorno relacionado con la apoptosis es cardiomiopatía
idiopática, cardiomiopatía inducida por drogas (p. ej.,
adriamicina), cardiomiopatía inducida por el alcoholismo crónico,
cardiomiopatía familiar, miocarditis viral, cardiomiopatía viral,
infarto cardíaco, angina cardíaca, trombosis periférica,
insuficiencia cardíaca congestiva, arritmia, ataque cerebral,
hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, trombosis cerebral, o
una combinación que comprende uno o más de los trastornos
anteriores.
10. El uso según la reivindicación 3ª, en el que
el trastorno relacionado con la apoptosis es la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington,
la esclerosis lateral amiotrófica, o la retinitis pigmentosa.
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