CN105640928A

CN105640928A - Fty720在制备预防与治疗缺血性脑卒药物中的应用

Info

Publication number: CN105640928A
Application number: CN201610107863.8A
Authority: CN
Inventors: 孙秀兰; 董银凤; 陈争珍; 杨丹丹; 季娟; 徐俊
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing University; Nanjing Medical University
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2016-06-08

Abstract

本发明公开了FTY720在制备预防和治疗缺血性脑卒药物中的应用，本发明揭示pFTY720对缺血性脑损伤所致星形胶质细胞的活化增殖与炎症反应依赖于S1PR3受体，通过下游的TLR2/4受体及PI3K/NF-κB信号通路调控星形胶质细胞的炎症反应，为pFTY720对星形胶质细胞功能的调控提供新机制。

Description

FTY720在制备预防与治疗缺血性脑卒药物中的应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及FTY720在制备预防与治疗缺血性脑卒药物中的应用。

背景技术

脑卒中是全球威胁人类健康的重大疾病之一，是目前首要的致残和仅次于癌症和心血管疾病的第三大致死性疾病。流行病学显示，脑卒中发病呈年轻化和逐年递增的趋势。因此，控制脑卒中病死率并提高生存质量是当前医学研究亟待解决的难题。目前美国FDA批准用于治疗脑卒中的仅组织型纤维蛋白酶原激活剂(tPA)，由于其严格的治疗时间窗及易诱发脑出血等并发症极大地限制了其临床的广泛应用，脑卒中的药物研发仍任重道远。

脑卒中根据病因的不同主要分为缺血性和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占87％。研究揭示影响脑卒中发生、发展的主要病理机制包括能量代谢障碍、神经元的过度去极化、兴奋性毒性损伤、离子稳态失衡、炎症与免疫障碍、凋亡及自噬等。过去关注基于神经元损伤保护而研发一些药物及小分子化合物，临床前期的基础研究结果可喜，但临床研究结果不理想。因此，近年研究者提出关注脑内胶质细胞功能的调节研究，脑缺血后的炎症与免疫调节逐渐受到重视。脑缺血后的炎症反应主要表现为缺血脑区胶质细胞的激活，释放大量的炎症因子和趋化因子，随后，外周血中单核细胞向脑实质大量浸润，进一步加剧脑内的炎症反应，持续大量存在的致炎因子是促进脑缺血后神经细胞凋亡的重要因素。星形胶质细胞是脑内数量最多的胶质细胞，约占大脑总体积的50％。正常情况下，星形胶质细胞通过调节谷氨酸的摄取与释放、离子平衡以及水的转运等维持大脑内环境的稳态与神经元的存活。星形胶质细胞在脑卒中发生及病理进程中均发挥重要调节作用。研究发现，脑卒中发病的风险随年龄的增大而增加，与老化过程中星形胶质细胞的功能受损有关。脑缺血可诱导星形胶质细胞的增殖与活化，释放大量致炎因子，如HMGB1、IL-1、IL-6、TNF-α等。这些致炎因子和趋化因子，一方面加重缺血脑组织的炎症反应，促进神经元凋亡；另一方面将外周的炎性细胞和有害物质招募至脑内，加剧脑内的炎症反应、加剧血脑屏障的破坏，从而加重缺血性脑损伤。因此，研究星形胶质细胞功能的调节对脑卒中的治疗至关重要。

2-(4-正辛基苯乙基)-2-氨基丙二醇盐酸盐(FTY720)是近几年新开发的一种免疫抑制剂，它是由中药冬虫夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分ISP-I改造而成的。FTY720在体内主要通过鞘氨醇激酶-2转化成为单磷酸酯化合物(FTY720-P)，选择性作用于鞘氨醇-1-磷酸(S1P)发挥作用，结构式见下所示。FTY720除了具有自身免疫抑制作用之外，还可以与其他免疫抑制剂如环孢素A、雷帕霉素等联用而发挥更好地协调增效作用，其目前主要用于多发性硬化症的治疗。近年的研究发现FTY720除了外周免疫功能，对肿瘤、中枢神经系统疾病等均有重要的免疫调节功能。基础研究证明FTY720具有减轻脑缺血所致的神经损伤与运动功能障碍，与调节脑缺血后机体的炎症与免疫反应有关；临床研究也证实缺血后3天内给予FTY720治疗能够减轻缺血性脑卒中病人的神经损伤，并发现与促进胶质细胞营养因子的分泌有关。但对于FTY720对脑卒中防治方面的全面评估及机制研究报道较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供FTY20在制备预防与治疗缺血性脑卒药物中的应用。

技术方案：FTY720在制备预防缺血性脑卒药物中的应用，所述FTY720的结构式如下：

作为本法民的优选，在防治对象出现缺血性脑卒症状之前施用。

FTY720在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用，所述FTY720的结构式如下：

作为本发明的优选，在防治对象出现缺血性脑卒症状之后施用。

本发明发现预给低剂量(0.5mg/kg.d)FTY720连续给药1周、脑缺血再灌1小时开始及脑缺血后1天至再灌5周持续给予FTY720(2mg/kg.d)治疗能够减轻局灶性脑缺血再灌注模型大鼠的神经损伤，FTY720能够抑制缺血性脑损伤引起的星形胶质细胞的增殖与活化以及降低脑缺血诱发的致炎因子的释放。研究进一步应用原代培养的星形胶质细胞制备离体缺血缺氧模型-氧糖剥夺并给予pFTY720干预发现，pFTY720能够减轻氧糖剥夺所诱导的星形胶质细胞的炎症反应，其发挥此作用依赖于S1PR3受体，并调节炎症有关的TLR2/4受体及PI3K/NF-κB信号通路。

星形胶质细胞是脑内数目最多的胶质细胞，约占大脑总体积的50％、胶质细胞总数的90％。星形胶质细胞主要通过调节脑血流、能量代谢、离子平衡及神经递质的摄取与释放等维持大脑内环境的稳态，并且与神经元之间形成“神经-胶质”网络，从而决定神经元的存活。以往关于脑卒中的研究主要关注对神经元的保护，而忽略胶质细胞的功能。随着对胶质细胞功能的深入研究，发现胶质细胞在脑卒中的病理进程中起着不可替代的重要作用。

脑缺血后，缺血核心区由于缺血缺氧严重，星形胶质细胞死亡；而缺血半影区星形胶质细胞被激活，形态与功能发生显著改变，主要表现为胞体增大、突起缩短并增粗，同时释放大量的活性氧和炎症因子，是引起继发性损害的重要因素；至缺血后期，活化的星形胶质细胞形成胶质瘢痕，对脑缺血损伤后期的神经再生和血管新生均有重要的调节作用。星形胶质细胞对脑卒中的发生、发展及转归起重要的调节作用，甚至有学者提出神经损伤病理机制的核心部分是神经元-星形胶质细胞功能的紊乱。因此，星形胶质细胞功能的调节对脑卒中后的神经保护至关重要。

有益效果：

本发明全面评估了FTY720在缺血性脑卒中防治过程中的作用，揭示pFTY720对缺血性脑损伤所致星形胶质细胞的活化增殖与炎症反应依赖于S1PR3受体，通过下游的TLR2/4受体及PI3K/NF-κB信号通路调控星形胶质细胞的炎症反应，为pFTY720对星形胶质细胞功能的调控提供新机制，。

附图说明

图1为FTY720(0.5mg/kg.d)预给药1周再制备局灶性脑缺血再灌注模型后大鼠脑组织冠状切面TTC染色图片和神经运动功能评分结果图1A是TTC染色后的脑组织冠状切片的图片，图1B是经TTC染色后的脑梗死体积的结果统计图，图1C是大鼠的神经运动功能评分的结果统计图。

图2为大鼠脑缺血再灌注1小时后给予FTY720(2mg/kg.d)治疗24小时后脑组织冠状切面TTC染色图片和神经运动功能评分结果图2A是TTC染色后的脑组织冠状切片的图片，图2B是经TTC染色后的脑梗死体积的结果统计图，图2C是大鼠的神经运动功能评分的结果统计图。

图3为大鼠脑缺血再灌注1小时后给予FTY720(2mg/kg.d)治疗不同时间后梗死周围脑区星形胶质细胞免疫组织化学染色的结果图3A是皮层的脑梗死周围区星形胶质细胞的免疫组化染色结果，左边是免疫组化染色的典型图片，右边是GFAP染色阳性细胞的计数结果；图3B是纹状体的脑梗死周围区星形胶质细胞的免疫组化染色结果，左边是免疫组化染色的典型图片，右边是GFAP染色阳性细胞的计数结果。

图4为大鼠脑缺血再灌注1天后开始给予FTY720(2mg/kg.d)治疗持续5周后大鼠的行为学测试结果图4A是角测试的结果，图4B是圆柱体测试的结果。

图5为大鼠脑缺血再灌注1天后开始给予FTY720(2mg/kg.d)持续治疗5周后大鼠血清中炎症因子的含量图5A是HMGB1，图5A是IL-1β，图5C是MMP-9，图5D是IL-6，图5E是TNF-α。

图6原代星形胶质细胞给予FTY720磷酸盐预处理的结果图6A是OGD不同时间后星形胶质细胞的活性测定，图6B是给予不同浓度FTY720预处理经OGD造模后星形胶质细胞的活性测定，图6C是星形胶质细胞中不同S1P受体表达的mRNA水平检测，图6D通过siRNA干扰将S1PR₃表达下调并给予pFTY720预处理对星形胶质细胞活性的影响。

图7FTY720磷酸盐预处理对星形胶质细胞炎症有关的受体表达及功能影响的结果图7A受体表达的免疫印迹图片，图7BRAGE受体表达的统计结果图，图7CTLR4受体表达的统计结果图，图7DTLR2受体表达的统计结果图，图7E受体阻断后细胞的活性测定。

图8炎症信号通路相关分子免疫印迹检测的结果图8A受体表达的免疫印迹图片，图8BERK磷酸化表达的统计结果图，图8CJNK磷酸化表达的统计结果图，图8DPI3K磷酸化表达的统计结果图，图8ENF-κB表达的统计结果图。

图9FTY720磷酸盐预处理对星形胶质细胞释放炎症因子影响的结果图9A细胞上清液中HMGB1的含量，图9B细胞上清液中TNF-α的含量，图9C细胞上清液中iNOS的含量，图9D细胞上清液中IL-1β的含量，图9E细胞上清液中IL-6的含量。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

(1)预处理：大鼠腹腔注射FTY720(0.5mg/kg、2mg/kg)预给药1周后，应用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型(缺血90分钟，再灌注24小时)，通过TTC染色法计算脑梗死体积和神经运动功能评分比较FTY720预给药对大鼠缺血性脑损伤的影响，结果如图1所示。结果显示FTY720(0.5mg/kg)预给药1周能够减小大鼠缺血性脑损伤后的脑梗死体积并降低神经运动功能障碍评分，表明FTY720预防性给药对缺血性脑卒中具有神经保护作用。

(2)急性期治疗：应用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，于大鼠脑缺血90分钟再灌注1小时后，腹腔注射FTY720(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg)，通过通过TTC染色法和神经运动功能评分比较FTY720对大鼠脑缺血急性期损伤的影响，结果如图2所示；通过免疫组织化学染色法比较星形胶质细胞(GFAP)的活化与增殖的变化，结果如图3所示。结果显示，脑缺血再灌1小时后给予FTY720(2mg/kg)治疗能够减小大鼠缺血性脑损伤后的脑梗死体积、降低神经运动功能障碍评分、抑制星形胶质细胞的活化与增殖并降低炎症因子的释放，提示了FTY720对缺血性脑卒中急性期治疗的神经保护作用及对星形胶质细胞的调节。

(3)长期持续治疗：应用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，于大鼠脑缺血90分钟再灌注1小时后，腹腔注射FTY720(2mg/kg)，连续给药治疗5周，通过Cornertest(角测试)和Cylindertest(圆柱体测试)等实验观察大鼠的行为学改变，结果如图4所示；通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中的炎症相关因子包括HMGB1、IL-1β、MMP-9、IL-6和TNF-α等的含量，结果如图5所示。结果显示，脑缺血再灌1天开始给予FTY720(2mg/kg)持续治疗5周，能部分改善大鼠的神经运动功能障碍、减少致炎因子HMGB1、IL-1β和MMP-9的释放，提示了FTY720长期持续治疗对缺血性脑卒中的神经保护作用及对炎症反应的调节作用。

(4)对星形胶质细胞的调控机制：培养大鼠原代的星形胶质细胞，经培养、传代与纯化后，给予不同浓度FTY720磷酸盐(pFTY720)(0.1,、1、10、100nM)处理1h，再制备离体的缺血性脑损伤模型--氧糖剥夺与复糖复氧模型(OGD)，通过细胞活性测试-MTT法检测细胞活性的变化来确定pFTY720的有效浓度。确定有效作用浓度(10nM)之后，通过RealTime-PCR试验检测星形胶质细胞中不同S1P受体的表达水平及变化(引物序列见下表1)，初步确定pFTY720作用在星形胶质细胞的受体(S1PR3)。通过构建S1PR3的寡居核苷酸(序列见下表1)进行下调S1PR3受体的表达，再观察pFTY720预处理对OGD所致星形胶质细胞活力的影响，明确pFTY720对OGD所致星形胶质细胞损伤的保护作用依赖于S1PR3受体。为了进一步阐明作用机制，通过免疫印迹法检测pFTY720及OGD对星形胶质细胞中炎症相关受体(RAGE、TLR2/4)及信号通路分子ERK、JNK、PI3K和NF-κB表达的表达；为了更加明确pFTY720作用的炎症

相关受体信号，还应用受体拮抗剂(TLR2/4)和单克隆抗体(RAGE)阻断受体的功能，再观察pFTY720的作用效果；通过ELISA法检测细胞上清液中致炎因子HMGB1、TNF-α、iNOS、IL-1β及IL-6的含量。结果显示，pFTY720能够改善氧糖剥夺诱导的星形胶质细胞活力的降低并降低氧糖剥夺引起S1pr3mRNA的表达增高；应用小分子RNA干扰下调S1PR3受体表达之后，能够取消pFTY720的保护作用、下调氧糖剥夺引起RAGE和TLR2受体、磷酸化的PI3K、胞核中NF-κB及细胞上清中HMGB1、TNF-α和iNOS的表达增高；并且通过药物拮抗TLR2/4受体的作用之后能够取消pFTY720的保护作用。因此，研究结果表明pFTY720能够减轻氧糖剥夺诱导的星形胶质细胞损伤与炎症反应，依赖于星形胶质细胞上的S1PR3受体，并通过调节TLR2/4受体和PI3K/NF-κB炎症信号通路发挥保护作用。

表1所有S1P受体及S1PR3的寡聚核苷酸的引物序列

Gene name	Forward(5’to 3’)	Reversed(5’to 3’)
			GAPDH(rat)	GGAGACAACTGGTCCTCCAGTG	ACCTGCCAAGTATGATGACATCA
S₁PR1(rat)	TTCAGCCTCCTTGCTATCGC	AGGATGAGGGAGATGACCCAG
			S₁PR2(rat)	GACGCTGGACATGCAGGAG	TACATGGCTGAGTGGAACTT
S₁PR3(rat)	GCCACCCGCCAGTCTTG	GCCAGCTTCCCCACGTAAT
			S₁PR4(rat)	CGTTTCCAGCATCCGCAG	CCAGTCCCTTCTCACCTCTCCT
S₁PR5(rat)	CCTATGTGCTCTTCTGCGTGCTG	CGCACCTGACAGTAAATCCTTG
			S₁PR3-siRNA	CUCCAAAGGUCAAGGAAGATT	UCUUCCUUGACCUUUGGAGTT

实施例2：FTY720预处理、急性期及长期持续治疗对缺血性脑卒中模型大鼠神经损伤的影响。

(1)给药方法：

①预处理：大鼠于制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型前，腹腔注射FTY720(0.5mg/kg、2mg/kg)连续给药一周。

②急性期治疗：大鼠脑缺血90分钟，再灌1小时后腹腔注射FTY720(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg)，再灌24小时后处死大鼠。

③长期持续治疗：大鼠脑缺血90分钟，再灌1小时后腹腔注射FTY720(2mg/kg)，连续给药5周后再处死大鼠。

(2)局灶性脑缺血再灌注损伤模型制备：

将大鼠腹腔注射水合氯醛(10％，1ml/100g)进行麻醉，颈部皮肤消毒并正中切开，分离颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)，将ECA远心端结扎、离断，使ECA残端游离，在残端的近心端穿线备用，结扎CCA，在ECA靠残端处剪开，插入线栓至颈内动脉(ICA)，深度约2cm，而后固定ECA残端与线栓，缺血90min后再拔出线栓进行血流复灌。

(3)脑梗死体积的测定：

腹腔注射水合氯醛(10％)麻醉大鼠，断头处死后，迅速取出脑组织，去除嗅球、小脑及低位脑干，-20℃冻存10min。自前极(anteriorpole，AP)连续切取2mm厚度的脑组织冠状切片，置于1％的TTC溶液中，37℃孵育30min，再用4％多聚甲醛中性缓冲液(pH7.4)固定，室温过夜并避光保存。相机微距拍摄，Imageproplus5.1图像分析软件分析并计算脑梗死体积。结果如图1A-图2A所示。

(4)神经运动功能评分的分析：

采用神经功能评分法评价大鼠的神经运动功能障碍，对大鼠进行死亡率统计以及神经运动功能障碍评分。0分：正常，无明显异常体征；1分：左前肢不能完全伸展；2分：行走时向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：无自主活动并伴有反应异常；5分：死亡。结果如图1C-图2C所示。

(5)免疫组织化学染色：

大鼠经左心室分别灌注100ml的生理盐水和4％多聚甲醛，断头取脑，置于4％多聚甲醛中固定，4℃过夜。脑组织经常规梯度脱水后，石蜡包埋，在切片机(Leica，Germany)上连续切片(5μm)，收集前脑(含侧脑室)脑片，隔六取一用于实验。经二甲苯、梯度酒精脱蜡水化，PBS缓冲液洗3次，滴加3％过氧化氢(H2O2)5～10min，PBS缓冲液洗3次，每次2min。将切片浸入0.01M，PH6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波炉加热至沸腾后断电，冷却。滴加一抗(兔抗GFAP多克隆抗体)，4℃孵育过夜。0.02MPBS洗3次每次2min。加入生物素抗兔二抗，37℃孵育30min,0.02MPBS洗3次,每次2min。用二氨基联苯(diaminobenzidin，DAB)(博世德，湖北武汉)避光染色5min，观察GFAP的表达。结果如图3所示。

(6)细胞计数：

参考文献方法，随机选取每只大鼠的GFAP免疫组化染色的切片6张，并在显微镜下将每张切片随机选取6个视野，通过ImageProPlus5.0软件进行分析计算每个视野中GFAP染色呈阳性的细胞，以mm²为单位表示。结果如图3所示。

(7)大鼠的行为学检测：

分别于脑缺血再灌后第7、14、21、28、35天进行角测验(cornertest)，圆柱体测验(cylindertest)来评价大鼠的感觉运动功能。

①角测验：

将小鼠置于夹板(30×20×1cm³，两板夹角为30°)之间，面朝夹角，当小鼠进入角落深处时，双侧胡须受到刺激，会向前上攀爬，接着转身面向开场。非缺血小鼠会朝右或朝左转向，而缺血小鼠主要向非损伤的同侧(右)转向。每只小鼠记录十次完整的转向过程，计算右侧转向的百分率。本测试检测完整的感觉运动功能，包括胡须刺激(感觉)和转向(运动反应)。结果如图4A所示。

②圆柱体测验：

圆柱体测试评价小鼠前肢使用和非对称旋转。小鼠置于直径9cm高15cm的透明圆柱体内，在圆柱体之后置一面镜子使实验者在小鼠背对镜头时也能观察到其前肢运动。在小鼠放入之后，摄像机总共记录10min，观察20次运动，按以下标准记录首先触壁的前肢运动：(1)在完整的攀爬过程中单独使用的前肢；(2)同时使用左右前肢接触圆柱体壁记“B”，意为“同时”(both)；(3)在首用前肢碰壁后(如右前肢)，另一前肢也触碰壁，并且右前肢未离开，记为右前肢独立运动+B。最后评分＝(非损伤侧前肢运动-损伤侧前肢运动)/(非损伤侧前肢运动+损伤侧前肢运动+B)。结果如图4B所示。

(8)酶联免疫吸附试验：

将分离后的大鼠血清通过酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)试剂盒测定致炎因子HMGB1、IL-1β、MMP-9、IL-6和TNF-α。所有操作过程均按照试剂盒说明书进行。首先做标准曲线，预实验摸索血清的稀释倍数，再根据说明书的操作步骤完成后续检测过程。

实施例3：pFTY720对氧糖剥夺/复糖复氧所致星形胶质细胞损伤的影响。

(1)原代星形胶质细胞的培养：

购买出生1d～2d的新生SD大鼠用于实验。将出生1d～2d的新生SD大鼠浸泡于75％酒精30s；处死新生鼠，取出脑组织，在显微镜下分离皮层并剥除脑膜与血管；将脑组织剪碎，加入0.25％胰蛋白酶，在室温下，反复吹打混匀至形成混悬液；再加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基终止，吹打混匀成单细胞悬液；经200目滤网过滤，1000rpm4℃离心5min；重悬后按2.5×10⁵/cm²密度接种于细胞培养板/培养瓶中，培养于37℃，含5％CO2的细胞培养箱。24h后全量换液，以后每隔3d换液一次。培养10～12d后，在摇床上按100rpm，37℃摇4～6h，去除混杂的小胶质细胞。细胞传代应用0.25％胰蛋白酶消化3min，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基终止，1000rpm4℃离心5min，传代1～2次后再用于实验。

(2)氧糖剥夺/复糖复氧模型的建立：

将传代培养的星形胶质细胞按2.5×10⁵/cm²密度接种于6孔细胞培养板中，培养24h后，用无菌的D-Hank’s缓冲液清洗细胞2次，再将正常的完全培养基换成无血清的无糖DMEM培养基(Gibco)，并把药物pFTY720稀释到培养基中，再将细胞培养板放入密封的厌氧盒(三菱，日本)中，厌氧盒内放置耗氧试剂与PH指示带(三菱，日本)。待PH指示带显示乏氧成功后，记下乏氧的时间，再取出细胞培养板并将培养基换成正常的含10％胎牛血清的细胞培养基，继续加入药物孵育24h。

(3)MTT法测定星形胶质细胞的活力：

将传代培养的星形胶质细胞按1.0×10⁴/cm²密度接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，将正常培养基弃除，每孔加入180μl无血清的DMEM培养基和20μlMTT(50mg/ml)，继续培养4h，弃上清，每孔加入200μl二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，振荡5min，于自动酶标仪上(波长490nm)测定吸光值的大小。结果如图6A-图6B及图6D所示。

实施例4：pFTY720对氧糖剥夺/复糖复氧所致星形胶质细胞损伤保护作用靶向作用的受体与信号通路的实验研究。

(1)Real-timePCR测定星形胶质细胞S1P受体的表达变化：

将6孔细胞培养板每孔加入500μlTrizol(Invitrogen，USA)，将细胞收集于EP管中，应用Trizol裂解法提取RNA，在每管中加入1/5体积(100μl)氯仿上下剧烈颠倒混匀，室温静置10min待液体清晰分层后，4℃离心，12000rpm，10min。吸取最上层透明的液体(约300μl)至另一EP管中，再加入等体积(300)μl的异丙醇混匀，室温静置10min，4℃离心，12000rpm，10min；吸弃上清，每管加入1ml75％乙醇，-20℃沉淀至少1h。室温融化，4℃离心，12000rpm，15min；再弃去上清，加入加入1ml75％乙醇，4℃离心，12000rpm，10min；弃去上清，室温风干；每管加入10μl无RNA酶的去离子水充分溶解沉淀。逆转录体系为

10ul(根据RNA浓度计算含500ugRNA的体积，逆转录酶2ul，DEPC水补足总体积至10ul)逆转录反应的条件为：42℃15min，87℃5s，4℃forever。PCR扩增的体系为20ul(cDNA1ul，上、下游引物各1ul，ROX7ul，DEPC水10ul)，PCR反应条件为：95℃10min，95℃15sfor40cycle，60℃60s。各S1P受体及内参的引物序列见表1。检测结果见图6C。

(2)转染S1pr3寡居核苷酸下调S1PR3的表达：

将siRNA冻干粉试剂进行高速离心后(12000rpm，15min)后，加入100ulDEPC水溶解成25uM的贮存液。稀释Lipo2000：8ulLipo2000与400ulopti-MEM涡旋10s后混匀，室温静置5min；稀释siRNA:取16ul的贮存液与400ulopti-MEM涡旋10混匀，与稀释的Lipo2000溶液混匀，室温孵育20min，形成两者混合物。在静置过程中，将细胞培养液换为1176ul的新鲜培养液，待混合物静置结束后，将混合物加入相应孔内，晃动混匀做好标记，放入培养箱内。处理8h后，将培养液换为完全新鲜培养液。再正常培养40h即可。

(3)Westernblot：

星形胶质细胞OGD5h复糖复氧24h后，弃除上清，用预冷的D-Hank’s(PH7.4)缓冲液洗涤3次，加入裂解液并将细胞刮下。BCA法测定细胞总蛋白的含量。沸水煮5min使蛋白预变性。取30μg蛋白样品，用12％SDS-PAGE胶进行电泳分离，利用电转系统C(miniprotein-IIIwettransferunit，Bio-Rad，Hercules，California，USA)转至PVDF膜(Millipore，USA)。10％脱脂奶粉-TBST(pH7.5，10mMTris-HCI，150mMNaCl，0.1％Tween-20)室温封闭1h，分别使用一抗：兔抗ERK(1：1000，Abcam，USA)、兔抗磷酸化ERK(1：1000，Abcam，USA)兔抗JNK(1：1000，Abcam，USA)、兔抗磷酸化JNK(1：1000，Abcam，USA)、兔抗PI3K(1：1000，Abcam，USA)、兔抗磷酸化PI3K(1：1000，Abcam，USA)、兔抗NF-κB(1：1000，Abcam，USA)、兔抗H3(1：1000，Abcam，USA)，4℃过夜。TBST漂洗3次后，加入二抗室温孵育1h。ECL(Pierce，Thermoscientific，USA)发光底物染1min。Omega16IC全自动化学发光凝胶成像系统(Ultra-Lum，Claremont，CA，USA)显影分析。

Claims

1.FTY720在制备预防缺血性脑卒药物中的应用，所述FTY720的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在防治对象出现缺血性脑卒症状之前施用。

3.FTY720在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用，所述FTY720的结构式如下：

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在防治对象出现缺血性脑卒症状之后施用。