ES2330350T3 - Utilizacion de un antagonista del receptor de nmda para el tratamiento de tinnitus inducido por excitotoxicidad coclear. - Google Patents
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Abstract
Utilización de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con la fórmula general I ** ver fórmula** donde R 1, R 2, R 3, R 4 y R 5 son, independientemente, H, Cl, F, I, CH 3, CH 2CH 3, NH 2, OH o COOH y R 6 y R 7 son, independientemente, H, CH3, CH2CH3, OH, Cl, F o I, para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar el tinnitus inducido por excitotoxicidad coclear en un humano, caracterizado porque la composición farmacéutica es efectiva para suprimir o reducir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un humano que necesita tal tratamiento.
Description
Utilización de un antagonista del receptor de
NMDA para el tratamiento de tinnitus inducido por excitotoxicidad
coclear.
La presente invención se refiere a la
utilización de un compuesto de fórmula general I para la preparación
de una composición farmacéutica para el tratamiento del tinnitus
inducido por excitotoxicidad coclear. Más específicamente, la
presente invención se refiere a la utilización de antagonistas del
receptor de
N-metil-D-aspartato
(NMDA) de fórmula I para la preparación de una composición
farmacéutica para su administración al oído interno con el fin de
suprimir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA en el
nervio auditivo después de un caso agudo, repetido o prolongado o
crónico de excitotoxicidad coclear provocado por un incidente tal
como trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento
con una o más determinadas medicaciones ototóxicas o sordera súbita
y, con ello, bloquear el tinnitus en caso de tales incidentes.
El tinnitus, percepción de sonido sin
estimulación acústica externa, es un trastorno muy común del oído
interno. Se estima que 8,6 millones de americanos, aproximadamente
el 3 por ciento de la población de Estados Unidos, sufre tinnitus
crónico (Centers for Diseases Control and Prevention, Vital and
Health Statistics, Series 10, #200, Octubre 1999). De acuerdo con
la Asociación Americana del
Habla-Lenguaje-Audición (ASHA), un
millón o más personas indican que su tinnitus les impide llevar
una vida normal (0,3% de la población). Estudios en la población
europea estiman que entre el 7% y el 14% de la población ha
consultado con su médico acerca del tinnitus, mientras que el
tinnitus potencialmente incapacitante se presenta en aproximadamente
entre un 1% y un 2,4% de las personas (Vesterarger V., British
Medical Journal 314 (7082): 728-731 (1997)).
A pesar de la alta prevalencia del tinnitus y de
su importante impacto sobre la salud y la calidad de vida de las
personas afectadas por él, no se dispone de un tratamiento
verdaderamente efectivo. Los enfoques terapéuticos actuales
incluyen evitar las medicaciones ototóxicas, reducir el consumo de
alcohol, cafeína y nicotina, reducir el estrés, la utilización de
sonidos de fondo o enmascaradores de tinnitus útiles (algunos en
combinación con audífonos), terapias de comportamiento tales como
hipnosis, terapia cognitiva y retroalimentación, terapia de
reentrenamiento del tinnitus (TRT), terapias farmacológicas y otras
complementarias.
El tinnitus no es una enfermedad, sino un
síntoma común de diversos trastornos de la audición, al igual que
el dolor que acompaña muchas y diferentes enfermedades. Con mucha
frecuencia está asociado a la pérdida de audición inducida por
ruido, presbiacusia y la enfermedad de Ménière
(Nicolas-Puel y col., International Tinnitus
Journal 8 (1): 37-44 (2002)). Otros orígenes
menos frecuentes incluyen la exposición a fármacos ototóxicos
(antibióticos aminoglicósidos, diuréticos de asa de altas dosis,,
fármacos antiinflamatorios no esteroideos y ciertos agentes
quimioterapéuticos), flujo vascular reducido (isquemia), procesos
autoinmunes, enfermedades infecciosas, pérdida de audición
conductiva, otoesclerosis, trauma craneal, etc. En más del 90% de
los casos, el tinnitus está asociado a una pérdida de audición de
origen conocido y en más del 70% se origina dentro del oído interno
(Nicolas-Puel y col., International Tinnitus
Journal 8 (1): 37-44 (2002)).
En la década pasada, los mayores avances en la
investigación de la fisiopatología del oído interno resultaron en
la identificación del papel clave del complejo sináptico de las
células pilosas interiores en el desarrollo del tinnitus inducido
por excitotoxicidad coclear, uno de los activadores del tinnitus más
frecuentes. En general, la excitotoxicidad, descrita en primer
lugar por Olney y col., J. Neuropathol Exp. Neurol. 31 (3):
464-488 (1972), se caracteriza por una liberación
sináptica excesiva de glutamato, el neurotransmisor más importante
del sistema nervioso central, así como también del sistema auditivo.
Activa los receptores de glutamato post-sináptico
(ionotrópico y metabotrópico), los cuales conducen a la
despolarización y excitación neuronal. Sin embargo, cuando la
activación del receptor llega a ser excesiva debido a una gran
liberación de glutamato, como en el caso de excitotoxicidad, se
dañan las neuronas diana y, eventualmente, pueden llegar a morir
(Puel J.L., Prog. Neurobiol. 47(6):
449-76 (1995)).
La excitotoxicidad coclear es provocada bien por
la exposición a un ruido excesivo, tal como en el caso del trauma
acústico repetido o agudo (que conduce a una pérdida de la audición
inducida por ruido o presbiacusia), a una sordera súbita o una
anoxia/isquemia (Pujol y Puel, Ann. NY Acad. Sci.
884:249-254 (1999)) o bien por un tratamiento
con una o más determinadas medicaciones ototóxicas. La liberación de
cantidades excesivas de glutamato es inducida ya sea por la presión
excesiva del sonido que entra a la cóclea en caso de un trauma
acústico, o bien a la sordera súbita debida al flujo sanguíneo
reducido del sistema regulador de glutamato en el caso de la
anoxia/isquemia, respectivamente. En todos los casos, la
excitotoxicidad es caracterizada por un mecanismo en dos etapas:
primero, aparece una inflamación aguda de las dendritas aferentes
tipo I mediada por los receptores de glutamato ionotrópicos, lo
cual conduce a la ruptura de las estructuras
post-sinápticas y a una pérdida de la función. En
los siguientes 5 días se observa una reparación sináptica
(neo-sinaptogénesis) con una recuperación completa
o parcial de los potenciales cocleares (Puel y col., Acta
Otolaryngol. 117(2):214-218 (1997)). En
la segunda fase de la excitotoxicidad, que se puede desarrollar
después de una lesión fuerte y/o repetitiva, una cascada de eventos
metabólicos inducida por la entrada de Ca^{2+} conduce a la muerte
neuronal de las neuronas del ganglio espiral.
La excitotoxicidad coclear puede inducir
tinnitus durante el proceso de ruptura de las estructuras
post-sinápticas y, siempre que la ruptura no sea
terminal, la neo-sinaptogénesis subsiguiente en el
complejo sináptico de células pilosas internas (Pue y col.,
Audiol. Neurootol. 7 (1): 49-54 (2002)). Los
receptores NMDA juegan un papel clave en la recuperación funcional
después de la excitotoxicidad, los cuales no están involucrados en
la actividad de las fibras del nervio auditor bajo condiciones
fisiológicas (Puel y col., Audiol. Neurootol. 7(1):
49.54 (2002)), sino que son regulados durante el proceso de
neo-sinaptogénesis (Puel y col., C. R. Acad.
Sci. III. 318 (1): 67-75 (1995)), principalmente
debido a su elevada permeabilidad al calcio (Ca^{2+}) (Sattler y
Tymianski, Mol. Neurobiol. 24 (1-3):
107-129 (2001)). Como se puede demostrar en un
modelo animal de mecanismos de reparación sinápticos cocleares, el
bloqueo de los receptores de NMDA por la administración local del
antagonista D-AP5 del receptor NMDA retarda la
recuperación funcional y el nuevo crecimiento de las dendritas
auditivas (Gervais D'Aldin y col. Int. J. Dev. Neurosci. 15
(4-5): 619-629 (1997)). Así,
podría concluirse que el glutamato, además de su papel como un
neurotransmisor excitador rápido, tiene un papel neurotrófico
vía la activación de los receptores de NMDA.
Se ha establecido la hipótesis de que la
regulación del ARNm de los receptores de NMDA inducida por
excitotoxicidad coclear es la responsable del "encendido"
espontáneo anormal de las fibras del nervio auditivo, el cual puede
ser percibido como tinnitus (Puel J.-L. y col., Audiol.
Neu-rootol. 7(1): 49-54
(2002)). Durante el proceso de neo-sinaptogénesis,
las dendritas aferentes están en estado crítico y por ello pueden
ser particularmente susceptibles a la excitación por la activación
de los receptores de NMDA. Para evitar tal excitación aberrante, y
por tanto el tinnitus, que puede continuar indefinidamente debido a
una neo-sinaptogénesis incompleta, una estrategia
terapéutica intentaría la antagonización específica de los
receptores NMDA. Como se ha demostrado, la administración local de
antagonistas del receptor NMDA a la cóclea previene la
excitotoxicidad inducida por trauma acústico o isquemia (Duan y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(13):
7597-7602 (2000); Puel, Prog. Neurobiol.
47(6): 449-476 (1995); Puel y col., J.
Comp. Neurol. 341(2): 241-256 (1994) y WO
2004/022069). Mientras que la excitotoxicidad también podría
bloquearse mediante la administración de
2-amino-3-(3-hidroxi-5-metilisooxazol-4-il)propionato
(AMPA) o de antagonistas del receptor cainato, debido a que la
inflamación aguda de las dendritas aferentes tiene lugar
principalmente vía éstas (Puel y col., J. Comp. Neurol.
341(2): 241-256 (1994)), tal
procedimiento podría tener un impacto potencialmente y
significativamente negativo en la función auditiva. Debido a que la
neurotransmisión excitatoria rápida entre las células pilosas
internas y las fibras nerviosas auditivas son predominantemente
mediadas por los receptores que prefieren AMPA (Ruel y col., J.
Physiol. London 518:667-680 (1999)), su bloqueo
podría suprimir no solamente la estimulación excesiva indeseada del
nervio auditor, sino también la excitación regular deseada, y con
ello, provocar una pérdida de audición (véase también Puel y col.
(Press Medical) (Paris, Francia 1983), 13 de julio del 2002, Vol.
311, Nº 24, páginas 1137-1143).
También Simpson y col. (Trends in
Pharmacological Sciences 1999, Reino Unido, Vol. 20, nº 1, páginas
12-18) describen la utilización de anticonvulsivos,
tales como receptores de NMDA, para el tratamiento del tinnitus,
realizándose pruebas en base a las similitudes descubiertas después
de una comparación entre el tinnitus y otros estados patológicos.
Simpson y col. (1999, supra), sin embargo, evaluaron y
seleccionaron tales receptores NMDA en base a un modelo de tinnitus
inducido por salicilato.
Hasta ahora, la teórica implicación de los
receptores NMDA en la generación de tinnitus se ha probado y
demostrado solamente in vivo en un modelo de comportamiento
de tinnitus inducido por salicilato (Guitton y col., J. of
Neuroscience 23(9): 3944-3952 (2003) y
Simpson y col., Trends in Pharmacological Sciences, 1999, Reino
Unido, vol. 20, nº 1, páginas 12-18). El modelo de
comportamiento que había sido desarrollado para medir el tinnitus,
debido a que el tinnitus no es directamente observable, se basa en
el paradigma activo de la evitación: los animales se condicionan
para saltar hacia una barra cuando escuchan un sonido en particular.
La administración de salicilato condujo a un incremento
significativo en el número de saltos incluso en ausencia de sonidos
externos (falsos positivos), indicando la percepción del tinnitus.
Después de la administración de MK-801,
7-CK y gaciclidina, antagonistas de NMDA, a las
cócleas de animales vía la membrana de ventana redonda, el número
de falsos positivos disminuyó significantemente, indicando la
supresión del tinnitus (véase también Giuitton y col., Audiological
Medine, 2004, Reino Unido, vol. 2, nº 1, Marzo 2004
(2004-03), páginas 3-7).
Aunque estos resultados proporcionaron por
primera vez una confirmación de la implicación de los receptores de
NMDA, según la hipótesis, en la incidencia del tinnitus, claramente
no podían ser generalizados para todos los tipos de este trastorno
del oído interno, ya que el tinnitus inducido por salicilato es una
forma muy peculiar de tinnitus. El salicilato, componente activo de
la aspirina, se conoce desde hace más de un siglo por inducir
tinnitus cuando se toma en altas dosis (Cazals Y., Prog.
Neurobiol. 62::583-631 (2000)). Puede provocar
sensaciones similares de tinnitus como en el caso de excitotoxicidad
coclear u otros casos de origen diferente, pero normalmente es
reversible y se basa en un mecanismo molecular específico. La
administración de mefenamato, un inhibidor de la ciclooxigenasa
bien conocido, en lugar de salicilato también incrementa el número
de respuestas falso positivo, sugiriendo que el tinnitus inducido
por salicilato está relacionado con la inhibición de la vía de la
ciclooxigenasa. Mientras que el tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear es el resultado de una cascada de procesos
mediados por glutamato que conduce a la regulación del ARNm de los
receptores de NMDA, el tinnitus inducido por salicilato es mediado
por cambios en el metabolismo del ácido araquidónico (véase por
ejemplo Cazals Y., Prog. Neurobiol.
62::583-631 (2000)). Se ha demostrado que el
salicilato inhibe la actividad de la ciclooxigenasa (véase por
ejemplo Vane y Botting, Am. J. Med.
104:2S-8S (1998)). La evidencia demuestra que el
ácido araquidónico potencia las corrientes del receptor NMDA
(Miller y col., Nature 355: 722-725 (1992);
Horimoto y col., NeuroReport 7: 2463-2467
(1996); Casado y Ascher, J. Physiol. 513:
317-330 (1998)). Estudios electrofisiológicos han
demostrado que el ácido araquidónico incrementa la probabilidad de
apertura del canal del receptor NMDA en varios sistemas, incluyendo
células granulares del cerebelo, células piramidales disociadas,
neuronas corticales y placas hipocampales adultas (véase por
ejemplo Miller y col., Nature 355:722-725
(1992); Horimoto y col., NeuroReport 7:
2463-2467 (1996); Yamakura y Shimoji, Prog.
Neurobiol. 59::279-298 (1999)). Contrariamente
al tinnitus inducido por excitotoxicidad, no existe en este caso
daño morfológico en el complejo sináptico de las células pilosas del
oído interno y, en particular, en el extremo sináptico involucrado
en el tinnitus inducido por salicilato.
La Patente Estadounidense Nº 5.716.961 de Sands
describe la administración de un antagonista específico del
receptor NMDA con el propósito de tratar el tinnitus. Sus
propiedades neuroprotectoras en caso de excitotoxicidad por
glutamato se demuestran en cultivos celulares. Sin embargo, no de
demuestra la acción y la eficacia farmacológica del compuesto bajo
condiciones patofisiológicas in vivo, es decir no existe
relación con el tinnitus inducido por excitotoxicidad coclear. Esto
debe ser considerado una deficiencia seria, dadas las complejidades
del complejo sináptico de las células pilosas internas. Además,
Sands muestra la administración oral de antagonistas del receptor
NMDA, mientras que discute la administración tópica sólo en casos en
los que un paciente es incapaz de tragar o la vía de administración
oral está impedida de otro modo. No se discute específicamente la
administración tópica en forma de "soluciones, lociones,
ungüentos, pomadas y similares".
La administración sistémica de antagonistas del
receptor NMDA para tratar trastornos del oído interno normalmente
no es efectiva, debido a que la cóclea está protegida por una
barrera biológica de igual forma que el cerebro. De este modo,
podrían ser necesarias dosis relativamente elevadas para lograr el
efecto terapéutico deseado, pero los diversos fuertes efectos
secundarios de los antagonistas del receptor NMDA, tales como
reducción de aprendizaje, memoria o motilidad, restringen
significantemente las dosis máximas tolerables. Como se ha
demostrado en varios estudios con humanos relativos al tratamiento
de trastornos del SNC con antagonistas del receptor de NMDA, los
niveles plasmáticos después de la administración sistémica estaban
considerablemente por debajo de aquellos necesarios para una
neuroprotección máxima en modelos animales, ya que las dosis
clínicas tuvieron que limitarse debido los efectos potencialmente
adversos sobre el SNC, catatonIa, aumento de la presión sanguínea y
anestesia (Kemp y McKernan, Nature Neuroscience 5,
supplemento: 1039-1042 (2002)). Por otro lado,
se ha demostrado que la administración local del antagonista del
receptor NMDA-AMPA caroverina en el oído interno
resulta en concentraciones intra-cocleares mayores,
mientras que evita las altas concentraciones secundarias en el
plasma y el líquido cerebroespinal observadas con la administración
sistémica (Chen y col., Audiol. Neuroptol,
8:49-56 (2003)).
La patente estadounidense Nº 6.066.652 de Zenner
y col. describe un método para tratar el tinnitus mediante la
administración de adamantano, un conocido antagonista del receptor
de NMDA. Los inventores mencionan los resultados de un estudio
clínico de administración sistémica, indicando una reducción del
tinnitus durante el tratamiento. Las hipótesis presentadas para
explicar los resultados obtenidos se centran en las células pilosas
exteriores y la presinapsis y no abarcan específicamente el papel
de los receptores de NMDA.
Mientras que existen varias pruebas que apoyan
la hipótesis de que los receptores de NMDA juegan un papel
importante en la génesis del tinnitus inducido por excitotocicidad
coclear, la discusión anterior demuestra que los mecanismos
moleculares aún no son claros y, por tanto, no es posible predecir
de forma fiable si la utilización de antagonistas del receptor de
NMDA bloqueará efectivamente este tipo de tinnitus en particular.
Así, se requieren estudios patofisiológicos adicionales de la
generación de tinnitus para validar la hipótesis y para el
desarrollo de estrategias terapéuticas específicas y verdaderamente
efectivas.
La presente invención se refiere a la
utilización de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto de fórmula general I, tal como se define más adelante,
para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir
y/o tratar el tinnitus inducido por excitotoxicidad coclear en
humanos. Este tratamiento incluye la administración a un humano de
una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición
farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NMDA de
acuerdo con la fórmula I. El antagonista del receptor NMDA a
administrar es efectivo en la supresión o reducción de la actividad
aberrante mediada por el receptor de NMDA en el nervio auditivo en
un humano que necesita tal tratamiento. Cuando se trata de prevenir
el tinnitus, el antagonista del receptor de NMDA puede
administrarse para prevenir la actividad aberrante mediada por el
receptor de NMDA en el nervio auditivo en un humano que necesita tal
tratamiento. El tinnitus a ser prevenido y/o tratado puede estar
provocado por traumas acústicos, presbiacusia, isquemia, anoxia,
tratamiento con una o más medicaciones ototóxicas, sordera súbita u
otras circunstancias que inducen excitotoxicidad coclear.
Fig. 1: muestra las medidas de CAP 7 días
después de un trauma en animales control. Se valoró la pérdida de
audición inducida por trauma acústico, registrando mediciones de CAP
7 días después del trauma. Se observó un cambio de umbral permanente
de como máximo 13 dB \pm 2,0 a 10 kHz en el séptimo día después
del trauma acústico.
Fig. 2: ilustra la medida resultante y las
respuestas falso positivo después del trauma acústico en animales
control. (A) El trauma acústico conduce a una disminución de las
respuestas de comportamiento correctas a la estimulación por sonidos
después de una recuperación parcial con el tiempo, reflejando la
pérdida de audición inducida. (B) El número de falsos positivos
difiere sustancialmente entre animales ensayados después del trauma
acústico. Los animales del grupo 1 no experimentaron tinnitus, los
animales del grupo 2 experimentaron tinnitus sólo temporalmente,
mientras que los animales del grupo 3 experimentaron tinnitus tanto
temporal como permanentemente.
Fig. 3: ilustra que la pérdida de células
pilosas o de audición inducida por un trauma acústico no juega un
papel significativo en la generación de tinnitus. El tratamiento con
D-JNKI-1 previno la pérdida de
audición después del trauma acústico, como se demuestra en la rápida
recuperación del resultado después del trauma (A), pero no tuvo
ningún efecto significativo en la prevención del tinnitus, ya que
tanto el predominio como los patrones del tinnitus eran
esencialmente los mismos que en los animales no tratados (B).
Fig. 4: ilustra que la administración local del
antagonista de NMDA 7-CK a la membrana de ventana
redonda resultó en una prevención del tinnitus. (A) El resultado
promedio de comportamiento cayó del día 0 hasta el día 1 y se
recuperó posteriormente; sin embargo, la mejoría era más lenta que
en los animales no tratados. (B) La administración local del
antagonista de NMDA 7-CK resultó en la supresión de
tinnitus persistente inducido por excitotoxicidad coclear; solamente
se pudieron observar casos de tinnitus temporal.
Fig. 5: demuestra que la administración local de
los antagonistas de NMDA S-(+)-cetamina a la
membrana de ventana redonda resultó en una prevención del tinnitus
persistente. (A) El resultado del comportamiento promedio cayó del
día 0 hasta el día 1 y se recuperó posteriormente; sin embargo, la
mejoría era más lenta que en los animales no tratados. (B) La
administración local del antagonista de NMDA
S-(+)-cetamina resultó en una supresión del tinnitus
persistente inducido por excitotoxicidad, solamente se pudieron
observar casos de tinnitus temporal.
Fig. 6: demuestra que el trauma acústico produce
un daño morfológico sustancial en el complejo sináptico de las
células pilosas sensoriales externas (CPE) y las células sensoriales
pilosas internas (CPI), mientras que la administración de
salicilato no. La estereocilia de CPE y CPI permanece intacta
después de inyecciones de salicilato durante 2 días (6A), mientras
que aquellos animales que fueron expuestos a un trauma acústico
mostraron severos daños en los haces estereociliares de CPE, así
como también desorden, y en algunos casos incluso fusión, de
estereocilia de CPI (indicado por la flecha negra (6D). El escaso
aumento del complejo sináptico de CPI no muestra ninguna anomalía
ultraestructural en casos de tratamiento con salicilato (6B),
mientras que en los animales traumatizados se puede observar un
masivo y dramático hinchamiento (indicado por asteriscos) de las
dendritas aferentes radiales del polo basal de las CPI en el rango
de la frecuencia afectada, confirmando que se ha producido una
excitotoxicidad (6E). Se observa la presencia de numerosas vacuolas
en la parte apical de las CPI y estereocilia anormalmente formada
(indicadas por la flecha). El elevado aumento del polo CPI basal no
muestra nuevamente ninguna anormalidad en el animal tratado con
salicilato (6C). Las dos terminales nerviosas aferentes (indicadas
por a1 y a2) son normales y es claramente visible un cuerpo aferente
encarante presináptico característico a2. Por el contrario, (6F)
muestra terminales nerviosas interrumpidas hinchadas (a1) e
interrumpidas (a2) y el cuerpo encarante presináptico a2. Las barras
de la escala para A y D son de 10 \mum (microscopio electrónico de
exploración), para B y E de 5 \mum, y para C y F de 0,25 \mum
(en todos los caoso microscopía electrónica de transmisión).
Fig. 7: muestra la expresión de la subunidad NR1
del receptor NMDA coclear después de la exposición a salicilato o
trauma acústico, determinada por Inmunodetección Western blot. Como
se puede observar, el tratamiento con salicilato no indujo ninguna
modificación significativa en la expresión de la subunidad del
receptor NMDA NR1 (un 4% mayor que los animales control). Por el
contrario, el trauma acústico condujo a una clara sobreexpresión 5
días después del incidente (+50% por encima de los animales
control), lo cual concuerda con la observación de un tinnitus
persistente. Sin embargo, 24 horas después del trauma no hay
sobreexpresión detectable significativa (+8%), lo cual sugiere que
son fundamentalmente diferentes los mecanismos del tinnitus temporal
y permanente después de un trauma acústico. Se realizaron
inmunoblots del cerebro de los animales control para verificar que
el peso molecular de la subunidad NR1 es idéntico tanto en el
cerebro como en la cóclea.
La presente invención se basa en hallazgos
experimentales en un modelo animal de tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear. La invención se refiere a la utilización
de compuestos farmacéuticos de fórmula general I que actúan
específicamente como antagonistas del receptor de NMDA. Sin ceñirse
a ninguna teoría en concreto, se cree que el antagonista del
receptor de NMDA de la presente invención se une al receptor de NMDA
en uno de sus varios sitios de enlace, con ello bloquea (parcial o
completamente) la abertura del canal iónico del receptor. El
receptor de NMDA se activa de manera compleja, de forma tal que se
requiere el enlace tanto de glutamato como de glicina para abrir el
canal iónico y permitir la entrada de calcio (Kemp y McKernan,
Nature Neuroscience 5, supplement: 1039-1042
(2002)). El glutamato tiene función neurotransmisora, ya que es
liberado desde los terminales presinápticos de forma dependiente de
la actividad, mientras que la glicina actúa como modulador, estando
presente en el fluido extracelular a niveles más constantes. El
canal iónico integral al receptor de NMDA es bloqueado de forma
dependiente del voltaje con magnesio y la despolarización elimina
este bloqueo. El enlace de un antagonista del receptor de NMDA a
cualquiera de los tres sitios antagonistas resulta en un bloqueo
parcial o completo del receptor NMDA y, por tanto, bloquea o reduce
la apertura del canal iónico y la despolarización de la neurona.
Así, el antagonista del receptor de NMDA suprime la excitación
aberrante del nervio auditivo mediante la regulación de los
receptores de NMDA que pueden seguir a la excitotoxicidad coclear y
de este modo también reducen o eliminan la percepción del tinnitus.
Después de la administración del antagonista del receptor de NMDA,
ya no se regulan los receptores NMDA. Dirigiendo específicamente los
receptores de NMDA, que sólo son regulados bajo condiciones
patológicas, para suprimir la actividad aberrante mediada por el
receptor NMDA del nervio auditivo, se pueden evitar efectos
secundarios no deseados en la audición, ya que la neurotransmisión
auditiva normal principalmente es mediada por los receptores
AMPA.
\newpage
En una realización, la invención se refiere a la
utilización de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto de fórmula general I para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar el tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear en humanos. El antagonista del receptor de
NMDA de fórmula I ha de administrarse en una cantidad y por un
periodo de tiempo efectivos para suprimir o reducir la actividad
aberrante mediada por el receptor de NMDA en el nervio auditivo en
un humano que requiere tal tratamiento. La supresión o reducción de
la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio
auditivo resulta en la supresión o reducción del tinnitus en el
individuo tratado. En una realización preferente de esta
utilización, el antagonista del receptor NMDA ha de administrarse
después o durante la exposición del humano a un incidente que induce
excitotoxicidad coclear.
En otra realización, la invención se refiere a
la utilización de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto de fórmula general I para la preparación de una
composición farmacéutica para prevenir el tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear en humanos, donde el antagonista del
receptor de NMDA de fórmula I ha de administrarse en una cantidad y
por un periodo de tiempo efectivos para prevenir la actividad
aberrante mediada por el receptor de NMDA en el nervio auditivo en
un individuo que necesita tal tratamiento. La prevención de la
actividad aberrante mediada por el receptor de NMDA en el nervio
auditivo previene el tinnitus en el individuo tratado. En una
realización preferente de esta utilización, el antagonista del
receptor de NMDA ha de administrarse antes o durante la exposición
del humano a un incidente que induce excitotoxicidad coclear
potencial. Es un objeto de la presente invención la prevención y/o
el tratamiento del tinnitus inducido por excitotoxicidad coclear.
No constituye un requisito que el tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear sea provocado por cualquier tipo específico
de incidencia, sólo que la incidencia provoque una excitotoxicidad
coclear e induzca tinnitus. No es necesariamente un requisito que la
naturaleza de la incidencia sea conocida en la prevención y/o el
tratamiento del tinnitus. El tinnitus prevenido y/o tratado puede
ser agudo, subagudo o crónico.
Es conocido en el estado de la técnica que el
tinnitus resulta de una excitotoxicidad colear después un trauma
acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más
diversas medicaciones ototóxicas y/o sordera súbita. En este
documento se ilustra la prevención del tinnitus inducido por trauma
acústico. Un experto en la técnica podrá predecir con un alto grado
de certeza que los métodos aquí proporcionados podrán ser efectivos
en la prevención y/o tratamiento del tinnitus inducido no solamente
por trauma acústico, sino también por presbiacusia, isquemia,
anoxia, tratamiento con una o más diversas medicaciones y/o sordera
súbita, puesto que el tinnitus resultante de todas estas
incidencias tiene una causa mecánica común. El trauma acústico,
presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de
diversas medicaciones ototóxicas y/o sordera súbita se pueden
caracterizar como agudos, repetidos o prolongados. Un experto en la
técnica podrá predecir que el método de la presente invención podrá
ser efectivo en la prevención y/o el tratamiento del tinnitus
inducido por causas diferentes al trauma acústico, presbiacusia,
isquemia, anoxia, tratamiento con una o más medicaciones ototóxicas
y/o sordera súbita, siempre que el tinnitus sea inducido por
excitotoxicidad coclear. La excitotoxicidad coclear resultante de
tales incidencias puede ser caracterizada como aguda, repetida o
prolongada, dependiendo de la duración de la incidencia que induce
excitotoxicidad
coclear.
coclear.
El término "medicación ototóxica" tal como
se usa en el contexto de la presente invención se refiere a
cualquier compuesto caracterizado por su capacidad de inducir
tinnitus vía excitotoxicidad coclear después de la administración
terapéutica. La excitotoxicidad coclear surge como un efecto
secundario de la administración de medicaciones ototóxicas, las
cuales generalmente se administran como compuestos terapéuticos para
tratar condiciones que no se pueden relacionar con la audición o la
percepción auditiva. Las medicaciones ototóxicas caracterizadas
como tales incluyen, por ejemplo, antibióticos aminoglicósidos y
agentes quimioterapéuticos, tales como cisplatino. La relación
entre el uso de tales medicaciones ototóxicas y la excitotoxicidad
coclear y la incidencia del tinnitus es bien conocida en la
técnica; sin embargo antes de la presente invención no existía
ningún tratamiento efectivo. La utilización de muchas de tales
medicaciones queda actualmente limitada por sus efectos ototóxicos,
y como tal, un método para reducir estos efectos podría permitir el
uso más amplio de tales medicaciones como terapéuticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las formulaciones de los compuestos
farmacéuticos a ser administrados en conjunto con la utilización de
la presente invención comprenden un antagonista selectivo del
receptor NMDA de fórmula general I, más adelante, el cual se enlaza
con el receptor de NMDA ya sea en el sitio de enlace del antagonista
NMDA competitivo, en el sitio de enlace del antagonista NMDA no
competitivo dentro del canal iónico o en el sitio de glicina.
Ejemplos de compuestos incluyen la cetamina. Un antagonista de NMDA
de fórmula I, indicada más abajo, para su utilización en la
presente invención puede ser también cualquier forma enantiomérica
de un antagonista NMDA que mantiene la función de dicho antagonista
de NMDA. La composición para administración en los métodos de la
presente invención puede comprender uno o más antagonistas del
receptor NMDA de fórmula general I.
\newpage
Los antagonistas de NMDA de fórmula general I se
refieren a la clase de compuestos arilcicloalquilamina (que
retienen la función de antagonista de NMDA), definiéndose como
sigue:
donde R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4} y R_{5} son, independientemente, H, Cl, F, I, CH_{3},
CH_{2}CH_{3}, NH_{2}, OH o COOH y donde R_{6} y R_{7} son,
independientemente, H, CH_{3}, CH_{2}CH_{3}, OH, Cl, F o I,
puede ser
preferente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una arilcicloalquilamina preferente de acuerdo
con la fórmula general I es la cetamina (C_{13}H_{16}ClNO (base
libre),
2-(2-clorofenil)-2-metilamino-ciclohexanona,
cuya fórmula estructural está representada por la fórmula II:
Como antagonistas de NMDA se puede emplear
cualquier forma enantiomérica de la cetamina o de un compuesto
arilcicloalquilamina como se define en la fórmula II ó I,
respectivamente.
La cetamina es un antagonista no competitivo del
receptor NMDA que se une al sitio de enlace PCP, un sitio separado
del complejo del receptor NMDA, ubicado dentro del canal iónico,
bloqueando con ello el flujo iónico transmembranoso. La cetamina
puede proporcionarse por los métodos descritos en el documento US
3.254.124. Más específicamente, el compuesto preferente es
(S)-cetamina, debido a que se une con una afinidad
3-4 veces superior al sitio de enlace PCP del
receptor NMDA que la (R)-cetamina (Vollenweider y
col., Eur. Neuropsychopharmacol. 7:25-38
(1997)). La síntesis de los isómeros ópticos se puede llevar a cabo
tal como se describe en DE 2062620 ó WO 01/98265. En una
realización preferente de la presente invención, la cetamina puede
también ser administrada como sal clorhidrato
(C_{l3}H_{l17}Cl_{2}NO) de su forma de base libre (clorhidrato
de cetamina).
La administración a un paciente del compuesto
según la fórmula general I se puede llevar a cabo de forma oral,
intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, rectal o
tópica, aunque generalmente es preferente la administración tópica
en el oído interno, ya que las dosis terapéuticamente efectivas con
la administración sistémica pueden inducir efectos secundarios no
deseados. Un experto en la técnica reconocerá que la administración
de un antagonista de NMDA en la presente invención se puede llevar a
cabo según diversas otras formas. El único requisito para la
administración en la presente invención es, que una cantidad
terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que
comprende un antagonista de NMDA de acuerdo con la fórmula general I
sea capaz de alcanzar el sitio de la actividad aberrante mediada
por el receptor NMDA del nervio auditivo en el individuo
afectado.
La administración del compuesto según la fórmula
general I en el oído interno se puede llevar a cabo mediante
diversas técnicas de administración. Éstas incluyen el uso de
dispositivos o portadores del fármaco para transportar y/o
suministrar el compuesto de forma dirigida a la membrana de la
ventana redonda u ovalada, donde se distribuye por el oído interno,
o es activamente infundido. Ejemplos son mechas para el oído (véase
por ejemplo la patente estadounidense 6.120.484 de Silverstein),
catéteres de ventana redonda (véase por ejemplo las patentes
estadounidenses 5.421.818; 5.474.529; 5..476.446; 6.045.528, todas
de Arenberg, ó 6.377.849 y su divisional 2002/0082554 de Lenarz), o
varios tipos de geles, espumas, fibrinas u otros portadores de
fármacos, los cuales se colocan en el nicho de la ventana redonda o
en la ventana ovalada y colocan el compuesto para una liberación
sostenida (véase por ejemplo WO 97/38698 de Manning; Silverstein y
col., Otolaryngology - Head and Neck Surgery 120 (5):
649-655 (1999); Balough y col., Otolaryngology -
Head and Neck Surgery 119 (5): 427-431 (1998)).
También incluyen el uso de dispositivos que se insertan en el
conducto coclear o en cualquier otra parte de la cóclea (véase por
ejemplo la patente de Estados Unidos 6.309.410 de Kuzma). El
compuesto de fórmula general I se puede también administrar al oído
interno por inyección transtimpánica, llenándose el oído medio o
parte de éste con una solución o con otros portadores del compuesto
(véase por ejemplo Hoffer y col., Otolaryngologic Clinics of
North America 36 (2):353-358 (2003)). El método
de administración preferente al oído interno es por difusión a
través de la membrana de la ventana redonda, la cual es
relativamente fácilmente accesible desde el espacio del oído medio,
y permite que el oído interno permanezca intacto, evitando así
cualquier problema potencial de derrame de fluidos
intracocleares.
El compuesto de acuerdo con la fórmula general I
incluido en la composición farmacéutica de la presente invención
puede proporcionarse en forma de una sal farmacéuticamente
aceptable. Ejemplos de tales sales incluyen aquellas formadas con
ácidos orgánicos (por ejemplo los ácidos acético, láctico, cítrico,
málico, fórmico, tartárico, esteárico, succínico, benzoico,
metanosulfónico, toluensulfónico o pamoico), ácidos inorgánicos (por
ejemplo los ácidos clorhídrico, nítrico, difosfórico, sulfúrico o
fosfórico) y ácidos poliméricos (por ejemplo ácido tánico,
carboximetilcelulosa, poliláctico, poliglicólico o copolímeros de
ácido poliláctico-poliglicólico).
Las composiciones farmacéuticas para cualquier
vía de administración de esta invención contienen una cantidad
terapéuticamente efectiva de un compuesto según la fórmula general I
y, en caso de ser necesarios, vehículos farmacéuticamente
aceptables, inorgánicos u orgánicos, sólidos o líquidos. Las
composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración tópica
en el oído interno incluyen soluciones o suspensiones acuosas que,
por ejemplo en caso de formulaciones liofilizadas que contienen el
ingrediente activo solo o junto con el vehículo, pueden ser
preparadas antes de su uso. Además, incluyen geles que pueden ser o
no biodegradables, acuosos o no acuosos o basados en microesferas.
Ejemplos de tales geles incluyen poloxámeros, hialuronatos,
xiloglucanos, quitosanos, poliésteres, poli(láctidos),
poli(glicólidos) o sus copolímeros PLGA,
isobutirato-acetato de sacarosa y monooleato de
glicerol. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la
administración enteral o parenteral incluyen tabletas o cápsulas de
gelatina o soluciones acuosas o suspensiones según se ha descrito
anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas pueden
esterilizarse y/o pueden contener adyuvantes, por ejemplo
conservantes, estabilizantes, humectantes y/o emulsionantes, sales
para regular la presión osmótica y/o tampones. Las composiciones
farmacéuticas de la invención también pueden contener, si se desea,
sustancias farmacológicamente activas. Éstas pueden prepararse
según cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, por
ejemplo por métodos convencionales de mezcla, granulación,
confección, disolución o liofilización, y contienen aproximadamente
desde un 0,01 a un 100%, preferentemente desde aproximadamente un
0,1 al 50% (liofilizados hasta un 100%) del ingrediente activo.
En una realización preferente, la composición
farmacéutica de acuerdo con la invención se formula para su
aplicación tópica. Los vehículos adecuados para la administración en
el oído son sustancias orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente
aceptables y que no reaccionan con los componentes activos, por
ejemplo salinos, alcoholes, aceites vegetales, alcoholes de
bencilo, alquilenglicoles, polietilenglicoles, triacetato de
glicerol, gelatina, hidratos de carbono tales como lactosa o
almidón, magnesio, estearato, talco y petrolato. Las preparaciones
mencionadas pueden esterilizarse y/o contener sustancias auxiliares
como son lubricantes, conservantes tales como tiomersal (por
ejemplo al 50%), estabilizantes y/o agentes humectantes,
emulsionantes, sales para actuar sobre la presión osmótica,
sustancias tampón, colorantes y/o sustancias aromatizantes.
En caso necesario también pueden contener uno o
más de otros ingredientes activos. Las composiciones óticas de
acuerdo con la presente invención pueden comprender varios
ingredientes, incluyendo otros agentes biológicamente activos tales
como antibióticos, por ejemplo fluoroquinolonas, agentes
antiinflamatorios, por ejemplo esteroides, cortisonas, analgésicos,
antipirina, benzocaína, procaína.
Las composiciones de la presente invención para
la administración tópica pueden comprender otros ingredientes
farmacéuticamente aceptables. En las realizaciones preferentes de la
presente invención se seleccionan excipientes tópicos que no
aumentan el suministro del agente a la circulación sistémica o al
sistema nervioso central cuando se administra en el oído.
Preferentemente el excipiente tópico no tiene características
sustancialmente oclusivas que aumenten la transmisión percutánea, a
través de la mucosa, a la circulación sistémica. Tales vehículos
oclusivos incluyen bases de hidrocarburos, bases anhidras de
absorción tales como petrolato hidrofílico y lanolina anhidra (por
ejemplo Aquaphor), y bases de emulsión agua - aceite tales como
lanolina y crema hidratante. Con especial preferencia se utilizan
vehículos sustancialmente no oclusivos que incluyen, y normalmente
incluyen aquellos que son solubles en agua, como son bases de
emulsión de aceite- agua (cremas o ungüentos hidrofílicos) y bases
solubles en agua, como vehículos basados en polietilenglicol y
soluciones acuosas gelificadas con varios agentes como
metilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa (por
ejemplo gel KY).
Los excipientes y los vehículos adecuados pueden
seleccionarse de la forma habitual para un uso particular por los
expertos en la técnica y especialmente con referencia a uno o muchos
de los textos básicos del sector, tal como Remington's
Pharmaceutical Sciences, Vol. 18, Marck Publishing Co., Easton, PA
(1990), en particular el Capítulo 87. Por ejemplo, los agentes
biológicamente activos de acuerdo con la presente invención pueden
combinarse con agentes intensificadores que mejoran la penetración
de un agente.
El compuesto de acuerdo con la fórmula general I
arriba dada puede administrarse antes, durante o después de la
inducción del tinnitus por excitotoxicidad. La cantidad a
administrar puede variar en función del método de administración,
la duración de la terapia, las condiciones del sujeto a tratar, la
severidad del tinnitus y la eficacia del compuesto en particular
utilizado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud,
el sexo, la dieta, el tiempo y la vía de administración, la
velocidad de excreción y la combinación de fármacos finalmente será
decidida por el médico que atiende al paciente. La duración de la
terapia puede variar entre aproximadamente una hora y varios días,
semanas o meses y puede prolongarse hasta un tratamiento crónico.
La cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto a administrar
puede oscilar entre aproximadamente 0,1 nanogramos/hora hasta
aproximadamente 100 microgramos/hora. Las sustancias de la invención
se administran normalmente de forma análoga a otros compuestos de
administración ótica. La cetamina puede administrarse, por ejemplo
al oído en una cantidad para tratar tinnitus, preferentemente en una
dosis de aproximadamente 10 \mug/30 ml a aproximadamente 10.000
\mug/30 ml, en especial aproximadamente de 500 \mug/30 ml, o
alrededor de 0,01-2 \mug por dosis. Por el término
"dosis" para la administración tópica se quiere indicar la
cantidad de agente administrado en un solo tratamiento, por ejemplo
aproximadamente 0,05-1 \mug de cetamina
administrada en el oído en dos gotas. Otros agentes
anti-tinnitus aquí mencionados pueden administrarse
de forma análoga, teniendo en cuenta la potencia del fármaco.
Una dosis terapéuticamente efectiva se define
como una cantidad efectiva para suprimir o reducir la actividad
aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un
individuo tratado. Una dosis terapéuticamente efectiva también es
la cantidad efectiva para suprimir o reducir el tinnitus en el
individuo afectado. Como se declara anteriormente, una dosis
terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de la selección
de antagonistas NMDA específicos para el tratamiento y del método
de administración. Por ejemplo, puede ser necesaria una dosis mayor
de un antagonista NMDA según la fórmula general I administrado por
vía intravenosa que la misma composición farmacéutica administrada
localmente a la membrana de ventana redonda u ovalada del oído.
Adicionalmente, podría ser necesaria una dosis menor de un
antagonista de NMDA de fórmula general I donde el antagonista NMDA
de la presente invención se une al receptor NMDA con una afinidad
superior de enlace que un antagonista NMDA que se une con una
afinidad menor. Como resultado, son preferentes los antagonistas
NMDA con afinidades de enlace superiores para los receptores de
NMDA. Como se declara anteriormente, la
(S)-cetamina, que se une al sitio de enlace PCP del
receptor NMDA con una afinidad 3-4 veces superior
que la (R)-cetamina (Vollenweider y col., Eur.
Neuropsychopharmacol. 7; 25-38 (1997)), es un
compuesto preferente para su utilización en los métodos de la
presente invención. La duración de la terapia puede también variar
dependiendo de la forma específica de tinnitus para la cual se
desea tratamiento, aguda, subaguda o crónica. Como guía, son
preferentes duraciones más cortas de terapia y son suficientes
cuando el tinnitus no vuelve una vez la terapia ha finalizado. Se
pueden aplicar duraciones de terapia más largas para un individuo en
el cual persiste el tinnitus después una terapia corta.
La utilización según invención de los compuestos
de la fórmula I arriba revelada para tratar o prevenir el tinnitus
particularmente inducido por excitotoxicidad coclear (como se
describe en este documento) pueden permitir análogamente el uso de
una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición
farmacéutica que comprende antagonistas del receptor de NMDA de
fórmula I ventajosamente efectivo para suprimir o reducir la
actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo
en un humano, para la producción de un medicamento para el
tratamiento o la prevención del tinnitus, particularmente el
inducido por excitotoxicidad coclear. Es particularmente preferente
la utilización de un compuesto de la clase de las
arilcicloalquilaminas de fórmula general I, en especial un
antagonista del receptor NMDA seleccionado de la cetamina. Además,
es preferente la utilización de una composición farmacéutica de
acuerdo con la invención que está formulada para su aplicación
tópica, en particular como solución, gel u otra formulación de
liberación controlada, ungüento o crema o por medio de técnicas
invasivas de suministro de fármacos, respectivamente, para ser
administrado de modo tópico a través la membrana de la ventana
redonda o de la membrana de la ventana ovalada en el oído interno o
directamente dentro del oído interno.
Se desarrolló y ensayó un modelo animal de
tinnitus inducido por excitotoxicidad coclear que fue provocado por
un trauma acústico. Debido a que, en general, el tinnitus no es
directamente observable, ya que la excitotoxicidad coclear no
resulta en tinnitus en todos los individuos, y a que las
percepciones de tinnitus pueden desaparecer en pocas horas después
del incidente excitotóxico o durar para siempre, la definición e
implementación de tal modelo animal representó un reto importante.
Estas consideraciones significan, por ejemplo, que se requieren más
animales para obtener un número suficiente de casos de tinnitus para
el estudio y para permitir la observación del tinnitus durante un
tiempo. Como no queda claro si un caso de tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear dura o no, es aconsejable realizar los
estudios en sus primeras etapas.
Los experimentos se realizaron en dos etapas.
Primero se evaluó la pérdida de audición después del trauma
acústico agudo, así como también la incidencia de tinnitus sin la
administración de compuestos. En la segunda etapa, se probó la
eficacia de tres compuestos farmacéuticos para la supresión del
tinnitus: S-(+)-cetamina, un antagonista del
receptor NMDA (Sigma-Aldrich),
7-cloroquinurenato (7-CK,
Sigma-Aldrich), otro antagonista del receptor NMDA,
que fue probado previamente en un modelo de tinnitus inducido por
salicilato (Guitton y col., J. of Neuroscience 23 (9):
3944-3952 (2003)) como referencia, y
D-JNKl-1, un inhibidor peptídico de
cinasa N-terminal c-Jun (Xigen
S.A.), el cual se demostró que protege contra la muerte de las
células pilosas auditivas y la pérdida de audición debida a un
trauma acústico (Wang y col., J. of Neuroscience 23 (24):
8596-8607 (2003)). Los resultados experimentales de
la primera etapa (es decir, sin emplear compuestos farmacéuticos)
sirvieron como control.
Los experimentos se realizaron con ratas
Long-Evans por su mayor capacidad locomotora en
comparación con otras ratas. Durante los experimentos, los animales
se enjaularon individualmente a una temperatura constante con un
ciclo día/noche de 12/12 horas. Todas las pruebas de comportamiento
se realizaron en la fase oscura, el periodo usual de actividad
animal, para cada animal individualmente, en aproximadamente el
mismo momento cada día. Fuera de los experimentos, los animales
recibieron agua y comida a voluntad. Se usaron un total de 60
animales: 30 para la primera etapa (de los cuales 25 se probaron
según las técnicas de comportamiento y 5 por electrofisiología), y
30 para la segunda etapa, con 10 para cada compuesto farmacéutico
probado.
Se indujo un trauma acústico con un tono puro
continuo de 6 kHz generado por un sintetizador de forma de ondas
(Hewlett-Packard 8904A). Los animales se
anestesiaron y se expusieron a un nivel de presión acústica de 130
dB (SPL) durante 20 minutos, el cual se controló mediante un
atenuador programable, y se presentó en los oídos en campo libre
vía un audífono JBL 075 colocado 10 cm frente a la cabeza del
animal. Se midió el nivel acústico usando un micrófono calibrado
Bruel and Kjaer (4314) y un amplificador de calibración Bruel and
Kjaer (2606).
Los animales se acondicionaron para lograr la
anulación activa (Guitton y col., J. of Neuroscience 23 (9):
3944-3952 (2003)). Las pruebas de comportamiento
consistieron en la realización de una actividad siempre que se
producía un sonido en una caja de acondicionamiento con un piso
eléctrico y una barra para trepar. El acondicionamiento del animal
se logró en un total de 10 sesiones, cada una de una duración entre
15 y 20 minutos, con estímulos de acondicionamiento de un tono puro
de 50 dB SPL de 3 segundos de duración a una frecuencia de 10 kHz.
Los estímulos incondicionales consistieron en un choque eléctrico
aplicado en las patas de los animales (3,7 mA) durante un máximo de
30 segundos. Los intervalos sin estimulación fueron de 1 segundo.
Los choques eléctricos fueron detenidos por el investigador una vez
que el animal se había subido correctamente a la barra. Los
intervalos entre ensayos fueron de al menos un minuto de
duración.
El resultado se definió como el desempeño del
animal, medido por el número de casos en que se subía correctamente
a la barra en respuesta al sonido. Tan pronto como el animal había
alcanzado un resultado de al menos un 80% en tres sesiones
consecutivas, se consideraba acondicionado con éxito y se empleó en
los experimentos.
Los experimentos se realizaron diariamente con
medidas de ambos resultados y respuestas falso positivo durante una
sesión de 10 minutos con 10 ensayos en total. Las respuestas falso
positivo se llevaron al extremo entre ensayos sin ninguna
estimulación acústica, es decir durante periodos de silencio. Se
pueden interpretar como la percepción de tinnitus debido a que los
animales realizaron la tarea de subirse a la barra como si
estuvieran oyendo el estímulo (Guitton y col., J. of
Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)). Los
estímulos de sonido eran aleatorios y las descargas eléctricas en
las patas solamente se aplicaron si los animales no se subían a la
barra en respuesta al sonido.
El potencial de acción del compuesto (PAC) del
nervio auditivo se midió mediante un electrodo implantado en la
membrana de la ventana redonda de los animales (con un electrodo de
referencia colocado en un músculo del cuello). El electrodo de
referencia y el electrodo de la ventana redonda se soldaron a una
toma fija en el cráneo. Se aplicaron 10 estallidos sonoros por
segundo (con una duración de 9 ms y un ciclo aumento/descenso de 1
ms), generados por un generador de función arbitraria (LeCroy Corp.,
modelo 9100R), al oído del animal en campo libre vía un audífono
JBL 075. Se probaron 10 frecuencias (2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 26
y 32 kHz) con niveles de estallido de 0 hasta 100 dB SPL en etapas
de 5 dB. Se amplificaron las respuestas del nervio auditivo (Grass
P511K, AstroMed Inc.), se filtraron (100 Hz hasta 3 kHz) y se
promediaron en un PC (Dimension Pentium, Dell). Se midieron las
amplitudes PAC pico a pico entre la primera depresión negativa N1 y
la onda positiva subsiguiente P1. El umbral del PAC se definió como
la intensidad de sonido (en dB SPL) necesaria para estimular una
respuesta medible (mayor de 5 \muV).
Los animales se anestesiaron con una inyección
i.p. de dosis única de 0,3 ml/kg de pentobarbital al 6% (Sanofi) y
se operó bajo condiciones asépticas directamente después de la
primera prueba de comportamiento (día 0). Se abrieron dos vesículas
a través de un procedimiento quirúrgico auricular posterior
(procedimiento dorsal). Después de la exposición de las dos
cócleas, se colocó espuma de gel (Gelita tampon, B. Braun Medical
AG) impregnada con 2,5 \mul de perilinfa artificial que contenía
los compuestos farmacéuticos en cada una de las ventanas redondas
de las dos cócleas. La concentración de los tres compuestos
farmacéuticos usados era de 50 \muM. Las vesículas se cerraron
entonces con cemento dental (Unifast Trad, GC Corporation), las
heridas se desinfectaron y suturaron. Los animales fueron expuestos
después al sonido traumatizante. Las pruebas de comportamiento se
reanudaron 24 horas después del trauma acústico (día 1), y se
repitieron diariamente durante un total de 8 días.
En cada experimento de comportamiento, se
compararon los parámetros relevantes de conformidad con un análisis
de varianza bidireccional (ANOVA) (grupo x tiempo, con mediciones
repetidas en el último factor), para probar el efecto de medición
(efecto de grupo), el efecto de tiempo y las interacciones de grupo
x tiempo. Al ANOVA siguieron comparaciones post-hoc
(prueba Tukey). Los análisis estadísticos de las mediciones PAC se
hicieron de acuerdo con ANOVA de un sentido, seguidos por la prueba
Dunnett. Todos los resultados se presentaron como media \pm
SEM.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Según lo esperado, el sonido traumatizante
condujo a una pérdida de audición permanente (5 animales probados
con electrofisiología). Como se muestra en la Fig. 1, pudo
observarse un cambio permanente en el umbral de como máximo 13 dB
\pm 2,0 a 10 kHz el 7º día después del trauma acústico (el cual
ocurrió en el día 1).
El trauma acústico también condujo a la
disminución en el resultado (25 animales probados en el modelo de
comportamiento). Como se muestra en la Fig. 2A, el registro promedio
cayó significantemente del nivel inicial elevado del día 0 (es
decir, antes del trauma acústico) del 87% \pm 1,6 a un nivel bajo
del 59% \pm 1,0 al día 1, cuando se provocó el trauma acústico (p
< 0,001). Se pudo observar una recuperación funcional parcial a
partir del día 2 (69% \pm 1,2), nivelándose el día 4 en un
resultado medio del 80% \pm 2,0. Los análisis estadísticos de los
resultados demostraron que la disminución observada en el registro
es significativa (p < 0,05) también a partir del día 2 hasta el
día 8 (80% \pm 1,4 el último día). La capacidad reducida de los
animales para reaccionar correctamente a los estímulos de sonido
acondicionados concuerda con el hecho de que la pérdida de audición
provocada por el sonido traumatizante ha reducido significantemente
su capacidad para escuchar sonidos en la frecuencia de los estímulos
acústicos.
Fue interesante el encontrar que el número de
falsos positivos difería sustancialmente entre los animales
ensayados después del trauma acústico, como se muestra en la Fig.
2B. Un grupo de animales (designados como grupo 1; n = 11) no
mostró ningún incremento en el número de falsos positivos - incluso
después del trauma acústico (0,18 falsos positivos \pm 0,12 en
los días 0 y 1). Los 14 animales restantes, sin embargo, tuvieron
un incremento significativo de falsos positivos de 0,34 \pm 0,13
el día 0 a 4,28 \pm 0,22 el día 1. Este aumento resultó ser
reversible para 6 de ellos (grupo 2), cayendo de nuevo el número de
falsos positivos hasta niveles normales en el día 2 y
posteriormente. Los otros 8 animales, sin embargo, (grupo 3)
mostraron después del incremento temporal todavía otro aumento en
los falsos positivos. El máximo de falsos positivos en esta segunda
fase se observó el día 5, con 3,87 \pm 0,29, y el efecto
permaneció estadísticamente significativo hasta el día 8 (2,25
\pm 0,25 falsos positivos el último día de observación). En otras
palabras: existió primero un incremento reversible, el cual fue
seguido por un incremento permanente en el número de respuestas
falso positivo al estímulo del sonido. Esto significa que, después
del trauma acústico, algunos animales no experimentaron ningún
tinnitus (grupo 1), algunos solamente de forma temporal (grupo 2) y
algunos primero de forma temporal y después nuevamente de forma
permanente durante el resto del periodo de observaciones. Este
resultado se corresponde, en principio, con las observaciones
generales en humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Para comprobar si el mecanismo fundamental para
la generación del tinnitus por trauma acústico se relaciona con la
pérdida de células pilosas cocleares y/o con la inducción de
excitotoxicidad, se aplicó localmente
D-JNKl-1 en la membrana de la
ventana redonda. Como se muestra en la Fig. 3A, el compuesto
farmacéutico no pudo prevenir la disminución del registro desde el
día 0 (88% \pm 2,5) al día 1 (65% \pm 1,7). Sin embargo, el
tratamiento resultó en una rápida recuperación funcional completa a
niveles pre-traumáticos al día 2 (90% \pm 2,6), la
cual persistió subsecuentemente (92% \pm 2,0 al día 8).
Mientras que el
D-JNKl-1 prevenía la pérdida de
audición permanente después del trauma acústico, no tenía ningún
efecto significativo en el número de falsos positivos y, por tanto,
en la prevención del tinnitus. Como se muestra en la Fig. 3B, los
patrones de falsos positivos son casi idénticos a aquellos
observados en el grupo control (Fig. 2B): mientras que el grupo 1
(n = 4) no mostró ningún incremento (0,25 \pm 0,25 falsos
positivos en ambos días), los otros dos grupos mostraron nuevamente
un incremento estadísticamente significativo (p < 0,05) en el
número de falsos positivos desde el día 0 (0,33 \pm 0,21) al día 1
(4,66 \pm 0,42). Igual que en el grupo 2 (n = 2), el incremento
es nuevamente un incremento completamente reversible a corto plazo,
mientras que el incremento temporal en el grupo 3 (n = 4) es
nuevamente seguido por un aumento permanente en el número de falsos
positivos (3,50 \pm 0,29 falsos positivos el día 4 y 2,25 \pm
0,25 el día 8). En general, estos resultados sugieren que la
pérdida de células pilosas inducida por el trauma acústico no juega
un papel importante en la generación del tinnitus y señala la
excitotoxicidad coclear como mecanismo en su base.
La aplicación local de dos antagonistas del
receptor NMDA 7CK y S-(+)-cetamina proporcionó
resultados que fueron muy similares entre sí. Como se muestra en la
Fig. 4A y 5A, el registro promedio cayó de modo significativo a
partir del día 0 al día 1 y después se recuperó, sin embargo a una
velocidad más lenta que en los animales no tratados. Al contrario
que los animales no tratados, la estabilización del registro se
produjo en los grupos de animales tratados con los antagonistas del
receptor NMDA solamente en el día 6 (89% \pm 2,3 y 88% \pm 2,5
para animales tratados con S-(+)-cetamina y
7-CK respectivamente). Una posible explicación de
esta diferencia puede ser que el bloqueo (parcial) de los
receptores NMDA se debe a una neosinaptogénesis retardada, pudiendo
tener un efecto neurotrófico y así retardar la recuperación
funcional.
Por otro lado, la administración de los dos
antagonistas NMDA tiene un impacto sustancial en el número de
falsos positivos (Fig. 4B y 5B). A diferencia de los animales no
tratados o aquellos tratados con
D-JNKl-1, no pudo observarse ningún
grupo en el que se presentara un incremento permanente del número de
respuestas falso positivo después de un incremento temporal
inicial. No hubo tampoco ningún incremento de falsos positivos
(grupo 1; n= 5 y n = 4 para animales tratados con
S-(+)-cetamina y 7CK, respectivamente), donde los
positivos falsos de 0,22 \pm 0,22 se observaron en los días 0 y
1, o solo el incremento reversible directamente después del trauma
acústico (grupo 2; n = 5 y n= 6 para animales tratados con cetamina
y 7-CK, respectivamente), aumentando el número de
falsos positivos desde 0,2 \pm 0,2
(S-(+)-cetamina) y 0,33 \pm 0,21
(7-CK) al día 9 a 5 \pm 0,48
(S-(+)-cetamina) y 4,66 \pm 0,42
(7-CK) en el día 1. Así, no se pudo observar el
comienzo de un tinnitus persistente después del incidente de
tinnitus temporal. Estos resultados demuestran que la administración
local de antagonistas del receptor NMDA a la cóclea suprime el
tinnitus persistente inducido por excitotoxicidad coclear.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar los diferentes mecanismos del
tinnitus inducido por salicilato y excitotoxicidad, se realizaron
análisis morfológicos comparativos de las estructuras
senso-neurales cocleares, así como también de
inmunodetección Western blot después de los dos diferentes tipos de
incidentes que inducen tinnitus.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos grupos de 3 ratas Long Evans se trataron
cada uno dos veces al día con una inyección intraperitoneal de 350
mg/kg de salicilato sódico durante 2 días o se sometieron a un
trauma como se describe en el Ejemplo 1. Después de la decapitación
de las ratas bajo anestesia profunda (pentobarbital 50 mg/kg), se
extrajeron las cócleas del hueso temporal y se perfundieron con una
solución fijadora al 2,5% de glutaraldehído en una solución tampón
0,1M salina con fosfato (PBS), pH 7,3. Después se procesaron, ya sea
por microscopía de exploración (SEM) o transmisión (TEM)
electrónica. Para SEM, la cápsula ótica se disectó y se retiraron la
estría vascular, las membranas tectoriales y de Reissner. Después
de lavar con PBS (pH 7,3), se deshidrataron las muestras en series
graduadas de etanol (30-100%), punto de secado
crítico en CO_{2}, se revistieron con paladio dorado y se
examinaron con un microscopio Hitachi S4000. Para TEM, las cócleas
se post-fijaron en una solución acuosa al 1% de
tetróxido de osmio durante 2 horas, se enjuagaron en un tampón
fosfato, se deshidrataron en series graduadas de etanol
(30-100%) y se embebieron en resina Epon. Las
secciones ultradelgadas transversas del órgano de Corti se tomaron
de la mitad apical de la cóclea. Las secciones montadas en rejillas
de malla o revestidas con formvar, se tiñeron con acetato de
uranilo y citrato de plata y se examinaron con un microscopio
Hitachi 7100.
\vskip1.000000\baselineskip
Tres grupos de 3 ratas Long Evans cada uno se
trataron cada uno dos veces durante 24 horas con una inyección
intraperitoneal de 350 mg/kg de salicilato de sodio o se
traumatizaron como se describe anteriormente. Se sabe que la dosis
de salicilato usada induce tinnitus (Guitton y col., J. of
Neurosciences 23 (9): 3944-3952 (2003)). Otro
grupo de 3 animales sirvió como control y se le inyectó vía i.p. una
solución al 0,9% de NaCl en el mismo volumen que los animales
tratados con salicilato. Las muestras se obtuvieron después de 24
horas de los grupos de salicilato y los grupos control y 24 horas
respectivamente 5 días después del incidente para el grupo de
trauma acústico. Como se ha demostrado en el Experimento 1, el
tinnitus temporal se presentó 24 horas después del trauma y se pudo
observar un tinnitus persistente a partir del tercer día; por tanto,
se puede esperar que el tinnitus persistente esté presente el día
5. Debido a que el salicilato no puede inducir un tinnitus
persistente, no se puede esperar que cualquier tratamiento y medida
más allá de 24 horas proporcione resultados diferentes de aquellos
después de 24 horas.
Los tejidos se cultivaron en PBS frío y se
homogenizaron en una solución tampón de muestra, y los lisados se
centrifugaron para eliminar el material no soluble en detergente y
se separaron con SDS-PAGE al 10% en Tris/Tricina.
Después de una electroforesis en gel, se transfirieron las proteínas
electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (membrana de
transferencia PVDF Hybond-P, Amersham Pharmacia
Biotech, EE.UU). En primer lugar se incubaron los Blots con un
anticuerpo primario contra la subunidad del receptor NMDA NR1
(dilución 1/100; anticuerpo policlonal de conejo, Chemicon
international, EE.UU), y con una anti-actina del
anticuerpo primario (dilución 1/50.000,
anti-\beta-actina monoclonal de
ratón, Sigma, EE.UU) durante la noche a 4ºC. Para verificar que el
peso molecular de la subunidad NR1 es idéntico tanto en el cerebro
como en la cóclea, se realizaron inmuno blots del cerebro de los
animales control. Después, se incubó a 4ºC durante 2 horas usando
anticuerpos anti-ratón IgG, anticuerpo completo
específico de especies biotiniladas (1/3.500, Amersham Lifescience,
EEUU) y IgG anti-conejo, anticuerpo completo
específico de especies biotiniladas, IgG anti-ratón
(1/3500, Amersham Lifescience, EEUU.). Después, se hicieron lavados
5 x 10 min con TBS-T (Tampón Tris
salino-Tween), se procedió a la incubación a 4ºC
durante 2 horas usando conjugado de fosfatasa alcalina de
estreptavidina (1/5.000, Amersham Lifescience, EEUU). Los complejos
proteína-anticuerpo se revelaron con BClP/NBT
(Sigma, USA). Después se realizó la exploración de imagen Western
blot para la semi-cuantificación de los niveles de
expresión de las proteínas NR1 y actina usando un software de Biorad
Fluor-S (Quantity one).
\vskip1.000000\baselineskip
Los mecanismos fundamentales del tinnitus
inducido por salicilato y excitotoxicidad implican, según lo
esperado, diferentes trayectorias y proporcionan diferentes
resultados morfológicos y fisiológicos. Como se muestra en la Fig.
6, la administración de salicilato deja intacta la estereocilia de
las células pilosas externas sensoriales (CPE) y de las células
pilosas internas (CPI), mientras que aquellos animales que se
expusieron a un trauma acústico muestran un daño severo en los
haces estereociliarios de las CPE, así como también desorden y, en
algunos casos incluso estereocilia IHC fusionada. No se pueden
observar anomalías ultraestructurales del complejo sináptico IHC en
caso de tratamiento con salicilato, mientras que en los animales
traumatizados es evidente un engrosamiento masivo y dramático de
las dendritas aferentes radiales en el polo basal del IHC en la
zona del rango de frecuencia afectado, lo que confirma que ha
aparecido excitotoxicidad. Aparecen numerosas vacuolas en la parte
apical del IHC y una estereocilia formada anormalmente. El aumento
elevado del polo IHC basal nuevamente no muestra ninguna anomalía
en el animal tratado con salicilato. Los terminales del nervio
aferente son normales y es claramente visible un anticuerpo
presináptico característico. Contrario a esto, después del trauma
aparecen terminales del nervio engrosados e interrumpidos.
La Fig. 7 muestra la expresión de la subunidad
NR1 del receptor NMDA coclear después de la exposición a salicilato
o trauma acústico, determinado por inmunodetección Western blot. El
tratamiento de salicilato no indujo ninguna modificación
significativa de la expresión de la subunidad del receptor NMDA NR1
(un 4% superior que en los animales control). Por el contrario, el
trauma acústico condujo a una sobreexpresión clara 5 días después
del incidente (+50% con relación a los animales control), lo cual
concuerda con la observación de un tinnitus persistente. La
diferencia en la expresión NMDA NR1 demuestra que el tinnitus
inducido por trauma acústico regula los receptores NMDA, mientras
que el de salicilato no. Esto confirma que el tinnitus inducido por
salicilato es mediado por una trayectoria diferente, como se
discute anteriormente. La Fig. 7 muestra además que 24 horas
después del trauma no existe sobreexpresión detectable (+8%), lo
cual sugiere que los mecanismos del tinnitus temporal y permanente
después del trauma acústico son fundamentalmente diferentes.
Tomados en conjunto, los resultados del análisis
morfológico y de la inmunodetección confirman la diferencia
fundamental sugerida en los mecanismos de acción entre el tinnitus
inducido por salicilato y por excitotoxicidad. La excitotoxicidad,
a diferencia del salicilato, daña el complejo sináptico de las
células pilosas internas e induce una regulación de los receptores
NMDA, conduciendo en cambio a la aparición de un tinnitus
persistente. Como están involucradas dos trayectorias diferentes en
la regulación de las respuestas al NMDA coclear, no se podía
presumir de modo realista la eficacia de los antagonistas del
receptor NMDA en la supresión del tinnitus persistente inducido por
excitotoxicidad coclear con un modelo de tinnitus inducido por
salicilato.
Claims (8)
1. Utilización de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto de acuerdo con la fórmula general I
donde R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4} y R_{5} son, independientemente, H, Cl, F, I, CH_{3},
CH_{2}CH_{3}, NH_{2}, OH o COOH y R_{6} y R_{7} son,
independientemente, H, CH_{3}, CH_{2}CH_{3}, OH, Cl, F o
I,
para la preparación de una composición
farmacéutica para prevenir o tratar el tinnitus inducido por
excitotoxicidad coclear en un humano, caracterizado porque la
composición farmacéutica es efectiva para suprimir o reducir la
actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo
en un humano que necesita tal tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque el antagonista del receptor NMDA es
cetamina.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque la excitotoxicidad coclear es provocada
por una incidencia seleccionada de entre el grupo consistente en
trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una
o más medicaciones ototóxicas y sordera súbita.
4. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque la composición farmacéutica es para su
administración por vía tópica a través de la membrana de la ventana
redonda o de la membrana de la ventana ovalada en el oído
interno.
5. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque la composición farmacéutica es para su
administración por vía tópica mediante técnicas invasivas de
suministro del fármaco en el oído interno.
6. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque la excitotoxicidad coclear se
caracteriza como aguda.
7. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque la excitotoxicidad coclear se
caracteriza como repetida.
8. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque la excitotoxicidad coclear se
caracteriza como prolongada o crónica.
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