MXPA06011078A - Uso de un antagonista del receptor nmda para el tratamiento de tinito inducido por excitotoxicidad coclear. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para la prevencion y/o tratamiento de tinito inducido por excitotoxicidad coclear. En estos metodos, se administra una composicion farmaceutica que comprende antagonista del receptor NMDA a un individuo en necesidad de tal tratamiento por dispositivo y/o formulaciones apropiadas para administracion local al oido interno. El tinito a ser prevenido y/o tratado puede ser provocado por trauma acustico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o mas medicaciones atotoxicas, sordera subita u otros incidentes que inducen excitotoxicidad coclear.

Description

USO DE UN ANTAGONISTA DEL RECEPTOR NMDA PARA EL TRATAMIENTO DE TINITO INDUCIDO POR EXCITOTOXICIDAD COCLEAR CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para el suministro de compuestos farmacéuticos al oido interno para el tratamiento de tinito inducido por excitotoxicidad coclear. Específicamente, esta invención se refiere a la administración local de antagonistas del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) al oído interno para suprimir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo después de acontecimientos agudos, repetidos o prolongados o crónicos de excitotoxicidad colear provocados por incidentes tales como trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de ciertas medicaciones ototóxicas o sordera súbita y de este modo, bloquea el tinito en el caso de tales incidentes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Tinito, la percepción de sonido sin la estimulación acústica externa, es un trastorno muy común del oído interno. Se estima que 8.6 millones de Americanos, aproximadamente 3 por ciento de la población de los Estados Unidos, sufren tinito crónico (Centers for Diseases Control and Prevention, Vital and Health Statistics, Series 10, #200, Octubre 1999) . De acuerdo con la Asociación 7Americana del Habla-Lenguaje-Audición (ASHA) , un millón o más personas encuentran que su tinito los previene de llevar una vida normal (0.3% de la población). Estudios de la población Europea estiman que 7% a 14% de la población han hablado con su médico a cerca del finitos, mientras el tinito potencialmente incapacitante ocurre en aproximadamente 1% hasta 2.4% de las personas (Vesterarger V., Bri tish Medical Journal 314 (7082) : 728-731 (1997)). A pesar del alto predominio del tinito y su impacto severo en la salud y calidad de vida de las personas afectadas por esta, no existe un tratamiento verdaderamente efectivo, disponible. Procedimientos de terapia actuales incluyen la anulación de medicaciones ototóxicas, consumo reducido de alcohol, cafeína y nicotina, estrés reducido, el uso de ruidos de fondo o enmascaradores de tinito usables (algunos en combinación con audífonos), terapias de comportamiento tales como hipnosis, terapia cognitiva y bio-retroalimentación, terapia de reentrenamiento del tinito (TRT) , terapias farmacológicas y otras complementarias. El tinito no es una enfermedad, sino un síntoma común de varios trastornos de audición, solo como dolor acompañante de muchas diferentes enfermedades. Está más frecuentemente asociado con pérdida de audición inducida por ruido, presbiacusia y enfermedad de Méniére (Nicolas-Puel et al., International Tinnitus Journal 8 (1) : 37-44 (2002). Otros orígenes menos frecuentes incluyen exposición a fármacos ototóxicos (antibióticos aminoglicósidos, diuréticos glomerulares de dosis elevada, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y ciertos agentes quimioterapéuticos) , flujo vascular reducido (isquemia) , procesos autoinmunes, enfermedades infecciosas, pérdida de audición conductiva, trauma craneal, etc. En más del 90% de los casos, el tinito está asociado con pérdida de audición de origen desconocido, y también más del 70% se origina dentro del oído interno (Nicolas-Puel et al., International Tinnitus Journal 8 (1) : 37-44 (2002)). En la década pasada, ventajas principales en la búsqueda de la fisiopatología del oído interno resultaron en la identificación del papel clave del complejo sináptic'o de las células pilosas interiores en el desarrollo de tinito, inducido por excitotoxicidad coclear, uno de los activadores de tinito más frecuente. La excitotoxicidad, la cual fue descrita primero por Olney et al., J. Neuropathol Exp . Neurol . 31 (3) : 464-488 (1972), se caracteriza de manera general, como una liberación sináptica excesiva de glutamato, el cual es el neurotransmisor más importante en el Sistema Nervioso Central, así como también en el sistema auditivo. Activa los receptores de glutamato post-sináptico (ionotrópico y metabotrópico) , los cuales conducen a la despolarización y excitación neuronal. Sin embargo, si la activación del receptor llega a ser excesiva por una liberación excesiva de glutamato como en el caso de excitotoxicidad, las neuronas objetivo son dañadas y pueden eventualmente, morir (Puel J. L., Prog. Neurobiol . 47(6): 1149-76 (1995) ) . La excitotoxicidad coclear es provocada ya sea por la exposición a ruido excesivo, tal como en el caso de trauma acústica repetida o aguda (el cual conduce a pérdida de la audición inducida por ruido o presbiacusia) , sordera súbita o anoxia/isquemia (Pujol and Puel, Ann . NY Acad. Sci . 884 : 249-254 (1999)) o tratamiento con una o más de' ciertas otras medicaciones ototóxicas. La liberación de ' cantidades excesivas de glutamato es inducida ya sea por la presión excesiva de sonido que entra a la cóclea en caso de trauma acústico, o el flujo sanguíneo reducido del sistema regulador de glutamato en el caso de anoxia/isquemia, respectivamente sordera súbita. En todos los casos, la excitotoxicidad es caracterizada por un mecanismo de dos etapas: primero, existe una inflamación aguda de dendritas aferentes tipo I, mediada por los receptores de glutamato ionotrópico, los cuales conducen a un rompimiento de las estructuras post-sinápticas y a una pérdida de la función. Dentro de los siguientes 5 días, se observa reparación sináptica (neo-sinaptogénesis) con una completa o parcial recuperación de los potenciales cocleares (Puel et al., Acta Otolaryngol . 11 7 (2) .-214-218 (1997)). En la segunda fase de excitotoxicidad, la cual se puede desarrollar después de lesión fuerte y/o repetitiva, una cascada de eventos metabólicos, accionada por la entrada de Ca2+, conduce a muerte neuronal de las neuronas del ganglio espiral . La excitotoxicidad coclear puede inducir tinito durante el proceso de rompimiento de las estructuras post-sinápticas y, siempre que la ruptura no sea terminal, la siguiente neo-sinaptogénesis en el complejo sináptico de células pilosas internas (Pue et al., Audiol . Neurootol . 1 ( 1 ) : 49-54 (2002) ) . Se juega papel clave en la recuperación funcional después de la excitotoxicidad por los receptores NMDA, los cuales no están involucrados en la actividad de las fibras del nervio auditor bajo condiciones fisiológicas (Puel et al., Audiol . Neurootol . 7(1): 49.54 (2002)), sino sobre reguladas durante el proceso de neo-sinaptogénesis (Puel et al., C. R . Acad. Sci . III. 318 (1) : 67-75 (1995)), principalmente debido a su permeabilidad al calcio elevada (Ca2+) (Sattler and Tymianski, Mol . Neurobiol . 24 (1-3) : 107-129 (2001) ) . Como se puede mostrar en un modelo animal de mecanismos de reparación sinápticos cocleares, el bloqueo de los receptores NMDA por administración local del antagonista D-AP5 del receptor NMDA, retarda la recuperación funcional y el recrecimiento de las dendritas auditivas (Gervais D'Aldin et al., Int . J. Dev. Neurosci . 15 (4-5) : 619-629 (1997)). Podría de este modo, concluirse que el glutamato, además de su papel como un neurotransmisor excitador rápido, tiene un papel neurotrófico vía la activación de los receptores NMDA. Se ha hipotetizado que la sobre regulación del ARNm de los receptores NMDA inducida por excitotoxicidad coclear, es responsable del "encendido" espontáneo anormal de las fibras del nervio auditivo, el cual puede ser percibido como tinito (Puel J.-L. et al., Audiol . Neurootol . 7 (1) : 49-54 (2002)). Durante el proceso de neo-sinaptogénesis aferente, las dendritas están en un estado crítico y, pueden de este modo, ser particularmente susceptibles a excitación por la activación de los receptores NMDA. Para evitar tal excitación aberrante, y por lo tanto tinito, el cual puede continuar bien indefinidamente debido a la neo-sinaptogénesis incompleta, una estrategia terapéutica que podría ser vista por antagonizar específicamente receptores NMDA. Como se ha demostrado, la administración local de antagonistas del receptor NMDA a la cóclea, previene la excitotoxicidad inducida por trauma acústico o isquemia (Duan et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 97 (13) : 7597-7602 (2000); Puel, Prog.

Neurobiol . 47 (6) : 449-416 (1995); Puel et al., J. Comp. Neurol . 341 (2) : 241-256 (1994)). Mientras la excitotoxicidad podría también ser bloqueada por la aplicación de 2-amino-3- (3-hidroxi~5-metilsiloxazol-4-il) propionato (AMPA) o antagonistas del receptor cainato, como la inflamación aguda de las dendritas aferentes ocurren principalmente vía estas (Puel et al., J. Comp. Neurol . 341 (2) : 241-256 (1994)), tal procedimiento podría tener un impacto potencialmente significantemente negativo en la función auditiva. Como la neurotransmisión excitatoria rápida entre las células pilosas internas y las fibras nerviosas auditivas son predominantemente mediadas por receptores preferentes AMPA (Ruel et al., J. Physiol . London 518: 661- 680 (1999 ) ) , su bloqueo podría suprimir no solamente la estimulación excesiva indeseada del nervio auditor, sino también la excitación regular deseada, y de este modo, provocar pérdida de audición. La implicación hipotetizada de receptores NMDA en la generación de tinito, se ha probado y demostrado solamente hasta ahora in vivo, con un modelo de comportamiento de tinito inducido por salicilato (Guitton et al., J. of Neuroscience 23 (9) : 3944-3952 (2003)). El modelo de comportamiento, el cual ha sido desarrollado. para medir el tinito, como el tinito no es directamente observable, se basa en el paradigma activo de la evitación: los animales fueron condicionados a saltar sobre una piscina siempre que escuchen un sonido particular. La administración de salicilato conduce a incremento significante en el número de saltos aún en la ausencia de sonido externo (positivos falsos), indicando la percepción de tinito. Después del suministro del MK-801, 7-CK y gaciclidina antagonistas de NMDA, a las cócleas de animales vía la membrana de la ventana redonda, el número de positivos falsos disminuyó significantemente, indicando la supresión de tinito. Mientras estos resultados proporcionan por primera vez un tiempo de confirmación de la implicación hipotetizada de receptores NMDA en la incidencia de tinito, podrían no ser claramente generalizados para todas las clases de este trastorno del oído interno, como el tinito inducido por salicilato es una forma muy peculiar de tinito. El salicilato, el componente activo de la aspirina, ha sido conocido por más de un siglo, por inducir tinito si se toma en dosis grandes (Cazáis Y., Prog. Neurobiol . 6".2:583-631 (2000)). Puede provocar sensaciones similares del tinito como en el caso de excitotoxicidad coclear u otros casos con origen diferente, pero es usualmente reversible y basado en un mecanismo molecular específico . La aplicación de mefenamato, un inhibidor de ciclooxigenasa bien conocido, en lugar de salicilato, también incrementa el número de respuestas positivas falsas, sugiriendo que el tinito inducido por salicilato, está relacionado con una inhibición de la trayectoria de ciclooxigenasa. Mientras el tinito inducido por excitotoxicidad coclear es el resultado de una cascada de procesos mediados por glutamato que conduce a la sobre regulación de ARNm de receptores NMDA, el tinito inducido por salicilato es mediado por cambios en el metabolismo del ácido araquidónico (véase por ejemplo, Cazáis Y., Prog. Neurobiol . 52:583-631 (2000)). El salicilato se ha mostrado por inhibir la actividad de ciclooxigenasa (véase por ejemplo, Van and Botting, Am . J.

Med. 104.-2S-8S (1998)). La evidencia demuestra que el ácido araquidónico potencia las corrientes del receptor NMDA (Miller et al., Nature 355 : 722-725 (1992); Hori oto et al., NeuroReport 7 : 2463-2467 (1996); Casado and Ascher, J. Physiol . 513 : 317-330 (1998)). Los estudios electrofisiológicos han demostrado que el ácido araquidónico incrementa la probabilidad de apertura de canal del receptor NMDA en varios sistemas, que incluyen células de granulos cerebelares, células piramidales disociadas, neuronas corticales y empalmes hipocampales de adulto (véase por ejemplo, Miller et al., Nature 355 : 122-725 (1992); Horimoto et al., NeuroReport 7: 2463-2467 (1996); Yamakura and Shimoji, Prog. Neurobiol . 59 : 219-298 (1999) ) . Distinto del tinito inducido por la excitotoxicidad, no existe de este modo daño morfológico al complejo sináptico de células pilosas del oído interno, y en particular, al extremo sináptico, involucrado en el tinito inducido por salicilato. La Patente Estadounidense No. 5,716,961 por Sands, describe la administración de un antagonista específico del receptor NMDA para propósitos de tratar tinito. Sus propiedades neuroprotectoras en el caso de excitotoxicidad de glutamato, se demuestran en cultivos celulares. Sin embargo, la acción y eficacia farmacológica del compuesto bajo condiciones patofisiológicas in vivo, no se muestran, es decir, no existe relación al tinito inducido por excitotoxicidad coclear. Esto debe- ser considerado una deficiencia seria dada las complejidades del complejo sínáptíco de células pilosas internas. Además, Sands muestra la administración oral del antagonista del receptor NMDA, mientras discute la administración tópica solamente para casos en donde un paciente es incapaz de tragar o la ruta oral de administración se deteriora de otro modo. La administración tópica es discutida no específicamente, en la forma de "soluciones, lociones, ungüentos, pomadas, y similares". La administración sistémica de antagonistas del receptor NMDA para tratar trastornos del oído interno, es usualmente inefectiva, conforme la cóclea es protegida como el cerebro por una barrera biológica. Dosis relativamente elevadas para lograr un efecto terapéutico deseado, podrían de este modo, ser requeridas, pero varios otros efectos colaterales potentes de antagonistas del receptor NMDA tales como aprendizaje, memoria o motilidad reducida, restringen significantemente las dosis máximas tolerables. Como varios estudios con humanos para el tratamiento de trastornos del SNC por antagonistas del receptor NMDA han mostrado, que los niveles del plasma después de la administración sistémica, estuvieron consistentemente por debajo de aquellos necesarios para neuroprotección máxima en modelos animales, como las dosis clínicas han sido limitadas debido al número de efectos al SNC potencialmente adversos, catatonía, aumento de la presión sanguínea y anestesia (Kemp and McKernan, Nature Neuroscience 5, supplement : 1039-1042 (2002)). Por otro lado, se ha mostrado que la administración local del antagonista caroverina del receptor NMDA-AMPA al oído interno, resulta en concentraciones elevadas intra-cocleares, mientras evita altas concentraciones secundarias en fluido del plasma y cerebroespinal como se observa con la administración sistémica (Chen et al., Audiol . Neuroptol, 8:49-56 (2003)). La Patente estadounidense No. 6,066,652 de Zenner et al., describe un método para tratar tinito a través de la administración de adamantano, un antagonista del receptor NMDA. Los inventores mencionan resultados de un estudio clínico con administración sistémica , la cual muestra una reducción en tinito durante el tratamiento . Hipótesis realizadas se adelantan a explicar los resultados obtenidos del centro o fuera de las células pilosas y la presinapsis y no específicamente cubren el papel de receptores NMDA. Mientras existen varias indicaciones que soportan la hipótesis que los receptores NMDA juegan un papel importante en la génesis de tinito inducido por excitotocicidad coclear, la discusión anterior muestra que los mecanismos moleculares aún no son claros, y que no es posible por lo tanto, predecir fiablemente si el uso de los antagonistas del receptor NMDA bloquearán efectivamente este tipo de tinito. Estudios patofisiológicos adicionales en la generación de tinito, son así requeridos para validar la hipótesis y desarrollo específico y estrategias terapéuticas verdaderamente efectivas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para prevenir y/o tratar tinito inducido por excitotoxicidad coclear en un humano. Los métodos incluyen administrar a un humano, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NMDA. En un método para tratar tinito, el antagonista del receptor NMDA administrado, es efectivo para suprimir o reducir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en el humano en necesidad de tal tratamiento. En un método para prevenir tinito, el antagonista del receptor NMDA es efectivo para prevenir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en el humano en necesidad de tal tratamiento. El tinito a ser prevenido y/o tratado, puede ser provocado por trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más medicaciones ototóxicas, sordera súbita, u otras incidencias que inducen excitotoxicidad coclear.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra mediciones CAP 7 días después del trauma en animales de control. Se valoró la pérdida de audición inducida por trauma acústico, registrando mediciones CAP 7 días después del trauma. Se observó un cambio de umbral permanente de máximamente 13 dB ± 2.0 a 10 kHz en el séptimo día después del trauma acústico. La FIG. 2 ilustra la medición del registro y respuesta positiva falsa después del trauma acústico en animales de control. (A) El trauma acústico conduce a una disminución en las respuestas de comportamiento correcto a la estimulación de sonido, después de una recuperación parcial con el tiempo, reflejando la pérdida de audición inducida. (B) El número de positivos falsos sustancialmente difiere entre animales probados después del trauma acústico. Grupo 1, animales que no experimentaron tinito, grupo 2, animales que experimentaron tinito solamente temporalmente, mientras el grupo 3, animales que experimentaron tinito tanto temporalmente como permanentemente . La FIG. 3, ilustra que la pérdida de audición en respuesta a la pérdida de células pilosas, inducida por trauma acústico, no juega un papel significante en la generación de tinito. El tratamiento con D-JNKI-1 previene la pérdida de audición después del trauma acústico, como se muestra por la recuperación rápida del registro después del trauma (A) , pero no tiene efecto significante en la prevención tinito, tanto el predominio y patrones de tinito son esencialmente los mismos como en animales no tratados (B) . La FIG. 4 ilustra la administración local del antagonista 7-CK de NMDA al rededor de la membrana de la ventana redonda, resultó en la prevención de tinito. (A) El registro de comportamiento promedio cayó del día 0 hasta el día 1 y se recuperó subsecuentemente; sin embargo, el mejoramiento es más lento que en animales no tratados. (B) La administración local del antagonista 7-CK de NMDA resultó en supresión de tinito persistente inducido por excitotoxicidad coclear; se puede observar solamente en casos de tinito temporal. La FIG. 5, muestra que la administración local de antagonistas S- (+) -cetamina de NMDA al rededor de la membrana de la ventana redonda, resultó en la prevención de tinito persistente. (A) El registro de comportamiento promedio cayó del día 0 hasta el día 1 y se recuperó subsecuentemente; sin embargo, el mejoramiento es más lento que en animales no tratados. (B) Administración local del antagonista S- (+) -cetamina de NMDA, resultó en supresión de tinito persistente inducido por excitotoxicidad, se puede observar solamente en casos de tinito temporal. La FIG. 6 muestra que el trauma acústico produce daño morfológico sustancial en el complejo sináptico de células pilosas internas (IHC) y células pilosas externas sensorias (OHC) , mientras que la administración de salicilato no . La estereocilia de OHC e IHC, permanece intacta después de las inyecciones de salicilato durante 2 días (6 A), mientras aquellos animales los cuales se exponen a trauma acústico, muestran severos daños en haces estereociliares de OHC, así como también desarreglos y en algunos casos aún estereocilia de OHC (indicado por flecha negra) fusionada (6 D) . El bajo aumento del complejo sináptico IHC no muestra anormalidades ultraestructurales en casos del tratamiento de salicilato (6 B) , mientras que en animales traumatizados se puede observar una masiva y dramática hinchazón (indicada por asteriscos) de las dendritas aferentes radiales en el polo basal del IHC en el área del rango de frecuencia afectada, confirmando que la excitotoxicidad ha ocurrido (6 E) . Se nota la presencia de numerosas vacuolas en la parte apical del IHC y estereocilia anormalmente formada (indicadas por flechas) . El elevado aumento del polo IHC basal, no muestra nuevamente anormalidades para el animal tratado con salicilato (6 C) . Las dos terminales nerviosas aferentes (indicadas por al y a2) son normales, y un cuerpo aferente encarante presináptico característico a2, es claramente visible. Contrario a esto, (6 F) muestra terminales nerviosas interrumpidas hinchadas (al) e interrumpidas (a2) y el cuerpo encarante presináptlco a2. Las barras a escala para A y D son de 10 µm (microscopio de exploración de electrón), para B y E de 5 µm, y para C y F de 0.25 µm (todos por microscopio de transmisión de electrón) . La FIG. 7 muestra la expresión de la subunidad NR1 del receptor NMDA coclear, después de la exposición a salicilato o trauma acústico, determinada por Inmunodetección de Manchado Western. Como se puede observar, el tratamiento de salicilato no induce alguna modificación significante de la expresión de la subunidad del receptor NMDA NR1 (4% mayor que los animales de control) . Por el contrario, el trauma acústico conduce a una clara sobreexpresión 5 días después del incidente (+50% sobre los animales de control) , lo cual es consistente con la observación de tinito persistente. Sin embargo, 24 horas después del trauma, no hay sobreexpresión detectable significante (+8%) , lo cual sugiere que son fundamentalmente diferentes los mecanismos de tinito temporal y permanente después del trauma acústico. Se realizaron inmunomanchados del cerebro de animales de control, para verificar que el peso molecular de la subunidad NR1 es idéntico tanto en el cerebro como en la cóclea .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Compendio La presente invención se basa en hallazgos experimentales con un modelo animal de finito inducido por excitotoxicidad coclear. La invención se refiere al uso de compuestos farmacéuticos que actúan específicamente como antagonistas del receptor NMDA. Mientras no se desea ligar por la teoría, se cree que un antagonista del receptor NMDA de la presente invención, se une al receptor NMDA en uno de sus varios sitios de enlace, con ello, bloquea (parcial o completamente) , la abertura del canal iónico del receptor. El receptor de NMDA se activa de una manera compleja, de manera tal que se requiere el enlace de glutamato y glicina para abrir el canal iónico y permitir la entrada de calcio (Kemp and McKernan, Nature Neuroscience 5, supplement : 1039-1042 (2002)). El glutamato tiene la función neurotransmisora, conforme se libera de terminales presinápticas en una manera dependiente de actividad, mientras que la glicina actúa como un modulador, el cual está presente en el fluido extracelular a niveles más constantes. El canal iónico integral al receptor NMDA, es bloqueado independientemente del voltaje por magnesio, y la despolarización remueve este bloque. El enlace de un antagonista del receptor NMDA a cualquiera de los tres sitios antagonistas, resulta en un bloque parcial o completo del receptor NMDA y por lo tanto, bloquea o reduce la abertura del canal de ion y despolarización de la neurona. El antagonista del receptor NMDA, de este modo, suprime la excitación aberrante del nervio auditivo a través de sobre-regulación de los receptores NMDA, los cuales pueden seguir con la excitotoxicidad coclear y de este modo, también reducen o eliminan la percepción de tinito. Después del suministro del antagonista del receptor NMDA, los receptores NMDA no son ampliamente sobre- regulados . Dirigiendo específicamente receptores NMDA, los cuales son solamente sobre-regulados bajo condiciones patológicas, para suprimir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo, se pueden evitar efectos colaterales indeseados en audición, como la neurotransmisión auditiva normal es principalmente mediada por receptores AMPA. En una modalidad, la invención se refiere a un método para tratar tinito inducido por excitotoxicidad coclear en un humano. El método comprende administrar a un humano, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NMDA. El antagonista del receptor NMDA se administra en una cantidad y por un periodo de tiempo, efectivo para suprimir o reducir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un humano en necesidad del tal tratamiento. La supresión o reducción de la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo, resulta en la supresión o reducción del tinito en el individuo tratado. En una modalidad preferida de este método, el antagonista del receptor NMDA se administra después o durante la exposición del humano a una incidencia que induce excitotoxicidad coclear . En otra modalidad, la invención se refiere a un método para prevenir tinito inducido por excitotoxicidad coclear en un humano. Este método comprende administrar a un humano, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NMD. En este método, el antagonista del receptor NMDA se administra en una cantidad y por un periodo de tiempo, efectivo para prevenir actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un individuo en necesidad de tal tratamiento. La prevención de la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo, previene tinito en el individuo tratado. En una modalidad preferida de este método, el antagonista del receptor NMDA se administra antes o durante la exposición del humano a una incidencia que induce excitotoxicidad coclear potencial. Es un objeto de la presente invención, prevenir y/o tratar tinito el cual se ha inducido por excitotoxicidad coclear. No hay un requerimiento que el tinito inducido por excitotoxicidad coclear sea provocado por cualquier tipo específico de incidencia, solamente que la incidencia provoque excitotoxicidad coclear e induzca tinito. No es necesariamente un requerimiento que la naturaleza de la incidencia sea conocida en la prevención y/o tratamiento de tinito. El tinito prevenido y/o tratado puede ser agudo, sebáceo o crónico. Se conoce en la técnica, que el tinito resulta de excitotoxicidad colear después del trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de ciertas medicaciones ototóxicas y/o sordera súbita. La prevención de tinito inducido por trauma acústico, se ejemplifica en este documento. Un experto en la técnica podrá predecir con un alto grado de certeza, que los métodos proporcionados en este documento, podrán ser efectivos en la prevención y/o tratamiento de tinito inducido no solamente por trauma acústico, sino también por presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de ciertas medicaciones y/o sordera súbita, puesto que el tinito resulta de todas las incidencias que portan una causa mecánica común. El trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de ciertas medicaciones ototóxicas y/o sordera súbita, se pueden caracterizar como agudos, repetidos o prolongados. Un experto en la técnica podrá predecir que el método de la presente invención podrá ser efectivo en la prevención y/o tratamiento de tinito inducido por medios diferentes del trauma acústico, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de las medicaciones ototóxicas y/o sordera súbita, tan pronto como el tinito sea inducido por excitotoxicidad coclear. La excitotoxicidad coclear resulta de tales incidencias, puede ser caracterizada como aguda, repetida u prolongada, dependiendo de la duración de la incidencia que induce excitotoxicidad coclear. El término "medicación ototóxica", como se usa en el contexto de la presente invención, se pretende que signifique cualquier compuesto caracterizado por la capacidad para inducir tinito vía excitotoxicidad coclear después de la administración terapéutica. La excitotoxicidad coclear surge como un efecto colateral de la administración de medicaciones ototóxicas, las cuales generalmente se administran como compuestos terapéuticos para tratar condiciones las cuales no se pueden relacionar con audición o percepción auditiva. Las medicaciones ototóxicas caracterizadas como tales incluyen, por ejemplo, antibióticos aminoglicósidos y agentes quimioterapéuticos tales como cisplatino. La correlación de uso de tales medicaciones ototóxicas con la excitotoxicidad coclear y la incidencia de tinito, es bien conocida en la técnica, pero antes de la presente invención, no ha estado disponible un tratamiento efectivo. El uso de muchas de las medicaciones es actualmente limitado por sus efectos ototóxicos, y como tal, un método para reducir estos efectos podrá permitir tales medicaciones ser usadas más ampliamente como terapéuticos .

Compuesto Las formulaciones de los compuestos farmacéuticos a ser administrados en conjunto con los métodos de la presente invención, comprenden un antagonista del receptor NMDA selectivo el cual se enlaza al receptor NMDA ya sea en el sitio de enlace del antagonista NMDA competitivo, el sitio de enlace del antagonista NMDA no competitivo con el canal iónico, o el sitio de glicina. Compuestos ejemplares incluyen, pero no se necesariamente se limitan a, ifenprodil, Cetamina, memantina, dizocilpina (MK-801) , gaciclidina, taxoprodil (antagonistas NMDA no competitivos), ácido D-2-amino-5-fosfonopentanoico (D-AP5) , ácido 3- (±) 2-carboxilpiperazin-4-il) -propil-1-fosfónico (CPP) , canantoquinas (antagonistas NMDA competitivos) , 7-cloroquinurenato (7-CK) , y Licostinal (antagonistas del sitio glicina) . Un antagonista NMDA para uso en la presente invención puede ser cualquier derivado, análogo y/o forma enantiomérica de un antagonista NMDA del mismo, el cual retiene la función de un antagonista NMDA. La composición para administración en los métodos de la presente invención puede comprender uno o más antagonistas del receptor NMDA. Las arilcicloalquilaminas pueden ser preferiblemente usadas en conjunto con la presente invención como antagonistas NMDA. Entre las clases de compuestos arilcicloalquilamina (que retienen la función de un antagonista NMDA) que tienen la fórmula general I en donde Rl, R2, R3, R4 y R5 son independientemente H, Cl, F, I, CH3, CH2CH3, NH2, OH o COOH y en donde R6 y R7 son independientemente H, CH3, CH2CH3, OH, Cl, F o l, pueden ser preferidos. Una arilcicloalquilamina preferida es cetamina (C?3Hi6ClNO (base libre), 2- (2-clorofenil) -2- (metilamino) -ciciohexanona) , la fórmula estructural la cual es representada por la fórmula II: Cualquier derivado, análogo y/o forma enantiomérica de cetamina o un compuesto de arilcicloalquilamina como se define por las fórmula II ó I, respectivamente, pueden ser usados como antagonistas NMDA. La cetamina es un antagonista del receptor NMDA no competitivo, el cual se enlaza al sitio de enlace PCP, un sitio separado del complejo del receptor NMDA, ubicado dentro del canal iónico, con ello, bloqueando el flujo iónico transmembranoso . La cetamina se puede proporcionar por métodos descritos en el documento US 3,254,124. Más específicamente, el compuesto preferido es (S) -cetamina, como se enlaza a una afinidad 3-4 veces superior al sitio de enlace PCP del receptor NMDA que a (R) -cetamina (Vollenweider et al., Eur. Neuropsychopharmacol . 7:25-38 (1997)). La síntesis de los isómeros ópticos se puede llevar a cabo como se describe por el documento DE 2062620 ó WO01/98265, el cual está incorporado en este documento por referencia. En una modalidad preferida de la presente invención, la cetamina puede también ser administrada como la sal de clorhidrato (C?3H?7Cl2NO) de su forma de base libre (clorhidrato de cetamina) . Otros compuestos preferidos de la presente invención, pertenecen a la clase de quinazolinas sustituidas que retienen la función de un antagonista de NMDA. En conjunto con la presente invención, los compuestos de quinazolina tienen la fórmula general III en donde R'l, R'2, R'3 y R'4 independientemente son H, Cl, F, I, CH3, CH2CH3, NH2, OH o COOH y en donde R'5 y R'6 son independientemente COOH, OH, CON H2, H, CH3, CH2 CH3, OH, Cl, F o l, pueden ser preferidos como antagonistas NMDA. Dentro de las clases de quinazolinas, 7-cloroquinurenato (7-CK) es particularmente preferido. 7-CK es representado por la siguiente estructura de fórmula IV.

Cualquier derivado, enantiómero o análogo de 7-CK de conformidad con la fórmula IV, o cualquier otro compuesto como se define por la fórmula III, se puede usar también en métodos de la presente invención.

Administración y formulación El suministro del compuesto a pacientes se puede completar oralmente, intravenosamente, subcutáneamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, rectalmente o tópicamente, mientras, la administración tópica al oído interno es de manera general preferida, como dosis terapéuticamente efectivas con administración sistémica pueden inducir efectos colaterales indeseados . Un experto en la técnica reconocerá que la administración de un antagonista NMDA en la presente invención, se puede realizar en una variedad de otras formas. El único requerimiento para la administración en la presente invención es que una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista NMDA, sea capaz para alcanzar el sitio de la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en el individuo afligido. La administración del compuesto al oído interno se puede realizar por varias técnicas de suministro. Estas incluyen el uso de dispositivos o portadores del fármaco para transportar y/o suministrar el compuesto en una forma dirigida a la membrana de la ventana redonda u oval, en donde se difunde en el oído interno, o es activamente infundido . Ejemplos son esponjas redondas (véase, por ejemplo Patente estadounidense 6,120,484 de Silverstein) , catéteres de ventana redonda (véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses 5,421,818; 5,474,529; 5,476,446; 6,045,528; todas de Arenberg o 6,377,849 y su división 2002/0082554 de Lenarz) , o varios tipos de geles, espumas, fibrinas u otros portadores del fármaco, los cuales se colocan en el nicho de la ventana redonda o en la ventana oval, y se cargan con el compuesto para liberación sostenida (véase, por ejemplo ?ÑO 91/38698 por Manning; Silverstein et al., Otolaryngology - Head and Neck Surgery 120 (5): 649-655 (1999); Balough et al., Otolaryngology - Head and Neck Surgery 119 (5): 427- 431 (1998) ) . Además, incluyen el uso de dispositivos los cuales se insertan en el conducto coclear o cualquier otra parte de la cóclea (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 6,309,410 de Kuzma) . El compuesto se puede también administrar al oído interno por . inyección transtimpánica, en donde el oído medio o parte de este, es llenado por una solución u otros portadores del compuesto (véase, por ejemplo Hoffer et al., Otolaryngologic Clinics of North America 36 (2):353-358 (2003)). El método preferido de administración al oído interno es por difusión a través de la membrana de la ventana redonda, la cual es relativamente fácilmente accesible del espacio del oído medio, y permite al oído interno permanecer intacto, evitando así cualquier problema potencial de derrame de fluidos intracocleares . Un compuesto contenido con la composición farmacéutica de esta invención, se puede proporcionar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales sales incluyen, pero no se limitan a, aquellas formados con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, láctico, cítrico, málico, formárico, tartárico, esteárico, succínico, benzoico, metansulfónico, toluensofónico o pamoico) , ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, nítrico, difosfórico, sulfúrico o fosfórico) , y ácidos poliméricos (por ejemplo, ácido tánico, carboximetil celulosa, poliláctico, poliglicólico o copolímeros del ácido poliláctico) . Composiciones farmacéuticas por cualquier ruta de administración de esta invención, contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de ingrediente activo, y como puede ser necesario, portadores farmacéuticamente aceptables inorgánicos u orgánicos, sólidos o líquidos. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración tópica al oído interno incluyen soluciones o suspensiones acuosas, las cuales, por ejemplo, en el caso de formulaciones liofilizadas que contienen el ingrediente activo solo o junto con un portador, se pueden preparar antes del uso. Además incluyen geles, los cuales pueden ser biodegradables ' o no biodegradables, acuosos o no acuosos o basados en microesferas. Ejemplos de tal gel incluyen, pero no se limita a, poloxámeros, hialuronatos, xiloglucanos, quitosanos, poliésteres, poli (láctidos) , poli (glicólido) o sus copolímeros PLGA, isoburato acetato de sacarosa y monooleato de glicerol. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración entérica o parentérica incluyen tabletas o cápsulas de gelatina o soluciones o suspensiones acuosas, como se describe anteriormente. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar y/o pueden contener adyuvantes, por ejemplo, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsificadores, sales para regulación de presión osmótica y/o amortiguadores. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden, si se desea, contener además sustancias farmacológicas activas. Se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia, por ejemplo, por métodos convencionales de mezclado, granulación, confección, disolución o liofilización, y contienen de aproximadamente 0.01 hasta 100%, preferiblemente de aproximadamente 0.1 hasta 50% (liofilizados hasta 100%) del ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica de conformidad con la invención, se formula para aplicación tópica. Vehículos adecuados para administración ótica son sustancias orgánicas o inorgánicas, las cuales son farmacéuticamente aceptables y las cuales no reaccionan con los compuestos activos, por ejemplo, salina, alcoholes, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilen glicoles, polietilen glicoles, triacetato de glicerol, gelatina, carbohidratos tales como lactosa o almidón, magnesio, estearato, talco o petrolato. Las preparaciones indicadas se pueden esterilizar y/o contener sustancias auxiliares tales como lubricantes, preservativos, tales como tiomerasal (por ejemplo a 50%), estabilizadores y/o agentes humectantes, emulsificadores, sales para influenciar la presión osmótica, sustancias amortiguadas, colorantes y/o sustancias aromatizantes. Pueden, si se requieren, también contener uno o más de ingredientes activos. Composiciones óticas de conformidad con la presente invención, pueden comprender varios ingredientes, que incluyen otros agentes biológicamente activos, tales como antibióticos, por ejemplo, fluoroquinolonas, agentes anti-inflamatorios, por ejemplo, esteroides, cortisona, analgésicos, antipirina, benzocaína, procaína, etc. Composiciones de la presente invención para administración tópica, pueden comprender otros ingredientes los cuales son farmacéuticamente aceptables . En modalidades preferidas de la presente invención, se selecciona un excipiente tópico que no mejora el suministro del agente a la circulación sistémica o al sistema nervioso central cuando se administra al oído. Por ejemplo, en general, se prefiere que el excipiente tópico no tenga propiedades oclusivas sustanciales, las cuales mejoran la transmisión percutánea a través de la mucosa en la circulación sistémica. Tales vehículos oclusivos incluyen bases de hidrocarburo, bases de absorción anhídrida, tales como petrolato hidrofílico y lanolina anhídrida (por ejemplo, Aquaphor) , y bases de emulsión agua en aceite tales como lanolina y crema fría. Más preferidos son vehículos los cuales son sustancialmente no oclusivos, y generalmente incluyen aquellos los cuales son solubles en agua, tales como bases de emulsión aceite en agua (cremas o ungüentos hidrofílicos) y base solubles en agua tales como vehículos a base de polietilen glicol y soluciones gelificadas acuosas con varios agentes tales como metilcelulosa, hidroxietil celulosa e hidroxipropilmetilcelulosa (por ejemplo, gel KY) . Excipientes y vehículos tópicos adecuados pueden ser rutinariamente seleccionados para un uso particular por aquellos expertos en la técnica, y especialmente con referencia a uno o muchos textos estándares en la técnica, tal como Remington's Pharmaceutical Sciences, Vol. 18, Marck Publishing Co., Easton, PA (1990), en particular el Capítulo 87. Por ejemplo, agentes biológicamente activos de conformidad con la presente invención, se pueden combinar con agentes intensificadores los cuales mejoran la penetración de un agente. El compuesto se puede administrar antes a, durante o después que el tinito se ha inducido por excitotoxicidad. La cantidad a ser administrada puede variar, dependiendo del método de administración, la duración de terapia, la condición del sujeto a ser tratado, la severidad de tinito y la eficacia del compuesto particular usado, edad, peso corporal, estado general de salud, sexo, dieta tiempo y ruta de administración, velocidad de excreción y combinación de fármaco, finalmente se decidirán por el médico tratante. La duración de terapia puede variar de entre aproximadamente una hora y varios días, semanas o meses y se puede prolongar a tratamiento crónico. La cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto a ser suministrado puede variar entre aproximadamente 0.1 nanogramo/hora hasta aproximadamente 100 microgramos/hora . Las sustancias de la invención son normalmente administradas análogamente a otros compuestos óticamente administrados. Por ejemplo, la cetamina puede ser óticamente administrada en una cantidad para tratar tinito, preferiblemente en dosificaciones de aproximadamente 10 µg/30 ml hasta aproximadamente 10,000 µg/30 ml, preferiblemente aproximadamente 500 µg/30 ml, o aproximadamente 0.01-2 µg por dosificación. Por el término "dosificación" para administración tópica, significa la cantidad de agente administrado en un tratamiento único, por ejemplo, aproximadamente 0.05-1 µg de cetamina administrada al oído en dos gotas. Otros agentes anti tinito mencionados en este documento se pueden administrar análogamente, tomando en cuenta la potencia del fármaco. Una dosis terapéuticamente efectiva se define como una cantidad efectiva para suprimir o reducir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un individuo tratado. Una dosis terapéuticamente efectiva también es la cantidad efectiva para suprimir o reducir tinito en el individuo afligido. Como se declara anteriormente, una dosis terapéuticamente efectiva puede variar, dependiendo de la selección de antagonistas NMDA específicos para tratamiento y en el método de su administración. Por ejemplo, una dosis elevada de un antagonista NMDA intravenosamente administrado, podrá requerir que la misma composición farmacéutica se administre localmente a la membrana de la ventana redonda o ventana oval del oído. Adicionalmente, la dosis inferior de una antagonista de NMDA se podrá requerir en donde el antagonista NMDA de la presente invención se enlaza al receptor NMDA con una afinidad superior de enlace, que un antagonista NMDA que se enlaza con una afinidad más baja. Como un resultado, se prefieren antagonistas NMDA con afinidades de enlace superiores para los receptores NMDA. Como se declara anteriormente, (S) -cetamina, la cual se enlaza con una afinidad 3-4 veces superior al sitio de enlace PCP del receptor NMDA que (R) -cetamina (Vollenweider et al., Eur. Neuropsychopharmacol . 1 ; 25-38 (1997)) es un compuesto preferido para uso en los métodos de la presente invención. La duración de terapia puede también variar, dependiendo de la forma específica de tinito para la cual se desea el tratamiento, aguda, subcutánea o crónica. Como una guía, se prefieren las duraciones más cortas de terapia y son suficientes cuando el tinito ha cesado y no recurren una vez a terapia. Se pueden emplear duraciones prolongadas de terapia para un individuo en el cual persiste el tinito después de la terapia corta. Los métodos inventivos descritos en este documento para tratar o prevenir tinito, particularmente inducido por excitotoxicidad coclear (como se describe en este documento) , pueden permitir análogamente el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende antagonistas del receptor de NMDA, ventajosamente efectivo para suprimir o reducir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un humano, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de tinito, particularmente inducido por excitotoxicidad coclear. Es particularmente preferido, el uso de un compuesto de la clase de arilcicloalquilaminas y quinazolinas, preferiblemente, un compuesto de fórmula general I o II, más preferiblemente de un antagonista del receptor NMDA seleccionado del grupo que consiste de cetamina, 7-cloroquinurenato, D-AP5, MK 801 y gaciclidina. Sin embargo, se prefiere usar una composición farmacéutica de conformidad con la invención la cual es formulada para aplicación tópica, en particular, como una solución, gel u otra formulación de liberación controlada, un ungüento o una crema o por medio de técnicas de suministro de fármaco invasivo, respectivamente, para ser administrado tópicamente vía la membrana de la ventana redonda o la membrana de la ventana oval al oído interno y directamente dentro del oído interno.

EJEMPLIFICACIÓN EJEMPLO 1 Métodos y Materiales Se desarrolló y probó un modelo animal de tinito inducido por excitotoxicidad coclear, el cual es provocado por trauma acústico. Como el tinito en general no es directamente observable, conforme la excitotoxicidad coclear no resulta en tiníto en todos los individuos, y como las percepciones de tinito pueden solo desaparecer en pocas horas después del incidente excitotóxico o durar para siempre, la definición e implementación de tal modelo animal representa un reto sustancial. Estas consideraciones significan por ejemplo, que más animales se requieren para obtener un número suficiente de casos de tinito para estudio y permitir observación de tinito durante un tiempo. Como no está claro si un caso de tinito inducido por excitotoxicidad coclear dura o no, es aconsejable conducir estudios en sus primeras etapas. Los experimentos se realizaron en dos etapas.

Primero, se evaluó la pérdida de audición después del trauma acústico agudo, asó como también la incidencia de tinito sin compuestos terapéuticos administrados. En la segunda etapa, se probó la eficacia de tres compuestos farmacéuticos en la supresión del tinito: S- (+) -cetamina, un antagonista del receptor NMDA (Sigma-Aldrich) , 7-cloroquinuretano (7-CK, Sigma-Aldrich) , otro antagonista del receptor NMDA, el cual fue probado previamente en un modelo de tinito inducido por salicilato (Guitton et al., J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)) como una referencia, y D-JNK1-1, un inhibidor peptídico de cinasa N-ter inal c-Jun (Xigen S.A.), el cual se muestra por proteger contra la muerte de células pilosas auditivas y pérdida de audición debido a trauma acústico (Wang et al., J. of Neuroscience 23 (24): 8596-8607 (2003)). Resultados experimentales de la primera etapa (es decir, no se usan compuestos farmacéuticos) sirven como un control.

Animales Los experimentos se realizaron con ratas Long- Evans por sus capacidades locomotoras superiores comparadas con otras ratas. Durante los experimentos, los animales se enjaularon individualmente a una temperatura constante con un ciclo día/noche de 12/12 horas. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron en la fase oscura, el periodo usual de actividad animal, para cada animal individualmente en aproximadamente el mismo tiempo cada día. Fuera de los experimentos, los animales recibieron agua y nutrición a voluntad. Se usaron un total de 60 animales: 30 para la primera etapa (de los cuales 25 son probados por las técnicas de comportamiento y 5 por electrofisiología) , y 30 para la segunda etapa con 10 para cada compuesto farmacéutico probado.

Trauma Acústico Agudo Se indujo el trauma acústico por un tono puro continuo de 6 kHz generado por un sintetizador que forma ondas (Hewlett-Packard 8904A) . Los animales se anestesiaron y se expusieron a nivel de presión de sonido de 130 dB (SPL) por 20 minutos, el cual se encaminó a través de un atenuador programable y se presentó a los oídos en campos libres vía un audífono JBL 075 colocado 10 cm en el frente de la cabeza del animal. Se midió el nivel de sonido usando un micrófono calibrado Bruel and Kjaer (4314) y un amplificador de calibración Bruel and Kjaer (2606) .

Acondicionamiento y Prueba de Comportamiento Los animales se acondicionaron para lograr la anulación activa (Guitton et al., J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)). Las pruebas de comportamiento consisten del desempeño de una tarea siempre que se produce un sonido en una caja de acondicionamiento con un piso eléctrico y un polo elevado. El acondicionamiento del animal se logró en un total de 10 sesiones, cada una dura entre 15 y 20 minutos, con estímulos de acondicionamiento de un tono puro a 50 dB SPL de 3 segundos de duración a una frecuencia de 10 kHz. Los estímulos incondicionales consisten de un choque eléctrico a la pata de los animales (3.7 mA) durante máximamente 30 segundos. Los intervalos interestímulos fueron de 1 segundo. Los choques eléctricos se detuvieron por el investigador una vez que animal se subió correctamente al polo. Los intervalos entre ensayos fueron al menos de un minuto de duración. El registro se definió como el desempeño del animal, medido por el número de casos cuando se sube correctamente al polo en respuesta al sonido. Tan pronto como el animal ha alcanzado un registro de al menos 80% en tres sesiones consecutivas, se considera exitosamente acondicionado y se emplea en los experimentos. Los animales se condujeron diariamente con las mediciones de ambos registros y respuestas falsas positivas durante una sesión de 10 minutos con 10 ensayos en total. Las respuestas falsas positivas son subidas al polo entre ensayos sin alguna estimulación acústica, es decir, durante periodos de silencio. Se puede interpretar como la percepción de tinito, conforme los animales realizaron la tarea de subirse en el polo como si estuvieran oyendo el estímulo (Guitton et al., J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003) ) . Los estímulos de sonido se aleatorizaron, y las descargas eléctricas a las patas solamente se suministraron si los animales no subieron al polo en respuesta al sonido.

Electrofisiologia El potencial de acción del compuesto (CAP) del nervio auditivo, se midió por un electrodo implantado en la membrana de la ventana redonda de los animales (con un electrodo de referencia colocado en un músculo del cuello) . El electrodo de referencia y el electrodo de la ventana redonda, se soldaron en un obturador fijo en el cráneo. Se aplicaron 10 ráfagas de tonos por segundo (con una duración de 9 ms y un ciclo aumento/descenso de 1 ms) , generadas por un generador de función arbitraria . (LeCroy Corp., modelo 9100R) , al oído del animal en presentaciones libres vía un audífono JBL 075. Se probaron 10 frecuencias (2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 26 y 32 kHz) con niveles de ráfagas de 0 hasta 100 dB SPL en las etapas de 5 dB. Se amplificaron las respuestas del nervio auditivo (Grass P511K, AstroMed Inc.), se filtraron (100 Hz hasta 3 kHz) y se promediaron en una PC (Dimensión Pentium, Dell) . Se midieron las amplitudes CAP pico a pico entre la primera depresión negativa NI y la onda positiva subsecuente Pl . El umbral CAP se define como la intensidad de sonido (en dB SPL) necesaria para estimular una respuesta medible (mayor de 5 µV) .

Farmacología Se anestesiaron animales con una inyección i.p. de dosis única, de 0.3 ml/kg de pentobarbital a 6% (Sanofi) y se operó bajo apropiadas condiciones asépticas directas después de la primera prueba de comportamiento (día 0) . Se abrieron dos ampollas a través de un procedimiento quirúrgico auricular posterior (procedimiento dorsal) . Después de la exposición de las dos cócleas, espumas de gel (Gelita tampon, B. Braun Medical AG) impregnadas con 2.5 µl de perilinfo artificial que contiene los compuestos farmacéuticos, se colocaron en cada una de las ventanas redondas de las dos cócleas. La concentración de todos los tres compuestos farmacéuticos usados fue 50 µM. Las ampollas entonces se cerraron con cemento dental (Unifast Trad, GC Corporation) , las heridas se desinfectaron y suturaron. Los animales entonces fueron expuestos a sonido traumatizante. Las pruebas de comportamiento se reanudaron 24 horas después del trauma acústico (día 1) , y se repitieron diariamente por un total de 8 días.

Estadísticas En cada experimento de comportamiento, se hicieron comparaciones de los parámetros relevantes de conformidad con un análisis de varianza de dos formas (ANOVA) (grupo x tiempo, con mediciones repetidas en el último factor) , para probar el efecto de medición (efecto de grupo) , el efecto de tiempo y las interacciones de grupo x tiempo. El ANOVA se siguió por comparaciones post-hoc (prueba Tukey) . Los análisis estadísticos de las mediciones CAP se hicieron de conformidad una de mas formas ANOVA seguidas por la prueba Dunnett. Todos los resultados se presentaron como media ± SEM.

Resultados Etapa 1 , compuesto terapéutico no administrado Como se esperaba, el sonido traumatizante conduce a una pérdida de audición permanente (5 animales probados con electrofisiología) . Como se muestra en la Fig. 1, un umbral permanente que cambia de máximamente 13 dB ± 2.0 debe ser observado a 10 kHz en el 7° día después del trauma acústico (el cual ha ocurrido en el día 1) . El trauma acústico también conduce a la disminución en el registro (25 animales probados en el modelo de comportamiento) . Como se muestra en la Fig. 2A, el registro promedio cayó significantemente del nivel inicial elevado del día 0 (es decir, antes del trauma acústico) de 87% ± 1.6 a uno bajo de 59% ± 1.0 al día 1, en donde el trauma acústico fue provocado (p < 0.001). Se puede observar la recuperación funcional parcial a partir del día 2 (69% ± 1.2), nivelándose al día 4 en un registro promedio de 80% ± 2.0. Los análisis estadísticos de los resultados muestran que la disminución observada en el registro es significante (p < 0.05), también a .partir del día 2 hasta el día 8 (80% ± 1.4 en el último día) . La capacidad reducida de animales para reaccionar correctamente a los estímulos de sonido acondicionados, es consistente con el hecho que la pérdida de audición provocada por el sonido traumatizante ha reducido significantemente su capacidad para escuchar sonido en la frecuencia de los estímulos acústicos. De manera interesante, se encontró que el número de positivos falsos difiere sustancialmente entre los animales probados después del trauma acústico, como se muestra en la Fig. 2B . Un grupo de animales (designados como grupo 1; n = 11) no mostró incremento en el número de positivos falsos en todos, aún después del trauma acústico (0.18 positivos falsos ± 0.12 en los días 0 y 1) . El resto de los 14 animales sin embargo, proporcionaron un incremento significante de positivos falsos de 0.34 ± 0.13 al día 0 a 4.28 ± 0.22 al día 1. Este aumento resultó ser reversible para 6 de ellos (grupo 2) , con el número de positivos falsos que caen a niveles normales nuevamente al día 2 y posteriormente. Los otros 8 animales sin embargo, (grupo 3) proporcionados después del incremento temporal, aún se elevan en otros en positivos falsos. El máximo de positivos falsos en esta segunda fase se observó al día 5 con 3.87 ± 0.29, y el efecto permanece estadísticamente significantemente a través del día 8 (2.25 + 0.25 positivos falsos en el último día de observación) . En otras palabras: existe primero un incremento reversible, el cual es entonces seguido por un incremento permanente en el número de respuestas positivas falsas al estímulo del sonido. Esto significa que después del trauma acústico, algunos animales no experimentaron tinito en todos (grupo 1) , algunos solamente en una forma temporal (grupo 2) , y algunos primero en una forma temporal y después nuevamente permanentemente por el resto del periodo de observaciones. Este resultado corresponde en principio, a observaciones generales en humanos.

Etapa 2, aplicación de compuestos terapéuticos Para probar si el mecanismo fundamental para la generación de tinito por trauma acústico se liga a la pérdida de células pilosas cocleares y/o a la inducción de excitotoxicidad, se aplicó localmente D-JNK1-1 a la membrana de la ventana redonda. Como se muestra en la Fig. 3A, el compuesto farmacéutico no previene la disminución de registro del día 0 (88% ± 2.5) al día 1 (65% ± 1.7). Sin embargo, el tratamiento resulta en rápida recuperación funcional completa a niveles pre-traumáticos al día 2 (90% ± 2.6), lo cual subsecuentemente persiste (92% ± 2.0 al día 8) . Mientras el D-JNK1-1 previene la pérdida de audición permanente después del trauma acústico, no tiene efecto significante en el número de positivos falsos y así en la prevención de tinito. Como la Fig. 3B muestra, los patrones de positivos falsos son al menos idénticos para algunos observados con el grupo de control (Fig. 2B) : mientras el grupo 1 (n = 4) no muestra incremento en todos (0.25 ± 0.25 positivos falsos en ambos días), los otros dos grupos muestran nuevamente un incremento estadísticamente significante (p < 0.05) en el número de positivos falsos del día 0 (0.33 + 0.21) al día 1 (4.66 ± 0.42). Como el grupo 2 (n = 2), el incremento es nuevamente a corto plazo, incremento completamente reversible, mientras el incremento temporal en el grupo 3 (n = 4) es nuevamente seguido por un aumento permanente en el número de positivos falsos (3.50 + 0.29 positivos falsos del día 4 y 2.25 + 0.25 al día 8). Completamente, estos resultados sugieren que la pérdida de células pilosas inducida por trauma acústico, no juega un papel importante en la generación de tinito, e indica la excitotoxicidad coclear como el mecanismo en su base. La aplicación local de los dos antagonistas del receptor NMDA 7CK y S- (+) -cetamina, proporcionó resultados, los cuales fueron muy similares entre sí. Como se muestra en la Fig. 4A y 5A, el registro promedio cae significantemente a partir del día 0 al día 1 y después se recupera, sin embargo a una velocidad más lenta que en los animales no tratados. Contrario a los animales no tratados, la estabilización del registro ocurre en los grupos de animales tratados con los antagonistas del receptor NMDA solamente al dia 6 (89% ± 2.3 y 88% ± 2.5, para animales tratados con S- (+) -cetamina y 7-CK respectivamente). Una posible explicación para esta diferencia puede ser que el bloqueo (parcial) de receptores NMDA es por neosinaptogénesis retardada, en donde puede tener un efecto neurotrófico, y así retardar la recuperación funcional. La administración de los dos antagonistas NMDA tiene por otro lado, un impacto sustancial en el número de positivos falsos (Fig. 4B y 5B) . Distinto de los animales no tratados o aquellos tratados con D-JNKl-1, no podría observarse un grupo, en donde un incremento permanente en el número de respuestas positivas falsas ocurre después de un incremento temporal inicial. No hubo ya sea, incremento en positivos falsos en todos (grupo 1; n= 5 y n = 4 para animales tratados con S- (+) -cetamina y 7CK, respectivamente), en donde los positivos falsos de 0.22 + 0.22 se observaron en los días 0 y 1, o solo el incremento reversible directo después del trauma acústico (grupo 2; n = 5 y n= 6 para animales tratados con cetamina y 7-CK, respectivamente) , con el número de positivos falsos originados desde 0.2 ± 0.2 (S- (+) -cetamina) y 0.33 ± 0.21 (7-CK) al día 9 a 5 ± 0.48 (S- (+) -cetamina) y 4.66 ± 0.42 (7-CK) al día 1. Así, no hubo observaciones del comienzo de un tinito persistente después del incidente de tinito temporal. Estos resultados demuestran que la administración local de los antagonistas del receptor NMDA a la cóclea, suprimen el tinito persistente inducido por excitotoxicidad coclear.

EJEMPLO 2 Métodos y Materiales Para evaluar los diferentes mecanismos de tinito inducido por salicilato y excitotoxicidad, se realizan análisis morfológicos comparativos de las estructuras sensorineurales cocleares, así como también inmunodetección de manchado Western después de los dos diferentes tipos de incidentes que inducen tinito.

Morfología Dos grupos de 3 ratas Long Evan, cada una es ya sea tratada dos veces al día con una inyección intraperitoneal de 350 mg/kg de salicilato de sodio por 2 días o traumatizadas como se describe en el Ejemplo 1. Después de la decapitación de las ratas bajo anestesia profunda (pentobarbital 50 mg/kg) , se removieron las cócleas del hueso temporal y se perfundieron con una solución fijadora de 2.5% de glutaraldehído en 0.1 M de salina amortiguada de fosfato (PBS), pH 7.3. Después se procesaron ya sea por microscopio de exploración (SEM) o transmisión (TEM) de electrón. Para SEM, la cápsula ótica se disectó y se removió la estría vascular, membranas j tectoriales y de Reissner. Después del aumento en PBS (pH 7.3), las muestras se deshidrataron en series graduadas de etanol (30-100%) , punto de secado crítico en C02, revestidas con paladio de oro y examinadas usando un microscopio Hitachi S4000. Para TEM, las cócleas se pos-fijaron en una solución acuosa al 1% de tetróxido de osmio por 2 horas, se enjuagaron en amortiguador de fosfato, se deshidrataron en series graduadas de etanol (30-100%) , y se empaparon en resina Epon. Las secciones ultradelgadas transversas del órgano de Corti, se toman de la mitad apical de la cóclea. Las secciones, montadas en gradillas de mallas o revestidas con formvar, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plata y se examinaron usando un microscopio Hitachi 7100.

Inmunodetección Tres grupos de 3 ratas Long Evans, fueron ya sea tratados dos veces cada 24 horas con una inyección intraperitoneal de 350 mg/kg de salicilato de sodio o se traumatizaron como se describe anteriormente. La dosis de salicilato usada se conoce por inducir tinito (Guitton et al., J. of Neurosciences 23 (9): 3944-3952 (2003)). Otro grupo de 3 animales sirvió como control y se inyectaron i.p., con una solución al 0.9% de NaCl del mismo volumen como los animales tratados con salicilato. Las muestras se obtuvieron después de 24 horas en el salicilato y grupos de control y 24 horas respectivamente, 5 días después del incidente para el grupo de trauma acústico. Como se ha mostrado en el Experimento 1, el tinito temporal ocurre 24 horas después del trauma, y se puede observar tinito persistente a partir del tercer día; por lo tanto se puede esperar que el tinito persistente este presente al día 5. Debido a que el salicilato no puede inducir tinito persistente, cualquier tratamiento y medición más allá de 24 horas, no se espera que proporcione resultados diferentes de aquellos después de 24 horas. Los tejidos se cosecharon en PBS frío y se homogenizaron en amortiguador de muestra, y los lisados se centrifugaron para remover material insoluble al detergente y se separaron en SDS-PAGE al 10% en Tris/Tricina. Después de electroforesis en gel, las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (membrana de transferencia PVDF Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, USA) . Los manchados primero se incubaron con un anticuerpo primario contra la subunidad del receptor NMDA NRl (dilución 1/100; anticuerpo policlonal de conejo, Chemicon international, USA) , y con una anti-actina del anticuerpo primario (dilución 1/50000, anti-ß-actina monoclonal de ratón, Sigma, USA) durante la noche a 4°C. Para verificar que el peso molecular de la subunidad NRl es idéntico en tanto el cerebro como cóclea, se realizaron inmunomanchados del cerebro de animales de control. Después, se realizó la incubación a 4°C durante 2 horas usando anticuerpos, el anticuerpo completo específico de especies biotiniladas, IgG anti-conejo (1/3500, Amersham Lifescience, USA) y el anticuerpo completo específico de especies biotiniladas, IgG anti-ratón (1/3500, Amersham Lifescience, USA) . Después, se hicieron lavados 5 x 10 min., con TBS-T (salina tween amortiguada Tris), incubación a 4°C durante 2 horas usando conjugado de fosfatasa alcalina de estreptavidina (1/5000, Amersham Lifescience, USA) . Los complejos proteína-anticuerpo se revelaron con BC1P/NBT (Sigma, USA) .

Después se realizó la exploración de imagen de manchados Western para semi-cuantificación de niveles de expresión de proteínas NRl y actina, usando software Biorad Fluor-S (una cantidad) .

Resultados Como se esperaba, los mecanismos fundamentales de tinito inducido por salicilato y excitotoxicidad, implican diferentes trayectorias y resultan en diferentes resultados morfológicos y fisiológicos. Como se muestra en la Fig. 6, la administración de salicilato deja la estereocilia de células pilosas externas sensorias (OHC) y células pilosas internas (IHC) intactas, aquellos animales los cuales se expusieron a trauma acústico muestran daño severo a haces estereociliarios OHC, así como también desarreglo en algunos casos aún en estereocilia IHC fusionada. No se pueden observar anormalidades ultraestructurales del complejo sináptico IHC en casos del tratamiento de salicilato, mientras en animales traumatizados, es evidente una hinchazón masiva y dramática de las dendritas aferentes radiales en el polo basal del IHC en el área del intervalo de frecuencia afectada, confirmado que ha ocurrido la excitotoxicidad. Están presente numerosas vacuolas en la parte apical del IHC y estereocilia formada anormalmente. El aumento elevado del polo IHC basal no muestra nuevamente anormalidades para el animal tratado con salicilato. Las terminales del nervio aferente son normales, y un anticuerpo presináptico característico es claramente visible. Contrario a esto, después del trauma, las terminales del nervio parecen hinchadas e interrumpidas. La Fig. 7, muestra la expresión de la subunidad NRl del receptor NMDA coclear después de la exposición a salicilato o trauma acústico, determinado por inmunodetección de Manchado Western. El tratamiento de salicilato no induce alguna modificación significante de la expresión de la subunidad del receptor NMDA NRl (4% superior que los animales de control) . Por el contrario, el trauma acústico conduce a una sobreexpresión clara 5 días después del incidente (+50% sobre los animales de control) , lo cual es consistente con la observación de tinito persistente. La diferencia en la expresión NMDA NRl, muestra que el tinito inducido por trauma acústico es una sobre-regulación de receptores NMDA, mientras que la de salicilato no. Esto confirma que el tinito inducido por salicilato es mediado por una trayectoria diferente, como se discute anteriormente. La Fig. 7, muestra además que 24 horas después del trauma, no hay sobreexpresión detectable (+8%) , lo cual sugiere que los mecanismos de tinito temporal y permanente después del trauma acústico son fundamentalmente diferentes.

Tomados en conjunto, los resultados del análisis morfológico e inmunodetección confirman la diferencia fundamental sugerida en mecanismos de acción entre tinito inducido por salicilato y excitotoxicidad. La excitotoxicidad, distinta del salicilato, daña el complejo sináptico de células pilosas internas e induce una sobre-regulación de los receptores NMDA, conduciendo en cambio, a la incidencia de tinito persistente. Como dos trayectorias diferentes en la regulación de respuestas NMDA coclear están involucradas, la eficacia de los antagonistas del receptor NMDA en la supresión de tinito persistente inducido por excitotoxicidad coclear, podría realmente, no ser presumida por un modelo de tinito inducido por salicilato.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar tinito inducido por excitotoxicidad coclear en un humano, caracterizado porque el método comprende administrar a un humano, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NMDA, efectivo para suprimir o reducir la actividad aberrante mediada del receptor NMDA del nervio auditivo en un humano en necesidad de tal tratamiento.

2. Un método para prevenir tinito inducido por excitotoxicidad coclear en un humano, caracterizado porque el método comprende administrar a un humano, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NMDA, efectiva para prevenir la actividad aberrante mediada por el receptor NMDA del nervio auditivo en un humano en necesidad de tal tratamiento.

3. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 6 2, caracterizado porque el antagonista del receptor NMDA se selecciona del grupo que consiste de cetamina, 7-cloroquinurenato, D-AP5, MK 801 y gaciclidina.

4. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la excitotoxicidad coclear es provocada por una incidencia seleccionada del grupo que consiste de trauma acústica, presbiacusia, isquemia, anoxia, tratamiento con una o más de las medicaciones ototóxicas y sordera súbita.

5. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la composición • farmacéutica se administra tópicamente vía la membrana de la ventana redonda o la membrana de la ventana oval al oído interno.

6. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2,- caracterizado porque la composición farmacéutica se administra tópicamente por medio de técnicas de suministro del fármaco invasivo al oído interno.

7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la excitotoxicidad coclear se caracteriza como aguda.

8. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la excitotoxicidad coclear se caracteriza como repetida.

9. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la excitotoxicidad coclear se caracteriza como prolongada o crónica.