ES2327604T3 - Medicamento para proteccion contra las enfermedades tromboticas. - Google Patents

Abstract

Medicamento para la protección contra enfermedades trombóticas, caracterizado porque comprende un anticuerpo, que induce una desactivación o degradación irreversible del receptor de colágeno en los trombocitos y se fija al mismo epítope del receptor de colágeno GPVI en los trombocitos que el anticuerpo monoclonal JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487.

Description

Medicamento para protección contra las enfermedades trombóticas.

El objeto de la invención es un medicamento para la protección contra enfermedades trombóticas que comprende un anticuerpo dirigido contra la glicoproteína receptora del colágeno de las plaquetas (GP)VI; que se fija al mismo epítope del receptor de colágeno en los trombocitos que el anticuerpo monoclonal JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487.

La agregación de las plaquetas es un mecanismo fundamental para la hemostasis normal, que limita la pérdida de sangre después de un traumatismo tisular (1; 2), pero puede conducir a oclusión arterial en el caso de ateroesclerosis y precipitar enfermedades tales como infarto de miocardio (3; 4). La trombosis arterial se inicia a menudo por ruptura brusca de la placa ateroesclerótica y deposición y activación de plaquetas en las capas subendoteliales (4; 5). Aunque varios de los componentes macromoleculares de la capa subendotelial tales como laminina, fibronectina, y el factor von Willebrand (vWf), proporcionan todos ellos un sustrato adecuado para la adhesión de las plaquetas, el colágeno fibrilar se considera como el constituyente más trombógeno del subendotelio vascular dado que no sólo respalda la adhesión plaquetaria, sino que es también un fuerte activador de las plaquetas (6; 7). La interacción entre plaquetas y colágeno implica primeramente adhesión y, posteriormente, activación que conduce a adhesión en segunda fase, secreción, y finalmente agregación (8; 9). Además de GPIb-IX-V, que interacciona indirectamente con el colágeno por la vía del factor von Willebrand (10), varios receptores de colágeno han sido identificados en las plaquetas, con inclusión de la integrina \alpha_{2}\beta_{1} (11), y el GPVI distinto a integrina (12). Actualmente está aceptado que la integrina \alpha_{2}\beta_{1} es el receptor principal que respalda la adhesión de las plaquetas al colágeno, mientras que GPVI media la activación (13-15). La clonación muy reciente de GPVI humano y de ratón ha demostrado que este receptor es una glicoproteína transmembranal de tipo I de 60-65 kDa perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas (16; 17) que forma un complejo con la cadena \gamma de FcR en la superficie celular en las plaquetas humanas y de ratón (14; 15; 18). La señalización a través de GPVI ocurre por un camino similar al utilizado por los inmunorreceptores (19) como ha sido revelado por la fosforilación de la tirosina del motivo de activación basado en el inmunorreceptor de tirosina (ITAM) de la cadena \gamma de FcR por una quinasa afín a src (20; 21). Los pacientes deficientes en GPVI sufren de una diatesis hemorrágica moderada y sus plaquetas exhiben respuestas claramente deterioradas al colágeno (12; 22). Adicionalmente, las plaquetas de los ratones deficientes en la cadena \gamma de FcR, que carecen de GPVI (15), fallan también en la agregación
en respuesta al colágeno (14; 19) pero no se ha consignado que ocurran hemorragias importantes en estos ratones.

Por esta razón, se ha propuesto que GPVI puede tener una función central como receptor de colágeno para activación de las plaquetas humanas. En los ratones, parecen existir mecanismos similares dado que las plaquetas de los ratones deficientes en la cadena \gamma de FcR no se agregan en respuesta al colágeno. En la solicitud de patente internacional WO 01/00810, se describen ya anticuerpos contra GPVI que, sin embargo, no se sabe que eliminen GPVI de modo irreversible.

La función de GPVI ha sido investigada ahora adicionalmente en ratones de control y deficientes en la cadena \gamma de FcR con un solo anticuerpo monoclonal (mAb) contra GPVI (JAQ1).

Los resultados de estas investigaciones pueden resumirse como sigue:

Sobre plaquetas de tipo salvaje, JAQ1 inhibía la agregación plaquetaria inducida por el colágeno, pero no la agregación plaquetaria inducida por PMA (12-miristato-13-acetato de forbol) o trombina. La reticulación de JAQ1 fijado, por otra parte, inducía la agregación de las plaquetas de tipo salvaje, pero no de las deficientes en la cadena \gamma de FcR. JAQ teñía las plaquetas y los megacariocitos de tipo salvaje pero no de los ratones deficientes en la cadena \gamma de FcR. Adicionalmente, JAQ1 reconocía GPVI (aproximadamente de 60 kD) en experimentos de inmunoprecipitación y transferencia Western de las plaquetas de tipo salvaje, pero no de las deficientes en la cadena \gamma de FcR . Estos resultados sugieren claramente que GPVI es el receptor de colágeno responsable de la activación plaquetaria en los ratones y demuestran que la asociación con la cadena \gamma de FcR es crítica para su expresión y función.

Estudios ulteriores demostraron claramente que JAQ1 reacciona de modo cruzado con GPVI humana (Niswandt B, resultados no publicados).

Basándose en estos resultados, se ha encontrado ahora que un medicamento es eficaz contra las enfermedades trombóticas si el mismo comprende un principio activo que induce una desactivación o degradación irreversible de un receptor de colágeno en los trombocitos. Este principio activo puede ser un compuesto químico o un anticuerpo monoclonal o policlonal. Un anticuerpo monoclonal preferido es JAQ1 y el receptor de colágeno preferido es GPVI plaquetario. Si se utiliza el anticuerpo monoclonal JAQ1, el mismo debe ser un anticuerpo monoclonal JAQ1 humanizado. La línea de células de hibridoma que secreta JAQ1 ha sido depositada bajo DSM ACC 2487 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH de Braunschweig de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Un objeto adicional de la invención es un agente de diagnóstico que contiene el anticuerpo monoclonal o policlonal marcado dirigido contra el epítope GPVI como se define por JAQ1, para la determinación de la tasa de expresión del receptor de colágeno GPVI. Los pacientes con niveles superiores a los normales se reconocerán por tanto como amenazados por complicaciones trombóticas, en tanto que los pacientes con niveles de GPVI inferiores a los normales se ven expuestos a sucesos hemorrágicos.

El anticuerpo JAQ1 puede marcarse por cualquier método convencional, todos los cuales están disponibles para los expertos en el campo del diagnóstico. El mismo puede marcarse radiactivamente, marcarse por fluorescencia, marcarse enzimáticamente, o puede contener cualquier otro marcador que permita la detección del anticuerpo en las células o en el tejido. El procedimiento de diagnóstico puede realizarse como sigue:

a)

una muestra de sangre diluida del paciente se incuba con JAQ1 marcado por fluorescencia durante 15 minutos a la temperatura ambiente y las plaquetas se analizan directamente por citometría de flujo;

b)

una muestra de sangre del paciente se fija en un vehículo sólido y se trata subsiguientemente con el anticuerpo JAQ1 marcado solo o en mezcla con anticuerpo JAQ1 sin marcar, seguido por la detección del anticuerpo marcado por métodos convencionales.

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Pueden realizarse estos y otros procedimientos de diagnóstico alternativos conocidos. Es muy adecuado el uso del anticuerpo monoclonal JAQ1 marcado por fluorescencia en citometría de flujo.

Se han realizado los experimentos siguientes:

Materiales y métodos

Animales. Ratones exentos de patógenos específicos (NMRI) de 6 a 10 semanas de edad se obtuvieron de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se mantuvieron en las instalaciones de animales de los autores de la invención.

Productos químicos. Los fármacos anestésicos xilazina (Rompun®) y quetamina (Imalgene 1000®) fueron suministrados por Bayer (Leverkusen, Alemania) y Mérial (Lyon, Francia), respectivamente. Papaína inmovilizada (Pierce, Rockford IL, EE.UU.), heparina de peso molecular alto (ADP, 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA), (todos ellos de Sigma, Deisenhofen, Alemania), Annexina V marcada con FITC (Boehringer Mannheim, Alemania) y colágeno (Kollagenreagent Horm, Nycomed, Munich, Alemania) eran adquiridas. CRP (KGO-(GPO)_{10}-KGOG) (código de aminoácidos de una sola letra donde O = hidroxiprolina) y convulxina fueron suministrados amablemente por S.P. Watson (Oxford, Reino Unido). La convulxina marcada con FITC era un obsequio generoso de N. Jandrok-Perrus (París, Francia).

Anticuerpos. El mAb RB40.34 de P-selectina anti-ratón de rata fue suministrado amablemente por D. Vestweber (Münster, Alemania). Los anticuerpos policlonales de conejo para fibrinógeno humano y vWF fueron adquiridos de DAKO (Glostrup, Dinamarca) y fueron modificados en los laboratorios de la Solicitante. El anti-isocianato de fluoresceína de conejo (FITC)-HRP era de DAKO. Los anticuerpos monoclonales contra las subunidades \alpha2 y \beta1 de integrina eran de Pharmingen. Todos los restantes anticuerpos fueron generados, producidos, y modificados en los laboratorios de la Solicitante y han sido descritos (23, 24). Modificación de los anticuerpos: fragmentos Fab de JAQ1 fueron generados por incubación durante 12 horas de 10 mg/ml de mAb con papaína inmovilizada (Pierce), y las preparaciones se aplicaron luego a una columna de proteína A inmovilizada seguida por una columna de proteína G inmovilizada (Pharmacia) para eliminar los fragmentos Fc y cualquier IgG no digerida. La pureza de los fragmentos Fab se comprobó por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y tinción del gel con plata. Se generaron fragmentos F(ab)_{2} de JON/A (GPIIb/IIIa anti-ratón) como se ha descrito (24).

Preparación y recuento de las plaquetas. Los ratones se sangraron bajo anestesia con éter en el plexo retroorbital. Se recogió la sangre en un tubo que contenía 10% (v/v) de citrato de sodio 0,1M o 7,5 U/ml de heparina y se obtuvo plasma rico en plaquetas por centrifugación a 300 g durante 10 minutos a la temperatura ambiente (TA). Para determinación de los recuentos de plaquetas, se obtuvo sangre (20 \mul) del plexo retroorbital de ratones anestesiados utilizando microcapilares siliconizados y se diluyó inmediatamente en relación 1:100 en kits Unopette (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). La muestra de sangre diluida se dejó sedimentar durante 20 minutos en un hemocitómetro Neubauer Mejorado (Superior, Bad Mergentheim, Alemania), y las plaquetas se contaron en un microscopio con contraste de fase a 400 aumentos.

Inmunotransferencia. Las plaquetas (3 x 10^{8}) se lavaron tres veces con PBS y se solubilizaron subsiguientemente en 0,3 ml de tampón de lisis (solución salina tamponada con Tris que contenía Tris/HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 \mug/ml de leupeptina, y 0,5% de Nonidet P-40, todos ellos de Boehringer Mannheim) durante 30 min a 40ºC. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación (15.000 g, 10 minutos) y el extracto celular total se pasó a través de un gel de SDS-PAGE en condiciones no reductoras y se transfirió a una membrana de PVDF. La membrana se incubó primeramente con 5 \mug/ml de anticuerpo primario marcado con FITC seguido por peroxidasa de rábano picante anti-FITC de conejo (1 \mug/ml). Las proteínas se visualizaron por ECL.

Electroforesis 2D. Las plaquetas lavadas se redujeron a un sedimento y se resuspendieron en Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, sacarosa 0,25M. Las plaquetas se solubilizaron por adición de 4 vol de urea 8,75M, tiourea 2,5M, DTT 25 mM, Triton X-100 1,25% y anfolitos 3-10, 0,75%. La electroforesis bidimensional en gel (2D-E) se llevó a cabo como se ha descrito (25). Resumidamente, la IEF se llevó a cabo con gradiente de pH inmovilizado disponible comercialmente (gradiente de pH lineal 3-10, 7 cm de longitud), utilizando el aparato Protean IEF Cell (Biorad, Marnes-la-Coquette, Francia). Los geles se rehidrataron en presencia de las muestras (lisados de plaquetas correspondientes a 5 x 10^{7} plaquetas) durante 18 h y se enfocaron para 20.000 Vh. Después de la IEF, las tiras de gel se incubaron a la temperatura ambiente en soluciones que contenían DTT y a continuación yodoacetamida como se ha descrito (26). Los geles se sometieron luego al paso en la segunda dimensión y se tiñeron con plata.

Agregometría. Para determinar la relación plaquetaria, se midió la transmisión de la luz utilizando prp (200 \mul con 0,5 x 10^{6} plaquetas/\mul). La transmisión se registró en un agregómetro Fibrintimer de 4 canales (APACT Laborgeräte und Analysensysteme, Hamburgo, Alemania) durante 10 minutos y se expresó como unidades arbitrarias con 100% de transmisión ajustada con plasma. La agregación plaquetaria se indujo por adición de colágeno (5-50 \mug/ml), PMA (50 ng/ml), o ADP (10 \muM).

Citometría de flujo. Se diluyó sangre entera heparinizada en relación 1:30 con tampón Tyrodes HEPES modificado (NaCl 134 mM, Na_{2}HPO_{4} 3,04 mM, KCl 2,9 mM, NaHCO_{3} 12 mM, HEPES 20 mM, glucosa 5 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH 6,6) y se dejó durante 30 min a 37ºC antes de la estimulación. Las muestras se estimularon con las concentraciones indicadas de ADP o CRP durante 2 min a TA, se tiñeron con mAbs marcados con fluoróforos durante 10 min a TA, y se analizaron directamente en un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg). El análisis citométrico de flujo de la fijación de Annexina V-FITC a plaquetas inactivas y activadas (combinación de 50 \mug/ml de colágeno y 0,01 U/ml de trombina) se midió de acuerdo con las condiciones del fabricante.

Experimentos in vivo . Los anticuerpos (en 200 \mul de PBS) se inyectaron intraperitonealmente. Tromboembolia inducida por colágeno y epinefrina: Se anestesiaron los ratones por inyección intraperitoneal de 150 \mul de una mezcla de 0,08% de xilazina base (Rompun, Bayer, Alemania) y 1,6% quetamina (Imalgen 1000, Mérial, Francia). Los ratones anestesiados recibieron una mezcla de colágeno (0,8 mg/kg) y epinefrina (60 \mug/kg) inyectada en la vena yugular (27). Las incisiones de los ratones supervivientes se cosieron, y se dejó que los animales se recuperaran. Se realizaron estudios necroscópicos e histológicos sobre pulmones fijados en formaldehído al 4% y se tiñeron con hematoxilina/eosina secciones en parafina. Experimentos de tiempo de hemorragia: Se anestesiaron los ratones y se amputaron 3 mm de la punta del rabo con un escalpelo. La cola se secó luego con papel de filtro cada 15 s hasta que el papel ya no se manchaba de sangre (28). En caso necesario, se detuvo manualmente la hemorragia en el punto temporal de 10 minutos para prevenir la muerte. Los experimentos se condujeron de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales.

Inmunohistoquímica. Se bloquearon criosecciones fijadas en acetona (6 \mum) (5% de suero normal de cabra, 5 mg/ml de seroalbúmina bovina, BSA en PBS) durante 30 min a la temperatura ambiente. Se añadió p0p1 conjugado a HRP (GPIb-IX anti-ratón (23)) a una concentración final de 2 \mug/ml durante 90 min y se añadió el sustrato AEC después de los tres pasos de lavado. Las secciones se sometieron luego a contratinción con hematoxilina.

Adhesión plaquetaria. El colágeno (2 \mug) en 100 \mul de PBS se inmovilizó en placas F96 MaxiSorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania) a 4ºC durante una noche. Las placas se saturaron luego con 1 mg/ml de BSA en PBS durante 3 h a 37ºC y se lavaron con PBS. Las plaquetas lavadas en tampón Tyrode's-albúmina (10^{6}/pocillo) se incubaron en los pocillos durante hasta 45 min. Se lavaron las placas 3 veces con PBS y se incubaron luego con anti-GPIb-IX marcado con HRP (p0p1) durante 30 min a la temperatura ambiente, y se añadió TMB a cada pocillo después de tres pasos de lavado. La reacción se paró por adición de H_{2}SO_{4} 2N después de 10 min. La absorbancia a 450 nm se registró en un instrumento Multiskan MCC/340 (Labsystems, Lugano, Suiza). Los resultados pueden resumirse como sigue:

En el estudio presente, se investigaron los efectos antitrombóticos de JAQ1 in vivo. La inyección de JAQ1 (100 \mug) causaba trombocitopenia moderada y transitoria con un descenso máximo de los recuentos de plaquetas de aproximadamente 34 \pm 7,4% el día 1 y un retorno a los valores normales al cabo de 72 h donde aquéllos se mantuvieron durante al menos 11 días más (Fig. 1a). La inyección de dosis mayores (200 \mug) o menores (50 \mug) tenía efectos comparables sobre los recuentos de plaquetas (Fig. 1a). El descenso transitorio de los recuentos de plaquetas no era dependiente de Fc, dado que fragmentos Fab de JAQ1 tenían efectos similares (Fig. 1b). Los ratones tratados con JAQ1 no exhibían signo alguno de reacciones anafilácticas como las que se sabe son inducidas por los anticuerpos monoclonales anti-GPIIb/IIIa (30) y no producían hemorragia espontánea durante al menos 3 semanas. JAQ1 era detectable inmunohistoquímicamente en los megacariocitos esplénicos y derivados de médula ósea 3 h después de la inyección de anticuerpo, demostrando que el mAb alcanzaba estas células en ambos órganos.

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El tratamiento con JAQ1 anula las respuestas plaquetarias al colágeno y péptidos afines al colágeno ex vivo durante al menos dos semanas

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Se estudió el efecto de JAQ1 sobre las plaquetas circulantes ex vivo en momentos diferentes después de la inyección de anticuerpo. La expresión superficial basal de los receptores principales de glicoproteína (GP), GPIIb/IIIa y GPIb-IX-V, CD9, e integrina \alpha_{2}\beta_{1} se mantuvo inalterada en comparación con las plaquetas de control al cabo de 3, 7, y 14 días después de la inyección del anticuerpo (Tabla 1). En ningún momento después de la inyección del anticuerpo exhibían las plaquetas circulantes indicio alguno de activación, como se demostraba por la falta de fibrinógeno unido a la superficie y P-selectina expresada en la superficie (Tabla 1). Los días 3, 7, y 14, las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 eran resistentes frente a la activación con el péptido afín al colágeno (CRP hasta 30 \mug/ml), que se sabe es un fuerte agonista de las plaquetas específico de GPVI (31) (Fig. 2a). En contraste, ADP inducía activación normal (fijación de fibrinógeno) de estas plaquetas. Adicionalmente, las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 eran completamente resistentes a la activación con colágeno a concentraciones de hasta 50 \mug/ml ex vivo, y este profundo efecto inhibidor duraba también al menos 14 días después de una sola inyección de 100 \mug de JAQ1 (Fig. 2b). En contraste con el colagéno, ADP y PMA inducían agregación normal de estas plaquetas, lo que indicaba que JAQ bloqueaba específicamente los caminos de activación de las plaquetas dependientes de GPVI, en tanto que no se veían afectadas otras funciones. In vitro, concentraciones saturantes de JAQ1 (20 \mug/ml) exhibían solamente un efecto inhibidor limitado sobre la agregación plaquetaria inducida por colágeno, que podía resolverse cuando se utilizaban concentraciones de colágeno mayores que \sim7 \mug/ml (Fig. 2c), confirmando resultados anteriores (29).

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JAQ1 induce la pérdida de GPVI en las plaquetas circulantes in vivo

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La discrepancia entre el efecto inhibidor de JAQ1 sobre la agregación inducida por colágeno in vitro y ex vivo era sorprendente y sugería que deben estar implicados mecanismos distintos del bloqueo puro de un epítope de GPVI. Por esta razón, el paso siguiente consistió en testar plaquetas de ratones tratados con JAQ1 en cuanto a la presencia de GPVI en un análisis de transferencia Western de lisados de células enteras. Como se muestra en la Figura 3A, GPVI no era detectable en las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 durante al menos 14 días después de una sola inyección de JAQ1, en tanto que GPIIIa estaba presente en cantidades normales en cualquier momento. En contraste, en todos los ratones testados, eran detectables nuevas plaquetas que expresaban GPVI funcional al cabo de 28 días. Para evaluar adicionalmente la ausencia de GPVI sobre las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1, se utilizó la toxina de veneno de serpiente específica de GPVI, convulxina (32). Como se muestra en Fig. 3b, la convulxina no inducía agregación de las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 en los días 3, 7, y 14, en tanto que inducía agregación de las plaquetas de control en presencia o ausencia de cantidades saturantes de JAQ1. Adicionalmente, el análisis por citometría de flujo demostró que la convulxina marcada con FITC no se fijaba a las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 (Fig. 3c). Finalmente, la ausencia de una proteína de \sim60 kD con un punto isoeléctrico de 5,6 en las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 se confirmó por electroforesis 2-D en gel. En conjunto, estos resultados sugerían claramente que GPVI había sido desactivado y eliminado irreversiblemente de estas plaquetas in vivo.

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La pérdida GPVI inducida por JAQ1 ocurre rápidamente in vivo y es independiente de Fc

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Para examinar los mecanismos que subyacen en la pérdida de GPVI, se inyectaron ratones con JAQ biotinilado y se determinó la cantidad de mAb fijado a la superficie por citometría de flujo ex vivo en momentos tempranos después de la inyección. Resulta interesante que, tan pronto como seis horas después de la inyección, únicamente eran detectables niveles muy bajos de JAQ1 fijado a la superficie y las señales disminuían adicionalmente hasta los valores de control después de 24 y 48 h en tanto que JAQ1^{FITC} y Cvx^{FITC} no se fijaban a las plaquetas en ningún momento. Estos datos sugerían que el complejo JAQ1-GPVI se había aclarado de la superficie de dichas plaquetas en el transcurso de 6 h. En contraste, las plaquetas de los ratones inyectados con un mAb biotinilado contra GPV (24) producían constantemente tinción positiva con estreptavidina marcada con FITC. En el paso siguiente, se testaron lisados de células enteras procedentes de plaquetas de ratones tratados con JAQ1 en cuanto a la presencia de GPVI y el mAb biotinilado. JAQ1 era claramente detectable en las plaquetas 6 h después de la inyección, mientras que las señales disminuían acusadamente a las 24 h y aún más a las 48 h. Se encontró un cuadro similar para GPVI, lo que sugería claramente que el complejo JAQ-GPVI había llegado a internalizarse y se degradaba en el transcurso de 2 días. En contraste con sus efectos in vivo, JAQ no inducía regulación decreciente detectable alguna de GPVI superficial en el transcurso de 6 horas de la incubación a 37ºC sobre las plaquetas lavadas o en sangre entera (heparinizada o adicionada de citrato), lo que indicaba que puede ser necesaria una segunda señal para inducir este efecto y que esta señal está ausente in vitro.

Para determinar si la parte Fc de JAQ1 o su forma divalente se requiere para la internalización/degradación de GPVI, se administraron a ratones 100 \mug de fragmentos Fab del mAb y se testaron las plaquetas en cuanto a la presencia de GPVI después de 48 h. Los fragmentos Fab, al igual que la IgG intacta, inducían la pérdida completa de GPVI de las plaquetas circulantes y las células eran completamente resistentes frente a la activación con CRP, colágeno o convulxina.

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Las plaquetas empobrecidas en GPVI exhiben adhesión reducida al colágeno y actividad procoagulante dependiente de colágeno anulada

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Se cree actualmente que GPVI es el receptor del colágeno plaquetario para la activación, mientras que la integrina \alpha_{2}\beta_{1} y GPIb-V-IX (por la vía de vWF) median la adhesión. Como se ha demostrado anteriormente (Tabla 1), la expresión superficial basal de ambos receptores no se veía influenciada por el tratamiento con JAQ1. Experimentos ulteriores demostraron que las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 fijaban niveles normales de vWF en presencia de botrocecetina y la trombina inducía la activación normal de las integrinas \beta_{1} como se evalúa con el mAb 9EG7, que reconoce específicamente la forma activada de la subunidad \beta1 (33) (Fig. 4a). En el paso siguiente, se testó en un ensayo estático la adhesión de plaquetas de ratones tratados con JAQ1 al colágeno. Como se muestra en Fig. 4b, la adhesión de las plaquetas de ratones tratados con JAQ1 se reducía claramente en comparación con las plaquetas de control y se anulaba en ausencia de magnesio/calcio extracelulares libres, lo que sugería claramente que la misma era mediada predominantemente por la integrina \alpha_{2}\beta_{1} (34). Es bien sabido que GPVI está involucrado críticamente en la respuesta procoagulante de las plaquetas, en tanto que las plaquetas estimuladas exponen la fosfatidilserina (PS) cargada negativamente en la membrana plasmática, lo que facilita la generación de trombina (35). De hecho, las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 no exponían PS en respuesta a una combinación de colágeno y trombina en los días 3, 7,
y 14 después de la inyección del anticuerpo, como se demostraba por la ausencia de fijación de Annexina V (Fig. 4c).

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El tratamiento anti-GPVI induce protección antitrombótica a largo plazo pero solamente tiempos de hemorragia moderadamente incrementados

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Los resultados de los experimentos previos sugerían que JAQ1 inducía específicamente un agotamiento completo de GPVI de las plaquetas in vivo. Para examinar en qué proporción este defecto específico influía en la hemostasis normal, se determinaron los tiempos de hemorragia del rabo el día 7 después de una inyección de bolus de JAQ1 (100 \mug). Como se muestra en Fig. 5, los tiempos de hemorragia se incrementaban significativamente en los ratones empobrecidos en GPVI comparados con ratones de control (330 \pm 103 frente a 158 \pm 89 s, respectivamente), pero consistentemente menores que en los ratones pre-tratados con 100 \mug de fragmentos bloqueantes F(ab)_{2} contra GPIIb/IIIa (24) (>600 s). En el paso siguiente, se examinó el efecto protector de JAQ1 en un modelo de tromboembolia pulmonar letal inducida por infusión de una mezcla de colágeno (0,8 mg/kg de peso corporal) y epinefrina (60 \mug/kg de peso corporal) (27). Entre los ratones de control pretratados con IgG2a irrelevante de rata, 95% (19 de 20) morían en el transcurso de 5 min por trombosis pulmonar generalizada y parada cardíaca. En contraste, todos los ratone pretratados con JAQ1 (100 \mug) sobrevivían, con indiferencia de si habían recibido el mAb 3, 7, o 14 días antes de la exposición (n = 8 por grupo) (Fig. 6a). Si bien los recuentos de plaquetas en los ratones pretratados con JAQ1 no se habían visto influidos significativamente por la infusión de colágeno/epinefrina, había una disminución neta detectable en los ratones de control (n = 8) que se determinó tres minutos después de la inducción de la tromboembolia en un grupo separado (Fig. 6b). Para examen histológico, ratones de control y pretratados con JAQ1 (3, 7 y 14 días) recibieron el mismo tratamiento en experimentos paralelos, pero los pulmones se extirparon al cabo de 3 min. Si bien la gran mayoría de los vasos grandes y pequeños estaban obstruidos por trombos ricos en plaquetas en los pulmones de los ratones de control, había solamente un número muy pequeño de trombos detectables en los pulmones de los ratones pretratados con JAQ1 (Fig. 6c).

Así pues, pudo demostrarse que el tratamiento de los ratones con un anticuerpo monoclonal contra GPVI da como resultado una protección antitrombótica profunda a largo plazo contra la tromboembolia dependiente del colágeno. Estos resultados confirman el papel crítico propuesto en GPVI en la activación plaquetaria inducida por el colágeno in vivo e indican que los agentes anti-GPVI podrían ser eficaces en la prevención de la trombosis arterial inducida por la rotura de la placa ateroesclerótica, creyéndose que las placas llegan a activarse principalmente por el subendotelio en condiciones de estrés por cizallamiento alto (4; 5; 36). Entre las proteínas de la matriz que respaldan la adhesión plaquetaria y la activación subsiguiente, el colágeno tiene un papel crítico, al menos en la hemostasis normal dado que los pacientes con defectos en los receptores de colágeno exhiben trastornos hemorrágicos moderados (12; 37; 38). Aunque el papel de GPIb, GPIIbIIIa y sus ligandos respectivos factor von Willebrand (vWF) y fibrinógeno en la trombosis están bien documentados (como ha sido revisado por Z.M. Ruggeri (39)), el descubrimiento de que los ratones desactivados doblemente en vWF y fibrinógeno son todavía capaces de formar trombos oclusivos sugiere que el colágeno y sus receptores plaquetarios podrían tener también un papel crítico en la trombosis (40).

El profundo efecto inhibidor de JAQ1 in vivo resultó inesperado, dado que estaba basado en el aclaramiento de GPVI de las plaquetas circulantes y hasta ahora no ha sido descrito ningún agotamiento específico de este tipo de un receptor plaquetario. La pérdida completa de GPVI funcional en las plaquetas circulantes de los ratones tratados con JAQ1 se confirmó por diferentes métodos. En primer lugar, la proteína no era detectable en un análisis por transferencia Western de lisados de plaquetas durante al menos dos semanas (lo que excede del tiempo de vida normal de las plaquetas (41)). En segundo lugar, la toxina de veneno de serpiente específica de GPVI convulxina, que se fija a un epítope distinto de JAQ1 (Fig. 3b, c) no se fijaba a las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1, lo que sugería claramente la ausencia de GPVI de la membrana plaquetaria. En tercer lugar, una proteína de \sim60 kD con un punto isoeléctrico de \sim5,6 (que es similar al descrito para la GPVI humana (42)) está ausente en el lisado de plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 (Fig. 4), y la misma proteína está ausente en las plaquetas de ratones deficientes en cadena \gamma de FcR (no representado), que se sabe carecen de GPVI (15). Es de la máxima importancia que las respuestas plaquetarias funcionales al colágeno eran anuladas completamente por JAQ in vivo, mientras que el mAb tiene solamente efectos inhibidores limitados in vitro (29). (Fig. 2c). Estos resultados demuestran que JAQ1 inducía el aclaramiento de GPVI desde la superficie de las plaquetas circulantes in vivo. Este descubrimiento está respaldado también por la observación de que era detectable JAQ biotinilado en los lisados, pero no en la superficie, de las plaquetas 6 horas después de la inyección, y lo mismo se encontró para GPVI. Adicionalmente, las señales decrecientes tanto para GPVI como para JAQ1 después de 24 y 48 horas sugieren claramente que el complejo internalizado se degradaba en los compartimientos intracelulares. GPVI pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y está estrechamente relacionado con inmunorreceptores, algunos de los cuales pueden llegar a internalizarse cuando se estimulan adecuadamente (43; 44). En el caso de JAQ-1-GPVI era difícil definir cuál es el estímulo apropiado, pero parece estar claro que la parte Fc del mAb no se requiere para inducir la internalización, dado que los fragmentos Fab producían el mismo efecto, excluyendo también por tanto el requerimiento de la aglomeración de GPVI. In vitro, JAQ1 no inducía la regulación decreciente de GPVI a partir de la membrana plaquetaria (Fig. 5a), lo que sugiere que puede ser necesaria una segunda señal para la inducción de este proceso que es proporcionado por otras células in vivo. Esta suposición puede verse respaldada por la observación de que los fragmentos de JAQ y Fab del mAb inducían trombocitopenia transitoria. La razón de esto no está clara, pero podría ser debida a la activación débil de GPIIb/IIIa, que conduce a la formación de agregados inconsistentes y su secuestración temporal en el bazo, donde puede tener lugar la pérdida real de GPVI. Pruebas recientes indican que JAQ1 reconoce un epítope idéntico a o en proximidad estrecha al sitio de fijación de CRP en GPVI (29) que se considera como el sitio de fijación principal para colágeno en el receptor. Hasta ahora, se sabe muy poco acerca de la regulación celular de GPVI, pero a la vista de los datos actuales parece posible que la ocupación de este epítope proporcione una señal que dé finalmente como resultado la regulación decreciente del receptor.

Con indiferencia del mecanismo subyacente, las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 eran completamente insensibles frente a la activación con concentraciones elevadas de CRP o colágeno, mientras que eran normalmente activables con ADP o PMA. Esto sugiere claramente que JAQ1 inducía selectivamente una deficiencia transitoria de GPVI en los ratones, mientras que otras glicoproteínas de la membrana, con inclusión de GPIIb/IIIa, GPIb-IX-V, CD9, y la integrina \alpha_{2}B_{1} no se veían afectadas en expresión y/o función. Los ratones tratados con JAQ1 tenían tiempos de hemorragia prolongados, lo que confirma el importante papel de GPVI en la hemostasis normal y está bien correlacionado con la diatesis hemorrágica en pacientes deficientes en GPVI (12; 22). Es muy interesante el hecho de que un paciente deficiente en GPVI desarrollaba anticuerpos muy específicos contra el receptor ausente (45), lo cual puede ser difícil de explicar. Sin embargo, basándose en los resultados que se presentan aquí, es factible especular que este paciente puede sufrir deficiencia de GPVI adquirida, basándose en el aclaramiento inducido por anticuerpos de GPVI de sus plaquetas circulantes.

Además de su papel central en la activación de las plaquetas inducidas por el colágeno, GPVI está también implicado críticamente en la reacción procoagulante de las plaquetas (46), lo que se confirmó por la actividad procoagulante dependiente de colágeno anulada de las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1. Este resultado sugiere claramente que el tratamiento anti-GPVI modula también la coagulación en sitios de lesión vascular. Una actividad anticoagulante de este tipo ha sido demostrada para los antagonistas de GPIIb/IIIa (47), que están considerados actualmente como los inhibidores más potentes de la participación de las plaquetas en la trombosis (48), dado que inhiben el camino final común de la agregación plaquetaria, con indiferencia del agonista que estimule las células. Se ha propuesto que esta inhibición más o menos completa de la función plaquetaria puede ir asociada a un riesgo potencial de seguridad, dado que se requiere también agregación plaquetaria para la hemostasis normal (49). Los autores de la invención encontraron que JAQ1 inducía tiempos de hemorragia significativamente más cortos que los anticuerpos bloqueantes contra GPIIb/IIIa en los ratones, lo que indicaba que las plaquetas empobrecidas en GPVI contribuían todavía significativamente a la hemostasis normal in vivo. Aunque no existe ninguna correlación clara entre el tipo de hemorragia y el riesgo de hemorragia (50), es tentador especular en cuanto a los motivos de estos resultados que una terapia anti-GPVI podría ir asociada a un riesgo relativamente bajo de hemorragia clínica.

Los mecanismos de las interacciones colágeno-plaquetas son complejos e implican fijación directa o indirecta de colágeno a varios receptores plaquetarios, con inclusión del complejo GPIb/IX-V, integrina \alpha_{2}\beta_{1}, GPIV, GPVI, y las proteínas de 65 y 85 kD (51). A pesar de su papel esencial en la activación de las plaquetas inducida por el colágeno, se han dado a conocer sólo pruebas muy limitadas para un papel de GPVI en la adhesión al colágeno (17) que se cree está mediada en gran parte por GPIb-IX-V (por la vía del factor von Willebrand, vWf) y la integrina \alpha_{2}\beta_{1}. En los ratones, las plaquetas empobrecidas en GPVI expresaban cantidades normales de integrina \alpha_{2}\beta_{1}, y las integrinas \beta_{1} eran normalmente activables, lo que se ha considerado como un requisito previo para la fijación eficaz del colágeno (Fig. 4b) (52). De hecho, las plaquetas empobrecidas en GPVI se adherían al colágeno a través de \alpha_{2}\beta_{1}, pero el grado de adhesión estaba claramente reducido en comparación con las plaquetas de control. Una observación similar ha sido consignada con plaquetas de pacientes deficientes en GPVI (12; 45), lo que indica que GPVI puede ser necesario para la adhesión normal al colágeno, probablemente por respaldar la activación de \alpha_{2}\beta_{1} (53). La expresión de GPIb-IX-V, no se veía afectada por el tratamiento con JAQ1, y los niveles normales de vWF fijados al receptor en presencia de botrocetina (Fig. 4a). En conjunto, estos resultados sugieren que la adhesión de las plaquetas al colágeno en los sitios de lesión vascular puede ser reducida, pero no bloqueada, por tratamiento anti-GPVI.

Pruebas muy recientes sugieren que GPVI se expresa exclusivamente en las plaquetas y los megacariocitos maduros (17; 54), y esto se confirma por estudios inmunohistoquímicos con JAQ1. Por esta razón, los efectos de los agentes anti-GPVI (al igual que JAQ1) deberían restringirse a las plaquetas y, lo que es muy importante, los megacariocitos. JAQ1 era detectable en los megacariocitos en el bazo y la médula ósea tres horas después de la inyección del antígeno, lo que sugiere que la generación siguiente de plaquetas estaba también afectada por el mAb. Esta suposición puede confirmarse por el hecho de que GPVI no era detectable en las plaquetas durante al menos dos semanas, aunque la duración de vida normal de las plaquetas de ratón es sólo aproximadamente 4-5 días (41). Sobre la base del número estimado de aproximadamente 2x10^{9} plaquetas/ratón (10^{9}/ml de sangre) y una duración de vida de las células de 5 días, las moléculas GPVI de 6x10^{9} plaquetas deben estar empobrecidas para dar como resultado la ausencia del receptor durante 15 días. La cantidad de 100 \mug de JAQ1 (PM = 150 kd) representa \sim 6,7 x 10^{13} moléculas de anticuerpo. Por consiguiente, están disponibles \sim1,1 x 10^{4} moléculas de anticuerpo por plaqueta para fijarse a y agotar GPVI. Dado que la tasa de expresión estimada de GPVI es solamente 1-2 x 10^{3} copias/plaqueta (55), son suficientes 100 \mug de JAQ1 para inducir el efecto observado.

Resultados preliminares demuestran que una segunda inyección de JAQ1 dos semanas después de la primera inyección no tiene influencia alguna sobre los recuentos de plaquetas, pero prolonga la ausencia de GPVI en las plaquetas circulantes. Esto indica que la segunda dosis del mAb afecta a los megacariocitos recién diferenciados, pero no tiene efecto alguno sobre las plaquetas circulantes (empobrecidas en GPVI). Así pues, JAQ1 puede utilizarse para inducir un fenotipo semejante al de GPVI desactivado en los ratones durante varias semanas, lo que permite realizar estudios sobre la función de las plaquetas en ausencia de este receptor crítico de la activación in vitro e in vivo.

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La respuesta de trombina en los ratones tratados con JAQ1 se reduce transitoriamente

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Después de la activación de las plaquetas de ratones tratados con JAQ1 con la proteasa de la coagulación \alpha-trombina el día 3 después de la inyección de JAQ, era detectable una respuesta de trombina significativamente reducida por medida de la activación de GPIIbIIIa y la expresión de P-selectina en respuesta a concentraciones crecientes de \alpha-trombina. En contraste, esta inhibición no era detectable en ratones tratados con JAQ1 los días 7 y 14. Este descubrimiento sugiere que una inhibición selectiva de la respuesta de trombina ocurre durante la fase temprana en las plaquetas durante el tratamiento anti-GPVI.

Para definir esta inhibición con mayor detalle, las plaquetas de ratones tratados con JAQ1 se analizaron los días 1, 2, 3, 4, y 5 después de la inyección de anticuerpos. Con objeto de minimizar la disminución transitoria de los recuentos de plaquetas, estos ratones recibieron tres inyecciones de 33 \mug de JAQ1 en el transcurso de 2 horas. Este tratamiento dio como resultado una disminución moderada de los recuentos plaquetarios el día 1 y un retorno a los valores normales el día 2 donde los mismos se mantuvieron durante al menos 12 días más. Las plaquetas de estos ratones exhibían una reducción acusada en la respuesta de trombina los días 1 y 2, que regresaba progresivamente a la normalidad entre los días 3 y 5. En contraste, las plaquetas eran totalmente activables con ADP y PMA en todo momento.

Estos resultados sugerían claramente que la internalización de GPVI inducida por JAQ1 afectaba transitoriamente a la función de uno o más receptores de trombina en las plaquetas circulantes. Este efecto se identificó como relacionado con una actividad reducida del receptor de trombina PAR4 como se muestra por el análisis mediante citometría de flujo de plaquetas de ratones tratados con JAQ1, estimulados con un péptido activador de PAR4.

A continuación, se sometieron ratones tratados con JAQ1 a un modelo de tromboembolia dependiente de trombina para determinar la relevancia del efecto observado para los procesos trombóticos in vivo. Ratones NMRI macho anestesiados (28-30 g de peso de peso corporal) recibieron tromboplastina humana recombinante (Thromborel, Dade Behring) por vía intravenosa. Es sabido que este tratamiento inicia la formación intravascular de trombina que conduce a la activación de las plaquetas. Estas plaquetas activadas por trombina facilitan luego la generación de trombina adicional y finalmente la tromboembolia intravascular. La inyección i.v. de 150 \mul/kg de peso corporal de tromboplastina daba como resultado 60% (12/20) de mortalidad en los ratones de control pretratados con IgG irrelevante de rata, en tanto que ninguno (0/20) de los ratones tratados con JAQ1 moría el día 1 y el día 2 después de la inyección del anticuerpo. La mortalidad aumentaba hasta 35% (7/20) el día 3, ulteriormente a 40% (8/20) el día 4, y finalmente alcanzaba el nivel del grupo de control el día 5 con 65% (13/20). Estos descubrimientos se correlacionaban satisfactoriamente con la respuesta reducida a la trombina observada en los ratones tratados con JAQ1 ex vivo. Se determinaron los parámetros siguientes dos minutos después de la inyección de 150 \mul/kg de peso corporal de tromboplastina en los ratones de control y los tratados con JAQ1 en grupos separados. El consumo de plaquetas y las concentraciones plasmáticas de TAT se reducían significativamente en los ratones tratados con JAQ1 en comparación con los controles. De nuevo este efecto alcanzaba su máxima intensidad los días 1 y 2 después de la inyección de JAQ1 y disminuía progresivamente entre los días 3 y 5.

En conjunto, estos descubrimientos demuestran que el tratamiento de los ratones con el mAb anti-GPVI JAQ1 da como resultado dos fases distintas de inhibición de las plaquetas: durante los primeros 3-4 días, las plaquetas exhiben una inhibición completa de respuestas al colágeno e inhibición parcial de respuestas a la trombina y por consiguiente una protección antitrombótica profunda. Después de este periodo, la respuesta a la trombina vuelve a la normalidad, en tanto que la respuesta al colágeno se mantiene ausente, dando como resultado una protección antitrombótica más moderada.

Tomados en su conjunto, estos resultados sugieren que GPVI podría llegar a ser una diana interesante para la profilaxis a largo plazo de las enfermedades cardiovasculares isquémicas y proporcionan la primera evidencia de que es posible empobrecer específicamente un receptor de las glicoproteínas activadoras de las plaquetas circulantes in vivo. Estos descubrimientos pueden abrir el camino para el desarrollo de una nueva generación de antitrombóticos potentes pero seguros.

Así pues, es un objeto de la presente invención proporcionar un medicamento para la protección contra enfermedades trombóticas que comprende como principio activo, un anticuerpo, contra un receptor del colágeno plaquetario que no sólo bloquea, sino que empobrece irreversiblemente el receptor diana. Un anticuerpo monoclonal de este tipo se define por su fijación al mismo epítope del receptor de colágeno en los trombocitos que el anticuerpo monoclonal JAQ1. Preferiblemente, debe utilizarse como anticuerpo el anticuerpo monoclonal JAQ1. El receptor de colágeno es GPVI plaquetario. Es sumamente preferido un medicamento que contiene el anticuerpo monoclonal humanizado respectivo para protección contra las enfermedades trombóticas.

El anticuerpo monoclonal JAQ1 puede humanizarse por métodos estándar que son bien conocidos por los expertos en el campo. Dicho anticuerpo monoclonal humanizado se administra usualmente a un paciente que está expuesto al riesgo de padecer enfermedades trombóticas en la forma de una inyección acuosa fisiológicamente aceptable. No se excluyen otras formas de administración. El anticuerpo monoclonal se administrará en una cantidad que está sujeta a la condición física del paciente. El médico experto no tendrá dificultad alguna en encontrar la cantidad óptima del anticuerpo monoclonal para el propósito deseado.

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TABLA 1 Expresión de glicoproteínas y fibrinógeno fijado a la superficie en las plaquetas de ratones tratados con JAQ1

Sangre entera diluida procedente de los ratones indicados se incubó con anticuerpos marcados con FITC en condiciones de saturación durante 15 min a la temperatura ambiente, y las plaquetas se analizaron directamente. Los resultados se expresan como log de la fluorescencia media \pm S.D. para seis ratones por grupo.

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Leyendas de las figuras Figura 1 JAQ1 induce trombocitopenia transitoria

Los ratones recibieron IgG purificada (a) o fragmentos Fab(b) del mAb indicado por vía intraperitoneal en 200 \mul de PBS estéril. Se determinaron los recuentos de plaquetas en los momentos indicados utilizando un hemocítómetro Neubauer mejorado. Los resultados se expresan como el recuento medio de plaquetas \pm SD para grupos de 6 ratones en cada caso.

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Figura 2 Las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 no responden a CRP y colágeno

(a) Análisis citométrico de flujo en dos colores de plaquetas de ratones tratados con JAQ1 o de control 3 días después de la inyección de anticuerpo. Se estimuló sangre entera diluida con ADP 10 \muM o CRP de 10 \mug/ml durante 2 min y se incubó subsiguientemente con anticuerpos anti-fibrinógeno^{FITC} y anti-selectina P^{PE} durante 10 min a TA y se analizó directamente. Las plaquetas se seleccionaron por sus características FSC/SSC e intensidad FI3 (GPIb\alpha^{PE/Cy5} anti-ratón). Los datos presentados son representativos de 6 ratones por grupo. Se obtuvieron resultados similares los días 7 y 14 después de la inyección del anticuerpo. (b) prp heparinizado de los ratones indicados se estimuló con colágeno (50 \mug/ml), ADP (10 \muM) o PMA (50 ng/ml). Se registró la transmisión de la luz en un agregómetro Fibrintimer de 4 canales. (c) prp heparinizado de ratones de control se incubó con agitación en presencia de IgG2a de rata irrelevante (20 \mug/ml - círculos) o JAQ1 (20 \mug/ml - triángulos) durante 5 min antes de la adición de las concentraciones indicadas de colágeno. En paralelo, se testó prp de ratones tratados con JAQ1 (cuadrados). Los resultados se expresan como la agregación plaquetaria máxima \pm S.D. para grupos de 6 ratones cada uno.

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Figura 3 GPVI no es detectable en las plaquetas de los ratones tratados con JAQ1 durante al menos dos semanas

(a) Se separaron las proteínas totales de las plaquetas por SDS-PAGE en condiciones no reductoras y se sometieron a inmunotransferencia con JAQ1 marcado con FITC (anti-GPVI) o EDL1 (anti-GPIIIa). El mAb fijado se detectó por medio de anti-FITC de conejo marcado con HRP y ECL. (b) Plaquetas lavadas de ratones de control, deficientes en cadena \gamma de FcR (FcR\gamma -/-) y tratados con JAQ1 (día 7) se estimularon con 10 \mug/ml de convulxina (Cvx). Las plaquetas de control se preincubaron con IgG2a irrelevante de rata o JAQ1 (20 \mug/ml) durante 5 min antes de la adición de Cvx. (c) Las plaquetas lavadas de los ratones indicados se incubaron con convulxina marcada con FITC (5 \mug/ml) durante 15 min a la temperatura ambiente y se analizaron luego en un instrumento FACScan (Becton Dickinson). Los datos presentados son representativos de 6 ratones por grupo.

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Figura 4 Adhesión reducida al colágeno y respuesta procoagulante anulada de las plaquetas empobrecidas en GPVI

(a) Las plaquetas de ratones tratados con JAQ1 (d7) fijan cantidades normales de vWF del plasma en presencia de botrocetina (2 \mug/ml - línea de trazo continuo). El vWF fijado se detectó con anticuerpos anti-vWF marcados con FITC (10 \mug/ml). No se detectó fijación alguna en ausencia de botrocetina (área sombreada). Activación normal de integrinas \beta1 en las plaquetas de ratones tratados con JAQ1 en respuesta a trombina (0,1 U/ml). Plaquetas inactivas (área sombreada) o activadas con trombina (línea de trazo continuo) se incubaron con 9EG7 marcado con FITC (5 \mug/ml) durante 15 min a la temperatura ambiente y se analizaron directamente. (b) Plaquetas lavadas de ratones de control o tratados con JAQ1 (d7) se incubaron en placas de microtitulación recubiertas de colágeno en presencia o ausencia de MgCl_{2} (1 mM)/CaCl_{2} (1 mM) durante los tiempos indicados y las plaquetas adherentes se cuantificaron fluorimétricamente. Los datos presentados corresponden a un solo experimento, representativo de 5 experimentos idénticos, y se expresan como el valor medio de lecturas triplicadas \pm SD. (c) Análisis citométrico de flujo de la fijación de Annexina V-FITC a plaquetas de ratones de control y tratados con JAQ1 (d 7) con una combinación de colágeno (50 \mug/ml) y trombina (0,01 U/ml).

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Figura 5 Tiempo de hemorragia de los ratones tratados con JAQ1

Se determinaron los tiempos de hemorragia en ratones 7 días después de la inyección de 100 \mug de IgG2a o JAQ1 no inmunes (n = 15 por grupo). Como control, los ratones recibieron 100 \mug de fragmentos F(ab)_{2} de JON/A (anti-GPIIb/IIIa) 24 horas antes del experimento (n = 6). En caso necesario, la hemorragia se detuvo manualmente al cabo de 10 minutos para evitar la muerte. Cada punto representa un individuo.

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Figura 6 JAQ1 induce protección a largo plazo contra la trombosis intravascular

Tromboembolia en respuesta a una inyección de bolus de una mezcla de colágeno (0,8 mg/kg de peso corporal) y epinefrina (60 \mug/kg de peso corporal). (a) Mortalidad en ratones de control y ratones tratados con 100 \mul de JAQ1 en los momentos indicados antes de la exposición. (b) Recuentos de plaquetas en ratones de control y tratados con JAQ1 tres minutos después de infusión de colágeno/epinefrina (n = 8 por grupo). (c) Panel superior: histología representativa de los pulmones (original x 100); los vasos obstruidos se indican por fechas. Panel inferior: detección inmunohistoquímica de las plaquetas en los trombos (original x 400). Se hicieron reaccionar secciones congeladas fijadas con acetona con un anticuerpo específico de las plaquetas (anti-GPIb-IX) y se sometieron a contratinción con hematoxilina. El producto rojo de reacción con peroxidasa de rábano picante exhibe alta densidad de plaquetas en el trombo.

Claims (11)

1. Medicamento para la protección contra enfermedades trombóticas, caracterizado porque comprende un anticuerpo, que induce una desactivación o degradación irreversible del receptor de colágeno en los trombocitos y se fija al mismo epítope del receptor de colágeno GPVI en los trombocitos que el anticuerpo monoclonal JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487.

2. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es JAQ1.

3. Medicamento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque contiene el anticuerpo monoclonal humanizado JAQ1.

4. Un agente de diagnóstico para la determinación de la tasa de expresión del receptor de colágeno GPVI, caracterizado porque contiene un anticuerpo monoclonal o policlonal marcado dirigido contra el mismo epítope de GPVI que el definido por JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito BSN ACC 2487.

5. Un método para la determinación de la tasa de expresión del receptor de colágeno GPVI en sangre, caracterizado porque

a)

una muestra de la sangre del paciente se incuba con un vehículo sólido en el cual el anticuerpo JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487, se fija, se lava el vehículo, se incuba el mismo con un segundo anticuerpo marcado JAQ1, se lava el vehículo nuevamente y se mide la señal del segundo anticuerpo marcado; o

b)

una muestra de la sangre del paciente se fija a un vehículo sólido y se trata después de ello con el anticuerpo marcado JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487, sola o en mezcla con el anticuerpo JAQ1 sin marcar, y subsiguientemente se detecta el anticuerpo marcado; o

c)

el anticuerpo monoclonal JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487, se fija en un vehículo sólido y se pone en contacto después de ello con la muestra de sangre, que debe ensayarse, junto con el anticuerpo marcado JAQ1, lavado del vehículo y medición de la señal del anticuerpo marcado.

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6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el mismo se realiza utilizando un anticuerpo monoclonal JAQ1 marcado por fluorescencia en un citómetro de flujo.

7. Una línea de células de hibridoma para la producción del anticuerpo monoclonal JAQ1, llevando dicha línea de células el número de depósito DSM ACC 2487.

8. Anticuerpo monoclonal, caracterizado porque se fija al mismo epítope del receptor de colágeno en los trombocitos que el anticuerpo monoclonal JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487.

9. Uso de un anticuerpo, que induce una desactivación o degradación irreversible del receptor de colágeno en los trombocitos y se fija al mismo epítope del receptor de colágeno GPVI en los trombocitos que el anticuerpo monoclonal JAQ1, que puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC 2487, para la preparación de un medicamento contra las enfermedades trombóticas.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

11. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 y 10, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal JAQ1.