ES2276078T3

ES2276078T3 - Proteina de fusion glicoproteina vi-fc para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Info

Publication number: ES2276078T3
Application number: ES03735562T
Authority: ES
Inventors: Steffen Massberg; Meinrad Gawaz; Andreas Bultmann; Gotz Munch; Martin Ungerer; Mario Peluso
Original assignee: Trigen GmbH
Current assignee: Trigen GmbH
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2023-06-05
Also published as: JP4722480B2; EP1511770A2; ATE346095T1; WO2003104282A2; CA2488630C; EP1511480A2; CN1668721B; EP1860118A3; CA2488630A1; ZA200409776B; WO2003103662A3; AU2003250825A1; EP1860118A2; WO2003104282A3; ES2527717T3; WO2003103662A2; DK1860118T3; US20050079541A1; EP1511770B1; DE60309865T2

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: a) una porción de GPVI seleccionada entre un dominio extracelular de GPVI y una variante del mismo que es funcional para la unión a colágeno; y b) una porción Fc seleccionada entre un dominio Fc de una inmunoglobulina y una variante conservada funcional del mismo, estando fusionados la porción de GPVI y la porción Fc por medio de un engarce, caracterizada por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg.

Description

Proteína de fusión glicoproteína VI-Fc para el tratamiento de enfermedades vasculares.

La presente invención se refiere a una inmunoadhesina que comprende un dominio de glicoproteína VI específico. La inmunoadhesina de la invención es obtenible por un proceso específico que proporciona la inmunoadhesina en forma de un dímero. La presente invención se refiere también al uso de la inmunoadhesina de la glicoproteína VI para la preparación de un medicamento para la prevención de la trombosis intraarterial en un grupo específico de pacientes. Además, la presente invención se refiere al uso de la inmunoadhesina de la glicoproteína VI para la preparación de un medicamento para la prevención y tratamiento de la ateroprogresión. La presente invención se refiere también al uso de la inmunoadhesina de la glicoproteína VI para la preparación de un medicamento para la prevención y tratamiento de la progresión crónica de la aterosclerosis en pacientes diabéticos. La presente invención se refiere también a métodos de detección in vitro de un inhibidor de la adhesión de plaquetas mediada por GPVI a lesiones intravasculares
activas.

Los síndromes coronarios agudos o carótidos son una causa principal de muerte en las sociedades occidentales. Incluso en el caso de una supervivencia inicial de tal acontecimiento cardiovascular, muchos pacientes padecen complicaciones amenazantes para la vida tales como trombosis intravascular que conducen a infartos de miocardio adicionales o apoplejía.

La trombosis intravascular es el resultado de la agregación de plaquetas en un vaso por lo cual el flujo de sangre en el vaso puede reducirse seriamente o incluso inhibirse completamente. Específicamente, la alteración de una placa aterosclerótica inicia una cascada de acontecimientos que culminan en trombosis arterial e isquemia del tejido aguas abajo, precipitando enfermedades tales como infarto de miocardio o apoplejía isquémica. La primera respuesta a la lesión vascular es la adhesión de plaquetas circulantes a proteínas de la matriz subendotelial expuestas, que dispara la agregación de plaquetas posterior. Entre los componentes macromoleculares de la capa subendotelial, se considera el colágeno fibrilar como el constituyente más trombogénico, ya que actúa como un fuerte activador de las plaquetas y soporta la adhesión de plaquetas tanto in vitro como in vivo (1-3).

Las proteínas de membrana de las plaquetas, que se ha informado que son supuestos receptores de colágeno, pueden dividirse entre las que interactúan indirectamente con el colágeno a través del factor de von Willebrand unido a colágeno (vWf), incluyendo GPIb\alpha y la integrina \alpha_{IIb}\beta_{3}, y las que interactúan directamente con el colágeno incluyendo GPVI, la integrina \alpha_{2}\beta_{1} y CD36 (analizado en (2)). Sólo recientemente, se ha identificado la glicoproteína VI de plaquetas (GPVI) como el principal receptor de colágeno de las plaquetas (4). GPVI es una glicoproteína transmembrana de tipo I de 60-65 kDa, que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas (5;6). En plaquetas de seres humanos y ratones, GPVI forma un complejo con la cadena FcR\gamma en la superficie celular (7;8). La unión del ligando a GPVI dispara la fosforilación de tirosinas del motivo ITAM de la cadena \gamma del receptor Fc iniciando aguas abajo la señalización por medio de quinasas Syk, LAT, SLP-76 y fosfolipasa C (9-13). Las plaquetas deficientes en GPVI muestran pérdida de adhesión inducida por colágeno y agregación in vitro (4:14). Asimismo, la función bloqueante de anticuerpos monoclonales anti-GPVI atenúa ex vivo la agregación de plaquetas en respuesta al colágeno y péptido CRP relacionado con el colágeno, que imita la triple hélice del colágeno (15;16).

Se sabe que el problema de las complicaciones debidas a la agregación de plaquetas pueden abordarse administrando inhibidores de la agregación de plaquetas. Para el tratamiento de síndromes coronarios agudos, los inhibidores de GP IIb/IIIa tales como ReoPro mejoran de forma significativa el resultado de los pacientes. Sin embargo, un reciente meta-análisis de ensayos clínicos reveló un riesgo de muerte o de infarto de miocardio restante significativo a pesar de la intervención antitrombótica óptima (Boersma E, Harrington RA, Moliterno DJ, White H, Theroux P, Van de Werf F, de Torbal A, Armstrong PW, Wallentin LC, Witcox RG, Simes J, Califf RM, Topol EJ, Simoons ML. Platelet glycoprotein IIb/IIIa inhibitors in acute coronary syndromes: a meta analysis of all major randomised clinical trials. Lancet 2002; 359:189-98). Son efectos secundarios graves específicos de este régimen terapéutico las complicaciones de hemorragias. Estas ocurren en el 2,4% de los pacientes, ocurriendo la forma más grave de hemorragia intracraneal en casi el 0,1% de los pacientes tratados. Se han revelado varios defectos mecánicos del bloqueo del receptor de GP IIb/IIIa que se consideran para la eficacia subóptima y los efectos secundarios (Dickfeld T, Ruf A, Pogatsa-Murray G, Muller I, Engelmann B, Taubitz W, Fischer J, Meier O, Gawaz M. Differential antiplatelet effects of various glycoprotein IIb-IIIa antagonists. Thromb Res. 2001;101:53-64. Gawaz M, Neumann FJ, Shomig A. Evaluation of platelet membrane glycoproteins in coronary artery disease: consequences for diagnosis and therapy. Circulation. 1999;99:E1-E11).

La inhibición de la agregación de las plaquetas conduce a un deterioro general de las plaquetas con respecto a su capacidad de agregarse. Por consiguiente, no solo se influencia la formación de trombosis no deseada, sino también la capacidad general de las plaquetas de terminar con la hemorragia. Por lo tanto, la administración de inhibidores de la agregación de las plaquetas conduce de forma inherente a efectos secundarios graves tales como hemorragias que pueden causar complicaciones amenazantes para la vida adicionales. Estos efectos secundarios son por supuesto más problemáticos en pacientes que padecen diabetes.

La diabetes es uno de los factores de riesgo principales para la aterosclerosis. La diabetes constituye adicionalmente un riesgo aumentado de complicaciones amenazantes para la vida y un exceso de morbilidad en pacientes que presentan síndromes vasculares agudos y especialmente coronarios. Los pacientes diabéticos con angina inestable presentan una incidencia alta de ulceración de placas y trombosis intracoronaria comparados con pacientes no diabéticos. (Biondo-Zoccai GGL; Abbate A; Liuzzo G, Biasucci L: Atherothrombosis, inflammation, and diabetes. J Am Coll Cardiol 41; 1071-1077; 2003).

Se reconoce cada vez más que las plaquetas son un accionador principal de la progresión de la aterosclerosis. El vínculo entre la ateroprogresión aumentada, la sensibilidad aumentada de las plaquetas y diabetes es un problema no resuelto hasta ahora. Los pacientes diabéticos padecen complicaciones vasculares agudas independientes del grado de aterosclerosis indicativo de mecanismos diferentes no conocidos en el presente de la activación de las plaquetas en el desarrollo de complicaciones vasculares agudas diabéticas y complicaciones vasculares agudas ateroscleróticas.

Por lo tanto, es el problema de esta invención proporcionar un medicamento que sea útil para evitar complicaciones amenazantes para la vida posteriores a un síndrome coronario o carótido agudo mientras que se mantiene la eficacia de la sangre en la hemostasis.

Es un problema adicional de la presente invención proporcionar un medicamento para el tratamiento o prevención de la ateroprogresión.

Es un problema adicional más de la invención proporcionar un medicamento para el tratamiento de la diabetes, en particular complicaciones asociadas con la diabetes.

Es un problema adicional de la invención proporcionar un método de detección in vitro de inhibidores de la adhesión de plaquetas a lesiones intravasculares.

Descripción general de la invención

Los problemas anteriores se resuelven de acuerdo con las reivindicaciones. La presente invención proporciona la primera prueba in vivo directa que indica que se requiere GPVI de hecho estrictamente en el proceso de reclutamiento de plaquetas en esfuerzo cortante fisiológico posterior a la lesión vascular. En diferentes modelos de ratón de denudación endotelial tanto la inhibición como la ausencia de GPVI suprimieron virtualmente las interacciones de la pared de los vasos con las plaquetas y la agregación de las plaquetas, identificando GPVI como el determinante principal de la formación de trombos arteriales. Esto indica que la inhibición de las interacciones GPVI-ligando previene la trombosis arterial en el ajuste de la aterosclerosis. La presente invención usa el potencial antitrombótico de una forma soluble específica de GPVI. Específicamente, se proporciona una proteína de fusión, que contiene el dominio extracelular de GPVI y una señal de Fc N-terminal humana. La forma soluble de la GPVI humana se une específicamente al colágeno con alta afinidad y atenúa la adhesión de las plaquetas a colágeno inmovilizado in vitro y a sitios de lesión vascular in vivo. Por consiguiente, la presente invención se basa en el reconocimiento de que la precondición para la trombosis intraarterial como una complicación clínica aguda es la adhesión inicial de plaquetas a lesiones activas en las paredes de los vasos. Los presentes inventores han reconocido que la adhesión de las plaquetas a colágeno de la matriz subendotelial en una lesión de la pared de los vasos por el receptor de glicoproteína VI (GPVI) representa el acontecimiento clave para la formación de trombosis. La inhibición de la adhesión de las plaquetas a colágeno de la matriz subendotelial de la proteína de fusión de la invención es por lo tanto capaz de no solo impedir la adhesión de las plaquetas a una lesión activa, sino también de impedir la agregación de las plaquetas en una lesión activa. De ese modo, la formación de trombosis intravascular puede evitarse de forma eficaz sin deteriorar la capacidad general de las plaquetas para agregarse.

Es sorprendente que el complejo proceso de formación de trombosis pueda inhibirse con la inhibición de un receptor de plaquetas único en vista del hecho de que diferentes componentes de las capas subendoteliales son ligandos y activadores de plaquetas tales como laminina, fibronectina, factor de von Willebrand (vWf) y colágeno. Además, se ha propuesto una amplia variedad de receptores en las plaquetas por exámenes in vitro, pero el receptor o combinaciones del receptor relevantes que influencian la adhesión de las plaquetas a lesiones in vivo no se había conocido antes.

La presente invención se basa también en el reconocimiento de que GPVI es un mediador principal de la actividad de las plaquetas para la progresión de la aterosclerosis. Se demuestra que la inhibición de la activación de GPVI mediada por colágeno atenúa la ateroprogresión en ratones Apo e -/- propensos a aterosclerosis (véase la figura 16). Además, se demuestra que las plaquetas de pacientes diabéticos, que son también propensos a aterosclerosis avanzada y complicaciones trombóticas aumentadas, muestran una expresión aumentada del receptor Fc-correceptor GPVI. Por lo tanto, las plaquetas de diabéticos pueden mostrar sensibilidad aumentada a la estimulación con colágeno que conduce a las complicaciones trombóticas aumentadas observadas clínicamente en angina inestable, donde el colágeno no está cubierto de capas vasculares subendoteliales por ruptura de placas o denudación endotelial.

La presente invención proporciona por lo tanto un tratamiento de la ateroprogresión en pacientes, en particular en pacientes que padecen diabetes. Además, la invención proporciona un medicamento para el tratamiento de complicaciones vasculares agudas tales como trombosis intravascular especialmente en pacientes con diabetes. Se incluye en la invención una inmunoadhesina Fc-GPVI-nt que es una potente herramienta terapéutica para atenuar la ateroprogresión y la sensibilidad aumentada de las plaquetas al colágeno por medio del receptor de GPVI. Por lo tanto, Fc-GPVI-nt es un medicamento para el tratamiento de la aterosclerosis y particularmente para el tratamiento de complicaciones ateroscleróticas en diabetes.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende:

a): una porción de GPVI seleccionada entre un dominio extracelular de la glicoproteína VI (GPVI) y una variante del mismo que es funcional para la unión a colágeno; y

b): una porción Fc seleccionada entre un dominio Fc de una inmunoglobulina y una variante conservada funcional del mismo,

estando fusionados el dominio extracelular o variante del mismo y el dominio Fc o variante del mismo por medio de un engarce caracterizado por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg.

En una realización, la proteína de fusión se caracteriza por una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 7. La proteína de fusión de acuerdo con la invención se obtiene o es obtenible por

(a): recolección 2 días después de la infección del sobrenadante del cultivo de células Hela infectadas con un adenovirus para la proteína de fusión de la invención que codifica una secuencia de aminoácidos como se muestra en la figura 7;

(b): centrifugación (3800 g, 30 min, 4ºC) del sobrenadante de la etapa (a);

(c): filtración (0,45 \mum) del sobrenadante de la etapa (b);

(d): precipitación de la inmunoadhesina por adición de 1 vol. de sulfato de amonio (761 g/l) y agitación durante toda la noche a 4ºC;

(e): sedimentación de las proteínas por centrifugación (3000 g, 30 min, 4ºC);

(f): disolución de las proteínas sedimentadas de la etapa (e) en 0,1 vol de PBS y dialización en PBS durante toda la noche a 4ºC;

(g): clarificación de la solución de proteínas por centrifugación (3000 g, 30 min, 4ºC);

(h): cargado de la solución de la etapa (g) en una columna de proteína A (HiTrap^{TM} protein A HP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia);

(i): lavado de la columna con tampón de unión (tampón de fosfato sódico 20 mM pH 7,0, NaN_{3} al 0,02%) hasta una DO_{280} < 0,01;

(k): elución de las fracciones con tampón de elución (glicina 100 mM pH 2,7)

(l): neutralización de las fracciones eluidas con tampón de neutralización (Tris/HCl 1 M pH 9,0, NaN_{3} al 0,02%);

(m): combinación de las fracciones;

(n): dialización de las fracciones combinadas en PBS durante toda la noche a 4ºC,

(o): alicuotamiento del producto dializado y congelación a -20ºC.

En las condiciones anteriores, la proteína de fusión se obtiene como un dímero unido de forma covalente de una masa molecular de 160 kDa como se mide en condiciones no reductoras por SDS-PAGE. La dimerización de la proteína de fusión ocurre presumiblemente por enlaces disulfuro intercatenarios de cisteínas en un dominio específico adyacente al fragmento GPVI de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 7. La naturaleza dimérica de la proteína de fusión depende al menos de la presencia de una región específica entre la porción Fc y la porción GPVI como se contienen en la Figura 7, y el proceso de preparación. Una proteína de fusión monomérica no es útil como un agente terapéutico en la práctica ya que las propiedades de unión inferiores de una proteína de fusión monomérica comparada con la proteína de fusión dimérica requerirían la administración de la proteína en una cantidad que está en el orden de una magnitud más grande que la cantidad de proteína de fusión dimérica para obtener un efecto similar, cf. Figura 9 (e). La administración de cantidades mayores de proteína es, sin embargo, problemática desde un punto de vista terapéutico y económico, en particular en el tratamiento de enfermedad crónica.

La proteína de fusión de la invención en una inmunoadhesina. Tiene un segmento (a) que tiene la función del dominio extracelular de la GP VI de plaquetas. Dicha GPVI puede ser una GPVI de mamíferos, preferiblemente es una GPVI humana. Dicha función es preferiblemente unión al colágeno ligando de GPVI. Puede usarse el dominio extracelular completo de GPVI para dicha proteína de fusión o cualquier fragmento del mismo con tal que dichos fragmentos sean capaces de unirse al colágeno. Una variante de la proteína de fusión puede tener una modificación en uno o varios aminoácidos de dicha proteína de fusión (por ejemplo glicosilación, fosforilación, acetilación, formación de enlaces disulfuro, biotinilación, marcaje cromogénico como marcaje con fluoresceína, etc). Preferiblemente, una variante es un homólogo de dicha proteína de fusión. En una variante modificada puede ensayarse fácilmente su capacidad de unión a colágeno usando los procedimientos descritos en este documento. Más preferiblemente, se usa como segmento (a) los restos 1 a 269 de la SEC ID Nº: 1. Sin embargo, dicho polipéptido puede modificarse también intercambiando aminoácidos seleccionados o truncando dicha secuencia sin suprimir dicha función.

El segmento (b) de dicha proteína de fusión sirve al menos para uno de los siguientes propósitos: secreción de la proteína de fusión a partir de células que producen dicha proteína de fusión, proporcionar el segmento (a) en una forma funcional (por ejemplo en estado de plegamiento o agregación) para la unión a colágeno, purificación por afinidad de dicha proteína de fusión, reconocimiento de la proteína de fusión por un anticuerpo, proporcionar propiedades favorables para la proteína de fusión cuando se use como un medicamento. Sorprendentemente y de forma más importante, el segmento (b) permite la producción de dicha proteína de fusión en células de mamífero, preferiblemente humanas, y la secreción al sobrenadante celular en forma activa; es decir, en una forma funcional para la unión a colágeno. El segmento (b) es más preferiblemente un dominio Fc de una inmunoglobulina. Son inmunoglobulinas adecuadas IgG, IgM, IgA, IgD, y se prefieren IgE, IgG e IgA. Las IgG son las más preferidas. Dicho dominio Fc puede ser un dominio Fc completo o una variante de función conservada del mismo. Una variante de Fc es de función conservada si mantiene al menos una de las funciones del segmento (b) enumeradas anteriormente. El más preferido es el polipéptido de los restos 273 a 504 de la SEC 10 Nº: 1. Sin embargo, se conoce en general que tal polipéptido puede modificarse o truncarse sin suprimir su función.

Los segmentos (a) y (b) de la proteína de fusión de la invención pueden unirse con un engarce. El engarce de la secuencia de aminoácidos de la Figura 7 (SEC ID Nº 1) es Gly-Gly-Arg.

Más preferiblemente, dicha proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 (denominada Fc-GPVI-nt en este documento).

En un aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada entre el siguiente grupo:

a): el ácido nucleico de la Figura 8 o una variante del mismo que codifica el mismo polipéptido de acuerdo con la degeneración del código genético;

b): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de homología de secuencia con el polipéptido codificado por la Figura 8, donde la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende, desde su N-terminal hasta su C-terminal, un dominio extracelular de GPVI o una variante del mismo con función de unión a colágeno, un engarce que tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg y un dominio Fc de inmunoglobulina o una variante conservada funcional del mismo funcional para posibilitar que una proteína codificada por el ácido nucleico se secrete a partir de una célula en una forma funcional para la unión a colágeno;

c): un ácido nucleico que codifica un polipéptido de al menos 300 aminoácidos y que tiene, en la dirección 5' a 3', un primer segmento que codifica al menos 100 aminoácidos que comprenden un dominio extracelular de GPVI o una variante del mismo que es funcional para la unión a colágeno, un segundo segmento que codifica la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg y un tercer segmento que codifica al menos 200 aminoácidos funcional como un dominio Fc de inmunoglobulinas para posibilitar que una proteína codificada por el ácido nucleico se secrete a partir de una célula en una forma funcional para la unión a colágeno.

Por lo tanto, la invención proporciona además una secuencia de ácido nucleico para la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada entre el siguiente grupo:

(i): la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 2 o una variante de la misma que codifica el mismo polipéptido de acuerdo con la degeneración del código genético;

(ii): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de homología de secuencia con el polipéptido codificado por la SEC ID Nº: 2;

(iii): un ácido nucleico que codifica un polipéptido de al menos 300 aminoácidos, por el cual un segmento de al menos 100 aminoácidos es funcional para la unión a colágeno y un segmento de al menos 200 aminoácidos es funcional como un dominio Fc; y

(iv): una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una inmunoadhesina, que es una proteína de fusión homodimérica, que comprende un dominio extracelular de GPVI o una variante del mismo que es funcional para la unión a colágeno; y un dominio Fc de una inmunoglobulina o una parte conservada funcional del mismo, estando fusionados el dominio extracelular o variante del mismo y el dominio Fc o parte conservada funcional del mismo por medio de un engarce, teniendo dicho engarce la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg.

La invención proporciona además un medicamento para la prevención o tratamiento de la trombosis intraarterial, que contiene una proteína que comprende el dominio extracelular de la glicoproteína VI o una variante del mismo que es funcional para la unión a colágeno. Preferiblemente, dicha proteína es dicha proteína de fusión de la invención. Si dicho medicamento contiene dicha proteína de fusión, dicho medicamento comprende además de forma preferente un vehículo apropiado. Dicho medicamento se administra preferiblemente de forma parenteral, mas preferiblemente se administra de forma intravenosa.

Como han descubierto los presentes inventores, las interacciones GP VI-colágeno son el factor principal de la adhesión de las plaquetas a una pared dañada de un vaso. La proteína de fusión de la invención puede prevenir la unión de las plaquetas a colágeno expuesto a la sangre en el sistema vascular bloqueando dicho colágeno expuesto a la sangre sin inhibir otras funciones de las plaquetas.

Se incluye en la presente invención un medicamento que contiene ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión para terapia génica. El ácido nucleico de la invención contiene preferiblemente la secuencia de ácido nucleico definida anteriormente. El ácido nucleico se contiene preferiblemente en un vector, preferentemente un vector vírico. Los vectores que codifican la proteína de fusión pueden introducirse en el sistema vascular de un paciente de forma que por ejemplo las células endoteliales se transducen con ellos. Los vectores adecuados para terapia génica se conocen en la técnica. Pueden basarse por ejemplo en adenovirus, en virus asociados a adeno, en retrovirus o en virus de herpes simplex. Los vectores pueden adoptarse para expresión a largo plazo o a corto plazo de la proteína de fusión por las células transducidas, como requiera el paciente. El dominio Fc de la proteína de fusión posibilita la secreción de la proteína en forma activa por células transducidas.

La invención proporciona además un procedimiento de detección in vitro de inhibidores de la unión de la glicoproteína VI a colágeno, que comprende

(i): proporcionar una superficie que exponga colágeno;

(ii): contactar una porción de la superficie con la proteína de fusión de la invención en condiciones predeterminadas que permitan la unión de la proteína de fusión a dicha superficie;

(iii): contactar otra porción de dicha superficie con la proteína de fusión en presencia de un compuesto de ensayo en condiciones como en la etapa (ii);

(iv): determinar la cantidad de dicha proteína de fusión unida a la superficie en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo;

(v): identificar un compuesto de ensayo como inhibidor si la unión de la proteína de fusión a la superficie es menor en presencia del compuesto de ensayo comparada con la ausencia del compuesto de ensayo; y

(vi): opcionalmente determinar el efecto funcional del inhibidor sobre la agregación de las plaquetas y/o activación de las plaquetas.

La superficie de la etapa (i) puede ser una superficie de vidrio o plástico revestida con colágeno. Las porciones de dicha superficie pueden ser los pocillos de una placa de titulación o una placa multi-pocillos. Puede prepararse fácilmente una superficie que exponga colágeno revistiendo una superficie de vidrio o plástico con colágeno como se describe en los ejemplos. Las placas revestidas con colágeno o placas multi-pocillo están también disponibles en el mercado. En la etapa (ii), se contacta una cantidad predeterminada de la proteína de fusión con una primera porción de la superficie en condiciones (en particular pH, tampón, temperatura) que permitan la unión de la proteína fusión a la superficie.

Preferiblemente, se eligen condiciones que permitan la unión óptima a la superficie. En la etapa (iii), se contacta otra porción de superficie con la misma cantidad de proteína de fusión y en las mismas condiciones que en la etapa (ii) en presencia de una cantidad o concentración predeterminada de un compuesto de ensayo. Puede usarse más de una cantidad o concentración de un compuesto de ensayo. Dicha determinación de la etapa (iv) comprende preferiblemente el lavado de las porciones de superficies contactadas de acuerdo con las etapas (ii) e (iii) una o mas veces para eliminar la proteína de fusión no unida. La cantidad de proteína de fusión unida puede determinarse después por ejemplo midiendo la fluorescencia de una marca fluorescente (por ejemplo fluoresceína, rodamina, etc) unida a la proteína de fusión. Como alternativa, la proteína de fusión unida puede detectarse usando un anticuerpo contra la proteína de fusión, por lo cual el anticuerpo puede estar marcado de forma fluorescente. Como alternativa, el anticuerpo puede estar marcado con una enzima (por ejemplo fosfatasa alcalina, una peroxidasa, luciferasa) capaz de producir un producto de reacción coloreado o luminescente. De forma más conveniente, la proteína de fusión puede marcarse con una marca cromogénica de forma que la marca cambie sus características de absorción de luz o emisión de luz tras la unión al colágeno. En esta realización, no se necesita el lavado de la proteína de fusión no unida.

En la etapa (v), pueden identificarse inhibidores. Los inhibidores identificados o restos seleccionados de los mismos pueden usarse como estructuras de ejemplo para mejorar el inhibidor. Tales estructuras de ejemplo pueden modificarse usando procedimientos químicos y las estructuras modificadas pueden analizarse de nuevo con este procedimiento de detección. Las estructuras modificadas o los compuestos de ensayo con propiedades de inhibición mejoradas pueden seleccionarse y modificarse además opcionalmente por procedimientos químicos. De esta forma, puede lograrse el mejoramiento iterativo de un inhibidor. Los inhibidores identificados usando los procedimientos de detección de la invención son valiosos como fármacos potenciales contra la trombosis y arteriosclerosis.

En la etapa (vi), puede determinarse el efecto funcional de dicho inhibidor sobre la agregación de las plaquetas y/o activación de las plaquetas de acuerdo con procedimientos descritos a continuación, por ejemplo por microscopía de fluorescencia intravital. Dicho procedimiento de detección puede realizarse a pequeña, mediana o gran escala dependiendo del número de compuestos de ensayo a analizar. Si se analizan muchos compuestos de ensayo (por ejemplo, bibliotecas de compuestos químicos), el procedimiento de detección preferiblemente toma la forma de una detección de alta capacidad (HTS). Para la HTS, la cantidad de proteína de fusión unida se detecta preferiblemente usando proteína de fusión marcada de forma fluorescente.

Los procedimientos de detección anteriores puede adoptarse también para detectar anticuerpos que inhiban la unión de GP VI a colágeno, en particular anticuerpos contra el dominio extracelular de GP VI. Tal detección de anticuerpos puede combinarse por ejemplo con tecnología de hibridoma de generación de anticuerpos monoclonales o cualquier otra técnica de generación de anticuerpos, por la cual la proteína de fusión de la invención se usa preferiblemente como antígeno. Los anticuerpos de sobrenadantes de células de hibridoma pueden usarse como dichos compuestos de ensayo.

Puede usarse un anticuerpo contra GPVI para la preparación de un medicamento para la prevención de la adhesión de las plaquetas a colágenos de la matriz subendotelial expuestos en lesiones ateroscleróticas activas como el accionador inicial del síndrome coronario o carótido agudo. Tales indicaciones pueden diagnosticarse como se describe a continuación. Preferiblemente, el paciente se caracteriza además por padecer de placas ateroscleróticas inestables. Dicho medicamento se administra preferiblemente de forma parenteral. Preferiblemente, dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Tales antibióticos pueden prepararse por ejemplo usando la proteína de fusión de la invención como inmunógeno.

De ese modo, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal a partir de un mamífero no humano que comprende usar una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la invención como inmunógeno.

Además, la invención proporciona un procedimiento de detección in vitro de un inhibidor de la adhesión de las plaquetas mediada por GPVI a lesiones intravasculares activas, comprendiendo dicho procedimientos las etapas de

(i): proporcionar una superficie que exponga colágeno;

(ii): contactar la superficie con plaquetas en condiciones predeterminadas que permitan una adhesión de las plaquetas al colágeno;

(iii): medir la adhesión de las plaquetas en presencia de un compuesto de ensayo; y

(iv): identificar el compuesto de ensayo como un inhibidor de GPVI cuando la adhesión de las plaquetas al colágeno sea menor en presencia del compuesto de ensayo comparada con la ausencia del compuesto de ensayo; y

(v): determinar opcionalmente el efecto funcional de dicho inhibidor sobre la agregación de las plaquetas y/o activación de las plaquetas.

Las plaquetas a usar en este procedimiento pueden aislarse de acuerdo con procedimientos conocidos (cf ejemplo 7). Pueden aislarse a partir de la sangre de mamíferos como ratones, ratas, conejos, cerdos, etc. Preferiblemente, se aíslan a partir de seres humanos. Dichas plaquetas pueden marcarse por ejemplo con un colorante fluorescente como fluoresceína. La adhesión de las plaquetas a dicha superficie puede medirse como se describe en los ejemplos. Los compuestos de ensayo para este procedimiento pueden ser moléculas orgánicas pequeñas. Preferiblemente, los compuestos de ensayo para estos procedimientos son inhibidores identificados en el procedimiento de detección anterior de inhibidores de la unión de GP VI a colágeno. De esta forma, el número de compuestos a detectar usando plaquetas puede reducirse de forma significativa y la probabilidad de encontrar inhibidores funcionales con plaquetas puede aumentar.

La proteína de fusión de la invención usada para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes diabéticos como se describe más tarde en este párrafo, es preferiblemente una proteína de fusión dimérica. Para proporcionar la posibilidad de dimerización, debe estar presente una región de bisagra entre los dominios (a) y (b) de la proteína de fusión. La región de bisagra se requiere para permitir la orientación adecuada de las cadenas polipeptídicas y la formación de enlaces disulfuro intercatenarios. Por consiguiente, la región de bisagra debe tener una longitud suficiente y contener restos de cisteína, preferiblemente al menos dos restos de cisteína. Preferiblemente, la proteína de fusión comprende los restos 1 a 267 de la SEC ID Nº: 1. La proteína de fusión se usa para el tratamiento de complicaciones agudas de la diabetes o para el tratamiento de la progresión crónica de la aterosclerosis en pacientes diabéticos. Preferiblemente, la proteína de fusión es Fc-GPVI-nt.

La presente invención proporciona también un procedimiento para la preparación de una proteína de fusión de la invención, que comprende las siguientes etapas:

(a): recolección 2 días después de la infección del sobrenadante del cultivo de células Hela infectadas con un adenovirus para la proteína de fusión de la invención que codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7;

(c): filtración (0,45 \mum) del sobrenadante de la etapa (b);

(m): combinación de las fracciones;

(o): alicuotamiento del producto dializado y congelación a -20ºC.

Descripción de las figuras

Figura 1 Adhesión y agregación de plaquetas posteriormente a lesión vascular de la arteria carótida común en ratones C57BL6/J in vivo.

(a): Micrografías electrónicas de barrido de arterias carótidas previamente (grupos de la izquierda) y 2 h después (grupos de la derecha) de la lesión vascular. La denudación endotelial induce la adhesión de las plaquetas y la agregación, produciendo la formación de un trombo rico en plaquetas (parte inferior izquierda).

(b): Se investigaron las interacciones plaquetas-células endoteliales 5 min después de la lesión vascular por microscopía de fluorescencia in vivo de la arteria carótida común in situ (columnas negras). Los animales sin lesión vascular sirvieron como controles (columnas abiertas). Los grupos izquierdo y derecho resumen la adhesión de las plaquetas transitoria y firme, respectivamente, de ocho experimentos por grupo. Las plaquetas se clasificaron de acuerdo con su interacción con el revestimiento de células endoteliales como se describe^{24} y se dan por mm^{2} de superficie del vaso. Media \pm s.e.m., el asterisco indica diferencia significativa comparada con el control, P < 0,05.

(c): Se determinó la agregación de las plaquetas posterior a la lesión vascular por microscopía de fluorescencia in vivo (columnas negras). Los animales sin lesión vascular sirvieron como controles (columnas abiertas). Media \pm s.e.m., n=8 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparada con ratones de tipo salvaje, P<0,05. Las microfotografías (derecha) muestran imágenes de microscopía de fluorescencia in vivo significativas en animales de control (grupo superior) o posteriormente a lesión vascular (grupo inferior). Las flechas blancas indican plaquetas adherentes.

Figura 2 La inhibición de GPVI anula la adhesión y agregación de las plaquetas después de la lesión vascular. (a) Se determinó la adhesión de las plaquetas posteriormente a la lesión vascular por microscopía de videofluorescencia intravital. Las plaquetas fluorescentes se preincubaron con 50 \mug/ml de fragmentos Fab anti-GPVI (JAQ1) o IgG de rata de control. Las plaquetas sin preincubación con mAb sirvieron como control. Los grupos izquierdo y derecho resumen la adhesión de las plaquetas transitoria y firme, respectivamente. Media t s.e.m., n=8 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparado con el control, P < 0,05. (b) ilustra el porcentaje de plaquetas que establecieron adhesión irreversible después de la translocación de superficie atada/lenta, (c) Agregación de plaquetas posterior a la lesión vascular in vivo. Se ensayó la agregación de plaquetas preincubadas con tyrodes, IgG de rata irrelevante, o FAB anti-GPVI (JAQ1) por microscopía de fluorescencia como se ha descrito. Media \pm s.e.m., n=8 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparado con el control, P<0,05. (d) Las fotomicrografías muestran imágenes de microscopía de fluorescencia in vivo representativas que ilustran la adhesión de las plaquetas en ausencia o presencia de Fab anti-GPVI (JAQ1) o IgG de control.

Figura 3 Adhesión de las plaquetas posteriormente a la denudación endotelial en ratones deficientes en GPVI. (a) Los ratones tratados con JAQ1 carecen de GPVI. Grupos superiores: Las plaquetas de ratones pretratados con IgG de control irrelevante (izquierda) o anti-GPVI (JAQ1) (derecha) se incubaron JAQ1 marcado con FITC y CD41 anti-ratón marcado con PE4 durante 10 min a temperatura ambiente y se analizaron directamente en un FACScan^{TM}. Se presenta una mancha de transferencia de puntos de 3 ratones por grupo. Grupo inferior: Los lisados de plaquetas completos de tres ratones tratados con IgG de control o JAQ1 se separaron por SDS-PAGE en condiciones no reductoras y se inmunotransfirieron con JAQ1 marcado con FITC, seguido por incubación con mAb de conejo anti-FITC marcado con HRP. (b) Micrografías electrónicas de barrido de arterias carótidas 2 h después de la lesión vascular en animales de control (grupos superiores) o ratones mermados en GPVI (grupos inferiores). La denudación endotelial indujo la adhesión de las plaquetas y la agregación de las plaquetas en animales de control. Por el contrario, sólo muy pocas plaquetas se unieron a lo largo de la pared de los vasos en ratones mermados en GPVI. Las fibras de colágeno subendotelial son visibles a lo largo del área denudada. (c) Se detectó el atado de las plaquetas y adhesión firme de las plaquetas, (d) la transición desde atado inicial hasta detención estable (porcentaje de plaquetas atadas), y (e) agregación de plaquetas posteriormente a lesión vascular de la arteria carótida en ratones deficientes en GPVI (ratones pretratados con JAQ1) o ratones pretratados con IgG de control (para detalles véase Materiales y Procedimientos). Los grupos resumen la adhesión de las plaquetas (transitoria y firme) y la agregación de las plaquetas en ocho experimentos por grupo. Media \pm s.e.m., el asterisco indica diferencia significativa comparado con IgG de control, P < 0,05. (f) Las fotomicrografías muestras imágenes de microscopía de fluorescencia in vivo representativas que ilustran la adhesión de las plaquetas en ratones deficientes en GPVI (JAQ1) y ratones tratados con IgG de control.

Figura 4 Se ensayó ex vivo la adhesión de las plaquetas a la superficie de cubreobjetos de vidrio revestidos de colágeno en condiciones de flujo fisiológico. Grupo izquierdo: Se investigó la adhesión de plaquetas de ratones pretratados con inmunoadhesinas IgG de control irrelevantes (control) (izquierda) o inmunoadhesinas anti-GpVI (Fc-GP Vi-nt) (derecha) en condiciones de flujo fisiológico. Se valoró el número de plaquetas por recuento FACS sobre los cubreobjetos lavados al final de cada experimento. Se valoró el atado de las plaquetas como la primera etapa de la adhesión de las plaquetas después de 30 segundos y la adhesión firme de las plaquetas después de 5 min en condiciones de flujo (para detalles véase el Ejemplo 6). Los grupos resumen la adhesión de las plaquetas transitoria y firme en ocho experimentos por grupo. Media \pm s.e.m., el asterisco indica diferencia significativa comparado con IgG de control, P<0,05.

Figura 5 Se controló la interacción de Fc-GP VI-nt con colágeno en un ensayo basado en EUSA. Se investigó la adhesión de la inmunoadhesina Fc-GP VI-nt constituida por el dominio extracelular de GP VI y la parte FC de una IgG a placas revestidas con concentraciones en aumento de Fc-GP VI-nt (0,5 \mug). La unión se visualiza con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa dirigido a la parte Fc de Fc-GP VI-nt. La peroxidasa se detecta finalmente por ELISA. En este experimento representativo se controló la unión de FC-GP VI-nt a colágeno con afinidad suficiente, que alcanzó la saturación a concentraciones de \mug.

Figura 6 Se demostró la interacción de Fc-GP VI-nt con colágeno y la posibilidad de detectar inhibidores de GP VI con el anticuerpo JAQ 1 anti GP VI de ratón inhibitorio. La adhesión de la inmunoadhesina Fc-GP VI-nt (2 \mug/pocillo) a placas de ELISA revestidas con colágeno se muestra que es específica: la inmunoadhesina vacía Fc-nt no mostró ninguna unión. De ese modo, esto proporciona una ensayo basado en EUSA para la detección de inhibidores de GP VI con el potencial de escalar a capacidades de alta producción.

Figura 7 Secuencia de aminoácidos de Fc-GPVI-nt SEC ID Nº: 1.

Figura 8 Secuencia de ADN de la inmunoadhesina Fc-GPVI-nt SEC ID Nº 2. Las bases 1 a 807 codifican el dominio extracelular de GP VI. Las bases 817 a 1515 codifican la parte Fc de la IgG.

Figura 9 Caracterización de GPVI-Fc. (a) grupo superior: Se usaron Fc-GPVII-nt y Fc de control que carecía del dominio GPVI extracelular para SDS-PAGE en condiciones reductoras. La tinción con azul de Coomasie (izquierda) y la inmunotransferencia con anticuerpo anti-Fc humano de cabra conjugado con peroxidasa (derecha) identificaron la Fc-GPVI-nt con una masa molecular de -80 kDa. Grupo del medio: Inmunotransferencia de Fc, Fc-GPVI, o plaquetas humanas usando el anticuerpo 5C4 monoclonal anti-GPVI. 5C4 detectó tanto la proteína de fusión Fc-GPVI-nt expresada de forma adenovírica como la GPVI de plaquetas, pero no Fc de control. Grupo inferior: Masa molecular en condiciones reductoras (derecha) y no reductoras (izquierda). Mientras que la masa molecular de Fc-GPVI-nt era aproximadamente 80 kDa en condiciones reductoras, la proteína nt completa con 160 kDa se identificó en condiciones no reductoras. (b-d) Caracterización de las interacciones de Fc-GPVI-nt con colágeno. (b) Se realizaron ensayos de unión usando diferentes concentraciones de Fc-GPVI soluble y colágeno inmovilizado (10 \mug/ml) para definir las interacciones Fc-GPVI-nt-colágeno. Se detectó la Fc-GPVI-nt unida con anticuerpo mAb anti Fc (dilución 1:10.000) y se da en relación a la unión observada a 10 \mug/ml de Fc-GPVI-nt. Fc-GPVI-nt se une al colágeno de una manera saturable. Media \pm s.e.m., n=6 cada concentración de Fc-GPVI-nt, el asterisco indica diferencia significativa comparado con 0 \mug/ml de Fc-GPVI-nt, P < 0,05. (c, grupo izquierdo) muestra la unión de Fc-GPVI-nt (20 \mug/ml) a diversos sustratos. La unión de Fc-GPVI-nt a BSA (10 \mug/ml) o vWf (10 \mug/ml) se da como el porcentaje de unión del dímero GPVI a colágeno inmovilizado. La unión de Fc-GPVI-nt no ocurrió con BSA o vWf, apoyando la especificidad de la unión de Fc-GPVI-nt. Media t s.e.m., el asterisco indica diferencia significativa comparado con colágeno, P<0,05. (c, grupo derecho) ilustra la unión de Fe-GPVI-nt (20 \mug/ml) o Fc (20 \mug/ml) a colágeno inmovilizado (10 \mug/ml). Se detectó la Fc-GPVI-nt o Fc unida con un anticuerpo mAb anti-Fc (dilución 1:10.000) y se da en relación a la unión observada con Fc-GPVI-nt. Sólo Fc-GPVI-nt, pero no Fc o mAb anti-Fc se une a colágeno inmovilizado. Media \pm s.e.m., n=8 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparado con la unión de Fc-GPVI-nt, P<0,05. (d) Se preincubó Fc-GPVI-nt (20 \mug/ml) durante 10 minutos con diferentes concentraciones de colágeno soluble. Después de la incubación las placas se lavaron y se detectó la unión de Fc-GPVI-nt con anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa (dilución 1:10.000). La unión de Fc-GPVI-nt se da en relación a la unión observada en ausencia de colágeno soluble. El colágeno soluble inhibe la unión del dímero GPVI-Fc a colágeno inmovilizado de una manera dependiente de la dosis. Media \pm s.e.m., n=3 cada concentración de colágeno, el asterisco indica diferencia significativa comparado con 0 \mug/ml de colágeno, P < 0,05. (e) Se valoró por comparación directa la diferencia de la afinidad de unión entre la forma monomérica de la proteína de fusión GPVI-Fc y Fc-GPVI-nt. La unión del monómero y del dímero se valoró en placas de EUSA revestidas con colágeno tipo 1. Se unieron al colágeno concentraciones en aumento de las proteínas de fusión GPVI de una manera saturable. Aquí, un gráfico Linewaver Burke demuestra la valoración de la afinidad (e). La afinidad de la proteína de fusión GPVI monomérica era aproximadamente 10 veces inferior comparada con concentraciones equimolares de la forma dimérica Fc-GPVI-nt.

Figura 10 Fc-GPVI-nt inhibe la activación de CD 62 P en plaquetas humanas como un parámetro de liberación de sustancias transmisoras intracelulares a partir de gránulos alfa aumentando las dosis de colágeno. Las plaquetas humanas se aislaron a partir de sangre completa y se incubaron con anticuerpos anti-CD 62 marcados con PE (para detalles véase Materiales y Procedimientos). Se determinó la fluorescencia en un dispositivo FACS Becton Dickenson. Se muestran histogramas representativos. Las concentraciones en aumento de colágeno de 0 a 10 \mug/ml indujeron un cambio de fluorescencia en presencia de la proteína Fc de control (100 \mug/ml; línea azul). En presencia de Fc-GPVI-nt (100 \mug/ml; línea roja), el cambio de fluorescencia y por lo tanto la activación de CD 62 P se inhibió de forma marcada.

Figura 11 Inhibición específica de la agregación de plaquetas mediada por colágeno y liberación de transmisores endógenos a partir de gránulos densos y alfa por Fc-GPVI-nt (a) Se incubaron plaquetas humanas con Fc de control (80 \mug/ml) o Fc-GPVI-nt (80 \mug/ml). Se indujo la agregación de las plaquetas con colágeno (1 \mug/ml) o ADP (5 \muM) o TRAP (10 \muM) y se determinó la agregación en un agregrómetro en condiciones de agitación (para detalles véase Materiales y Procedimientos). Se realizaron medidas triples a partir de n = 5 donadores de sangre diferentes. Las medias \pm s.e.m. se dan en % de agregación de la agregación de control sin proteínas de fusión. (b) Se midió de forma simultánea la liberación de ATP en las mismas sondas después de la incubación con Fc de control (80 \mug/ml) o Fc-GPVI-nt (80 \mug/ml). La cantidad de liberación de ATP se da en % de controles sin proteínas de fusión. (c) Se determinó la liberación de PDGF en plaquetas humanas con un sistema de ELISA específico para PDGF humano en condiciones basales y después de la estimulación con colágeno (20 \mug/ml) (para detalles véase Materiales y Procedimientos). La preincubación con Fc de control no tuvo efecto significativo sobre la liberación de PDGF a partir de plaquetas estimuladas con colágeno, mientras que Fc-GPVI-nt (100 \mug/ml) redujo la liberación de PDGF de forma significativa. La inhibición de la liberación de PDGF no ocurrió en plaquetas no estimuladas.

Figura 12 Fc-GPVI-nt no tiene efecto significativo sobre el tiempo de hemorragia en la sangre humana ex vivo. El tiempo de hemorragia en la sangre humana se midió ex vivo después de la estimulación con ADP/colágeno y la estimulación con epinefrina/colágeno en un dispositivo PFA-100. Fc-GPVI-nt (5 y 20 \mug/ml) y Fc (5 y 20 \mug/ml) prolongaron de forma máxima el tiempo de hemorragia en ambas condiciones. Se resumen las medias \pm s.e.m. de n=4 donadores de sangre con medidas triples.

Figura 13 Fc-GPVI-nt inhibe la adhesión de las plaquetas a colágeno inmovilizado en condiciones de flujo. Se aislaron plaquetas humanas (2 x 10^{8} células/ml) a partir de sangre completa (para detalles véase "materiales y procedimientos"). Las placas se revistieron con colágeno inmovilizado (10 \mug/ml) o vWF (10 \mug/ml). Se determinó la adhesión de las plaquetas a las placas revestidas en una cámara de flujo de placas paralelo en presencia de Fc-GPVI-nt o Fc que carecía del dominio GPVI extracelular (200 \mug/ml). La inhibición de la adhesión de las plaquetas por Fc-GPVI-nt se da en % de control (Fc de control). Fc-GPVI-nt atenuó de forma significativa la adhesión de las plaquetas sobre colágeno inmovilizado a velocidades de rotura de 500 seg^{-1} y 1000 seg^{-1}, respectivamente. Por el contrario, Fc-GPVI-nt no afectó la adhesión de las plaquetas sobre vWF inmovilizado. Media \pm s.e.m., n=4 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparado con Fc de control, P < 0,05. Los grupos inferiores muestran imágenes microscópicas representativas.

Figura 14 Fc-GPVI-nt tiene farmacocinética favorable con una semivida en el plasma prolongada después de inyección intraperitoneal en ratones in vivo. Se determinaron las concentraciones en la sangre de Fc-GPVI-nt con anticuerpos anti-Fc específicos y ELISA (para detalles véase por favor "materiales y procedimientos"). (a) La inyección intraperitoneal única de Fc-GPVI-nt (4 \mug/g) condujo a concentraciones sanguíneas de picos rápidos de Fc-GPVI-nt después de - 24 h con declinación lenta de las concentraciones sanguíneas de Fc-GPVI-nt. Se muestran las medias \pm s.e.m. de 10 animales. (b) Las aplicaciones intraperitoneales repetidas (10 \mug/g; dos veces a la semana) conducen a la acumulación continua de Fc-GPVI en ratones in vivo durante 28 días. Se muestran las medias \pm s.e.m. de 6 animales. (c) La inyección por dosis única intravenosa de 30 \mug de Fc-GPVI-nt (1 \mug/g de peso corporal); 60 \mug (2 \mug/g de peso corporal) y 100 \mug de Fc-GPVI-nt (3 \mug/g de peso corporal) por ratón condujo a un aumento dependiente de la dosis de la concentración de inmunoadhesina en el plasma. La concentración en el plasma en las dos dosis más altas en estos ratones alcanzó in vivo niveles elevados prolongados de 5 a 60 minutos y después de 24 horas, suficiente para la limpieza eficaz del colágeno y por lo tanto para la inhibición eficaz de la activación del receptor de GPVI en plaquetas. Se muestran las medias \pm s.e.m. de 5 animales.

Figura 15 Efectos de Fc-GPVI-nt sobre la adhesión y agregación de plaquetas in vivo. (a) Se trataron ratones (n=6 por grupo) con 2 mg/kg ó 4 mg/kg de Fc-GPVI-nt iv. Como controles positivos sirvieron ratones tratados con integrilina (0,2 mg/kg) (n=8). Los tiempos de hemorragia se determinaron como se ha descrito (véase "materiales y procedimientos"). La proteína de fusión Fc-GPVI-nt no aumentó los tiempos de hemorragia finales comparados con los animales de control. En ratones tratados con integrilina los tiempos de hemorragia finales se prolongaron de forma masiva. **P < 0,05 frente al control. (b) La inhibición de GPVI anula la adhesión y agregación de las plaquetas después de la lesión vascular. La adhesión de las plaquetas posterior a la lesión vascular se determinó por microscopía de videofluorescencia intravital. Se pretrataron los ratones con 1 ó 2 mg/kg de Fc-GPVI-nt o cantidades equimolares de Fc de control. Los grupos izquierdo y derecho resumen el atado de las plaquetas y la adhesión firme de las plaquetas, respectivamente. Media \pm s.e.m., n=5 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparado con Fc, P<0,05. (c) Efectos de Fc-GPVI-nt sobre la formación de trombos posteriormente a la lesión vascular in vivo. Se valoró el número de trombos de plaquetas (derecha) y el área de trombos total (izquierda) por microscopía de fluorescencia como se ha descrito. Media \pm s.e.m., n=5 cada grupo, el asterisco indica diferencia significativa comparado con Fc, P < 0,05. (d) Las fotomicrografías muestran imágenes de microscopía de fluorescencia in vivo representativas que ilustran la adhesión de las plaquetas en ausencia o presencia de 1 ó 2 mg/kg de Fc-GPVI-nt o Fc de control. Las barras representan 50 \mum. (e) Micrografías electrónicas de barrido de arterias corótidas 1 h después de la lesión vascular en animales tratados con Fc- o Fc-GPVI-nt. La denudación endotelial indujo la adhesión de las plaquetas y la agregación de las plaquetas en ratones tratados con Fc. Por el contrario, únicamente muy pocas plaquetas se unieron a lo largo de las paredes dañadas de los vasos en ratones tratados con Fc-GPVI-nt. Las fibras de colágeno subendotelial son visibles a lo largo del área denudada. Las barras representan 10 \mum (f) Fc-GPVI-nt se une específicamente: al subendotelio de arterias carótidas. La unión de Fc-GPVI-nt al subendotelio se determinó en secciones de carótidas, teñidas con anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa. Como controles sirvieron arterias carótidas obtenidas a partir de ratones tratados con Fc. Se detectó Fc-GPVI-nt en el subendotelio pero no proteína de control Fc, como se indica por la tinción marrón. Magnificación original: 100 veces.

Figura 16 Fc-GPVI-nt atenúa de forma significativa la ateroprogresión en ratones knockout apo e -/- in vivo. Se trataron ratones Apo e -/- con Fc-GPVI-nt (4 \mug/g) o Fc de control (4 \mug/g) de forma intraperitoneal durante 4 semanas dos veces a la semana. Se investigó la ateroprogresión post mortem después de la tinción con rojo sudán de los vasos grandes para visualizar la formación de ateromas y placas. En animales de control, la formación extensiva de placas en preparaciones de arterias carótidas se indicó por el color rojo, en particular en la región ramificada. En animales tratados con Fc-GPVI-nt la aterosclerosis se suprimió casi de forma completa en arterias carótidas de ratones apo e -/-. Se muestran preparaciones vasculares completas macroscópicas representativas de las arterias carótidas de un ratón apo e -/- después de 4 semanas de tratamiento con Fc-GPVI-nt (lateral izquierdo) y de un ratón apo e -/- después de 4 semanas de tratamiento con la proteína Fc de control (lateral derecho).

Figura 17 Plaquetas recién aisladas de pacientes que padecen diabetes mellitus muestran expresión reducida del receptor de fibrinógeno (CD61, parte superior) y expresión aumentada del receptor de Fc (CD32, en el medio) y por lo tanto expresión aumentada de GPVI. La correlación entre la expresión de CD32 y la expresión de GPVI (detectada con el anticuerpo monoclonal específico 4C9) se muestra en plaquetas humanas (parte inferior). Las plaquetas humanas se aislaron a partir de la sangre completa de pacientes que padecían diabetes y se incubaron con anticuerpos anti-CD61 o anti-CD32 fluorescentes o anticuerpos 4C9 marcados con FITC. La fluorescencia se determinó en un dispositivo FACScalibur Becton Dickenson. Se resumen las medias +/- s.e.m. de n=111 pacientes diabéticos y de n=363 pacientes sin diabetes. La correlación de la fluorescencia de CD32 y la fluorescencia de 4C9 se calculó con el coeficiente de correlación r=0,516.

Figura 18 Secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión monomérica basada en Fc-GPVI-nt.

Descripción detallada de la invención

Una hipótesis previa sugería que la glicoproteína (GP) lb de las plaquetas que se une a von vWf recluta las plaquetas que fluyen en la pared dañada del vaso (Ruggeri, ZM:, Mechanisms initiating platelet thrombus formation. Thromb. Haemost. 1997; 78, 611-616), mientras que los colágenos fibrilares subendoteliales soportan la adhesión firme y la activación de las plaquetas (van Zanten, G.H. y col. Increased platelet deposition on atherosclerotic coronary arteries. J Clin. Invest 1994; 93, 615-632; Clemetson, KJ. & Clemetson, J.M. Platelet collagen receptors. Thromb. Haemost 2001, 86, 189-197). Sin embargo, la presente invención demuestra por microscopía de fluorescencia in vivo de la arteria carótida de ratón que la inhibición o ausencia del receptor de colágeno principal de la plaqueta, GPVI, en su lugar, suprime las interacciones entre las plaquetas-paredes del vaso posteriormente a una erosión endotelial. De forma inesperada, la inhibición de GPVI reduce el atado de las plaquetas y la adhesión al subendotelio aproximadamente en el 89%. Además, la detención y la agregación estables de las plaquetas se suprime virtualmente en estas condiciones. El requerimiento estricto de GPVI en estos procesos se confirmó en ratones deficientes en GPVI, donde las plaquetas también fallan en adherirse y agregarse sobre la pared dañada del vaso. Estos descubrimientos revelan un papel inesperado de GPVI en la iniciación de la unión de las plaquetas en sitios de lesión vascular e identifican inequívocamente las interacciones plaquetas-colágeno como el determinante principal de las complicaciones ateroscleróticas inducidas por plaquetas arteriales.

Se ha descrito el hecho de que GP VI funcione generalmente como un receptor para el colágeno de la matriz subendotelial (Moroi M, Jung SM, Okuma M, Shinmyozu K. A patient with platelets deficient in glycoprotein VI that lack both collagen-induced agregation and adhesion. J Clin Invest 1989; 84:1440-1445). Estos autores caracterizaron las plaquetas in vitro que se originan a partir de pacientes con una deficiencia en el receptor de GP VI. Sin embargo, la significación fisiológica de la interacción del colágeno y del receptor de GP VI en el contexto in vivo y la contribución relativa del receptor de GP VI en la adhesión posterior a la lesión vascular era desconocida. En particular, no se sabía que la inhibición de este receptor inhibe la etapa clave en la formación de la trombosis intravascular que es el atado de las plaquetas.

La presente invención revela que el receptor de GP VI es un receptor esencial para la adhesión de las plaquetas al endotelio por medio de la unión al colágeno de la matriz subendotelial in vivo. Entre la variedad de otras proteínas de superficie de las plaquetas tales como GP Ib (receptor de von Willebrand), el receptor de integrina \alphallb\beta3, los receptores de la integrina \alpha2\beta1 o de GP V, se ha identificado de forma sorprendente el receptor de GP VI como un receptor esencial para mediar la adhesión de las plaquetas a la pared vascular. Ya que la adhesión de las plaquetas es la primera y más importante etapa para la agregación de las plaquetas y la formación del trombo intraarterial en condiciones de esfuerzo cortante fisiológicas, los efectos nocivos posteriores que conducen a la oclusión intraarterial son la base funcional de los síndromes clínicos de infarto de miocardio o apoplejía cerebral. En un ajuste crónico, la interacción de las plaquetas con el endotelio propaga las etapas tempranas de la arteriosclerosis. Esta invención mostró también por primera vez que el receptor de GP VI juega un papel crucial entre la variedad compleja de varias proteínas de superficie de las plaquetas en la adhesión inicial de las plaquetas y en la interacción plaquetas-endotelio crónica en la propagación de la arteriosclerosis.

Los documentos WO 01/16321 y WO 01/00810 describen una secuencia de ADN y proteína del receptor de GPVI humano. Sin embargo, la significación sobre la adhesión y la activación de las plaquetas por lesiones endoteliales no se ha demostrado en un antecedente in vivo.

El documento US 6.383.779 describe proteínas de fusión de GPVI. Sin embargo, esta referencia no describe una proteína de fusión dimérica o cualquier efecto terapéutico de GPVI.

Recientemente, se investigaron las diferentes fases de la interacción plaquetas-colágeno con colágeno artificial in vitro en condiciones de perfusión (Moroi M, Jung SM, Shinmyozu K, Tzomiyama Y, Ordinas A y Diaz-Ricart M. Analysis of platelet adhesion to collagen-coated surface under flow conditions: the involvement of glycoprotein VI in the platelet adhesion. Blood 1997; 88: 2081-2091). Los autores de ese estudio apuntaron ya a la importancia de la interacción colágeno-GP VI durante condiciones de esfuerzo de rotura. Sin embargo, la relevancia del colágeno de la matriz subendotelial para la adhesión no pudo estudiarse en esta situación in vitro artificial. Como una consecuencia de la limitada relevancia de su modelo in vitro, los autores del estudio mencionado anteriormente llegaron a la conclusión de que los receptores de GP VI están más implicados en la activación de las plaquetas que en la adhesión de las plaquetas al endotelio. Por el contrario, el receptor de GP lb de von Willebrand está implicado de manera significativa en la interacción plaquetas-subendotelio. Estos autores se centraron también en toda la información disponible sobre la interacción plaquetas-colágeno en un análisis de la bibliografía actual. Previamente, Moroi M y Jung, SM (Platelet receptors for collagen. Thromb. Haemost. 1997; 78:439-444) han analizado la interacción de las fibras de colágeno con diferentes receptores de colágeno en plaquetas para la adhesión y la formación de trombos de plaquetas. Sin embargo, los autores no esperaban un papel relevante del receptor de GP VI en la adhesión en una situación in vivo clínicamente relevante ya que no pudieron validar la significación de los diferentes receptores de colágeno en el proceso de
adhesión.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una solución al problema de inhibir la diana relevante para la interacción plaquetas-subendotelio y para la adhesión de las plaquetas sin provocar efectos secundarios no deseados de complicaciones de hemorragias. Además de la interacción colágeno-plaquetas bien conocida por medio del receptor de GP VI, se proporcionan datos de la interacción de la matriz subendotelial nativa y plaquetas medida por la adhesión de las plaquetas in vivo. Consecutivamente, se pudo validar la significación de la interacción GP VI-endotelio para la adhesión de las plaquetas como la etapa inicial de la trombosis intravascular. De ese modo, esta invención resuelve el problema de un tratamiento de un fármaco antiplaquetario eficaz para la importante etapa de adhesión de las plaquetas sin efectos secundarios no deseados.

Por lo tanto, la inmunoadhesina consiste en el dominio extracelular del receptor de GPVI junto con la parte Fc de una inmunoglobulina IgG (Fc-GPVI-nt) fusionados por medio de un engarce que tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg. Esta proteína de fusión nueva se basa aproximadamente en el 50% de la secuencia de ADN original de GP VI como se ha publicado previamente. La estructura de la proteína de la inmunoadhesina es nueva ya que la proteína de fusión recombinante no forma una proteína de membrana como el receptor de GPVI pero es una inmunoadhesina soluble, similar a una inmunoglobulina, liberada por la célula huésped respectiva. Esta inmunoadhesina puede bloquear la interacción ligando-receptor del colágeno y GP VI. Los resultados demuestran que la inmunoadhesina tiene efectos marcados sobre las principales funciones fisiológicas de las plaquetas inducidas por la estimulación con colágeno. La agregación inducida por colágeno, la adhesión y la función de liberación pueden inhibirse con la inmunoadhesina en el mismo grado que con un anticuerpo específico, monoclonal. El mecanismo, sin embargo, es diferente: mientras que el anticuerpo inhibe la activación de GP VI uniéndose directamente al sitio de unión del ligando del receptor de GP VI, la inmunoadhesina limpia el colágeno del ligando de GP VI y por lo tanto impide la activación de GP VI mediada por ligando.

La inmunoadhesina de la invención en un nuevo inhibidor de GP VI. Tiene la ventaja de la inhibición selectiva de la rama activada de los efectos mediados por GP VI limpiando el ligando. Los efectos secundarios de usar un anticuerpo anti-GPVI, como efectos mediados por el anticuerpo sobre la interiorización del receptor de GP VI, se impiden cuando se usa una proteína de fusión de la invención en lugar de un anticuerpo. La proteína de fusión de la invención puede usarse para el tratamiento de complicaciones ateroscleróticas causadas por placas ateroscleróticas inestables con ruptura de placas o lesión endotelial. Por lo tanto, la inmunoadhesina Fc-GPVI-nt sirve como un inhibidor terapéutico para la activación de GP VI mediada por colágeno sin afectar la actividad intrínseca del receptor de GP VI con el sistema de señalización relevante. Además, la inmunoadhesina GP VI sirve como un epítope ideal para la selección de anticuerpos. La parte Fc permite la purificación conveniente de la proteína y la fijación simple a superficies para realizar selección de anticuerpos a gran escala frente a bibliotecas de anticuerpos, es decir, por presentación de fagos. La selección permite la detección de anticuerpos selectivos en el epítope relevante que se parece a la proteína intacta con una estructura similar a la proteína nativa.

Finalmente, Fc-GPVI-nt es una herramienta importante en la detección de inhibidores de la activación de receptor de GP VI. Se ha establecido un ensayo in vitro basado en ELISA que simula la interacción colágeno-GP VI con placas revestidas de colágeno como ligando. Este ensayo puede realizarse como alternativa con Fc-GPVI-nt marcado con fluorescencia y de ese modo puede escalarse a formatos de alta producción. Este ensayo permite la detección tanto de anticuerpos inhibidores como de moléculas pequeñas por su potencia de inhibir la función de GP VI por medida de la fluorescencia. Con este ensayo de detección sin células, se ha establecido un procedimiento prototipo de ensayos de detección de fluorescencia escalables de alta producción para el análisis de fármacos.

Basándose en mejoras recientes en las técnicas de imagen por ultrasonidos intravasculares o imagen de resonancia magnética nuclear, es posible identificar pacientes con aterosclerosis que están en riesgo de complicaciones clínicas agudas tales como síndrome coronario o carótido agudo, por los cuales los pacientes tienen lesiones activas como causas posibles de trombosis intravascular.

Las lesiones activas se caracterizan por el desenmascaramiento de colágenos de la matriz subendotelial y activación de las plaquetas. La existencia de tales lesiones puede investigarse por ejemplo por ultrasonidos intravasculares o termografía (por ejemplo, Fayed y Fuster, Clinical imaging of the high-risk or vulnerable atherosclerotic plaque. Circulation 2001; 89:305-316) o imagen de resonancia nuclear (Helft y col., Progression and Regression of Atherosclerotic Lesions. Circulation 2002; 105:993-998). Tales lesiones son altamente probables en pacientes con síndromes coronarios o carótidos agudos, y el riesgo de que vuelvan a existir complicaciones clínicas agudas tales como infarto de miocardio o apoplejía es muy alto, disminuyendo progresivamente con el aumento de la distancia de tiempo desde el acontecimiento primario.

Por consiguiente, basándose en la presente invención, es posible tratar pacientes que están en riesgo de aterosclerosis. Para impedir la ateroprogresión, se trata un paciente con la proteína de fusión de la invención para impedir la interacción entre las plaquetas y el colágeno subendotelial expuesto. La proteína de fusión de la invención bloquea el ligando del receptor de GPVI de las plaquetas en la pared vascular (por ejemplo subendotelio) de forma que se inhibe la interacción entre las plaquetas y el colágeno expuesto.

La proteína de fusión de la invención puede estar en forma de un polvo lioflizado que se dispersa en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable adecuado previamente a la administración a un paciente. La proteína de fusión de la invención puede incorporarse también en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral, en el caso del tratamiento de complicaciones agudas, preferiblemente administración intraarterial o intravenosa. Tales composiciones normalmente comprenden la proteína de fusión y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye disolventes, medios de dispersión agentes antibacterianos y antifúngicos y agentes isotónicos, que son compatibles con la administración farmacéutica. La presente invención incluye procedimientos para la fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedad cardiovascular crónica o aguda. Tales procedimientos comprenden formular un vehículo farmacéuticamente aceptable con la proteína de fusión de la invención. En el caso del tratamiento de enfermedad cardiovascular aguda, la composición se administra preferiblemente de forma intravenosa o intraarterial. En el caso del tratamiento de enfermedad cardiovascular crónica, la composición puede administrarse también de forma subcutánea e intraperitoneal. Tales composiciones pueden incluir además componentes activos adicionales, tales como polipéptidos adicionales (tales como insulina) o moléculas pequeñas terapéuticamente activas. De ese modo, la invención incluye además procedimientos para preparar una composición farmacéutica formulando un vehículo farmacéuticamente aceptable con la proteína de fusión de la invención y uno o más compuestos activos adicionales tales como insulina. En el caso de la coformulación de la proteína de fusión e insulina para el tratamiento de pacientes diabéticos, se prefiere que la forma de dosificación permita el almacenamiento separado de las diferentes proteínas por lo cual la mezcla de las proteínas se realiza justo antes o durante la administración de la composición. Por consiguiente, se considera la aplicación de una jeringa multi-cámara. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración parenteral pretendida. Los ejemplos de rutas de administración parenteral incluyen, por ejemplo, administración intraarterial e intravenosa. Las soluciones o suspensiones usadas para administración parenteral pueden incluir un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, polietilenglicoles, aceites fijados, glicerina, propilenglicol, TWEEN u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico, dextrosa, sacarosa o manitosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede meterse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de un revestimiento tal como lecitina, con el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y con el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, trimerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoles tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico. Puede provocarse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad de los mismos. Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidades de dosificación. Una forma de unidad de dosificación son unidades discretas ajustadas como dosis unitarias para un paciente. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión (es decir, una dosis eficaz) para el tratamiento de complicaciones agudas se extiende desde 0,05 a 5 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de 0,1 a 2 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión (es decir, una dosis eficaz) para el tratamiento de la ateroprogresión crónica se extiende desde 0,5 hasta 6 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de 1 a 5 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de 2 a 5 mg/kg de peso corporal. El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión incluye un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con la proteína de fusión de la invención frente a la ateroprogresión crónica en el intervalo de 0,5 a 6 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de 1 a 5 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de 2 a 5 mg/kg de peso corporal, al menos dos veces a la semana.

Procedimientos para investigar la interacción plaquetas-colágeno y la modulación por inhibidores Agregación de plaquetas y liberación de ATP

La estimulación de plasma de ratón rico en plaquetas con concentraciones en aumento de colágeno bovino tipo I de 0,2 a 4 \mug/ml, provoca una agregación dependiente de la dosis del 2 al 95% y una liberación de ATP dependiente de la dosis de 0 a 1,66 nM de liberación de ATP. Se eligió la mitad de la concentración máxima de colágeno para experimentos adicionales. La incubación del plasma de ratón rico en plaquetas con el anticuerpo JAQ 1 anti-GP VI de ratón específico (50 \mug/ml y 100 \mug/ml) casi suprimió completamente la agregación de las plaquetas después de la estimulación con 2 \mug de colágeno/ml (con 50 \mug de JAQ 1: 2 +/- 0,7; con 100 \mug de JAQ 1: 1,5 +/- 0,3%). Además, se inhibió la liberación de ATP de una manera dependiente de la dosis de anticuerpo hasta 1,09 nM de ATP (10 \mug de anticuerpo/ml) o se suprimió completamente (50 y 100 \mug de anticuerpo/ml).

De forma similar, la incubación de plasma de ratón rico en plaquetas con la inmunoadhesina para GP VI (Fc-GPVI-nt) (50 \mug/ml y 100 \mug/ml) casi suprimió completamente la agregación de las plaquetas después de la estimulación con 2 \mug de colágeno/ml (con 50 \mug de Fc-GPVI-nt: 2 +/- 0,7; con 100 \mug de Fc-GPVI-nt: 1,5 +/- 0,3%) y liberación de ATP hasta 0 nM de ATP.

Por lo tanto, la inmunoadhesina inhibió de forma suficiente la activación de GP VI limpiando el colágeno ligando de GP VI natural. Tanto la crucial función de agregación de las plaquetas como el mecanismo de liberación de las plaquetas como se determina por la liberación de ATP pudieron influenciarse por la Fc-GPVI-nt.

Adhesión mediada por GP VI en condiciones de flujo fisiológico (cámara de flujo)

Se analizó la adhesión de las plaquetas en condiciones de rotura fisiológicas en una cámara de flujo. La adhesión inicial y firme de las plaquetas se inhibió se forma significativa con la adición de la inmunoadhesina Fc-GPVI-nt en el 60% (véase la figura 4).

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Ensayo de unión a GP VI

Se determinó la adhesión de Fc-GPVI-nt a placas revestidas con colágeno en un ensayo de fluorescencia basado en ELISA. La unión de la inmunoadhesina Fc-GPVI-nt aumentó de forma dependiente de la dosis hasta niveles de saturación en una concentración de 0,2 a 10 \mug de Fc-GPVI-nt (véase por favor la figura 5). La especificidad se demostró comparando la unión de Fc-GPVI-nt con la de la inmunoadhesina vacía Fc-nt o la superficie de plástico no revestida (véase la figura 6).

Procedimientos para investigar la adhesión de las plaquetas y la agregación a lesiones vasculares in vivo como las etapas cruciales de la activación de las plaquetas en acontecimientos vasculares agudos

Para analizar la significación biológica de las interacciones plaquetas-colágeno en los procesos de adhesión a lesiones in vivo, se valoró las interacciones plaquetas-paredes del vaso posteriormente a la lesión vascular de la arteria carótida de ratón. La lesión vascular en este importante cauce vascular puede servir como modelo para las primeras etapas de arteriosclerosis tales como lesión endotelial en la etapa temprana de la arteriosclerosis o ruptura de la placa en etapas tardías de arteriosclerosis con el desenmascaramiento de las fibras de colágeno del subendotelio. Además, este modelo permite el estudio de las complicaciones posteriores de la lesión vascular. Las lesiones del endotelio pequeño conducen a la activación máxima de las plaquetas con las siguientes etapas de adhesión y agregación de las plaquetas. En etapas adicionales, los agregados de plaquetas pueden conducir a embolismo de la arteria carótida con apoplejía cerebral isquémica consecutiva. De ese modo, esta preparación experimental sirve como un modelo in vivo relevante para un subgrupo de pacientes con aterosclerosis inestable que implica ruptura de placas y lesiones endoteliales que conducen a síndrome coronario agudo y apoplejía.

La ligación vigorosa de la arteria carótida durante 5 minutos causa de forma consistente pérdida completa de la capa celular endotelial e inicia la adhesión de las plaquetas en el sitio de la lesión, como se valora por microscopía electrónica de barrido (Fig. 1a). Puede usarse microscopía de fluorescencia in vivo para visualizar y cuantificar directamente el proceso dinámico de acumulación de plaquetas posteriormente a la lesión vascular. Se atan numerosas plaquetas a la pared vascular dentro de los primeros minutos después de la denudación endotelial (4620 \pm 205 plaquetas/mm^{2}). Virtualmente, todas las plaquetas que establecen contacto con el subendotelio muestran inicialmente una translocación de superficie lenta del tipo "stop-start" (Savage, B., Saldivar, E & Ruggeri, Z.M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell 1996; 84, 289-297). Mientras, se observa transición desde tanslocación de superficie lenta inicial hasta adhesión de plaquetas irreversible en el 88% de todas las plaquetas (4182 \pm 253 plaquetas/mm^{2}) (Fig. 1b), la detención de las plaquetas se mantiene transitoria en sólo el 12% (543 \pm 32 plaquetas/mm^{2}). Una vez que se establece la detención firme, las plaquetas adherentes reclutan plaquetas adicionales de la circulación, produciendo la formación de un agregado (Fig. 1c). Se obtienen similares características del reclutamiento de plaquetas con colágeno inmovilizado in vitro. Por el contrario, solo unas pocas plaquetas se atan a la pared vascular intacta en condiciones fisiológicas (P < 0,05 frente a lesión vascular) y virtualmente el 100% de estas plaquetas se desplazan de la pared vascular sin detención firme (P < 0,05 frente a lesión vascular, Fig. 1a-c).

Identificación de GP VI como una nueva y relevante proteína diana en plaquetas para lesión vascular in vivo

La alta complejidad de la interacción plaquetas-pared del vaso, que implica una diversidad de receptores diferentes y rutas de señalización, hace muy difícil la inhibición in vivo de este proceso. Además de GPIb-V-I-X e integrina \alpha_{IIIb}\beta_{3} que interactúan directamente con el colágeno por medio del factor de von Willebrand (vWf), se han identificado un gran número de receptores de colágeno en las plaquetas, incluyendo de forma más importante la integrina \alpha_{2}\beta_{1} (Santoro, S.A. Identification of a 160,000 dalton platelet membrane protein that mediates the initial divalent cation-dependant adhesion of platelets to collagen. Cell 1986; 46, 913-920), GPV (Moog, S. y col. Platelet glycoprotein V binds to collagen and participates en platelet adhesion and agregation. Blood 2001; 98, 1038-1046), y GPVI (Moroi, M., Jung, S.M., Okuma, M & Shinmyozu, K. A patient with platelets deficient in glicoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation and adhesion. J Clin. Invest 84, 1440-1445). Entre varios informes sobre diferentes sistemas de señalización que juegan un papel in vitro, se ha analizado ahora también GPVI (Gibbins, J.M., Okuma, M., Famdale, R., Barnes, M. & Watson, S.P. Glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptor gamma-chain. FEBS Lett. 1997; 413, 255-259; Nieswandt, B. y col. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J. Exp. Med. 2001; 193, 459-469, Nieswandt, B. y col. Glycoprotein VI but not \alpha2\beta1 integrin is essential for platelet interaction with collagen. EMBO J 2001; 20, 2120-2130).

Para analizar directamente la relevancia in vivo de las interacciones plaquetas-colágeno en la formación de trombos arteriales, se inhibió o delecionó GPVI in vivo. El anticuerpo monoclonal (mAb) JAQ1 bloquea el sitio de unión de colágeno principal en GPVI de ratón (Schulte, V. y col. Evidence for two distinct epitopes within collagen for activation of murine platelets. J Biol. Chem. 2001; 276, 364-368) e inhibe casi completamente la adhesión firme de las plaquetas a colágeno fibrilar inmovilizado en condiciones de flujo de rotura alta (Nieswandt, B. y col. Glycoprotein VI but not alpha2beta1 integrin is essential for platelet interaction with collagen. EMBO J 2001; 20, 2120-2130). Para estudiar la significación de las interacciones GPVI-colágeno en el proceso dinámico de la adhesión/agregación de plaquetas en la formación de trombos arteriales, los ratones recibieron plaquetas singénicas, marcadas fluorescentemente preincubadas con fragmentos Fab de JAQ1 o IgG de control de isotipo emparejado y se indujo lesión en la carótida como se ha descrito anteriormente. De forma muy inesperada, se descubrió que la inhibición de GPVI reduce el atado de plaquetas inicial posterior a la denudación endotelial en la arteria carótida común en el 89% (P < 0,05 frente IgG de control,
Fig. 2a), un proceso que se pensaba que esta mediado principalmente por la interacción de GPIb\alpha con vWF inmovilizado (Goto, S., Ikeda, Y., Saldivar, E. & Ruggeri, Z.M. Distinct mechanisms of platelet agregation as a consecuence of different shearing flow conditions. J. Clin. Invest. 1998; 101, 479-486; Sixma, J.J., van Zanten, G.H., Banga, J.D., Nieuwenhuls, H.K. & de Groot, P.G. Platelet adhesion. Semin. Hematol. 1995; 32, 89-98). Además, la detención estable de las plaquetas se redujo en el 93% con JAQ1 (Fig. 2a). Se observó transición desde atado inicial/translocación de superficie lenta hasta adhesión de plaquetas irreversible en sólo el 58% de las plaquetas que establecieron contacto inicial con la superficie del subendotelio (comparado con el 89% de las plaquetas pretratadas con IgG de control, P < 0,05, Fig. 2b). La agregación de plaquetas adherentes estaba virtualmente ausente posteriormente al pretratamiento de las plaquetas con fragmentos Fab de JAQ1, pero no en los controles (P < 0,05 frente control, Fig. 2c y d). Estos datos demostraron que las interacciones plaquetas-colágeno directas son cruciales para el atado de las plaquetas inicial y la adhesión y agregación de plaquetas estable posterior en sitios de lesión vascular. Además, estos descubrimientos muestran que GPVI es un regulador clave en este proceso, mientras que otros receptores de superficie, de forma más importante GPIb-V-IX y \alpha_{2}\beta_{1}, no son suficientes para iniciar adhesión y agregación de plaquetas en el subendotelio
in vivo.

Para excluir la posibilidad de que este efecto se base en el deterioro estérico de otros receptores, por ejemplo GPIb-V-IX, por JAQ1 unido a superficie, se generaron ratones deficientes en GPVI por inyección de JAQ1 cinco días antes de la lesión vascular. Como se ha informado previamente, tal tratamiento induce virtualmente la pérdida completa de GP VI por ejemplo por interiorización y degradación proteolítica de GPVI en plaquetas circulantes, produciendo un fenotipo similar a "GPVI knock out" durante al menos dos semanas (Nieswandt, B. y col. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J. Exp. Med. 2001; 193, 459-469). Como se ilustra en la Fig. 3a, GPVI era indetectable en plaquetas de ratones tratados con JAQ1 en el día 5 después de la inyección de 100 \mug/ratón de JAQ1, pero no IgG de control, mientras que la expresión de superficie y todos los otros receptores analizados, incluyendo GPIb-V-IX, \alpha_{IIIb}\beta_{3} y \alpha_{2}\beta_{1} no cambiaron en ambos grupos de ratones, confirmando los resultados anteriores (datos no mostrados y documento de Nieswandt, B. y col. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J. Exp. Med. 2001; 193, 459-469).

Como se muestra por microscopía electrónica de barrido, la adhesión y agregación de plaquetas posterior a la denudación endotelial de la arteria carótida común esta virtualmente ausente en ratones deficientes en GPVI, pero no en los pretratados con IgG (Fig. 3b). Los siguiente, se usó microscopía de videofluorescencia in vivo para definir la dinámica de adhesión de las plaquetas posterior a la lesión vascular en ratones deficientes en GPVI (Fig. 3c-f).

La pérdida de GPVI reduce de forma significativa el atado/translocación de superficie lenta de las plaquetas en el sitio de lesión vascular (el 83% comparado con ratones pretratados con IgG, P < 0,05). Esta tanslocación de superficie lenta independiente de GPVI requiere la interacción vWF-GPIba, ya que se anula por preincubación de las plaquetas con fragmentos Fab de un mAb de función bloqueante contra GPIb\alpha (pOp/B) confirmando el papel crítico de GPIb\alpha en este proceso (no mostrado). En ausencia de GPVI, se reduce la adhesión estable de las plaquetas en aproximadamente el 90% comparado con el control (tratado con IgG), mientras que la agregación de las plaquetas adherentes está virtualmente ausente (Fig. 3b-f). Se vio transición de atado de plaquetas a adhesión estable de plaquetas en sólo el 58% de todas las plaquetas atadas inicialmente en el sitio de lesión (comparado con el 89% de plaquetas de control pretratadas con mAb, P < 0,05, Fig. 3d), indicando que la translocación de superficie dependiente de GPIb\alpha no es suficiente para promover adhesión estable de plaquetas y agregación posterior.

La profunda inhibición del atado de plaquetas por el bloqueo de GPVI era sorprendente y sugería una función no reconocida previamente de este receptor en la fase muy inicial de adhesión firme de plaquetas a lesiones vasculares. El colágeno fibrilar es un constituyente principal de lesiones ateroscleróticas humanas (Rekhter, M.D. Collagen synthesis in atherosclerosis: too much and not enough. Cardiovasc. Res. 1999; 41, 376-384; Rekhter, M. D. y col. Type I collagen gene expression in human atherosclerosis. Localization to specific plaque regions. Am. J Pathol. 1993; 143, 1634-1648); la síntesis de colágeno potenciada (por células musculares lisas íntimas y fibroblastos) contribuye de forma significativa al estrechamiento luminal en el proceso de aterogénesis (Opsahl, W.P., DeLuca, D.J. & Ehrhart, L.A. Accelerated rates of collagen synthesis in atherosclerotic arteries quantified in vivo. Arteriosclerosis 1987; 7, 470-476). La ruptura o fisura de las placas (de forma espontánea o posteriormente a angioplasia de globo) produce la exposición de las fibras de colágeno a la sangre que fluye.

La invención muestra por primera vez que tales colágenos subendoteliales son el accionador principal de la formación de trombos arteriales y revela una función inesperada del receptor GPVI de colágeno en el reclutamiento de las plaquetas a la pared dañada del vaso. El proceso de atado de las plaquetas y translocación de superficie lenta en condiciones de rotura elevada se sabe que dependen en gran medida de la interacción de GPIb\alpha con vWF inmovilizado. Esta interacción no es, sin embargo, suficiente para establecer las interacciones plaquetas-pared del vaso in vivo ya que se requiere también GPVI funcional (Fig. 2 y 3). De ese modo, tanto GPIb\alpha como GPVI deben actuar de forma concertada para reclutar plaquetas en el subendotelio. Durante el atado de las plaquetas, la ligación de GPVI puede cambiar las integrinas \alpha_{IIb}\beta_{3} y \alpha_{2}\beta_{1} de un estado de baja afinidad a uno de alta. Tanto \alpha_{IIb}\beta_{3} como \alpha_{2}\beta_{1} actúan después de forma concertada para promover la posterior detención estable de las plaquetas sobre el colágeno, mientras que \alpha_{IIb}\beta_{3} es esencial para la agregación posterior de plaquetas adherentes. De ese modo, la ligación de GPVI durante el contacto inicial entre plaquetas y colágeno subendotelial proporciona una señal de activación que es esencial para la posterior adhesión y agregación estable de las plaquetas. De forma importante, la ocupación o agrupamiento lateral de GPIb\alpha (durante la translocación de superficie dependiente de GPIb\alpha), que induce niveles bajos de activación de la integrina \alpha_{IIb}\beta_{3} in vitro (Kasirer-Friede, A. y col. Lateral clustering of platelet GP Ib-IX complexes leads to up-regulation of the adhesive function of integrin \alphaIIb\beta3. J. Biol. Chem. 2002; Vol 227; 11949-11956), no es suficiente para promover adhesión de plaquetas in vivo.

La invención ha identificado por lo tanto un receptor esencial para la inibición de la unión de las plaquetas al subendotelio. Un anticuerpo que bloquee la interacción de GPVI con colágeno expuesto puede inhibir específicamente todas las fases principales de la formación de trombos, es decir, el atado de las plaquetas, la adhesión firme y la agregación en sitios de lesión arterial (por ejemplo durante síndromes coronarios agudos). La protección muy profunda que se logró por inhibición o reducción de GPVI establece la importancia de la modulación farmacológica selectiva de las interacciones colágeno-GPVI para controlar la aparición y progresión de lesiones ateroscleróticas patológicas.

Posteriormente a la ruptura de la placa aterosclerótica, la exposición del colágeno subendotelial es el accionador principal que inicia la adhesión y agregación de las plaquetas en el sitio de lesión, seguido por trombosis arterial (1; 24; 25). La glicoproteína GPVI de plaquetas, que se ha clonado recientemente (5;6), se ha identificado por la invención como el receptor de colágeno principal de las plaquetas (4), mediando la adhesión de las plaquetas tanto in vitro (22) como en condiciones (pato-)fisiológicas in vivo (3). Por lo tanto, la inhibición de GPVI impide el reclutamiento de plaquetas y la trombosis arterial en pacientes con aterosclerosis avanzada como se muestra por la presente invención por las actividades inhibidoras de la proteína de fusión específica Fc-GPVI-nt sobre la adhesión de las plaquetas in vitro e in vivo.

La proteína de fusión Fc-GPVI-nt se expresa en células HELA usando un sistema de expresión adenovírico para obtener Fc-GPVI-nt soluble. La caracterización de las formas solubles de GPVI revelaron que Fc-GPVI-nt se secreta como un dímero con una masa molecular de aproximadamente 160 kDa. De forma consistente, Miura y colaboradores informaron recientemente que el dímero GPVI-Fc está presente como un dímero, en el que dos moléculas de dímero GPVI-Fc están entrecruzadas por enlaces disulfuro formados entre las Cys del dominio Fc de cada molécula (21). De forma importante, se ha informado que sólo la forma dimérica de GPVI, pero no los monómeros del dominio extracelular de GPVI, muestran afinidad de unión a colágeno y que atenúan la agregación de las plaquetas inducida por colágeno (21).

Los ensayos de unión se realizaron para definir la interacción dímero de GPVI-colágeno. La GPVI soluble se une a colágeno inmovilizado de una manera saturable. La unión del dímero GPVI-Fc a colágeno fibrilar era altamente específica, ya que no ocurría a vWF o BSA inmovilizados. Además, la unión de GPVI a colágeno inmovilizado pudo inhibirse con colágeno soluble. Se requirieron concentraciones altas de colágeno soluble para bloquear la unión del dímero GPVI-Fc, indicando que la proteína de fusión se une a colágeno inmovilizado con afinidad alta. De forma correspondiente, se ha informado de una constante de asociación y disociación alta (K_{D} de aproximadamente 5,8 x 10^{-7} M) para la interacción GPVI-colágeno (21).

Se ha demostrado anteriormente que Fc-GPVI-nt soluble atenúa la activación y agregación de las plaquetas en respuesta a colágeno o convulxina, una toxina de serpiente, que se une a GPVI con afinidad alta (6;21;27). Aparte de la agregación de plaquetas, GPVI está implicada de manera crítica en el proceso de adhesión de plaquetas a colágeno (3;22). En el presente estudio, se analizó por lo tanto los efectos de Fc-GPVI-nt sobre la adhesión de las plaquetas en condiciones de flujo fisiológico in vitro. Se muestra que Fc-GPVI-nt soluble inhibe de forma dependiente con la dosis la adhesión de las plaquetas en condiciones de rotura bajas y altas in vitro. En presencia de Fc-GPVI-nt, pero no de péptido Fc de control, la agregación de plaquetas adherentes estaba virtualmente ausente, indicando que GPVI contribuye al proceso tanto de adhesión de plaquetas como de posterior activación por colágeno inmovilizado. GPVI confiere respuestas de colágeno (es decir, adhesión y agregación) de una manera dependiente de la densidad de receptor (22). Correspondientemente, se ha informado que una reducción de más del 50% en la expresión de GPVI en células RBL-2H3 transfectadas está asociada con una carencia de agregación inducida por colágeno en estas células (8;22). Ya que se ha informado de una variabilidad baja en la densidad de receptor de GPVI, aunque en una muestra pequeña de población (22), se podría esperar que la inhibición de aproximadamente el 50% de los enlaces colágeno-GPVI sea suficiente para atenuar el reclutamiento de plaquetas a colágeno expuesto. En el presente estudio, se requirieron dosis de 1 mg/kg de Fc-GPVI-nt para inducir inhibición significativa de la adhesión de plaquetas en flujo, apoyando la noción de que están disponibles múltiples sitios de unión de GPVI en cada fibra de colágeno. Se requirieron cantidades similares de un anticuerpo anti-GPVI de función bloqueante para atenuar la interacción plaquetas-pared dañada del vaso in vivo (3).

El colágeno fibrilar en un constituyente principal de las paredes normales de los vasos pero también de lesiones ateroscleróticas (28). La ruptura o fisura de la placa aterosclerótica produce la exposición de las fibras de colágeno a plaquetas circulantes. Como se ha informado anteriormente, las interacciones GPVI-colágeno están implicadas esencialmente en la formación de trombos arteriales posteriormente a la lesión vascular (3). Aquí se demuestran los efectos in vivo de Fc-GPVI-nt soluble sobre el reclutamientos de plaquetas después de la lesión arterial. Se indujo la denudación endotelial por ligación reversible de la arteria carótida y el proceso dinámico de unión de las plaquetas se controló por microscopía de videofluorescencia intravital como se ha descrito (3). Se demuestra por primera vez in vivo que Fc-GPVI-nt soluble atenúa el atado estable de las plaquetas, la adhesión y agregación de plaquetas posteriormente a la denudación endotelial. La inhibición del reclutamiento de plaquetas por Fc-GPVI-nt era dependiente de la dosis. Aparte de impedir la detención estable de las plaquetas, Fc-GPVI-nt redujo de forma significativa el atado inicial de las plaquetas/translocación de superficie lenta en sitios de denudación endotelial. Se ha demostrado anteriormente que la inhibición de GPIb\alpha o de GPVI atenúa el atado de las plaquetas en un grado similar (3), apoyando que la interacción de GPVI y GPIbM necesita actuar en contacto para promover el atado de las plaquetas a colágeno subendotelial (2;29-31). De hecho, las altas tasas de asociación y disociación comunicadas para la interacción GPVI-ligando (22) son consistentes con el papel de GPVI como un receptor del atado.

La presente invención identifica Fc-GPVI-nt como un ingrediente activo de un medicamento para atenuar la trombosis arterial posterior a lesión vascular. Este concepto se apoya además por la observación de que Fc-GPVI-nt se fija como objetivo el subendotelio expuesto en el sitio de lesión vascular, como se demuestra por inmunohistoquímica. Esto implica que la inhibición de las interacciones GPVI-colágeno es probable que se restrinjan al sitio de lesión vascular, mientras que una inhibición sistémica prolongada de la función de las plaquetas está limitada por la esperada semivida corta del Fc-GPVI-nt no unido. Por el contrario, la administración de anticuerpos monoclonales dirigidos contra GPVI conduce inevitablemente a la inhibición sistémica de GPVI en todas las plaquetas circulantes. Además, la administración de Fc-GPVI-nt no afectó al recuento de plaquetas. Por el contrario, los mAb anti-GPVI pueden inducir eventualmente trombocitopenia inmune o una pérdida completa de GPVI en plaquetas circulantes (14;32), dificultando su uso en la práctica clínica. Por consiguiente, la terapia con Fc-GPVI-nt estará probablemente asociada con un menor riesgo de hemorragia clínica, comparada con estrategias basadas en mAb anti-GPVI.

La adhesión y agregación de plaquetas a sitios de lesión vascular es crucial para la hemostasia pero puede conducir a oclusión arterial en el establecimiento de la aterosclerosis y precipitar enfermedades tales como trombosis coronaria e infarto de miocardio. El uso de inhibidores del receptor de GPIIb-IIIa intravenosos, ha mejorado de manera significativa el éxito clínico de pacientes que sufren oclusión coronaria (33-35). Sin embargo, se ha informado que las complicaciones de hemorragias graves dificultan el resultado de pacientes tratados con abciximab (36). La presente invención demuestra que la inhibición de las interacciones GPVI-colágeno por Fc-GPVI-nt era suficiente para reducir de forma significativa la adhesión tanto in vitro como in vivo; sin embargo, la forma soluble de GPVI sólo prolongó de forma moderada los tiempos de hemorragia finales. De manera similar, se ha informado de trastornos de hemorragias moderadas en pacientes con plaquetas deficientes en GPVI (37), indicando que la coagulación y la hemostasia son eficaces incluso en la ausencia completa de GPVI. En parte esta discrepancia puede deberse al hecho de que la inhibición o ausencia de GPVI no interfiere con la agregación de las plaquetas en respuesta a agonistas de plaquetas diferentes del colágeno, por ejemplo AFP, factor de tejido o trombina. Por el contrario, la inhibición directa de GPIIb-IIIa, por ejemplo por 7E3 o su derivado humanizado, bloquea la unión de fibrinógeno a plaquetas, un proceso que es esencial para la agregación de las plaquetas, y atenúa de manera sustancial la agregación de las plaquetas a la mayoría de los agonistas de plaquetas conocidos hasta ahora. Por consiguiente, la terapia con Fc-GPVI-nt está asociada con un menor riesgo de hemorragia clínica, comparada con las estrategias basadas en anti-GPIIb-IIIa.

En conclusión, la presente invención proporciona la primera prueba in vivo de que Fc-GPVI-nt atenúa la adhesión de las plaquetas en flujo in vitro y posteriormente a la denudación endotelial en la arteria carótida de ratones in vivo. Esto apoya además el concepto de que las interacciones GPVI-colágeno juegan un papel central en todas las fases principales de la formación de trombos, es decir, atado de plaquetas, adhesión firme y agregación a sitios de lesión arterial (por ejemplo durante síndromes coronarios agudos). La presente invención apoya además el concepto de que GPVI juega un papel principal en la progresión de la aterosclerosis. Además, la presente invención muestra por primera vez la conexión causal entre GPVI y diabetes.

La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos específicos.

Ejemplos

Animales. Se obtuvieron ratones C57BL6/J sin patógenos específicos de Charles River (Sulzfeld, Alemania). Para los experimentos, se usaron ratones machos de 12 semanas de edad. Todos los procedimientos experimentales realizados en los animales estaban aprobados por la legislación alemana sobre protección de animales. Anticuerpos monoclonales. Se generaron anticuerpos monoclonales (mAb) anti GPVI (JAQ1) y anti-GPIb\alpha (pOp/B) y fragmentos Fab de JAQ y pOp/B como se ha descrito (Bergmeier, W., Rackebrandt, K., Schroder, W., Zirngibl, H. & Nieswandt, B. Structural and functional characterization of the mouse von Willebrand factor receptor GPib-IX with novel monoclonal antibodies. Blood 2000; 95, 886-893; Nieswandt, B., Bergmeier, W., Rackebrandt, K., Gessner, J.E. & Zirngibl, H. Identification of critical antigen-specific mechanisms in the development of inmune thrombocytopenic purpura in mice. Blood 2000; 96, 2520-2527). Se obtuvo IgG de rata de control irrelevante de Pharmingen (Hamburg, Alemania).

Generación de ratones deficientes en GPVI

Para generar ratones que carecen de GPVI, se inyectaron 100 \mug de JAQ1 i.c a ratones de tipo salvaje C57BL6/J. Los animales se usaron para valorar in vivo la adhesión de las plaquetas en el día 5 después de la inyección de mAb. La ausencia de expresión de GPVI en plaquetas se verificó por análisis de transferencia de Western y citometría de flujo.

Citometría de flujo

Se diluyó 1:30 sangre completa heparinizada, obtenida de ratones C57BL6/J o mermados en GPVI, con tampón Tyrodes-HEPES modificado (NaCl 134 nM, Na_{2}HPO_{4} 0,34 mM, KCl 2,9 mM, NaHCO_{3} 12 mM, HEPES 20 mM, glucosa 5 mM y MgCl_{2} 1 mM, pH 6,6). Las muestras se incubaron con mAb anti-GPVI marcado con fluoróforo (JAQ1) y anti-CD41 durante 10 minutos a temperatura ambiente y se analizaron directamente en un FACScan^{TM} (Becton Dickinson).

Clonación, expresión vírica y purificación de GPVI humana y de ratón soluble. Para generar una forma soluble de GPVI humana, se clonó el dominio extracelular de GPVI humana y se fusionó con el dominio Fc de inmunoglobulina humana de acuerdo con los siguientes ejemplos 1 a 3. Las construcciones adenovíricas que codifican la proteína de fusión GPVI-Fc o Fc de control se prepararon para generar la proteína recombinante. GPVI-Fc y Fc de control se expresaron y secretaron como proteínas solubles usando la línea celular HELA humana para evitar la pérdida de plegamiento y la no-glicosilación de las proteínas expresadas.

Ejemplo 1 Clonación de la inmunoadhesina de GPVI (Fc-GPVI-nt)

Se generó una inmunoadhesina del receptor de GP VI generando una proteína de fusión recombinante de la parte n-terminal de GP VI -que codifica el dominio extracelular de GPVI- junto con la parte Fc de una IgG. La Fc se amplificó a partir de una biblioteca de ADNc de corazón humano (Clonetech, Palo Alto, CA) por PCR usando el cebador directo 5'-cgcggggcggccgcgagtccaaatcttgtgacaaaac-3' y el cebador inverso 5'-gcgggaagctttcatttacccggagacagggag3'. La reacción de PCR se realizó a una temperatura de hibridación de 58ºC y 20 ciclos con el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). El fragmento de PCR se clonó en el plásmido pADTrack CMV con NotI/HindIII y la secuencia se analizó por secuenciación (MediGenomix, Martinsried, Alemania).

Para la clonación del dominio extracelular de GPVI humana, se aisló ARN de megacariocitos cultivados (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se realizó transcripción inversa (Omniscript RT Kit; Qiagen) con 2 \mug de ARN a 37ºC durante toda la noche. Se usaron 100 ng de la reacción como molde en la amplificación por PCR de la HGPVI con el cebador 5'-gcggggagatctaccaccatgtctccatccccgacc-3' y
5'-cgcggggcggccgccgttgcccttggtgtagtac-3'. La reacción de PCR se realizó a una temperatura de hibridación de 54ºC y 24 ciclos con el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). El fragmento de PCR se clonó en el plásmido pDATrack CMV Fc con BglII/NotI y la secuencia se analizó por secuenciación.

Construcción de una proteína de fusión monomérica basada en Fc-GPVI-nt

El fragmento de monómero Fc se amplificó por PCR usando la pareja de cebadores 5'-cgcggggcggccgcccagcacctgaactcctg-3' y 5'-cgcggggatatctcatttacccggagacagggag-3' y pADTrack CMV gpVI-Fc como molde. La reacción de PCR se realizó a una temperatura de hibridación de 58ºC y 20 ciclos con el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche MOlecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). El fragmento de PCR de monómero Fc (NotI/EcoRV) y el fragmento gpVI de pADTrack CMV gpVI-Fc (BgIII/NotI) se clonaron como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2 Generación del adenovirus para Fc-GPVI-nt (Af-Fc-GPVI-nt)

El plásmido pADTrack CMV Fc-GPVI-nt se linearizó con PmeI (New England Biolabs, Beverly, MA) durante toda la noche, se desfosforiló y se purificó (ADN GFX y Gel Purification Kit; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Para la recombinación, se cotransfectaron E. coli BJ5183 electrocompetentes (Stratagene, La Jolla, California) con 1 \mug de plásmido linearizado y 0,1 \mug de pAdeasy1 a 2500 V, 200 \Omega y 25 \muFD (E. coli-pulser, Biorad, Heidelberg, Alemania), se pusieron en placas y se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Las colonias se analizaron después de la minipreparación del plásmido-ADN con PacI y los clones positivos se retransformaron en E. coli DH5\alpha.

Para la transfección de 293 células (reactivo Effectene Transfection; Qiagen, Hilden, Alemania), se digirió plásmido-ADN con PacI. Las células se cultivaron durante 7 días y se recogieron por raspado y centrifugación. El sedimento se resuspendió en PBS de Dulbecco y las células se lisaron con cuatro ciclos repetitivos de congelación (-80ºC) y descongelación (37ºC). Los restos de células se retiraron por centrifugación y el lisado se almacenó a -80ºC.

Para la selección de placas de virus recombinantes, se infectan 293 células en PBS de Dulbecco durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación suave con diferentes diluciones en serie de lisado de la transfección. Posteriormente a la infección, las células se recubren con medio de crecimiento que contiene agarosa al 0,5% (mezcla 1:1 de medio Eagles modificado 2 x, Gibco Life Technologies Nº 21935, suplementado con suero al 20%, Penicilina/Streptomicina 2 x, L-glutamina 2 x y agarosa en agua al 1%, Seacam). A los 5-14 días post-infección se controló en la capa celular la formación de placas que se recogieron usando una pipeta Pasteur, se resuspendieron en 0,5 ml de PBS de Dulbecco y se almacenaron a -80ºC. Las placas se usaron para rondas de amplificación adicional en 293 células.

Construcción CHO estables que expresan el monómero gpVI-Fc humano

Las células que expresan el monómero se generaron de acuerdo con el ejemplo 2.

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Ejemplo 3 Purificación de la proteína Fc-GPVI-nt y la inmunoadhesina de control Fc

Se recogió el sobrenadante del cultivo de células Hela infectadas con Ad-Fc-GPVI-nt 2 días después de la infección, se centrifugaron (3800 g, 30 min, 4ºC) y se filtraron (0,45 \mum). La inmunoadhesina se precipitó por adición de 1 vol. de sulfato de amonio (761 g/l) y se agitó durante toda la noche a 4ºC. Las proteínas se sedimentaron por centrifugación (3000 g, 30 min, 4ºC), se disolvieron en 0,1 Vol de PBS y se dializaron en PBS durante toda la noche a 4ºC. La solución de proteína se clarificó por centrifugación (3000 g, 30 min, 4ºC) y se cargó en una columna de proteína A (HiTrap^{TM} protein A HP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). La columna se lavó con tampón de unión (tampón de fosfato sódico 20 mM pH 7,0, NaN_{3} al 0,02%) hasta una DO_{280} < 0,01 y se eluyó con tampón de elución (glicina 100 mM pH 2,7). Las fracciones eluidas se neutralizaron con tampón de neutralización (Tris/HCl 1 M pH 9,0, NaN_{3} al 0,02%), se combinaron, se dializaron en PBS durante toda la noche a 4ºC, se alicuotaron y se congelaron a -20ºC.

La masa molecular de la proteína Fc-GPVI-nt era de -80 kDa en condiciones reductoras en SDS-PAGE, como se detectó por tinción con azul de Coomasie o por inmunotransferencia con anticuerpo anti-Fc humano de cabra conjugado con peroxidasa o por mAb 5C4 anti-GPVI (Fig. 1a, grupo superior y del medio). Por el contrario, se identificó una proteína de \sim160 kDa en condiciones no reductoras (Fig. 1a, grupo inferior), apoyando la noción de que GPVI-Fc se obtiene únicamente como un dímero (21).

Ejemplo 4 Ensayo de detección de inhibidores de GPVI

Se revistieron placas de ELISA (Immulon2 HB, Dynx Technologies, Chantilly, VA) durante toda la noche a 4ºC con 1 \mug/pocillo de colágeno (bovino tipo I; BD Bioscience, Bedford, MA) en 100 \mul de Tris/HCl 50 mM pH 8,0. La placa se lavó con 250 \mul/pocillo de PBS/Tween 20 al 0,05% (PBST) dos veces y se bloqueó con 250 \mul/pocillo de Roti-Block (Roth, Karlsruhe, Alemania) durante toda la noche. La placa se lavó con 250 \mul/pocillo de PBST dos veces, se añadieron 100 \mul de Fc-GPVI-nt en PBST (óptimo, 2 \mug/pocillo) y la placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar 5 veces con 250 \mul de PBST, se añadieron 100 \mul de anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa (Dianova, Hamburg, Alemania) en una dilución de 1:10000 y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de repetir el lavado con 250 \mul de PBST, se añadieron 100 \mul de reactivo de detección (BM Blue POD Substrate; Roche, Mannheim, Alemania) y se incubó durante 15 min. La reacción se paró por adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M y la placa se midió a 450 nm frente a la longitud de onda de referencia de 690 nm. Para detectar inhibidores potenciales, se añaden compuestos de ensayo a la incubación en 100 \mul de PBST a diversas concentraciones.

Ejemplo 5 Agregación de Plaquetas y luminometría

Se evaluó la agregación de plaquetas ex vivo por agregometría óptica en muestras de sangre con citrato a 37ºC usando un agregómetro Chronolog de dos canales (Nobis, Alemania). Se preparó plasma rico en plaquetas a partir de sangre completa con citrato por centrifugación (200 g durante 20 min). El recuento final de plaquetas se ajustó a 2 x 10^{8} plaquetas/ml con plasma autólogo. Después del ajuste de la línea basal, se añadió colágeno (tipo I, bovino) de 0,2 a 4 \mug/ml y se registró la agregación durante 5 min. De manera simultánea, se registró la liberación de ATP usando el procedimiento de luminometría de luciérnaga. La incubación con el anticuerpo JAQ1 GP VI monoclonal se realizó durante 15 min con 50 \mug/ml de anticuerpo.

Ejemplo 6 Ensayo de adhesión de plaquetas in vitro para la interacción GP VI-colágeno

A partir de sangre ACD (concentración final del 20%) se preparó plasma rico en plaquetas y se ajustó a una concentración final de 10^{8} plaquetas/ml con Hepes Tyrodes (pH 6,5). Se revistieron cubreobjetos con monocapas de diversas proteínas adhesivas (colágeno, vWF) a diferentes concentraciones. Los estudios de perfusión se realizaron en una cámara de perfusión generada a partir de cubreobjetos de vidrio. La perfusión se realizó a velocidades de rotura de 500/s que representa flujo bajo-medio y 2000/s que representa velocidades de rotura altas. La adhesión se midió a 37ºC durante 20 minutos y después se sacó de la cámara a velocidades de rotura de la pared fijas durante 5 minutos usando una bomba de jeringa automatizada. Después de la perfusión, los cubreobjetos se lavaron suavemente con Hepes Tyrodes, tomado de la cámara. Los cubreobjetos se lavaron repetidamente con Hepes Tyrodes hasta retirar completamente las plaquetas adhesivas. Las plaquetas en suspensión se analizaron cuantitativamente por medidas de FACS. El análisis del estado funcional de las plaquetas se valoró además por análisis de marcadores de expresión de superficie (CD 41; CD 61 y CD 62 P) de acuerdo con el protocolo de citometría de flujo convencional.

Ejemplo 7 Preparación de plaquetas para microscopía intravital

Se aislaron plaquetas (tipo salvaje, o deficientes en GPVI) a partir de sangre completa como se ha descrito (Massberg, S. y col. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: the role of P-selectin. Blood 1998; 92, 507-515) y se marcaron con 5-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (DCF). La suspensión de plaquetas marcadas con DCF se ajustó a una concentración final de 200 x 10^{6} plaquetas/250 \mul. Donde se indique, las plaquetas de tipo salvaje fluorescentes se preincubaron con 50 \mug/ml de fragmentos Fab anti-GPVI (JAQ1), o fragmentos Fab anti GPIb\alpha (pOp/B) durante 10 min. Posteriormente, las plaquetas pretratadas junto con los fragmentos Fab se infundieron en ratones destinatarios de tipo salvaje y se valoró la adhesión de las plaquetas previamente y después de la lesión en la carótida por videomicroscopía in vivo, como se describe a continuación.

Ejemplo 8 Valoración de la adhesión y agregación de las plaquetas por microscopia intravital

Se anestesiaron ratones de tipo salvaje C57BL6/J o deficientes en GPVI por inyección intraperitoneal de una solución de midazolama (5 mg/kg de peso corporal, Ratiopharm, Ulm, Alemania), medetomidina (0,5 mg/kg de peso corporal, Pfizer, Karlsruhe, Alemania) y fentanilo (0,5 mg/kg de peso corporal, CuraMed Pharma GmbH, Munich, Alemania). Se implantaron catéteres de polietileno (Portex, Hythe, Inglaterra) en la vena yugular derecha y se infundieron plaquetas fluorescentes (200 x 10^{6}/250 \mul) de forma intravenosa. Se diseccionó libre la arteria carótida derecha y se ligó vigorosamente cerca de la bifurcación carótida durante 5 minutos para inducir lesión vascular. Previamente y posteriormente a la lesión vascular, las plaquetas fluorescentes se visualizaron in situ por videomicroscopía in vivo de la arteria carótida común derecha. Se controlaron las interacciones plaquetas-pared del vaso usando un microscopio Zeiss Axiotech (objetivo de inmersión de agua 20 x, W 20 x/0,5, Zeiss) con una lámpara de mercurio HBO de 100 W para epi-iluminación. Todas las imágenes de vídeo grabadas se evaluaron usando un programa de análisis de imagen asistido por ordenador (Cap Image 7,4, Dr. Zeintl, Heidelberg, Alemania). Las plaquetas adherentes de forma transitoria se definieron como células que cruzan una perpendicular imaginaria por el vaso a una velocidad significativamente inferior que la velocidad de la línea central; sus números se dan como células por mm^{2} de superficie endotelial. El número de plaquetas adherentes se valoró contando las células que no se movieron o separaron de la superficie endotelial en 10 segundos. El número de agregados de plaquetas en el sitio de la lesión vascular se cuantificó también y se presenta en mm^{2}.

Ejemplo 9 Microscopía electrónica de barrido

Posteriormente a la microscopía de videofluorescencia intravital, se perfundió la arteria carótida con PBS (37ºC) durante 1 min, seguido por fijación por perfusión con glutaraldehido tamponado con fosfato (1% vol/vol). La arteria carótida se extirpó, se abrió longitudinalmente, se fijó adicionalmente por inmersión en glutaraldehído tamponado con PBS al 1% durante 12 horas, se deshidrató en etanol y se procesó por secado de punto crítico con CO_{2}. Posteriormente, los especímenes de arterias carótidas se orientaron con el lumen expuesto, se montaron con pintura de carbono, se revistieron por metalizado por bombardeo atómico con platino y se examinaron usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (JSM-6300F, Jeol., Tokyo, Japón).

Ejemplo 10 Valoración de la unión de Fc-GPVI a colágeno inmovilizado

Se determinó la unión de Fc-GPVI-nt a colágeno inmovilizado. Se revistieron placas de ELISA (Immulon2 HB, Dynx Technologies, Chantilly, VA) durante toda la noche a 4ºC con 1 \mug de colágeno (tipo I bovino; BD Biosciences, Bedford, MA) en 100 \mul de tampón de revestimiento (1,59 g/l de Na_{2}CO_{3}, 2,93 g/l de NaHCO_{3}, 0,2 g/l de NaN_{3}, pH 9,6). Las placas se lavaron con 250 \mul/pocillo de PBS/Tween 20 al 0,05% (PBST) dos veces y se bloquearon con 250 \mul/pocillo de Roti-Block (Roth, Karlsruhe, Alemania) durante toda la noche. Las placas se lavaron con 250 \mul/pocillo de PBST dos veces, después se añadieron 3,0, 6,0, 12,5, 25,0, 50,0 ó 100 \mug/ml de Fc-GPVI-nt en PBST y la placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Donde se indique, se preincubó Fc-GPVI-nt (20 \mug/ml) durante 10 min con colágeno soluble. Después de la incubación, las placas se lavaron 5 veces con 250 \mul de PBST y se añadió un fragmento específico de anticuerpo Fc\gamma anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa (109-035-098; Dianova, Hamburg, Alemania) en una dilución de 1:10.000 y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar 5 veces con 250 \mul de PBST, se añadieron 100 \mul de reactivo de detección (BM Blue POD Substrate; Roche, Mannheim, Alemania) y se incubo hasta 10 min. La reacción se paró por adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M y la placa se midió a 450 nm frente a la longitud de onda de referencia de 690 nm.

Fc-GPVI-nt mostró una unión a colágeno inmovilizado dependiente de la dosis y saturable (Fig. 9b). Se observó la mitad de la unión a colágeno máxima a una concentración de Fc-GPVI-nt final de 6,0 \mug/ml. La unión de GPVI no ocurrió a BSA, vWF (Fig. 9c, grupo izquierdo) o Poli-L-Lisina (no mostrado), apoyando la especificidad de la unión de Fc-GPVI-nt. Además, no se detectó ninguna unión significativa de la proteína Fc de control que carece del dominio GPVI externo en condiciones idénticas (Fig. 9c, grupo derecho).

Para abordar adicionalmente la especificidad de la unión de GPVI, se analizó la capacidad del colágeno fibrilar solubilizado de competir con el colágeno inmovilizado para la asociación con Fc-GPVI-nt. El colágeno soluble inhibió la unión de Fc-GPVI-nt a colágeno inmovilizado de una manera dependiente con la dosis (Fig. 9d). Se requirió una concentración de 100 \mug/ml de colágeno soluble para reducir la unión de Fc-GPVI-nt en más del 50%. Juntos, estos datos indican que la unión de Fc-GPVI a colágeno es específica y se caracteriza por afinidad alta.

Ejemplo 11 Generación de anticuerpos monoclonales contra GPVI humana

Se generaron anticuerpos monoclonales esencialmente como se ha descrito (17). Se inmunizaron ratas Lou/C con la proteína de fusión Fc-GPVI-nt humana expresada de forma adenovírica. Se realizó la detección de sobrenadantes de hibridomas en un inmunoensayo en fase sólida usando Fc-GPVI-nt o Fc que carecía del dominio GPVI. La detección identificó que el sobrenadante de hibridoma 5C4 se une específicamente a Fc-GPVI-nt pero no a Fc que carecía del dominio GPVI externo. Se determinó el tipo de inmunoglobulina con una clase de Ig de rata (anti-IgM) y mAb de ratón específica de la subclase de IgG. Los anticuerpos monoclonales se purificaron usando columnas de Proteína G-Sepharose. Se verificó la especificidad de anticuerpo de 5C4 por inmunotransferencia contra Fc-GPVI-nt y Fc de control. El anticuerpo monoclonal 5C4 detectó Fc-GPVI-nt expresada de forma adenovírica pero no Fc de control. Además, se recuperó GPVI humana en lisados obtenidos de plaquetas humanas. Además, 5C4 se une específicamente a la superficie de las plaquetas pero no de leucocitos o glóbulos rojos sanguíneos, como se demuestra usando citometría de flujo (no mostrado).

Ejemplo 12 Medidas FACS de la externalización de CD62 P

Se recogió sangre humana con citrato de voluntarios. Se generó plasma rico en plaquetas (PRP) después de procedimientos de centrifugación y lavado (PBS 1 x; pH 7,2) con 2000 rpm a 4ºC y resuspensión. Se diluyó PRP en tampón de tinción (PBS 1 x (w/o Ca^{2+} y Mg^{+}) con azida sódica al 0,1% y suero fetal bovino al 2% (FBS), CaCl 2 mM) y se incubó con colágeno equino tipo 1 (0; 2; 5 y 10 \mug/ml; Nobis) en presencia de Fc-GPVI-nt (100 \mug/ml) o concentraciones equimolares de Fc de control. Se añadieron anticuerpos anti CD 62P marcados con el fluoróforo peroxidasa (Immunotech). Se realizó la medida de FACS con un dispositivo FACScalibur Becton Dickenson.

Concentraciones en aumento de colágeno condujeron a la secreción de plaquetas a partir de gránulos alfa indicado por la externalización de CD 62P. La co-incubación de colágeno con Fc-GPVI-nt debilitaron la externalización de CD62P determinada por FACS (Fig 10).

Ejemplo 13 Agregación de plaquetas y liberación de ATP

Se generó PRP como se ha descrito anteriormente. Se determinó la agregación en un agregómetro de sangre completa 500 VS (Chrono-Log Corporation). Se ajustó el número de células de plaquetas del PRP a 1,0 x 10^{8} células/ml con tampón Thyrodes-HEPES (2,5 mmol/l de HEPES, 150 mmol/l de NaCl, 12 mmol/l de NaHCO_{3}, 2,5 mmol/l de KCl, 1 mmol/l de MgCl_{2}, 2 mmol/l de CaCl_{2}, 5,5 mmol de D-glucosa, 1 mg/ml de BSA, pH 7,4). Se añadió Chrono-Lume Nº 395 (Chrono-Log Corporation) para la medida de ATP. Se añadieron agonistas a las plaquetas, se pipetearon en el agregómetro y se inició la agregación en condiciones de agitación definidas. Se determinó la agregación por el cambio en la transmisión de luz debido a las plaquetas que coagulan y se normalizó a un patrón interno. Se determinó la liberación de ATP a la longitud de onda característica de Chrono-Lume para el ATP y se normalizó a un patrón interno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La agregación de plaquetas y liberación de ATP se inhibió específicamente por Fc-GPVI-nt para estimulación de agonistas mediada por colágeno (Fig 11a y b). La agregación de plaquetas mediada por ADP y trombina (TRAP 10 \muM) y la liberación de ATP no se afectaron por Fc-GPVI-nt.

Ejemplo 14 Liberación de PDGF de plaquetas humanas

Se preparó PRP de voluntarios humanos como se ha descrito anteriormente. Se determinó la liberación de PDGF de plaquetas humanas con un sistema de kit (R & D systems Nº DHD00B) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estimuló la liberación de PDGF con colágeno tipo 1 (20 \mug/ml; Nobis) en condiciones de control y en presencia de Fc-GPVI-nt (100 \mug/ml) o concentraciones equimolares de Fc de control. La liberación de PDGF se normaliza con la sonda patrón del fabricante.

La liberación de PDGF como un indicador de la liberación de transmisores endógenos a partir de gránulos alfa de plaquetas se debilitó también después de la estimulación con colágeno. (Fig 11c).

Ejemplo 15 Efecto de Fc-GPVI-nt sobre el tiempo de hemorragia a partir de sangre humana completa in vitro

Se determinó el tiempo de hemorragia in vitro con un dispositivo PFA-100 (Dade-Behring). Se inyectaron 800 \mul de sangre humana completa en el dispositivo PFA-100. Se midió el tiempo de hemorragia con células de medición revestidas con ADP/colágeno y epinefrina/colágeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

No hubo prolongación significativa del tiempo de hemorragia in vitro (dispositivo PFA-100) con concentraciones en aumento de Fc-GPVI-nt después de estimulaciones con diferentes agonistas. Por el contrario, concentraciones terapeúticamente relevantes de ReoPro prolongaron de forma máxima el tiempo de hemorragia en el dispositivo PFA-100 (Fig 12).

Ejemplo 16 Efecto de GPVI soluble sobre la adhesión de las plaquetas a colágeno inmovilizado en flujo

Se aislaron plaquetas humanas a partir de sangre completa anticoagulada con ADC como se ha descrito (18). Las plaquetas lavadas se resuspendieron en tampón Thyrodes-HEPES (2,5 mmol/l de HEPES, 150 mmol/l de NaCl, 12 mmol/l de NaHCO_{3}, 2,5 mmol/l de KCl, 1 mmol/l de MgCl_{2}, 2 mmol/l de CaCl_{2}, 5,5 mmol de D-glucosa, 1 mg/ml de BSA, pH 7,4) hasta obtener un recuento de plaquetas de 2 x 10^{8} células/ml. Se determinó la adhesión de las plaquetas a placas revestidas con colágeno inmovilizado en una cámara de flujo de placas en paralelo en presencia de 200 \mug/ml de Fc-GPVI-nt o Fc de control.

GPVI juega un papel crucial en el proceso de reclutamiento de plaquetas a colágeno inmovilizado in vitro (22). Se determinó el efecto de Fc-GPVI-nt sobre la adhesión de plaquetas humanas a colágeno inmovilizado en condiciones de rotura in vitro. Como han informado otros anteriormente (23), las plaquetas se adhirieron firmemente a colágeno inmovilizado tanto a velocidades de rotura bajas (500 sec^{-1}) como altas (1000 sec^{-1}) formando trombos (Fig. 13). Fc-GPVI-nt soluble, pero no Fc de control que carecía del dominio GPVI externo, atenuó de forma significativa la adhesión de las plaquetas sobre colágeno inmovilizado en el 37 y 44% a velocidades de rotura de 500 seg^{-1} y 1000 seg^{-1}, respectivamente (Fig. 13). La inhibición era específica ya que Fc-GPVI-nt no afectó a la adhesión de las plaquetas a vWF inmovilizado.

Ejemplo 17 La determinación de las concentraciones en el plasma de Fc-GPVI-nt

Se realizó con un sistema IMMUNO-TEK ELISA para la determinación cuantitativa de IgG humana (ZeptoMetrix Corporation; Cat Nº 0801182). Se usan anticuerpos anti-IgG humana de cabra conjugados con peroxidasas específicos contra la parte Fc o la Fc-GPVI-nt (Dianova). Después de varias etapas de lavado con PBS-T de acuerdo con las especificaciones del fabricante, se añade sustrato de peroxidasa (BM Blue POD, Roche) y se mide a la longitud de onda característica de 450 nm en un lector de ensayo ELISA (Tecan Sunrise). Se cuantifica la concentración de Fc-GPVI-nt por comparación con un patrón de IgG humano interno. Fc-GPVI-nt mostró farmacocinética favorable in vivo. Después de la inyección intraperitoneal única en ratones, los niveles en plasma fueron medibles después de 24 horas y la semivida de la proteína de fusión excedió las 96 horas (Fig 14a). La inyección intraperitoneal repetida conducía a la acumulación en la sangre de la proteína de fusión (Fig 14b) sugiriendo cinética favorable para aplicación a largo plazo para el tratamiento de enfermedades crónicas. Después de la inyección intravenosa de Fc-GPVI-nt con dosis en aumento, eran detectables concentraciones de Fc-GPVI-nt en plasma dependientes de la dosis durante 5 a 60 minutos hasta 14 horas (Fig 14 c).

Ejemplo 18 Preparación de plaquetas de ratón para microscopía de fluorescencia intravital

Se aislaron plaquetas de ratón a partir de sangre completa y se marcaron con 5-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (DCF) como se ha informado anteriormente (19). La suspensión de plaquetas marcadas con DCF se ajustó a una concentración final de 200 x 108 plaquetas/250 \mul. Se valoró la adhesión de las plaquetas antes y después de la lesión en la carótida por videomicroscopía in vivo, como se describe a continuación.

Ejemplo 19 Ligación de la carótida y valoración de la adhesión y agregación de las plaquetas por microscopía intravital

Se realizó el reclutamiento de plaquetas posterior a denudación endotelial como se ha informado anteriormente (3). En resumen, se anestesiaron ratones C57BL6/J de tipo salvaje por inyección intraperitoneal de una solución de midazolama (5 mg/kg de peso corporal, Ratiopharm, Ulm, Alemania), medetomidina (0,5 mg/kg de peso corporal, Pfizer, Karlsruhe, Alemania) y fentanilo (0,05 mg/kg de peso corporal, CuraMed Pharma GmbH, Munich, Alemania). Donde se indique, se administró de forma intravenosa Fc-GPVI-nt (1 ó 2 mg/kg de peso corporal) o Fc de control en una cantidad equimolar a 2 mg/kg de Fc-GPVI-nt. Después de eso, se indujo la denudación endotelial cerca de bifurcación de la carótida por ligación vigorosa durante 5 min. Posteriormente a la inducción de la lesión vascular, se infundieron plaquetas fluorescentes (200 x 106/250 \mul) de forma intravenosa por medio de catéteres de polietileno (Portex, Hythe, Inglaterra) implantados en la vena yugular derecha. Las plaquetas fluorescentes se visualizaron in situ por videomicroscopía in vivo de la arteria carótida común derecha usando un microscopio Zeiss Axiotech (objetivo de inmersión en agua 20 x, W 20 x/0,5, Zeiss) con una lámpara de mercurio HBO de 100 W para epi-iluminación. Todas las imágenes grabadas en vídeo se evaluaron usando un programa de análisis de imagen asistido por ordenador (Cap Image 7.4, Dr. Zeintl, Heidelberg, Alemania (19;20)). Las plaquetas atadas se definieron como todas las células que establecen contacto inicial con la pared del vaso, seguido por translocación de superficie lenta (a una velocidad inferior de forma significativa que la velocidad de la línea central) o por adhesión firme; sus números se dan como células por mm^{2} de superficie endotelial. El número de plaquetas adherentes se valoró contando las células que no se movieron o se separaron de la superficie endotelial en 10 segundos. El número de agregados de plaquetas en el sitio de la lesión vascular se cuantificó también y se presenta por mm^{2}. Además, se valoró el área de trombos total usando Cap Image 7.4.

Ejemplo 20 Microscopía electrónica de barrido

Posteriormente a la microscopía de videofluorescencia intravital, se perfundió la arteria carótida con PBS (37ºC) durante 1 min en tres animales por grupo, seguido por fijación por perfusión con glutaraldehído tamponado con fosfato (1% vol/vol). Se extirpó la arteria carótida, se abrió longitudinalmente, se fijó adicionalmente por inmersión en glutaraldehído tamponado con PBS al 1% durante 12 horas, se deshidrató en etanol y se procesó por secado de punto crítico con CO_{2}. Posteriormente, los especímenes de arteria carótida se orientaron con el lumen expuesto, se montaron con pintura de carbono, se revistieron por metalizado de bombardeo atómico con platino y se examinaron usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (JSM-6300F, Jeol Ltd., Tokyo, Japón).

Ejemplo 21 Valoración de la unión de Fc-GPVI-nt in vivo por inmunohistoquímica

Las arterias carótidas obtenidas de ratones tratados con Fc-GPVI-nt se congelaron por choque y se embebieron en criobloques (medite, Medizintechnik GmbH, Burgdorf, Alemania). Se determinó la unión de Fc-GPVI-nt al endotelio y subendotelio en secciones de criostato de 5 \mum, teñidas con fragmentos específicos de anticuerpos Fc\gamma anti-IgG humana de cabra conjugados con peroxidasa (109-035-098; Dianova, Hamburg, Alemania). Las arterias carótidas obtenidas de ratones tratados con Fc sirvieron como controles.

Ejemplo 22 Efecto de GPVI soluble sobre recuentos de plaquetas, tiempo de hemorragia y adhesión de plaquetas in vivo

Los animales se trataron con 2 mg/kg o 4 mg/kg de Fc-GPVI-nt o dosis equimolares de Fc de control que carecía del dominio GPVI externo. La inyección de Fc-GPVI-nt o Fc de control incluso a dosis más altas de 4 mg/kg no tuvo efectos significativos sobre el recuento de plaquetas periféricas. Además, la proteína de fusión Fc-GPVI-nt no indujo ninguna prolongación significativa de los tiempos de hemorragia finales comparado con los animales de control (Fig. 15a). Los tiempos de hemorragia absolutos fueron 1,9 \pm 0,9 en ratones tratados con PBS y 2,9 \pm 1,9 min y 4,6 \pm 0,6 min en ratones tratados con 2 mg/kg o 4 mg/kg de Fc-GPVI-nt. Por el contrario, los tiempos de hemorragia se prolongaron considerablemente (42,6 \pm 21,6) en animales tratados con integrilina (0,2 mg por kg IV).

Los efectos de Fc-GPVI-nt sobre el reclutamiento de plaquetas en un modelo de ratón de lesión en la carótida pueden estudiarse usando microscopía de fluorescencia intravital. Los animales se trataton con 1 mg/kg o 2 mg/kg de Fc-GPVI-nt o una cantidad equimolar de Fc de control que carecía de dominio GPVI externo como se ha descrito anteriormente. Después de la inyección de Fc-GPVI-nt o Fc de control, se indujo denudación endotelial de la arteria carótida del ratón por ligación vigorosa como se ha informado previamente (3). La ligación de la carótida causa de forma consistente pérdida completa de la capa de células endoteliales. La adhesión de las plaquetas se visualizó y se cuantificó directamente usando microscopía de fluorescencia in vivo (19;20) (Fig. 15 d). En los ratones de control (tratados con Fc), se ataron numerosas plaquetas a la pared celular en los primeros minutos después de la denudación endotelial (12.026 \pm 1.115 plaquetas atadas/mm^{2}). Las plaquetas que establecían contacto con el subendotelio mostraron inicialmente una translocación de superficie lenta, que es frecuentemente seguida por adhesión de plaquetas firme posterior y agregación de plaquetas (5.494 \pm 874 plaquetas adherentes/mm^{2} y 114 \pm 17 trombos de plaquetas/mm^{2}). Por el contrario, en presencia de Fc-GPVI-nt, el reclutamiento de plaquetas en el sitio de la lesión vascular se atenuó radicalmente. El atado de plaquetas se redujo en el 65 y 71% comparado con animales tratados con Fc posteriormente al pretratamiento con 1 mg/kg o 2 mg/kg de Fc-GPVI-nt (P < 0,05 frente al control). En paralelo, la adhesión firme de las plaquetas se redujo de una manera dependiente de la dosis (en el 49 y 65% posteriormente a la administración de 1 mg/kg o 2 mg/kg de Fc-GPVI-nt, respectivamente; P < 0,05 frente al control). Asimismo, la agregación de plaquetas adherentes estaba virtualmente ausente en animales tratados con 2 mg/kg de proteína de fusión Fc-GPVI-nt (P < 0,05 frente Fc de control, Fig. 15b-d). La microscopía electrónica de barrido demostró también claramente que la adhesión y agregación de las plaquetas posterior a la denudación endotelial de la arteria carótida común estaban virtualmente ausentes en ratones tratados con Fc-GPVI-nt, pero no en los pretratados con Fc (Fig. 15 e). Para confirmar la presencia de Fc-GPVI-nt en el sitio de la lesión, se extirparon las arterias carótidas posteriormente a la microscopía in vivo y se procesaron adicionalmente por inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-IgG humana de cabra conjugados con peroxidasa. En los ratones tratados con Fc-GPVI-nt, se detectó Fc-GPVI-nt en el aspecto luminal del sitio de lesión vascular (Fig. 15f). Todos juntos, estos datos demuestran que Fc-GPVI-nt se une específicamente a sitios de lesión vascular in vivo e impide el posterior reclutamiento de plaquetas.

Efecto de GPVI soluble sobre la aterosclerosis. Ratones apoE -/- de 4 semanas de edad (The Jackson Laboratory) consumieron una dieta de colesterol al 0,25% (dietas Harlan Research) durante 6 semanas. Después de 2 semanas, se inyectaron 4 ratones apoE -/- con 200 \mug de Fc-GPVI-nt por ratón dos veces a la semana con dieta de colesterol continua. 4 ratones apoE -/- con el protocolo similar se inyectaron con la proteína Fc de control (200 \mug) dos veces a la semana y sirvieron como ratones de control. Para la valoración de la formación de placas, los animales se sacrificaron y se diseccionó cuidadosamente el árbol vascular de los animales. Las preparaciones completas de las aortas y carótidas se lavaron abundantemente con cloruro sódico al 0,9% y se fijaron. La preparación vascular completa se tiñó con rojo SUDAN III para valorar la formación de placas y se vieron al microscopio. El tratamiento de ratones apoE -/-knockout propensos a aterosclerosis con Fc-GPVI-nt durante 4 semanas atenuó de manera significativa la ateroprogresión.
(Fig 16).

Ejemplo 23 Medidas FACS de la expresión de superficie de CD61 y CD32 en plaquetas de pacientes diabéticos

Se recogió sangre humana con citrato de 111 pacientes que padecían diabetes o de 363 pacientes no diabéticos. Se generó plasma rico en plaquetas (PRP) después de procedimientos de centrifugación y lavado (PBS 1x, pH 7,2) con 2000 rpm a 4ºC y resuspensión. Se añadieron anticuerpos anti CD61 y anti CD32 marcados con el fluoróforo peroxidasa (Immunotech) o el anticuerpo 4C9 anti-GPVI anti monoclonal marcado con FITC. La medida de FACS se realizó con un dispositivo FACScalibur Becton Dickenson. La expresión de superficie se cuantificó por fluorescencia. La correlación de la fluorescencia de CD32 y la fluorescencia de 4C9 se calculó con el coeficiente de correlación r=0,516.

Análisis estadístico. Las comparaciones entre grupos de significación se realizaron usando el análisis Mann-Whitney Rank Sum. Los datos representan la media \pm s.e.m. Un valor de P < 0,05 se consideró como significativo.

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<223> proteína de fusión

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<400> 1

1

2

3

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<210> 2

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<211> 1515

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> ADN que codifica la proteína de fusión de la SEC ID Nº: 1

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<400> 2

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4

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<210> 3

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<211> 490

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<212> PRT

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<213> artificial

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<400> 3

5

6

7

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<210> 4

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggggcgg ccgcgagtcc aaatcttgtg acaaaac

\hfill

37

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<210> 5

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggaagct ttcatttacc cggagacagg gag

\hfill

33

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<210> 6

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcggggagat ctaccaccat gtctccatcc ccgacc

\hfill

36

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<210> 7

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 7

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cgcggggcgg ccgccgttgc ccttggtgta gtac

\hfill

34

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<210> 8

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 8

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cgcggggcgg ccgcccagca cctgaactcc tg

\hfill

32

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<210> 9

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggggata tctcatttac ccggagacag ggag

\hfill

34

Claims

1. Una proteína de fusión que comprende:

a): una porción de GPVI seleccionada entre un dominio extracelular de GPVI y una variante del mismo que es funcional para la unión a colágeno; y

estando fusionados la porción de GPVI y la porción Fc por medio de un engarce, caracterizada por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg.

2. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el dominio Fc de la misma es un dominio Fc de IgG.

3. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por la secuencia de aminoácidos de la Figura 7.

4. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que el dominio extracelular de GPVI es de ser humano.

5. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el dominio Fc es de ser humano.

6. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la parte conservada funcional del dominio Fc es funcional para posibilitar que la proteína de fusión se secrete de una célula en una forma funcional para unirse a colágeno.

7. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que está glicosilada en uno o varios aminoácidos.

8. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que es una proteína de fusión homodimérica.

9. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 8, en la que los dos monómeros se unen de forma covalente.

10. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9, que está marcada con fluorescencia.

11. Una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada entre el siguiente grupo:

a): el ácido nucleico de la Figura 8 o una variante del mismo que codifica el mismo polipéptido de acuerdo con la degeneración del código genético.

b): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de homología de secuencia con el polipéptido codificado por la Figura 8, donde la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende, desde su N-terminal hasta su C-terminal, un dominio extracelular de GPVI o una variante funcional del mismo para unirse a colágeno, un engarce que tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg, y un dominio Fc o una variante conservada funcional del mismo funcional para posibilitar que una proteína codificada por el ácido nucleico se secrete de una célula en una forma funcional para unirse a colágeno; y

c): un ácido nucleico que codifica un polipéptido de al menos 300 aminoácidos que tiene, en la dirección 5' a 3', un primer segmento que codifica al menos 100 aminoácidos que comprenden un dominio extracelular de GPVI o una variante del mismo que es funcional para unirse a colágeno, un segundo segmento que codifica la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg, y un tercer segmento que codifica al menos 200 aminoácidos funcional como un dominio Fc para posibilitar que una proteína codificada por el ácido nucleico se secrete de una célula en una forma funcional para unirse a colágeno.

12. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, que se caracteriza por la secuencia de la Figura 8.

13. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11b o reivindicación 11c, en el que las bases en las posiciones correspondientes a las bases 1 a 807 de la Figura 8 codifican el dominio extracelular de GPVI.

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14. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11b o reivindicación 11c, en el que las bases en las posiciones correspondientes a las bases 817 a 1515 de la Figura 8 codifican un dominio Fc de una inmunoglubulina IgG.

15. Una proteína codificada por el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

16. Un agente anti-aterosclerótico para el tratamiento o prevención de la aterosclerosis, que comprende dos cadenas polipeptídicas codificadas por el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, teniendo cada una una región de bisagra conectada con la región de bisagra de la otra por enlaces disulfuros inter-catenarios.

17. Un vector que comprende el ácido nucleido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

18. Una célula que expresa una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9.

19. La proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 para su uso como un producto farmacéutico.

20. Una composición farmacéutica que comprende una inmunoadhesina, que es una proteína de fusión homodimérica, que comprende un dominio extracelular de GPVI o una variante del mismo que es funcional para unirse a colágeno; y un dominio Fc de una inmunoglubulina o una parte conservada funcional del mismo, estando fusionados el dominio extracelular o variante del mismo y el dominio Fc o parte conservada funcional del mismo por medio de un engarce, estando dicho engarce caracterizado por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Arg.

21. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 en la que la inmunoadhesina es un homodímero del polipéptido de la Figura 7.

22. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 o reivindicación 21, que es una preparación intravenosa.

23. Uso de una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 o de una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 en una forma dimérica, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la aterosclerosis en un paciente.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el medicamento es para la prevención de la ateroprogresión.

25. Uso de una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 o de una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 en forma homodimérica para la fabricación de un medicamento para la prevención de la trombosis intraarterial en un paciente.

26. Uso de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el paciente padece de síndrome coronario o carótido agudo y tiene lesiones intraarteriales activas.

27. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que el medicamento es para el tratamiento de complicaciones ateroscleróticas de la diabetes.

28. Uso de una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9, o de una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 en forma dimérica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del infarto de miocardio y/o apoplejía cerebral.

29. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que el medicamento es para administración oral, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa.

30. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29 en el que el medicamento está en una forma de dosificación para administrar de 0,5 a 6,0 mg/kg de la proteína de fusión.

31. Uso de una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 o de una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 en forma dimérica para la detección de inhibidores de la unión de GPVI a colágeno in vitro.

32. Uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que la proteína de fusión homodimérica esta marcada con fluorescencia.

33. Procedimiento de detección in vitro de inhibidores de la unión de la glicoproteína VI a colágeno, que comprende:

(i): proporcionar una superficie que exponga colágeno;

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(ii): poner en contacto una porción de dicha superficie con la proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 o de una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 cuando está en forma dimérica en condiciones predeterminadas que permitan la unión de dicha proteína de fusión con dicha superficie;

(iii): poner en contacto otra porción de dicha superficie con dicha proteína de fusión en presencia de un compuesto de ensayo en condiciones como en la etapa (ii);

(iv): determinar la cantidad de dicha proteína de fusión unida a dicha superficie en ausencia y en presencia de dicho compuesto de ensayo;

(v): identificar un compuesto de ensayo como inhibidor si la unión de dicha proteína de fusión a dicha superficie es menor en presencia de dicho compuesto de ensayo comparado con la ausencia del compuesto de ensayo; y

(vi): opcionalmente determinar el efecto funcional de dicho inhibidor sobre la agregación de las plaquetas y/o actuación de las plaquetas.

34. Uso de una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 o de una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 cuando está en forma dimérica para la detección in vitro de inhibidores de la adhesión de las plaquetas mediada por GPVI a lesiones intravasculares activas.

35. Procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal a partir de un mamífero no humano que comprende usar una proteína de fusión homodimérica de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 o una proteína de acuerdo con la reivindicación 15 cuando está en forma dimérica como un inmunógeno.