WO2022055073A1 - 2'-푸코실락토오스를 포함하는 뇌심혈관 질환의 개선용 식품 조성물 및 뇌심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

2'-푸코실락토오스를 포함하는 뇌심혈관 질환의 개선용 식품 조성물 및 뇌심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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cerebrovascular disease
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blood
collagen
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김경호
신철수
윤종원
전선민
송영하
전옥선
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(주)에이피테크놀로지
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving, preventing or treating cerebrovascular diseases caused by thrombus formation containing 2'-fucosyllactose, and more particularly, to various cerebrovascular diseases caused by thrombus formation, such as blood circulation disorders, It relates to a food composition containing 2'-fucosyllactose and a pharmaceutical composition containing 2'-fucosyllactose, which are effective in improving arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina, and stroke.
  • Factors involved in blood circulation can be largely divided into blood cells and blood coagulation factors. Platelet adhesion to prevent bleeding due to blood vessel damage, hemostasis due to plug formation, and abnormally excessive platelet activity in pathophysiological conditions Thrombogenesis and vascular occlusion are important pathologic factors causing vascular disease.
  • human milk oligosaccharides human milk oligosaccharides, HMO
  • HMO human milk oligosaccharides
  • HMO contains D-glucose (Glc), D-galactose (Gal), N-acetylglucosamine (GlcNAc), L-fucose (Fuc) and sialic acid [Sia; N-acetyl neuraminic acid (Neu5Ac)]. Since the structure of HMO is very diverse and complex, about 200 isomers with different residues and glycosyl bonds can exist with different polymerization degrees (DP 3-20). However, despite structural complexity, HMOs have several common structures. Most HMOs have a lactose (Gal ⁇ 1-4Glc) residue at the reducing end.
  • Gal of lactose is sialylated in the form of 3-sialyllactose or 6-sialyllactose through ⁇ -(2,3)- and ⁇ -(2,6)- bonds, respectively.
  • ⁇ -(1,2)- and ⁇ -(1,3)-bonded with 2'-fucosyllactose (2'-fucosyllactose, 2-FL) or 3-fucosyllactose (3-fucosyllactose, 3 -FL) in the form of fucosylation (fucosylation) can be.
  • the present invention intends to develop a material that can be used for improvement, prevention or treatment of cerebrovascular disease caused by thrombosis using HMO, which is derived from human milk and whose safety has been verified.
  • HMO is used to improve various cerebrovascular diseases caused by thrombus formation, such as blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina pectoris, and stroke.
  • thrombus formation such as blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina pectoris, and stroke.
  • the present invention provides a food composition for improving cerebrovascular disease caused by thrombus containing 2'-fucosyllactose (2'-FL).
  • the thrombus may preferably be caused by blood clotting by platelets.
  • the blood coagulation by platelets is preferably CRP (collagen-related peptide) or collagen (collagen), which is an agonist for platelets.
  • CRP collagen-related peptide
  • collagen collagen
  • the cerebrovascular disease is preferably one selected from blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina pectoris, and stroke.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cerebrovascular disease caused by a thrombus containing 2'-fucosyllactose (2'-FL).
  • the thrombus may preferably be caused by blood clotting by platelets.
  • the blood coagulation by platelets is preferably CRP (collagen-related peptide) or collagen (collagen), which is an agonist for platelets. It may be caused by the action of CRP (collagen-related peptide) or collagen (collagen), which is an agonist for platelets. It may be caused by the action of CRP (collagen-related peptide) or collagen (collagen), which is an agonist for platelets. It may be caused by the action of
  • the cerebrovascular disease is preferably one selected from blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina pectoris, and stroke.
  • 2'-fucosyllactose of the present invention exhibits antagonistic (inhibitory) action on CRP and collagen, which are agonists for platelets, and can be used to inhibit the formation of blood clots due to abnormal action of platelets. This was confirmed through the present invention. Therefore, when the 2'-fucosyllactose of the present invention is continuously ingested or administered, cerebrovascular diseases caused by the formation of thrombi, for example, blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina pectoris and stroke, etc. are improved You can do it.
  • 2'-fucosyllactose of the present invention exhibits an antagonistic (inhibitory) action only on CRP and collagen, which are agonists for platelets, and has no inhibitory action on thrombin used for hemostasis in emergency situations.
  • the absence of an inhibitory action on thrombin is clinically very important, because thrombin is urgently injected for hemostasis in case of bleeding due to an accident or the like. If 2'-fucosyllactose of the present invention had an inhibitory effect on thrombin in addition to CRP and collagen, hemostasis would not be possible even by administration of thrombin in the event of an accident. It can be dangerous.
  • the 2'-fucosyllactose of the present invention does not inhibit the action of thrombin, there is no problem in inducing hemostasis by thrombin administration in the event of an accident even if it is continuously administered in usual times.
  • FOS fructooligosaccharide
  • 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose used in the experiments of the present invention.
  • Figure 3 confirms the mechanism of inhibition of platelet activation of HMO.
  • the present invention provides a food composition for improving cerebrovascular disease caused by thrombus containing 2'-fucosyllactose.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cerebrovascular disease caused by thrombus containing 2'-fucosyllactose.
  • the cerebrovascular disease may be one selected from blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, hypertension, myocardial infarction, angina pectoris, and stroke.
  • the thrombus may preferably be caused by blood clotting by platelets.
  • the blood coagulation by platelets may preferably be caused by the action of CRP or collagen, which is an agonist on platelets.
  • 2'-fucosyllactose of the present invention is preferably an agonist for platelets, CRP or collagen for platelets. It may inhibit the agonist action. That is, it can be inferred that 2'-fucosyllactose of the present invention inhibits platelet activation by acting on 'the platelet aggregation signaling pathway mediated by GPVI (Glycoprotein VI; a glycoprotein receptor for collagen)'.
  • GPVI Glycoprotein VI; a glycoprotein receptor for collagen
  • the 2'-fucosyllactose preferably acts as an agonist for platelets of thrombin, which is an agonist for platelets. It may not be detrimental to That is, it can be inferred that the 2'-fucosyllactose of the present invention does not exhibit an inhibitory effect on 'platelet activation mediated by the GPCR (G-protein coupled receptor) signaling pathway'.
  • GPCR G-protein coupled receptor
  • Blood of a healthy person does not coagulate in blood vessels, but due to causes such as damage to blood vessels, blood stagnation, and increased coagulability, a blood clot, or thrombus, occurs at the site of occurrence.
  • Platelets one of the blood cells, are involved in the formation of blood clots, and platelets are cell fragments with a diameter of 2-3 ⁇ m that are separated from large cells in the bone marrow and play an important role in blood clotting.
  • the blood clotting action as described above is essential for survival, but if excessive thrombus is formed due to thrombus formation or bleeding caused by other causes than bleeding, it narrows or blocks the blood flow in that part. interfere with or stop Such abnormal thrombus formation acts as a factor that interferes with blood flow, that is, blood circulation, and can cause various cerebrovascular diseases such as blood circulation disorders, arteriosclerosis, thrombosis, high blood pressure, myocardial infarction, angina pectoris, and stroke.
  • Blood clotting by platelets is induced by an agonist.
  • agonists for platelets include CRP, collagen, thrombin, and thromboxane A2 analogue (U46619).
  • CRP and collagen play an important role in platelet aggregation in the GPVI-mediated platelet aggregation signaling pathway.
  • thrombin, a thromboxane A2 analogue plays an important role in platelet aggregation mediated by the GPCR signaling pathway.
  • the 2'-fucosyllactose of the present invention showed a concentration-dependent inhibitory effect on carotid artery thrombosis, which was comparable to aspirin, a conventional thrombosis treatment. Efficacy was confirmed. In addition, it was confirmed that it did not affect the hemostatic effect, which is a side effect of the existing synthetic drugs, and through this, it was confirmed that it has an effect that can replace the side effect of aspirin, which is an existing thrombosis treatment. Therefore, it was also confirmed that this 2'-fucosyllactose can be used in vivo as a health functional food or therapeutic material for improving blood circulation.
  • the food composition of the present invention is not particularly limited by its dosage form, and for example, meat, grains, caffeinated drinks, general drinks, chocolate, breads, snacks, confectionery, pizza, jelly, noodles, gums, ice creams, alcoholic beverages , alcohol, vitamin complexes, and other health supplements such as pills, tablets, and granules may be any one selected.
  • 2'-Fucault room lactose may be added in a ratio of 0.01 to 99 wt% in food, and for example, the concentration of 2'-Fucault room lactose contained in the health supplement composition is 1,600 mg. It may preferably contain 100 to 1,000 mg, and it is recommended to consume it once a day for a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically usable carrier, diluent or excipient in addition to 2'-fucosyllactose.
  • Usable carriers, excipients or diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, There are microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and one or more of these may be used.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers or preservatives may be additionally included.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a desired form according to the method of use, and in particular, a method known in the art is adopted to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. It is better to formulate it.
  • Examples of specific formulations include warning agents (PLASTERS), granules (GRANULES), lotions (LOTIONS), LINIMENTS (LINIMENTS), LIMONADES (LEMONADES), perfumes (AROMATIC WATERS), powders (POWDERS), syrups ( SYRUPS), OPHTALMIC OINTMENTS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, ointment (OINTMENTS), fluid extract (FLUIDEXTRACTS), emulsion (EMULSIONS) ), suspensions (SUSPENSIONS), premises (DECOCTIONS), infusions (INFUSIONS), eye drops (OPHTHALMIC SOLUTIONS), tablets (TABLETS), suppositories (SUPPOSITORIES), injections (INJECTIONS), alcohol tablets (SPIRITS), cataplasmas (CATAPLAS) ), capsules (CAPSULES), creams (CREAMS), troches (TROCHES), tinct
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably determined in consideration of the administration method, the age, sex and weight of the user, and the severity of the disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered once, preferably at 24-40 mg/kg (body weight) per day based on 2'-fucosyllactose.
  • the above dosage is only an example for illustration, and may be changed by a doctor's prescription according to the state of the user.
  • thrombin Human thrombin, thromboxane A2 analogue (U46619), PGE1, and all reagents were purchased from Sigma (St. Louis, MO). D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl ketone (PPACK) was purchased from EMD Millipore (Billerica, Mass.). Equine tendon collagen (type I) was obtained from Chrono-log (Havertown, PA), and Collagen-related peptide (CRP) was obtained from Dr. It was purchased from Richard Farndale (Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK) and used in this experiment.
  • PPACK D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl ketone
  • Equine tendon collagen type I
  • CPP Collagen-related peptide
  • PE-conjugated isotype control IgGs PE anti-mouse CD62P (P-selectin) antibody, and PE anti-mouse ⁇ IIb ⁇ 3 (JON/A) antibodies were purchased from Biolegend (San Diego, CA). 2'-Fucault room lactose and 3-fucosyl lactose were used as materials produced by AP Technology.
  • mice were collected from the abdominal vein of the mouse using a syringe pretreated with citrate-dextrose solution (ACD, sigma). After centrifugation at 300 ⁇ g for 20 minutes at room temperature to obtain platelet-rich plasma (PRP), 0.5 ⁇ M PGE1 was added to the plasma separated from red blood cells and re-centrifuged at 700 ⁇ g for 4 minutes. separated.
  • ACD citrate-dextrose solution
  • the precipitated platelets were washed with HEPES-Tyrode buffer (5 mM HEPES/NaOH, pH 7.3, 5 mM glucose, 136 mM NaCl, 12 mM NaHCO 3 , 2.7 mM KCl) containing 10% ACD, followed by 700 for 5 min. Re-centrifugation at ⁇ g. The precipitated platelets were adjusted to a concentration of 3 ⁇ 10 8 cells/mL in HEPES-Tyrode buffer, and used in this experiment.
  • HEPES-Tyrode buffer 5 mM HEPES/NaOH, pH 7.3, 5 mM glucose, 136 mM NaCl, 12 mM NaHCO 3 , 2.7 mM KCl
  • Mouse platelets immersed in HEPES-Tyrode buffer at a concentration of 3 ⁇ 10 8 cells/mL were treated with Vehicle (distilled water), 1,000 ⁇ M of FOS, 3-fucosyllactose, and various concentrations (300 ⁇ 1,000 ⁇ M) at 37°C for 15 minutes. ), after pretreatment with 2'-fucosyllactose, it was activated with CRP, collagen, thrombin, and thromboxane A2 analogues in the platelet aggregation system. Platelet aggregation was measured by inducing platelet aggregation at a rate of 1,000 rpm in a platelet aggregation meter (Chronolog Corp, Havertown, PA) at 37°C.
  • 'light transmission' on the horizontal axis is a measure showing that platelet aggregation occurred a lot due to increased light transmission. Platelets originally floated in floating cells and were activated by platelet agonists, resulting in changes in platelet shape and aggregation. This principle is used to increase the transmittance of light.
  • 'time (sec)' on the horizontal axis means that the complete aggregation of platelets usually takes about 300 seconds (sec), and thus the degree of platelet aggregation is measured during that time.
  • platelets pretreated with 2'-fucosyllactose in HMO compared to platelets pretreated with distilled water of a control (vehicle) CRP (0.15 ⁇ g/ml) and collagen among platelet agonists (0.5 ⁇ g/ml) (FIG. 2A) and FIG. 2B)) was found to significantly inhibit platelet aggregation in a concentration-dependent manner. It was confirmed that platelets pretreated with FOS and 3-fucosyllactose did not significantly inhibit platelet aggregation by CRP and collagen.
  • Platelets were pretreated with Vehicle (distilled water) or FOS, 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose at 37°C for 15 minutes, and after activation at 37°C with 0.15 ⁇ g/ml CRP for 5 minutes, P-selectin and Platelet activity was measured using ⁇ IIb ⁇ 3 antibodies.
  • the cytotoxicity of HMO was evaluated by CCK assay (Oh, YC; Jeong, YH; Pak, ME; Go, Y., Banhasasim-Tang Attenuates Lipopolysaccharide-Induced Cognitive Impairment by Suppressing Neuroinflammation in Mice. Nutrients 2020, 12, ( 7)). Since a protocol for measuring cytotoxicity to platelets has not been established, HepG2 cells were pretreated with HMO (2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose) in a concentration-dependent manner. After 24 hours, the cell counting kit solution (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) was treated in each well, incubated for 1 hour, and then absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using a microplate reader.
  • CCK assay Oh, YC; Jeong, YH; Pak, ME; Go, Y., Banhasasim-Tang Attenuates Lipopolysacc
  • Example 2 Blood circulation improvement-related platelet activity by HMO ( in vivo ) Efficacy Check
  • the purpose of this study was to evaluate the blood circulation improvement efficacy of HMO in an animal model of carotid artery ligation thrombus, and to confirm the platelet aggregation and activation efficacy after oral administration (ex vivo).
  • mice used in the experiment were purchased from Dooyeol Biotech Co., Ltd., and were used for the experiment after an acclimatization period at 23 ⁇ 1°C and 56% relative humidity under general feed for 1 week. did In the following, animal experiments were conducted according to the protocol of the animal experiment protocol approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of the Korea Institute of Oriental Medicine (approval number: 20-058).
  • FeCl 3 (10%) was used to create a thrombosis-induced mouse model.
  • Mice were orally administered with 2'-fucosyllactose (500, 1,000 mg/kg BW), 3-fucosyllactose (1,000 mg/kg BW) or ASA (100 mg/kg BW) for 7 days, and 2 hours after the last administration
  • 2'-fucosyllactose 500, 1,000 mg/kg BW
  • 3-fucosyllactose 1,000 mg/kg BW
  • ASA 100 mg/kg BW
  • a tail bleeding time assay was performed to measure hemostasis caused by thrombosis.
  • Mice were orally administered with 2'-fucosyllactose (500, 1,000 mg/kg BW), 3-fucosyllactose (1,000 mg/kg BW) or ASA (100 mg/kg BW) once a day for 7 days
  • Mice were anesthetized with 2% isoflurane 2 hours after the last administration. Then, using a razor blade, 5 mm of the tail of the mouse was cut, and the tail was placed in a 50 mL conical tube containing 45 mL of PBS and fixed, and then the bleeding time and amount of bleeding were measured.
  • the specific process and photos are shown in FIG. 6(A).
  • the amount of blood flow loss was quantified by measuring the blood hemoglobin content collected with 45 mL of PBS. At this time, the body temperature was maintained at 37°C using a heating pad.
  • platelets When blood vessels are damaged, platelets are activated and aggregate at the damaged site to stop bleeding at the site of blood vessel damage, but at the pathological/pathophysiological stage, thrombus occurs, and platelet activity plays the most important role.
  • the average carotid artery occlusion time occurred in 7.47 minutes in the control group (vehicle) as shown in FIG. 5, and in the low concentration (500 mg/kg BW) 2'-fucosyllactose administration group, the average The carotid artery occlusion time was significantly increased with an average of 14.52 minutes in the 11.79 minutes and high concentration (1,000 mg/kg BW) 2'-fucosyllactose administration group.
  • the carotid artery occlusion time was 8.18 minutes in mice orally administered with high concentration (1,000 mg/kg BW) of 3-fucosyllactose, which was not significantly different from the control group.
  • the carotid artery occlusion time in the high-concentration (1,000 mg/kg BW) 2'-fucosyllactose administration group was almost equal to 18.05 minutes in the Aspirin (100 mg/kg BW)-treated group, which is a positive control (indicated by ASA). has been shown to prolong carotid artery occlusion time.

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Abstract

본 발명은 혈전의 생성으로 말미암은 여러 뇌심혈관 질환에 개선, 예방 또는 치료에 효과가 있는 2'-푸코실락토오스 함유 식품 조성물 및 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose, 2'-FL)는 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP (collagen-related peptide), 콜라겐에 대해서 길항 (저해) 작용을 나타내어, 혈소판의 비정상적 작용에 의한 혈전의 생성을 억제하는데 사용될 수 있다.

Description

2'-푸코실락토오스를 포함하는 뇌심혈관 질환의 개선용 식품 조성물 및 뇌심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 2'-푸코실락토오스를 포함하는 혈전 생성으로 말미암은 뇌심혈관 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 혈전의 생성으로 말미암은 여러 뇌심혈관 질환, 예로서 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 등의 개선에 효과가 있는 2'-푸코실락토오스 함유 식품 조성물 및 2'-푸코실락토오스 함유 약학 조성물에 관한 것이다.
식생활 및 생활양식의 서구화, 그리고 노인 인구의 증가로 인해 혈행장애가 원인이 되는 뇌심혈관계질환 발병이 크게 증가하고 있으며, 2018년 사망원인 통계자료에 의하면 10대 사망원인 중 심장질환, 뇌혈관질환, 고혈압성 질환이 각각 2위, 4위, 10위를 차지할 정도로 심각한 사회문제가 되고 있다.
혈행에 관여하는 인자는 크게 혈구세포와 혈액응고인자로 나뉠 수 있는데, 혈관 손상에 따른 출혈을 방지하기 위한 혈소판의 유착, 플러그 형성에 따른 지혈 작용, 그리고 병태 생리적 상태에서 비정상적으로 과도한 혈소판 활성에 따른 혈전 생성 및 혈관 폐색은 혈관 질환을 일으키는 중요 병증 요인이다.
따라서, 혈전을 제거하거나 혈전의 생성을 억제할 수 있는 식품의 지속적 섭취 또는 약품의 투여가 필요한데, 기존의 혈행개선과 관련된 의약품들은 위장 장애, 혈압 상승 등의 부작용을 가지고 있어 복용에 어려움이 있어 왔다. 이에 부작용이 적어 인체에 안전하면서도, 혈전의 생성을 억제하여 혈행장애를 근본적으로 개선할 수 있는 제품의 개발이 필요하다.
한편, 사람의 모유에는 200여 종 이상의 독특한 구조를 가지는 올리고당 (human milk oligosaccharides, HMO)이 다른 포유류의 젖에 비해 상당히 높은 농도 (5∼15 g/L)로 존재한다. HMO는 장내 유산균의 생육을 돕는 프리바이오틱 (prebiotic) 효과, 병원균 감염 예방, 면역시스템 조절 및 두뇌 발달과 같이 유아의 성장과 두뇌 발달 및 건강에 긍정적 영향을 미치는 등 다양한 생물학적 활성을 제공하는 것으로 보고되어 있다.
HMO는 D-글루코오스 (Glc), D-갈락토오스 (Gal), N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc), L-푸코오스 (L-fucose, Fuc)와 시알산 (sialic acid) [Sia; N-acetyl neuraminic acid (Neu5Ac)]으로 구성되어 있다. HMO의 구조는 매우 다양하고 복잡하기 때문에, 다른 잔기와 글리코실 결합을 가지는 200개 정도의 이성질체가 서로 다른 중합도(DP 3-20)로 존재할 수 있다. 다만, 구조적 복잡성에도 불구하고, HMO는 몇 가지 공통적인 구조를 가진다. 대부분의 HMO는 환원 말단에 락토오스 (Galβ1-4Glc) 잔기를 가진다. 락토오스의 Gal은 α-(2,3)-과 α-(2,6)-결합으로 각각 3-시알릴락토오스 (3-sialyllactose) 또는 6-시알릴락토오스 (6-sialyllactose)의 형태로 시알화되거나, α-(1,2)-과 α-(1,3)-결합으로 각각 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose, 2-FL) 또는 3-푸코실락토오스 (3-fucosyllactose, 3-FL)의 형태로 푸코실화 (fucosylation) 될 수 있다.
약 200개의 다른 복합 올리고당이 모유에서 발견되었는데, 함량이 가장 많은 올리고당 3가지를 포함하여 137개가 푸코실화되어 그 비율은 거의 77%이고, 남은 올리고당은 대부분은 시알화된 것 (39개)으로 약 28%에 해당한다. 이중, 특히 2'-푸코실락토오스와 3-푸코실락토오스는 앞서 언급한 다양한 생물학적 활성에 관여하는 주요 HMO인 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서는 인간의 모유에서 유래한 것으로 안전성이 검증된 HMO를 이용하여, 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있는 소재를 개발하고자 한다.
본 발명에서는 HMO를 이용하여 혈전의 생성으로 말미암은 여러 뇌심혈관 질환, 예로서 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중의 개선에 효과가 있는 식품 조성물 및 예방 또는 치료에 효과가 있는 약학 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 혈전은, 바람직하게 혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 혈소판에 의한 혈액 응고는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트 (agonist; 작용자)인 CRP (collagen-related peptide) 또는 콜라겐 (collagen)의 작용에 의해 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 뇌심혈관 질환은, 바람직하게 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 혈전은, 바람직하게 혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 혈소판에 의한 혈액 응고는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트 (agonist; 작용자)인 CRP (collagen-related peptide) 또는 콜라겐 (collagen)의 작용에 의해 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 뇌심혈관 질환은, 바람직하게 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 2'-푸코실락토오스는 혈소판에 대한 아고니스트 (agonist; 작용자)인 CRP, 콜라겐에 대해서 길항 (저해) 작용을 나타내어, 혈소판의 비정상적 작용에 의한 혈전의 생성을 억제하는데 사용될 수 있음이 본 발명을 통해 확인되었다. 따라서, 본 발명의 2'-푸코실락토오스를 꾸준히 섭취 또는 투여할 경우, 혈전의 생성으로 말미암은 뇌심혈관 질환, 일 예로서 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 등을 개선할 수 있을 것이다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP, 콜라겐에 대해서만 길항 (저해) 작용을 나타내고, 긴급한 상황에서 지혈을 위해 사용되는 트롬빈에 대해서는 저해 작용이 없는 것으로 확인되었다. 트롬빈에 대해 저해 작용이 없는 것은 임상적으로 대단히 중요한 의미를 갖는데, 사고 등에 의해 출혈이 발생한 경우 지혈을 위해 트롬빈을 긴급하게 투입하기 때문이다. 본 발명의 2'-푸코실락토오스가 CRP, 콜라겐 외에 트롬빈에 대해서도 저해 효과가 있었다면, 사고 발생 시 트롬빈의 투여에 의해서도 지혈이 이루어질 수 없을 것인데, 그렇다면 2'-푸코실락토오스를 지속적으로 투여하는 것은 위험할 수 있다. 하지만, 놀랍게도 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 트롬빈의 작용은 저해하지 않기 때문에, 평상시에 지속적으로 투여되더라도 사고의 발생 시 트롬빈 투여에 의한 지혈의 유도에는 아무런 문제가 없는 것이다.
도 1은 본 발명의 실험에서 사용한 fructooligosaccharide (FOS)와 2'-푸코실락토오스 및 3-푸코실락토오스의 구조를 보여준다.
도 2는 HMO의 혈소판 응집력 억제 효과를 보여준다.
도 3은 HMO의 혈소판 활성화 억제 기전을 확인시켜 준다.
도 4는 HMO의 세포독성을 CCK assay로 측정한 결과이다.
도 5는 동물모델에서의 HMO의 혈전증 억제 효능을 확인한 결과이다.
도 6은 동물모델에서의 HMO의 지혈 작용 효능을 확인한 결과이다.
본 발명은 2'-푸코실락토오스를 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 2'-푸코실락토오스를 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 뇌심혈관 질환은, 바람직하게 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 혈전은, 바람직하게 혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것일 수 있다. 이때, 상기 혈소판에 의한 혈액 응고는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP 또는 콜라겐의 작용에 의해 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP 또는 콜라겐의 혈소판에 대한 아고니스트 작용을 저해하는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 'GPVI (Glycoprotein VI; a glycoprotein receptor for collagen)를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로'에 작용하여 혈소판의 활성화를 억제하는 것으로 추론할 수 있다.
상기 본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물 및 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 2'-푸코실락토오스는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트인 트롬빈의 혈소판에 대한 아고니스트 작용에 대해서는 저해하지 않는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 'GPCR (G-protein coupled receptor) 신호전달 경로를 매개로 한 혈소판 활성화'에 대해서는 억제 효과를 나타내지 않는 것으로 추론할 수 있다.
건강한 사람의 혈액은 혈관 속에서 응고하는 일이 없지만, 혈관의 손상, 혈액의 정체(停滯), 응고성이 높아진 경우 등의 원인에 의해 그 발생 국소에서는 피가 굳어진 덩어리 즉 '혈전'이 생긴다.
혈전의 생성에는 혈구 중 하나인 혈소판이 관여하는데, 혈소판은 골수 내에 있던 큰 세포로부터 세포질이 갈라져 나온 지름 2∼3 ㎛의 세포 조각으로 혈액의 응고에 중요한 역할을 한다.
출혈의 억제라는 정상적인 과정에서 상기와 같은 혈액 응고작용은 생존에 필수적이나, 출혈 외의 다른 원인에 의한 혈전 생성 또는 출혈에 의한 정상적인 과정이라 하더라도 과다한 혈전이 생기면 그 부분의 혈관을 좁히거나 또는 막아 피의 흐름을 방해하거나 멈추게 한다. 이와 같은 비정상적 혈전의 생성은 피의 흐름 즉 혈행을 방해하는 요소로 작용하여, 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 등의 다양한 뇌심혈관 질환을 유발할 수 있다.
혈소판에 의한 혈액 응고는 아고니스트에 의해 유도되는데, 혈소판에 대한 아고니스트로는 CRP, 콜라겐, 트롬빈 (thrombin), 트롬복산 A2 유사체 (thromboxane A2 analogue, U46619) 등이 있다. CRP, 콜라겐은 GPVI를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로에서 혈소판 응집에 중요한 역할을 수행한다. 또한, 트롬빈, 트롬복산 A2 유사체는 GPCR 신호전달 경로를 매개로 한 혈소판 응집에 중요한 역할을 수행한다.
하기 본 발명의 실험에서는 상기 4종의 아고니스트를 대상으로 하여 HMO인 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스와 양성대조물질로서 FOS의 길항 (저해) 작용 여부를 확인하여 보았다. 그런데, 특이하게도 2'-푸코실락토오스만이 4종의 아고니스트 중 CRP, 콜라겐에 대해서만 길항 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다. 2'-푸코실락토오스와 매우 유사한 구조를 갖는 3-푸코실락토오스는 길항 효과가 나타나지 않았다. 또한, 2'-푸코실락토오스는 아고니스트들 중에서도 CRP, 콜라겐에 대해서만 길항 작용이 확인되었고, 트롬빈에 대해서는 길항 작용이 없는 것으로 확인되었다.
트롬빈에 대해 저해 작용이 없는 것은 임상적으로 대단히 중요한 의미를 갖는데, 사고 등에 의해 출혈이 발생한 경우 지혈을 위해 트롬빈을 긴급하게 투입하기 때문이다. 본 발명의 2'-푸코실락토오스가 CRP, 콜라겐 외에 트롬빈에 대해서도 저해 효과가 있었다면, 사고 발생 시 트롬빈의 투여에 의해서도 지혈이 이루어질 수 없을 것인데, 그렇다면 일상생활에서 2'-푸코실락토오스를 지속적으로 섭취하는 것은 대단히 위험한 것일 수 있다. 하지만, 놀랍게도 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 트롬빈의 작용은 저해하지 않기 때문에, 평상시에 꾸준히 섭취하더라도 사고의 발생 시 트롬빈 투여에 의한 지혈의 유도에는 아무런 문제가 없는 것이다.
또한, 동물 모델에서 경동맥 혈전증 억제 및 지혈 작용에 관련한 실험을 수행하였을 때, 본 발명의 2'-푸코실락토오스가 농도의존적으로 경동맥 혈전증 억제효과를 보였으며, 이는 기존 혈전치료제인 아스피린과도 견줄만한 효능임을 확인하였다. 또한, 기존 합성의약품의 부작용인 지혈작용에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였고, 이를 통해 기존 혈전치료제인 아스피린의 부작용을 대체할만한 효능을 지닌 것을 확인하였다. 따라서 이러한 2'-푸코실락토오스는 혈행개선 건강기능식품이나 치료소재로써 생체내 이용이 가능함도 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은 그 제형으로 특별히 한정되는 것은 아니고, 일 예로 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 환, 정, 과립 등의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
2'-푸코실락토오스는 식품 중 0.01~99 중량%의 비율로 첨가되어 조성될 수 있는데, 일 예로, 건강보조식품 조성물에 함유되는 2'-푸코실락토오스의 농도는 1,600 mg으로 제조되는 정 기준으로 바람직하게 100∼1,000 mg 함유될 수 있으며, 1일 1회 장기간 섭취하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 2'-푸코실락토오스 이외에 약제학적으로 사용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명 약학 조성물의 제형은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제조될 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제 (PLASTERS), 과립제 (GRANULES), 로션제 (LOTIONS), 리니멘트제 (LINIMENTS), 리모나데제 (LEMONADES), 방향수제 (AROMATIC WATERS), 산제 (POWDERS), 시럽제 (SYRUPS), 안연고제 (OPHTALMIC OINTMENTS), 액제 (LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제 (AEROSOLS), 엑스제 (EXTRACTS), 엘릭실제 (ELIXIRS), 연고제 (OINTMENTS), 유동엑스제 (FLUIDEXTRACTS), 유제 (EMULSIONS), 현탁제 (SUSPENSIONS), 전제 (DECOCTIONS), 침제 (INFUSIONS), 점안제 (OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제 (TABLETS), 좌제 (SUPPOSITORIES), 주사제 (INJECTIONS), 주정제 (SPIRITS), 카타플라스마제 (CATAPLASMA), 캅셀제 (CAPSULES), 크림제 (CREAMS), 트로키제 (TROCHES), 틴크제 (TINCTURES), 파스타제 (PASTES), 환제 (PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 약학 조성물은 2'-푸코실락토오스를 기준으로 하였을 때 바람직하게 1일 24∼40 mg/kg(체중)으로 1회 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일례에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1 : HMO에 의한 선택적 혈소판 응집 억제 효과 확인]
(1) 실험 목적
HMO를 활용하여 혈행개선 전략소재로의 가능성을 타진하고자 하였다. 이를 위해 본 실험에서는 HMO 중 2'-푸코실락토오스 및 3-푸코실락토오스와 양성대조물질로서 FOS를 이용하여, 혈소판 활성 억제 기작 및 나아가 혈소판 작용으로 말미암은 혈행장애 개선에 대한 효능을 확인하고자 하였다.
(2) 실험 재료 및 방법
① 재료
Human thrombin, thromboxane A2 analogue (U46619), PGE1, 그리고 모든 시약은 시그마 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl ketone (PPACK)은 EMD Millipore (Billerica, MA)로부터 구입하였다. Equine tendon collagen (type I)은 Chrono-log (Havertown, PA)에서, Collagen-related peptide (CRP)는 Dr. Richard Farndale (Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK)에서 구입하여 본 실험에 사용하였다. Phycoerythrin (PE)-conjugated isotype control IgGs, PE anti-mouse CD62P (P-selectin) antibody, and PE anti-mouse αIIbβ3 (JON/A) antibody들은 Biolegend (San Diego, CA)로부터 구입하였다. 2'-푸코실락토오스 및 3-푸코실락토오스는 (주)에이피테크놀로지에서 생산한 소재를 사용하였다.
② 혈소판 분리 방법
마우스 (6-8주령)의 혈소판은 구연산염-덱스트로스 용액 (ACD, sigma)이 전 처리된 주사기를 이용하여 마우스의 복부정맥에서 채혈하였다. 혈소판이 풍부한 혈장 (platelet-rich plasma, PRP)을 얻기 위해 실온에서 20분 동안 300×g로 원심분리한 후, 적혈구에서 분리된 혈장에 0.5 μM PGE1을 첨가하여 4분 동안 700×g에서 재원심분리하였다. 침전된 혈소판을 10% ACD를 함유한 HEPES-Tyrode 완충액 (5 mM HEPES / NaOH, pH 7.3, 5 mM 포도당, 136 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl)으로 세척한 후, 5분 동안 700×g에서 재원심분리하였다. 침천된 혈소판은 HEPES-Tyrode 버퍼에서 3×108 cells/mL의 농도로 조정되었으며, 본 실험에 사용하였다.
③ 혈소판 응집 분석방법
3×108 cells/mL의 농도로 HEPES-Tyrode 버퍼에 담겨진 마우스 혈소판을 37℃에서 15분 동안 Vehicle (distilled water), 1,000 μM의 FOS, 3-푸코실락토오스, 그리고 다양한 농도 (300∼1,000 μM)의 2'-푸코실락토오스로 전처리한 후, 혈소판 응집계에서 CRP, 콜라겐, 트롬빈, 트롬복산 A2 유사체로 활성화시켰다. 혈소판 응집은 37℃의 혈소판 응집계 (Chronolog Corp, Havertown, PA)에서 1,000 rpm 속도로 혈소판 응집을 유도하여 측정하였다.
④ Flow cytometry 분석
혈소판 활성의 biomarker로 알려진 혈소판 P-selectin 및 αIIbβ3의 활성도는 flow cytometry (Gallios, Beckman Coulter)를 이용하여 측정하였다. 마우스 혈소판은 37℃에서 15분 동안 Vehicle (distilled water), 1,000 μM의 FOS, 3-푸코실락토오스, 그리고 다양한 농도 (300∼1,000 μM)의 2'-푸코실락토오스로 전처리되었으며, 혈소판 활성을 위해 마우스 혈소판은 37℃에서 5분 동안 0.15 μg/ml CRP로 처리한 후 P-selectin 및 αIIbβ3 antibodies를 이용하여 활성도를 측정하였다.
⑤ 통계 처리
통계분석은 GraphPad Prism 5를 이용하여 자료 분석을 실시하였다. 통계적 유의성은 다중집단의 ANOVA와 Dunnett's test for comparisons of multiple group, Student's t-test for comparisons of two groups로 분석하였다. 0.05보다 낮은 P 값은 유의미한 결과로 간주하였다.
(3) 실험 결과
① HMO에 의한 혈소판 응집 억제 효능 확인
HMO가 혈소판 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 혈소판 응집력에 대한 효능을 조사하였다.
그 결과는 도 2와 같이 나타났다. 도 2의 그래프에서 가로축의 'light transmission'는 빛 투과가 증가되어 혈소판 응집이 많이 일어났다는 것을 보여주는 척도인데, 원래 혈소판은 floating cell로 떠다니다가 혈소판 아고니스트에 의해 활성화되면서 혈소판 형태가 변화 및 응집이 일어나 빛의 투과도가 증가하는데 이 원리를 이용한 것이다. 도 2의 그래프에서 가로축의 'time (sec)'은, 보통 혈소판의 완전한 응집이 300초 (sec) 정도 걸리므로, 그 시간 동안 혈소판의 응집 정도를 측정한 것을 의미한다.
본 실험 결과에서는 HMO 중 2'-푸코실락토오스에 의해 전처리된 혈소판이 대조군 (vehicle)의 증류수 (distilled water)에 의해 전처리된 혈소판과 비교하여, 혈소판 아고니스트 중 CRP (0.15 μg/ml)와 콜라겐 (0.5 μg/ml) (도 2의 A) 와 도 2의 B))에 의해 유도된 혈소판 응집에서 농도의존적으로 유의하게 혈소판 응집력을 저해하는 것으로 확인되었다. FOS와 3-푸코실락토오스에 의해 전처리된 혈소판에서는 CRP와 콜라겐에 의한 혈소판 응집을 유의적으로 억제하지 못함을 확인하였다. 또한, 2'-FL에 의해 전처리된 혈소판에서 트롬빈 (0.025 U/ml)과 트롬복산 A2 유사체 (3 μM) (도 2의 C)와 도 2의 D))에 의해 유도된 혈소판 응집력 억제 효능은 대조군 대비 유의적 차이를 관찰할 수 없었다. 즉, 트롬빈과 트롬복산 A2 유사체에 의해 유도된 혈소판 응집력에 대해서는 2'-푸코실락토오스가 억제 효능을 보이지 않는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 HMO 중 2'-푸코실락토오스만이 GPVI를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로에서 선택적인 혈소판 응집에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 반면, 2'-푸코실락토오스는 ‘GPCR 신호전달 경로를 통해 혈소판응집반응을 활성화시키는 트롬빈과 트롬복산 A2 유사체에 대한 억제효능은 없는 것으로 추론할 수 있었다.
② HMO에 의한 혈소판 활성화 억제 기작 확인
HMO에 의한 혈소판 활성화 억제 기작을 확인하고자 하였다. 혈소판 활성화에서 positive feedback cycle을 유도하는 주요 과정 중 혈소판 활성 biomarker로 쓰이는 혈소판의 α-granule의 P-selectin 및 αIIbβ3 integrin 활성화 조절 기작에 대한 HMO의 효능을 flow cytometry analysis를 이용하여 분석하였다.
앞선 혈소판 응집력 억제 실험에서 HMO 중 2'-푸코실락토오스만이 GPVI를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로에서 선택적으로 혈소판 응집에 중요한 역할을 함이 확인되었기 때문에, 본 혈소판 활성화 실험에서는 CRP만을 이용하여 활성화 효능 억제 실험을 진행하였다.
혈소판은 37℃에서 15분 동안 Vehicle (distilled water) 또는 FOS, 2'-푸코실락토오스 및 3-푸코실락토오스로 전처리하고 0.15 μg/ml CRP로 37℃에서 5분 동안 활성화시킨 후 P-selectin 및 αIIbβ3 antibodies를 이용하여 혈소판 활성도를 측정하였다.
그 결과는 도 3과 같이 나타났다. 혈소판 활성화가 일어나면 혈소판 활성 시그널로 인해 α-granule에 있던 P-selectin이 혈소판 세포 밖으로 표출되면서 혈소판 활성을 더 견고하게 일으키고, 혈소판-혈소판 응집에 중요한 αIIbβ3의 활성 증가는 αIIbβ3과 fibrinogen에 대한 결합이 증가되어 혈소판-혈소판 응집이 더 많이 일어나게 된다. 따라서 혈소판 활성의 척도로 P-selectin exposure level과 aIIbβ3 activation level을 flow cytometry를 이용하여 측정하는데, 그래프에서 피크가 왼쪽으로 이동할수록 혈소판 활성에 따른 P-selectin exposure level과 aIIbβ3 activation level이 줄어들었음을 의미하며, 2'-푸코실락토오스가 농도의존적으로 혈소판 활성을 억제하는 효능이 있음을 의미하게 된다.
대조군 (vehicle)과 비교하여 HMO 중 2'-푸코실락토오스만이 전처리된 혈소판에서 농도의존적으로 마우스 혈소판 α-granule의 P-selectin (도 3의 A)) 및 혈소판 αIIbβ3 integrin (도 3의 B)) 활성화를 현저히 억제하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 2'-푸코실락토오스가 과립분비와 αIIbβ3 integrin 활성화 억제를 통해 혈소판 활성화를 선택적으로 억제한다는 것을 시사한다.
[실험예 1: HMO의 세포독성 테스트]
본 실험예에서는 HMO의 세포독성을 CCK assay (Oh, Y. C.; Jeong, Y. H.; Pak, M. E.; Go, Y., Banhasasim-Tang Attenuates Lipopolysaccharide-Induced Cognitive Impairment by Suppressing Neuroinflammation in Mice. Nutrients 2020, 12, (7))에 의해 측정하고자 하였다. 혈소판에 대한 세포 독성을 측정할 수 있는 프로토콜이 확립되어 있지 않아, HepG2 세포에 HMO (2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스)을 농도의존적으로 전처리하였다. 24시간 후에 Cell counting kit solution (Dojindo Molecular Technologies, Inc.)을 각 well에 처리하여 1시간 추가 배양한 다음 Microplate reader를 사용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
HMO를 HepG2 세포에 전처리하여 cell viability를 측정한 결과, 도 4에서 보듯이 HMO (2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스)의 처리에 따른 HepG2의 세포 사멸은 확인되지 않았고, 이로부터 HMO는 세포 독성이 없는 것으로 결론내릴 수 있었다.
[실시예 2: HMO에 의한 혈행개선 관련 혈소판 활성( in vivo ) 효능 확인]
(1) 실험 목적
경동맥 결찰 혈전 동물모델에서 HMO의 혈행개선 효능을 평가하고자 하였고, 이를 경구투여한 후 (ex vivo) 혈소판의 응집 및 활성 효능을 확인하고자 하였다
(2) 실험동물준비 및 실험방법
① 실험동물 준비
실험에 사용된 수컷 C57BL/6 (6∼8주령) 마우스는 (주)두열바이오텍에서 구매하였으며, 1주일간 일반사료 급여 하에 23±1℃와 56% 상대습도 조건에서 순응 기간을 거친 후 실험에 이용하였다. 하기에서 동물실험은 한국한의학연구원 실험동물 윤리위원회에서 승인된 동물실험계획서 프로토콜에 따라 진행되었다 (승인번호:20-058).
② FeCl3를 이용한 혈전증 동물모델 제작 및 혈류량 측정
혈전증 유도 마우스 모델을 만들기 위해 FeCl3 (10%)를 이용하였다. 마우스는 7일간 2'-푸코실락토오스 (500, 1,000 mg/kg BW), 3-푸코실락토오스 (1,000 mg/kg BW) 또는 ASA (100 mg/kg BW)를 경구투여하고 마지막 투여 2시간 후 2% 이소플루란으로 마우스를 마취시킨 다음 마우스의 왼쪽 경동맥을 분리시키고, FeCl3 (10%)를 적신 필터용지 (직경 2 mm)를 이용하여 경동맥 위에 2분간 올려두면서 혈전증을 유도하였다. 혈류량은 혈액유량계 (AD 계측기, 혈류량계)를 사용하여 측정하였다.
③ Tail bleeding time 동물모델 제작 및 지혈작용 측정
혈전증에 의한 지혈작용을 측정하기 위하여 tail bleeding time assay를 실시하였다. 마우스는 1일 1회, 7일간 2'-푸코실락토오스 (500, 1,000 mg/kg BW), 3-푸코실락토오스 (1,000 mg/kg BW) 또는 ASA (100 mg/kg BW)를 경구투여하고 마지막 투여 2시간 후 2% 이소플루란으로 마우스를 마취하였다. 이후 면도날을 사용하여 마우스 꼬리의 5 mm를 절단하고 45 mL의 PBS가 담긴 50 mL conical tube에 꼬리를 넣고 고정시킨 뒤 출혈시간 및 출혈량을 측정하였다. 구체적인 과정 및 사진은 도 6의 (A)에 나타냈다. 혈중 혈류의 손실양은 45 mL의 PBS로 수집된 혈중 헤모글로빈 함량을 측정하여 정량화하였다. 이때, 체온은 난방 패드를 사용하여 37℃를 유지하였다.
④ 통계 처리
통계분석은 GraphPad Prism 5를 이용하여 자료 분석을 실시하였다. 통계적 유의성은 다중집단의 ANOVA와 Dunnett's test for comparisons of multiple group, Student's t-test for comparisons of two groups로 분석하였다. 0.05보다 낮은 P 값은 유의미한 결과로 간주하였다.
(3) 실험 결과
① 경동맥 혈전증 동물 모델에서의 HMO에 의한 혈전증 생성 억제 효능 확인
혈소판은 혈관이 손상되면 활성화되어 손상부위에 응집됨으로써 혈관 손상에 따른 부위의 출혈을 지혈시키지만, 병적/병리생리적 단계에서는 혈전을 일으키며 이때 혈소판 활성이 가장 중요한 역할을 하게 된다.
혈전증 유도 마우스 모델에서의 혈전증 생성 억제 효능을 확인한 결과, 도 5와 같이 대조군 (vehicle)에서 경동맥 폐색시간이 평균 7.47분 발생하였고, 저농도 (500 mg/kg BW) 2'-푸코실락토오스 투여군에서는 평균 11.79분, 그리고 고농도 (1,000 mg/kg BW) 2'-푸코실락토오스 투여군에서는 평균 14.52분으로 경동맥 폐색 시간이 유의적으로 증가되었다. 반면 고농도 (1,000 mg/kg BW)의 3-푸코실락토오스을 경구투여한 마우스에서는 경동맥 폐색 시간이 8.18분으로 대조군과 유의적인 차이가 없었다. 또한, 고농도 (1,000 mg/kg BW)의 2'-푸코실락토오스 투여군에서의 경동맥 폐색 시간은 양성 대조군 (ASA로 표기)인 Aspirin (100 mg/kg BW) 처리군의 18.05분과 비교 시 거의 동등한 수준으로 경동맥 폐색 시간을 연장시키는 것으로 나타났다.
② 경동맥 혈전증 동물 모델에서의 HMO에 의한 지혈효능 확인
혈관이 손상되면 혈소판이 활성화되어 손상부위에 응집 및 패착됨으로써 혈관 손상에 따른 출혈을 억제하는 지혈작용을 한다. 상기에서 경동맥 혈전증에서 농도의존적으로 억제 효능을 나타냈던 2'-푸코실락토오스가 지혈작용에 어떤 영향을 주는지 확인하고자 하였다.
혈전증 유도 마우스 모델의 꼬리절단 후 출혈시간 및 출혈량을 측정한 결과, 도 6의 (B)와 같이 고농도 3-푸코실락토오스 및 저·고농도 2'-푸코실락토오스 투여군의 마우스 꼬리 출혈 시간은 대조군과 비교 시 통계적으로 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 또한, 절단 부위에서 채취한 혈액과 헤모글로빈 함량을 대조군과 비교 정량화한 결과, 도 6의 (C)와 같이 HMO를 먹인 마우스에서의 혈류의 손실량은 대조군과 유의적인 차이가 없었다. 단, 7일간 100 mg/kg BW의 ASA를 경구투여하였을 때 2'-푸코실락토오스와 대조군에 비해 출혈시간과 헤모글로빈 함량이 훨씬 더 증가하였으며, 이같은 결과는 HMO가 생체 내 지혈작용에 유의적인 영향을 주지 않으며, 기존 혈전치료제인 아스피린의 부작용을 대체하는 치료 소재로써 이용가능한 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (8)

  1. 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈전은,
    혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 혈소판에 의한 혈액 응고는,
    혈소판에 대한 아고니스트 (agonist; 작용자)인 CRP(collagen-related peptide) 또는 콜라겐(collagen)의 작용에 의해 발생한 것임을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 뇌심혈관 질환은,
    혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
  5. 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혈전은,
    혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 혈소판에 의한 혈액 응고는,
    혈소판에 대한 아고니스트 (agonist; 작용자)인 CRP(collagen-related peptide) 또는 콜라겐(collagen)의 작용에 의해 발생한 것임을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 뇌심혈관 질환은,
    혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
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