KR20020062698A

KR20020062698A - 혈전성 질환에 대한 보호용 약제

Info

Publication number: KR20020062698A
Application number: KR1020020003618A
Authority: KR
Inventors: 베른하르트 니스반트
Original assignee: 베른하르트 니스반트
Priority date: 2001-01-23
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2002-07-29
Also published as: DE60138867D1; AU784917B2; US20020141992A1; EP1224942A1; US20040170624A1; DK1228768T3; EP1228768A1; AU1198002A; ATE432713T1; EP1228768B8; CA2368791A1; ES2327604T3; US20070036784A1; EP1228768B1; JP2002363100A

Abstract

본 발명은 혈소판 상의 콜라겐 수용체의 비가역적인 불활성화 또는 분해를 유도하는 활성소를 포함하는, 혈전성 질환에 대한 보호를 위한 약제에 관한 것이다. 항체, 특히 사람화된 모노클로날 항체 JAQ1이 바람직한 활성소이다. 본 발명은 추가로, GPVI 에피토프에 대해 지시된 표지된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 바람직하게는 JAQ1로 정의되는 항체를 함유하는, 콜라겐 수용체 GPVI의 발현율을 측정하기 위한 진단제에 관한 것이다.

Description

혈전성 질환에 대한 보호용 약제 {Medicament for the protection against thrombotic diseases}

본 발명의 목적은 혈소판 콜라겐 수용체 당단백질(GP)VI에 대해 지시된 항체를 포함하는, 혈전성 질환에 대한 보호용 약제에 관한 것이다.

혈소판 응집은 조직 외상 후 혈액 손실을 제한하는 정상적인 지혈을 위한 주요한 메카니즘이지만(1;2), 죽상경화증의 상태에서 동맥 폐색을 초래하며 심근 경색 같은 질환의 발생을 촉진시킬 수 있다(3;4). 동맥 혈전증은 종종 죽상경화증 병반의 급작스러운 파괴 및 내피하층 상의 혈소판 침전 및 활성화에 의해 개시된다(4;5). 라미닌, 피브로넥틴, 및 폰 빌레브란트 인자(vWf) 같은 내피하층의 몇몇 거대분자성 성분 모두가 혈소판 부착에 대한 적합한 기질을 제공하지만, 섬유성 콜라겐이 혈관 내피하층의 가장 혈전원성 성분으로 고려되며, 이는 섬유성 콜라겐이 혈소판 부착을 지지할 뿐만 아니라 혈소판의 강력한 활성인자이기 때문이다(6;7). 혈소판 및 콜라겐 사이의 상호작용은 우선 부착 후, 후속적으로 제2상 부착을 초래하는 활성화, 분비, 및 궁극적으로 응집과 관련된다(8;9). 폰 빌레브란트 인자를 통해 콜라겐과 간접적으로 상호작용하는 GPIb-IX-V(10) 이외에, 몇몇 콜라겐 수용체가 혈소판 상에서 확인되어져 왔으며, 인테그린 α₂β₁(11), 및 비인테그린 GPVI(12)를 포함한다. 인테그린 α₂β₁은 콜라겐에 대한 혈소판의 부착을 지지하는 주요 수용체인 반면, GPVI은 활성화를 매개하는 것으로 현재 인정되고 있다(13 내지 15). 아주 최근 사람 및 마우스 GPVI의 클로닝 결과, 상기 수용체는 사람 및 마우스 혈소판의 세포 표면에서 FcRγ-쇄와 복합체를 형성하는 면역글로불린 슈퍼패밀리(16;17)에 속하는 60 내지 65 kDa의 I형 트랜스막 당단백질인 것으로 확인되었다(14;15;18). GPVI를 통한 신호전달은 src-유형 키나제에 의한 FcR γ-쇄 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프(ITAM)의 티로신 인산화에 의해 밝혀진 바와 같이 면역수용체(19)에 의해 사용되는 것과 유사한 경로를 통해 일어난다(20;21). GPVI-결핍 환자는 가벼운 출혈 소질을 겪게 되며 이들의 혈소판은 콜라겐에 대한 심각하게 손상된 반응을 나타낸다(12;22). 추가로, GPVI가 결여되는 FcR γ-쇄 결핍 마우스(15)로부터의 혈소판은 또한 콜라겐에 대한 반응에서 응집하지 못하지만(14;19), 상기 마우스에서 중대한 출혈이 일어나는 것으로 보고된 바 없다.

따라서, GPVI는 사람 혈소판의 활성화를 위한 콜라겐 수용체로서 중요한 작용을 수행할 수 있다는 것이 제시되어져 왔다. 마우스에서, FcR γ쇄-결핍 마우스로부터의 혈소판은 콜라겐에 대한 반응에서 응집하지 않기 때문에, 유사한 메카니즘이 존재하는 것으로 보인다. 문헌[WO 제01/00810호]에서는, GPVI에 대한 항체가 이미 기술되어져 있지만, 이것이 비가역적으로 GPVI를 제거하는지 공지되어 있지 않다.

본원에 이르러, GPVI의 기능은 GPVI에 대한 독특한 모노클로날 항체(mAb)(JAQ1)을 사용하여 대조군 및 FcR γ쇄-결핍 마우스에서 추가로 연구되었다.

이러한 연구의 결과는 다음과 같이 요약될 수 있다:

야생형 혈소판에 있어서, JAQ1은 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집은 억제하지만, PMA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트) 또는 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집은 억제하지 않았다. 한편, 결합된 JAQ1의 교차 결합은 야생형의 응집을 유도하지만, FcR γ쇄-결핍 혈소판의 응집은 유도하지 않았다. JAQ1은 야생형으로부터의 혈소판 및 거핵세포를 염색시키지만, FcR γ쇄-결핍 마우스에서는 염색시키지 못했다. 추가로, JAQ1은 야생형을 사용한 면역침전 및 웨스턴 블롯 실험에서는 GPVI(약 60 kD)을 인식하지만, FcR γ쇄-결핍 혈소판에서는 인식하지 못했다.이러한 결과들은 GPVI이 마우스에서 혈소판 활성화를 담당하는 콜라겐 수용체임을 강력하게 제시하며 FcR γ-쇄와의 결합은 이의 발현 및 기능에 결정적으로 중요하다는 것을 입증한다.

추가의 연구는 JAQ1이 사람 GPVI과 교차 반응한다는 것을 명백히 나타낸다[Nieswandt B, 공개되지 않은 결과들].

이러한 결과들에 근거하여, 본원에 이르러, 약제가 혈소판 상의 콜라겐 수용체의 비가역적 불활성화 또는 분해를 유도하는 활성소(active principle)를 포함하는 경우 이는 혈전성 질환에 대해 효과적이라는 것을 확인하였다. 이러한 활성소는 화학적 화합물이거나 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 바람직한 모노클로날 항체는 JAQ1이며 바람직한 콜라겐 수용체는 혈소판 GPVI이다. 모노클로날 항체 JAQ1이 사용되는 경우 이는 사람화된 모노클로날 항체 JAQ1이어야 한다. JAQ1을 분비하는 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약에 따라서 브라운슈바이크 소재의 수탁기관(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 2000년 12월 20일자로 제DSM ACC 2487호로서 기탁되었다.

본 발명의 추가의 목적은 GPVI 에피토프에 대해 지시된 표지된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 바람직하게는 JAQ1로 정의되는 항체를 함유하는, 콜라겐 수용체 GPVI의 발현율을 측정하기 위한 진단제이다. 따라서, 정상 수준 보다 높은 환자는 혈전성 합병증의 위험이 있는 반면, 정상 GPVI 수준 보다 낮은 환자는 출혈의 위험이 있는 것으로 인식될 것이다.

도 1은 JAQ1이 일시적인 혈소판감소증을 유도한다는 것을 나타내는 도식이다. 마우스에 멸균된 PBS 200㎕ 중 정제된 IgG(a) 및 지시된 mAb의 Fab 단편들(b)을 복강내로 제공한다. 혈소판 수는 개선된 노이바우어 혈구계(Improved Neubauer hemocytometer)를 사용하여 지시된 시점에서 측정하였다. 결과는 각각 6마리 마우스의 그룹에 대해서 평균 혈소판 수 ±SD로서 나타냈다.

도 2는 JAQ1-처리된 마우스의 혈소판이 CRP 및 콜라겐에 반응하지 않는다는 것을 나타내는 도식이다. (a) 항체 주사 3일 후 JAQ1-처리된 또는 대조군 마우스로부터의 혈소판에 대한 이색 유동 세포계수 분석. 희석시킨 전혈을 2분 동안 ADP 10μM 또는 CRP 10㎍/㎖로 자극시키고 후속적으로 RT에서 10분 동안 항-피브리노겐^FITC및 항-P-셀렉틴^PE항체와 항온처리하고 직접적으로 분석하였다. 혈소판을 FSC/SSC 특성화 및 F13 강도(항-마우스 GPIbα^PE/Cy5)로 조절하였다. 나타낸 데이터는 그룹 당 6마리 마우스의 대표적인 예이다. 유사한 결과가 항체 주사 7일 및 14일째에 수득되었다. (b) 지시된 마우스로부터의 헤파린 처리된 prp를 콜라겐(50㎍/㎖), ADP(10μM) 또는 PMA(50ng/㎖)로 자극시켰다. 광 투과는 응집계(Fibrintimer 4 channel aggregometer) 상에서 기록하였다. (c) 대조군 마우스로부터의 헤파린 처리된 prp를 지시된 농도의 콜라겐 부가 전 5분 동안 무관한 랫트 IgG2a(20㎍/㎖-원형) 또는 JAQ1(20㎍/㎖-삼각형)의 존재하에서 교반과 함께 항온처리하였다. 병행하여, JAQ1-처리된 마우스로부터의 prp를 시험하였다(정방형). 결과는 각각 6마리 마우스의 그룹에 대해서 최대 혈소판 응집 ±S.D.로서 나타냈다.

도 3은 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판에서 GPVI가 2주 이상 동안 검출되지 않는다는 것을 나타내는 도식이다. (a) 전체 혈소판 단백질을 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 분리시키고 FITC-표지된 JAQ1(항-GPVI) 또는 EDL1(항-GPIIIa)로 면역블롯시켰다. 결합된 mAb는 HRP-표지된 랫트 항-FITC 및 ECL에 의해 검출되었다. (b) 대조군, FcRγ쇄 결핍(-/-) 및 JAQ1-처리된(7일) 마우스로부터의 세척한 혈소판을 컨불신(Conbulxin, Cvx) 10㎍/㎖로 자극시켰다. 대조군 혈소판은 Cvx 부가 전 5분 동안 무관한 랫트 IgG2a 또는 JAQ1(20㎍/㎖)로 예비처리하였다. (c) 지시된 마우스로부터의 세척한 혈소판을 실온에서 15분 동안 FITC-표지된 컨불신(5㎍/㎖)으로 항온처리한 후 FACScan(제조원: Becton Dickinson) 상에서 분석하였다. 나타낸 데이터는 그룹 당 6마리 마우스의 대표적인 예이다.

도 4는 GPVI-결핍된 혈소판의 콜라겐에 대한 감소된 부착 및 손상된 응고촉진 반응을 나타낸다. (a) JAQ1-처리된 마우스(7일)로부터의 혈소판은 보트로세틴 (2㎍/㎖-검은 선)의 존재하에서 정상적인 양의 혈장 vWF를 결합시킨다. 결합된vWF는 FITC-표지된 항-vWF 항체(10㎍/㎖)에 의해 검출되었다. 보트로세틴의 부재하에서는 어떠한 결합도 검출되지 않았다(어두운 영역). 트롬빈(0.1U/㎖)에 대한 반응에서 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판 상의 β1-인테그린의 정상적인 활성화. 휴지기(어두운 영역) 또는 트롬빈 활성화된(검은 선) 혈소판을 RT에서 15분 동안 FITC-표지된 9EG7(5㎍/㎖)과 항온처리하고 직접적으로 분석하였다. (b) 대조군 또는 JAQ1-처리된 마우스(7일)로부터의 세척한 혈소판을 지시된 시간 동안 MgCl₂(1mM)/CaCl₂(1mM)의 존재 또는 부재하에서 콜라겐-피복된 미세역가 플레이트에서 항온처리하고 부착된 혈소판을 형광계수적으로 정량화하였다. 나타낸 데이터는 5회 동일한 실험의 대표로서 단일 실험으로부터의 것이며, 3회 판독값 평균 ±SD로 나타낸다. (c) 콜라겐(50㎍/㎖) 및 트롬빈(0.01U/㎖)의 혼합물로 활성화시킨 대조군 및 JAQ1-처리된(7일) 마우스로부터의 혈소판에 대한 아넥신 V-FITC 결합에 대한 유동 세포계수 분석.

도 5는 JAQ1-처리된 마우스의 출혈 시간을 나타낸다. 출혈 시간은 비면역 IgG2a 또는 JAQ1 100㎍을 주사한 7일 후 마우스(그룹 당 n =15마리)에서 측정하였다. 대조군으로서, 마우스(n = 6마리)에게 실험 24시간 전에 JON/A(항-GPIIb/IIIa)의 F(ab)₂단편 100㎍을 공급하였다. 경우에 따라서, 출혈은 치사를 예방하기 위해서 10분 시점에서 수동으로 종결시킨다. 각각의 지점은 한 개체를 나타낸다.

도 6은 JAQ1이 혈관내 혈전증으로부터의 장기간 보호를 유도함을 나타낸다.콜라겐(0.8㎎/㎏ 체중) 및 에피네프린(60㎍/㎏ 체중)의 혼합물의 일시 주사에 대한 반응에서 혈전색전증. (a) 대조군 마우스 및 챌린지 전 지시된 시점에서 JAQ1 100㎍으로 처리한 마우스에서의 사망률. (b) 콜라겐/에피네프린 주입 3분 후 대조군 및 JAQ1-처리된 마우스(그룹 당 n = 8마리)에서의 혈소판 수. (c) 상부 패널: 폐의 전형적인 조직 구조(실물 x 100); 폐색된 혈관은 화살표로 나타낸다. 하부 패널: 혈전에서 혈소판의 면역조직화학적 검출(실물 x 400). 아세톤 고정된 동결된 절편을 혈소판-특이적인 항체(항-GPIb-IX)와 반응시키고 헤마톡실린으로 대염색시켰다. 붉은색 서양고추냉이 퍼옥시다제 반응 생성물은 혈전내에 고밀도의 혈소판을 나타낸다.

항체 JAQ1은 진단제 분야의 숙련자에게 통용되는 임의의 통상적인 방법으로 표지시킬 수 있다. 이는 방사성-표지, 형광-표지, 효소-표지될 수 있거나, 세포 또는 조직에서 항체의 검출을 가능하게 하는 임의의 다른 마커를 함유할 수 있다. 진단 과정은 다음과 같이 수행될 수 있다:

a) 환자의 희석시킨 혈액 샘플을 실온에서 15분 동안 형광-표지된 JAQ1과 항온처리하고 혈소판을 유동 세포계수법으로 직접적으로 분석한다.

b) 환자의 혈액 샘플을 고체 캐리어에 고정시키고 후속적으로 표지된 항체 JAQ1 단독 또는 비표지된 항체 JAQ1와의 혼합물과 함께 처리한 후, 통상적인 방법에 의해 표지된 항체를 검출한다.

이러한 진단 과정 및 다른 공지된 대안법을 수행할 수 있다. 가장 적합한 것은 유동 세포계수법에서 형광-표지된 모노클로날 항체 JAQ1을 사용하는 것이다.

하기 실험들이 수행되었다.

재료 및 방법

동물.

6 내지 10주령의 특정무균 마우스(NMRI)를 공급원(Charles River, Sulzfeld, Germany)으로부터 수득하여 본 발명자의 동물 사육시설에서 유지시킨다.

화학제.

마취제 자일라진(Rompun) 및 케타민(Imalgene 1000)은 각각 제조원(Bayer, Levekusen, Germany) 및 제조원(Merial, Lyon, France)으로부터 공급받았다. 고정된 파파인(제조원: Pierce, Rockford, IL, USA), 고분자량 헤파린, ADP, 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)(이들 모두의 제조원: Sigma, Deisenhofen, Germany), FITC-표지된 아넥신 V(제조원: Boehringer Mannheim, Germany), 및 콜라겐(제조원: Kollagenreagent Horm, Nycomed, Munich, Germany)을 구입하였다. CRP(GKO-(GPO)₁₀-GKOG)(일문자 아미노산 암호, 이때 O는 하이드록시프롤린) 및 컨불신(convulxin)은 왓슨(S.P. Watson, Oxford, U.K.)으로부터 친절하게 제공되었다. FITC-표지된 컨불신은 엠. 장드롯-페루스(M. Jandrot-Perrus)로부터의 인심좋은 선물이었다.

항체.

랫트 항-마우스 P-셀렉틴 mAb RB40.34는 베스트베버(D. Vestweber, Munster, Germany)로부터 친절하게 제공되었다. 사람 피브리노겐 및 vWF에 대한 폴리클로날 래빗 항체는 제조원(DAKO, Glostrup, Denmark)으로부터 구입하였으며 본 발명자의 연구실에서 변형되었다. 래빗-항 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-HRP는 제조원(DAKO)으로부터 구입하였다. 인테그린 α2 및 β1 서브유니트에 대한 모노클로날 항체들은 모두 제조원(Pharmingen)으로부터 구입하였다. 모든 다른 항체들은 본 발명자의 연구실에서 생성, 생산 및 변형되었으며 문헌(23;24)에 기술되어져있다. 항체의 변형: JAQ1로부터의 Fab 단편은 고정된 파파인(제조원: Pierce)과 함께 mAb 10㎎/㎖를 12시간 항온처리하여 생성시키고, 이후 상기 제제는 고정된 단백질 A 컬럼에 적용한 후 고정된 단백질 G 컬럼(제조원: Pharmacia)에 적용하여 Fc 단편 및 모든 절단되지 않은 IgG를 제거하였다. Fab 단편의 순도는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 상기 겔을 은염색하여 점검하였다. JON/A(항-마우스 GPIIb/IIIa)로부터의 F(ab)₂단편은 문헌(24)에 기술된 바와 같이 생성시켰다.

혈소판 준비 및 계수.

마우스를 에테르 마취하에서 완와후총(retroorbital plexus)으로부터 채혈하였다. 혈액을 10%(v/v) 0.1M 시트르산 나트륨 또는 헤파린 7.5U/㎖를 함유하는 튜브내에 수집하고 혈소판 농축 혈장을 실온(RT)에서 10분 동안 300 g에서 원심분리하여 수득하였다. 혈소판 계수를 측정하기 위해서, 혈액(20㎕)을 실리콘 처리된 미세모세관을 사용하여 마취된 마우스의 안와후총으로부터 수득하고 즉시 유노펫 키트(Unopette kit, 제조원: Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)에서 1:100으로 희석시켰다. 희석시킨 혈액 샘플을 개선된 노이바우어 혈구계(Improved Neubauer Haemocytometer, 제조원: Superior, Bad Mergentheim, Germany)에서 20분 동안 정치하고, 혈소판을 400배 배율에서 위상차 현미경하에서 계수하였다.

면역블롯팅.

혈소판(3 x 10⁸개)을 PBS에 3회 세척하고 후속적으로 4℃에서 30분 동안 용해액(20mM 트리스/HCl, pH 8, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 아프로티닌 2㎍/㎖, 류펩틴 0.5㎍/㎖, 및 0.5% 노니데트 p-40을 함유하는 트리스-완충된 염수, 이들 모두의 제조원: Boehringer Mannheim) 0.3㎖에 용해시켰다. 세포 파쇄물을 원심분리(15,000g, 10분)시켜 제거하고 전체 세포 추출액을 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하여 PVDF 막으로 전이시켰다. 상기 막을 우선 FITC-표지된 일차 항체 5㎍/㎖와 함께 항온처리한 후 래빗 항-FITC-서양고추냉이 퍼옥시다제(1㎍/㎖)로 항온처리하였다. 단백질을 ECL로 가시화시켰다.

2D-전기영동.

세척한 혈소판을 펠렛화시키고 트리스 20mM, pH 7.5, EDTA 2mM, 슈크로오스 0.25M에 재현탁시켰다. 혈소판을 우레아 8.75M, 티오우레아 2.5M, DTT 25mM, 트리톤 X100 1.25% 및 양성전해질 3 내지 10, 0.75%의 4용적을 부가하여 용해시켰다. 이차원 겔 전기영동(2D-E)을 문헌(25)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하면, IEF를 Protean IEF Cell 장치(제조원: Biorad, Marnes-la-Coquette, France)를 사용하여 시판중인 고정된 pH 구배(선형 pH 구배 3 내지 10, 7㎝ 길이)로 수행하였다. 상기 겔을 샘플의 존재(5 x 10⁷개 혈소판에 상응하는 혈소판 용해액)하에서 16시간 동안 재수화시키고 20.000 Vh 동안 집중시켰다. IEF 후, 문헌(26)에 기술된 바와 같이 겔 스트립을 실온에서 DTT를 함유하는 용액 중에서 항온처리하고 요오도아세트아미드 용액 중에서 항온처리한다. 이후, 겔을 이차원 전기영동하고 은으로 염색시켰다.

응집 측정.

혈소판 응집을 측정하기 위해서, prp(0.5 x 10⁶개혈소판/㎕와 함께 200㎕)를 사용하여 광 투과를 측정하였다. 투과는 응집계(Fibrintimer 4 channel aggregometer, 제조원: APACT Laborgerate und Analysensysteme, Hamburg, Germany) 상에서 10분 동안 기록되며 혈장으로 조정된 100% 투과와 함께 임의의 단위로서 표현하였다. 혈소판 응집을 콜라겐(5 내지 50㎍/㎖), PMA(50ng/㎖) 또는 ADP(10μM)의 부가로 유도시켰다.

유동 세포계수.

헤파린 처리된 전혈을 변형된 타이로드의(tyrode's)-HEPES 완충액(134mM NaCl, 3.04mM Na₂HPO₄, 2.9mM KCl, 12mM NaHCO₃, 20mM HEPES, 5mM 글루코오스, 1mM MgCl₂, pH 6.6)으로 1:30으로 희석시키고 자극에 앞서 37℃에서 30분 동안 방치시켰다. 샘플을 RT에서 2분 동안 지시된 농도의 ADP 또는 CRP로 자극하고, 실온에서 10분 동안 형광단-표지된 mAb로 염색하고, FACScan(제조원: Beckton Dickinson,Heidelberg) 상에서 직접적으로 분석하였다. 아넥신 V-FITC의 휴지기 및 활성화된(콜라겐 50㎍/㎖ 및 트롬빈 0.01U/㎖의 혼합물) 혈소판에 대한 결합의 유동 세포계수적 분석을 제조업자의 지침에 따라서 측정하였다.

생체내 실험.

항체(PBS 200㎕ 중)를 복막내 주사하였다. 콜라겐 및 및 에피네프린에 의해 유도된 혈전색전증: 마우스를 0.08% 자일라진 기재(Rompun, 제조원: Bayer, Germany) 및 1.6% 케타민(Imalgen 1000, 제조원: Merial, France)의 혼합물 150㎕의 복막내 주사로 마취시켰다. 마취된 마우스에 콜라겐(0.8㎎/㎏) 및 에피네프린(60㎍/㎏)의 혼합물을 경정맥내로 주입하였다(27). 생존 마우스의 절개부를 꿰매고, 이들이 회복되게 하였다. 검시 및 조직학적 연구를 4% 포름알데하이드에 고정시킨 폐 상에서 수행하고, 파라핀 절편들을 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 출혈 시간 실험: 마우스를 마취시키고 꼬리 끝의 3㎜를 외과용 메스로 절단시켰다. 이후, 꼬리를 여과지가 더이상 혈액으로 착색되지 않을 때까지 매 15초 마다 여과지로 닦아내었다(28). 경우에 따라서, 출혈은 치사를 예방하기 위해서 10분 시점 마다 손으로 중단시켰다. 실험들은 지방 당국의 규제에 따라서 수행되었다.

면역조직화학.

아세톤-고정된 동결 절편(6㎛)을 실온에서 30분 동안 블록킹(PBS 중 5% 정상염소 혈청, 소 혈청 알부민, BSA 5㎎/㎖)하였다. HRP-접합된 p0p1(항-마우스 GPIb-IX(23))을 90분 동안 2㎍/㎖의 최종 농도에서 부가하고 AEC 기질을 3회 세척 단계 후에 부가하였다. 이후, 절편들을 헤마톡실린으로 대염색하였다.

혈소판 부착.

PBS 100㎕ 중 콜라겐(2㎍)을 밤새 4℃에서 F96-MaxiSorp 플레이트(제조원: Nunc, Wiesbaden, Germany) 상에 고정시켰다. 이후, 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 PBS 중 BSA 1㎎/㎖로 포화시키고 PBS로 세척하였다. 타이로드의(Tyrode's)-알부민 완충액 중 세척시킨 혈소판(10⁶/웰)을 45분 이하로 웰내에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후 실온에서 30분 동안 HRP-표지된 항-GPIb-IX(p0p1)로 항온처리하고, TMB를 각각의 웰에 3회 세척 단계 후에 부가하였다. 10분 후, 반응은 2N H₂SO₄를 부가하여 종결시켰다. 450㎚에서의 흡광도를 Multiskan MCC/340(제조원: Labsystems, Lugano, Switzerland) 상에서 기록하였다. 결과는 다음과 같이 요약할 수 있다:

본 연구에서, 본 발명자는 생체내 JAQ1의 항혈전 효과를 연구하였다. JAQ1(100㎍)의 주사는 온화하고 일시적인 혈소판감소증을 야기하며, 혈소판 수는 1일째에 약 34 ±7.4%의 최대 감소를 나타내고 72시간 후에 정상으로 복귀하며, 혈소판 수의 감소는 최소한 11일 이상 지속되었다(도 1a). 보다 높은(200㎍) 또는 보다 낮은(50㎍) 투여량의 주사는 혈소판 수에 대해서 비교할만한 효과를나타냈다(도 1a). 혈소판 수의 일시적인 감소는 Fc-의존적이지 않은데, 이는 JAQ1의 Fab 단편들도 유사한 효과를 갖기 때문이다(도 1b). JAQ1-처리된 마우스는 항-GPIIb/IIIa mAb(30)에 의해 유도되는 것으로 공지된 과민증 반응의 어떠한 증후도 나타내지 않으며, 3주 이상 동안 자발적인 출혈을 일으키지 않았다. JAQ1은 항체 주사 3시간 후 비장 및 골수-유도된 거핵세포 상에서 면역조직화학적으로 검출할 수 있으며, 이는 mAb가 두 기관 모두에서 이러한 세포들에 도달하였음을 입증한다.

JAQ1 처리는 생체외에서 콜라겐 및 콜라겐 관련된 펩타이드에 대한 혈소판 반응을 2주 이상 동안 손상시킨다

순환성 혈소판에 대한 JAQ1의 효과를 항체 주사 후 상이한 시점에서 생체외에서 연구하였다. 주요 당단백질(GP) 수용체인 GPIIb/IIIa 및 GPIb-IX-V, CD9, 및 인테그린 α₂β₁의 기저 표면 발현은 항체 주사 후 3, 7 및 14일째에 대조군 혈소판과 비교하여 변화하지 않았다(표 1). 항체 주사 후 어떠한 시점에서도 순환성 혈소판은 활성화의 어떠한 징후도 나타내지 않으며, 이는 표면 결합된 피브리노겐 및 표면 발현된 P-셀렉틴의 결핍에 의해 입증되었다(표 1). 3, 7 및 14일째, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판은 강력한 GPVI-특이적인 혈소판 효능제로서 공지된(31) 콜라겐 관련된 펩타이드(30㎍/㎖ 이하의 CRP)를 사용한 활성화에 대해 내성을 나타냈다(도 2a). 반대로, ADP는 이러한 혈소판의 정상적인 활성화(피브리노겐 결합)를 유도하였다. 추가로, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판은 생체외에서 50㎍/㎖ 이하의 농도의 콜라겐을 사용한 활성화에 완전히 내성을 나타내며, 이러한 완전한 억제 효과는 또한 JAQ1 100㎍의 단독 주사 만으로 14일 이상 지속되었다(도 2b). 콜라겐과는 반대로, ADP 및 PMA는 이러한 혈소판의 정상적인 응집을 유도하며, 이는 JAQ1이 GPVI-의존성 혈소판 활성화 경로를 특이적으로 차단하는 반면, 다른 기능들은 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 시험관내에서는, JAQ1의 포화 농도(20㎍/㎖)만이 콜라겐-유도된 혈소판 응집에 제한적인 억제 효과를 나타내며, 이는 약 7㎍/㎖ 이상의 보다 높은 콜라겐 농도를 사용하는 경우에 극복될 수 있으며(도 2c), 이는 이전의 결과들을 확인해준다(29).

JAQ1은 생체내에서 순환성 혈소판 상의 GPVI의 손실을 유도한다

시험관내 및 생체외에서 콜라겐-유도된 응집에 대한 JAQ1의 억제 효과의 차이는 놀라운 것이며 GPVI 상의 에피토프에 대한 단순한 차단 이외의 메카니즘이 관련됨을 제시한다. 따라서, 다음 단계는 전체 세포 용해액에 대한 웨스턴 블롯 분석에서 GPVI의 존재에 대해 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판을 시험하는 것이다. 도 3a에서 나타낸 바와 같이, GPVI은 JAQ1 단독 주사시 14일 이상 동안 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판에서 검출되지 않지만, GPIIIa는 모든 시점에서 정상적인 양으로 존재하였다. 반대로, 모든 시험된 마우스에서, 기능성 GPVI을 발현하는 신규 혈소판이 28일 후에 검출 가능하였다. 추가로 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판 상에서 GPVI의 부재를 평가하기 위해서, 본 발명자는 GPVI-특이적인 뱀 독 독소 컨불신(32)을 사용하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 컨불신은 3, 7 및14일째 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판의 응집을 유도하지 않지만, 이는 포화량의 JAQ1의 존재 또는 부재하에서 대조군 혈소판의 응집을 유도하였다. 추가로, 유동 세포계수적 분석 결과, FITC-표지된 컨불신은 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판에 결합하지 않았다(도 3c). 최종적으로, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판에서 등전점 5.6을 갖는 약 60 kD 단백질의 부재가 2-D 겔 전기영동에 의해 확인되었다. 종합해 보면, 이러한 결과들은 GPVI가 생체내에서 이러한 혈소판으로부터 비가역적으로 불활성화되고 제거되었다는 것을 강력하게 제시한다.

JAQ1-유도된 GPVI 손실은 생체내에서 신속하게 발생하며 Fc-독립적이다

GPVI의 손실의 근거가 되는 메카니즘을 시험하기 위해서, 마우스에 바이오티닐화된 JAQ1을 주사하고 표면 결합된 mAb의 양을 주사 후 초기 시점에서 생체외에서 유동 세포계수법으로 측정하였다. 흥미롭게도, 주사 후 6시간이 되면, 매우 낮은 수준의 표면 결합된 JAQ1만이 검출 가능하며 추가로 시그날은 24 및 48h 이후에 대조군 수준으로 감소하는 반면, JAQ1^FTIC및 Cvx^FITC는 모든 시점에서 혈소판에 결합하지 않았다. 이러한 결과는 JAQ1-GPVI 복합체가 6시간내에 상기 혈소판의 표면으로부터 제거되었음을 제시한다. 반대로, GPV에 대한 바이오티닐화된 mAb(24)를 주사한 마우스로부터의 혈소판은 FITC-표지된 스트렙타비딘을 사용한 염색에서 일정하게 포지티브를 나타냈다. 다음 단계에서, 본 발명자들은 GPVI 및 바이오티닐화된 mAb의 존재에 대해서 JAQ1-처리된 마우스의 혈소판으로부터의 전체 세포 용해액을 시험하였다. JAQ1은 주사 6시간 후 혈소판에서 강력하게 검출 가능한 반면, 시그날은 24시간 후에 현저하게 감소되고 48시간 후에는 보다 더 감소하였다. 유사한 상황이 GPVI에서도 확인되며, 이는 JAQ1-GPVI 복합체가 내재화되어 2일내에 분해된다는 것을 강력하게 제시한다. 생체내 효과와는 반대로, JAQ1은 세척된 혈소판 또는 전혈(헤파린 처리된 또는 시트레이트 처리된) 상에서는 37℃에서 6h 항온처리 후 표면 GPVI의 어떠한 검출가능한 감소 조절을 유도하지 못하며, 이는 2차 시그날이 이러한 효과를 유도하는데 필요할 수 있으며 이러한 시그날은 시험관내에서는 부재한다는 것을 나타낸다.

JAQ1의 Fc 부분 또는 이의 이가 형태가 GPVI의 내재화/분해를 위해서 필요한지를 측정하기 위해서, 마우스에 상기 mAb의 Fab 단편 100㎍을 공급하고 혈소판을 48시간 후 GPVI의 존재에 대해서 시험하였다. Fab 단편은 온전한 IgG와 마찬가지로, 순환성 혈소판으로부터의 GPVI의 완전한 손실을 유도하며, 세포는 CRP, 콜라겐, 또는 컨불신을 사용한 활성화에 대해서 완전히 내성을 나타내었다.

GPVI-결핍된 혈소판은 콜라겐에 대해서 감소된 부착 및 손상된 콜라겐-의존성 응고촉진제 활성을 나타낸다

최근까지, GPVI은 활성화를 위한 혈소판 콜라겐 수용체이며, 인테그린 α₂β₁및 GPIb-V-IX(vWF를 통해서)는 부착을 매개하는 것으로 생각되었다. 이전에 나타낸 바와 같이(표 1), 두 수용체 모두의 기저 표면 발현은 JAQ1 처리에 의해서영향을 받지 않았다. 추가의 실험들은 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판은 보트로세틴의 존재하에서 정상 수준으로 vWF에 결합하며 β1 서브유니트의 활성화된 형태를 특이적으로 인식하는 mAb 9EG7로 평가된 바와 같이(33), 트롬빈은 β1-인테그린의 정상적인 활성화를 유도한다는 것을 입증하였다(도 4a). 다음 단계에서, 콜라겐에 대한 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판의 부착을 정적 분석(static assay)으로 시험하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판 부착은 대조군 혈소판과 비교하여 급격히 감소하였으며 세포외 유리 마그네슘/칼슘의 부재하에서 손상되었으며, 이는 부착이 인테그린 α₂β₁에 의해 주로 매개된다는 것을 강력하게 제시한다(34). GPVI는 혈소판의 응고촉진 반응에서 결정적으로 관여하며, 이때 자극된 혈소판은 트롬빈 생성을 촉진시키는 혈장 막에서 음으로 하전된 포스파티딜세린(PS)을 노출시킨다(35). 진정으로, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판은 아넥신 V 결합의 결핍으로부터 입증되는 바와 같이, 항체 주사 3, 7 및 14일 후 콜라겐 및 트롬빈의 혼합물에 대한 반응에서 PS를 노출시키지 않았다(도 4c).

항-GPVI 처리는 장기간 항혈전 보호를 유도하지만 단지 온건하게 증가된 출혈 시간을 유도한다

이전 실험들의 결과는 JAQ1이 생체내에서 혈소판 중 GPVI의 완전한 결핍을 특이적으로 유도한다는 것을 제시하였다. 이러한 특이적인 결함이 정상적인 지혈에 어느 정도로 영향을 미치는지를 시험하기 위해서, 본 발명자는 JAQ1의 1회 주사(100㎍) 후 7일째에 꼬리 출혈 시간을 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 출혈 시간은 대조군 마우스에 비해 GPVI-결핍된 마우스에서 현저하게 증가(각각, 158 ±89초 대 330 ±103초)하지만, GPIIb/IIIa에 대한 차단성 F(ab)₂단편 100㎍으로 예비처리한 마우스(> 600 초)에서 보다는 일관되게 낮았다. 다음 단계에서, 본 발명자는 콜라겐(0.8㎎/㎏ 체중) 및 에피네프린(60㎍/㎏ 체중)의 혼합물의 주입에 의해 유도된 치명적인 폐 혈전색전증의 모델에서 JAQ1의 보호 효과를 시험하였다(27). 무관한 랫트 IgG2a로 예비 처리한 대조군 마우스 중에, 95%(20마리 중 19마리)가 광범위한 폐 혈전증 및 심박 정지로 5분내에 치사하였다. 반대로, 이들에게 투여 전 mAb를 3, 7 또는 14일째에 공급하였는가에 무관하게, JAQ1(100㎍)으로 예비 처리한 마우스(n = 그룹 당 8마리) 모두는 생존하였다(도 6a). JAQ1 예비 처리된 마우스에서 혈소판 수는 콜라겐/에피네프린의 주입에 의해 유의하게 영향을 받지 않는 반면, 각각의 그룹에서 혈전색전증의 유도 3분 후에 측정된 대조군 마우스(n = 8마리)에서는 급격한 감소가 검출되었다(도 6b). 조직학적 시험을 위해서, 대조군 및 JAQ1 예비 처리된(3, 7 및 14일째) 마우스에 병행 시험으로 동일한 처리를 하지만, 폐를 3분 후에 제거하였다. 대부분의 크고 작은 혈관들이 대조군 마우스의 폐에서 혈소판 농축된 혈전에 의해 폐색되는 반면, JAQ1 예비 처리된 마우스의 폐에서는 매우 극소수의 혈전이 검출되었다(도 6c).

따라서, GPVI에 대한 모노클로날 항체로 마우스를 처리하는 것은 콜라겐-의존성 혈전색전증에 대한 완전한 장기간 항혈전 보호를 초래하는 것으로 입증될 수 있다. 이러한 결과는 생체내에서 혈소판의 콜라겐-유도된 활성화에서 GPVI의 제시된 결정적인 역할을 확인시켜 주며, 항-GPVI 제제가 죽상경화성 병반 파열(이때, 혈소판이 고도의 전단 스트레스의 조건하에서 내피하층에 의해 주로 활성화되는 것으로 생각된다)에 의해 유도된 동맥 혈전증을 예방하는데 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다(4;5;36). 혈소판 부착 및 후속적인 활성화를 지지하는 매트릭스 단백질 중, 콜라겐이 적어도 정상적인 지혈에서는 결정적인 역할을 수행하며, 이는 콜라겐 수용체 결함 환자가 온화한 출혈 질환을 나타내기 때문이다(12;37;38). 혈전에서 GPIb, GPIIb/IIIa 및 이들 각각의 리간드인 폰 빌리브란트 인자(vWF) 및 피브리노겐이 잘 입증되어져 있음에도 불구하고[참조: Z.W. Ruggeri (39)], vWF 및 피브리노겐 이중 녹아웃 마우스는 여전히 폐색성 혈전을 형성시킬 수 있다는 발견은, 콜라겐 및 이의 혈소판 수용체가 또한 혈전증에서 결정적인 역할을 수행할 수 있다는 것을 제시한다(40).

생체내에서, JAQ1의 완전한 억제 효과는 예기치 못한 것이었으며, 이는 순환성 혈소판으로부터 GPVI를 제거하는데 기초하며 최근까지 혈소판 수용체의 그러한 특이적인 결핍은 기술된 바 없기 때문이다. JAQ1-처리된 마우스에서 순환성 혈소판 상의 기능성 GPVI의 완전한 상실은 상이한 접근법으로도 확인되었다. 우선, 2주 이상 동안 상기 단백질은 혈소판 용해액의 웨스턴 블롯 분석에서 검출되지 않았다(이는 혈소판의 정상적인 수명을 초과한다(41)). 둘째로, JAQ1 이외의 상이한 에피토프에 결합하는 GPVI-특이적인 뱀 독 독소 컨불신(도 3b, c)은 JAQ1-처리된마우스로부터의 혈소판에는 결합하지 않으며, 이는 혈소판 막으로부터의 GPVI의 부재를 강력하게 제시한다. 셋째로, 약 5.6의 등전점을 갖는 약 60 kD 단백질(이는 사람 GPVI에 대해 기술된 것과 유사하다(42))이 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판의 용해액에서 부재하며(도 4), 동일한 단백질이 GPVI가 결여되는 것으로 공지된 FcR γ쇄-결핍 마우스(나타내지 않음)로부터의 혈소판에서 부재한다(15). 가장 중요하게는, 콜라겐에 대한 기능성 혈소판 반응은 생체내에서 JAQ1에 의해서 완전히 손상되는 반면, mAb만이 시험관내에서 제한된 억제 효과를 갖는다(29)(도 2c). 이러한 결과는 JAQ1이 생체내에서 순환성 혈소판 표면으로부터 GPVI의 제거를 유도한다는것을 입증한다. 이러한 발견은 또한 바이오티닐화된 JAQ1이 주입 6시간 후 용해액에서는 검출되지만, 혈소판의 표면에서는 검출되지 않았다는 관찰로부터 지지되며, GPVI에 대해서도 동일하게 확인되었다. 추가로, 24 및 48시간 후 GPVI 및 JAQ1 모두에 대한 시그날이 감소하는 것은 국재화된 복합체가 세포내 구획에서 분해된다는 것을 강력히 제시한다. GPVI은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며 면역수용체와 밀관되며, 이중 일부는 적절하게 자극되는 경우 국재화될 수 있다(43;44). JAQ1-GPVI의 경우에 있어서, 적절한 자극이 무엇인지를 정의하는 것은 어렵지만, mAb의 Fc 부분이 국재화를 유도하는데 필요하지 않다는 것이 명확해 보이며, 이는 Fab 단편이 동일한 효과를 생성하며 이로써 또한 GPVI 클러스터화에 대한 필요성을 배제시키기 때문이다. 시험관내에서, JAQ1은 혈소판 막으로부터 GPVI의 감소 조절을 유도하지 않으며(도 5a), 이는 2차 시그날이 생체내에서 다른 세포에 의해 제공되는 이러한 과정의 유도에 필요할 수 있다는 것을 제시한다. 이러한 가정은 JAQ1 및 mAb의 Fab 단편이 일시적인 혈소판감소증을 유도한다는 관찰에 의해 지지될 수 있다. 이의 이유는 명확하지 않지만, 이는 GPIIb/IIIa의 약한 활성화로 인해 초래된 느슨한 응집의 형성 및 이의 일시적인 비장으로의 격리에 기인할 수 있으며, 비장내에서 GPVI의 실질적인 손실이 발생할 수 있다. 최근의 증거는 JAQ1이 수용체 상의 콜라겐의 주요 결합 부위로서 간주되는 GPVI 상의 CRP 결합 부위(29)와 동일하거나 매우 근접한 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. 지금까지, GPVI의 세포성 조절에 대해서는 거의 공지된 바 없지만, 최근 자료들을 근거로, 이러한 에피토프의 점유가 최종적으로 상기 수용체의 감소 조절을 초래하는 시그날을 제공할 수도 있는 것으로 보인다.

기본적인 메카니즘을 고려하지 않고, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판이 고농도의 CRP 또는 콜라겐을 사용한 활성화에 완전히 무반응성인 반면, 이들은 ADP 또는 PMA을 사용하여 정상적으로 활성화되었다. 이는 JAQ1이 마우스에서 일시적인 GPVI 결핍을 선택적으로 유도하는 반면, GPIIb/IIIa, GPIb-IX-V, CD9 및 인테그린 α₂β₁을 포함하는 다른 막 당단백질들은 발현 및/또는 기능에서 영향을 받지 않는다는 것을 강력히 제시한다. JAQ1-처리된 마우스는 연장된 출혈 시간을 가지며 이는 정상적인 지혈에서 GPVI의 중요한 역할을 입증하며 GPVI 결핍 환자에서 출혈성 소질과 매우 상관 관계가 있다(12;22). 매우 흥미롭게도, 어떤 GPVI 결핍 환자는 상기 부재하는 수용체에 대해 매우 특이적인 항체를 생성하며(45), 이는 설명하기 어렵다. 그러나, 본원에 제시된 결과를 기초로, 상기 환자는 그녀의 순환성 혈소판으로부터 자가항체-유도된 GPVI의 제거에 기초하는 후천성 GPVI 결핍을 앓을 수도 있다고 추측하는 것이 가능하다.

콜라겐-유도된 혈소판 활성화에서 이의 중요한 역할 이외에, GPVI는 또한 혈소판의 응고촉진 반응에 결정적으로 중요하게 관여하며(46), 이는 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판의 손상된 콜라겐-의존성 응고촉진 활성에 의해 입증되었다. 이러한 결과는 항-GPVI 치료가 또한 혈관 손상 부위에서 응고를 조절한다는 것을 강력하게 제시한다. 상기 항응고 활성은 GPIIb/IIIa 길항제에 대해서 입증된 바 있으며(47), 이는 최근에 혈전증에서 혈소판 참여의 가장 강력한 억제제로서 고려되고 있으며(48), 이는 이들이 세포를 자극하는 효능제와 무관하게, 혈소판 응집의 최종 공통 경로를 억제하기 때문이다. 이러한 다소 완전한 혈소판 기능 억제는 혈소판 응집이 또한 정상적인 지혈에서도 요구되기 때문에 잠재적인 안전성 위험을 동반할 수 있다는 것을 제시하였다(49). 본 발명자들은 JAQ1이 마우스에서 GPIIb/IIIa에 대한 차단성 항체 보다 유의하게 더 짧은 출혈 시간을 유도한다는 것을 확인하였으며, 이는 GPVI-결핍된 혈소판이 여전히 생체내에서 정상적인 지혈에 상당히 기여한다는 것을 제시한다. 출혈 시간과 출혈 위험 사이에는 명백한 상관 관계가 없음에도 불구하고(50), 이러한 결과들을 근거로, 항-GPVI 요법이 임상적인 출혈의 상대적으로 낮은 위험도와 관련될 수 있음을 추측해 볼 수 있다.

콜라겐-혈소판 상호작용의 메카니즘은 복잡하며 GPIb-IX-V 복합체, 인테그린 α₂β₁, GPIV, GPVI, 및 65- 및 85-kD 단백질을 포함하는 수 개의 혈소판 수용체에대한 콜라겐의 직간접적인 결합과 관련된다(51). 혈소판에 대한 콜라겐-유도된 활성화에서 이의 필수적인 역할에도 불구하고, 마우스에서 GPIb-IX-V(폰 빌레브란트 인자, vWF를 통해서) 및 인테그린 α₂β₁에 의해 매개된다고 주로 교시되는 콜라겐에 대한 부착에서 GPVI의 역할(17)에 대해서는 극히 제한적인 증거만이 존재할 뿐이었다. 마우스에서, GPVI-결핍된 혈소판은 정상적인 양의 인테그린 α₂β₁을 발현하며, β₁-인테그린은 정상적으로 활성화될 수 있으며, 이러한 활성화는 콜라겐의 효과적인 결합을 위한 예비조건으로서 보고되어져 왔다(도 4b)(52). 진정으로, GPVI-결핍 혈소판은 α₂β₁을 통해서 콜라겐에 부착되지만, 부착의 정도는 대조군 혈소판과 비교하여 매우 감소되었다. 유사한 관찰이 GPVI 결핍 환자로부터의 혈소판에서 보고된 바 있으며(12;45), 이는 GPVI이 아마도 α₂β₁의 활성화를 지지함으로써 콜라겐에 대한 정상적인 부착에 필요할 수 있다는 것을 제시한다(53). GPIb-IX-V의 발현은 JAQ1 처리에 의해 영향을 받지 않으며 상기 수용체는 보트로세틴의 존재하에서 정상 수준의 vWF를 결합시켰다(도 4a). 종합해 보면, 이러한 결과는 혈관 손상 부위에서 콜라겐에 대한 혈소판 부착이 항-GPVI 처리에 의해서 감소될 수 있지만, 차단되지는 않는다는 것을 제시한다.

매우 최근 증거는 GPVI이 혈소판 및 성숙 거핵 세포에서 배타적으로 발현된다는 것을 제시하며(17;54), 이는 JAQ1을 사용한 면역조직화학적 연구에서 입증된다. 따라서, 항-GPVI제(JAQ1 같은)의 효과는 혈소판에 제한되어져야 하며, 매우중요하게는 거핵 세포에 제한되어져야 한다. JAQ1은 항체 주입 3시간 후 비장 및 골수내 거핵 세포에서 검출가능하였으며, 이는 다음 세대의 혈소판이 상기 mAb에 의해서 또한 영향을 받는다는 것을 제시한다. 이러한 가정은 비록 마우스 혈소판의 정상적인 수명이 대략 4 내지 5일 정도임에도 불구하고(41), GPVI이 2주 이상 동안 혈소판에서는 검출되지 않았다는 사실로 입증될 수 있다. 대략 2 x 10⁹개 혈소판/마우스(10⁹개/㎖ 혈액)의 대략적인 수와 5일의 세포 수명을 근거로 하면, 6 x 10⁹개 혈소판의 GPVI 분자가 결핍되어 15일 동안 상기 수용체의 부재를 초래해야만 한다. JAQ1(MW: 150 kD) 100㎍의 양은 약 6.7 x 10¹³개 항체 분자를 제시한다. 따라서, 혈소판 당 약 1.1 x 10⁴개 항체 분자가 GPVI에 결합하여 이를 고갈시키는 것이 가능하다. GPVI의 평가된 발현율이 단지 1 내지 2 x 10³개 복사체/혈소판(55)이기 때문에, JAQ1 100㎍은 관찰된 효과를 유도하는데 충분하다.

예비 결과는 JAQ1의 최초 주입 2주 후 2차 주입은 혈소판 수에 전혀 영향을 미치지 않지만, 순환성 혈소판 상의 GPVI의 부재를 연장시킨다는 것을 나타낸다. 이는 mAb의 2차 투여는 신규하게 분화된 거핵 세포에 영향을 미치지만, 순환성(GPVI-결핍된) 혈소판에는 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, JAQ1은 수 주 동안 마우스에서 GPVI 녹아웃-유형 유전자형을 유도하는데 사용할 수 있으며, 이는 시험관내 및 생체내에서 이러한 중요한 활성화 수용체의 부재하에서혈소판의 기능을 연구하는 것을 가능하게 한다.

JAQ1-처리된 마우스에서 트롬빈 반응은 일시적으로 감소된다

JAQ1 주입 후 3일 째에 JAQ1-처리된 마우스를 응고 프로테아제 α-트롬빈을 사용하여 활성화시킨 후, α-트롬빈의 농도 증가에 대한 반응에서 GPIIb/IIIa 활성화 및 P-셀렉틴 발현을 측정한 결과, 현저하게 감소된 트롬빈 반응이 검출되었다. 반대로, 이러한 억제는 7일 및 14일째 JAQ1-처리된 마우스에서는 검출되지 않았다. 이러한 발견은 트롬빈 반응에 대한 선택적인 억제는 항-GPVI 처리시 혈소판에서 초기 단계 동안 일어난다는 것을 제시한다.

상기 억제를 보다 상세히 정의하기 위해서, JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판을 항체 주입 후 1, 2, 3, 4 및 5일째에 분석하였다. 혈소판 수의 일시적인 저하를 최소화하기 위해서, 상기 마우스에게 2시간 내에 JAQ1 33㎍를 3회 공급하였다. 이러한 처리는 1일째에 혈소판 수의 가벼운 감소를 초래하며 2일째에 정상 수준으로 회복되는데, 이때 혈소판 수는 12일 이상 동안 유지되었다. 이러한 마우스로부터의 혈소판은 1일 및 2일째에 트롬빈 반응에서 현저한 감소를 나타내며 이는 3일 및 5일 사이에서 정상으로 점진적으로 회복되었다. 반대로, 혈소판은 모든 시점에서 ADP 및 PMA를 사용하여 완전히 활성화시킬 수 있었다.

이러한 결과는 JAQ1-유도된 GPVI 국재화가 순환성 혈소판내 하나 이상의 트롬빈 수용체의 기능에 일시적으로 영향을 미친다는 것을 강력하게 제시한다. 이러한 효과는 PAR-4-활성화된 펩타이드로 자극시킨 JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판에 대한 유동 세포계수 분석에 의해 나타나는 바와 같이 PAR4 트롬빈 수용체에 대한 감소된 활성과 관련되는 것으로 확인되었다.

다음으로, JAQ1-처리된 마우스를 트롬빈-의존성 혈전색전증 모델에 적용하여 생체내에서 혈전 과정에 대한 관찰된 효과의 관련성을 측정하였다. 마취시킨 수컷 NMRI 마우스(체중 28 내지 30g)에게 재조합 사람 트롬보플라스틴(Thromborel, 제조원: Dade Behring)을 정맥내 주사하였다. 이러한 처리는 혈소판 활성화를 초래하는 혈관내 트롬빈 혈성을 개시시키는 것으로 공지되어져 있다. 이후, 이러한 트롬빈-활성화된 혈소판은 추가로 트롬빈 생성을 촉진시키고 결국에 혈관내 혈전색전증을 초래한다. 체중 ㎏ 당 150㎕의 트롬보플라스틴의 정맥내 주사는 항체 주사 1일 및 2일째에, 무관한 랫트 IgG를 예비 처리한 대조군 마우스에서 60% 사망률(12/20)을 초래하는 반면, JAQ1-처리된 마우스는 전혀 사망하지 않았다(0/20). 3일째 사망률은 35%(7/20)로, 추가로 4일째는 40%(8/20)로, 및 최종적으로 5일째에서는 대조군 수준인 65%(13/20)에 도달하였다. 이러한 발견은 생체외에서 JAQ1 처리된 마우스내에서 관찰되는 감소된 트롬빈 반응과 매우 상관 관계가 있다. 하기 변수들을 개별적인 그룹에서 대조군 및 JAQ1-처리된 마우스에서 체중 ㎏ 당 150㎕의 트롬보플라스틴 주사 2분 후 측정하였다. 혈소판 소비 및 혈장 TAT 농도는 대조군과 비교하여 JAQ1-처리된 마우스에서 유의하게 감소하였다. 다시, 이러한 효과는 JAQ1 주입 1일 및 2일째에 가장 강력하였으며 3일 내지 5일 사이에서 점진적으로 감소하였다.

종합해 보면, 이러한 발견은 마우스를 항-GPVI mAb JAQ1로 처리하는 것은 혈소판 억제의 두 가지 독특한 단계를 초래한다는 것을 입증한다: 처음 3 내지 4일 동안, 혈소판은 콜라겐 반응의 완전한 억제와 트롬빈 반응의 부분적인 억제 및 결과적으로 완전한 항혈전 보호를 나타낸다. 이러한 기간 이후에, 트롬빈 반응은 정상적으로 복귀되는 반면 콜라겐 반응은 결여된 채로 남아, 보다 온화한 항혈전 보호를 초래하게 된다.

종합해 보면, 이러한 결과들은 GPVI이 허혈성 심혈관 질환의 장기간 예방을 위한 흥미로운 표적일 수 있다는 것을 제시하며, 생체내에서 순환성 혈소판으로부터의 활성화 당단백질 수용체를 특이적으로 고갈시킬 수 있다는 최초의 증거를 제공한다. 이러한 발견은 강력하지만 안전한 차세대 항혈전제의 개발을 위한 방법을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 표적 수용체를 차단할 뿐만 아니라 비가역적으로 결핍시키는 혈소판 콜라겐 수용체에 대한 활성소, 바람직하게는 항체를 포함하는 혈전성 질환에 대한 보호를 위한 약제를 제공하는 것이다. 상기 모노클로날 항체는 혈소판에 대한 콜라겐 수용체상의 모노클로날 항체 JAQ1와 동일하거나 유사한 에피토프에 대한 이의 결합에 의해서 정의된다. 바람직하게는, 항체로서 모노클로날 항체 JAQ1이 사용되어야 한다. 바람직한 콜라겐 수용체는 혈소판 GPVI이다. 혈전성 질환에 대한 보호를 위한 각각의 사람화된 모노클로날 항체를 함유하는 약제가 가장 바람직하다.

모노클로날 항체 JAQ1은 당해 분야의 숙련자에게 숙지되어져 있는 표준 방법으로 사람화시킬 수 있다. 상기 사람화된 모노클로날 항체는 일반적으로 혈전성질환으로 위험한 환자에게 생리학적으로 허용되는 수성 주사제의 형태로 투여된다. 다른 형태의 투여가 배제되지는 않는다. 상기 모노클로날 항체는 환자의 육체적 조건에 따른 양으로 투여될 것이다. 경험있는 의사는 의도된 목적을 위한 상기 모노클로날 항체의 최적의 양을 찾아내는데 어려움이 없을 것이다.

참조 문헌

JAQ1-처리된 마우스로부터의 혈소판 상에서 당단백질 및 표면-결합된 피브리노겐의 발현. 지시된 마우스로부터의 희석된 전혈을 RT에서 15분 동안 포화 농도의 FITC-표지된 항체와 항온처리하고 혈소판을 직접적으로 분석한다. 결과는 그룹 당 6마리의 마우스에 대해서 평균 로그 형광 ±S.D.로서 나타낸다.

	대조군	JAQ1 3일째	JAQ1 7일째	JAQ1 14일째
GPIIb/IIIa	321.3 ± 9.7	318.1 ± 9.4	328.7 ± 9.1	325.3 ± 9.8
GPIb-IX	278.9 ±16.8	275.4 ±18.0	269.5 ±15.9	273.1 ±11.4
GPV	165.4 ±10.9	163.3 ±14.1	169.1 ±15.3	158.1 ±10.5
CD9	543.8 ±15.8	554.3 ±14.6	549.5 ±19.6	557.0 ±13.0
GPla(α2)	38.2 ± 6.7	40.3 ± 6.5	35.2 ± 7.8	36.7 ± 6.2
피브리노겐	14.1 ± 1.7	15.0 ± 1.4	14.3 ± 1.5	14.4 ± 1.5
P-셀렉틴	6.2 ± 0.8	6.5 ± 0.8	6.7 ± 0.8	6.0 ± 1.1

본 발명은 혈소판 상의 콜라겐 수용체의 비가역적인 불활성화 또는 분해를 유도하는 JAQ1 항체를 포함하는, 혈전성 질환에 대한 보호용 약제를 제공한다.

Claims

혈소판 상의 콜라겐 수용체의 비가역적 불활성화 또는 분해를 유도하는 활성소(active principle)를 포함함을 특징으로 하는, 혈전성 질환에 대한 보호를 위한 약제.
제1항에 있어서, 항체가 혈소판 상의 콜라겐 수용체의 비가역적 불활성화 또는 분해를 유도함을 특징으로 하는 약제.
제1항에 있어서, 모노클로날 항체 JAQ1을 포함함을 특징으로 하는 약제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 혈소판 콜라겐 수용체 GPVI에 대한 항체를 함유함을 특징으로 하는 약제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사람화된 모노클로날 항체 JAQ1을 함유함을 특징으로 하는 약제.
GPVI 에피토프에 대해 지시된 표지된 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체, 바람직하게는 JAQ1로 정의되는 항체를 함유함을 특징으로 하는, 콜라겐 수용체 GPVI의 발현율을 측정하기 위한 진단제.
a) 환자의 혈액 샘플을 표면에 항체 JAQ1을 고정시킨 고체 캐리어와 항온처리하고, 캐리어를 세척하고, 이를 제2 표지된 항체 JAQ1과 항온처리하고, 다시 캐리어를 세척하고, 제2 표지된 항체의 시그날을 측정하거나,

b) 환자의 혈액 샘플을 고체 캐리어에 고정시킨 후 표지된 항체 JAQ1 단독 또는 표지되지 않은 항체 JAQ1과의 혼합물로 처리하고, 후속적으로 표지된 항체를 검출하거나; 또는

c) 모노클로날 항체 JAQ1을 고체 캐리어에 고정시킨 후 표지된 항체 JAQ1과 함께 시험하고자 하는 혈액 샘플과 접촉시키고, 캐리어를 세척하고 표지된 항체의 시그날을 측정함을 특징으로 하는, 혈액 중 콜라겐 수용체 GPVI의 발현율을 측정하는 방법.
제7항에 있어서, 유동 세포계수기에서 형광-표지된 모노클로날 항체 JAQ1을 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
모노클로날 항체 JAQ1의 생산을 위한 기탁 번호 제DSM ACC 2487호인 하이브리도마 세포주.
혈소판의 콜라겐 수용체상에서 모노클로날 항체 JAQ1과 동일하거나 유사한 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
혈전성 질환에 대한 약제 제조를 위한, 혈소판 상의 콜라겐 수용체의 비가역적인 불활성화 또는 분해를 유도하는 활성소의 용도.
제11항에 있어서, 활성소가 모노클로날 항체인 용도.
제11항 또는 제12항에 있어서, 활성소가 모노클로날 항체 JAQ1인 용도.