CN102026659A - 通过抑制gpvi预防和治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于预防和或治疗癌症的GPVI抑制剂并且还提供了这种GPVI抑制剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本发明的另一个方面是包含GPVI抑制剂的药物制剂，其适合于治疗癌症，优选皮肤癌，更优选黑素瘤，且更优选恶性皮肤黑素瘤。

Description

通过抑制GPVI预防和治疗癌症的方法
癌症仍然代表对药物的关键挑战之一。今年以来，大量研究已经产生了对具体类型癌症的特异性疗法的选择。使用特异性疗法所治疗的具体恶性肿瘤的实例是用
Figure BPA00001249572500011
治疗的乳腺癌，并且就其他变化形式而言，例如进行性直肠或肺癌，使用
Figure BPA00001249572500012
治疗，进行性直肠癌或头颈癌，使用
Figure BPA00001249572500013
治疗，慢性淋巴细胞性白血病使用治疗，或滤泡性非何杰金淋巴瘤，使用
Figure BPA00001249572500015
治疗。而这些特异性疗法中没有一种能够完全替代传统的化疗或外科手术。事实上，大部分新疗法就其自身而言并非充分有效，因此，需要化疗作为共同疗法。另一方面，化疗不可避免地带来严重和可能的严重副作用负担。简言之，癌症的治疗选择仍然有限，并且即使可利用，则与其他威胁生命疾病例如心血管疾病的标准疗法相比，基本上可接受程度较低。
尽管治疗癌症的治疗选择有限并且与不良副作用相关，但是就一些极具侵害性的恶性肿瘤而言，病程进展如此之快，以致于诊断时通常已太晚以致于甚至无法根据直接开始的传统疗法预测合理的有益性。
这些侵害性变化形式之一是恶性皮肤黑素瘤，即一种皮肤癌。已经针对这种黑素瘤的发展鉴定了几个危险因素。除遗传素质外，皮肤-品质和毛发-颜色也起作用。最常见的影响是浅肤色的人，即具有光敏类型皮肤。特别的风险是淡红色毛发-颜色的基因。与具有这些易患病的体质的人的风险相比，深肤色的人发生皮肤癌的风险仅为10％。这种类型癌症的发展不仅快速，而且所影响的患者数量较大。每年仅在德国就有大约15.000个新病例，并且约2.000患者死于其后果。这一结果显著高于因其他皮肤肿瘤导致的全部死亡率，且目前来自黑素瘤的死亡率快速增加，高于任何其他癌症的死亡率。如果在最早期诊断，则通过完全手术除去原发性肿瘤的长期治愈率仍然较高。然而，与其他恶性肿瘤相反，在诊断为该病时，它典型地已经通过转移广泛在体内扩散。然后手术除去再也不可能了，由此迄今为止保持放疗或全身化疗作为唯一的不充分的有效治疗策略。这种高度的侵害性和转移性使得恶性黑素瘤与其他形式的皮肤癌以及一般癌症的其他变化形式相比都极具致命性。其他恶性肿瘤在发展阶段的转移类似地对该病的未来过程具有破坏性。因此，在检测到循环黑素瘤或其他癌细胞的患者中，预后更差。一旦影响了多个器官，则用目前治疗干预的成功机会就会明显下降。与癌症类型和具体肿瘤发生转移时的点无关，恶性肿瘤细胞典型地通过血管系统扩散。
血小板在止血和血栓形成过程中起关键作用。它们因其与内皮下胶原蛋白的相互作用而停止在损害部位并且在那里变活化，从而覆盖损害。胶原蛋白与血小板的相互作用主要由如下三种受体介导：1)主要作用在于使血小板与胶原蛋白粘附的α2β1整联蛋白受体；2)通过Von Willebrand Factor(VWF)间接结合到胶原蛋白受体的GPIb-V-IX；和3)GPVI，即信号传导受体，它在结合胶原蛋白时活化血小板。GPVI是免疫受体家族成员并且在血小板上与Fc受体γ链(FcRγ)共同表达。结合配体的GPVI导致血小板活化且由此介导血小板聚集(Varga-Szabo D.等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2008，Vol.28(3)，403-412)。最初α2β1和GPIb-V-IX受体以及GPVI一起被视为预防因心血管疾病或其他疾病导致的动脉血栓形成的富有希望的靶标(Clemetson K.J.等人，2007，Curr.Pharm.Des.，vol.13(26)，2673-2683))。GPVI是最富有希望的治疗靶标，因为单一治疗可以导致GPVI长期缺失或抑制(Nieswandt B.等人，J.Exp.Med.2001、Vol.193(4)：459-469)。
由于血小板和胶原蛋白的相互作用在止血和血栓形成过程中起关键作用，所以并不令人意外的是，抑制这三种胶原蛋白受体产生抗血栓形成效果。除血小板在血栓形成和止血方面的功能外，近来还将它们鉴定为癌生长和转移中的重要参与者。由于胶原蛋白-受体抑制的类似抗血栓形成效果，所以可以预料抑制所述受体在癌生长和转移中类似的后果。给予阻断α2β1整联蛋白受体的抗体会支持癌细胞溢出，即增加癌细胞数量，这可以导致它们离开血流且然后这种阻断增加形成的肿瘤数量(Hangan D.等人，Cancer Res.1996，Vol.1，56(13)，3142-3149)。类似地，肺中B16黑素瘤转移灶的数量在VWF-敲除小鼠中高于野生型小鼠，即可以通过用VWF取代小鼠逆转效果(Terraube V.等人，J.Thromb.Haemost.2006，Vol.4(3)，519-526)。因此，预计抑制GPVI还可以具有促进癌症的效果。目前本文概括的数据令人意外地显示相反的结果：抑制GPVI不仅显著减少癌细胞生长，而且减少相应癌细胞转移。
所谓″抑制GPVI″在本发明中的含义如下：GPVI正常功能的任何防止，任何例如通过防止结合激动剂，或通过配体防止GPVI活化或通过使细胞或细胞碎片表面上的GPVI失活或不可逆耗尽。
所谓″GPVI抑制剂″在本发明中的含义如下：如果对哺乳动物给药则导致如上述所定义的″GPVI抑制″的任意化合物。
抑制GPVI可以因各种机制、例如因抗-GPVI自身抗体导致的获得性GPVI缺陷或遗传性先天性缺陷导致，其中GPVI不被表达或以具有缺陷性胞内信号传导和内源性血小板金属蛋白酶活化的功能失调形式被表达，从而导致胞外域脱落(Arthur J.F.等人，Br.J.Haematol.2007，Vol.139(3)，363-372)。
本发明GPVI抑制剂的活性成分可以是小化学化合物、肽类、多肽类或单克隆或多克隆抗体。作为非限制性实例，可以将GPVI抑制剂分类如下：
□在结合GPVI时导致GPVI从细胞表面耗尽的GPVI配体，例如抗体及其片段，例如scFv、Fab、Fv、dAb、Fd或结合GPVI的双抗体，例如：
■JAQ1(EP20010101406)
■F1232-10-2、F-1232-21-1、F-1232-7-1、F-1232-19-1、F-1232-37-2、F-1232-18、F-1232-17-1、F-1232-18-3、F-1232-14-2、F-1232-24-1、F-1201-20，F-1232-43-3、F-1201-18、F1199-6、F1232-37-2、YA-Abs-88、YA-Abs-03、F-1249-18-2、F-1245-7-1、F-1246-1-1、F-1249-5-1、F-1249-20-1、F-1249-24-1、F-1249-30-1、F-1245-5-1、F-1246-6-2、F-1249-3-2、F-1245-4-1、F-1249-22-1、F-1251-1-1、F-1257-3-1、F-1232-37-2，F1239-6-1(WO/2006/118350)
■F1239-1-3、F1239-2-3、F1239-4-2、F1239-5-3、F1239-7-1、F1239-8-1、F1239-8-1、F1239-10-2，F1239-11-1、F1239-15-3、F1239-16-3、F1239-17-2、F1239-18-1、F1239-19-1、F1239-22-2、F1239-22-3、F1239-23-1(WO/2007/116779)
■hGP 5C4(PCT/EP2004/013779)
■10B12，16E12，1C3，8A1、4H9，4D 5(WO/2003/054020)
■8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J 24.2、6E12.3、1P10.2、4L7.3、7H4.6、9012.2(WO 2001/000810)
□导致GPVI蛋白水解失活例如金属蛋白酶失活的GPVI的配体。(Bergmeier W.等人，Thromb.Haemost.2004.Vol.91(5)：951-958)。
□抑制GPVI功能、但不通过防止如下情况导致GPVI从细胞表面耗尽的配体：
ο配体受体识别和/或
ο与胞外基质相互作用和/或
ο例如通过用GPVI或其片段掩蔽GPV I胶原蛋白结合位点来与胶原蛋白发生相互作用(WO/2001/16321、WO/2006/131512、WO/2003/008454、WO/2001/000810、WO/2000/068377、WO/2000/68377)和/或
ο血小板细胞相互作用
□例如通过抑制活化的GPV I引起的信号传导级联减少不依赖于如上所述机制的GPVI功能的配体
ο例如通过防止涉及胞内信号传导途径的蛋白质例如Syk激酶、c-Src、蛋白激酶c、磷脂酶Cγ2、Fc受体γ磷酸化。
本发明的GPVI抑制剂可以通过常规化学合成制备，或就单克隆或多克隆抗体或片段而言，通过本领域众所周知的重组方法制备(例如，参见Benny K.C.Lo，″Antibody engineering，methods and protocols，Humana press，2003)。还可以通过免疫接种GPVI或GPVI片段使动物的多克隆抗体升高，然后纯化。
在污染分子方面，优选将本发明的GPVI抑制剂纯化至大于80％纯度，更优选大于95％纯度，且特别优选药学纯度状态即、大于99.9％纯度，例如，如果GPVI抑制剂是来自污染大分子的肽或多肽，特别是其他蛋白质和核酸，且不含传染原和致热原。优选本发明的经分离或纯化的GPVI抑制剂基本上不含其他多肽类。
本发明提供了如本文所述的用于预防和或治疗癌症的GPVI抑制剂，并且还涉及这种GPVI抑制剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。因此，本发明的另一个方面提供了药物制剂，包括该抑制剂，其适合于治疗癌症，优选皮肤癌，更优选黑素瘤，且更优选恶性皮肤黑素瘤。
可以将本发明所述的抑制剂配制成用于治疗用途的药物制剂。可以将经纯化的蛋白质溶于可以任选加入制成药物制剂的药用赋形剂的常用生理相容性含水缓冲液。
这种药用载体和赋形剂以及适合的药物制剂是本领域众所周知的(例如，参见″Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins″，Frokjaer等人，Taylor & Francis(2000)或″Handbook of Pharmaceutical Excipients″，第3版，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。特别地，可以将包含本发明多肽的药物组合物配制成冻干或稳定可溶形式。可以通过本领域公知的各种方法将多肽冻干。在使用前通过添加一种或多种药学可接受的稀释剂例如注射用水或无菌生理盐水溶液再溶解冻干制剂。
通过任意药学适合的给药方式递送组合物制剂。各种递送系统是公知的并且可以用于通过任意便利途径给予组合物。优选通过全身给予本发明的组合物。对全身应用而言，可以根据常规方法配制用于胃肠外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内或透皮)或肠(例如口服、阴道或直肠)递送的本发明治疗蛋白。最优选的给药途径是基于多肽类的GPVI抑制剂的静脉内给药。可以通过输注或通过快速浓注(bolus injection)连续给予制剂。一些制剂包括缓释系统。
就基于小分子而言的GPVI抑制剂，口服给药是最优选的给药方式。用于口服给药的片剂和胶囊可以包含常用赋形剂例如粘合剂、填充剂、润滑剂和湿润剂等。口服液体制剂可以是水或油混悬液、溶液、乳剂、糖浆剂、酏剂等形式，或可以将它们制成用水或其他适合载体再溶解使用的干燥产品。这种液体制剂可以包含常用添加剂，例如助悬剂、乳化剂、非水载体和防腐剂。
适合于局部施用的制剂可以是水或油混悬液、溶液、乳剂、凝胶或优选乳剂软膏剂形式。用于喷雾施用的制剂可以是可喷雾液体或干粉。
以治疗有效剂量对患者给予本发明的GPVI抑制剂，即足以产生期望效果、预防或减轻所治疗疾病或适应征的严重性或扩散的剂量，但不是产生不可耐受的不良副作用的剂量。确切剂量取决于许多因素，例如适应征、制剂和给药方式并且必须在前期临床和临床试验中对每一相应适应征确定。
可以将本发明的药物组合物单独给予或与其他治疗剂联合给予。可以将这些活性剂作为组成部分掺入同一药物。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备用于同时、分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤的药物制剂中的应用。
本发明的另一个方面在于可通过实施例3所述方法鉴定的抑制剂在抑制也是GPVI信号传导级联下游的成分中的应用。
本发明的另一个实施方案在于鉴定GPVI抑制剂的方法，该方法包括下列步骤：
a)将适量的可能的GPVI抑制剂加入到哺乳动物、优选获自人或标准实验室动物种类例如小鼠的富含血小板的血浆中；
b)任选将步骤(a)的富含血小板的血浆与可能的GPVI抑制剂一起温育；
c)通过添加胶原蛋白相关肽或convulxin或胶原蛋白来启动血小板聚集，以通过GPVI-介导的信号传导诱导血小板聚集；
d)比较如步骤(c)中测定的聚集与将胶原蛋白相关肽或convulxin或特异性较低胶原蛋白加入到富含血小板的血浆中、但不加入步骤(a)的可能的GPVI抑制剂时得到的聚集。
如果如步骤(a)中所述的当加入可能的GPVI抑制剂时，血小板聚集受到损害，则该化合物是本发明的GPVI抑制剂。可以在对照实验中进一步测试这种GPVI抑制剂的特异性，其中将GPVI抑制剂施用于富含血小板的血浆，优选自如第一步中那样的相同的生物体，但其中GPVI缺陷。可以通过GPVI的遗传缺陷例如GPVI敲除小鼠(Kato K，Kanaji T，Russell S，等人，Blood.2003；102：1701-1707)或通过导致GPVI活性基本上下降例如使基因沉默或例如siRNA这样的技术实现这种缺陷。这种缺陷可能不一定需要是完全的。如果用替代的激动剂而非胶原蛋白相关肽、convulxin或特异性较低的胶原蛋白、通过其他非GPVI的受体例如ADP、凝血酶或花生四烯酸等活化血小板诱导聚集时，加入的化合物仍然损害这种制剂的聚集，则该化合物(尽管它抑制GPVI)对GPVI没有特异性。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备同时、分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤的联用药物制剂中的应用。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种治疗化合物的组合物，所述的另一种治疗化合物不是GPVI抑制剂，该组合物用于同时、分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种治疗化合物的联用组合物，所述的另一种治疗化合物不是GPVI抑制剂，该组合物用于同时、分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤。
因为GPVI抑制具有经证实的抗血栓形成效果并且已经证实其不会导致出血风险，所以使用GPVI抑制剂的治疗干预可以对不一定面临增加的出血并发症风险的患者、例如进行常规外科手术的癌症患者具有特别的有益性。
特别是对癌症患者而言，GPVI抑制可以因抗血栓形成和抗癌效果而具有协同作用。因此，甚至对患有血栓形成风险增加的癌症患者也是如此。
图：
图1：静脉内给予5x104 B16细胞后2周与阴性(载体治疗的)对照组相比通过GPVI抑制在小鼠中癌症发生率的减少。
图2：静脉内给予1x106 B16细胞后2周载体治疗的小鼠的肺。
图3：静脉内给予1x106 B16细胞后2周使用GPVI抑制的小鼠的肺。
图4：静脉内给予1.5x106 B16细胞后2周肺集落的数量(n＝5-10/组，各结果，线连接的组平均值)。
图5：B 16注射前或之后用载体(阴性对照)治疗后或GPVI抑制有限期限后B16输注小鼠的存活率(n＝9-10/组)。
图6：B16注射前或之后用载体(阴性对照)治疗后或GPVI抑制有限期限后B16输注小鼠的体重(平均值，n＝9-10/组)。
实施例：
实施例1：
第一组实验的目的在于评价以三种不同细胞数量静脉内注射B16细胞后用结合到GPVI的单克隆抗体JAQ1治疗C57BI6小鼠是否可以预防肺中B16黑素瘤集落生长。
按照如下方式完成用于测试该推定的模型。为了使癌细胞增殖，在无菌条件下由购自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)的深度冷冻储备溶液制备B16细胞。缓慢融化细胞，用培养基重新混悬。用色氨酸蓝检查1x106 B16细胞的存活率。就第一次增殖而言，将它们经皮下注入C57BI6小鼠。2周后，取出得到的皮下肿瘤，用胶原酶分离肿瘤细胞。在体外再次增殖细胞。简言之，将分离的细胞转入充满相应介质的培养皿。一旦细胞增殖到可目视检测的阶段，则使用胰蛋白酶使粘连细胞移动。在该阶段，照此进行另一体外增殖，或将细胞经静脉内注入C57BI6测试小鼠尾静脉，以测试GPVI抑制剂的治疗效果。将小鼠(Charles River)保持在标准放置条件下。这种皮肤癌动物模型的关键终点如下：
1)发现具有肿瘤的治疗组中的动物百分比(发生率)；
2)死亡率(死于肿瘤或发现濒临死亡的动物数量并且处死)；
3)在相应治疗组中每只动物肺上发现的肿瘤和转移灶的平均数量。
尽管肿瘤也在皮肤中生长，但是它们在小鼠肺上可以得到最佳定量，这是因肿瘤的深棕色与黑色之间的反差代表与浅色肺组织的强烈反差的情况所致。针对深色皮肤的背景，这种分析的可靠性可能较低。此外，大部分注射的细胞被俘获在肺微血管系统中，与血管内皮粘着。
测试小鼠的治疗方案如表1详细描述。JAQ1或盐水(作为阴性对照)载体的剂量对全部小鼠而言均相同。治疗在注射B16细胞之前4或1天开始，如表1详细描述的持续进行。给小鼠注射三种不同数量的B16细胞：5x104、1x106或1，5x106。约2周后，处死动物，测定肺中B16集落的数量。用JAQ1单一治疗耗尽了GPVI达约5天的延长期限(Nieswandt B.等人，J.Exp.Med.2001、Vol.193(4)：459-469)。选择的重复短间隔方案确保GPVI的耗尽在本实验过程中完成。
表1：治疗组
如果注射的B16细胞数量低(5x104 B16细胞/小鼠，A组)，则在静脉内输注B16细胞前1天开始用JAQ1治疗使发生B16肺集落的动物数量从82％显著减少至恰好18％(表2，图1)。肺中集落的数量也因这种治疗而类似地减少。
表2：静脉内5x104 B16细胞/小鼠后14天的肺集落(A组，n＝11/组，平均值±SD)
Figure BPA00001249572500102
在注射的B16细胞数量增加到约20x时(1x106 B16细胞/小鼠，B组)，全部盐水治疗的小鼠显示集落，但其数量如此之高，以至于无法对它们进行可靠地计数。与A组的另一差异在于治疗早于A组3天开始，即B16细胞输注前4天。此外，在这一侵害性的情况下，就B16输注而言，JAQ1治疗导致B16肺集落明显减少。盐水治疗小鼠肺上的集落数量如此之高(＞100)，以至于无法对它们进行可靠地计数，由此，图2和3显示载体治疗的器官的图像和清楚地显示JAQ1注射治疗效果的JAQ1治疗的小鼠图像(表3)。
表3：静脉内给予1x106 B16细胞/小鼠后2周的肺集落(B组，n＝11/组，平均值±SD)
Figure BPA00001249572500111
在重复实验中，为了证实这一发现针对模型偶发的变化的情况下的稳定性，增殖的B16细胞在体外的恶性逐步变得小于B组。这使得进一步增加至1.5x106细胞/小鼠(C组)。治疗方案与B组相同。此外，在这种细胞负荷越高、侵害性细胞越少时，B16细胞输注前4天开始的JAQ1治疗仍然导致肺集落明显减少(表4，图4)。
表4：静脉内给予1，5x106 B16细胞/小鼠后2周的肺集落(C组，n＝5-10/组，平均值±SD)
Figure BPA00001249572500112
这组数据一起表明JAQ1治疗减少了黑素瘤集落的数量。
通过这种机制可以推断GPVI抑制导致这种保护作用。它可以由几种机制介导。它可以因防止实验开始时注射的恶性肿瘤细胞阻滞导致。然而，肿瘤减少还可以因预防受阻滞的细胞生长导致，这些细胞从最初的肿瘤中释放、即转移，所述肿瘤是因实验开始时的输注生成的。然而，尚无理由推定循环细胞的起源确定其进一步的命运，即最初的输注已经反映出在小鼠中生长的肿瘤转移的情况。此外，还合理地显示出GPV I缺陷抑制肿瘤生长，由此延缓转移开始时的时间点或因GPVI缺陷而抑制了将转移细胞释放入循环的过程。
实施例2：
第一个实施例中概括的数据显示GPVI耗尽不仅明显减少了肿瘤生长，而且将转移减少到最低限度。然而，在注射恶性肿瘤细胞前诱导受体耗尽。然而，尚无癌症证据表明预防性GPVI抑制可以代表潜在临床环境相对罕见的情况。在第二个实施例中测试的推定由此是GPVI抑制是否也是有效的，条件是在输注恶性肿瘤细胞后开始，由此不仅能够预防癌症，而且能够在已经确诊癌症后治疗。为了评价这一问题，将临床最相关的终点、即死亡率用于确定功效，而不仅仅是及时确定一个具体时间点时的集落数量。此外，对最坏情况的方案选择短期疗法。如表5中详细描述的那样治疗在该实施例中的C57BI6小鼠。作为实施例1的变化形式和及时与疗法开始时的潜在影响直接比较，通过两种治疗方案评价JAQ1的效果。一种在输注恶性肿瘤细胞前4天开始，即与实施例1相同；第二种方案在输注B16细胞后8小时开始，即不再出现任何自由循环的癌细胞时的时间点。因此，即使不是全部，也可以推定决大多数恶性肿瘤细胞已经受阻或与内皮粘附或已经在通过血管壁外渗后侵入周围组织。这是重要的，以便确定治疗效果是依赖于肺微血管系统中肿瘤细胞的保留减少，还是由独立的机制介导，例如涉及外渗和成功转移这样的机制。
用JAQ1治疗限于约1周。设计治疗方案用于确保给药后的显著GPVI抑制。在约3-4天的期限内，这种单一治疗得到的抑制是完全的，而一旦增加数量的完全活性态的血小板从其先祖细胞中释放并且受抑制的血小板被清除，则这种抑制开始衰减，由此其在循环中的比例也相应改变。在最后治疗后约1周后，GPVI抑制水平相当小并且推定在这种情况下无关紧要。因此，在本实施例中GPVI抑制维持到死亡为止，但限于输注恶性肿瘤细胞后至少第一周。因此，直到死亡时的大部分观察期(到死亡时典型地3-4周中的约2-3周)，两个治疗组中的动物实际上未治疗。
表5：治疗组
Figure BPA00001249572500131
尽管治疗期限十分短，但是GPVI抑制明显延缓了死亡(表6和图5)。死亡率也显示十分类似，条件是GPVI抑制在输注B16细胞之前或之后开始。体重的时程相当于最初肿瘤块生长，然后是恶化的一般条件(图6)。
表6：静脉内给予5x105 B16黑素瘤细胞后的存活率
  时间点[天]   载体   JAQ1治疗前   JAQ1治疗后
  第17天   100％   100％   100％
  第18天   90％   100％   100％
  第19天   90％   100％   100％
  第20天   80％   100％   100％
  第21天   70％   100％   100％
  第22天   50％   100％   90％
  第23天   40％   67％   80％
  第24天   20％   56％   40％
  第25天   0   44％   30％
  第26天   0   33％   20％
  第27天   0   22％   10％
  第28天   0   0   0
在本实施例中的预治疗效果证实了上述实施例1提供的证据，显示GPVI抑制减少肿瘤生长和/或转移。
仅基于实施例1，GPVI抑制的抗癌效果也可以通过抑制GPVI的抗血栓形成效果来解释，因为癌细胞增殖可以依赖于癌细胞诱导凝固的潜能，这种凝固支持癌细胞在微脉管系统中的保留增加，且由此增加其外渗的机会。例如，报道了对抗凝或纤维蛋白原-缺陷动物的有益效果(Amirkhosravi A.等人，J.Thrombosis Haemostasis，2003，Vol.1，1972-1976；Palumbo J.S.，Cancer Research，2002，Vol.62，6966-6972)。
相反，实施例2显示在恶性肿瘤细胞输注时无论GPVI抑制是否存在，还是此后被诱导，都没有显著性差异。因此，这些数据显示，即使在肺中捕集到癌细胞和甚至外渗已经完成时(例如在GPVI抑制剂的抗血栓形成效果的重要性可能较低时)开始疗法，但是仍然可以得到最大的抗癌、抗转移效果。
本实施例还证明，GPVI耗尽的小鼠的死亡延缓与肿瘤减少平行发生。重要的是，在对这种最坏情况的方案也选择十分短期的GPVI抑制，则治疗带来明显的死亡延迟。在GPVI连续抑制的情况下，预计治疗效果甚至更为显著。
实施例3：
第三个实施例示例了GPVI抑制的治疗效果不依赖于抑制剂的性质。可以通过将适合浓度的可能的抑制剂加入到哺乳动物、优选获自人或标准实验室动物种类例如小鼠的富含血小板的血浆中来鉴定抑制性化合物。在适合的温育期限后，如EP1228768中所述，通过添加胶原蛋白相关肽或convulxin或特异性较低的胶原蛋白启动血小板聚集。使用这些化合物，因为它们通过GPVI-介导的信号传导诱导血小板聚集(Nieswandt B，Watson SP.，Blood.2003；15：102：449-461)。如果聚集受到损害，则所用化合物或方法抑制GPVI或GPVI活化的下游信号传导级联成分。在第二步中，作为对照实验，将可能的GPVI抑制剂施用于富含血小板的血浆，优选选自与第一步相同的生物体，但其中GPVI是缺乏的。这种缺乏可以通过GPVI的遗传性缺陷例如GPVI敲除小鼠(Kato K，Kanaji T，RussellS，等人，Blood.2003；102：1701-1707)或通过导致GPVI活性实质性地降低的其他手段例如使基因沉默或例如siRNA这样的技术得到。这种缺陷可能不一定是完全的。如果当是通过其他非GPVI的受体例如ADP、凝血酶或花生四烯酸等活化血小板的可替代激动剂诱导聚集时，加入的化合物仍然损害这种制剂的聚集，则该化合物(尽管它抑制GPVI)对GPVI没有特异性。
抑制GPVI的小的化学化合物的具体实例是EXP3179，即血管紧张素II 1型受体拮抗剂氯沙坦的代谢物(Grothusen C，Umbreen S等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol.2007 May；27(5)：1184-90)。通过反复给予或其他手段例如连续输注，可以达到小鼠血浆水平，从而确保不间断的高水平GPVI抑制。可以通过对胶原蛋白诱导的血小板聚集进行定量来测试是否达到高水平抑制。
为了评价GPVI抑制剂例如EXP3179是否也预防癌症例如黑素瘤，用EXP3179预治疗一组约10只小鼠，直到达到足够的GPVI抑制为止。优选其为至少25％或至少50％或至少75或至少90％。用于本研究的适合放置条件和小鼠品系详细描述在实施例1中。接下来如实施例1所详细描述的那样通过静脉内输注B16细胞，可能还有一定范围的不同细胞数量或还具有可变恶性的细胞。在用GPVI抑制剂例如EXP3179连续治疗条件下，将小鼠观察适当期限，约1周以上，同时记录小鼠存活。在观察期结束时，处死小鼠并且对实施例1中举出的终点进行定量。作为参比，将类似大组的小鼠保持在相同条件下并且以相同方式治疗，除了输注溶液不含B16细胞之外。与该对照组的比较显示使用抑制剂例如EXP3179的GPVI抑制在减少肿瘤和转移灶生长方面类似地有效，附带改善的存活率，就如同使用例如JAQ1这样的抑制剂一样。
在第二种手段中，在诊断癌症后可以研究用GPVI抑制剂例如EXP3179治疗的患者的临床更相关的情况。这与实施例1中所述的预防环境互补-在已输注癌细胞后存在完全抑制。在这种实施例2中概述的真实治疗环境中，在用适合的GPVI抑制剂治疗前诱导癌症(通过输注B16细胞)发生。终点的定量保持相同。此外，在这种治疗情况中，观察到肿瘤和转移灶生长减少，附带存活率改善。
在通过GPVI抑制来预防和治疗癌症的方法方面，评价GPVI抑制有益性的潜在可替代手段可以是使用GPVI敲除小鼠。然而，存在几个基本方面使得这种手段不同于使用导致GPVI功能抑制的有完整GPVI的小鼠的治疗。严格地说，GPVI敲除小鼠的应用仅反映出一种GPVI基因破坏的患者，这是一种罕见情况(就综述而言，参见：Arthur JF，Dunkley S，Andrews RK..Br J Haematol.2007 Nov；139(3)：363-72.)。这种情况的特征在于在癌症的发展过程中GPVI缺陷已经存在。因此，它反映出在预防性GPVI抑制治疗下、然而仍然发生了癌症的患者的情况。这种情况甚至在具有完全GPVI缺陷的患者中更加显而易见(也由GPVI敲除小鼠反映出)。目的在于在这种患者中降低GPVI活性的疗法可能没有意义。相反，本发明显示在最初GPVI活性并未受到抑制的具有GPVI活性的个体中GPVI抑制不仅具有以预防方式预防癌症的潜能，而且更可以在诊断癌症后以治疗方式治疗癌症。如实施例2所示，如果在诊断该病后启动这种治疗，则GPVI抑制也是有效的，由此可以作为治疗手段。
因此，可以推断GPVI抑制不仅可以有效地作为预防性治疗手段，而且在具有确诊的黑素瘤的患者中和转移是明显过程的阶段中也是治疗手段。因为血小板是启动血管重塑的主要参与者(Massberg等人，J.Exp.Med.，2006，Vol.203(5)：1221-1233)，所以GPVI耗尽可以通过干扰或抑制几种机制来进行，这些机制例如涉及癌生长所需的新生血管发生或癌细胞转移即扩散、阻滞或侵入这样的机制。因此，耗尽GPVI的药剂或抑制GPVI的药剂或通过其他方式防止GPVI功能的药剂可以用作新的抗癌/抗转移药。它们可以对不必须面临出血并发症的增加的风险的患者具有特别的有益性。

Claims (14)

1.)GPVI抑制剂在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
2.)用于预防和/或治疗癌症的GPVI抑制剂。
3.)权利要求1的应用或权利要求2的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中GPVI是人GPVI。
4.)权利要求1和3的应用或权利要求2和3的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中所述癌症类型是皮肤癌。
5.)权利要求1、3和4的应用或权利要求2和4的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中所述癌症类型是黑素瘤。
6.)权利要求1和3-5的应用或权利要求2-5的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中所述癌症类型是恶性皮肤黑素瘤。
7.)权利要求1和3-6的应用或权利要求2-6的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中GPVI抑制剂是抗体。
8.)权利要求1和3-7的应用或权利要求2-7的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中GPVI抑制剂是单克隆抗体JAQ 1。
9.)权利要求1和3-6的应用或权利要求2-6的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中GPVI抑制剂是小分子。
10.)包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备用于同时、分别或依次用于癌症疗法的药物制剂中的应用。
11.)包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备用于同时、分别或依次用于皮肤癌疗法的联用药物制剂中的应用。
12.)组合物，其包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种不是GPVI抑制剂的治疗化合物，它们同时、分别或依次用于癌症疗法。
13.)联用组合物，其包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种不是GPVI抑制剂的治疗化合物，它们同时、分别或依次用于皮肤癌疗法。
14.)鉴定GPVI抑制剂的方法，包括下列步骤：
a)将适量的可能的GPVI抑制剂加入到哺乳动物的富含血小板的血浆中；
b)任选将步骤(a)的富含血小板的血浆与可能的GPVI抑制剂一起温育；
c)通过添加胶原蛋白相关肽或convulxin或胶原蛋白启动血小板聚集，以通过GPVI-介导的信号传导诱导血小板聚集；
d)比较如步骤(c)中测定的聚集与将胶原蛋白相关肽或convulxin或胶原蛋白加入到富含血小板的血浆中、但不加入步骤(a)的可能的GPVI抑制剂时得到的聚集。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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