KR20100134677A

KR20100134677A - Ｇｐｖｉ의 억제에 의한 암의 예방 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20100134677A
Application number: KR1020107023363A
Authority: KR
Inventors: 울리히 크론탈러; 베른하르트 니스반트
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2010-12-23
Also published as: US20120039901A1; WO2009129980A1; JP2011518203A; AU2009240269A1; EP2279000A1; US20110044993A1; CA2722018A1; CN102026659A

Abstract

본 발명은 암 예방 및/또는 치료용 GPVI 억제제 및 암 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에 있어서 GPVI 억제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 추가의 양상은 암, 바람직하게는 피부암, 더욱 바람직하게는 흑색종, 가장 바람직하게는 악성 피부 흑색종의 치료에 적합한 GPVI 억제제를 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다.

Description

ＧＰＶＩ의 억제에 의한 암의 예방 및 치료 방법{Method for the prevention and treatment of cancer by inhibition of GPVI}

암은 약제(medicament)에 있어 여전히 주요한 과제 중 하나이다. 최근 수년에 걸쳐서, 실질적인 연구 결과 특정 유형의 암에 대해 특정 치료법을 선택할 수 있게 되었다. 특정 치료법으로 치료될 특정 악성종양의 예에는, Herceptin^®에 의해 치료되는 유방암, 및 다른 변이체, 예를 들어 Avastin^®에 의해 치료되는 진행된 직장암 또는 폐암, Erbitux^®를 사용하는 진행된 직장암 또는 두경부암, MabCampath^®을 사용하는 만성 림프성 백혈병 또는 Zevalin^®에 의해 치료되는 여포성 비호지킨 림프종이 있다. 그러나, 이들 특정 치료법 중 어떠한 것도 종래의 화학요법 또는 외과적 시술을 완전히 대체할 수 없었다. 사실, 대부분의 새로운 치료법은 단독으로는 충분히 효과적이지 않아서 공동-투약으로서 화합요법을 필요로 한다. 화학요법은 다른 한편으로 불가피하게 중증의 가능하게는 심각한 부작용의 부담을 초래한다. 간단히 설명하여, 암에 대한 치료 선택은 여전히 제한적이며, 효력이 있다고 하더라도, 심혈관 질환과 같은 다른 생명 위협적인 질환의 표준 치료법과 비교하여 실질적으로 덜 만족스럽다.

암을 치료하기 위한 치료적 선택사항에 대한 선택이 제한적이며 유해한 부작용과 관련되는 한편, 일부 매우 공격적인 악성종양에 대해서는 질환 진행이 매우 빠르기 때문에, 종종 진단이 너무 늦어져 종래의 치료법으로의 즉각적인 조치에도 불구하고 적당한 이득을 예측할 수 없다.

이러한 공격적인 변이체 중의 하나가 피부암인 악성의 피부 흑색종이다. 이러한 흑색종의 발병에 대해 수개의 위험 요소가 확인되었다. 유전적 소인 이외에도, 피부-색조 및 모발-색상이 역할을 한다. 밝은-피부의 사람, 즉 광-민감성 유형의 피부를 갖는 사람이 매우 종종 이 병에 걸린다. 특별한 위험이 붉은 모발-색상에 대한 유전자에 주어진다. 이러한 소인을 갖는 사람들의 위험과 비교하여, 어두운-피부의 사람들의 피부암 발병 위험은 단지 10%이다. 이러한 유형의 암은 진행이 빠를 뿐만 아니라, 병에 걸린 환자들의 수도 상당하다. 매년, 독일에서만 약 15,000명의 새로운 경우가 발생하며, 그 결과 약 2,000명의 환자가 사망한다. 이는 다른 피부 종양에 의해 야기되는 모든 사망보다 상당히 많으며, 현재 흑색종으로부터의 사망률이 임의의 다른 암에 의한 사망률 이상으로 빠르게 증가하고 있다. 매우 초기에 진단되는 경우, 일차 종양의 완전한 수술적 제거에 의한 장기간 치유 가능성은 여전히 높다. 그러나, 흑색종은, 다른 악성종양과는 대조적으로, 통상적으로 질환이 진단되는 시점에서 전이에 의해 신체에 이미 널리 퍼져있다. 이에, 수술적 제거가 더 이상 가능하지 않아, 방사선- 또는 전신적 화학요법이 지금껏 유일하나 불충분한 유효 치료 전략이 되고 있다. 이러한 높은 침습성 및 전이가 악성 흑색종을 피부암의 다른 형태 및 일반적인 암의 다른 변이체와 비교하여 매우 유독하게 한다. 다른 악성종양의 진행된 상태에서의 전이도 유사하게 질환의 장래 경과를 초토화시킨다. 따라서, 순환하고 있는(circulating) 흑색종 또는 다른 암 세포가 검출된 환자의 예후는 더욱 나쁘다. 일단 다수 기관이 병에 걸리면, 현행 치료적 시술에 의한 성공 가능성이 실질적으로 감소한다. 암의 유형 및 전이가 특정 종양과 함께 발생하는 시점과 무관하게, 악성종양 세포는 통상 혈관계를 통해 퍼진다.

혈소판은 지혈 및 혈전증의 과정에서 중요한 역할을 한다. 이들은 병변에 노출되는 내피하 콜라겐과의 상호작용 때문에 병변의 부위에 억류되고(arrested) 활성화된다. 콜라겐과 혈소판 사이의 상호작용은 필수적으로 3개의 수용체에 의해 매개된다: 1) 일차적 역할이 콜라겐에 대한 혈소판의 부착인 알파2베타1 인테그린 수용체, 2) 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 통해 콜라겐 수용체에 간접적으로 결합하는 GPIb-V-IX, 및 3) 콜라겐에 결합시 혈소판을 활성화시키는 신호전달 수용체인 GPVI. GPVI는 면역수용체 패밀리의 일원이며, Fc 수용체 감마-쇄(FcR감마)와 함께 혈소판에서 공동-발현된다. GPVI에 대한 리간드-결합은 혈소판 활성화를 이끌어, 혈소판 응집을 매개한다 [참조: Varga-Szabo D. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008, Vol. 28(3), 403-412]. 종합하면, 알파2베타1 및 GPIb-V-IX 수용체 및 GPVI가 일차적으로 심혈관 또는 다른 질환으로부터 발생하는 동맥 혈전증을 막기 위한 유망한 표적물로서 간주되었다 [참조: Clemetson K.J. et al., 2007, Curr. Pharm. Des., vol. 13(26), 2673-2683)]. GPVI는, 단일 처치로 GPVI의 장기간 손실 또는 억제를 일으킬 수 있기 때문에 가장 유망한 치료 표적물이었다 [참조: Nieswandt B. et al., J. Exp. Med. 2001, Vol. 193(4): 459-469].

지혈 및 혈전증의 과정에서 중요한 역할을 하는 혈소판과 콜라겐의 상호작용에 있어서 이들 3개의 콜라겐 수용체의 억제가 항-혈전 효과를 초래한다는 것이 크게 놀랍지 않았다. 혈전증 및 지혈에 대한 혈소판의 기능에 추가하여, 최근 이들은 암 성장 및 전이에 있어서 중요한 역할자로서 확인되었다. 콜라겐-수용체 억제의 유사한 항-혈전 효과 때문에, 암 성장 및 전이에 있어서 상기 수용체 억제에 의한 유사한 결과가 예측될 것이다. 알파2베타1 인테그린 수용체를 차단하는 항체의 투여는 암 세포의 혈관외 유출을 지지하며, 즉 혈류를 떠날 수 있는 암 세포수를 증가시키며, 그 결과 이러한 차단은 형성되는 종양의 수를 증가시킬 수 있다 [참조: Hangan D. et al., Cancer Res. 1996, Vol. 1,56(13), 3142-3149]. 유사하게, 폐에 있는 B16 흑색종의 전이 병터의 수가 야생형 마우스와 비교하여 VWF-녹아웃 마우스에서 더 크며, 이러한 효과는 VWF를 갖는 마우스로 대체시킴으로써 역전될 수 있다 [참조: Terraube V. et al., J. Thromb. Haemost. 2006, Vol. 4(3), 519-526]. 따라서, GPVI의 억제가 또한 암 촉진 효과를 가질 것으로 예상되었다. 본원에 요약된 자료는 놀랍게도 반대를 입증한다: GPVI의 억제는 암 세포의 성장을 극적으로 감소킬 뿐만 아니라 각각의 암 세포의 전이를 감소시킨다.

본 발명에 있어 용어 "GPVI의 억제"는, 예를 들어 효능제(agonist)의 결합을 방지하거나 리간드에 의해 GPVI 활성화를 방지하거나 세포 또는 세포 단편의 표면에 있는 GPVI의 불활성화 또는 가역적 또는 비가역적 고갈에 의해, GPVI의 정상적 기능을 방해하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어 용어 "GPVI 억제제"는, 포유동물에게 투여시 상기 정의되는 바와 같은 "GPVI의 억제"를 초래하는 화합물을 의미한다.

GPVI의 억제는 매우 다양한 기작, 예를 들어 항-GPVI 자가-항체로부터 발생하는 후천적 GPVI 결핍, 또는 GPVI가 발현되지 않거나 결함이 있는 세포내 신호전달에 의해 기능이상 형태로 발현되는 유전적, 선천적 결핍 및 엑토도메인 쉐딩(extodomain shedding)으로부터 발생하는 내인성 혈소판 메탈로프로테이나제의 활성화로부터 초래될 수 있다 [참조: Arthur J. F. et al., Br. J. Haematol. 2007, Vol. 139(3), 363-372].

본 발명의 GPVI 억제제의 활성 성분은 작은 화학적 화합물, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 비제한적 예시로서, GPVI 억제제는 하기와 같이 분류될 수 있다.

□ GPVI에 결합시 세포 표면으로부터 GPVI를 고갈시키는 GPVI에 대한 리간드, 예를 들어

o GPVI에 결합하는 항체 및 이의 단편, 예를 들어 scFv, Fab, Fv, dAb, Fd 또는 디아바디(diabody), 예를 들어

■ JAQ1(EP20010101406)

■ F1232-10-2, F-1232-21-1, F-1232-7-1, F-1232-19-1, F-1232-37-2, F- 1232-18, F-1232-17-1, F-1232-18-3, F-1232-14-2, F-1232-24-1, F-1201-20, F-1232-43-3, F-1201-18, F1199-6, F1232-37-2, YA-Abs-88, YA-Abs-03, F-1249-18-2, F-1245-7-1, F-1246-1-1, F-1249-5-1, F-1249-20-1, F-1249-24-1, F-1249-30-1, F-1245-5-1, F-1246-6-2, F-1249-3-2, F-1245-4-1, F-1249-22-1, F-1251-1-1, F-1257-3-1, F-1232-37-2, F1239-6-1(WO/2006/118350)

■ F1239-1-3, F1239-2-3, F1239-4-2, F1239-5-3, F1239-7-1, F1239-8-1,

F1239-8-1, F1239-10-2, F1239-11-1, F1239-15-3, F1239-16-3,

F1239-17-2, F1239-18-1, F1239-19-1, F1239-22-2, F1239-22-3, F1239-23-1,(WO/2007/116779)

■ hGP 5C4(PCT/EP2004/013779)

■ 10B12, 16E12, 1C3, 8A1, 4H9, 4D5(WO/2003/054020)

■ 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6, 9012.2(WO 2001/000810)

□ 하기와 같이 GPVI의 단백질분해 불활성화를 초래하는 GPVI에 대한 리간드:

o 메탈로프로테이나제의 활성화(참조: Bergmeier W. et al., Thromb. Haemost. 2004. Vol. 91(5): 951-958).

□ GPVI의 기능은 억제하지만 하기를 방해함으로써 세포 표면으로부터 GPVI의 고갈을 야기하지는 않는 리간드:

o 리간드 수용체 인식 및/또는

o 세포외 기질과의 상호작용 및/또는

o 예를 들어 콜라겐의 GPVI 결합 부위의 GPVI 또는 이의 단편에 의한 차폐에 의한 콜라겐과의 상호작용(WO/2001/16321, WO/2006/131512, WO/2003/008454, WO/2001/000810, WO/2000/068377, WO/2000/68377) 및/또는

o 혈소판 세포 상호작용

□ 예를 들어 하기에 의해 활성화된 GPVI에 의해 유발되는 신호전달 케스케이드를 억제함으로써 상술된 기작에 대해 독립적으로 GPVI 기능을 감소시키는 리간드:

o 세포내 신호전달 경로에 수반되는 단백질, 예를 들어 Syk 키나제, c-Src, 단백질 키나제 c, 포스포리파제 Cγ2, Fc 수용체 γ의 인산화의 억제.

본 발명의 GPVI 억제제는 통상의 화학적 합성에 의해 제조되거나 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 항체들의 단편의 경우에는 당해 기술 분야에 널리 공지된 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 [참조: Benny K.C. Lo, "Antibody engineering, methods and protocols, Humana press, 2003]. 또한, 폴리클로날 항체는 GPVI 또는 GPVI의 단편으로 면역력을 갖게한 후 정제함으로써 동물에서 증가시킬 수 있다

예를 들어, GPVI의 억제제가 오염 마크로분자, 특히 다른 단백질 및 핵산으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드이고 감염제(infectious agent) 및 발열제(pyrogenic agent)를 함유하지 않는 경우, 본 발명의 GPVI 억제제는 오염 분자에 대해 80% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과, 특히 바람직하게는 99.9% 초과의 약제학적으로 순수한 상태로 정제하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 분리되거나 정제된 본 발명의 GPVI 억제제는 다른 폴리펩타이드를 실질적으로 함유하지 않는다.

본 발명은 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 본원에 기술된 GPVI 억제제 및 암 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에 있어 GPVI 억제제의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상에 따라, 암, 바람직하게는 피부암, 더욱 바람직하게는 흑색종, 가장 바람직하게는 악성 피부 흑색종의 치료에 적합한 억제제를 포함하는 약제학적 제형이 제공된다.

본 발명에 기술된 억제제는 치료적 용도를 위해 약제학적 제제로 제형될 수 있다. 정제된 단백질은 통상의 생리학적으로 적합한 수성 완충액(임의로 약제학적 제제를 제공하기 위해 완충액에 약제학적 부형제가 첨가될 수 있다)에 용해될 수 있다.

이러한 약제학적 담체, 부형제 및 적합한 약제학적 제형은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다 [참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis(2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press(2000)]. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조되거나 안정한 가용 형태로 제형될 수 있다. 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 절차에 따라 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 예를 들어 주사용 멸균수 도는 멸균된 생리학적 식염수 용액을 첨가함으로써 사용 전에 재구성될 수 있다.

조성물의 제형은 투여를 위한 모든 약제학적으로 적합한 수단에 의해 개체에게 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 모든 편리한 경로로 조성물을 투여하는데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전신적으로 투여된다. 전신 사용을 위해, 본 발명의 치료학적 단백질은 통상의 방법에 따라 비경구(예: 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피) 또는 장관(경구, 질내 또는 직장내) 전달을 위해 제형된다. 폴리펩타이드에 기초한 GPVI 억제제에 대해 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다.

제형은 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방출 시스템을 포함한다.

소분자에 기초한 GPVI 억제제에 대해서는 경구 투여가 가장 바람직한 투여 방식이다. 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 통상의 부형제, 예를 들어 결합제, 충전제, 윤활제, 습윤제 등을 함유할 수 있다. 경구 액상 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르 등의 형태일 수 있거나, 사용시 물 또는 다른 적합한 비히클을 사용하여 재구성하는 건조 제품으로 제공될 수 있다. 이러한 액상 제제는 통상의 첨가제, 예를 들어 현탁제, 유화제, 비-수성 비히클 및 보존제를 함유할 수 있다.

국소 적용에 적합한 제형은 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 겔 또는 바람직하게는 에멀젼 연고의 형태일 수 있다. 분무 적용에 유용한 제형은 분무가능한 액체 또는 건조 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 GPVI 억제제는 허용가능하지 않는 유해 부작용을 형성하는 용량에 도달함이 없이 치료되는 상태 또는 증상의 중증도 또는 확산을 방지하거나 감소시키고 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. 정확한 용량은 많은 인자, 예를 들어 증상, 제형 및 투여 방식에 의존적이며, 각각의 개별 증상에 대한 임상전 및 임상 시험으로 결정되어야 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 이들 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 암의 치료, 바람직하게는 피부암의 치료, 더욱 바람직하게는 흑색종의 치료에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 약제학적 제제의 제조를 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 또한 GPVI의 신호전달 케스케이드 다운스트림의 성분들을 억제하기 위한 실시예 3에 기술된 방법에 의해 확인가능한 억제제의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는

a) 바람직하게는 사람 또는 표준 실험실 동물종, 예를 들어 마우스로부터 수득되는 포유동물의 혈소판 농축 혈장에 잠재적인 GPVI 억제제 적당량을 가하는 단계;

b) 임으로 단계 a)의 혈소판 농축 혈장을 잠재적인 GPVI 억제제와 함께 인큐베이션하는 단계;

c) 콜라겐 관련된 펩타이드 또는 콘불신(convulxin) 또는 덜 특이적인 콜라겐을 가하여 GPVI-매개된 신호전달에 의한 혈소판 응집을 유도함으로써 혈소판 응집을 개시하는 단계; 및

d) 단계 c)에서 측정된 응집을, 콜라겐 관련된 펩타이드 또는 콘불신 또는 덜 특이적인 콜라겐을 단계 a)의 잠재적인 GPVI 억제제 첨가 없이 혈소판 농축 혈장에 가하여 수득된 응집과 비교하는 단계를 포함하는, GPVI 억제제를 확인하는 방법에 관한 것이다.

단계 a)에서 기술되는 바와 같이 잠재적인 GPVI 억제제를 가했을 때 혈소판 응집이 손상되는 경우, 이러한 화합물이 본 발명에 따른 GPVI 억제제이다. 이러한 GPVI 억제제의 특이성은, GPVI 억제제가 바람직하게는 제1 단계에서와 동일한 유기체로부터의 것이나 GPVI가 결핍된 혈소판 농축 혈장에 적용되는 대조군 실험에서 추가로 시험될 수 있다 이러한 결핍은 GPVI 녹-아웃 마우스에서와 같이 GPVI의 유전적 결핍에 의해 [참조: Kato K, Kanaji T, Russell S, et al., Blood. 2003; 102: 1701-1707], 또는 실질적으로 감소된 GPVI 활성을 유도하는, 예를 들어 유전자를 침묵시키는 다른 접근 또는 siRNA와 같은 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 결핍은 반드시 완전할 필요는 없을 것이다. 첨가되는 화합물이 여전히 이러한 제제의 응집을 손상시키는 경우, 응집이 GPVI 이외의 다른 수용체를 통해 혈소판을 활성화시키는, 콜라겐 관련된 펩타이드, 콘불신 또는 덜 특이적인 콜라겐 이외의 다른 작용제, 예를 들어 ADP, 트롬빈 또는 아라키돈산 또는 유사물에 의해 유도된다면, 이 화합물은(비록 GPVI를 억제하기는 하지만) GPVI에 대해 특이적이지 않다.

본 발명의 또 다른 양상은 암의 치료, 바람직하게는 피부암의 치료, 더욱 바람직하게는 흑색종의 치료에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 병용된 약제학적 제제의 제조를 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 암의 치료, 바람직하게는 피부암의 치료, 더욱 바람직하게는 흑색종의 치료에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제 및 GPVI의 억제제가 아닌 하나 이상의 추가의 치료 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양상은 암의 치료, 바람직하게는 피부암의 치료, 더욱 바람직하게는 흑색종의 치료에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제 및 GPVI의 억제제가 아닌 하나 이상의 추가의 치료 화합물을 포함하는 병용 조성물에 관한 것이다.

GPVI 억제가 입증된 항혈전 효과를 갖고 출혈 위험을 일으키지 않는 것으로 밝혀졌으므로, GPVI 억제제를 사용한 치료적 시술은 통상의 외과적 시술을 겪는 암 환자와 같이 증가된 출혈 위험 합병증에 노출되지 않아야 하는 환자에 대해 특히 유리할 수 있다.

특히 암 환자에 있어 GPVI 억제는 항혈전 및 항암 효과 모두로부터 상승작용적 효과를 가질 수 있다. 따라서, 보다 많은 암 환자들이 증가된 혈전증 위험을 겪는다.

도면의 간단한 설명

도 1: 5 x 10⁴ B16 세포를 정맥내 투여한 지 약 2주 후, 음성(비히클 처리된) 대조군 마우스와 비교한, GPVI 억제 처리된 마우스에서의 암 발병률의 감소.

도 2: 1 x 10⁶ B16 세포를 정맥내 투여한 지 2주 후 비히클 처리된 마우스의 폐.

도 3: 1 x 10⁶ B16 세포를 정맥내 투여한 지 2주 후 GPVI 억제 처리된 마우스의 폐.

도 4: 1.5 x 10⁶ B16 세포를 정맥내 투여한 지 2주 후 폐 콜로니의 수(n=5 내지 10/그룹, 개별 결과, 선으로 연결된 그룹 중앙).

도 5: B16 주사 전 또는 후에 개시되는, 비히클(음성 대조군)로의 처리 후 또는 제한된 기간 동안의 GPVI 억제 후의 B16 주입된 마우스의 생존률(n=9 내지 10/그룹).

도 6: B16 주입 전 또는 후에 개시되는, 비히클(음성 대조군)로의 처리 후 또는 제한된 기간 동안의 GPVI 억제 후의 시간 경과에 따른 B16 주입된 마우스의 체중(평균, n=9 내지 10/그룹).

실시예

실시예 1

제1 세트의 실험의 목적은, GPVI에 결합하는 모노클로날 항체 JAQ1을 사용한 C57B16 마우스의 처리가 3가지의 상이한 세포수에서 B16 세포의 정맥내 주사후 폐에 있는 B16 흑색종 콜로니의 성장을 방지할 수 있는가를 평가하는 것이었다.

이러한 전제를 시험하기 위해 사용된 모델은 하기와 같은 방식으로 수행되었다. 암성 세포를 증식시키기 위해서, B16 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입한 초저온냉동된 스톡으로부터 멸균 조건 하에 제조하였다. 세포를 서서히 해동시키고, 배양 배지에 재현탁시켰다. 1 x 10⁶ B16 세포를 트립판 블루를 사용해 생존력을 점검하였다. 제1 증식을 위해, C57B16 마우스에 피하 주사하였다. 2주 후, 생성된 피하 종양을 떼어내고, 종양 세포를 콜라게나제로 분리시켰다. 세포에 대한 추가의 증식을 시험관내에서 수행하였다. 간단히 설명하면, 분리된 세포를 각각의 배지로 채워진 배양 접시에 옮겼다. 일단 세포가 가시적으로 검출가능한 스테이지로 증식되면, 부착 세포를 트립신을 사용해 가동시켰다. 이 단계에서, 또 다른 시험관내 증식 사이클이 뒤따르거나 세포에 C57B16 시험 마우스의 꼬리 정맥으로 정맥내 주사하여 GPVI 억제제의 치료 효과를 시험하였다. 마우스(Charles River)를 표준 하우징 조건 하에 두었다. 이러한 피부암 동물 모델에 대한 주요 종점은 하기와 같다.

1) 처리 그룹 중 종양을 갖는 것이 밝혀진 동물의 퍼센트(발병률),

2) 사망률(종양으로 사망하거나 죽어가는 것으로 밝혀지고 희생된 동물의 수),

3) 각각의 처리 그룹에서 동물당 폐에서 발견된 전이 및 종양의 평균수.

종양은 피부에서도 성장하나, 종양의 어두운 갈색 내지 검은 색상 사이의 대조가 밝은 색상의 폐 조직에 대해 강력한 대조를 나타내는 환경 때문에 마우스의 폐에서 가장 잘 정량화될 수 있다. 어두운 피부의 배경에 대해서는 이러한 분석이 덜 확실할 것이다. 또한, 주사된 세포의 대부분은 폐 미세혈관계에 트랩핑되어 혈관 내피에 부착된다.

시험 마우스의 처리 스케쥴이 표 1에 나타나 있다. JAQ1 또는 식염수(음성 대조군) 비히클의 용량은 모든 마우스에 대해 동일하였다. 처리는 B16 세포를 주사하기 4일 또는 1일 전에 시작하고 표 1에 나타난 바와 같이 수행하였다. 마우스에 3가지의 상이한 수의 B16 세포(5 x 10⁴, 1 x 10⁶ 또는 1.5 x 10⁶)를 주사하였다. 약 2주 후, 동물을 희생시키고, 폐에 있는 B16 콜로니의 수를 측정하였다. JAQ1을 사용한 단독 처리가 약 5일의 연장된 기간 동안 GPVI를 고갈시킨다 [참조: Nieswandt B. et al., J. Exp. Med. 2001, Vol. 193(4): 459-469]. 선택된 반복적 짧은 간격 스케쥴은 GPVI 고갈이 실험 과정 동안 완벽했다는 것을 확실히 하였다.

주사된 B16 세포의 수가 적은 경우(5 x 10⁴ B16 세포/마우스, 세트 A), B16 세포의 정맥내 주입 1일 전에 개시된 JAQ1으로의 처리가 발병 동물의 수를 극적으로 감소시켰으며, B16 폐 콜로니를 82%로부터 단지 18%로 전개시켰다(표 2, 도 1). 폐에 있는 콜로니의 수도 이러한 처리에 의해 마찬가지로 감소되었다.

주사된 B16 세포의 수가 20x 만큼 증가시(1x10⁶ B16 세포/마우스, 세트 B), 모든 식염수 처리된 마우스는 콜로니를 보였으나 이들의 수가 너무 커서 믿을만하게 계수될 수 없었다. 세트 A에 대한 추가의 차이는 세트 A에서 보다는 3일 먼저 개시된 처리, 즉 B16 세포를 주입하기 4일 전에 처리를 시작하였다는 것이다. 또한, B16 주입과 관련한 이러한 보다 공격적인 상태에서, JAQ1 처리는 B16 폐 콜로니를 뚜렷하게 감소시켰다. 식염수로 처리된 마우스의 폐에서의 콜로니의 수는 매우 높아(>100) 이들은 믿을만하게 계수할 수 없었다. 도 2 및 3은 비히클 및 JAQ1 처리된 마우스의 기관에 대한 사진을 나타내며(표 3), 이는 JAQ1 주사의 치료 효과를 뚜렷하게 보여주고 있다.

이 모델에 대하여 우발적인 변화의 백그라운드에 대하여 이러한 발견의 확고함을 확인하기 위한 반복 실험에서, 증식된 B16 세포가 세트 B에 대한 것보다 시험관내에서 덜 악성인 것으로 판명되었다. 이는 1.5 x 10⁶ 세포/마우스(세트 C)로의 추가의 상승을 가능하게 하였다. 처리 스케쥴은 세트 B에서와 같았다. 또한, 덜 공격적인 세포(aggressive cell)를 사용한 더욱 많은 세포 로딩에서, B16 세포를 주입하기 4일 전에 개시된 JAQ1 처리가 여전히 폐 콜로니를 뚜렷하게 감소시켰다(표 4, 도 4).

따라서, 이러한 세트의 자료는 JAQ1 처리가 흑색종 콜로니의 수를 감소시킨다는 것을 입증한다.

어떠한 기작으로 GPVI 억제가 이러한 보호를 야기하는지 생각해볼 수 있다. 이는 수개의 기작에 의해 매개될 수 있을 것이다. 실험 개시 시 주사된 악성종양 세포의 억류(arrest)를 방해하는 것으로부터 발생할 수 있을 것이다. 그러나, 종양의 감소는 또한 초기 종양으로부터 방출되고 실험의 개시 시 트랜스퓨전(transfusion), 즉 전이에 의해 생성되는 억류된 세포의 성장을 방해함으로써 야기될 수 있다. 그러나, 순환하는 세포(circulating cell)의 기원이 이들의 추가 운명을 정의한다고, 즉 초기 트랜스퓨전이 마우스에서의 종양 성장에 의한 전이 상태를 이미 반영한다고 추정할 이유가 없다. 또한, GPVI 결핍이 종양 성장을 억제함으로써 전이가 개시되는 시점을 연장시키거나 전이 세포의 혈행(circulation)으로의 방출 과정이 GPVI 결핍에 의해 억제된다는 것이 그럴듯하게 보인다.

실시예 2

제1 실시예에 요약된 자료는 GPVI 고갈이 종양 성장을 극적으로 감소시키는 것 뿐만 아니라 전이를 최소화한다는 것을 입증한다. 그러나, 수용체 고갈은 악성종양 세포의 주사 이전에 유도되었다. 그러나, 암의 증거가 없는 예방적 GPVI 억제는 가능한(potential) 임상 세팅에 대해 다소 드문 상태를 나타낼 수 있다. 따라서, 제2 실시예에서 시험되는 전제는 악성종양 세포의 트랜스퓨전 후 개시되는 경우에도 GPVI 억제가 효과적이어서 암에 대해 예방적 보호뿐만 아니라 이미 확립된 암의 치료가 가능한지에 대한 여부였다. 이러한 질문을 평가하기 위해, 단지 적당한 때의 하나의 특정 시점에서의 콜로니의 수를 측정하는 대신에, 임상적으로 가장 관련된 종점, 즉 사망률을 이용하여 효능을 측정하였다. 또한, 단기간 치료에 대한 최악의 시나리오를 선택하였다. 이 실시예에서 C57B16 마우스는 표 5에 나타난 바와 같이 처리하였다. 실시예 1의 변형으로서, 치료를 위한 적당한 때의 출발 시점에 대한 가능한 영향을 직접적으로 비교하기 위해서, JAQ1의 효과를 2가지 처리 스케쥴로 평가하였다. 하나는 실시예 1에서와 같이 악성종양 세포를 트랜스퓨전하기 4일 전에 개시하고, 제2 스케쥴은, 더 이상 어떠한 자유로이 순환하는 암 세포가 존재하지 않는 적당한 때의 시점인, B16 세포를 트랜스퓨전한 지 8시간 후에 개시하였다. 따라서, 아마도 모든 악성종양 세포는 아니더라도 대부분의 세포가 억류 또는 내피에 부착되거나 혈관 벽을 통한 혈관외유출 후 이미 주변 조직을 침습하였다. 이는 처리 효과가 폐 미세혈관계에서 종양 세포의 감소된 정체에 의존하는지 또는 혈관외유출 및 성공적인 전이와 관련된 기작과 같은 독립적 기작에 의해 매개되는 지의 여부를 결정하는데 중요하다.

JAQ1으로의 처리는 약 1주일로 제한되었다. 처리 계획은 투여 후 확연한 GPVI 억제를 보증하도록 고안되었다. 약 3 내지 4일의 기간 내에, 이러한 단일 처리에 의해 달성되는 억제는 완벽하며, 일단 증가하는 수의 완전한 적격(competent) 혈소판이 이들의 기원 세포로부터 방출되고 억제된 혈소판이 제거되어 순환중인 이들의 비율이 변하면 억제는 쇠퇴하기 시작한다. 마지막 처리한 지 약 1주일 후, GPVI 억제의 수준은 다소 적고 아마도 이러한 세팅에서 유의하지 않다. 따라서, GPVI 억제를 이 실시예에서는 사망까지는 유지하지만 악성종양 세포를 트랜스퓨전한 후 적어도 첫주로 제한하였다. 따라서, 사망할 때까지의 관측 기간 중 주요 부분(사망까지 통상 3 내지 4주 중 약 2 내지 3주)에서, 처리 그룹 모두에서의 동물은 실제로 비처리되었다.

비록 치료 기간은 상당히 짧았지만, GPVI 억제는 분명히 사망을 지연시켰다(표 6, 도 5). 또한, GPVI 억제를 B16 세포를 주입하기 전 또는 후에 개시하는 경우, 사망률은 상당히 유사하였다. 체중에 대한 시간 경과는 초기의 대량의 종양 성장에 상응하였으며, 악화되는 일반적 상태도 이어졌다(도 6).

이 실시예에서의 전-처리 효과는 이전 실시예 1에서 제공되는 입증을 뒷받침하며, GPVI의 억제가 종양 성장 및/또는 전이를 감소시킨다는 것을 보여준다.

단지 실시예 1에 기초할 때, 암 세포 증식이 미세혈관계에서의 암 세포의 증가된 정체를 지지하고 따라서 혈관외유출에 대한 기회를 증가시키는, 응고를 유도할 암세포의 잠재력에 의존적일 수 있기 때문에, GPVI 억제의 항암 효과가 GPVI를 억제하는 항-혈전 효과에 의해 설명될 수 있었다. 예를 들어, 유리한 효과가 항응고처리되거나 피브리노겐-결핍된 동물에 대해 보고되어 있다 [참조: Amirkhosravi A. et al., J. Thrombosis Haemostasis, 2003, Vol. 1, 1972-1976; Palumbo J. S., Cancer Research, 2002, Vol. 62, 6966-6972].

이와는 대조적으로, 실시예 2는 GPVI 억제가 악성종양 세포 주입 시점에 존재하는지의 여부 또는 GPVI 억제가 악성종양 세포 주입 후에 유도되는지의 여부에 실질적인 차이가 없다는 것을 보여준다. 따라서, 이들 자료는, 폐에 암 세포의 트래핑 시 및 가능하게는 혈관외유출이 이미 완결된 시점, 예를 들어 GPVI 억제제의 항-혈전 효과가 덜 중요할 수 있는 시점에서 치료가 시작되는 경우에서조차, 최대 항암, 항전이 효과가 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.

또한, 이 실시예는 종양 감소가 GPVI 고갈된 마우스의 지연된 사망과 유사하다는 것을 입증한다. 중요하게는, 상당히 짧은 기간의 GPVI 억제에 대한 최악의 시나리오에서도, 처리는 확실히 사망을 지연시켰다. GPVI의 계속적인 억제에 의해, 치료 효능이 더욱 명확해질 것으로 예상된다.

실시예 3

제3 실시예는 GPVI 억제의 치료 효과가 억제제의 특성과는 무관하다는 것을 설명한다. 억제하는 화합물은 포유동물, 바람직하게는 사람 또는 마우스와 같은 표준 실험실 동물종으로부터 수득되는 포유동물의 혈소판 농축 혈장에 적당한 농도의 잠재적 억제제를 가함으로써 확인될 수 있다. 적합한 인큐베이션 기간 후, EP1228768에 기술되어 있는 바와 같이 콜라겐 관련 펩타이드 또는 콘불신 또는 덜 특이적인 콜라겐을 첨가함으로써 혈소판 응집을 개시한다. GPVI-매개된 신호전달에 의해 혈소판 응집을 유도하기 때문에 이들 화합물이 사용된다 [참조: Nieswandt B, Watson SP., Blood. 2003; 15:102: 449-461]. 응집이 손상되는 경우, 사용되는 화합물 또는 방법은 GPVI 또는 GPVI에 의해 활성화되는 다운스트림 신호전달 케스케이드의 성분을 억제한다. 제2 단계에서, 대조군 실험으로서, 잠재적인 GPVI 억제제를 바람직하게는 제1 단계에서와 동일한 유기체이나 GPVI가 결핍된 유기체로부터의 혈소판 농축 혈장에 적용한다. 이러한 결핍은 GPVI 녹-아웃 마우스와 같이 GPVI에 대한 유전적 결핍 [참조: Kato K, Kanaji T, Russell S, et al., Blood. 2003; 102: 1701-1707] 또는 실질적으로 감소된 GPVI 활성을 유발하는, 예를 들어 유전자를 침묵시키는 다른 접근 또는 siRNA와 같은 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 결핍이 반드시 완전할 필요는 없을 것이다. 첨가되는 화합물이 여전히 이러한 제제의 응집을 손상시키는 경우, 응집이 GPVI 이외의 다른 수용체를 통해 혈소판을 활성화시키는 다른 작용제, 예를 들어 ADP, 트롬빈 또는 아라키돈산 또는 유사물에 의해 유도된다면, 이 화합물은(비록 GPVI를 억제하기는 하지만) GPVI에 대해 특이적이지 않다.

GPVI를 억제하는 작은 화학적 화합물에 대한 특정 예는, 안지오텐신 II 타입 1 수용체 길항제 로사탄의 대사물인 EXP3179이다 [참조: Grothusen C, Umbreen S, et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 May;27(5): 1184-90]. 반복 투여 또는 연속 주입과 같은 다른 접근법에 의해, 마우스의 혈장 수준이 도달되어 방해되지 않은 고수준의 GPVI 억제를 확보할 수 있다. 고수준의 억제에 도달하는 지의 여부는 콜라겐 유도된 혈소판 응집을 정량함으로써 시험될 수 있다.

EXP3179와 같은 GPVI 억제제가 흑색종과 같은 암을 방지하는데 효과적인지의 여부를 평가하기 위해서, 약 10마리의 마우스의 그룹을 충분한 GPVI 억제가 도달될 때까지 EXP3179로 사전-처리한다. 이는, 바람직하게는 적어도 25% 또는 적어도 50% 또는 적어도 75% 또는 적어도 90%이다. 이러한 조사를 위한 적합한 하우징 조건 및 마우스 스트레인은 실시예 1에 나타나 있다. 이어서, B16 세포를 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 가능하게는 상이한 세포수의 범위 또는 다양한 악성종양을 갖는 세포로, 정맥내 트랜스퓨전한다. EXP3179와 같은 GPVI 억제제를 사용한 연속 처리 하에, 마우스를 적당한 기간, 약 1주일 이상 동안 관측하고, 마우스의 생존을 기록한다. 관측 말기에 마우스를 희생시키고, 실시예 1에 열거된 종점을 정량한다. 참조로서, 유사하게 큰 그룹의 마우스를 동일한 조건 하에 두었으며, 트랜스퓨전 용액이 B16 세포를 포함하지 않는다는 것을 제외하고는 동일하게 처리한다. 이러한 대조 그룹과의 비교는 EXP3179와 같은 억제제를 사용한 GPVI 억제가, JAQ1과 같은 억제제를 사용하는 것과 같이, 개선된 생존과 함께, 종양 및 전이 성장을 감소시키는데 있어서 마찬가지로 효과적이라는 것을 입증할 것이다.

EXP3179와 같은 GPVI 억제제를 사용한 환자의 치료에 대한 임상적으로 보다 관련된 상태를 나타내는 제2 접근으로서, 암 진단 후가 조사될 수 있다. 이는, 암 세포가 트랜스퓨전되는 시점에 충분히 억제되는 실시예 1에서 기술된 예방적 세팅에 상보적이다. 실시예 2에서 요약되는 진정한 치료적 세팅에서는,(B16 세포의 트랜스퓨전에 의한) 암의 유도는 적합한 GPVI 억제제로의 처리 전에 발생한다. 종점의 정량화는 동일하다. 또한 이러한 치료적 상태에서도, 개선된 생존률과 함께 종양 및 전이 성장이 감소된다.

GPVI의 억제에 의한 암의 예방 및 치료를 위한 방법에 대한 GPVI 억제의 이점을 평가하기 위한 가능한 대안적인 접근법은 GPVI 녹-아웃 마우스를 사용하는 것일 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은, 온전한 GPVI를 사용하여 GPVI 기능을 억제하는 마우스의 처리와 상이하게 하는 수개의 중요한 국면이 있다. 엄격히, GPVI 녹-아웃 마우스의 사용은 단지 드문 상태인 GPVI 유전자가 파괴된 환자만을 반영한다 [참조: Arthur JF, Dunkley S, Andrews RK.. Br J Haematol. 2007 Nov; 139(3): 363-72]. 이러한 경우의 특징은 GPVI 결핍이 암의 발병 동안 이미 존재한다는 것이다. 따라서, 이는 예방적 GPVI 억제 처리 하의 환자, 단 그럼에도 불구하고 암이 발병한 환자의 상태를 반영한다. 이는(GPVI 녹-아웃 마우스에 의해서도 반영되는) 완전한 GPVI 결핍을 갖는 환자의 경우에 보다 분명해진다. 이러한 환자에서의 GPVI 활성을 감소시키고자 하는 치료법은 무의미할 것이다. 이와는 대조적으로, 본 발명은, 초기에는 억제되지 않은 GPVI 활성을 갖는 개체에서 GPVI의 억제가 암을 예방학적으로 방지하는 것뿐만 아니라 암의 진단 후 치료학적으로 암을 치료하는데 잠재성을 가질 수 있다는 것을 보인다. 실시예 2에서 나타난 바와 같이, GPVI의 억제는 또한 처리가 질병 진단 후 개시되는 경우에 효과적이어서 치료적 접근으로서 효과적이다.

종합하면, GPVI 억제는 예방적 처리뿐만 아니라 확립된 흑색종을 갖는 환자 및 전이가 두드러진 과정의 스테이지에 있는 환자에서도 효과적일 수 있다는 결론에 도달한다. 혈소판은 혈관 재모델링의 개시에 중요한 역할을 하기 때문에 [참조: Massberg et al., J.Exp.Med., 2006, Vol. 203(5): 1221-1223], GPVI 고갈은 암 성장에 필요한 신혈관형성, 또는 전이, 즉 파종, 억류 또는 암 세포의 침습에 수반되는 기작과 같은 수개의 기작을 방해하거나 억제함으로써 작용할 수 있다. 따라서, GPVI-고갈제 또는 GPVI-억제제 또는 다른 수단에 의한 GPVI의 기능 억제제를 신규한 항암/항전이제로 사용할 수 있다. 이는 증가된 출혈 합병증 위험에 노출되지 말아야 하는 환자들에 대해 특히 유리할 수 있다.

Claims

암 예방 및/또는 치료용 약제(medicament)의 제조를 위한 GPVI 억제제의 용도.
암 예방 및/또는 치료용 GPVI 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, GPVI가 사람 GPVI인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 유형이 피부암인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 유형이 흑색종인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 유형이 악성의 피부 흑색종인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPVI 억제제가 항체인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPVI 억제제가 모노클로날 항체 JAQ1인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPVI 억제제가 소분자인, 용도 또는 암 예방 및/또는 치료용 억제제.
암 치료법에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 약제학적 제제의 제조를 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제를 포함하는 조성물의 용도.
피부암 치료법에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 병용 약제학적 제제의 제조를 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제를 포함하는 조성물의 용도.
암 치료법에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제 및 GPVI 억제제가 아닌 하나 이상의 추가의 치료 화합물을 포함하는 조성물.
피부암 치료법에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 하나 이상의 분리된 GPVI 억제제 및 GPVI 억제제가 아닌 하나 이상의 추가의 치료 화합물을 포함하는 병용 조성물.
a) 포유동물의 혈소판 농축 혈장에 잠재적인 GPVI 억제제의 적당량을 가하는 단계;
b) 임의로 단계 a)의 혈소판 농축 혈장을 상기 잠재적인 GPVI 억제제와 함께 인큐베이션하는 단계;
c) 콜라겐 관련된 펩타이드 또는 콘불신(convulxin) 또는 콜라겐을 가하여 GPVI-매개된 신호전달에 의한 혈소판 응집을 유도함으로써 혈소판 응집을 개시하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 측정된 응집을, 콜라겐 관련된 펩타이드 또는 콘불신 또는 콜라겐을 단계 a)의 상기 잠재적인 GPVI 억제제 첨가 없이 혈소판 농축 혈장에 가하여 수득된 응집과 비교하는 단계를 포함하는, GPVI 억제제의 확인 방법.