JP2004508415A - 抗脈管形成因子としてのtweakレセプターアゴニスト - Google Patents
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Abstract
本発明は、TWEAKレセプター(Fn14)アゴニストを使用することによって脈管形成を調節する方法および腫瘍進行を阻害する方法に関する。詳細には、脈管形成を阻害するための方法を開示する。1つの局面では、本発明は、脈管形成を調節する方法であって、治療有効量のTWEAKレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法、を提供する。別の局面では、本発明は、脈管形成を調節する方法であって、治療有効量の少なくとも2つのFn14アゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法、を提供する。
Description
【0001】
脈管形成は、種々の正常な事象および病理学的事象(例えば、女性の生殖周期、胎児の発達、創傷治癒、炎症および腫瘍進行)の間の組織再構築の必須の要素である(Han,Z.C.およびY.Liu、Int.J.Hematol、70(2):68(1999);Folkman,J.、Nat.Med.、1(1):27(1995))。微小血管の成長は、内皮細胞の同調的な移動、増殖、分化および毛細血管構造への形態発生的組織化に関与する。新生血管のさらなる安定化および成熟は、その血管壁への隣接する間葉細胞の動員を介して生じる(Bussolino,F.A.、Trands Biochem Sci.、22(7):251(1997))。発生中の血管および休止中の血管の維持は、適切な生存シグナルの利用能に依存する。これらの脈管形成事象は、細胞外因子(いくつかのクラスのサイトカイン、細胞外マトリクスおよびインテグリンを含む)のネットワークによって、そしてそれらの同族のレセプターによって、調整される。
【0002】
多くの公知の脈管形成調節因子は、腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーに属する。このファミリーのリガンドは、II型膜タンパク質として発現され、これは、タンパク質分解的に切断され、可溶性のサイトカインを生成し得る(Smith,C.A.ら、Cell、76:959(1994))。これらのリガンドは、TNFレセプターファミリーにおけるそれらの対応するレセプターを介して結合しそしてシグナル伝達することによって、生物学的活性を誘発する。TNFファミリーメンバーの大半は、宿主防御、炎症および免疫学的調節を媒介する(Vassalli,P.Annu Rev Immunol、10:411(1992);De Togni,P.J.ら、Science,264(5159):703(1994);Nagata,S.およびGoldstein,P.、Science、267:1449(1995);Foy,T.M.ら、Annu Rev Immunol、14:591(1996);Mackay,F.ら、J.Exp Med、190(11)1697(1999))。さらに、これらのリガンドのいくつか(TNF−β、Fasリガンド(FasL)、血管内皮増殖インヒビター(VEGI)またはTLIを含む)、およびTWEAKは、EC機能を調節することが示されている(Frater−Schroder,M.W.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5277(1987);Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997);Ruegg,C.ら、Nat Med、4(4):408(1998);Fajardo,L.F.ら、Am J Pathol、140(3):539(1992);Leibovich,S.J.、Nature、329(6140):630(1987);Biancone,L.、J Exp Med、186(1):147(1997);Yue,T.ら、J.Biol.Chem、274:1479(1999);Zhai,Y.ら、Faseb J、13(1):181(1999))。ECの挙動に対するTNF−αの効果は、複雑である。TNF−αは、インビトロでEC増殖を阻害するが、毛細管形成を誘導する(Frater−Schroder,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5277(1987);Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997))。これはまた、固形腫瘍の環境下で抗脈管形成性であり得るか(Ruegg,C.A.Nat Med、4(4):408(1998))、またはインビボでの角膜設定下で脈管形成性である(Frater−Schroder,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5277(1987);Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997);Fajardo,L.F.ら、Am J Pathol、140(3):539(1992);Leibovich,S.J.、Nature、329(6140):630(1987))。Fas/FasL相互作用は、インビボで内皮毛細管形成を誘導し得、これはおそらく、ヘパリン結合増殖因子の産生を誘発することによる(Biancone,L.ら、J.Exp Med、186(1):147(1997))。一方、VEGIは、ECの生存および増殖を阻害する(Zhai,Y.ら、Faseb J、13(1):181(1999);Yue,T.ら、J.Biol.Chem.、274:1479(1999))。TNFリガンドファミリーの新規メンバーであるTWEAK(Chicheportiche,Y.ら、J Biol Chem、272(51):32401(1997))は、いくつかの上皮腫瘍細胞株において脈管形成性ケモカインであるインターロイキン−8(IL−8)の発現を誘導する。最近、TWEAKは、減少した増殖因子条件下での、培養ヒトECの増殖および角膜新生血管形成の両方を誘導することが報告された(Lynch,C.N.ら、J.Biol.Chem.、271(13):8455(1999))。
【0003】
発現クローニングの使用によって、TWEAKに対するレセプタータンパク質が、「Fn14」であることが最近同定された。このタンパク質は、元来、FGF−1誘導最初期応答遺伝子として特徴付けられた(J.Biol.Chem.274:33166−33176(1999)およびWO98/55508)。Fn14は、(TWEAKと比較した場合)成体組織においてより限定された発現パターンを有し、今日までに記載される中で最も小さいTNFレセプターであり、たった1つのシステインリッチ反復しか有さない。
【0004】
(発明の要旨)
脈管形成の誘導においてTWEAKおよびFn14によって果される役割(WO01/45730を参照のこと)に加えて、本発明者らは、Fn14アゴニストまたは活性化因子(例えば、TWEAKおよびアゴニスト抗Fn14モノクローナル抗体)が、脈管形成の阻害を介して間接的にか、または直接的な抗腫瘍活性によって、実際に(1)脈管形成を阻害し、そして(2)腫瘍の進行を遅くさせることを発見した。
【0005】
従って、本発明は、治療有効量の、TWEAKレセプターに対するアゴニストを投与することによって脈管形成を調節する方法を提供する。好ましい実施形態において、TWEAKレセプターは、Fn14である。他の好ましい実施形態において、Fn14レセプターアゴニストは、TWEAKであるかまたは抗Fn14モノクローナル抗体である。本発明は、好ましくは、治療有効量の、TWEAKレセプターに対するアゴニストを投与することによって脈管形成を阻害する方法を提供する。
【0006】
本発明はまた、治療有効量のTWEAKレセプターに対するアゴニストを投与することによって腫瘍進行を阻害する方法を提供する。好ましい実施形態において、TWEAKレセプターは、Fn14である。他の好ましい実施形態において、Fn14アゴニストは、TWEAKであるかまたは抗Fn14モノクローナル抗体である。
本発明はまた、治療有効量の、TWEAKレセプターに対するアゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を意図する。
【0007】
本発明の方法が脈管形成を調節することを意図する程度に、これらは、新生血管形成を促進するために増強した脈管形成活性が所望される疾患において、処置として有用である。このような疾患および状態としては、以下が挙げられる:心筋虚血状態(例えば、心筋梗塞、心筋虚血または心臓以外の領域への不十分な血流(末梢血管疾患におけるような)に罹患している冠状動脈疾患を有する患者における血流(ここでは、血流の減少が問題である)の改善、壊死組織(例えば、梗塞または血管形成術後の心筋層)の血管再生、アンギナ、心臓移植片、血管移植片、ならびにこれらの病変の血管形成、灌流、膠原化および組織化を改善するための血管の再開)、創傷治癒、ならびに組織移植および器官移植(例えば、自己微小血管移植または異種微小血管移植の増強)。創傷治癒の促進としては、切開部の治癒、骨修復、痛みの治癒、心筋損傷の梗塞後修復、胃潰瘍および胃腸管の他の潰瘍の治癒、ならびに一般的な、組織の形成、維持および修復の促進が挙げられる。移植(grafted)または移植(transplanted)された組織の新生血管形成もまた、特に、血管不全に罹患している被験体(例えば、糖尿病患者)において、意図される。
【0008】
本発明の方法が脈管形成を阻害することを意図する程度に、これらは、新生血管形成を阻害するために減少した脈管形成活性が所望される疾患において、処置として有用である。このような状態としては、癌、炎症性黄斑変性、および糖尿病性網膜症が挙げられる。
【0009】
本発明の方法が腫瘍進行を阻害することを意図する程度に、これらは、所望されない細胞増殖に関連する状態(例えば、癌(前立腺癌、リンパ腫、腺癌、神経新生物、結腸癌、膵臓癌、パラガングリオーマ、乳癌、腎細胞癌、肺癌、卵巣癌、平滑筋腫、肺癌、髄膜腫、褐色細胞腫、骨肉腫および甲状腺癌を含むが、これらに限定されない))を処置するために有用である。
【0010】
(発明の詳細な説明)
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。
【0011】
用語「抗腫瘍活性」とは、物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、またはその腫瘍細胞の死を誘導する、能力をいう。
【0012】
用語「腫瘍進行の阻害」とは、物質または化合物が、その物質または化合物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、またはその腫瘍細胞の増殖および発達を減少する、能力をいう。
【0013】
用語「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死のプロセスをいう。
【0014】
用語「細胞傷害活性」は、物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する細胞の死を誘導する能力をいう。
【0015】
用語「エピトープ」(または抗原決定基)は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と結合する分子の一部と規定される。単一のエピトープは、モノクローナル抗体(mAb)によって認識される。複数のエピトープが、通常ポリクローナル抗体によって認識される。
【0016】
用語「脈管形成因子」は、このプロセスの以下の段階を含むが、これらに限定されない、脈管形成プロセスを促進する因子をいう:すなわち、細胞外マトリクスの分解、細胞増殖、細胞移動および構造的組織化(Kumarら、Int.J.Oncology 12:749−757(1998);Bussolinoら、Trends in Biochem,22:251−256(1997))。脈管形成因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、FGF−5、血管内皮増殖因子アイソフォーム(VEGF)、アンギオポエチン−1(Ang−1)およびアンギオポエチン−2(Ang−2)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD−ECGF)、肝細胞増殖因子、プロリファリン(proliferin)、B61、可溶性血管細胞接着分子−1、可溶性E−セレクチン(selection)、12−ヒドロジエイコサテトラエノン酸(hydrozyeicosatetraenoic acid)、HIV−1のTatタンパク質、アンギオゲニン、TNFα、FasL、トランスフォーミング増殖因子−β。
【0017】
抗体の「Fcドメイン」は、CH2領域、CH3領域およびヒンジ領域を含むが抗原結合部位を欠く分子の一部をいう。
【0018】
用語「Fn14」は、J.Biol.Chem.,274:33166−33176(1999)(この全体が本明細書中に参考として援用される)において特徴付けられたTWEAKレセプタータンパク質をいう。このI型膜貫通タンパク質についてのヒトおよびマウスのアミノ酸配列は、図10Aおよび10Bに提供される。
【0019】
用語「Fn14アゴニスト」または「Fn14活性化因子」は、Fn14に対するリガンド、Fn14シグナル伝達を増強し得る任意の因子、またはFn14シグナルが細胞内で解釈される態様に影響を与え得る任意の因子をいう。Fn14アゴニストの例としては、TWEAK、可溶性抗Fn14Ab、架橋抗Fn14Abおよび多価抗Fn14Abが挙げられる。
【0020】
用語「Fn14シグナル伝達」は、Fn14経路に関連する分子反応の全て、およびFn14経路から生じるその後の分子反応をいう。
【0021】
用語「抗Fn14抗体」(「抗Fn14Ab」)は、Fn14レセプターの少なくとも1つのエピトープを認識しかつこれに結合する任意の抗体をいう。
【0022】
用語「抗Fn14モノクローナル抗体」(「抗Fn14mAb」)は、Fn14の単一のエピトープを認識しかつこれに結合する任意のモノクローナル抗体をいう。
【0023】
用語「架橋抗Fn14(m)Ab」は、抗Fn14抗体(AbもしくはmAb)架橋剤を使用して互いに架橋されて溶液中で抗体塊を形成したか、または表面またはマトリクス上で互いに近接して固定化されているかのいずれかである、Fn14に対する抗体をいう。
【0024】
用語「抗Fn14Ab(またはmAb)架橋剤」は、Abが標的細胞表面Fn14クラスタリングに結合しかつこれを増強するように、溶液中で抗Fn14Abを共有結合的にかまたは非共有結合的に凝集させ得る任意の薬剤をいう。このような架橋剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:化学的架橋剤、抗Fn14AbもしくはmAbの一部と反応する二次抗体、および抗Fn14Abに結合し得る可溶性Fcレセプターもしくは表面結合Fcレセプター(内因性であるかまたは外因的に加えられたかのいずれか)。
【0025】
用語「多価リガンド」は、1より多いレセプター結合部位を有し、そして少なくとも2つのレセプター分子を同時に結合し得かつ近傍に導き得る分子または複合体をいう。
【0026】
「I型リーダー配列」は、真核生物タンパク質のアミノ末端部分であり、これは、小胞体(ER)膜にこのタンパク質を指向させるシグナルとして作用し、しばしば分泌経路全体を通じて作用する。リーダー配列は、通常ER膜においてシグナルペプチダーゼによって切り出される。
【0027】
「シグナル配列」は、原核生物宿主における真核生物I型リーダー配列の機能的等価物であり、細菌の脂質二重膜内部へのタンパク質の移動または細菌の脂質二重膜を横切るタンパク質の移動を指向する。
【0028】
(抗Fn14抗体の供給源)
抗タンパク質(抗ペプチド)抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的プロトコル(例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor press:1988を参照のこと)によって作製し得る。
【0029】
ヒトFn14に対するポリクローナル抗体血清を、動物(例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス)に、フロイント完全アジュバント中のヒトFn14 Fc融合タンパク質を皮下注射し、ブースターをフロイント完全アジュバントで腹腔内注射または皮下注射することによる慣用的技術を使用して調製する。Fn14に対する所望の抗体を含むポリクローナル抗血清を、慣用的手順によってスクリーニングする。
【0030】
ヒトFn14融合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体(mAb)を、アジュバント非存在下でプロテインAセファロースビーズに付着させたCHO細胞由来組換えFn14融合タンパク質(Fn14 Fc)を用いて、RBFマウスの反復性腹腔内免疫によって調製する。動物を、最終的に可溶性Fn14 Fc(i.p.およびi.v.の両方)でブーストし、脾臓細胞を、古典的なプロトコルを使用して融合させ、そしてハイブリドーマを、ELISAによってスクリーニングした(Lingら、J.Interferon and Cytokine Res.,15,pp.53−59(1995))。純粋なmAbを、ハイブリドーマ培養上清よりIgGのプロテインAセファロース精製によって調製する。
【0031】
抗Fn14抗体の種々の形態をまた、標準的組換えDNA技術(WinterおよびMilstein,Nature,349,pp293−99(1991))を使用して作製し得る。例えば、「キメラ」抗体を構築し得、この抗体において、動物抗体由来の抗原結合ドメインをヒト定常ドメインに連結させている(例えば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,pp.6851−55(1984))。キメラ抗体は、ヒト臨床処置において使用する場合、動物抗体によって惹起された、観察された免疫原性応答を減少させる。
【0032】
さらに、Fn14を認識する組換え「ヒト化抗体」を合成し得る。ヒト化抗体は、特異的抗原結合を担う領域が挿入されている、大部分ヒトIgG配列を含むキメラである(例えば、WO 94/04679)。動物を、所望の抗原で免疫し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の部分を除去する。次いで、動物由来の抗原結合領域を、抗原結合領域が除かれているヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングする。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種(種間)配列の使用を最小限にし、処置した被験体において免疫応答をほとんど惹起しないようである。また、霊長類化した(primatized)mAbおよび/または完全なヒトmAbを、当該分野において周知の技術を使用して生成し得、本発明において利用し得る。
【0033】
異なるクラスの組換え抗Fn14抗体の構築をまた、抗Fn14可変ドメイン、および異なるクラスの免疫グロブリンから単離されたヒト定常ドメイン(CH1、CH2、CH3)を含むキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することによって達成し得る。例えば、抗原結合部位の結合価を増加させた抗Fn14 IgM抗体を、ヒト:鎖定常領域を保有するベクターに抗原結合部位をクローニングすることによって組換え生成し得る(Arulanandamら、J.Exp.Med.,177,pp.1439−50(1993);Laneら、Eur.J.Immunol.,22,pp.2573−78(1993);Trauneckerら、Nature,339,pp.68−70(1989))。
【0034】
さらに、標準的組換えDNA技術を使用して、抗原結合部位に近接するアミノ酸残基を変更することによって、組換え抗体のその抗原に対する結合親和性を変更し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性を、分子モデルに基づく変異誘発によって増加させ得る(Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,pp.10029−33(1989);WO 94/04679)。
【0035】
標的化される組織型または想定された特定の処置スケジュールに依存して、Fn14に対する抗Fn14Abの親和性を増加または減少させることが、所望され得る。例えば、半予防的処置について、Fn14経路を介してシグナル伝達する能力が低下した定常レベルの抗Fn14で、患者を処置することが有利かもしれない。同様に、Fn14に対する親和性が増加した抗Fn14Abは、短期間の腫瘍標的化処置に有利かもしれない。
【0036】
(溶液中の複数の抗Fn14 Abは、Fn14アゴニストとして作用する) Fn14アゴニストとして作用する、複数の抗Fn14 Abを溶液中に含む組成物が、本発明において提供される。Fn14の異なるエピトープに対するポリクローナル抗Fn14Abが、使用され得る。好ましくは、抗Fn14 Abは、Fn14の異なるエピトープおよび非重複エピトープに対するモノクローナル抗体である。
【0037】
Fn14活性化に対する複合抗Fn14 mAbアプローチは、2つの非重複エピトープを合わせることを必要とする。免疫化マウス脾臓細胞を融合し続けることによって、異なる種の動物を免疫することによって、そして異なる経路の免疫化を使用することによって、さらなるエピトープ(新たなmAbによって規定されるような)を同定し得る。
【0038】
BIAcoreクロマトグラフィー技術(Pharmacia BIAtechnology Handbook,「Epitope Mapping」,Section 6.3.2,(May 1994);Johneら、J.Immunol.Methods,160,pp.20191−8(1993)をまた参照のこと)を使用してFn14への結合について互いに競合する異なるmAbの能力を評価することによって、エピトープをまた、マッピングし得る。
(Fn14アゴニストとしての抗Fn14モノクローナル抗体の機能)
通常の2つより多いIgG抗原結合部位を含む抗Fn14 mAbもまた、細胞表面Fn14架橋剤として溶液中で機能し、従って、本発明に従うFn14アゴニストの定義内に入る。標準的組換えDNA技術およびハイブリドーマ技術を使用して、抗Fn14 mAbの抗原結合部位を、10個の抗原結合部位を有するIgM分子内に組み込み得る。
【0039】
あるいは、抗原を用いた単回の免疫後にハイブリドーマ融合技術によって単離された完全なマウス(または他の動物)のIgM分子を回収および富化し得る。IgM分子を富化する方法の1つは、CD40シグナル伝達欠損マウス(Kawabeら、Immunity,1,pp.167−78(1994);Xuら、Immunity,1,pp.423−31(1994))を免疫することである。これらのマウスは、IgGを効果的には生成し得ず、従って、抗原によるチャレンジに対するこれらのマウスの応答は、IgMアイソタイプを富化させる。
【0040】
抗Fn14 IgM抗体は、その増加した結合価によって、膜面内にFn14分子を効率的に凝集し得、これにより、抗原結合部位を2つ有するIgG対照物と比較してFn14シグナル伝達を増強し得る。レセプタークラスタリングにおける多価抗体の増加した効果の劇的な例示は、Fasレセプターに対する抗体に関して見られる。ここで、IgM形態は非常に強力であり、そして正常な二価IgGは溶液中で効果的ではない(Yonihara and Yonihara,J.Exp.Med.,169,pp.1747−56(1989);Aldersonら、Int.Immunol.,6,pp.1799−1806(1994))。
【0041】
同様に、Fasレセプターに対するapo−1 mAbは、IgG3 mAbである。このmAbは、IgG3サブタイプに特有なFc相互作用に依存してより大きな多価形態へと凝集する、強力な細胞傷害性因子である。Fc領域の除去は、より大きな凝集体に会合し得ずそして不活性であるF(ab)2形態を生成する(Dheinら、J.Immunol.,149,pp.3166−73(1992))。よって、類推によって、抗Fn14 mAbのIgMバージョンが強力な抗腫瘍因子であると予測する。
【0042】
(Fn14アゴニストを使用する処置)
本発明の組成物は、扱われる特定の臨床状態を処置するために効果的な用量で投与される。所定の適用について好ましい薬学的処方物および治療的有効量のレジメンの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度、およびその処置に対する患者の寛容を十分に考慮している当業者の範囲内にある。
【0043】
本発明の治療剤は、その選択された薬剤と適合性である任意の経路によって投与され得、そして投与経路に適切な薬学的に受容可能な任意のキャリアとともに処方され得る。好ましい投与経路は非経口であり、特に、静脈内投与、腹腔内投与および嚢内投与である。処置はまた、好ましくは、外来患者ベースで長期間にわたって行われる。治療剤の日々の投薬量は、約0.01〜1000μg/kg体重、より好ましくは約10〜300μg/kg体重の範囲内であることが予想されるが、正確な投薬量は、使用される特定の治療剤ならびに特定の被験体の健康状態および病歴に依存して変動する。
【0044】
単離および精製された形態の抗体および複合体、その塩またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む、本発明の抗Fn14 Abの投与は、抗腫瘍活性を示す薬剤の慣用的に受容された投与様式のいずれかを使用して達成され得る。
【0045】
これらの治療において使用される薬学的組成物はまた、種々の形態にあり得る。これらとしては、例えば、固体、半固体および液体の投薬形態(例えば、錠剤、丸剤、粉末、液体の溶液または懸濁物、坐剤、ならびに注射可能な溶液および注入可能な溶液)が挙げられる。好ましい形態は、投与および治療適用の意図された様式に依存する。投与の様式としては、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与または局所投与が挙げられ得る。
【0046】
抗Fn14Abは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を伴うかまたは伴わないで、滅菌された等張性の処方物中に置かれ得る。処方物は、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥された粉末であり得る。例えば、抗Fn14Abは、5.0mg/ml クエン酸一水和物、2.7mg/ml クエン酸三ナトリウム、41mg/ml マンニトール、1mg/ml グリシンおよび1mg/ml ポリソルベート20を含む処方緩衝液で希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され得、冷凍庫内で貯蔵され得、滅菌したWater−For−Injection(USP)で投与される前に再構成され得る。
【0047】
組成物はまた、好ましくは、当該分野において周知の従来の薬学的に受容可能なキャリアを含み得る(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Editin,1980,Mac Publishing Companyを参照のこと)。このような薬学的に受容可能なキャリアとしては、他の医療用薬剤、キャリア、遺伝的キャリア、アジュバント、賦形剤など(例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物)が挙げられ得る。組成物は、好ましくは単位用量の形態であり、通常1日に1回以上投与される。
本発明の薬学的組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微小粒子送達系、あるいは患部組織中、患部組織のそば、もしくは患部組織と連絡してか、または血流に置かれる徐放性処方物を使用して投与され得る。徐放性キャリアの適切な例としては、坐剤または微小カプセルのような形状の物品の形態での半透過性のポリマーマトリクスが挙げられる。移植可能な徐放性マトリクスまたは微小カプセルの徐放性マトリクスとしては、以下が挙げられる:ポリ乳酸(米国特許第3,773,319号;EP 58,481)、L−グルタミン酸とγエチル−L−グルタメートとのコポリマー(Sidmanら、Biopolymers,22,pp.547−56(1985));ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはエチレンビニルアセテート(Langerら、J.Biomed.Mater.Res.,15,pp.167−277(1981);Langer,Chem,Tech.,12,pp.98−105(1982))。
【0048】
抗Fn14Abを含むリポソームは、周知の方法によって調製され得る(例えば、DE 3,218,121;Epsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82,pp.3688−92(1985);Hwangら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,pp.4030−34(1980);米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号を参照のこと)。通常、リポソームは、小さな(約200〜800Å)単層型であり、ここで、脂質含量は、約30モル%コレステロールより多い。コレステロールの割合は、抗Fn14 Ab放出の最適な速度を制御するように選択される。
【0049】
本発明の抗Fn14Abはまた、他のFn14活性化因子、IFN−(代表的に、腫瘍領域に見出される)を補充した化学療法剤を含む、リポソームに結合され得る。リポソームのTWEAK複合体および抗Fn14Abの結合は、標的化された送達について、毒素または化学療法剤を抗体に結合するために広範に使用されているヘテロ二官能性架橋剤のような、公知の任意の架橋剤によって達成され得る。リポソームの結合体化はまた、炭化水素指向型架橋剤である4−(4−マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド(MPBH)(Duzgunesら、J.Cell.Biochem.Abst.Suppl.16E 77(1992))を使用して達成され得る。
【0050】
腫瘍を保有するヒトに慣用的な抗腫瘍治療(すなわち、放射線療法および化学療法)と組み合わせてmAbが投与されることが、想定される。Fn14活性化の慣用的化学療法との併用処置は、慣用的な抗腫瘍治療が単独で使用される場合よりも患者の腫瘍形成細胞をより清澄化するようである腫瘍殺傷活性の外因子を提供し得る。
【0051】
このアプローチは比較的副作用を有し得ず、従って、転移し得なかった癌腫の場合に半予防的意味で与えられ得るか、または特定の型の癌について遺伝的な素因を示す家系由来の患者において与えられ得ることが、さらに可能である。
【0052】
以下は、本発明の方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定として解釈されるべきではなく:これらの実施例は、例示の目的で含まれ、そして本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0053】
(実施例)
(実施例1:TWEAKは、塩基性線維芽細胞増殖因子と血管内皮増殖因子に対する内皮細胞応答を調節する)
(細胞および培養条件)−ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)およびヒト皮膚微小血管内皮細胞(HDMEC)を、Cell System Corporation(CS−C)(Kirkland,WA)またはClonetics(San Diego,CA)から得た。大動脈EC、大動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞、胚筋芽細胞およびヒト末梢血樹状細胞を、Cloneticsから購入した。HUVECおよびHDMECを、10%ウシ胎仔血清(FBS)と供給増殖補充物とを含むCS−C完全培地中で慣用的に継代し、そして7回継代まで実験において使用した。生存研究を、特定したようなCS−C完全培地およびCS−C培地(FBSを含まない、および増殖補充物を含まない)中で実施した。増殖実験、移動実験および免疫蛍光染色実験のために、2% FBSと供給増殖補充物とを含むEC基底培地(EBM)(本明細書中で「完全培地」と規定する)、および2% FBSを含むEBM(本明細書中で「基底培地」と規定する)を、使用した(Clonetics)。毛細管形成アッセイのために、5% FBSと供給増殖補充物とを含むEC基底培地2(EBM−2)を、使用した(Clonetics)。MS−1細胞株およびM210B4細胞株を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入した。200 g/mlの抗CD3モノクローナル抗体(mAb)(クローン2C11)(Pharmingen,San Diego,CA)を用いてインビボで活性化した24〜48時間後に、マウスリンパ系細胞を得た。チオグリコレート誘導性末梢マクロファージを、インターフェロンγ(IFNγ)(100単位/ml)、TNF−β(10μg/ml)、またはリポ多糖(LPS)(1μg/ml)を用いてインビトロで48時間刺激した。
【0054】
(試薬および抗体)−組換えヒトbFGFを、増殖供給補充物(Clonetics)として入手し、そしてbFGFおよびVEGFをまた、R&D Systems(Minneapolis,MN)およびSigma(St.Louis,MO)から購入した。Annexin V−FITCおよびプロピジウムヨーダイト(PI)を、Pharmingenから入手した。R&D(Minneapolis,MN)から入手した、マウス抗ヒトTNF−β mAb、およびマウス抗ヒトIL−8 mAb、ならびにアイソタイプ適合コントロールIg MOPC21(ICN Biomedicals Inc.,Irvine,CA)を、ブロッキング研究のために使用した。ビオチン結合化抗FLAGを、Eastman Kodak Company(New Haven,CT)から入手し、そしてフィコエリトリン(PE)−ストレプトアビジンを、Southern Biotechnology Associates,Inc.(Birmingham,AL)から入手した。
【0055】
(TWEAK特異的mAb)−可溶性ヒトTWEAKタンパク質による免疫および標準的ハイブリドーマ生成手順によって、アルメニアハムスターにおいて、BE.B3、AB.G11およびAB.D3を生成した。AB.D3およびAB.G11がヒトおよびマウスのTWEAKに結合し、BE.B3がヒトTWEAKに結合する能力を、96ウェルマイクロタイタープレート上に固定した組換え可溶性TWEAKタンパク質を使用するELISAアッセイにおいて示した。AB.D3およびAB.G11のブロッキング活性が、FACS分析においてHT29細胞に可溶性フラッグ(flag)タグ化ヒトTWEAKが結合することを阻害することが、これらのmAbによって示されたが、BE.B3によっては示されなかった。BE.B3を、製造業者のプロトコルに従ってImmunoPure Biotinylationキット(Pierce,Rockford,IL)を使用して、ビオチン化した。ハムスターコントロールIg(クローンHa4/8−3.1)を、American Type Culture Collectionから入手し、そしてmAbを、Protein A Fast Flowカラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)により、培養物上清から精製した。
【0056】
(組換え可溶性ヒトTWEAKタンパク質)−アミノ酸残基A106〜H249を含む組換え可溶性ヒトTWEAK(GenBank登録番号AF030099)を、酵母Pichia pastoris(Invitrogen,location)において、N末端フラッグ(flag)エピトープとともにかまたはN末端フラッグエピトープを含まないかのいずれかで、発現させた。可溶性ヒトTWEAKを発現するpichiaからの発酵培地を濃縮し、そして20mM Tris−HCl(pH8.0)においてダイアフィルトレーションし、そしてQ Sepharoseカラム上でイオン交換し、その後、Znキレートカラムにローディングした。可溶性TWEAKを、20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム(pH7.5)中でのイミダゾール勾配によって溶出した後、Sephacryl 300カラムを使用するサイズ排除によって最終的に分画した。
【0057】
(アポトーシスの分析)−血清枯渇実験のために、HUVECまたはHDMECを、1.2×105細胞/ウェルの密度にて6ウェルプレートに播種し、そしてCS−C完全培地にて一晩インキュベートした。各実験の直前に、細胞をリン酸生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)およびヘパリン(10μg/ml)を補充し、VEGF(10ng/ml)もしくはTWEAK(200ng/ml)を含むかまたは含まない、CS−C完全培地またはCS−C培地において、48時間培養した。示される場合、2μg/mlの抗TWEAK mAb AB.G11またはコントロールIgもまた、添加した。48時間後、細胞を、PBSで洗浄し、そしてジスパーゼ(dispase)(CS−C)とともに37℃で15分間インキュベートすることにより剥離させ、その後、5mM EDTAと0.1% BSAとを含むPBSで37℃にて15分間置換した。PBS中でさらに1回洗浄した後、供給業者に従って、細胞を、FITC−Annexin−Vおよび5μg/ml PIで染色した。FACStarPLUS(Becton Dickinson,San Jose,CA)を使用して、1時間以内に蛍光を分析した。
【0058】
(増殖アッセイ)−HUVECを、96ウェルマイクロタイタープレート中にサブコンフルエント(4000細胞/ウェル)で配置し、そして供給増殖補充物を添加しないCS−C培地において一晩培養した。培地を、上記に規定したような完全培地または基底培地で置換した。TWEAK(100ng/ml)を含むかもしくは含まないか、bFGF補充物(Clonetics)の1/500〜1/1000希釈物もしくは1ng/ml(R&D Systems)を使用するbFGFを含むかもしくは含まないか、VEGF(10ng/ml)を含むかもしくは含まないか、またはこれらの因子の組み合わせを含むかもしくは含まない、基底培地において、細胞を培養した。示される場合、抗TWEAK mAbであるAB.D3、BE.B3またはハムスターコントロールIg Ha4/8 10μg/mlもまた、添加した。細胞を、5% CO2ととともに37℃にて3日間インキュベートし、そして培養の最後の10時間の間3H−チミジンでパルスすることによって、増殖を測定した。細胞結合性放射能を、BetaplateTM(EG&G Wallac,Gaithersburg,MD)を用いて測定した。
【0059】
(内皮創傷修復アッセイ)−標準的創傷修復アッセイを、以前に記載された(Morales,D.E.ら、Circulation 91(3):755(1995))のように使用した。簡単に述べると、HUVECのコンフルエントな単層を、2mmグリッドを備えた35×10mm細胞培養皿(Nalge Nunc International,Napervile,IL)において、CS−C完全培地中で増殖させた。1mmのチップを用いた、その皿の直径を通る2本の垂直な線によって、その単層を傷つけた。取り外された細胞を吸引し、そしてプレートをPBSでリンスした。TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1/1000または1ng/ml)、VEGF(10ng/ml)もしくはこれらの組み合わせを含むかまたは含まない、上記で規定したような完全培地または基底培地において、細胞を18時間培養し、その後、1%パラホルムアルデヒドで固定し、その後、Harris Hematoxylin(Sigma、St.Louis、MO)で染色した。間隔が移動細胞により見えないグリッドの数を眼で計数することによって、創傷修復を定量した。この数を、創傷を並べたグリッドの総数で除算し、そして結果を、平均創傷修復パーセンテージ±SEMとして表した。
【0060】
(免疫蛍光染色)−細胞を、flag−TWEAKと共にインキュベートすることによってTWEAK結合について分析し、そして結合を、ビオチン化マウス抗flag mAbまたはビオチン化BE.B3のいずれか、およびストレプトアビジン−PEを用いて検出した。非標識競合を、100ng/mlのflag−TWEAKおよび漸増濃度の非タグ化TWEAKを用いて行い、結合を、ビオチン化マウス抗flag mAbを用いて検出した。AB.D3 AbによるTWEAK結合のブロックを、10μg/mlのmAbとのflag−TWEAKのプレインキュベーションによって行った。
【0061】
(毛細血管形成アッセイ)−ECによる毛細血管形成を、以前に記載された方法(Machら、Am J Pathol 154、(1):229(1999))に基づく、フィブリンマトリクスゲルアッセイを使用して分析した。手短に言うと、4mg/mlの無プラスミノーゲンヒトフィブリノーゲン(Calbiochem、San Diego、CA)を、ヘパリンおよびポリミキシンB(両方とも、1μg/ml)(Sigma)、ならびにVEGFおよびbFGFを除く全ての供給補充物を含む、無血清EBM−2培地中に溶解した。フィブリン溶液を濾過滅菌し、そしてフィブリンマトリクスを、トロンビン(20〜50ミリユニット/ml)(Sigma)を添加し、そして24ウェルプレート中の1ウェル当たり300μlで分配することによって、調製した。HUVEC(4×104細胞/cm2)をゲル表面に播種し、そしてTWEAK、bFGF、VEGFまたはこれらの因子の組み合わせの存在下または非存在下で、上記のEBM−2培地および5% FBSを重層した。TWEAKを1μg/mlまたは100ng/mlで、bFGFを100ng/mlで、そしてVEGFを50ng/mlで用いて、類似の結果が得られた。いくつかの実験において、TNFに特異的な中和mAb(1μg/ml)およびIL−8に特異的な中和mAb(10μg/ml)またはアイソタイプコントロールIgを、使用した。48〜72時間の培養後、ゲル表面の位相差顕微鏡写真を撮影した。ゲルを、10%エタノールで10分間固定し、元のウェルから新しいウェルに移し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包理視、切片化(5ミクロン)し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【0062】
(RNase保護アッセイ(RPA))−RPAを、hAngio multiprobe Template Set(Pharmingen)を使用して行った。HUVECを、5% FBSならびにbFGFおよびVEGFを除く供給補充物を含むEBM−2培地中で、接着単層として培養した。TWEAK、VEGFまたはVEGF+TWEAKを添加し、そしてRNAを16時間の培養後に単離した。
【0063】
(結果)
(TWEAK結合は細胞型限定性である)−どの細胞型がTWEAK活性の標的であり得るかを決定するために、本発明者らは、免疫蛍光染色によって、組換え可溶性ヒトTWEAKに結合する能力について、種々の初代細胞を調査した。表Iに示されるように、TWEAKは、ヒトの静脈および動脈のEC、動脈平滑筋細胞、胚性筋芽細胞、およびより低い程度で、肺線維芽細胞に結合した。flag−TWEAK結合は、AB.D3 mAbでのブロッキングおよび独立したTWEAK調製物での非標識競合によって明らかにされるように、用量依存性かつ特異的であった(図1およびデータは示さず)。同様に、TWEAKは、マウスのECおよび線維芽細胞株に結合した。しかし、TWEAKは、いかなるヒト白血球(新鮮に単離されたか、または種々の条件下で活性化されたかのいずれか)にも検出可能に結合しなかった。
【0064】
(TWEAKはEC生存を促進する)−TWEAKがEC生存を促進する能力を、TWEAKの非存在下または存在下の無血清培地中でHUVECを培養することによって試験した。これらの条件下でのHUVECの生存性を、VEGFを補充した無血清培地中での生存性(Nor,J.E.ら、Am J Pathol、154(2):375(1999))またはCS−C完全培地中での生存性と比較した。細胞生存性を、アネキシンV(Annexin V)(アポトーシスについての初期マーカー)での標準的な二重染色およびPI色素排除によって測定した。図2Aに示されるように、CS−C完全培地中で培養した細胞は、48時間で生存可能なままであったが(97%)、さらなる因子を含まない無血清培養物中では、生存細胞は、25%に減少し、有意な割合のアポトーシス細胞(48%)および死細胞(26%)が現れた。しかし、TWEAKの存在下で、HUVECは、アポトーシスからほとんど保護されたままであった(73% 生存性)。TWEAKで達成されたこのEC生存の程度は、VEGFで達成されたEC生存の程度に匹敵した。無血清培地中でのHDMECの生存もまた、TWEAKによって増強されたが、HUVECよりも低い程度であり、そしてこの活性は、抗TWEAK mAb AB.G11によって特異的に阻害された(図2B)。
【0065】
(TWEAKは、bFGFと協同してEC増殖を増加させる)−本発明者らは、TWEAKを単独で含むか、または2つの重要な脈管形成因子と組み合わせて含む、基底培地中で培養したHUVECの3Hチミジンの取り込みを測定することによって、増殖に対するTWEAKの効果をさらに試験した。TWEAKは、HUVEC増殖に対する、小さい有意でない増加(基底培地と比較して平均1.6倍の増加)(n=7回の独立した実験)を誘導した。対照的に、TWEAKおよびbFGFと共に培養した細胞は、bFGFのみの存在下で培養した細胞と比較して、有意に増強された増殖応答を示した(図3A)。達成された3Hチミジンの取り込みのレベルは、完全培地中で培養したECの取り込みと匹敵するかまたはそれより高かった。同様の結果が、1ng/mlのbFGFを使用して得られた。bFGFとのTWEAKの相乗活性は、抗TWEAK mAb AB.D3によって完全に阻害され、これは、TWEAKの効果が特異的であることを示すが、抗TWEAK mAb BE.B3によってもコントロールIgによっても阻害は見られなかった。対照的に、TWEAKは、VEGFに対する増殖応答に影響しなかった(図3B)。
【0066】
(TWEAKは、bFGF依存性EC移動を増強し、そしてVEGF依存性EC移動を阻害する)−TWEAKがEC移動をもたらす能力もまた、他の脈管形成因子の存在下および非存在下で評価した。コンフルエントなHUVEC単層に傷をつけ、そして創傷修復の程度を測定することによって、EC移動を最初の18時間モニターした。基底培地へのTWEAKまたはbFGFの添加は、低レベルの創傷修復を誘導する。対照的に、TWEAKおよびbFGFの両方で処理した培養物は、基底培地中で維持した培養物またはいずれかの因子のみで刺激した培養物よりも効率的に修復された(図4)。対照的に、創傷修復は、VEGFのみで処理した培養物と比較して、TWEAK+VEGFで処理した培養物において減少された。このように、TWEAKは、bFGFと協同し、創傷修復に対するVEGFの効果をアンタゴナイズする。
【0067】
(TWEAKは、bFGFおよびVEGFによって誘導されるEC形態発生を差示的に調節する)−微小血管の成長は、ECの同調的な増殖、移動、および毛細血管構造への形態発生的組織化に関与する。形態発生活性に対するTWEAKの効果を、bFGFまたはVEGFの存在下または非存在下でフィブリンゲルの表面上に播種したECの培養物を使用して評価した。本発明者らは、位相差顕微鏡によって示されるように、bFGFが、フィブリンゲル表面上のEC単層における形態学的変化を誘導するが、TWEAKは誘導しないこと(図5A)、およびbFGFへのTWEAKの添加が、これらの形態学的変化を顕著に増強し、毛細血管出芽数の2倍の増加を誘導すること(図6)を、見出した。さらに、マトリクス表面に対して垂直の断面の組織学的分析は、bFGFが、フィブリンマトリクスへのEC浸潤を促進するが、TWEAKが促進しないこと、および、bFGFへのpTWEAKの添加が、内腔含有構造の形成を誘導すること(図5B)を明らかにした。同様の結果は、いくつかの異なるEC型(HUVEC、HDMEC、ヒト肺動脈EC、およびヒト肺微小血管ECを含む)で得られたが、内腔形態発生の刺激は、TWEAKを別のTNFファミリーメンバーであるCD40Lによって置換した場合に観察されなかった(データは示さず)。TWEAKとbFGFとの間の協同は、TWEAKがIL−8(Chicheportiche,Yら、J Biol Chem、272(51):32401(1997))および/またはTNF(Schneider,P.R.ら、Eur J Immunol、29(6):1785(1999))(インビトロでECの形態発生を協同的に促進することが以前に示されたサイトカイン(Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997);Koolwijk,P.ら、The J.of Biol.Chem.、132:1177(1996))を誘導する能力に起因し得る。しかし、図6に示されるように、TWEAK+bFGFによって形成される毛細血管出芽の数は、これらの因子に対する中和mAbの存在下で減少されなかった。これらのmAbの阻害活性は、独立して確かめられ、抗TNF mAbは、腫瘍殺傷を阻害し、そして抗IL−8は、IL−8誘導性EC増殖を阻害する(データは示さず)。
【0068】
VEGFはまた、フィブリンゲル表面上のHUVEC単層の再構成により証明されるように、EC形態形成を誘導した(図7)。VEGFにより誘導された構造の外観は、bFGFにより誘導された構造の外観とは、質的に異なり、そしてフィブリンマトリクスへのEC浸潤はなかった。興味深いことに、TWEAK+VEGFを用いて処理したコンフルエントなEC単層は、再構成されず、そして未処理の培養物およびTWEAKのみで処理した培養物に外観が類似していた。従って、TWEAKは、bFGFと協同して毛細管様構造の形成を誘導するが、VEGFに対するHUVECの形態学的応答をアンタゴナイズする。
【0069】
(TWEAKは、VEGFレセプターFLT1の発現を阻害する)−TWEAKは、VEGFのレセプターを通じるVEGFシグナル伝達を調節することによって、VEGFに対するEC応答を制御し得る。脈管形成サイトカインおよびレセプターのパネルにおけるRPA発現分析を、この可能性を扱う手段として行った。本発明者らの結果(図8)は、コントロール培養物と比較した、VEGFを用いて処理した培養物におけるFLT1の発現の増加を示す。TWEAKのみで処理した培養物は、コントロールと類似していた(データ示さず)。興味深いことに、この応答は、TWEAK+VEGFで処理した培養物中で阻害された。従って、TWEAKは、VEGFの存在下でのFLT1のmRNAレベルを低下させた。本発明者らのRPA分析はまた、TIE(新脈管形成に必要とされる別のECレセプター)の発現のTWEAKによる阻害を示す(Sato,T.N.ら、Nature,376(6535):70−74(1995))。これらのデータは、TWEAKが、脈管形成因子によりシグナル伝達を調節し得る機構を示唆する。
【0070】
従って、これらの結果は、TWEAKが、VEGFに対するECの形態学的応答をアンタゴナイズし、そしてVEGF誘導性EC移動を阻害するが、VEGFの存在下でのEC増殖に対する測定可能な効果はなく、そしてTWEAKの作用は、特定の脈管形成状況に依存して、前脈管形成的かまたは抗脈管形成的であり得る。
【0071】
bFGFの状況におけるTWEAKの前脈管形成活性と対照的に、これらの結果は、TWEAKが他の設定におけるECの脈管形成行動を阻害し得ることを示す。TWEAKは、両方の因子の存在下でのフィブリンゲル表面上にプレートしたコンフルエントなEC単層の外観における、もしあったとしてもわずかな変化により証明されるように、VEGFにより誘導されるEC形態形成を阻害する。TWEAKのこの抗脈管形成効果は、創傷修復アッセイにおいて独立して観察されたVEGF依存EC移動のTWEAK阻害を反映し得る。VEGFのみと比較した場合、TWEAKおよびVEGFを用いて処理した培養物中のインテグリンαv、α1、α2、α5、β3、およびβ1の発現に変化はなかった(A.Jakubowski,未公開の観察)。しかし、本発明者らは、VEGFレセプターFlt−1の誘導性発現が、TWEAKの添加により阻害されたことを見出した。従って、TWEAKは、VEGFのレセプターを介してVEGFシグナル伝達を調節することにより、VEGFに対するEC応答を制限し得る。このことは、腫瘍生物学を理解および有効にするのに特に重要であり、ここでの内因性VEGFの役割は、腫瘍の進行に重要である(Ferrars,N.およびDavis−Smyth,T.,Endocrine Reviews,18:4−25(1997))。
【0072】
このデータは、TNFパラダイムと合わせて、TWEAKが特定の脈管形成設定に依存して新脈管形成を差次的に調節し得るという仮説を支持する。これらの結果は、それが微小血管成長のインビボでの調節、再構築、および/または維持において役割を果たし、脈管形成の状況に依存して前脈管形成的であるかまたは抗脈管形成的であることを示す。TWEAK経路のアゴニスト(またはアンタゴニスト)は、虚血性損傷、癌、脈管増殖性障害および炎症性障害の設定における処置に対して有用な治療アプローチを提供し得る。
【0073】
(実施例2:ルイス肺癌の増殖は、TWEAKトランスジェニック(Tg)マウスにおいて阻害される)
インビトロ細胞株におけるルイス肺癌を、Tumor Repository、NCI−Frederick Cancer Research and Development Centerから入手した。この細胞株を、インビトロでRPMI−1640/10%FBS中で抗生物質なしで4継代まで継代した後、動物に移植した。(C57BL/6マウス系統起源の)腫瘍細胞を、1匹のマウスあたり1×106細胞の接種量で、TWEAK−Tgマウスおよび非Tg同腹仔(これはC57BL/6バックグラウンドで連続して繁殖されている)の右脇腹領域に皮下注射した。各々の実験において、腫瘍細胞を、8匹のTWEAK−Tgマウスおよび8匹の非Tg同腹仔に注射した。腫瘍の測定を、2週ごとに記録し、そして各時点での平均腫瘍重量を、各実験群について計算した。2つの別個の実験の各々についての腫瘍重量対時間のプロットを図9に示す。これは、腫瘍成長が、正常な同腹仔と比較して、TWEAKを発現するマウスにおいてより遅かったことを示す。
【0074】
(表I:主な細胞型に対するTWEAK結合)
【0075】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、平均蛍光強度(MFI) 対 TWEAK濃度を示す2つのプロットを示し(左)、点線は、間接的な検出工程のみでのバックグラウンドのMFIを示す。ヒストグラム(右)は、(1)間接的な検出工程のみでのバックグラウンド蛍光、(2)TWEAK結合、および(3)AB.D3 mAbによるTWEAK結合の阻害に対応する。
【図2】
図2は、TWEAKでの処理後に生存しているか、アポトーシス状態であるか、または死んでいる、(A)HUVEC細胞および(B)HDMEC細胞のパーセンテージを示す、2つの棒グラフを示す。ECを、CM(10%FBSおよび増殖補充物を含む、CS−C完全培地)、0% FBS(FBSおよび増殖補充物を含まず、かつ0.1% BSAおよび10μg/mlヘパリンを補充した、CS−C培地)、およびTWEAKもVEGFも含まない0% FBS中で、48時間培養した。抗TWEAK mAb AB.G11およびコントロールIgを、示されるように添加した。細胞を、FITC−Annexin−VおよびPIで染色し、そして生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞のパーセンテージを示した。これらの結果の各々は、2回の独立した実験を表す。
【図3】
図3は、bFGF依存性の増殖を示す、2つの棒グラフを示す。HUVECを、完全培地中または基底培地中で3日間培養した。TWEAK(100ng/ml)、bFGF(1/500希釈)、VEGF(10ng/ml)またはこれらの因子の組み合わせを、示されるように基底培地に添加し、そして増殖を、3Hチミジンの取り込みによって測定した。(A)示されるデータは、3連のウェルの平均値+/−SDである。これらの結果は、4回の独立した実験を示す。増殖因子に加えて、ブロッキング抗TWEAK mAb AB.D3、非ブロッキング抗TWEAK mAb BE.B3、および無関係のハムスターコントロールIg Ha4/8(10μg/ml)を、示されるように添加した。結果は、2回の独立した実験を示す。(B)示される結果は、3連のウェルの平均値+/−SDであり、そして4回の独立した実験を示す。
【図4】
図4は、bFGF依存性HUVEC移動に対するTWEAKの効果を示す、棒グラフを示す。TWEAK、bFGF、VEGFおよびこれらの因子の組み合わせで処理したコンフルエントなHUVEC単層に傷をつけ、そして18時間の培養後に修復を測定した。示される結果は、4回の実験の平均+/−SEMである。
【図5A】
図5Aは、未処理、あるいはbFGF、TWEAKまたはbFGF+TWEAKで処理した、3日間の培養後のフィブリンゲルマトリクスの表面上のHUVECの位相差画像を示す。全ての画像は、4×の倍率である。これらの結果は、8回の独立した実験を示す。
【図5B】
図5Bは、フィブリンゲル培養物のヘマトキシリン染色切片およびエオシン染色切片を示す。未処理およびTWEAK処理した培養物中のEC細胞は、フィブリンゲル表面上に残存する。浸潤しているECの紐様構造が、bFGF処理培養物中に示され、そしてTWEAK+bFGF処理培養物中に、内皮内腔の構造組織化が示される。同様の結果が、4つの独立したEC型から得られた。
【図6】
図6は、TWEAKおよびbFGFでの処理後の毛細血管出芽の数を示す、棒グラフを示す。HUVECをフィブリンゲルマトリクス上にプレートし、そして処理なしでか、または示されるような因子および抗TNF mAbおよび抗IL−8 mAbと共に48時間で培養した。毛細血管出芽を、1ウェル当たり5つの領域を使用して、可視的に計数した。これらの結果は、4回の独立した実験を示す。
【図7】
図7は、未処理、あるいはVEGF、TWEAKまたはTWEAK+VEGFで処理した、3日間の培養後のフィブリンゲルマトリクスの表面上のHUVECの位相差画像を示す。全ての画像は、4×の倍率である。
【図8】
図8は、VEGFレセプターFLT1のmRNAレベルが、VEGFのみで処理した培養物と比較して、TWEAK+VEGFで処理した培養物において減少されることを示す、ゲル電気泳動画像である。
【図9A】
図9Aは、移植後の日数での腫瘍重量(mg)としてプロットしたTWEAKトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖を示す。
【図9B】
図9Bは、移植後の日数での腫瘍重量(mg)としてプロットしたTWEAKトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖を示す。
【図10】
図10Aは、I型膜貫通タンパク質Fn14[Homo Sapiens]のアミノ酸配列である。図10Bは、I型膜貫通タンパク質Fn14[Mus Musculus]のアミノ酸配列である。
脈管形成は、種々の正常な事象および病理学的事象(例えば、女性の生殖周期、胎児の発達、創傷治癒、炎症および腫瘍進行)の間の組織再構築の必須の要素である(Han,Z.C.およびY.Liu、Int.J.Hematol、70(2):68(1999);Folkman,J.、Nat.Med.、1(1):27(1995))。微小血管の成長は、内皮細胞の同調的な移動、増殖、分化および毛細血管構造への形態発生的組織化に関与する。新生血管のさらなる安定化および成熟は、その血管壁への隣接する間葉細胞の動員を介して生じる(Bussolino,F.A.、Trands Biochem Sci.、22(7):251(1997))。発生中の血管および休止中の血管の維持は、適切な生存シグナルの利用能に依存する。これらの脈管形成事象は、細胞外因子(いくつかのクラスのサイトカイン、細胞外マトリクスおよびインテグリンを含む)のネットワークによって、そしてそれらの同族のレセプターによって、調整される。
【0002】
多くの公知の脈管形成調節因子は、腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーに属する。このファミリーのリガンドは、II型膜タンパク質として発現され、これは、タンパク質分解的に切断され、可溶性のサイトカインを生成し得る(Smith,C.A.ら、Cell、76:959(1994))。これらのリガンドは、TNFレセプターファミリーにおけるそれらの対応するレセプターを介して結合しそしてシグナル伝達することによって、生物学的活性を誘発する。TNFファミリーメンバーの大半は、宿主防御、炎症および免疫学的調節を媒介する(Vassalli,P.Annu Rev Immunol、10:411(1992);De Togni,P.J.ら、Science,264(5159):703(1994);Nagata,S.およびGoldstein,P.、Science、267:1449(1995);Foy,T.M.ら、Annu Rev Immunol、14:591(1996);Mackay,F.ら、J.Exp Med、190(11)1697(1999))。さらに、これらのリガンドのいくつか(TNF−β、Fasリガンド(FasL)、血管内皮増殖インヒビター(VEGI)またはTLIを含む)、およびTWEAKは、EC機能を調節することが示されている(Frater−Schroder,M.W.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5277(1987);Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997);Ruegg,C.ら、Nat Med、4(4):408(1998);Fajardo,L.F.ら、Am J Pathol、140(3):539(1992);Leibovich,S.J.、Nature、329(6140):630(1987);Biancone,L.、J Exp Med、186(1):147(1997);Yue,T.ら、J.Biol.Chem、274:1479(1999);Zhai,Y.ら、Faseb J、13(1):181(1999))。ECの挙動に対するTNF−αの効果は、複雑である。TNF−αは、インビトロでEC増殖を阻害するが、毛細管形成を誘導する(Frater−Schroder,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5277(1987);Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997))。これはまた、固形腫瘍の環境下で抗脈管形成性であり得るか(Ruegg,C.A.Nat Med、4(4):408(1998))、またはインビボでの角膜設定下で脈管形成性である(Frater−Schroder,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5277(1987);Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997);Fajardo,L.F.ら、Am J Pathol、140(3):539(1992);Leibovich,S.J.、Nature、329(6140):630(1987))。Fas/FasL相互作用は、インビボで内皮毛細管形成を誘導し得、これはおそらく、ヘパリン結合増殖因子の産生を誘発することによる(Biancone,L.ら、J.Exp Med、186(1):147(1997))。一方、VEGIは、ECの生存および増殖を阻害する(Zhai,Y.ら、Faseb J、13(1):181(1999);Yue,T.ら、J.Biol.Chem.、274:1479(1999))。TNFリガンドファミリーの新規メンバーであるTWEAK(Chicheportiche,Y.ら、J Biol Chem、272(51):32401(1997))は、いくつかの上皮腫瘍細胞株において脈管形成性ケモカインであるインターロイキン−8(IL−8)の発現を誘導する。最近、TWEAKは、減少した増殖因子条件下での、培養ヒトECの増殖および角膜新生血管形成の両方を誘導することが報告された(Lynch,C.N.ら、J.Biol.Chem.、271(13):8455(1999))。
【0003】
発現クローニングの使用によって、TWEAKに対するレセプタータンパク質が、「Fn14」であることが最近同定された。このタンパク質は、元来、FGF−1誘導最初期応答遺伝子として特徴付けられた(J.Biol.Chem.274:33166−33176(1999)およびWO98/55508)。Fn14は、(TWEAKと比較した場合)成体組織においてより限定された発現パターンを有し、今日までに記載される中で最も小さいTNFレセプターであり、たった1つのシステインリッチ反復しか有さない。
【0004】
(発明の要旨)
脈管形成の誘導においてTWEAKおよびFn14によって果される役割(WO01/45730を参照のこと)に加えて、本発明者らは、Fn14アゴニストまたは活性化因子(例えば、TWEAKおよびアゴニスト抗Fn14モノクローナル抗体)が、脈管形成の阻害を介して間接的にか、または直接的な抗腫瘍活性によって、実際に(1)脈管形成を阻害し、そして(2)腫瘍の進行を遅くさせることを発見した。
【0005】
従って、本発明は、治療有効量の、TWEAKレセプターに対するアゴニストを投与することによって脈管形成を調節する方法を提供する。好ましい実施形態において、TWEAKレセプターは、Fn14である。他の好ましい実施形態において、Fn14レセプターアゴニストは、TWEAKであるかまたは抗Fn14モノクローナル抗体である。本発明は、好ましくは、治療有効量の、TWEAKレセプターに対するアゴニストを投与することによって脈管形成を阻害する方法を提供する。
【0006】
本発明はまた、治療有効量のTWEAKレセプターに対するアゴニストを投与することによって腫瘍進行を阻害する方法を提供する。好ましい実施形態において、TWEAKレセプターは、Fn14である。他の好ましい実施形態において、Fn14アゴニストは、TWEAKであるかまたは抗Fn14モノクローナル抗体である。
本発明はまた、治療有効量の、TWEAKレセプターに対するアゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を意図する。
【0007】
本発明の方法が脈管形成を調節することを意図する程度に、これらは、新生血管形成を促進するために増強した脈管形成活性が所望される疾患において、処置として有用である。このような疾患および状態としては、以下が挙げられる:心筋虚血状態(例えば、心筋梗塞、心筋虚血または心臓以外の領域への不十分な血流(末梢血管疾患におけるような)に罹患している冠状動脈疾患を有する患者における血流(ここでは、血流の減少が問題である)の改善、壊死組織(例えば、梗塞または血管形成術後の心筋層)の血管再生、アンギナ、心臓移植片、血管移植片、ならびにこれらの病変の血管形成、灌流、膠原化および組織化を改善するための血管の再開)、創傷治癒、ならびに組織移植および器官移植(例えば、自己微小血管移植または異種微小血管移植の増強)。創傷治癒の促進としては、切開部の治癒、骨修復、痛みの治癒、心筋損傷の梗塞後修復、胃潰瘍および胃腸管の他の潰瘍の治癒、ならびに一般的な、組織の形成、維持および修復の促進が挙げられる。移植(grafted)または移植(transplanted)された組織の新生血管形成もまた、特に、血管不全に罹患している被験体(例えば、糖尿病患者)において、意図される。
【0008】
本発明の方法が脈管形成を阻害することを意図する程度に、これらは、新生血管形成を阻害するために減少した脈管形成活性が所望される疾患において、処置として有用である。このような状態としては、癌、炎症性黄斑変性、および糖尿病性網膜症が挙げられる。
【0009】
本発明の方法が腫瘍進行を阻害することを意図する程度に、これらは、所望されない細胞増殖に関連する状態(例えば、癌(前立腺癌、リンパ腫、腺癌、神経新生物、結腸癌、膵臓癌、パラガングリオーマ、乳癌、腎細胞癌、肺癌、卵巣癌、平滑筋腫、肺癌、髄膜腫、褐色細胞腫、骨肉腫および甲状腺癌を含むが、これらに限定されない))を処置するために有用である。
【0010】
(発明の詳細な説明)
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。
【0011】
用語「抗腫瘍活性」とは、物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、またはその腫瘍細胞の死を誘導する、能力をいう。
【0012】
用語「腫瘍進行の阻害」とは、物質または化合物が、その物質または化合物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、またはその腫瘍細胞の増殖および発達を減少する、能力をいう。
【0013】
用語「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死のプロセスをいう。
【0014】
用語「細胞傷害活性」は、物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する細胞の死を誘導する能力をいう。
【0015】
用語「エピトープ」(または抗原決定基)は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と結合する分子の一部と規定される。単一のエピトープは、モノクローナル抗体(mAb)によって認識される。複数のエピトープが、通常ポリクローナル抗体によって認識される。
【0016】
用語「脈管形成因子」は、このプロセスの以下の段階を含むが、これらに限定されない、脈管形成プロセスを促進する因子をいう:すなわち、細胞外マトリクスの分解、細胞増殖、細胞移動および構造的組織化(Kumarら、Int.J.Oncology 12:749−757(1998);Bussolinoら、Trends in Biochem,22:251−256(1997))。脈管形成因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、FGF−5、血管内皮増殖因子アイソフォーム(VEGF)、アンギオポエチン−1(Ang−1)およびアンギオポエチン−2(Ang−2)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD−ECGF)、肝細胞増殖因子、プロリファリン(proliferin)、B61、可溶性血管細胞接着分子−1、可溶性E−セレクチン(selection)、12−ヒドロジエイコサテトラエノン酸(hydrozyeicosatetraenoic acid)、HIV−1のTatタンパク質、アンギオゲニン、TNFα、FasL、トランスフォーミング増殖因子−β。
【0017】
抗体の「Fcドメイン」は、CH2領域、CH3領域およびヒンジ領域を含むが抗原結合部位を欠く分子の一部をいう。
【0018】
用語「Fn14」は、J.Biol.Chem.,274:33166−33176(1999)(この全体が本明細書中に参考として援用される)において特徴付けられたTWEAKレセプタータンパク質をいう。このI型膜貫通タンパク質についてのヒトおよびマウスのアミノ酸配列は、図10Aおよび10Bに提供される。
【0019】
用語「Fn14アゴニスト」または「Fn14活性化因子」は、Fn14に対するリガンド、Fn14シグナル伝達を増強し得る任意の因子、またはFn14シグナルが細胞内で解釈される態様に影響を与え得る任意の因子をいう。Fn14アゴニストの例としては、TWEAK、可溶性抗Fn14Ab、架橋抗Fn14Abおよび多価抗Fn14Abが挙げられる。
【0020】
用語「Fn14シグナル伝達」は、Fn14経路に関連する分子反応の全て、およびFn14経路から生じるその後の分子反応をいう。
【0021】
用語「抗Fn14抗体」(「抗Fn14Ab」)は、Fn14レセプターの少なくとも1つのエピトープを認識しかつこれに結合する任意の抗体をいう。
【0022】
用語「抗Fn14モノクローナル抗体」(「抗Fn14mAb」)は、Fn14の単一のエピトープを認識しかつこれに結合する任意のモノクローナル抗体をいう。
【0023】
用語「架橋抗Fn14(m)Ab」は、抗Fn14抗体(AbもしくはmAb)架橋剤を使用して互いに架橋されて溶液中で抗体塊を形成したか、または表面またはマトリクス上で互いに近接して固定化されているかのいずれかである、Fn14に対する抗体をいう。
【0024】
用語「抗Fn14Ab(またはmAb)架橋剤」は、Abが標的細胞表面Fn14クラスタリングに結合しかつこれを増強するように、溶液中で抗Fn14Abを共有結合的にかまたは非共有結合的に凝集させ得る任意の薬剤をいう。このような架橋剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:化学的架橋剤、抗Fn14AbもしくはmAbの一部と反応する二次抗体、および抗Fn14Abに結合し得る可溶性Fcレセプターもしくは表面結合Fcレセプター(内因性であるかまたは外因的に加えられたかのいずれか)。
【0025】
用語「多価リガンド」は、1より多いレセプター結合部位を有し、そして少なくとも2つのレセプター分子を同時に結合し得かつ近傍に導き得る分子または複合体をいう。
【0026】
「I型リーダー配列」は、真核生物タンパク質のアミノ末端部分であり、これは、小胞体(ER)膜にこのタンパク質を指向させるシグナルとして作用し、しばしば分泌経路全体を通じて作用する。リーダー配列は、通常ER膜においてシグナルペプチダーゼによって切り出される。
【0027】
「シグナル配列」は、原核生物宿主における真核生物I型リーダー配列の機能的等価物であり、細菌の脂質二重膜内部へのタンパク質の移動または細菌の脂質二重膜を横切るタンパク質の移動を指向する。
【0028】
(抗Fn14抗体の供給源)
抗タンパク質(抗ペプチド)抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的プロトコル(例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor press:1988を参照のこと)によって作製し得る。
【0029】
ヒトFn14に対するポリクローナル抗体血清を、動物(例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス)に、フロイント完全アジュバント中のヒトFn14 Fc融合タンパク質を皮下注射し、ブースターをフロイント完全アジュバントで腹腔内注射または皮下注射することによる慣用的技術を使用して調製する。Fn14に対する所望の抗体を含むポリクローナル抗血清を、慣用的手順によってスクリーニングする。
【0030】
ヒトFn14融合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体(mAb)を、アジュバント非存在下でプロテインAセファロースビーズに付着させたCHO細胞由来組換えFn14融合タンパク質(Fn14 Fc)を用いて、RBFマウスの反復性腹腔内免疫によって調製する。動物を、最終的に可溶性Fn14 Fc(i.p.およびi.v.の両方)でブーストし、脾臓細胞を、古典的なプロトコルを使用して融合させ、そしてハイブリドーマを、ELISAによってスクリーニングした(Lingら、J.Interferon and Cytokine Res.,15,pp.53−59(1995))。純粋なmAbを、ハイブリドーマ培養上清よりIgGのプロテインAセファロース精製によって調製する。
【0031】
抗Fn14抗体の種々の形態をまた、標準的組換えDNA技術(WinterおよびMilstein,Nature,349,pp293−99(1991))を使用して作製し得る。例えば、「キメラ」抗体を構築し得、この抗体において、動物抗体由来の抗原結合ドメインをヒト定常ドメインに連結させている(例えば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,pp.6851−55(1984))。キメラ抗体は、ヒト臨床処置において使用する場合、動物抗体によって惹起された、観察された免疫原性応答を減少させる。
【0032】
さらに、Fn14を認識する組換え「ヒト化抗体」を合成し得る。ヒト化抗体は、特異的抗原結合を担う領域が挿入されている、大部分ヒトIgG配列を含むキメラである(例えば、WO 94/04679)。動物を、所望の抗原で免疫し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の部分を除去する。次いで、動物由来の抗原結合領域を、抗原結合領域が除かれているヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングする。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種(種間)配列の使用を最小限にし、処置した被験体において免疫応答をほとんど惹起しないようである。また、霊長類化した(primatized)mAbおよび/または完全なヒトmAbを、当該分野において周知の技術を使用して生成し得、本発明において利用し得る。
【0033】
異なるクラスの組換え抗Fn14抗体の構築をまた、抗Fn14可変ドメイン、および異なるクラスの免疫グロブリンから単離されたヒト定常ドメイン(CH1、CH2、CH3)を含むキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することによって達成し得る。例えば、抗原結合部位の結合価を増加させた抗Fn14 IgM抗体を、ヒト:鎖定常領域を保有するベクターに抗原結合部位をクローニングすることによって組換え生成し得る(Arulanandamら、J.Exp.Med.,177,pp.1439−50(1993);Laneら、Eur.J.Immunol.,22,pp.2573−78(1993);Trauneckerら、Nature,339,pp.68−70(1989))。
【0034】
さらに、標準的組換えDNA技術を使用して、抗原結合部位に近接するアミノ酸残基を変更することによって、組換え抗体のその抗原に対する結合親和性を変更し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性を、分子モデルに基づく変異誘発によって増加させ得る(Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,pp.10029−33(1989);WO 94/04679)。
【0035】
標的化される組織型または想定された特定の処置スケジュールに依存して、Fn14に対する抗Fn14Abの親和性を増加または減少させることが、所望され得る。例えば、半予防的処置について、Fn14経路を介してシグナル伝達する能力が低下した定常レベルの抗Fn14で、患者を処置することが有利かもしれない。同様に、Fn14に対する親和性が増加した抗Fn14Abは、短期間の腫瘍標的化処置に有利かもしれない。
【0036】
(溶液中の複数の抗Fn14 Abは、Fn14アゴニストとして作用する) Fn14アゴニストとして作用する、複数の抗Fn14 Abを溶液中に含む組成物が、本発明において提供される。Fn14の異なるエピトープに対するポリクローナル抗Fn14Abが、使用され得る。好ましくは、抗Fn14 Abは、Fn14の異なるエピトープおよび非重複エピトープに対するモノクローナル抗体である。
【0037】
Fn14活性化に対する複合抗Fn14 mAbアプローチは、2つの非重複エピトープを合わせることを必要とする。免疫化マウス脾臓細胞を融合し続けることによって、異なる種の動物を免疫することによって、そして異なる経路の免疫化を使用することによって、さらなるエピトープ(新たなmAbによって規定されるような)を同定し得る。
【0038】
BIAcoreクロマトグラフィー技術(Pharmacia BIAtechnology Handbook,「Epitope Mapping」,Section 6.3.2,(May 1994);Johneら、J.Immunol.Methods,160,pp.20191−8(1993)をまた参照のこと)を使用してFn14への結合について互いに競合する異なるmAbの能力を評価することによって、エピトープをまた、マッピングし得る。
(Fn14アゴニストとしての抗Fn14モノクローナル抗体の機能)
通常の2つより多いIgG抗原結合部位を含む抗Fn14 mAbもまた、細胞表面Fn14架橋剤として溶液中で機能し、従って、本発明に従うFn14アゴニストの定義内に入る。標準的組換えDNA技術およびハイブリドーマ技術を使用して、抗Fn14 mAbの抗原結合部位を、10個の抗原結合部位を有するIgM分子内に組み込み得る。
【0039】
あるいは、抗原を用いた単回の免疫後にハイブリドーマ融合技術によって単離された完全なマウス(または他の動物)のIgM分子を回収および富化し得る。IgM分子を富化する方法の1つは、CD40シグナル伝達欠損マウス(Kawabeら、Immunity,1,pp.167−78(1994);Xuら、Immunity,1,pp.423−31(1994))を免疫することである。これらのマウスは、IgGを効果的には生成し得ず、従って、抗原によるチャレンジに対するこれらのマウスの応答は、IgMアイソタイプを富化させる。
【0040】
抗Fn14 IgM抗体は、その増加した結合価によって、膜面内にFn14分子を効率的に凝集し得、これにより、抗原結合部位を2つ有するIgG対照物と比較してFn14シグナル伝達を増強し得る。レセプタークラスタリングにおける多価抗体の増加した効果の劇的な例示は、Fasレセプターに対する抗体に関して見られる。ここで、IgM形態は非常に強力であり、そして正常な二価IgGは溶液中で効果的ではない(Yonihara and Yonihara,J.Exp.Med.,169,pp.1747−56(1989);Aldersonら、Int.Immunol.,6,pp.1799−1806(1994))。
【0041】
同様に、Fasレセプターに対するapo−1 mAbは、IgG3 mAbである。このmAbは、IgG3サブタイプに特有なFc相互作用に依存してより大きな多価形態へと凝集する、強力な細胞傷害性因子である。Fc領域の除去は、より大きな凝集体に会合し得ずそして不活性であるF(ab)2形態を生成する(Dheinら、J.Immunol.,149,pp.3166−73(1992))。よって、類推によって、抗Fn14 mAbのIgMバージョンが強力な抗腫瘍因子であると予測する。
【0042】
(Fn14アゴニストを使用する処置)
本発明の組成物は、扱われる特定の臨床状態を処置するために効果的な用量で投与される。所定の適用について好ましい薬学的処方物および治療的有効量のレジメンの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度、およびその処置に対する患者の寛容を十分に考慮している当業者の範囲内にある。
【0043】
本発明の治療剤は、その選択された薬剤と適合性である任意の経路によって投与され得、そして投与経路に適切な薬学的に受容可能な任意のキャリアとともに処方され得る。好ましい投与経路は非経口であり、特に、静脈内投与、腹腔内投与および嚢内投与である。処置はまた、好ましくは、外来患者ベースで長期間にわたって行われる。治療剤の日々の投薬量は、約0.01〜1000μg/kg体重、より好ましくは約10〜300μg/kg体重の範囲内であることが予想されるが、正確な投薬量は、使用される特定の治療剤ならびに特定の被験体の健康状態および病歴に依存して変動する。
【0044】
単離および精製された形態の抗体および複合体、その塩またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む、本発明の抗Fn14 Abの投与は、抗腫瘍活性を示す薬剤の慣用的に受容された投与様式のいずれかを使用して達成され得る。
【0045】
これらの治療において使用される薬学的組成物はまた、種々の形態にあり得る。これらとしては、例えば、固体、半固体および液体の投薬形態(例えば、錠剤、丸剤、粉末、液体の溶液または懸濁物、坐剤、ならびに注射可能な溶液および注入可能な溶液)が挙げられる。好ましい形態は、投与および治療適用の意図された様式に依存する。投与の様式としては、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与または局所投与が挙げられ得る。
【0046】
抗Fn14Abは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を伴うかまたは伴わないで、滅菌された等張性の処方物中に置かれ得る。処方物は、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥された粉末であり得る。例えば、抗Fn14Abは、5.0mg/ml クエン酸一水和物、2.7mg/ml クエン酸三ナトリウム、41mg/ml マンニトール、1mg/ml グリシンおよび1mg/ml ポリソルベート20を含む処方緩衝液で希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され得、冷凍庫内で貯蔵され得、滅菌したWater−For−Injection(USP)で投与される前に再構成され得る。
【0047】
組成物はまた、好ましくは、当該分野において周知の従来の薬学的に受容可能なキャリアを含み得る(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Editin,1980,Mac Publishing Companyを参照のこと)。このような薬学的に受容可能なキャリアとしては、他の医療用薬剤、キャリア、遺伝的キャリア、アジュバント、賦形剤など(例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物)が挙げられ得る。組成物は、好ましくは単位用量の形態であり、通常1日に1回以上投与される。
本発明の薬学的組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微小粒子送達系、あるいは患部組織中、患部組織のそば、もしくは患部組織と連絡してか、または血流に置かれる徐放性処方物を使用して投与され得る。徐放性キャリアの適切な例としては、坐剤または微小カプセルのような形状の物品の形態での半透過性のポリマーマトリクスが挙げられる。移植可能な徐放性マトリクスまたは微小カプセルの徐放性マトリクスとしては、以下が挙げられる:ポリ乳酸(米国特許第3,773,319号;EP 58,481)、L−グルタミン酸とγエチル−L−グルタメートとのコポリマー(Sidmanら、Biopolymers,22,pp.547−56(1985));ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはエチレンビニルアセテート(Langerら、J.Biomed.Mater.Res.,15,pp.167−277(1981);Langer,Chem,Tech.,12,pp.98−105(1982))。
【0048】
抗Fn14Abを含むリポソームは、周知の方法によって調製され得る(例えば、DE 3,218,121;Epsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82,pp.3688−92(1985);Hwangら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,pp.4030−34(1980);米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号を参照のこと)。通常、リポソームは、小さな(約200〜800Å)単層型であり、ここで、脂質含量は、約30モル%コレステロールより多い。コレステロールの割合は、抗Fn14 Ab放出の最適な速度を制御するように選択される。
【0049】
本発明の抗Fn14Abはまた、他のFn14活性化因子、IFN−(代表的に、腫瘍領域に見出される)を補充した化学療法剤を含む、リポソームに結合され得る。リポソームのTWEAK複合体および抗Fn14Abの結合は、標的化された送達について、毒素または化学療法剤を抗体に結合するために広範に使用されているヘテロ二官能性架橋剤のような、公知の任意の架橋剤によって達成され得る。リポソームの結合体化はまた、炭化水素指向型架橋剤である4−(4−マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド(MPBH)(Duzgunesら、J.Cell.Biochem.Abst.Suppl.16E 77(1992))を使用して達成され得る。
【0050】
腫瘍を保有するヒトに慣用的な抗腫瘍治療(すなわち、放射線療法および化学療法)と組み合わせてmAbが投与されることが、想定される。Fn14活性化の慣用的化学療法との併用処置は、慣用的な抗腫瘍治療が単独で使用される場合よりも患者の腫瘍形成細胞をより清澄化するようである腫瘍殺傷活性の外因子を提供し得る。
【0051】
このアプローチは比較的副作用を有し得ず、従って、転移し得なかった癌腫の場合に半予防的意味で与えられ得るか、または特定の型の癌について遺伝的な素因を示す家系由来の患者において与えられ得ることが、さらに可能である。
【0052】
以下は、本発明の方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定として解釈されるべきではなく:これらの実施例は、例示の目的で含まれ、そして本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0053】
(実施例)
(実施例1:TWEAKは、塩基性線維芽細胞増殖因子と血管内皮増殖因子に対する内皮細胞応答を調節する)
(細胞および培養条件)−ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)およびヒト皮膚微小血管内皮細胞(HDMEC)を、Cell System Corporation(CS−C)(Kirkland,WA)またはClonetics(San Diego,CA)から得た。大動脈EC、大動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞、胚筋芽細胞およびヒト末梢血樹状細胞を、Cloneticsから購入した。HUVECおよびHDMECを、10%ウシ胎仔血清(FBS)と供給増殖補充物とを含むCS−C完全培地中で慣用的に継代し、そして7回継代まで実験において使用した。生存研究を、特定したようなCS−C完全培地およびCS−C培地(FBSを含まない、および増殖補充物を含まない)中で実施した。増殖実験、移動実験および免疫蛍光染色実験のために、2% FBSと供給増殖補充物とを含むEC基底培地(EBM)(本明細書中で「完全培地」と規定する)、および2% FBSを含むEBM(本明細書中で「基底培地」と規定する)を、使用した(Clonetics)。毛細管形成アッセイのために、5% FBSと供給増殖補充物とを含むEC基底培地2(EBM−2)を、使用した(Clonetics)。MS−1細胞株およびM210B4細胞株を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入した。200 g/mlの抗CD3モノクローナル抗体(mAb)(クローン2C11)(Pharmingen,San Diego,CA)を用いてインビボで活性化した24〜48時間後に、マウスリンパ系細胞を得た。チオグリコレート誘導性末梢マクロファージを、インターフェロンγ(IFNγ)(100単位/ml)、TNF−β(10μg/ml)、またはリポ多糖(LPS)(1μg/ml)を用いてインビトロで48時間刺激した。
【0054】
(試薬および抗体)−組換えヒトbFGFを、増殖供給補充物(Clonetics)として入手し、そしてbFGFおよびVEGFをまた、R&D Systems(Minneapolis,MN)およびSigma(St.Louis,MO)から購入した。Annexin V−FITCおよびプロピジウムヨーダイト(PI)を、Pharmingenから入手した。R&D(Minneapolis,MN)から入手した、マウス抗ヒトTNF−β mAb、およびマウス抗ヒトIL−8 mAb、ならびにアイソタイプ適合コントロールIg MOPC21(ICN Biomedicals Inc.,Irvine,CA)を、ブロッキング研究のために使用した。ビオチン結合化抗FLAGを、Eastman Kodak Company(New Haven,CT)から入手し、そしてフィコエリトリン(PE)−ストレプトアビジンを、Southern Biotechnology Associates,Inc.(Birmingham,AL)から入手した。
【0055】
(TWEAK特異的mAb)−可溶性ヒトTWEAKタンパク質による免疫および標準的ハイブリドーマ生成手順によって、アルメニアハムスターにおいて、BE.B3、AB.G11およびAB.D3を生成した。AB.D3およびAB.G11がヒトおよびマウスのTWEAKに結合し、BE.B3がヒトTWEAKに結合する能力を、96ウェルマイクロタイタープレート上に固定した組換え可溶性TWEAKタンパク質を使用するELISAアッセイにおいて示した。AB.D3およびAB.G11のブロッキング活性が、FACS分析においてHT29細胞に可溶性フラッグ(flag)タグ化ヒトTWEAKが結合することを阻害することが、これらのmAbによって示されたが、BE.B3によっては示されなかった。BE.B3を、製造業者のプロトコルに従ってImmunoPure Biotinylationキット(Pierce,Rockford,IL)を使用して、ビオチン化した。ハムスターコントロールIg(クローンHa4/8−3.1)を、American Type Culture Collectionから入手し、そしてmAbを、Protein A Fast Flowカラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)により、培養物上清から精製した。
【0056】
(組換え可溶性ヒトTWEAKタンパク質)−アミノ酸残基A106〜H249を含む組換え可溶性ヒトTWEAK(GenBank登録番号AF030099)を、酵母Pichia pastoris(Invitrogen,location)において、N末端フラッグ(flag)エピトープとともにかまたはN末端フラッグエピトープを含まないかのいずれかで、発現させた。可溶性ヒトTWEAKを発現するpichiaからの発酵培地を濃縮し、そして20mM Tris−HCl(pH8.0)においてダイアフィルトレーションし、そしてQ Sepharoseカラム上でイオン交換し、その後、Znキレートカラムにローディングした。可溶性TWEAKを、20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム(pH7.5)中でのイミダゾール勾配によって溶出した後、Sephacryl 300カラムを使用するサイズ排除によって最終的に分画した。
【0057】
(アポトーシスの分析)−血清枯渇実験のために、HUVECまたはHDMECを、1.2×105細胞/ウェルの密度にて6ウェルプレートに播種し、そしてCS−C完全培地にて一晩インキュベートした。各実験の直前に、細胞をリン酸生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)およびヘパリン(10μg/ml)を補充し、VEGF(10ng/ml)もしくはTWEAK(200ng/ml)を含むかまたは含まない、CS−C完全培地またはCS−C培地において、48時間培養した。示される場合、2μg/mlの抗TWEAK mAb AB.G11またはコントロールIgもまた、添加した。48時間後、細胞を、PBSで洗浄し、そしてジスパーゼ(dispase)(CS−C)とともに37℃で15分間インキュベートすることにより剥離させ、その後、5mM EDTAと0.1% BSAとを含むPBSで37℃にて15分間置換した。PBS中でさらに1回洗浄した後、供給業者に従って、細胞を、FITC−Annexin−Vおよび5μg/ml PIで染色した。FACStarPLUS(Becton Dickinson,San Jose,CA)を使用して、1時間以内に蛍光を分析した。
【0058】
(増殖アッセイ)−HUVECを、96ウェルマイクロタイタープレート中にサブコンフルエント(4000細胞/ウェル)で配置し、そして供給増殖補充物を添加しないCS−C培地において一晩培養した。培地を、上記に規定したような完全培地または基底培地で置換した。TWEAK(100ng/ml)を含むかもしくは含まないか、bFGF補充物(Clonetics)の1/500〜1/1000希釈物もしくは1ng/ml(R&D Systems)を使用するbFGFを含むかもしくは含まないか、VEGF(10ng/ml)を含むかもしくは含まないか、またはこれらの因子の組み合わせを含むかもしくは含まない、基底培地において、細胞を培養した。示される場合、抗TWEAK mAbであるAB.D3、BE.B3またはハムスターコントロールIg Ha4/8 10μg/mlもまた、添加した。細胞を、5% CO2ととともに37℃にて3日間インキュベートし、そして培養の最後の10時間の間3H−チミジンでパルスすることによって、増殖を測定した。細胞結合性放射能を、BetaplateTM(EG&G Wallac,Gaithersburg,MD)を用いて測定した。
【0059】
(内皮創傷修復アッセイ)−標準的創傷修復アッセイを、以前に記載された(Morales,D.E.ら、Circulation 91(3):755(1995))のように使用した。簡単に述べると、HUVECのコンフルエントな単層を、2mmグリッドを備えた35×10mm細胞培養皿(Nalge Nunc International,Napervile,IL)において、CS−C完全培地中で増殖させた。1mmのチップを用いた、その皿の直径を通る2本の垂直な線によって、その単層を傷つけた。取り外された細胞を吸引し、そしてプレートをPBSでリンスした。TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1/1000または1ng/ml)、VEGF(10ng/ml)もしくはこれらの組み合わせを含むかまたは含まない、上記で規定したような完全培地または基底培地において、細胞を18時間培養し、その後、1%パラホルムアルデヒドで固定し、その後、Harris Hematoxylin(Sigma、St.Louis、MO)で染色した。間隔が移動細胞により見えないグリッドの数を眼で計数することによって、創傷修復を定量した。この数を、創傷を並べたグリッドの総数で除算し、そして結果を、平均創傷修復パーセンテージ±SEMとして表した。
【0060】
(免疫蛍光染色)−細胞を、flag−TWEAKと共にインキュベートすることによってTWEAK結合について分析し、そして結合を、ビオチン化マウス抗flag mAbまたはビオチン化BE.B3のいずれか、およびストレプトアビジン−PEを用いて検出した。非標識競合を、100ng/mlのflag−TWEAKおよび漸増濃度の非タグ化TWEAKを用いて行い、結合を、ビオチン化マウス抗flag mAbを用いて検出した。AB.D3 AbによるTWEAK結合のブロックを、10μg/mlのmAbとのflag−TWEAKのプレインキュベーションによって行った。
【0061】
(毛細血管形成アッセイ)−ECによる毛細血管形成を、以前に記載された方法(Machら、Am J Pathol 154、(1):229(1999))に基づく、フィブリンマトリクスゲルアッセイを使用して分析した。手短に言うと、4mg/mlの無プラスミノーゲンヒトフィブリノーゲン(Calbiochem、San Diego、CA)を、ヘパリンおよびポリミキシンB(両方とも、1μg/ml)(Sigma)、ならびにVEGFおよびbFGFを除く全ての供給補充物を含む、無血清EBM−2培地中に溶解した。フィブリン溶液を濾過滅菌し、そしてフィブリンマトリクスを、トロンビン(20〜50ミリユニット/ml)(Sigma)を添加し、そして24ウェルプレート中の1ウェル当たり300μlで分配することによって、調製した。HUVEC(4×104細胞/cm2)をゲル表面に播種し、そしてTWEAK、bFGF、VEGFまたはこれらの因子の組み合わせの存在下または非存在下で、上記のEBM−2培地および5% FBSを重層した。TWEAKを1μg/mlまたは100ng/mlで、bFGFを100ng/mlで、そしてVEGFを50ng/mlで用いて、類似の結果が得られた。いくつかの実験において、TNFに特異的な中和mAb(1μg/ml)およびIL−8に特異的な中和mAb(10μg/ml)またはアイソタイプコントロールIgを、使用した。48〜72時間の培養後、ゲル表面の位相差顕微鏡写真を撮影した。ゲルを、10%エタノールで10分間固定し、元のウェルから新しいウェルに移し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包理視、切片化(5ミクロン)し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【0062】
(RNase保護アッセイ(RPA))−RPAを、hAngio multiprobe Template Set(Pharmingen)を使用して行った。HUVECを、5% FBSならびにbFGFおよびVEGFを除く供給補充物を含むEBM−2培地中で、接着単層として培養した。TWEAK、VEGFまたはVEGF+TWEAKを添加し、そしてRNAを16時間の培養後に単離した。
【0063】
(結果)
(TWEAK結合は細胞型限定性である)−どの細胞型がTWEAK活性の標的であり得るかを決定するために、本発明者らは、免疫蛍光染色によって、組換え可溶性ヒトTWEAKに結合する能力について、種々の初代細胞を調査した。表Iに示されるように、TWEAKは、ヒトの静脈および動脈のEC、動脈平滑筋細胞、胚性筋芽細胞、およびより低い程度で、肺線維芽細胞に結合した。flag−TWEAK結合は、AB.D3 mAbでのブロッキングおよび独立したTWEAK調製物での非標識競合によって明らかにされるように、用量依存性かつ特異的であった(図1およびデータは示さず)。同様に、TWEAKは、マウスのECおよび線維芽細胞株に結合した。しかし、TWEAKは、いかなるヒト白血球(新鮮に単離されたか、または種々の条件下で活性化されたかのいずれか)にも検出可能に結合しなかった。
【0064】
(TWEAKはEC生存を促進する)−TWEAKがEC生存を促進する能力を、TWEAKの非存在下または存在下の無血清培地中でHUVECを培養することによって試験した。これらの条件下でのHUVECの生存性を、VEGFを補充した無血清培地中での生存性(Nor,J.E.ら、Am J Pathol、154(2):375(1999))またはCS−C完全培地中での生存性と比較した。細胞生存性を、アネキシンV(Annexin V)(アポトーシスについての初期マーカー)での標準的な二重染色およびPI色素排除によって測定した。図2Aに示されるように、CS−C完全培地中で培養した細胞は、48時間で生存可能なままであったが(97%)、さらなる因子を含まない無血清培養物中では、生存細胞は、25%に減少し、有意な割合のアポトーシス細胞(48%)および死細胞(26%)が現れた。しかし、TWEAKの存在下で、HUVECは、アポトーシスからほとんど保護されたままであった(73% 生存性)。TWEAKで達成されたこのEC生存の程度は、VEGFで達成されたEC生存の程度に匹敵した。無血清培地中でのHDMECの生存もまた、TWEAKによって増強されたが、HUVECよりも低い程度であり、そしてこの活性は、抗TWEAK mAb AB.G11によって特異的に阻害された(図2B)。
【0065】
(TWEAKは、bFGFと協同してEC増殖を増加させる)−本発明者らは、TWEAKを単独で含むか、または2つの重要な脈管形成因子と組み合わせて含む、基底培地中で培養したHUVECの3Hチミジンの取り込みを測定することによって、増殖に対するTWEAKの効果をさらに試験した。TWEAKは、HUVEC増殖に対する、小さい有意でない増加(基底培地と比較して平均1.6倍の増加)(n=7回の独立した実験)を誘導した。対照的に、TWEAKおよびbFGFと共に培養した細胞は、bFGFのみの存在下で培養した細胞と比較して、有意に増強された増殖応答を示した(図3A)。達成された3Hチミジンの取り込みのレベルは、完全培地中で培養したECの取り込みと匹敵するかまたはそれより高かった。同様の結果が、1ng/mlのbFGFを使用して得られた。bFGFとのTWEAKの相乗活性は、抗TWEAK mAb AB.D3によって完全に阻害され、これは、TWEAKの効果が特異的であることを示すが、抗TWEAK mAb BE.B3によってもコントロールIgによっても阻害は見られなかった。対照的に、TWEAKは、VEGFに対する増殖応答に影響しなかった(図3B)。
【0066】
(TWEAKは、bFGF依存性EC移動を増強し、そしてVEGF依存性EC移動を阻害する)−TWEAKがEC移動をもたらす能力もまた、他の脈管形成因子の存在下および非存在下で評価した。コンフルエントなHUVEC単層に傷をつけ、そして創傷修復の程度を測定することによって、EC移動を最初の18時間モニターした。基底培地へのTWEAKまたはbFGFの添加は、低レベルの創傷修復を誘導する。対照的に、TWEAKおよびbFGFの両方で処理した培養物は、基底培地中で維持した培養物またはいずれかの因子のみで刺激した培養物よりも効率的に修復された(図4)。対照的に、創傷修復は、VEGFのみで処理した培養物と比較して、TWEAK+VEGFで処理した培養物において減少された。このように、TWEAKは、bFGFと協同し、創傷修復に対するVEGFの効果をアンタゴナイズする。
【0067】
(TWEAKは、bFGFおよびVEGFによって誘導されるEC形態発生を差示的に調節する)−微小血管の成長は、ECの同調的な増殖、移動、および毛細血管構造への形態発生的組織化に関与する。形態発生活性に対するTWEAKの効果を、bFGFまたはVEGFの存在下または非存在下でフィブリンゲルの表面上に播種したECの培養物を使用して評価した。本発明者らは、位相差顕微鏡によって示されるように、bFGFが、フィブリンゲル表面上のEC単層における形態学的変化を誘導するが、TWEAKは誘導しないこと(図5A)、およびbFGFへのTWEAKの添加が、これらの形態学的変化を顕著に増強し、毛細血管出芽数の2倍の増加を誘導すること(図6)を、見出した。さらに、マトリクス表面に対して垂直の断面の組織学的分析は、bFGFが、フィブリンマトリクスへのEC浸潤を促進するが、TWEAKが促進しないこと、および、bFGFへのpTWEAKの添加が、内腔含有構造の形成を誘導すること(図5B)を明らかにした。同様の結果は、いくつかの異なるEC型(HUVEC、HDMEC、ヒト肺動脈EC、およびヒト肺微小血管ECを含む)で得られたが、内腔形態発生の刺激は、TWEAKを別のTNFファミリーメンバーであるCD40Lによって置換した場合に観察されなかった(データは示さず)。TWEAKとbFGFとの間の協同は、TWEAKがIL−8(Chicheportiche,Yら、J Biol Chem、272(51):32401(1997))および/またはTNF(Schneider,P.R.ら、Eur J Immunol、29(6):1785(1999))(インビトロでECの形態発生を協同的に促進することが以前に示されたサイトカイン(Yoshida,S.ら、Mol Cell Biol、17(7):4015(1997);Koolwijk,P.ら、The J.of Biol.Chem.、132:1177(1996))を誘導する能力に起因し得る。しかし、図6に示されるように、TWEAK+bFGFによって形成される毛細血管出芽の数は、これらの因子に対する中和mAbの存在下で減少されなかった。これらのmAbの阻害活性は、独立して確かめられ、抗TNF mAbは、腫瘍殺傷を阻害し、そして抗IL−8は、IL−8誘導性EC増殖を阻害する(データは示さず)。
【0068】
VEGFはまた、フィブリンゲル表面上のHUVEC単層の再構成により証明されるように、EC形態形成を誘導した(図7)。VEGFにより誘導された構造の外観は、bFGFにより誘導された構造の外観とは、質的に異なり、そしてフィブリンマトリクスへのEC浸潤はなかった。興味深いことに、TWEAK+VEGFを用いて処理したコンフルエントなEC単層は、再構成されず、そして未処理の培養物およびTWEAKのみで処理した培養物に外観が類似していた。従って、TWEAKは、bFGFと協同して毛細管様構造の形成を誘導するが、VEGFに対するHUVECの形態学的応答をアンタゴナイズする。
【0069】
(TWEAKは、VEGFレセプターFLT1の発現を阻害する)−TWEAKは、VEGFのレセプターを通じるVEGFシグナル伝達を調節することによって、VEGFに対するEC応答を制御し得る。脈管形成サイトカインおよびレセプターのパネルにおけるRPA発現分析を、この可能性を扱う手段として行った。本発明者らの結果(図8)は、コントロール培養物と比較した、VEGFを用いて処理した培養物におけるFLT1の発現の増加を示す。TWEAKのみで処理した培養物は、コントロールと類似していた(データ示さず)。興味深いことに、この応答は、TWEAK+VEGFで処理した培養物中で阻害された。従って、TWEAKは、VEGFの存在下でのFLT1のmRNAレベルを低下させた。本発明者らのRPA分析はまた、TIE(新脈管形成に必要とされる別のECレセプター)の発現のTWEAKによる阻害を示す(Sato,T.N.ら、Nature,376(6535):70−74(1995))。これらのデータは、TWEAKが、脈管形成因子によりシグナル伝達を調節し得る機構を示唆する。
【0070】
従って、これらの結果は、TWEAKが、VEGFに対するECの形態学的応答をアンタゴナイズし、そしてVEGF誘導性EC移動を阻害するが、VEGFの存在下でのEC増殖に対する測定可能な効果はなく、そしてTWEAKの作用は、特定の脈管形成状況に依存して、前脈管形成的かまたは抗脈管形成的であり得る。
【0071】
bFGFの状況におけるTWEAKの前脈管形成活性と対照的に、これらの結果は、TWEAKが他の設定におけるECの脈管形成行動を阻害し得ることを示す。TWEAKは、両方の因子の存在下でのフィブリンゲル表面上にプレートしたコンフルエントなEC単層の外観における、もしあったとしてもわずかな変化により証明されるように、VEGFにより誘導されるEC形態形成を阻害する。TWEAKのこの抗脈管形成効果は、創傷修復アッセイにおいて独立して観察されたVEGF依存EC移動のTWEAK阻害を反映し得る。VEGFのみと比較した場合、TWEAKおよびVEGFを用いて処理した培養物中のインテグリンαv、α1、α2、α5、β3、およびβ1の発現に変化はなかった(A.Jakubowski,未公開の観察)。しかし、本発明者らは、VEGFレセプターFlt−1の誘導性発現が、TWEAKの添加により阻害されたことを見出した。従って、TWEAKは、VEGFのレセプターを介してVEGFシグナル伝達を調節することにより、VEGFに対するEC応答を制限し得る。このことは、腫瘍生物学を理解および有効にするのに特に重要であり、ここでの内因性VEGFの役割は、腫瘍の進行に重要である(Ferrars,N.およびDavis−Smyth,T.,Endocrine Reviews,18:4−25(1997))。
【0072】
このデータは、TNFパラダイムと合わせて、TWEAKが特定の脈管形成設定に依存して新脈管形成を差次的に調節し得るという仮説を支持する。これらの結果は、それが微小血管成長のインビボでの調節、再構築、および/または維持において役割を果たし、脈管形成の状況に依存して前脈管形成的であるかまたは抗脈管形成的であることを示す。TWEAK経路のアゴニスト(またはアンタゴニスト)は、虚血性損傷、癌、脈管増殖性障害および炎症性障害の設定における処置に対して有用な治療アプローチを提供し得る。
【0073】
(実施例2:ルイス肺癌の増殖は、TWEAKトランスジェニック(Tg)マウスにおいて阻害される)
インビトロ細胞株におけるルイス肺癌を、Tumor Repository、NCI−Frederick Cancer Research and Development Centerから入手した。この細胞株を、インビトロでRPMI−1640/10%FBS中で抗生物質なしで4継代まで継代した後、動物に移植した。(C57BL/6マウス系統起源の)腫瘍細胞を、1匹のマウスあたり1×106細胞の接種量で、TWEAK−Tgマウスおよび非Tg同腹仔(これはC57BL/6バックグラウンドで連続して繁殖されている)の右脇腹領域に皮下注射した。各々の実験において、腫瘍細胞を、8匹のTWEAK−Tgマウスおよび8匹の非Tg同腹仔に注射した。腫瘍の測定を、2週ごとに記録し、そして各時点での平均腫瘍重量を、各実験群について計算した。2つの別個の実験の各々についての腫瘍重量対時間のプロットを図9に示す。これは、腫瘍成長が、正常な同腹仔と比較して、TWEAKを発現するマウスにおいてより遅かったことを示す。
【0074】
(表I:主な細胞型に対するTWEAK結合)
【0075】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、平均蛍光強度(MFI) 対 TWEAK濃度を示す2つのプロットを示し(左)、点線は、間接的な検出工程のみでのバックグラウンドのMFIを示す。ヒストグラム(右)は、(1)間接的な検出工程のみでのバックグラウンド蛍光、(2)TWEAK結合、および(3)AB.D3 mAbによるTWEAK結合の阻害に対応する。
【図2】
図2は、TWEAKでの処理後に生存しているか、アポトーシス状態であるか、または死んでいる、(A)HUVEC細胞および(B)HDMEC細胞のパーセンテージを示す、2つの棒グラフを示す。ECを、CM(10%FBSおよび増殖補充物を含む、CS−C完全培地)、0% FBS(FBSおよび増殖補充物を含まず、かつ0.1% BSAおよび10μg/mlヘパリンを補充した、CS−C培地)、およびTWEAKもVEGFも含まない0% FBS中で、48時間培養した。抗TWEAK mAb AB.G11およびコントロールIgを、示されるように添加した。細胞を、FITC−Annexin−VおよびPIで染色し、そして生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞のパーセンテージを示した。これらの結果の各々は、2回の独立した実験を表す。
【図3】
図3は、bFGF依存性の増殖を示す、2つの棒グラフを示す。HUVECを、完全培地中または基底培地中で3日間培養した。TWEAK(100ng/ml)、bFGF(1/500希釈)、VEGF(10ng/ml)またはこれらの因子の組み合わせを、示されるように基底培地に添加し、そして増殖を、3Hチミジンの取り込みによって測定した。(A)示されるデータは、3連のウェルの平均値+/−SDである。これらの結果は、4回の独立した実験を示す。増殖因子に加えて、ブロッキング抗TWEAK mAb AB.D3、非ブロッキング抗TWEAK mAb BE.B3、および無関係のハムスターコントロールIg Ha4/8(10μg/ml)を、示されるように添加した。結果は、2回の独立した実験を示す。(B)示される結果は、3連のウェルの平均値+/−SDであり、そして4回の独立した実験を示す。
【図4】
図4は、bFGF依存性HUVEC移動に対するTWEAKの効果を示す、棒グラフを示す。TWEAK、bFGF、VEGFおよびこれらの因子の組み合わせで処理したコンフルエントなHUVEC単層に傷をつけ、そして18時間の培養後に修復を測定した。示される結果は、4回の実験の平均+/−SEMである。
【図5A】
図5Aは、未処理、あるいはbFGF、TWEAKまたはbFGF+TWEAKで処理した、3日間の培養後のフィブリンゲルマトリクスの表面上のHUVECの位相差画像を示す。全ての画像は、4×の倍率である。これらの結果は、8回の独立した実験を示す。
【図5B】
図5Bは、フィブリンゲル培養物のヘマトキシリン染色切片およびエオシン染色切片を示す。未処理およびTWEAK処理した培養物中のEC細胞は、フィブリンゲル表面上に残存する。浸潤しているECの紐様構造が、bFGF処理培養物中に示され、そしてTWEAK+bFGF処理培養物中に、内皮内腔の構造組織化が示される。同様の結果が、4つの独立したEC型から得られた。
【図6】
図6は、TWEAKおよびbFGFでの処理後の毛細血管出芽の数を示す、棒グラフを示す。HUVECをフィブリンゲルマトリクス上にプレートし、そして処理なしでか、または示されるような因子および抗TNF mAbおよび抗IL−8 mAbと共に48時間で培養した。毛細血管出芽を、1ウェル当たり5つの領域を使用して、可視的に計数した。これらの結果は、4回の独立した実験を示す。
【図7】
図7は、未処理、あるいはVEGF、TWEAKまたはTWEAK+VEGFで処理した、3日間の培養後のフィブリンゲルマトリクスの表面上のHUVECの位相差画像を示す。全ての画像は、4×の倍率である。
【図8】
図8は、VEGFレセプターFLT1のmRNAレベルが、VEGFのみで処理した培養物と比較して、TWEAK+VEGFで処理した培養物において減少されることを示す、ゲル電気泳動画像である。
【図9A】
図9Aは、移植後の日数での腫瘍重量(mg)としてプロットしたTWEAKトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖を示す。
【図9B】
図9Bは、移植後の日数での腫瘍重量(mg)としてプロットしたTWEAKトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖を示す。
【図10】
図10Aは、I型膜貫通タンパク質Fn14[Homo Sapiens]のアミノ酸配列である。図10Bは、I型膜貫通タンパク質Fn14[Mus Musculus]のアミノ酸配列である。
Claims (30)
- 脈管形成を調節する方法であって、治療有効量のTWEAKレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記TWEAKレセプターがFn14である、請求項1に記載の方法。
- 前記TWEAKレセプターアゴニストがFn14アゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが抗Fn14抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記抗Fn14抗体がモノクローナル抗体である、請求項4に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが、治療有効量の少なくとも1つの内皮細胞モジュレーターの存在下で投与される、請求項3に記載の方法。
- 脈管形成を調節する方法であって、治療有効量の少なくとも2つのFn14アゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
- 前記Fn14アゴニストの少なくとも1つが抗Fn14抗体を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記抗Fn14抗体がモノクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが、少なくとも2つの抗Fn14モノクローナル抗体を含み、該抗体が、Fn14の重複しないエピトープに対するものである、請求項7に記載の方法。
- 脈管形成を調節する方法であって、治療有効量のFn14−Fc融合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 脈管形成を阻害する方法であって、治療有効量のTWEAKレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記TWEAKレセプターがFn14である、請求項12に記載の方法。
- 前記TWEAKレセプターアゴニストがFn14アゴニストである、請求項12に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが抗Fn14抗体である、請求項14に記載の方法。
- 前記抗Fn14抗体がモノクローナル抗体である、請求項15に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが、治療有効量の少なくとも1つの内皮細胞モジュレーターの存在下で投与される、請求項14に記載の方法。
- 脈管形成を阻害する方法であって、治療有効量の少なくとも2つのFn14アゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
- 前記Fn14アゴニストの少なくとも1つが抗Fn14抗体を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記抗Fn14抗体がモノクローナル抗体である、請求項19に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが、少なくとも2つの抗Fn14モノクローナル抗体を含み、該抗体が、Fn14の重複しないエピトープに対するものである、請求項18に記載の方法。
- 腫瘍進行を阻害する方法であって、治療有効量のTWEAKレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記TWEAKレセプターがFn14である、請求項22に記載の方法。
- 前記TWEAKレセプターアゴニストがFn14アゴニストである、請求項22に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが抗Fn14抗体である、請求項24に記載の方法。
- 前記抗Fn14抗体がモノクローナル抗体である、請求項25に記載の方法。
- 前記Fn14アゴニストが、治療有効量の少なくとも1つの内皮細胞モジュレーターの存在下で投与される、請求項26に記載の方法。
- 腫瘍進行を阻害する方法であって、治療有効量のFn14−Fc融合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する、方法。
- TWEAKレセプターに対するアゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 前記アゴニストが抗Fn14モノクローナル抗体である、請求項29に記載の薬学的組成物。
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