TWI275399B

TWI275399B - Tweak receptor agonists as anti-angiogenic agents

Info

Publication number: TWI275399B
Application number: TW090122896A
Authority: TW
Inventors: Jeffrey Browning; Linda Burkly; Aniela Jakubowski; Timothy Zheng
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2007-03-11
Also published as: NZ525140A; EP2260867A1; CA2422095A1; WO2002022166A9; AR030721A1; EP1317283B1; ATE515271T1; EP1317283A2; WO2002022166A3; AU8901901A; JP2004508415A; AU2001289019B2; WO2002022166A2

Description

1275399 A7 B7 五、發明説明（i ) 背景在各種正常生理及病態過程（諸如女性生理循環，胚胎發展，傷口癒合，發炎及腫瘤蔓延）令，血管形成作用是組織改造不可或缺的要素（Han，Z. C.及Y. Liu，Int. J. Hematol， 70(2):68(1999) ; Folkman，J·，Nat. Med.，1(1):27(1995))。微血管的生長與内皮細胞（endothelial cell(EC))綜合性移動、增生、分化及形體發育組織成新的毫管結構有關，恢復血管壁上鄰近間葉細胞的健康，可進一步穩定新血管並使其成熟（Bussolino, F.A·，Trands Biochem Sci.，22(7):251(1997))，保持發育中及靜止血管端視各種適當的存活訊息效益而定，這些血管形成作用是由胞外因子，包括數群的細胞激素，胞外基質及整合素，及其同系受體之網狀組織所控制。一些已知血管形成調控子係屬腫瘤壞疽因子（TNF)群，這些因子的配位體係以第II型膜蛋白表現，其可被蛋白酶分解成可溶性細胞素（Smith, C.A. 等人·，Cell，76:959(1994))。這些配位體與其相對的TNF受體群鍵結，並傳導訊息，而啟動了生物活性。大部分的 TNF群會媒介宿主的抗性、發炎及免疫調控（Vassalli，P.， Annu Rev Immunol, 10:411( 1992) ; De Togni，P. J.等人·，Science，264(5 159):703(1994) ; Nagata，S.，及 Goldstein，p·，Science, 267:1449(1995) ; Foy，Τ·Μ·等人·，Annu Rev Immunol，14:591(1996) ; Mackay，F.等人·，J Exp Med，190(1 1)1697(1999)。除此之外，這些配位體中有些（包括TNF-α、Fas配位體（FasL)、jk管内皮 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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1275399 A7 B7 五、發明説明（生長抑制子(VEGI)或TL1，及TWEAK)已證明可調控EC 功能（Frater-Schroder，M.W.等人·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84:5277 (1987) ; Yoshida，S.等人·，Μο1 Cell Biol，17 (7):4015 (1997) ; Ruegg，C·等人.，Nat Med， 4(4):408 (1998) ; Fajardo，L. F.等人.，Am J Pathol, 140(3):539 (1992) ； Leibovich, S.J.,Nature, 329 (6140):630(1987) ; Biancone，L·，J Exp Med， 186(1):147(1997) ； Yue， T·等人·，J· Biol.

Chem，274:1479 (1999) ; Zhai， Y·，等人.，Faseb J，13( 1):1 8 1(1999))。TNF- α對EC行為的效應是複雜的，在活體外，雖TNF- α會抑制EC生長，但卻會誘發毫管的生成（Frater-Schroder，M·等人.，proc. Natl. Acad. Sci· USA，84:5277(1987) ; Y0Shida，S·等人·，Μ〇1 Cell

Biol，17(7):4015(1997))，於活體内，其在固態腫瘤中亦具有抗血管形成效應（Ruegg， C.A·， Nat Med，4(4):408(1998)，或在角膜四周中具有血管形成效應 (Frater-Schroder，M.等人·，Proc· Natl. Acad. Sci. USA， 84:5277(1987) ; Yoshida，S.等人·，Mol cell Biol， 17(7):4015 (1997) ; Fajardo, L· F,等人.，Am J Pathol， 140(3):539(1992) ； Leibocich, S. J·等人.，

Nature，329(6140):630(1987))，Fas/FasL 交互作用可誘發活體内内皮毫管形成’可能是藉由產生肝素-鍵結生長因子啟動（Biancone， L.等人，j Exp Med， 186(1):147(1997)，而 VEGI 會抑制 ec 存活及增生（Zhai -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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1275399 A7 B7 五、發明説明（ Y.等人·，Faseb J，13(1):181(1999) ; Yue，T·等人·，J· Biol· Chem·，274:1479(1999))，TWEAK 是種新穎的 TNF 配位體群（Chicheportiche, Υ·等人·，J Biol Chem， 272(51):32401(1997)，可誘發某些上皮腫瘤細胞株中血管形成化學素白間素-8(IL-8)的表現。近來，咸已報導， TWEAK在減少生長因子條件下，可誘發增生人類ecs培養細胞’及角膜新血管型成作用（Lynch，C.N.等人.，J.

Biol· Chem. 271(13):8455(1999))。利用表現選殖方法，近來已鑑定出名為”Fnl4 ”的 TWEAK受體蛋白，此蛋白原來為早期反應基因誘發出的 FGF-1(J· Biol· Chem· 274:33 166-33 17 6(1999)及 WO 98/55508)。Fnl4在成人的組織（與TWEAK比較）中具有更為侷限的表現型式，且是目前所揭示者中最小的TNF受體’其只有一個富含半胱胺酸之重複。發明摘要 TWEAK及Fn 14除了在誘發血管形成作用上所扮演的角色外（參考WO 01/45730)，本發明發明者亦發現Ρηΐ4激動劑或活化劑（例如TWEAK激動劑及抗-Fnl4單株抗體) 實際上可間接經由抑制血管形成作用或是直接抗腫瘤活性而達到（1)抑制血管形成及（2)減緩腫瘤蔓延。因此’本發明提供藉由投與醫療有效含量TWEAK受體激動劑’以調控血管形成作用之方法。在一個較佳的具體只例中’ TWEAK受體為Fnl4’在另一個較佳的具體實例中’ Fnl4受體激動劑為TWEAK，或抗邛nl4單株抗體。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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1275399 A7 B7 五、發明説明（4 本發明較佳的是提供藉由投與醫療有效含量TWEAK受體激動劑，以抑制血管形成的方法。本發明亦包括藉由投與醫療有效含量TWEAK受體激動劑，以抑制腫瘤蔓延之方法，在一個較佳的具體實例中， TWEAK受體為Fn 14，在另一個較佳的具體實例中，Fn 14 激動劑為TWEAK或抗-Fnl4單株抗體。

本發明亦包括含有醫療有效含量TWEAK受體激動劑及醫藥學上可接受載劑的組合物。

本發明包括調控血管形成作用方法，可延伸用以治療血管形成活性是促進新血管形成所必須之的疾病，此種疾病及病徵包括：心肌缺血症（例如心肌梗塞，促進因心肌缺血而罹患冠狀動脈疾病病患之血流或血流流至心臟以外區域 (諸如週邊血管疾病）不足，該處不足的血流是種問題，壞疽組織的血管新生（例如梗塞後心肌或血管新生術，絞痛，心臟移植，血管移植，及血管擴張，以促進血管形成，灌注，膠原化作用及該患病處的組織），傷口癒合，及組織及器官的移植作用（例如促進自體或異體移植作用）。促進傷口癒合包括割傷癒合，骨骼修補，臀部癒合，心肌梗塞傷害後修補，胃潰瘍癒合及其他腸胃道潰瘍，及一般促進組織形成，維持及修補。亦包括移植組織的新血管形成作用，特別是罹患血管不足之病患，諸如糖尿病患。本發明包括抑制血管形成作用方法，可延伸用以治療減少血管形成活性是所必須之疾病，此種病徵包括癌症，發炎斑退化，及糖尿病視網膜症。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（ 3H-胸腺嘧啶測定增生作用。（A)數據顯示為三個重複槽孔所得之平均數值+/-SD，4次獨立實驗結果求出這些結果。除了生長因子外，加入所示之阻斷性抗_TWEAK mAb AB.D3抗體，非阻斷性抗-TWEAK mAb BE.B3抗體’及不相關之倉鼠控制Ig Ha4/8(10微克/毫升）抗體，兩次獨立實驗結果求出此一結果，（B)結果所示是三個重複槽孔所得之平均數值+/-SD，為4次獨立實驗所求出之結果。圖4顯示TWEAK對bFGF-依賴性HUVEC移動的效應，將經以TWEAK、bFGF、VEGF，及這些因子的組合處理之長滿HUVEC單層細胞刮傷，並培養18後測定修補情形。所示結果為4次實驗平均值+/-SEM。圖 5(A)所示為經 bFGF，TWEAK 或 bFGF + TWEAK 處理及未經處理之HUVECs細胞培養3天後，在纖維蛋白膠體基質表面上的相位差影像。所有的影像放大4倍，此為 8次獨立實驗求得之結果。圖5(B)所示為以蘇木素及曙紅染色纖維蛋白膠體培養細胞橫斷面之結果。未經處理與經以TWEAK處理之EC培養細胞仍在纖維膠體表面上，而經以bFGF處理的培養細胞，及經以TWEAK+bFGF處理之内皮内腔細胞中有侵入EC似中空管柱的結構，四次獨立之EC細胞類別中亦有相似的結果產生。圖6所示為經以TWEAK及bFGF處理後，毫管突出物的數目。將HUVECS種植在纖維膠體基質上，未經處理，或以所示之因子及抗-TNF及抗-IL-8 mAb處理，培養48 小時’計數每個槽孔五個範圍區域中毫管突出物的數目， -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（7 所示者為每個細胞培養的總數目。此為四次獨立實驗結果所求得之結果。圖7圖所示為未經處理，或經VEGF，TWEAK或 VEGF + TWEAK處理之HUVECs細胞培養3天後’在纖維蛋白膠體基質表面上的相位差影像。所有的影像放大4 倍。

圖8為膠體電泳影像，顯示相較與只以VEGF處理之培養細胞，經以TWEAK+VEGF處理過的培養細胞中之 VEGF受體FLT1 mRNA含量減少。圖9A及圖9B所示為路易士肺癌在TWEAK-轉植老鼠中生長的情形，係以移植後不同天數之腫瘤重量（毫克）表示。圖10A是第I型穿膜蛋白Fn 14[人類]之胺基酸序列。圖10B是第I型穿膜蛋白Fnl4[Mus Musculus]之胺基酸序列。發明詳細說明

為完全了解本專利說明書所揭示之發明，特於下列詳述之。 ”抗-腫瘤活性”係指當腫瘤細胞與物質或組合物相互作用後，該物質或組合物阻斷腫瘤細胞增生作用或誘發其死亡之能力。 •’抑制腫瘤蔓延”係指當腫瘤細胞與物質或化合物相互作用後，該物質或化合物阻斷腫瘤妇胞增生作用，或減低其生長及發展的能力。 ”細胞凋零”係指所計劃之細胞死亡的過程。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1275399

，，細胞毒性活性，，係指細胞與物質或組合物相互作用後，該物質或組合物誘發細胞死亡之能力。。仏原决疋子（或抗原性決定子）定義為可與抗體分子上之早，原鍵結位置結合之分子的部分，單株抗體（mAb)可辨識單抗原决定子，而多株抗體（Ab)則可辨識複抗原決定 0 血官形成因子"係指可促進血管形成之因子，包括但不侷限於下列過程，換言之，胞外基質的分解作用，細胞增生作用，細胞移動及結構組織（Kumar等人，Int J Oncology 12:749_757(1998) ; Buss〇lin。等人，Trends in Biochem，22:251-256(1997))。血管形成因子包括但不局限於纖維母細胞生長因子（bFGF)，酸性FGF(aFGF)， FGF-5，jk管内皮生長因子同型（VEGF)，血管形成素-UAng-l)，及血管形成素_2(Ang-2)，血小板_衍生内皮生長因子（PD-ECGF)，肝細胞生長因子，增生素，B61，可浴性血管細胞附著分子，可溶性£_篩選素，12_羧基二十石反四稀酸’ HIV-1的Tat蛋白，血管形成素，TNFa， FasL，轉型生長因子-^。抗體的”Fc區域’’係指分子的一部份，其包括ch2，CH3 及絞鏈區域，但缺乏抗原鍵結位置。 ”Fnl4”係指 J. Biol. Chem· 274:33 166-33 176(1999)中所指的TWEAK受體蛋白，該文獻中所有揭示者一併併入本專利說明書參考。人類及老鼠之第I型穿膜蛋白的胺基酸序列示於圖10A及10B。 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（常ER膜中的訊息肽酶可切割掉引導序列。 ”訊息序列”係原核宿主細胞如真核性第I型引導序列的同功能物，可引導蛋白質轉移進或穿過細菌之雙脂層。抗-Fnl4抗醴來源

可依標準步驟製備抗-蛋白（抗-肽抗血清或單株抗體）（參考，例如，抗體：實驗室手冊,Harlow及Lane出版，冷泉灣印行：1988)。利用慣用的技術，以人類Fn 14 Fc融合蛋白併以完全伏氏佐劑注射動物（諸如山羊，兔子或老鼠），而後以腹膜方式或皮下注射方式追加完全伏氏佐劑後，可製備對抗人類 Fn 14的多株抗體血清。利用慣用的方法篩選含有對抗 Fnl4抗體的多株抗血清。

將不含佐劑而連接有蛋白A之赛福洛施（sepharose)珠的 CHO細胞-衍生重組Fnl4 Fc融合蛋白（Fnl4 Fc)，以腹膜内方式重複注射免疫RBF老鼠，用以製備對抗人類Fnl4 Fc融合蛋白的老鼠單株抗體（mAbs)，最後以可溶性Fnl4 Fc(利用腹膜内方式及靜脈注射方式）追加注射動物，利用傳統方法融合胰臟細胞，並以ELISA篩選融合瘤（Ling等人.，J Interferon and Cytokine Res，15，53-59(1995)) 〇利用蛋白.A賽福洛施珠純化作用自融合瘤培養澄清液中製備純化之mAbs。利用標準重組DNA技術可製備各種型式之抗-Fnl4抗體 (Winter 及 Milstein，Nature，349，293-99(1991))，例如，將動物抗體的抗原鍵結區域連結至人類固定區域後可 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（^ ) 構築，，嵌合，，抗體（例如Cabilly等人.，美國專利案 4,816,567 ; Morrison 等人·，Proc. Natl· Acad. Sci. USA.，81，685 1-55(1984))。喪合抗體可減低因使用動物抗體治療人類臨床疾病所引發的免疫反應。除此之外，可合成辨識Fnl4的重組”人類化抗體，’，人類化抗體是種嵌合抗體，其在專一性抗原鍵結區域處插入大部分人類IgG序列（例如w0 94/04679)。用所要的抗原激敏動物，分離相對的抗體’將負責專一性抗原鍵結的變異區域序列部分去除，而後將動物衍生抗原鍵結區域選殖至已將抗原鍵結區域刪除之人類抗體基因的適當位置，人類化抗體減少了人類抗體中異質序列（種族之間），是以較不會引發欲治療個體的免疫反應，另外，利用技藝中所熟知的技術可製備靈長類化及/或完全人類mAbs，可用於本發明中。製備包括分離自不同類別之免疫球蛋白之抗-Fn 14變異區域及人類固定區域（CHI，CH2，CH3)之嵌合或人類化抗體可構築不同類別的重組抗-Fnl4抗體，例如，將抗原键結位置選殖至帶有人類//鏈固定區域之載體上，可重組製備出具有較多抗原鍵結位置價數的抗、Ρηκ IgM(Arulanandam 等人.，J. Exp. Med., 177? I439 50(1993) ; Lane 等人·，Eur. J. Immunol·，22，257, 78(1993) ; Traunecker 等人.，Nature， 339 70(1989)) 〇除此之外，利用標準重組DNA技術改變抗原鍵結你 0 '夏附 -14-

1275399 A7 B7 五、發明説明（近的胺基酸’可用以改變重組抗體與其抗原的鍵結親合力’利用分子模式的突變作用，可增進人類化抗體之抗原鍵結親合力（Queen 等人，proc Natl. Acad. Sci. USA.，86，10029-33(1989) ; WO 94/04679)。增進或減低抗-Fnl4 Abs對Fnl4的親合力端視標的組織類型或特別治療療程而定，例如，較佳的是以固定含量之具有減弱Fnl4訊息路徑之抗-Fnl4 Abs半預防性治療病患。同理，對Fn 14有高親和力之抗-Fn 14 Abs較佳是用以短期治療腫瘤標的物。在溶液中作為Fn 14激動劑的複抗-Fn 14 本發明提供含有溶液中複抗-Fnl4 Abs(其係作為Fii14 激動劑）之組合物，可使用對抗Fnl4不同抗原決定子的多株抗-Fnl4 Abs，較佳地，抗-Fnl4 Abs可以是對抗ρηΐ4 之不同及非重疊抗原決定子的單株Abs。組合抗-Fnl4 mAb與Fnl4活化作用需要結合兩種未重疊的抗原決定子，利用持續融合免疫老鼠胰臟細胞，免疫不同的動物種類，及不同的免疫途徑，可鑑定出另外的抗原決定子（定義為新穎的mAb s)。利用BIAcore層析法技術可評估不同mAbs鍵結至Fnl4 的能力，可直接定出抗原決定子序譜（Pharmacia BIAtechnology Handbook，"Epitope Mapping”，6.3 2 章節（1994年五月）；亦參考Johne等人，j以瓜仙吐

Methods，160，20191-8 頁（1993))。功能為Fnl4激動劑的抗-Fnl4 IgM單株抗想 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1275399 A7 B7

五、發明説明（13 ) 包括通常多於兩個IgG抗原鍵結位置之抗-Fnl4 mAbs 在溶液中亦具有細胞表面Fn 14交互連接劑的功能，因此，其為本發明所定義範圍内之F η 14激動劑。利用標準重組 DNA及融合瘤技術，抗-Fnl4 mAbs之抗原鍵結位置可紐成IgM分子一其具有十個抗原鍵結位置。另一種方式是，利用融合瘤技術，經以抗原一次免疫作用後，吾人可收集及增量完全老鼠（或其他動物）之1分子。一種增量IgM分子的方法是免疫CD40訊息缺乏老氣 (Kawabe 等人·，Immunity，1，167-78(1994)，Xu 等人，

Immunity，1，423-31(1994))，這些老鼠不能有效的產生 IgGs，因此其以抗原激敏後的反應係增加IgM同型含量。抗-Fnl4 IgM抗體靠著其所增加的效價能夠有效的凝集膜平面内的Fn 14分子，因此與其具有兩個抗原鍵結位置的 IgG相對者比較，其能增進Fnl4訊息。複價抗體所增加的效能在受體簇集的明顯實例是用對Fas受體之抗體，其中 IgM型相當的有效，而正常的雙價IgGs在溶液中並無效果 (Yonihara 及 Yonihara，J. Exp· Med· 169，1747-56(1989) ; Alderson 等人·，Int. Immunol·，6，1799-1806(1994)) 〇相似的情況，Fas受體之apo-1 mAb是種IgG3 mAb。此mAb為細胞毒性劑，其靠獨特lgG3次型的、Fc交互反應’而凝集成較大的聚價型式。去除Fc區域所產生的 F(ab)2型式不能產生較大的凝集物，其不具活性（Dhein等人，J· Immunol.，149，3 166-73(1992))。因此，藉由相似 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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者推論抗-Fnl4 mAbs的IgM為抗-腫瘤劑。以Fnl4激動劑治療投以有效劑量之本發明組合物可治療所述之特定臨床疾病。決定特定病例之較佳醫藥調配物及療效劑量療法是技藝中範圍需考量者，例如，病患的病況及體重，欲治療的程度及病患對治療的耐受性。本發明治療劑可與所選用的藥劑相容之任何投藥方法投用，且可以任何適當投藥途徑之醫藥學上可接受載劑調配，較佳的投藥途徑為非經腸方式，特別是，靜脈Y腹膜，及囊内方式。較佳的治療方式是門診病患長期投藥，雖然精確的劑量根據所選用之治療劑及病患的病況及病史而有所不同，但每日治療劑的劑量範圍預估約〇〇1_1〇〇〇微克/公斤體重，更佳者約10-300微克/公斤體重。利用任何投用呈現抗-腫瘤活性藥劑之投藥模式，來投用本發明抗-Fnl4 Abs，包括抗體或複合物的分離及純化型式’其鹽類或醫藥學上可接受的衍生物。這些療法所用的醫藥組合物亦可為各種不同的型式，這些包括，例如，固態、半固態及液態劑量型式，諸如錠片、藥丸、粉末、液態溶液或懸浮液、坐劑、及注射用或灌注用的溶液。較佳的型式端視投藥模式及治療應用而定’投藥模式包括經·口、非經腸、皮下、靜脈、病灶内或局部投藥。抗-Fnl4 Abs可製成（例如）含/不含可刺激吸收或穩定性輔因子之無菌等張調配物。調配物較佳為液態，或為冷;東 -17- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1275399 A7 B7 五、發明説明（"" 一 ------- 15 7 2粉末’例如，抗_Fnl4 Abs可用調配緩衝液（包括5 〇 =克/毫升單水檸檬酸、2.7毫克/毫升三轉檬酸鹽、41毫 ^升甘转、1毫克/較甘㈣及1毫克/毫升聚山梨 k 20)稀釋，此溶液可冷;東乾燥，冷;東保存，並於投藥前以注射用水（USP)復水。 ☆組合物較佳亦可包括技藝中所熟知的慣用醫藥學上可接受載劑（參考，例如 Remingt〇n，s pharmaceuticai Wence，16 版，198〇,職 PubHshing c〇mpany)，此醫藥子上可接文載劑可包括醫藥劑、載劑、基因載劑、佐劑、賦型劑等，諸如人類血清白蛋白或槳製劑。'组合物較佳為單劑量型式，通常每曰投藥一次或多次。利用置於、罪近患部組織或互通血流内之微粒、脂小體、其他微細顆粒傳輸系統或持續釋放調配物，亦可投用本發明醫藥組合物。適當持續釋放載劑的實例包括成型物體之半透性聚合物基質，諸如坐劑或微膠囊，植入性或微膠囊持續釋放基質包括聚丙交酯（美國專利案3,773,319 ; 歐洲專利案58,481)，L-麩胺酸及加瑪乙基麩胺酸 (Sidman 等人·，Biopolymers，22，547-56(1985);聚（2- 羥基乙基-曱丙烯酸）或乙烯基乙酸乙酯（Langer等人，j Biomed. Mater. Res.,15, 167-277(198 1) ； Langer,

Chem.. Tech.,12, 98-105(1982)) 〇利用熟知的方法可製備含有抗-Fnl4 Abs的脂小體（參考，例如 DE 3,218，121 ; Epstein 等人·，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，82，3688-92(1985) ; Hwang 等人·， -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（16 )

Proc_ Natl. Acad. Sci. U.S.A.，77,4030-34(1980);美國專利案4,485,045及4,544,545〉。通常脂小體是微小（約 200-800A)單脂層型式，其中脂含量大於約3〇莫耳％膽固醇。選用此比例的膽固醇係為控制抗-171114 Abs釋放的最佳速率。本發明抗-Fnl4 Abs亦可與含有其他Fnl4活化劑、能補充IFN- 7發現於腫瘤區域之化學治療劑的脂小體連結。利用任何已知的交互連結劑（諸如廣泛用以偶合毒素或化學治療劑至標的傳輸抗體的異質雙官能基交互連結劑）可將 TWEAK複合物及抗-Fni4 Abs連結至月旨小體上，利用碳水化合物-指引交互連結劑4-(4-順丁烯二醯基苯基）丁酸醯胼（MPBH)亦可共軛至脂小體上（Duzgunes等人，j cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E77(1992)) ° mAbs亦可與慣用抗-腫瘤療法（例如放射線治療及化療）一起施與帶有腫瘤病患，Fn 14活化作用與慣用化學療法組合治療可提供殺死腫瘤活性的額外因子，與只單獨施用慣用抗-腫瘤療法相較，其更可以清除病患中腫瘤性細胞。另外的可能性是，因此方法具有相當低的副作用，因此對腫瘤尚未轉移之病患，或家族顯示對某種癌症具有前置性基因的病患，可投與半預防性的治療。下列的實例係用以說明本發明方法，這些實例不應用以限制本發明：實例包括用以說明的目的及本發明只侷限於專利申請範圍。實例 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1275399 五、發明説明（實例1 : TWEAK調控基礎纖維母細胞生長因子及血管内皮生長因子的内皮細胞反應細胞及細胞條件-人類臍靜脈内皮細胞（HUVEC)及人類皮膚微血管内皮細胞（HDMEC)獲自細胞系統公司（Cell System Corporation ; CS-C)(Kirkland，WA)或克隆尼斯 (Clonetics)公司（聖地牙哥，CA)，主動脈EC，主動脈平滑肌細胞，肺臟纖維母細胞，胚胎肌胚細胞及人類週邊血液星狀細胞購自克隆尼斯公司。以含有10%胎牛血清（FBS) 及供應生長補充物之CS-C完全培養液，例行性的轉代 HUVEC及HDMEC，直至第七代用於實驗，如說明書所述，進行其在CS-C完全培養液及CS-C培養液（無FBS及無生長補充物）中的存活力。以增生作用、移動及免疫螢光染色實驗而言，使用含有2%FBS及供應生長補充物的EC 基礎培養液（EBM)(本專利說明書定義為”完全培養液”），及含有2%FBS之EBM(本專利說明書定義”基礎培養液 ”）（克隆尼斯），以毫管形成分析而言，則使用含有5%FBS 及供應生長補充物之EC基礎培養液2(EBM-2)。MS-1及 M2 10B4細胞株購自美國型細胞中心（American Type Culture Collection)(Manassas，VA)，老鼠淋巴細胞（選殖體2C11)係以用200微克/毫升的抗-CD3單株抗體（mAb) 進行活體内活化作.用後24-48小時後獲得（法敏基 (Pharmingen)，聖地牙哥，CA)，而巯基乙酸-誘發腹膜巨嗜細胞則是在活體外，以干擾素珈瑪（IFNr)(l〇〇單位/毫升）’ TNF-a(i〇微克/毫升）或脂聚糖（LPS)(1微克/毫升） -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1275399 A7 _______B7 __ 五、發明説明（18 ) 刺激48小時。試劑及抗體_所購重組人類bFGF為生長補充劑（克隆尼斯），而bFGF及VEGF亦購自R&D系統公司（Minneapolis，MN)及 Sigma(St L〇uis，M〇)，艾奈辛V-FITC及碳化曹皮錠（ρι)購自法敏基公司，老鼠抗_人類TNF-α及老鼠抗-人類IL-8 mAbs購自R&D公司 (Minneapolis，MN)，而相符同型控制 Ig m〇pC21(ICN 生物醫藥公司（BiomediCals Inc，irvine，ca)則作為阻斷研究之用。生物素-共軛抗-FLAG購自東方人柯達公司 (Eastman Kodak Company ; New Haven，CT)，植物紅素（PE)-抗生蛋白鏈素購自南方生技公司（s〇uthern

Biotechnology ASS〇Ciates，Inc ; Birmingham’AL)。 TWEAK-專一性mAbs-以可溶性人類TWEAK蛋白免疫美國倉鼠及標準融合瘤產製步驟，製備出BE. B3， AB.G11及AB.D3。將重組可溶性TWEAK蛋白固定在96 槽孔微量盤之ELISA分析法，證明AB.D3及AB.G11鍵結至人類及老鼠TWEAK的能力及BE.B3鍵結至人類 TWEAK的能力，利用這些mAbs，而非BE.B3抑制可溶性flag標記人類TWEAK鍵結至HT29細胞上之FACS分析法，證明AB.D3及AB.G11的阻斷活性，根據廠商的步驟（Pierce，Rockford，IL)，以免疫純化生物素化作用 (ImmunoPure Biotinylation)套組將 BE.B3 生物素化，倉鼠控制Ig(選殖體Ha4/8-3· 1)獲自美國型細胞中心，及利用蛋白A快速流動管柱（法瑪西亞，Piscataway，NJ)自培養 -21 - ^紙張尺度通用中國國^家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（澄清液中純化出HiAb。重組可溶性人類TWEAK蛋白-在酵母菌Pichia pastoris(購自因威基（invitr〇geil)，location)中，表現出具有或不具有N-端標記抗原決定子之含有胺基酸殘基A106-H249的重組可溶性TWEAK(基因庫編號#AF030099)。濃縮能表現可溶性人類TWEAK的pichia發酵培養液，並在 20mM Tris-HCl，pH8.0中進行透析過濾作用，並在加入 Zn螯合管柱之前，先以q賽福洛施管柱進行離子交換作用，以咪唑昨梯度之20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，ρΗ7·5 沖堤可溶性TWEAK，以賽福洛施300管柱分子大小排除進行最後的分配作用。細胞凋零分析-以血清飢餓實驗而言，以每一槽孔為 1.2X105細胞密度，將HUVEC或HDMEC種植6槽孔盤中，並隔夜培養在CS-C完全培養液。每次實驗之前，以磷酸緩衝鹽液（PBS)清洗細胞，並於有/無VEGF(10毫微克/ 毫升）或TWEAK(200毫微克/毫升）下，培養在CS-C完全培養液，或以0.1%牛血清白蛋白（BSA)及肝素（1〇微克/毫升）補充之CS-C培養液中，根據所示，亦加入2微克/毫升抗-TWEAK mAb AB.G11或控制Ig，48小時後，用PBS 清洗細胞，用迪斯酶（CS-C)在37°c下培養15分鐘，後以含有5mM EDTA及0.1%BSA之PBS在3 7°C下培養15 分鐘，將細胞分開，再以PBS清洗，根據廠商說明，以 FITC-艾奈辛-V及5微克/毫升PI染色細胞，利用 FACStarPLUS(Becton Dickinson，San Jose，CA)於小時 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） A7 B7 1275399 五、發明説明（内分析螢光。純化分析-HUVEC半滿種植在96槽孔微量盤中（每一槽孔4000個細胞），並隔夜培養於未添加供應生長補充物之 CS-C培養液中，以前述定義之完全培養液或以基礎培養液置換培養液，細胞培養於含或不含TWEAK(100毫微克/毫升），經1/500-1/1000稀釋bFGF補充物之bFGF(克隆尼斯）或1毫微克/毫升（R&D系統公司），VEGF(10毫微克/ 毫升）或這些因子之組合的基礎培養液。如所不’亦加入1 0 微克/毫升抗-TWEAK mAbs AB.D3，BE.B3或倉鼠控制 Ig Ha4/8，細胞在37°C下（含5%C02)培養3天，最後1〇時小，於培養液中加入3H-胸腺嘧啶，以測定增生作用，利用 BetaplateTM(EG&G 瓦雷克（Wallac)，Gaithersburg， MD)測定細胞所鍵結之放射線活性。内皮受傷修補分析法-應用前所揭示之標準傷口修補分析法（Morales, D.E·等人.，Circulation，91(3):755(1995)。簡而言之，以CS-C完全培養液將HUVEC培養在含有2 毫米格子的35x10毫米細胞培養碟（耐耳納克國際公司 (Nalge Nunc International ； Napeville，IL)長至滿層’ 用1毫米尖端物在單層細胞碟子直徑處晝上兩道垂直的傷口，吸出脫離的細胞，並以P B S潤濕培養盤。將細胞培養在含/不含TWEAK(200毫微克/毫升），bFGF(l/l〇〇〇或1 毫微克/毫升），VEGF(10毫微克/毫升）或這些因子之組合的完全培養液或基礎培養液中18小時，後以1%三聚曱醛固定，後以Harris蘇木素（西格瑪（Sigma) ; St. -23- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1275399 五、發明説明（

Louis，MO)染色。細胞移動後會使得傷口間隙模糊不清，肉眼計數格子中傷口間隙的數目，以定出傷口修補。此數目除以排列於傷口的格子總數目，結果以平均百分比傷口修補+/-SEM表示之。免疫螢光染色-細胞與標記-TWEAK培養，以分析與 TWEAK的鍵結，並以生物素化老鼠抗-標記mAb或生物素化BE.B3及抗生蛋白鏈素-PE偵測鍵結情形。利用標記-TWEAK(100毫微克/毫升）及漸增濃度之未標記TWEAK，以生物素化老鼠抗-標記mAb偵測鍵結作用，進行非放射性的競爭作用。標記-TWEAK與10微克/毫升mAb事先培養後，以進行AB.D3阻斷TWEAK的鍵結。毫管形成分析-根據前所揭示的方法（Mach等人.，Am J Pathol 154,（1):229(1999))，以纖維蛋白基質膠分析法分析ECs的毫管形成。簡而言之，將不含人類纖維蛋白元的 4毫克/毫升胞漿素原（克皮化學公司（Calbiochem) ; San Diego，CA)溶解在不含血清之EBM-2(含有兩者均為1微克/毫升之肝素及多黏菌素B(西格瑪），及除了 VEGF及 bFGF外所有的供應補充物）中，纖維蛋白溶液以過濾方式除菌，添加纖維蛋白酵素（20-50毫單位/毫升）（西格瑪）製備纖維蛋白基質，並將其分裝至24-槽孔中，每一槽孔300 微升。HUVEC(4xl04細胞/平方公分）種植在膠質表面，並以前述EBM-2培養液及5%FBS(含/不含TWEAK， bFGF，VEGF或這些因子的組合）蓋過細胞，1微克/毫升或1〇〇毫微克/毫升TWEAK得到相似的結果，FGF使用 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（22 100毫微克/毫升，而VEGF使用50毫微克/毫升。在某些實驗中，使用對TNF(1微克/毫升）及il-8(10微克/毫升) 具有專一性之中和mAbs，或使用同型控制Ig。培養48-72小時後，以相位差方式攝影膠質表現照片，用1〇〇/0乙醇固定膠質10分鐘，並自原來的槽孔移至新的槽孔，以4% 三聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5微米），並以蘇木素及曙紅染色。 RNAse 保護分析法（RPA)·利用 hAngio mutliprobe Template Set(複探針模板組）（法敏基）進行rpa實驗， HUVEC培養於含有5%FBS及供應補充物（除了 bFGF及 VEGF)之EBM-2培養液至單層，加入TWEAK，VEGF 或VEGF + TWEAK，培養16小時後分離RNA。結果 TWEAK鍵結具有細胞類型限制性-為了測定何種類型細胞可為TWEAK活性的標的，我們利用免疫螢光染色法，進行各種一級細胞鍵結至重組可溶性TWEAK的能力。如表I所示，TWEAK可鍵結至人麫靜脈及主動脈ECs，主動脈平滑肌細胞，胚胎肌胚細胞，並對肺臟纖維母細胞具有較低程度的鍵結。利用AB.D3進行之阻斷實驗及以獨立 TWEAK製劑所進行之非放射線競爭作用（圖1及數據未示），證明標記-TWEAK鍵結是劑量依賴性的，且具有專一性。相似地，TWEAK可鍵結至老鼠EC及纖維母細胞細胞株，然而，無法偵測到TWEAK會鍵結至任何人類的白血球細胞’無論其是否為新鮮分離者或在各種條件下活化 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1275399 五、發明説明（者。 TWEAK增進EC存活-在含/不含TWEAK下’將 HUVEC培養於不含血清之培養液中，以測定TWEAK增進EC存活力的能力。利用標準雙染色法，以艾奈辛-V(細胞凋零標記）及pi染劑排除法來測定細胞活力。如圖2A所示，培養在CS-C完全培養液之細胞在48小時仍具有活力 (970/〇)，而未有額外因子之無血清培養液中的活細胞降低至 25%，明顯出現凋零細胞（48%)及死亡細胞（26%)。而，在含有TWEAK下，大部分HUVECs可受保護而免於細胞凋零（73%活力）。以TWEAK所完成之EC存活力程度與 VEGF者比較，TWEAK可增強HDMEC在無血清培養液之存活力，但較HUVECs的程度低，而抗-TWEAK mAb AB.G11可專一性的抑制此此活性（圖2B)。 TWEAK與bFGF合作促進EC增生作用-我們將 HUVEC培養於含有TWEAK基礎培養液中，單獨培養或與兩個重要的血管形成因子一起組合培養，測定其所併入的3H-胸腺嘧啶，進一步測定TWEAK對增生作用的效應，TWEAK會稍微誘發而非明顯誘發HUVEC的增生作用，關於基礎培養液平均可增加1.6倍（n=7獨立實驗）。相反地，用TWEAK及bFGF培養細胞，可明顯的較只培養於bFGF的細胞增加增生反應（圖3A)，所併入的3H-胸腺嘧啶含量與培養於完全培養液的ECs相當或較多，利用1 耄微克/¾升bFGF所得結果相似，抗-TWEAK mAb AB.D3會完全抑制bFGF與TWEAK的相乘作用，此表示 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明 TWEAK的效應具有專一性，而抗-TWEAK mAb BE B3 或控制ig並無抑制現象。相反地，TWEAK並不會影響 VEGF所造成的增生反應（圖3B)。 TWEAK增強bFGF-獨立及抑制VEGF·獨立的EC移動· 在含/不含其他血管形成因子下，亦評估TWEAK影響Ec 移動的能力。將滿單層的HUVEC細胞刮傷，於ι8小時内測定受傷復原修補的程度，來監控EC的移動。在基礎培養液中添加入TWEAK或bFGF會誘發低程度的傷口修補，相反地，同以TWEAK及bFGF處理，則所培養的細胞較只單獨保持在基礎培養液者或只單以其中一項所刺激者，更能有效率的修補細胞（圖4)，相反地，以 TWEAK+VEGF處理之細胞較只單以VEGF處理者，傷口修補能力會降低，因此，在傷口修補上，TWEAK會與 bFGF合作，而會與VegF有拮抗作用。 TWEAK不同地調控因bFGF及VEGF所誘發之EC型態作用-微血管的生長涉及ECs協調性的增生作用，移動及型態組織成毫管。在含/不含bFGF或VEGF下，將EC種植在纖維蛋白膠體表面上，以評估TWEAK在型態活性上的效應。我們發現在纖維蛋白膠體表面上，根據相位差顯微鏡證明，是bFGF而非TWEAK可以誘發EC單層細胞的形態變化（圖5A)，而在bFGF中加入TWEAK明顯可增強這些型態的變化，包括毫管突出物的數目增加2倍（圖 6) ’除此之外，根據垂直於基質表面的切面所做的組織學分析’在bFGF中加入TWEAK可誘發内腔結構（圖5B)， -27- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210X297公釐〉 1275399 A7 B7 五、發明説明（25 數種不同的EC類型細胞均有相似的結果，包括 HUVECs，HDMEC，人類肺動脈EC，及人類肺微血管 EC，而當以其他TNF群，CD40L取代TWEAK時，則未發現有刺激内腔型態作用（數據未示）。TWEAK與bFGF間的合作用可能係因為TWEAK誘發IL-8(Chicheportich， Y.等人·，J Biol Chem，272(51):32401(1997)及 / 或 TNF(Schneider， P. R.等人.，Eur J Immunol, 29(6):1785(1999))的能力所導致，先前細胞素已證明可在活體外合作性地促進EC型態作用（Yoshida，S.等人·，Μο1 Cell Biol，17(7)..4015(1997) ; Koolwijk，Ρ·等人·，The J· of Biol. Chem·，132:1 177(1996))。然而，如圖 6 所示，在中和這些因子之mAbs存在下，TWEAK+bFGF所形成之毫管突出物數目並未減少。這些mAbs之抑制活性是個別證明的，抗-TNF mAb抑制腫瘤死亡及抗-IL-8抑制 IL-8誘發EC增生作用（數據未示）。由纖維蛋白膠體表面上HUVEC的重組作用（圖7)，可證明VEGF亦可誘發型態形成作用，VEGF誘發的結構外觀經定性測定是與bFGF所誘發者不同，在纖維基質中並無 EC侵入。有趣的是，經TWEAK+VEGF處理的滿層EC 單層細胞並不會重組，外觀上與未經處理及只經TWEAK 處理者相似，因此，TWEAK可與bFGF合作共同誘發似毫管結構’但不會拮抗VEGF對HUVECs的型態反應。

TWEAK抑制VEGF受體FLT1的表現-經由VEGF受體’藉由調控VEGF訊息，TWEAK可調節EC對VEGF -28- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CMS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1275399 五、發明説明（的反應，進行RPA表現分析對一群血管形成細胞素及受體’以了解此可能性。我們結果（圖8)顯示，與控制組培養細胞相較，經以VEGF處理之細胞培養的FLT1表現會增加，只以TWEAK處理之細胞培養與控制組的結果相似（結果未示）。有趣的是，以TWEAK+VEGF處理的細胞培養中的此種反應會被抑制’因此，在存有VEGF下’ TWEAK會減少FLT1的mRNA含量，我們的RPA分析亦顯示TWEAK會抑制TIE(jk管形成作用所需的另一種EC 受體）的表現（Sato，T.N·，等人·，Nature，376(6535):70-74(1995))。這些數據推測TWEAK會調控血管形成因子之訊息傳導機制。因此’這些結果顯示TWEAK可拮抗VEgf所造成的 ECs型態反應，及抑制VEGF-誘發EC移動作用，但在 VEGF存在下，對EC增生作用並無偵測到的效應，而 TWEAK的作用可為前-血管形成性或抗-血管形成性，端視特定的血管形成内容而定。與TWEAK的前-jk管形成活性相反地，在bFGF中，這些結果顯示TWEAK可抑制ECs在其他周圍血管形成行為。假若在兩者因子存在下，種植在纖維膠體表面上的滿層EC單層只有稍微改變，此顯示TWEAK會抑制VEGF 所誘發之EC的型態形成作用，此一 TWEAK的抗_血管形成效應反應出TWEAK抑制VEGF-依賴EC移動作用（在傷口修補分析中發現）。與只以VEGF處理的細胞培養相較，以TWEAK及VEGF處理之細胞培養種的整合素^心， -29-

1275399 A7 B7 五、發明説明 q，α2，α5，03及pi表現並無改變（A Jakub〇wski，未發表的發現）。然而，我們發現添加TWEAK可抑制VEGF受體Flt-Ι的誘發性表現，因此，經由VEGF受體，藉由調控VEGF訊息，TWEAK會限制EC對VEGF的反^，在了解及影響腫瘤生物學上，此點是特別重要的，内^因性 VEGF的角色在腫瘤蔓延上是重要的（Ferrars，N及

Davis-Smyth, T·， Endocrine Reviews, 18:4-25(1997))。 ’ 此數據與TNF範例支持依據特定的血管型成，tweak 可區分調控血管型成作用的假設，這些結果顯示，其扮演調節活體内微血管生長，重組，及/或維持的角色，或為前· 血管形成性或抗-血管形成性，端視血管形成性質而定。 TWEAK路徑激動劑（或拮抗劑）可提供治療缺血性傷害，癌症，血管增生及發炎疾病的方法。實例2:路易士肺癌生長在TWEAK_轉植（Tg)老鼠中受到抑制從腫瘤保存，NCI-Frederick癌症研發中心獲取路易士肺癌活體外細胞株。在植入動物體内之前，先以不含抗生素之RPMI-1640/10。/。FBS，將細胞株在活體外進行四次的轉代。在業經成功育種而帶有C57BL/6背景之每隻 TWEAK-Tg及非Tg·同產老鼠右側腹處，以皮下注射方式接種1X106腫瘤細胞（源自於C57BL/6老氣種），在每一實驗中’有8隻TWEAK-Tg老氣及8隻非Tg同產老鼠接種腫瘤細胞。每週測量紀錄腫瘤兩次，在每個時間點計算出 -30- ^紙張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1275399 A7 B7__ 五、發明説明（28 ) 每個實驗組腫瘤的平均重量，兩組實驗所得腫瘤重量與時間點的圖形示於圖9，其顯示與正常同產老鼠相較起來，表現TWEAK的老鼠中腫瘤生長較慢。

表I TWEAK鍵結至一級細胞類型人類細胞類型 TWEAK鍵結a HUVEC ++ + 主動脈EC + + 主動脈平滑肌細胞 + + + 肺臟纖維母細胞 + 胚胎肌胚細胞 + + 週邊血液淋巴細胞週邊血液星狀細胞老鼠細胞類型 EC細胞株（MS-1) + + 骨髓纖維母細胞株（M210B4) + 有及無抗-CD3 mAb活化之胰臟細胞 - 有及無抗-CD3 mAb活化之淋巴節細胞有及無抗-CD3 mAb活化之胸腺細胞 - 駐留腹膜巨嗜細胞麵巯基乙酸誘發巨嗜細胞 • -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1275399 A7 B7 五、發明説明（ (有及無LPS，TNF或IFNa 刺激）___ A以免疫螢光染色法測定相較於HUVECs的相對鍵結 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims

B8 匕I j j---------------- 中文申請專利範圍替換本(9多年：^月g 申請專利範圍 ι· -種抑制個體中血管形成作用之醫藥組合物，其包括有效醫療含量之推克（TWEAK)受體激動劑及醫藥上可接受之載劑。 2. 根據申.月專利範圍第！項之醫藥組合物，其中該推克受體為Fnl4 〇 3. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，λ中該推克受體激動劑為F η 14激動劑。 4. 根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該Fni4激動劑為抗-Fnl4抗體。 5. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該抗心4 抗體為單株抗體。 6. 根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該&14激動劑為一可溶性重組推克蛋白。 7· f種抑制個體中血管形成作用之醫藥組合物，其包括有效醤療含篁之至少兩種不同Fnl4激動劑及醫藥上可接受之載劑。 8. 根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中至少一種 Fnl4激動劑為抗·；ρη14抗體。 9. 根據申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該抗-Fw 抗體為單株抗體。 10. 根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該兩種不同之Fnl4激動劑為兩種對抗Fnl4之非·重叠性抗原決定子之抗_Fnl4單株抗體。 11·根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中至少一種 73511-951017.doc t -1 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) ' --* 1275399

Fnl4激動劑為一可溶性重組推克蛋白。 i2•-種抑制個體中腫瘤蔓延之醫藥組合物，其包括有效醫療含量之推克受體激動劑及醫藥上可接受之載劑。 •-種治療個體中與不必要細胞增生有關之疾病之醫藥組合物，其包括有效醫療含量之推克受體激動劑及醫藥上可接受之載劑。 14.根據中請專利範圍帛13項之醫藥組合物，其中該與不必要細胞增生有關之疾病係癌症。 15·根據申請專利範圍第14項之醫藥組合物，其中該癌症係選自下列所組成之群：前列腺癌，淋巴腫瘤，腺惡性腫瘤，神經贅瘤，大腸癌，胰臟癌，，亞神經節瘤，乳癌，腎臟細胞癌，肺癌，卵巢癌，平滑肌瘤，肺癌，腦膜瘤，親鉻細胞瘤，骨癌及甲狀腺癌。 16·根據申請專利範圍第12至15項任一項之醫藥組合物，其中該推克受體為Fnl4。 17·根據申請專利範圍第12至15項任一項之醫藥組合物，其中該推克受體激動劑為Fnl4激動劑。 18. 根據申請專利範圍第17項之醫藥組合物，其中該Fnl4 激動劑為抗-Fnl4抗體。 19. 根據申請專利範圍第18項之醫藥組合物，其中該抗一 Fnl4抗體為單株抗體。 73511-951017.doc 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)