KR102241938B1 - 2'-푸코실락토오스를 포함하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물 - Google Patents
2'-푸코실락토오스를 포함하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈전의 생성으로 말미암은 여러 뇌심혈관 질환에 효과가 있는 2'-푸코실락토오스 함유 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose, 2'-FL)는 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐에 대해서 길항(저해) 작용을 나타내어, 혈소판의 비정상적 작용에 의한 혈전의 생성을 억제하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 2'-푸코실락토오스를 포함하는 혈전 생성으로 말미암은 뇌심혈관 질환의 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 혈전의 생성으로 말미암은 여러 뇌심혈관 질환, 예로서 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 등의 개선에 효과가 있는 2'-푸코실락토오스 함유 식품 조성물에 관한 것이다.
식생활 및 생활양식의 서구화, 그리고 노인 인구의 증가로 인해 혈행장애가 원인이 되는 뇌심혈관계질환 발병이 크게 증가하고 있으며, 2018년 사망원인 통계자료에 의하면 10대 사망원인 중 심장질환, 뇌혈관질환, 고혈압성 질환이 각각 2위, 4위, 10위를 차지할 정도로 심각한 사회문제가 되고 있다.
혈행에 관여하는 인자는 크게 혈구세포와 혈액응고인자로 나뉠 수 있는데, 혈관 손상에 따른 출혈을 방지하기 위한 혈소판의 유착, 플러그 형성에 따른 지혈 작용, 그리고 병태 생리적 상태에서 비정상적으로 과도한 혈소판 활성에 따른 혈전 생성 및 혈관 폐색은 혈관 질환을 일으키는 중요 병증 요인이다.
따라서, 혈전을 제거하거나 혈전의 생성을 억제할 수 있는 식품의 지속적 섭취 또는 약품의 투여가 필요한데, 기존의 혈행 개선과 관련된 의약품들은 위장 장애, 혈압 상승 등의 부작용을 가지고 있어 복용에 어려움이 있어 왔다. 이에 부작용이 적어 인체에 안전하면서도, 혈전의 생성을 억제하여 혈행 장애를 근본적으로 개선할 수 있는 제품의 개발이 필요하다.
한편, 사람의 모유에는 200여 종 이상의 독특한 구조를 가지는 올리고당 (human milk oligosaccharides, HMO)이 다른 포유류의 젖에 비해 상당히 높은 농도 (5~15 g/L)로 존재한다. HMO는 장내 유산균의 생육을 돕는 프리바이오틱 (prebiotic) 효과, 병원균 감염 예방, 면역시스템 조절 및 두뇌 발달과 같이 유아의 성장과 두뇌 발달 및 건강에 긍정적 영향을 미치는 등 다양한 생물학적 활성을 제공하는 것으로 보고되어 있다.
HMO는 D-글루코오스 (Glc), D-갈락토오스 (Gal), N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc), L-푸코오스 (L-fucose, Fuc)와 시알산 (sialic acid) [Sia; N-acetyl neuraminic acid (Neu5Ac)]으로 구성되어 있다. HMO의 구조는 매우 다양하고 복잡하기 때문에, 다른 잔기와 글리코실 결합을 가지는 200개 정도의 이성질체가 서로 다른 중합도(DP 3-20)로 존재할 수 있다. 다만, 구조적 복잡성에도 불구하고, HMO는 몇 가지 공통적인 구조를 가진다. 대부분의 HMO는 환원 말단에 락토오스 (Galβ1-4Glc) 잔기를 가진다. 락토오스의 Gal은 α-(2,3)-과 α-(2,6)-결합으로 각각 3-시알릴락토오스 (3-sialyllactose) 또는 6-시알릴락토오스 (6-sialyllactose)의 형태로 시알화되거나, α-(1,2)-과 α-(1,3)-결합으로 각각 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose, 2-FL) 또는 3-푸코실락토오스 (3-fucosyllactose, 3-FL)의 형태로 푸코실화 (fucosylation) 될 수 있다.
약 200개의 다른 복합 올리고당이 모유에서 발견되었는데, 함량이 가장 많은 올리고당 3가지를 포함하여 137개가 푸코실화되어 그 비율은 거의 77%이고, 남은 올리고당은 대부분은 시알화된 것 (39개)으로 약 28%에 해당한다. 이중, 특히 2'-푸코실락토오스와 3-푸코실락토오스는 앞서 언급한 다양한 생물학적 활성에 관여하는 주요 HMO인 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서는 인간의 모유에서 유래한 것으로 안전성이 검증된 HMO를 이용하여, 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환의 개선을 위해 사용될 수 있는 소재를 개발하고자 한다.
본 발명에서는 HMO를 이용하여 혈전의 생성으로 말미암은 여러 뇌심혈관 질환, 예로서 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중의 개선에 효과가 있는 식품조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 혈전은, 바람직하게 혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 혈소판에 의한 혈액 응고는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP(collagen-related peptide) 또는 콜라겐(collagen)의 작용에 의해 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 뇌심혈관 질환은, 바람직하게 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose; 2'-FL)은 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐에 대해서 길항(저해) 작용을 나타내어, 혈소판의 비정상적 작용에 의한 혈전의 생성을 억제하는데 사용될 수 있음이 본 발명을 통해 확인되었다. 따라서, 본 발명의 2'-푸코실락토오스를 꾸준히 섭취할 경우, 혈전의 생성으로 말미암은 뇌심혈관 질환, 일 예로서 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 등을 개선할 수 있을 것이다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐에 대해서만 길항(저해) 작용을 나타내고, 긴급한 상황에서 지혈을 위해 사용되는 트롬빈 대해서는 저해 작용이 없는 것으로 확인되었다. 트롬빈에 대해 저해 작용이 없는 것은 임상적으로 대단히 중요한 의미를 갖는데, 사고 등에 의해 출혈이 발생한 경우 지혈을 위해 트롬빈을 긴급하게 투입하기 때문이다. 본 발명의 2'-푸코실락토오스가 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐 외에 트롬빈에 대해서도 저해 효과가 있었다면, 사고 발생 시 트롬빈의 투여에 의해서도 지혈이 이루어질 수 없을 것인데, 그렇다면 일상 생활에서 2'-FL을 지속적으로 섭취하는 것은 대단히 위험한 것일 수 있다. 하지만, 놀랍게도 본 발명의 2'-FL은 트롬빈의 작용은 저해하지 않기 때문에, 평상시에 꾸준히 섭취하더라도 사고의 발생시 트롬빈 투여에 의한 지혈의 유도에는 아무런 문제가 없는 것이다.
도 1은 본 발명의 실험에서 사용한 fructo-oligosaccharide (FOS)와 2'-fucosyllactose (2'-FL) 및 3-fucosyllactose (3-FL)의 구조를 보여준다.
도 2는 HMO의 혈소판 응집력 억제 효과를 보여준다.
도 3은 HMO의 혈소판 활성화 억제 기전을 확인시켜 준다.
도 4는 HMO의 세포독성을 CCK assay로 측정한 결과이다.
도 2는 HMO의 혈소판 응집력 억제 효과를 보여준다.
도 3은 HMO의 혈소판 활성화 억제 기전을 확인시켜 준다.
도 4는 HMO의 세포독성을 CCK assay로 측정한 결과이다.
본 발명은 본 발명은 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다. 이때, 상기 뇌심혈관 질환은, 바람직하게 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 혈전은, 바람직하게 혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것일 수 있다. 이때, 상기 혈소판에 의한 혈액 응고는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트(agonist; 작용자)인 CRP(collagen-related peptide) 또는 콜라겐(collagen)의 작용에 의해 발생한 것일 수 있다.
본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트인 CRP(collagen-related peptide) 또는 콜라겐(collagen)의 혈소판에 대한 아고니스트 작용을 저해하는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 'GPVI(Glycoprotein VI; a glycoprotein receptor for collagen)를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로'에 작용하여 혈소판의 활성화를 억제하는 것으로 추론할 수 있다.
상기 본 발명의 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 2'-푸코실락토오스는, 바람직하게 혈소판에 대한 아고니스트인 트롬빈의 혈소판에 대한 아고니스트 작용에 대해서는 저해하지 않는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 2'-푸코실락토오스는 'GPCR(G-protein coupled receptor) 신호전달 경로를 매개로 한 혈소판 활성화'에 대해서는 억제 효과를 나타내지 않는 것으로 추론할 수 있다.
건강한 사람의 혈액은 혈관 속에서 응고하는 일이 없지만, 혈관의 손상, 혈액의 정체(停滯), 응고성이 높아진 경우 등의 원인에 의해 그 발생 국소에서는 피가 굳어진 덩어리 즉 '혈전'이 생긴다.
혈전의 생성에는 혈구 중 하나인 혈소판이 관여하는데, 혈소판은 골수 내에 있던 큰 세포로부터 세포질이 갈라져 나온 지름 2~3㎛의 세포 조각으로 혈액의 응고에 중요한 역할을 한다.
출혈의 억제라는 정상적인 과정에서 상기와 같은 혈액 응고작용은 생존에 필수적이나, 출혈 외의 다른 원인에 의한 혈전 생성 또는 출혈에 의한 정상적인 과정이라 하더라도 과다한 혈전이 생기면 그 부분의 혈관을 좁히거나 또는 막아 피의 흐름을 방해하거나 멈추게 한다. 이와 같은 비정상적 혈전의 생성은 피의 흐름 즉 혈행을 방해하는 요소로 작용하여, 혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 등의 다양한 뇌심혈관 질환을 유발할 수 있다.
혈소판에 의한 혈액 응고는 아고니스트에 의해 유도되는데, 혈소판에 대한 아고니스트로는 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐(collagen), 트롬빈(thrombin), 트롬복산 A2 유사체 (thromboxane A2 analogue, U46619) 등이 있다. CRP(collagen-related peptide), 콜라겐(collagen)은 GPVI(Glycoprotein VI; a glycoprotein receptor for collagen)를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로에서 혈소판 응집에 중요한 역할을 수행한다. 또한, 트롬빈(thrombin), 트롬복산 A2 유사체 (thromboxane A2 analogue, U46619)은 GPCR(G-protein coupled receptor) 신호전달 경로를 매개로 한 혈소판 응집에 중요한 역할을 수행한다.
하기 본 발명의 실험에서는 상기 4종의 아고니스트를 대상으로 하여 모유올리고당(HMO)인 2'-FL, 3-FL와 양성대조물질로서 FOS(fructooligosaccharide)의 길항(저해) 작용 여부를 확인하여 보았다. 그런데, 특이하게도 2'-FL만이 4종의 아고니스트 중 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐에 대해서만 길항(저해) 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다. 2'-FL과 매우 유사한 구조를 갖는 3-FL은 길항(저해) 효과가 나타나지 않았다. 또한, 2'-FL은 아고니스트들 중에서도 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐에 대해서만 저해 작용이 확인되었고, 트롬빈 대해서는 저해 작용이 없는 것으로 확인되었다.
트롬빈에 대해 저해 작용이 없는 것은 임상적으로 대단히 중요한 의미를 갖는데, 사고 등에 의해 출혈이 발생한 경우 지혈을 위해 트롬빈을 긴급하게 투입하기 때문이다. 본 발명의 2'-FL이 CRP(collagen-related peptide), 콜라겐 외에 트롬빈에 대해서도 저해 효과가 있었다면, 사고 발생 시 트롬빈의 투여에 의해서도 지혈이 이루어질 수 없을 것인데, 그렇다면 일상 생활에서 2'-FL을 지속적으로 섭취하는 것은 대단히 위험한 것일 수 있다. 하지만, 놀랍게도 본 발명의 2'-FL은 트롬빈의 작용은 저해하지 않기 때문에, 평상시에 꾸준히 섭취하더라도 사고의 발생시 트롬빈 투여에 의한 지혈의 유도에는 아무런 문제가 없는 것이다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은 그 제형으로 특별히 한정되는 것은 아니고, 일 예로 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 환, 정, 과립 등의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
2'-FL은 식품 중 0.01~99 중량%의 비율로 첨가되어 조성될 수 있는데, 일 예로, 건강보조식품 조성물에 함유되는 2'-FL의 농도는 1,600mg으로 제조되는 정 기준으로 바람직하게 100~1,000mg 함유될 수 있으며, 1일 1회 장기간 섭취하는 것이 좋다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: HMO에 의한 선택적 혈소판 응집 억제 효과 확인]
(1) 실험 목적
모유에 함유된 올리고당(human milk oligosaccharide; HMO))을 활용하여 혈행개선 전략소재로의 가능성을 타진하고자 하였다. 이를 위해 본 실험에서는 HMO 중 2'-fucosyllactose (2'-FL) 및 3-fucosyllactose (3-FL)과 양성대조물질로서 fructooligosaccharide (FOS)를 이용하여, 혈소판 활성 억제 기작 및 나아가 혈소판 작용으로 말미암은 혈행 장애 개선에 대한 효능을 확인하고자 하였다.
(2) 실험 재료 및 방법
① 재료
Human thrombin, thromboxane A2 analogue (U46619), PGE1, 그리고 모든 시약은 시그마 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl ketone (PPACK)은 EMD Millipore (Billerica, MA)로부터 구입하였다. Equine tendon collagen (type I)은 Chrono-log (Havertown, PA)에서, Collagen-related peptide (CRP)는 Dr. Richard Farndale (Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK)에서 구입하여 본 실험에 사용하였다. Phycoerythrin (PE)-conjugated isotype control IgGs, PE anti-mouse CD62P (P-selectin) antibody, and PE anti-mouse αIIbβ3 (JON/A) antibody들은 Biolegend (San Diego, CA)로부터 구입하였다. 2'-FL 및 3-FL은 (주)에이피테크놀로지에서 생산한 소재를 사용하였다.
② 혈소판 분리 방법
마우스 (6-8주령)의 혈소판은 구연산염-덱스트로스 용액 (ACD, sigma)이 전 처리된 주사기를 이용하여 마우스의 복부정맥에서 채혈하였다. 혈소판이 풍부한 혈장 (platelet-rich plasma, PRP)을 얻기 위해 실온에서 20분 동안 300×g로 원심분리한 후, 적혈구에서 분리된 혈장에 0.5 μM PGE1을 첨가하여 4분 동안 700×g에서 재원심분리하였다. 침전된 혈소판을 10% ACD를 함유한 HEPES-Tyrode 완충액 (5mM HEPES / NaOH, pH 7.3, 5mM 포도당, 136 mM NaCl, 12mM NaHCO3, 2.7 mM KCl)으로 세척한 후, 5분 동안 700×g에서 재원심분리하였다. 침천된 혈소판은 HEPES-Tyrode 버퍼에서 3×108 cells/mL의 농도로 조정되었으며, 본 실험에 사용하였다.
③
혈소판 응집 분석방법
3×108 cells/mL의 농도로 HEPES-Tyrode 버퍼에 담겨진 마우스 혈소판을 37℃에서 15분 동안 Vehicle (distilled water), 1,000 μM의 FOS, 3-FL, 그리고 다양한 농도(300~1000 μM)의 2'-FL로 전처리한 후, 혈소판 응집계에서 thrombin, collagen-related peptide (CRP), collagen, thromboxane A2 analogue (U46619)로 활성화시켰다. 혈소판 응집은 37℃의 혈소판 응집계 (Chronolog Corp, Havertown, PA)에서 1,000 rpm 속도로 혈소판 응집을 유도하여 측정하였다.
④ Flow cytometry 분석
혈소판 활성의 biomarker로 알려진 혈소판 P-selectin 및 αIIbβ3의 활성도는 flow cytometry (Gallios, Beckman Coulter)를 이용하여 측정하였다. 마우스 혈소판은 37℃에서 15분 동안 Vehicle (distilled water), 1,000 μM의 FOS, 3-FL, 그리고 다양한 농도(300~1000 μM)의 2'-FL로 전처리되었으며, 혈소판 활성을 위해 마우스 혈소판은 37℃에서 5분 동안 0.15 μg/ml CRP로 처리한 후 P-selectin 및 αIIbβ3 antibodies를 이용하여 활성도를 측정하였다.
⑤ 통계 처리
통계분석은 GraphPad Prism 5를 이용하여 자료 분석을 실시하였다. 통계적 유의성은 다중집단의 ANOVA와 Dunnett's test for comparisons of multiple group, Student's t-test for comparisons of two groups으로 분석하였다. 0.05보다 낮은 P 값은 유의미한 결과로 간주하였다.
(3) 실험 결과
① HMO에 의한 혈소판 응집 억제 효능 확인
HMO가 혈소판 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 혈소판 응집력에 대한 효능을 조사하였다.
그 결과는 도 2와 같이 나타났다. 도 2의 그래프에서 가로축의 'light transmission'는 빛 투과가 증가되어 혈소판 응집이 많이 일어났다는 것을 보여주는 척도인데, 원래 혈소판은 floating cell로 떠다니다가 혈소판 아고니스트에 의해 활성화되면서 혈소판 형태가 변화 및 응집이 일어나 빛의 투과도가 증가하는데 이 원리를 이용한 것이다. 도 2의 그래프에서 가로축의 'time(sec)'은, 보통 혈소판의 완전한 응집이 300초(sec) 정도 걸리므로, 그 시간 동안 혈소판의 응집 정도를 측정한 것을 의미한다.
본 실험 결과에서는 HMO 중 2'-FL에 의해 전처리된 혈소판이 대조군(vehicle)의 증류수(distilled water)에 의해 전처리된 혈소판과 비교하여, 혈소판 아고니스트(agonist) 중 CRP (0.15 μg/ml)와 collagen (0.5 μg/ml) (도 2의 A) 와 도 2의 B))에 의해 유도된 혈소판 응집에서 농도 의존적으로 유의하게 혈소판 응집력을 저해하는 것으로 확인되었다. FOS와 3-FL에 의해 전처리된 혈소판에서는 CRP와 collagen에 의한 혈소판 응집을 유의적으로 억제하지 못함을 확인하였다. 또한, 2'-FL에 의해 전처리된 혈소판에서 트롬빈 (Thrombin 0.025 U/ml)과 U46619 (3 μM)(도 2의 C)와 도 2의 D))에 의해 유도된 혈소판 응집력 억제 효능은 대조군 대비 유의적 차이를 관찰할 수 없었다. 즉, 트롬빈과 트롬복산 A2 유사체(U46619)에 의해 유도된 혈소판 응집력에 대해서는 2'-FL이 억제 효능을 보이지 않는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 HMO 중 2'-FL만이 GPVI (Glycoprotein VI; a glycoprotein receptor for collagen)를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로에서 선택적인 혈소판 응집에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 반면, 2'-FL은 ‘GPCR (G-protein coupled receptor) 신호전달 경로를 통해 혈소판응집반응을 활성화시키는 트롬빈과 트롬복산 A2 유사체(U46619)에 대한 억제효능은 없는 것으로 추론할 수 있었다.
② HMO에 의한 혈소판 활성화 억제 기작 확인
HMO에 의한 혈소판 활성화 억제 기작을 확인하고자 하였다. 혈소판 활성화에서 positive feedback cycle을 유도하는 주요 과정 중 혈소판 활성 biomarker로 쓰이는 혈소판의 α-granule의 P-selectin 및 αIIbβ3 integrin 활성화 조절 기작에 대한 HMO의 효능을 flow cytometry analysis를 이용하여 분석하였다.
앞선 혈소판 응집력 억제 실험에서 HMO 중 2'-FL만이 GPVI를 매개로 한 혈소판 응집 신호전달 경로에서 선택적으로 혈소판 응집에 중요한 역할을 함이 확인되었기 때문에, 본 혈소판 활성화 실험에서는 CRP(collagen-related peptide) 만을 이용하여 활성화 효능 억제 실험을 진행하였다.
혈소판은 37℃에서 15분 동안 Vehicle (distilled water) 또는 FOS, 2'-FL 및 3-FL로 전처리하고 0.15 μg/ml CRP로 37℃에서 5분 동안 활성화시킨 후 P-selectin 및 αIIbβ3 antibodies를 이용하여 혈소판 활성도를 측정하였다.
그 결과는 도 3과 같이 나타났다. 혈소판 활성화가 일어나면 혈소판 활성 시그널로 인해 α-granule에 있던 P-selectin이 혈소판 세포 밖으로 표출되면서 혈소판 활성을 더 견고하게 일으키고, 혈소판-혈소판 응집에 중요한 αIIbβ3의 활성 증가는 αIIbβ3과 fibrinogen에 대한 결합이 증가되어 혈소판-혈소판 응집이 더 많이 일어나게 된다. 따라서 혈소판 활성의 척도로 P-selectin exposure level과 aIIbβ3 activation level을 flow cytometry를 이용하여 측정하는데, 그래프에서 피크가 왼쪽으로 이동할수록 혈소판 활성에 따른 P-selectin exposure level과 aIIbβ3 activation level이 줄어들었음을 의미하며, 2'-FL이 농도의존적으로 혈소판 활성을 억제하는 효능이 있음을 의미하게 된다.
대조군 (vehicle)과 비교하여 HMO 중 2'-FL만이 전처리된 혈소판에서 농도 의존적으로 마우스 혈소판 α-granule의 P-selectin (도 3의 A)) 및 혈소판 αIIbβ3 integrin (도 3의 B)) 활성화를 현저히 억제하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 2'-FL이 과립분비와 αIIbβ3 integrin 활성화 억제를 통해 혈소판 활성화를 선택적으로 억제한다는 것을 시사한다.
[실험예 1: HMO의 세포독성 테스트]
본 실험예에서는 HMO의 세포독성을 CCK assay (Oh, Y. C.; Jeong, Y. H.; Pak, M. E.; Go, Y., Banhasasim-Tang Attenuates Lipopolysaccharide-Induced Cognitive Impairment by Suppressing Neuroinflammation in Mice. Nutrients 2020, 12, (7))에 의해 측정하고자 하였다. 혈소판에 대한 세포 독성을 측정할 수 있는 프로토콜이 확립되어 있지 않아, HepG2 세포에 HMO (2'-FL, 3-FL)을 농도의존적으로 전처리하였다. 24시간 후에 Cell counting kit solution (Dojindo Molecular Technologies, Inc.)을 각 well에 처리하여 1시간 추가 배양한 다음 Microplate reader 를 사용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
HMO를 HepG2 세포에 전처리하여 cell viability를 측정한 결과, 도 4에서 보듯이 HMO (2'-FL, 3-FL)의 처리에 따른 HepG2의 세포 사멸은 확인되지 않았고, 이로부터 HMO는 세포 독성이 없는 것으로 결론내릴 수 있었다.
Claims (4)
- 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose; 2'-FL)을 포함하며,
혈소판에 대한 아고니스트인 CRP(collagen-related peptide)와 콜라겐(collagen)에 대해서는 저해 작용을 나타내는 반면, 혈소판에 대한 아고니스트인 트롬빈(thrombin)과 트롬복산 A2 유사체(thromboxane A2 analogue)에 대해서는 저해 작용을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 혈전으로 말미암은 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 혈전은,
혈소판에 의한 혈액 응고로 말미암아 발생한 것을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 뇌심혈관 질환은,
혈행장애, 동맥경화, 혈전증, 고혈압, 심근경색, 협심증 및 뇌졸중 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 뇌심혈관 질환 개선용 식품 조성물.
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-
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| 대한민국 특허등록번호 제1016821080000호 (등록일자 2016.11.28)에는, 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체; 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액; 상기 균사체 배양액의 건조분말; 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈행 개선용 조성물이 기재되어 있다. |
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