ES2322566T3 - Vacuna y uso de la misma para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica. - Google Patents
Vacuna y uso de la misma para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de Cop 1 para la preparación de una vacuna para tratar pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) mediante la reducción de la evolución de la enfermedad, y/o la protección frente a la degeneración de nervios motores, y/o la protección frente a la toxicidad del glutamato.
Description
Vacuna y uso de la misma para el tratamiento de
la esclerosis lateral amiotrófica.
La presente invención se refiere a una vacuna y
al uso de la misma para el tratamiento de la esclerosis lateral
amiotrófica (ELA).
Enfermedad de neuronas motoras (ENM) es el
nombre que se da a un grupo de enfermedades relacionadas que
afectan a las neuronas motoras del cerebro (neuronas motoras
superiores) y la médula espinal (neuronas motoras inferiores). Las
neuronas motoras (o motoneuronas) son las neuronas a lo largo de
las cuales el cerebro envía instrucciones, en forma de impulsos
eléctricos, a los músculos. La degeneración de las neuronas motoras
conduce a debilidad y atrofia de los músculos. Ésto se produce
generalmente en brazos o piernas inicialmente, viéndose afectados
algunos grupos de músculos más que otros.
Hay varias clasificaciones de ENM. En la mayoría
de los casos de ENM, se produce la degeneración tanto de las
neuronas motoras superiores como inferiores. Este estado se
denomina esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también conocida
como enfermedad de Lou Gehrig, y se caracteriza por fasciculaciones
(espasmos musculares), rigidez y debilidad musculares. Hay también
formas menos comunes en las que se observa una degeneración más
selectiva de o bien las neuronas motoras superiores (tal como
esclerosis lateral primaria, ELP) o bien neuronas motoras
inferiores (tal como atrofia muscular progresiva, AMP). La
parálisis bulbar progresiva (PBP o aparición bulbar) es una versión
de la ELA que comienza con dificultades para tragar, masticar y
hablar y afecta aproximadamente al 25% de los pacientes con ELA.
Hay una considerable coincidencia entre estas
formas de ENM. Las personas con AMP desarrollan con el tiempo una
implicación de las neuronas motoras superiores y tanto en la AMP
como en la ELA algunas personas pueden experimentar finalmente
dificultades para tragar y hablar en grados variables (AMP o ELA de
aparición bulbar).
La ELA es una enfermedad neurodegenerativa
progresiva, crónica, caracterizada por una degeneración gradual de
las neuronas del sistema nervioso central (SNC) que controlan el
movimiento de los músculos voluntarios. La pérdida progresiva de
neuronas motoras conduce a una atrofia gradual del músculo
esquelético y a una muerte inevitable, habitualmente en el plazo de
2-3 a diez años tras la aparición de la enfermedad.
La atrofia y debilidad musculares y los signos de la disfunción de
células del asta anterior se observan inicialmente de la manera más
frecuente en las manos y menos frecuentemente en los pies. El sitio
de aparición es aleatorio, y la evolución es asimétrica. En los
EE.UU. solo, 30.000 personas tienen actualmente ELA y se
diagnostican aproximadamente 8.000 nuevos casos cada año.
La ELA se produce en formas esporádicas (ELAE) y
familiares (ELAF) (Mulder et al., 1986; Munsat, 1989). Los
factores de riesgo principales se desconocen en su mayor parte,
aunque del 5 al 10% de todos los pacientes con ELA son familiares
(ELAF). En aproximadamente el 20% de todas las formas familiares se
encontraron mutaciones en el gen que codifica para la Cu/Zn
superóxido dismutasa tipo 1 del cromosoma 21 (Rosen et al.,
1993; Brown, 1995). La SOD es una enzima que cataliza la conversión
de aniones superóxido en peróxido de hidrógeno, y por tanto la SOD
puede proteger a las células frente a los efectos perjudiciales de
estos radicales tóxicos. Parece que la toxicidad de diferentes
mutantes de SOD no se debe a una disminución de la actividad de
eliminación de radicales libres dado que no se encontró correlación
entre la actividad enzimática, la vida media del polipéptido y la
resistencia a la proteolisis con la edad de aparición o la rapidez
de la evolución de la enfermedad en seres humanos (para una
revisión, véase Julien, 2001). Ratones transgénicos que expresaban
diversos mutantes de SOD1 desarrollaron la enfermedad de neuronas
motoras y por tanto constituyen un modelo animal aceptado para
someter a prueba la ELA y otros tratamientos de neuronas
motoras.
Recientemente, dos grupos independientes de
científicos han identificado un nuevo gen de la ELA (Hadano et
al., 2001; Yang et al., 2001). Este nuevo gen,
denominado ALS2, está ubicado en el cromosoma 2 y codifica una
proteína denominada alsina. El nuevo gen ALS2 está mutado, tanto en
personas con esclerosis lateral amiotrófica juvenil (ELAJ), también
conocida como ELA2, como en personas con esclerosis lateral
primaria juvenil (ELPJ). Las mutaciones en diferentes regiones del
cromosoma están asociadas a diferentes enfermedades de neuronas
motoras. Específicamente, se encuentra una mutación en una región
en personas con ELA, mientras que se encuentran mutaciones en otras
dos regiones en personas con ELPJ. En el futuro, ratones
transgénicos que lleven estas mutaciones constituirán sin duda un
modelo adicional para someter a prueba tratamientos de la ELA.
Numerosos estudios a lo largo de la última
década se han dedicado a entender la etiología, el pronóstico y la
evolución de la enfermedad. No se ha alcanzado un consenso, excepto
para admitir que es una enfermedad multifactorial en cuanto a las
circunstancias que conducen a su evolución, mientras que la
etiología permanece confusa.
Es evidente en la actualidad que muchos de los
factores que contribuyen a la evolución de la ELA se encuentran en
muchos otros trastornos neurodegenerativos crónicos y agudos. Estos
factores incluyen estrés oxidativo, excitotoxicidad, privación de
soporte trófico y desequilibrio iónico. A lo largo de los años se
han hecho intentos para detener la evolución de la ELA, como en
otros trastornos neurodegenerativos crónicos y agudos, bloqueando
diferentes mediadores de citotoxicidad. La mayoría de estos ensayos
clínicos tuvieron resultados negativos (Turner et al.,
2001).
El estrés oxidativo se caracteriza por la
acumulación de radicales libres que conducen a la muerte de
neuronas motoras. Los radicales libres dañan componentes de las
membranas, proteínas o el material genético de las células
"oxidándolos". Estos radicales libres pueden generarse cuando
la enzima SOD funciona mal, o bien debido a mutación genética, tal
como se produce en algunos pacientes con ELA familiar o bien debido
al entorno químico de las neuronas, o pueden generarse como
resultado de la excitotoxicidad del glutamato, o por alguna otra
razón. Muchos pacientes con ELA toman coenzima Z Q10 y vitamina E
en un esfuerzo por neutralizar los radicales libres.
El glutamato es uno de los mediadores de
toxicidad más comunes en trastornos degenerativos agudos y crónicos
(Pitt et al., 2000) como estado epiléptico, isquemia
cerebral, lesión cerebral traumática, ELA, corea de Huntington,
latirismos y enfermedad de Alzheimer. El glutamato es un
neurotransmisor excitador primario en el SNC de seres humanos. El
L-glutamato está presente en una mayoría de
sinapsis y puede presentar actividad doble: desempeña un papel
central en el funcionamiento normal como neurotransmisor esencial,
pero se convierte en tóxico cuando se superan sus niveles
fisiológicos.
Para neuronas motoras espinales, se logra la
eliminación rápida del glutamato tras la actividad sinóptica
mediante el transportador de glutamato EAAT2 presente en
astrocitos. Se encontró una disminución de la actividad de EAAT2 y
el nivel de proteínas en tejido cerebral de pacientes con ELA
(Rothstein et al., 1992). Ésto podría conducir a un aumento
de la concentración extracelular del glutamato y a la muerte de
neuronas motoras. Clínicamente, el efecto beneficioso del riluzol,
un inhibidor de la liberación de glutamato, sobre el transcurso del
trastorno tanto en seres humanos como en ratones transgénicos,
condujo al tratamiento farmacológico aprobado de la ELA. Sin
embargo, al neutralizar el efecto tóxico es probable que interfiera
con el funcionamiento fisiológico del glutamato como
neurotransmisor del SNC ubicuo.
El papel de factores inmunitarios, celulares y
moleculares en la ELA se ha debatido a lo largo de los años. Se ha
argumentado que, como en muchas otras enfermedades
neurodegenerativas, la inflamación está asociada a la propagación de
la enfermedad, y se ha sugerido el uso de fármacos inmunosupresores
en la ELA. Además, en muchos pacientes con ELA se observó una
correlación con la presencia de anticuerpos
anti-gangliósido, que condujo a algunos
investigadores a sugerir que la ELA es una enfermedad
autoinmunitaria. Sin embargo, no se han proporcionado pruebas
concluyentes que apoyen esta hipótesis.
En el laboratorio de los presentes inventores,
se ha observado recientemente que en estados neurodegenerativos
provocados por agresiones mecánicas (axotomía) o bioquímicas
(glutamato, estrés oxidativo), el sistema inmunitario desempeña un
papel crítico. Así, se ha encontrado que las células T activadas
que reconocen un antígeno del sistema nervioso (SN) promueven la
regeneración de nervios o confieren neuroprotección. Se hace
referencia a la publicación PCT número WO 99/60021. Más
específicamente, se mostró que las células T reactivas frente a la
MBP eran neuroprotectoras en modelos de rata de nervio óptico
parcialmente aplastado (Moalem et al, 1999) y de lesión de
la médula espinal (Hauben et al, 2000). Hasta hace poco, se
pensaba que el sistema inmunitario no permitía que las células
inmunitarias participaran en la reparación del sistema nervioso.
Fue bastante sorprendente descubrir que podrían usarse células T
activadas específicas del SN para promover la regeneración de
nervios o para proteger al tejido del sistema nervioso frente a la
degeneración secundaria que podría seguir al daño provocado por
lesión o enfermedad del SNC o el sistema nervioso periférico
(SNP).
Los presentes inventores observaron además que
condiciones estresantes en el SNC se aprovechan de la respuesta
inmunitaria adaptativa para hacer frente al estrés y que esta
respuesta está controlada genéticamente. Así, se mostró que la tasa
de supervivencia de células ganglionales retinianas en ratas o
ratones adultos tras lesión por aplastamiento del nervio óptico o
inyección intravítrea de una dosificación tóxica de glutamato era
hasta dos veces superior en cepas que eran resistentes a
enfermedades autoinmunitarias del SNC que en cepas susceptibles. Se
encontró que la diferencia podía atribuirse a una respuesta de
células T autoinmunitarias beneficiosa que se provocó
espontáneamente tras la agresión al SNC en las cepas resistentes
pero no en las susceptibles. Así, la tasa de supervivencia de
neuronas como resultado de una agresión de este tipo es superior
cuando se provoca una respuesta de células T dirigida contra las
mismas, siempre que esté bien regulada. En otras palabras, se
demostró que se provoca una respuesta inmunitaria protectora que se
opone a las condiciones estresantes de modo que protege al animal
frente a las consecuencias de la agresión. Se observó además que en
animales con una capacidad deteriorada para regular una respuesta
de este tipo, o en animales desprovistos de células T maduras (como
resultado de haberse sometido a timectomía al nacer), se reduce la
capacidad de hacer frente a las condiciones estresantes. En
consecuencia, la tasa de supervivencia de neuronas tras la agresión
al SNC en estos animales es significativamente inferior que en
animales dotados de un mecanismo eficaz para desencadenar una
respuesta mediada por células T autoinmunitaria protectora (Kipnis
et al.,
2001).
2001).
Entonces, los presentes inventores encontraron
además que puede usarse vacunación con copolímeros sintéticos no
patógenos que se parecen a las proteínas propias tales como el
Copolímero 1 (Cop 1 o glatirámero), un copolímero al azar compuesto
por los cuatro aminoácidos:
tirosina-glutamato-alanina-lisina
(a continuación en el presente documento "Cop 1"), y
poli-Glu,Tyr (a continuación en el presente
documento "PolyYE"), y mediante células T activadas de ese
modo, tras agresión traumática al SNC, para reforzar la
autoinmunidad protectora y reducir de ese modo el daño adicional
inducido por la lesión, y puede proteger además a las células del
SNC frente a la toxicidad del glutamato. Se hace referencia a las
solicitudes de patentes estadounidenses previas con números de
serie 09/756.301 y 09/765.644, fechadas ambas el 22 de enero de
2001, correspondientes al documento WO 01/93893, que dan a conocer
que Cop 1, polipéptidos y péptidos relacionados con Cop 1 y células
T activadas con los mismos protegen a las células del SNC frente a
la toxicidad del glutamato (documento USSN 09/756.301) y previenen
o inhiben la degeneración neuronal o promueven la regeneración de
nervios en el SNC o SNP (documento USSN 09/765.644). En particular,
el documento WO 01/93893 da a conocer un método para proteger a las
células del sistema nervioso central (SNC) frente a la toxicidad
del glutamato, que comprende administrar a un individuo que
necesita del mismo una cantidad eficaz de: (a) células T activadas
que se han activado mediante Cop 1 o un polipéptido o péptido
relacionado con Cop 1; o (b) Cop 1 o un polipéptido o péptido
relacionado con Cop 1. Se hace referencia también a la solicitud
internacional previa WO 01/52878, que da a conocer un método para
prevenir o inhibir la degeneración neuronal, o para promover la
regeneración de nervios, en el sistema nervioso central o sistema
nervioso periférico, que comprende administrar a un individuo que
necesita del mismo una cantidad eficaz de (a) células T activadas
que se han activado mediante Cop 1 o un polipéptido o péptido
relacionado con Cop 1; o (b) Cop 1 o un polipéptido o péptido
relacionado con
Cop 1.
Cop 1.
El único fármaco aprobado y disponible
actualmente para el tratamiento de la ELA es el riluzol
(2-amino-6-(trifluorometoxi)benzotiazol),
un supuesto bloqueante de la liberación de glutamato, que parece
tener efectos de reducción de los espasmos en este estado,
posiblemente a través de la inhibición de la transmisión
glutamatérgica en el SNC. Se administra por vía oral en forma de
comprimidos. El riluzol no cura la enfermedad ni mejora los
síntomas. Ejerce un efecto de modesto a significativo en pacientes
con ELA alargando su vida durante aproximadamente 3 meses, pero no
mejora la fuerza muscular o la función neurológica.
Sería sumamente deseable proporcionar
medicamentos adicionales para el tratamiento de enfermedades de
neuronas motoras, incluyendo la ELA.
La mención o identificación de cualquier
referencia en esta sección o cualquier otra parte de esta solicitud
no debe interpretarse como una admisión de que tal referencia esté
disponible como técnica anterior para la invención.
Se ha encontrado ahora, según la presente
invención, que la inmunización con Cop 1 puede proteger a ratones
transgénicos que sobreexpresan SOD1 humana y a ratones tras
axotomía del nervio facial, ambos modelos para la ELA, frente a la
degeneración de neuronas motoras. Ésto y el hecho de que Cop 1 sea
eficaz en la protección de células ganglionales retinianas frente a
la toxicidad del glutamato, indican la idoneidad de este copolímero
para el tratamiento de la ELA.
La presente invención se refiere por tanto, en
un aspecto, al uso de Cop 1 para la preparación de una vacuna para
tratar pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) mediante
la reducción de la evolución de la enfermedad, y/o la protección
frente a la degeneración de nervios motores, y/o la protección
frente a la toxicidad del glutamato.
En una realización, el método de la invención
incluye el tratamiento también con riluzol o cualquier otro fármaco
adecuado para el tratamiento de la ELA.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una vacuna que comprende Cop 1 para tratar pacientes
con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) mediante la reducción de
la evolución de la enfermedad, y/o la protección frente a la
degeneración de nervios motores, y/o la protección frente a la
toxicidad del glutamato.
Cop 1 puede administrarse sin ningún adyuvante o
puede emulsionarse en un adyuvante adecuado para uso clínico en
seres humanos. El adyuvante adecuado para uso clínico en seres
humanos se selecciona de hidróxido de aluminio, gel de hidróxido de
aluminio e hidroxifosfato de aluminio. En una realización
preferida, el adyuvante de la vacuna es hidroxifosfato de aluminio
amorfo que tiene un punto isoeléctrico ácido y una razón Al:P de
1:1 (denominada en el presente documento
Alum-phos).
Además, la vacuna puede administrarse en un
régimen que incluye la administración de riluzol u otro fármaco
adecuado para el tratamiento de la ELA.
La figura 1 muestra que la inmunización con Cop
1 o PolyYE sin adyuvante protege a las células ganglionales
retinianas (RGC) de ratones frente a la toxicidad del
glutamato.
Las figuras 2A-B muestran que la
inmunización con Cop 1 (2A) o PolyYE (2B) en adyuvante (CFA)
protege a las RGC de ratones frente a la toxicidad del
glutamato.
Las figuras 3A-B muestran el
efecto de la inmunización con PolyYE (figura 3A) o Cop 1 (figura
3B) sobre la supervivencia de RGC en el modelo de presión
intraocular (PIO) de glaucoma.
Las figuras 4A-4B representan
resultados de la prueba de fuerza muscular llevada a cabo con
ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1 mutante humana (a
continuación en el presente documento "ratones con ELA"). La
figura 4A muestra el tiempo de suspensión promedio (segundos) en
una varilla vertical giratoria por semana de ratones con ELA
inmunizados con Cop 1 emulsionado en Alum-phos
(ratones 1, 2 y 4) y de ratones transgénicos no inmunizados
(ratones 3, 5 y 6). La figura 4B representa el tiempo de suspensión
promedio (% de la referencia) de 3 ratones con ELA inmunizados con
Cop 1 en Alum-phos (columnas en negro) en
comparación con el de 3 ratones no inmunizados transgénicos
(control, columnas en gris). Para comparar la tasa de evolución de
la enfermedad, todos los animales se sincronizaron con respecto al
tiempo de aparición de debilidad muscular (tiempo 0), normalizando
cada tiempo de suspensión del animal a su propio tiempo de
referencia antes de la aparición de la enfermedad (tiempo de
referencia - 100%). La figura representa el promedio \pm EEM del
tiempo de suspensión por cada grupo, durante las siguientes semanas
de evolución de la enfermedad.
La figura 5 muestra la conservación del peso
corporal en ratones con ELA inmunizados con Cop 1 en
Alum-phos (cuadrados en negro) en comparación con
ratones no inmunizados (rombos en gris).
La figura 6 es un gráfico que muestra la
esperanza de vida en ratones con ELA inmunizados con
Cop-1 en CFA. La parálisis está provocada por la
pérdida progresiva de neuronas motoras de la médula espinal. Los
controles no vacunados (n = 15) se paralizaron en una o más
extremidades y se murieron a la edad de 211 \pm 7 días (media
\pm DE). Ratones tratados con Cop 1 sobrevivieron durante 263
\pm 8 días.
La figura 7 muestra la esperanza de vida en
ratones con ELA inmunizados con Cop-1 en CFA y
ratones con ELA tratados con riluzol. Ratones con ELA tratados con
riluzol e inmunizados con Cop 1 mostraron un aumento del 9% y el
25%, respectivamente, con respecto a ratones control no
vacunados.
La figura 8 muestra la actividad giratoria
promedio medida en los puntos de tiempo indicados en ratones con
ELA no tratados y tratados con Cop 1. Se dejó que los ratones
agarraran y se mantuvieran sobre un cable vertical (de 2 mm de
diámetro) con un pequeño bucle en el extremo inferior. Se registró
su actividad individualmente mediante un sistema computerizado y se
analizó diariamente. Para la evaluación estadística, se normalizó
la actividad en la varilla giratoria con respecto a la actividad
media de cada ratón desde el día 40 hasta el día 60. Los datos se
expresan como la media \pm el error estándar de la media (EEM).
Se observaron diferencias significativas entre ratones tratados y
no tratados en los siguientes periodos de tiempo: entre los días 12
y 20 (P < 0,058), entre los días 21 y 24 (P <
0,0079) y entre los días 25 y 28 (P < 0,0017).
Las figuras 9A-D muestran el
rescate de neuromas motoras por Cop 1 administrado a ratones tras
axotomía del nervio facial. Ocho semanas tras la axotomía, el
número de neuronas motoras marcadas con FluoroGold en los troncos
encefálicos de ratones vacunados con Cop-1 (figura
9D) era significativamente mayor que el número obtenido en el grupo
al que se le inyectó PBS en CFA (figura 9B). El tratamiento con
Cop-1 no tuvo efecto sobre el número de neuronas
motoras en el núcleo facial no lesionado (figuras 9A, 9C). La
inmunización control con PBS en CFA no tuvo efecto protector.
La presente invención proporciona una vacuna y
un método para reducir la evolución de la enfermedad, para la
protección frente a la degeneración de nervios motores, para
prolongar la vida y mejorar la calidad de vida, y/o para la
protección frente a la toxicidad del glutamato en un paciente que
padece ELA, que comprende inmunizar a dicho paciente con una vacuna
que comprende Cop 1, o bien sin adyuvante o bien emulsionado en un
adyuvante adecuado para uso clínico en seres humanos.
Tal como se usa en el presente documento, las
expresiones "Cop 1" y "Copolímero 1", se usan cada una de
manera intercambiable.
Para los fines de la presente invención, "Cop
1" pretende incluir cualquier polipéptido o péptido, incluyendo
un copolímero al azar, que reaccione de manera cruzada
funcionalmente con la proteína básica de la mielina (MBP) y pueda
competir con la MBP en el CMH de clase II en la presentación de
antígenos.
El Copolímero 1 según esta invención comprende
en combinación alanina, ácido glutámico, lisina y tirosina, de
carga eléctrica positiva global neta y de un peso molecular de
aproximadamente 2.000 - 40.000 Da, preferiblemente de
aproximadamente 2.000 - 13.000 Da, y más preferiblemente el
Copolímero 1 de peso molecular promedio de aproximadamente 4,700 -
13.000 Da. Se describen procedimientos e intervalos de peso
molecular preferidos para preparar una forma preferida de Cop 1 en
la patente estadounidense número 5.800.808.
Según la presente invención, el copolímero
preferido para su uso en la vacuna de la invención es el Copolímero
1, denominado en el presente documento también Cop 1, lo más
preferiblemente en forma de su sal de acetato conocida con el
nombre genérico acetato de glatirámero. El acetato de glatirámero
se ha aprobado en varios países para el tratamiento de la esclerosis
múltiple (EM) con el nombre comercial COPAXONE® (una marca
comercial de Teva Pharmaceuticals Ltd., Petah Tikva, Israel).
Varios ensayos clínicos demostraron que Cop 1 se tolera bien con
sólo reacciones secundarias menores que eran principalmente
reacciones suaves en el sito de inyección (Johnson et al,
1995).
Tal como se mencionó anteriormente, las
mutaciones en el gen de SOD1 son una causa genética de la ELA
familiar (Rosen et al., 1993; Brown, 1995). Varios modelos
de ratón que expresan genes de SOD1 mutados desarrollan
degeneración de neuronas motoras similar a la de seres humanos
(Gurney et al., 1994; Ripps et al., 1995; Kong y Xu,
1998). La caracterización inicial de estas líneas de ratón ha
probado que una ganancia dominante de una propiedad adversa
mediante las enzimas mutadas provoca degeneración de neuronas
motoras (para una revisión, véase Bruijn y Cleveland, 1996).
Además, estos análisis confirmaron numerosos rasgos patológicos que
se han observado en seres humanos (Hirano, 1991; Chou, 1992). El
entendimiento de esta mutación, denominada alteración de SOD1,
produjo un modelo animal aceptado (ratones con ELA) para someter a
prueba tratamientos para la ELA familiar. Dado que la ELA
esporádica (que representa el 90% de todos los casos de ELA) y la
ELA familiar relacionadas con SOD1 tienen rasgos patológicos y
síntomas similares, el ratón transgénico que porta un gen de SOD1
mutado es un modelo animal aceptado para someter a prueba
tratamientos para formas de ELA tanto esporádica como familiar, y
es el modelo usado por la ALS Therapy Development Foundation
(ALS-TDF) (Fundación de Desarrollo de tratamiento de
la ELA). Los ratones con ELA desarrollan una enfermedad motora que
se parece estrechamente a la ELA. La disfunción motora provoca
finalmente su muerte.
Según la presente invención, se mostró que
ratones con ELA que se inmunizaron con una vacuna de Cop 1
emulsionada en CFA o en adyuvante adecuado para uso en seres
humanos estaban protegidos frente a la degeneración de nervios
motores, a pesar de los estados de estrés oxidativo creados por la
sobreexpresión de SOD. Por tanto, la vacunación con el antígeno Cop
1 autorreactivo débil "universal" en CFA prolongó en 52 días
la vida de ratones con ELA (media \pm DE, 263 \pm 8 días, n=14)
en comparación con controles apareados no tratados (211 \pm 7
días; n=15; P<0,0001). La vacunación mejoró
significativamente la actividad motora en los estadios clínico y
preclínico. Además, la vacunación con Cop 1 también previno la
degeneración de neuronas motoras aguda tras axotomía del nervio
facial: sobrevivió casi un 200% más de neuronas motoras en ratones
vacunados que en controles axotomizados (P<0,5). Estos
resultados sugieren que el concepto de autoinmunidad como protector
puede extenderse para incluir enfermedades de neuronas motoras.
También tienen implicaciones clínicas potencialmente
dramáticas.
Los adyuvantes usados para la inmunización según
la invención son adyuvantes a base de aluminio. Más comúnmente
usados en vacunas que contienen antígenos derivados de virus tales
como antígeno de superficie de hepatitis B o polisacárido capsular
de tipo b de Haemophilus influenza, estos adyuvantes se usan
por primera vez junto con copolímeros sintéticos, particularmente
con Cop 1.
La dosis de Cop 1 que va a administrarse la
determinará el médico según la edad del paciente y el estadio de la
enfermedad y puede elegirse de un intervalo de
10-80 mg, aunque cualquier otra dosificación
adecuada está abarcada por la invención. La administración puede
realizarse al menos una vez al mes o al menos una vez cada 2 ó 3
meses, o menos frecuentemente, pero se prevé por la invención
cualquier otro intervalo adecuado entre las inmunizaciones según el
estado del paciente.
La vacuna de la invención puede administrarse
mediante cualquier modo de administración adecuado, incluyendo por
vía oral, por vía intramuscular, por vía subcutánea y por vía
intradérmica, con o sin adyuvante.
Cuando se administra junto con riluzol o
cualquier otro fármaco adecuado para el tratamiento de la ELA, el
fármaco adicional se administra en el mismo día de la vacunación, y
después diariamente, según las instrucciones del fabricante, sin
asociación al régimen de vacuna. Por ejemplo, la dosis diaria de
riluzol es de 100 mg.
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas
características de la presente invención pero no pretenden limitar
el alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Animales. El centro de cría de animales
del Instituto Científico Weizmann ("Animal Breeding Center of
The Weizmann Institute of Science") (Rehovot, Israel)
suministró ratones de la especie C57BL/6J, de 8-13
semanas de edad. Antes de su uso en los experimentos, se
anestesiaron los ratones mediante administración intraperitoneal de
80 mg/kg de ketamina y 16 mg/kg de xilazina. Se adquirieron ratones
transgénicos que sobreexpresaban el gen Gly93\rightarrowAla (G93A)
(B6SJL-TgN (SOD1-G93A)1Gur)
que contenía el alelo de SOD1 mutante humano defectuoso (en el
presente documento "ratones con ELA") de The Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.). Se trataron todos los animales
según las normas formuladas por el Comité Institucional del Uso y
Cuidado de Animales ("Institutional Animal Care and Use
Committee") (IACUC).
Materiales. Cop 1 (PM medio: 7.200
Dalton) era de Teva Pharmaceuticals Ltd. (Petah Tikva, Israel). Se
adquirió gel de hidroxifosfato de aluminio (adyuvante de vacuna
REHYDRAPHOST^{TM}, en el presente documento
Alum-phos) de Reheis (NJ, EE.UU.). Se adquirió
adyuvante completo de Freund que contenía Mycobacterium
tuberculosis (CFA) 0,5 mg/ml de Difco (Detroit, Michigan,
EE.UU.), Si no se específica lo contrario.
Inmunización. Se inmunizaron los ratones
con Cop 1 emulsionado en CFA o en Cop
1-Alum-phos (100 \mug en un
volumen total de 100 \mul). Se mezcló vigorosamente
Alum-phos con Cop 1 en una razón de 1:4. Se inyectó
cada vacuna por vía subcutánea (SC) en un sitio en el costado de los
ratones. Se inyectó a los ratones control manitol o bien en CFA o
bien en Alum-phos.
Inyección de glutamato. Se punzó el ojo
derecho de un ratón C57B BL/6J anestesiado con una aguja de calibre
27 en la parte superior de la esclerótica y se insertó una jeringa
Hamilton de 10 \mul con una aguja de calibre 30 hasta el cuerpo
vítreo. Se inyectó a los ratones un volumen total de 1 \mul (200
nmol) de L-glutamato disuelto en solución
salina.
salina.
Marcaje de las células ganglionares
retinianas (RGC) en ratones. Se marcaron las RGC 72 horas antes
del final del experimento. Se anestesiaron los ratones y se
colocaron en un dispositivo estereotáctico. Se expuso el cráneo y
se mantuvo seco y limpio. Se identificó el bregma y se marcó. El
punto de inyección designado estaba a una profundidad de 2 mm desde
la superficie cerebral, 2,92 mm por detrás del bregma en el eje
anteroposterior y 0,5 mm lateral con respecto a la línea media. Se
perforó una ventana en el cuero cabelludo por encima de las
coordenadas designadas en los hemisferios derecho e izquierdo.
Entonces se aplicó (1 \mul, a una velocidad de 0,5 \mul/min. en
cada hemisferio) el colorante neurotrazador FluoroGold (disolución
al 5% en solución salina; Fluorochrome, Denver, CO) usando una
jeringa Hamilton, y se suturó la piel sobre la herida. La captación
retrógrada del colorante proporciona un marcador de las células
vivas.
Valoración de la supervivencia de RGC en
ratones. Se administró a los ratones una dosis letal de
pentobarbital (170 mg/kg). Se enuclearon sus ojos y se separaron
las retinas y se prepararon como preparaciones completas aplanadas
en paraformaldehído (4% en PBS). Se contaron las células marcadas a
partir de 4-6 campos seleccionados de tamaño
idéntico (0,7 mm^{2}). Los campos seleccionados estaban ubicados
a aproximadamente la misma distancia desde la papila óptica (0,3
mm) para superar la variación en la densidad de RGC como una
función de la distancia desde la papila óptica. Observadores ciegos
al tratamiento que recibió el ratón contaron los campos en el
microscopio de fluorescencia (aumento x 800). Se calculó el número
de RGC promedio por campo en cada retina.
Modelo de esclerosis lateral amiotrófica.
Se vacunaron tres ratones con ELA, de 75 días de edad, con
Cop-1 emulsionado en Alum-phos (100
\mug de Cop-1 en un volumen total de 100 \mul,
una inyección subcutánea en el costado). Se administró a los
ratones una inyección de refuerzo una semana más tarde y después
inyecciones mensuales. No se inmunizaron tres ratones transgénicos
adicionales y sirvieron como control para determinar la evolución
espontánea de la enfermedad. Se evaluó la fuerza muscular
sometiendo a prueba de manera ciega el tiempo de suspensión de cada
ratón en una varilla vertical giratoria. Dado que el tiempo máximo
que la mayoría de los animales podían estar suspendidos en la
varilla giratoria era de 5 minutos, se prolongó cada experimento
hasta 5 minutos.
Prueba de la fuerza muscular. Se realizó
la prueba tal como se describió anteriormente (Kong y Xu, 1998). Se
dejó que los ratones agarraran y se mantuvieran sobre un cable
vertical (de 2 mm de diámetro) con un pequeño bucle en el extremo
inferior. Un cable vertical permite a los ratones usar las
extremidades tanto anteriores como posteriores para coger el cable.
Se mantuvo el cable en un movimiento circular orientado
verticalmente (el radio del círculo era de 10 cm) a 24 rpm. Se
registró el tiempo que el ratón pudo estar suspendido en el cable
con un cronómetro. Puesto que la mayoría de los ratones se cayeron
en el plazo de 5 min., las pruebas se cortaron en 5 min.
Normalmente se sometieron a prueba los ratones una vez a la semana
y las pruebas continuaron hasta que ya no pudieron estar
suspendidos en el cable.
Análisis de datos. Se analizaron los
datos de supervivencia mediante la prueba de
Mantel-Cox o el análisis de regresión de riesgos
proporcionales de Cox. Se sometió a prueba la significación
estadística mediante ANOVA de una vía, seguido por un procedimiento
de Student-Neuman-Keuls
post-hoc con el programa de software
SPSS-PC (SPSS, Chicago, IL).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En primer lugar se examinó si la toxicidad
inducida por glutamato puede bloquearse mediante vacunación activa
con Cop 1 emulsionado en CFA o en Alum-phos. CFA es
un adyuvante no aprobado para el uso en seres humanos y se usa
frecuentemente sólo en experimentos con animales de laboratorio.
Alum-phos y otros adyuvantes a base de hidróxido de
aluminio han recibido la aprobación de la FDA y otras autoridades y
se usan de manera extensa en vacunas veterinarias y humanas.
Se inyectó por vía subcutánea Cop 1 emulsionado
o bien en CFA o bien en Alum-phos (100 \mug de
Cop 1 en un volumen total de 100 \mul) en un sitio en el costado
de ratones C57BL/6J, y siete días más tarde se inyectó glutamato
(200 nmol) en el cuerpo vítreo de los ratones. Tras siete días se
contaron las RGC supervivientes. La supervivencia de las RGC tras
la toxicidad del glutamato sin ninguna inmunización anterior se
tomo como el 100%.
Tal como se muestra en la tabla 2, la
inmunización previa con Cop-1 o bien en CFA o bien
en Alum-phos siete días antes de la inyección de
glutamato proporcionó una protección significativa de las células
ganglionares retinianas frente a la toxicidad del glutamato, pero
la protección con Cop 1 emulsionado en Alum-phos
era significativamente superior que en CFA.
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Ejemplo
2
La toxicidad del glutamato es uno de los
factores de riesgo en la neurodegeneración por la ELA. Para
examinar la eficacia de la inmunización con Cop 1 y PolyYE sin
adyuvante para proteger a las neuronas frente a la toxicidad del
glutamato, se expuso la retina de ratones C57BL a una cantidad en
exceso de glutamato. Se dividieron los ratones C57BL en 4 grupos
experimentales:
1. Animales que no se inmunizaron - control
negativo, n=9.
2. Animales que se inmunizaron con 25 \mug de
PolyYE por ratones, n=10.
3. Animales que se inmunizaron con 225 \mug de
PolyYE por ratones, n=10.
4. Animales que se inmunizaron con 75 \mug de
Cop 1 por ratones, n=7.
Se inmunizaron los grupos tratados con PolyYE o
Cop 1 disuelto en 100 \mul de PBS 7 días antes de la inyección
intraocular de glutamato. Se contó el número de RGC que
sobrevivieron 7 días tras la exposición a nivel elevado de
glutamato y se calculó como el porcentaje de ojos normales. Los
resultados se muestran en la figura 1. La supervivencia de RGC de
todos los grupos tratados (grupos 2-4) era
significativamente (prueba de la t p< 0,001) superior que el
grupo control negativo.
En experimentos adicionales, se trataron ratones
C57B1 con Cop 1 (100 \mug) emulsionado en
Alum-phos (n=8) o con Alum-phos
solo (n=8) o PolyYE (100 \mug) emulsionado en CFA (n=24) o con
adyuvante solo (control negativo) (n=27) (100 \mul), 7 días antes
de la inyección intraocular de glutamato. Se contó el número de RGC
que sobrevivieron 7 días tras la exposición a nivel elevado de
glutamato. Se calculó la protección como el porcentaje de RGC que
sobrevivieron de la pérdida de RGC total en el grupo no tratado.
Los resultados se muestran en las figuras 2A-B. La
supervivencia de RGC en el grupo tratado con Cop 1 (figura 2A) y el
grupo tratado con PolyYE (figura 2B) era significativamente
superior que los grupos control negativo que recibieron adyuvante
sólo.
Se someten a prueba Cop 1 de tamaños de peso
molecular alto (PM medio: 12.600, 15.500 y 22.000 Dalton) en el
modelo de toxicidad del glutamato. Se determina la eficacia para
provocar una respuesta neuroprotectora específica en el modelo de
toxicidad del glutamato aguda en RGC tal como se describió
anteriormente. Se inmunizan ratones C57BL/6 (total de 5 grupos por
experimento, 10 animales por grupo) 14 días antes de la inyección
intraocular de glutamato (200 nmol), y se examina la supervivencia
de RGC 7 días tras la inyección de glutamato. Se someten a prueba
tres dosis de Cop 1 de cada PM y se comparan con el control
negativo (sólo glutamato) y control positivo (75 \mug de Cop 1 de
PM 7.200 d, 7 días antes de la toxicidad del glutamato).
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Ejemplo
3
El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa
crónica con pérdida progresiva de neuronas visuales que finalmente
conduce a la ceguera. El aumento de la presión intraocular (PIO) se
considera el mayor factor de riesgo y se cree que es la causa
principal de muerte neuronal. Por consiguiente, los agentes
bioquímicos o la cirugía diseñada para reducir la PIO son los
tratamientos habituales actualmente. No obstante, la disminución de
la PIO no es siempre suficiente para detener la pérdida neuronal.
Además, la degeneración del nervio óptico a veces se produce en
ausencia de PIO elevada, un estado denominado glaucoma de tensión
normal (que se produce en aproximadamente un tercio de los
pacientes con glaucoma). Por tanto, se considera apropiado un
tratamiento neuroprotector. Se usó un modelo de elevación crónica
de la PIO de la rata para examinar la capacidad de la vacunación
con Cop 1 o PolyYE para atenuar la muerte de neuronas que están en
estados de estrés continuo, tal como puede producirse en pacientes
con ELA. Dado que el glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa
crónica como ELA, la neuroprotección proporcionada en el modelo de
glaucoma puede ser indicativa de una neuroprotección similar en
ELA.
Se realizó la inducción de PIO alta tal como
sigue: usando una lámpara de hendidura Haag-Streit
que emitía irradiación de láser de argón verde azulado, se trató el
ojo derecho de ratas Lewis macho adultas anestesiadas mediante
80-120 aplicaciones dirigidas hacia tres de las
cuatro venas epiescleróticas y hacia 270 grados del plexo límbico.
Se aplicó el haz de láser con una potencia de 1 vatio durante 0,2
segundos, produciendo un tamaño de mancha de 100 mm en las venas
epiescleróticas y de 50 mm en el plexo límbico. En una segunda
sesión de láser una semana más tarde, se usaron los mismos
parámetros excepto porque el tamaño de mancha era de 100 mm para
todas las aplicaciones. Se dirigió la irradiación hacia las cuatro
venas epiescleróticas y 360 del plexo límbico 24.
Para medir la elevación de la PIO, se inyectó a
las ratas por vía intraperitoneal 10 mg/ml de acepromazina, un
fármaco sedante que no reduce la PIO, y cinco minutos más tarde se
midió la presión en ambos ojos usando un tonómetro
Tono-Pen XL (Automated Ophthalmics, Ellicott City,
MD, EE.UU.), tras aplicar Localin a la cornea. Se calculó el
promedio de 10 mediciones tomadas de cada ojo. Una semana después
del primer tratamiento con láser, la PIO alcanzó niveles de
aproximadamente 30 mmHg sin ningún cambio significativo hasta el
final del experimento (3 semanas después del primer tratamiento con
láser) tal como se muestra en la tabla 3 a continuación.
Para determinar la supervivencia de RGC, se
aplicó el colorante neurotrazador hidrófilo
dextrano-tetrametilrodamina
(rodamina-dextrano) (Molecular Probes, Oregón, USA)
3 semanas después del primer tratamiento con láser directamente en
la parte intraorbital del nervio óptico. Sólo los axones que
sobreviven a la alta PIO y siguen siendo funcionales, y cuyos
cuerpos celulares están todavía vivos, pueden captar el colorante y
demostrar RGC marcadas. Se sacrificaron las ratas 24 horas más
tarde y se extirparon sus retinas, se hicieron preparaciones
completas y se contaron las RGC marcadas con un aumento de x800 en
un microscopio de fluorescencia Zeiss. Se contaron cuatro campos de
cada retina, todos con el mismo diámetro (0,076 mm^{2}) y a la
misma distancia desde la papila óptica. Un observador ciego con
respecto a la identidad de las retinas contó las RGC.
La tabla 3 resume la supervivencia de RGC en
ratas con PIO normal y en ratas con un aumento de PIO inducido por
láser 3 semanas más tarde.
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Se inmunizaron ratas SPD con PolyYE (500 \mug)
emulsionado con CFA una hora después del primer tratamiento con
láser (n=9). Se inmunizó un grupo control con CFA sin el antígeno
(n=7) y se inyectó al segundo grupo control PBS solo (n=5). Tal
como se muestra en la figura 3A, aunque la PIO seguía siendo
elevada durante todo el periodo experimental, las ratas inmunizadas
con PolyYE, pero no con PBS, mostraron un aumento significativo de
la supervivencia de sus RGC en comparación con las ratas no
inmunizadas. Se calculó la protección de RGC como el porcentaje de
células supervivientes en los grupos tratados de la pérdida de
células totales en el grupo no inmunizado.
Usando el modelo de rata de la elevación de la
PIO, se demostró que Cop 1 atenuaba la pérdida neuronal cuando se
administraba (500 \mug en CFA) al inicio de la elevación de la PIO
o una semana más tarde (véase la figura 3B), a pesar del hecho de
que la PIO seguía siendo alta y ya se había iniciado la
degeneración de nervios. Adicionalmente, la vacunación con Cop 1,
administrada junto con el fármaco que reduce la PIO, brimonodina,
dio como resultado una mayor protección de RGC que usando
brimonodina sólo (véase la figura 3B, inserto).
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Ejemplo
4
Para someter a prueba si la inmunización con Cop
1 puede proteger frente a la evolución de la degeneración de
neuronas motoras, se inmunizaron ratones con ELA con SOD1 (n=3) con
Cop 1 en Alum-phos cuando tenían 75 días de edad y
se administró una administración de refuerzo una semana más tarde.
Entonces se inmunizaron cada 30 días. Un grupo control (n=3) de
ratones con ELA no se inmunizó con Cop 1. Entonces se sometieron a
prueba los ratones varias por semana para determinar la fuerza
muscular, sometiendo a prueba de manera ciega el tiempo de
suspensión en una varilla vertical giratoria. Cada experimento duró
5 min.
El desarrollo de la debilidad muscular en los
ratones se representa en las figuras 4A-B. La
figura 4A representa el tiempo de suspensión promedio para cada
animal por semana (los resultados son la media \pm EEM). Tal como
se muestra, dos de los animales inmunizados con Cop 1 (ratones 1 y
4) mostraron un tiempo de suspensión mayor que los ratones no
inmunizados.
La aparición del descenso de la fuerza muscular
variaba entre ratones individuales. Para evaluar el efecto de la
vacunación sobre la tasa de descenso en cada ratón, se comparó la
fuerza muscular a cualquier tiempo dado con la encontrada una
semana antes del comienzo del descenso.
La figura 4B muestra el gráfico sincronizado del
descenso de la fuerza muscular en ratones transgénicos
individuales. Está claro que los ratones inmunizados con
Cop-1 (columnas en negro) mostraron una tasa de
descenso de la fuerza muscular significativamente inferior,
independientemente de su fuerza en el día de inmunización. Por
tanto, conservan la potencia motora durante un periodo de tiempo
mayor en comparación con animales no inmuni-
zados.
zados.
El efecto beneficioso de la inmunización con Cop
1 también se refleja en el peso corporal de los ratones. Tal como
se muestra en la figura 5, a medida que evoluciona la enfermedad,
los ratones transgénicos inmunizados con Cop-1
también mostraron una pérdida más lenta del peso corporal. Entre la
edad de 86 a 111 días, todos los ratones transgénicos no
inmunizados perdieron 2 gramos de su peso corporal. En cambio, en
el grupo inmunizado con Cop 1, un ratón no cambió y dos aumentaron
2 gramos su peso corporal.
La inmunización con Cop 1 también afectó a la
tasa de mortalidad de los ratones transgénicos. Con la evolución de
la enfermedad, los ratones se paralizaron y se murieron. La
inmunización con Cop 1 prolongó significativamente la vida de los
ratones transgénicos: mientras que los ratones no tratados murieron
2, 3 y 4 semanas después de la aparición de la enfermedad, un ratón
inmunizado con Cop 1 sobrevivió durante 4 semanas y los otros dos
durante 7 semanas después de la aparición de la enfermedad (tabla
4). En el momento de la muerte, los ratones transgénicos
inmunizados con Cop 1 eran 3 semanas mayores, en promedio, que los
ratones no inmunizados.
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Ejemplo
5
Se vacunaron catorce ratones con ELA, de 60 días
de edad con Cop 1 (75 \mug) emulsionado en CFA (Difco
Laboratories, Heidelberg, Alemania) que contenía Mycobacterium
tuberculosis 5 mg/ml. Se inyectó la emulsión (volumen total de
200 \mul) en la almohadilla plantar trasera, y se trataron
posteriormente los ratones diariamente con Cop 1 (12,5 mg/kg/día)
oral administrado en el agua para beber. Se observaron diariamente
y se pesaron semanalmente ratones inmunizados a la edad de 60 días
con Cop-1 y ratones control no tratados. Se
monitorizó su actividad motora y su mortalidad. Se determinó la
edad en la aparición de síntomas como la edad (en días) en el
momento de la primera aparición de temblores y/o agitación de las
extremidades, o la suspensión (más que la separación) de las
extremidades traseras cuando el ratón se mantenía en el aire por la
cola. Se tomó la pérdida del reflejo de enderezamiento para indicar
el estadio final de la enfermedad. La parálisis está provocada por
la pérdida progresiva de neuronas motoras de la médula espinal. Tal
como se muestra en la figura 6, los controles no vacunados (n=14)
se paralizaron en una o más extremidades y se murieron a la edad de
211 \pm 7 días (media \pm DE). Los ratones tratados con
Cop-1 sobrevivieron durante 263 \pm 8 días. Por
tanto, la vacunación con Cop-1 aumentó
drásticamente la esperanza de vida de los ratones con ELA (figura
6).
Como control positivo, se administró a 15
ratones con ELA una dosis diaria (30 mg/kg) de riluzol, el único
fármaco que se administra actualmente a pacientes con ELA. Tal como
se muestra en la figura 7, los ratones tratados con riluzol
mostraron un aumento del 9% de la supervivencia con respecto al
control, mientras que los ratones tratados con Cop
1-mostraron un aumento del 25% con respecto al
control.
Además del aumento de casi el 25% de vida, se
retrasó la aparición de la enfermedad (manifestada mediante el
rendimiento motor), lo que indica que el beneficio también se
expresaba en la calidad de vida, tanto en los estadios clínico como
preclínico (figura 8). Se dejó que los ratones agarraran y se
mantuvieran en un cable vertical (de 2 mm de diámetro) con un
pequeño bucle en el extremo inferior. Se obtuvieron valores
normales para cada ratón valorando la actividad motora por la noche
(desde las 8 PM hasta las 8 AM) entre las edades de 40 y 60 días,
usando el aparato de varilla giratoria (LMTB, Berlín). Se registró
su actividad individualmente mediante un sistema computerizado y se
valoró diariamente. Para la evaluación estadística se normalizó la
actividad en la varilla giratoria con respecto a la actividad media
de cada ratón desde el día 40 hasta el día 60. Se expresan los datos
como la media \pm el error estándar de la media (EEM). Se
compararon las pruebas con la varilla giratoria y el peso mediante
análisis de la varianza (ANOVA). Se sometió a prueba la
significación estadística mediante ANOVA de una vía seguido por un
procedimiento de
Student-Neuman-Keuls
post-hoc con el programa de software
SPSS-PC (SPSS, Chicago, IL). Se observaron
diferencias significativas entre ratones no tratados y tratados con
Cop-1 en los siguientes periodos de tiempo: entre
los días 12 y 20 (P < 0,058), entre los días 21 y 24 (P <
0,0079) y entre los días 25 y 28
(P < 0,0017).
(P < 0,0017).
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Ejemplo
6
Se dividieron ratones con ELA (15 animales por
grupo) en 11 grupos experimentales:
1. Ratones no tratados - grupo control
negativo.
2. Ratones tratados con riluzol - 30
mg/kg/día
3. Ratones inmunizados con Cop 1/CFA - 75 \mug
de vacunación primaria seguida por administración oral diaria de
Cop 1 (12,5 mg/kg) - grupo control positivo.
4. Ratones inmunizados con dos inyecciones de 75
\mug de Cop 1: la primera en el día 45 y la segunda en el
día
59.
59.
5. Ratones inmunizados como en el grupo nº 4
seguido por una única inyección de 100 \mug de Cop 1 en el
día
87.
87.
6. Ratones inmunizados con dos inyecciones de
150 \mug de Cop 1: la primera en el día 45 y la segunda en el
día
59.
59.
7. Ratones inmunizados con dos inyecciones de 75
\mug de Cop 1: la primera en el día 83 y la segunda en el
día
97.
97.
8. Igual que en el grupo nº 4, con riluzol 30
mg/kg/día.
9. Igual que en el grupo nº 5, con riluzol 30
mg/kg/día.
10. Igual que en el grupo nº 6, con riluzol 30
mg/kg/día.
11. Igual que en el grupo nº 7, con riluzol 30
mg/kg/día.
Se monitorizan la actividad motora y el peso
corporal de los ratones una vez a la semana, iniciándose dos
semanas antes del comienzo del tratamiento. El criterio de estadio
final para sacrificar a los animales se define mediante su
incapacidad para enderezarse por sí mismos en el plazo de 30
segundos cuando se colocan de cualquier lado sobre una superficie
plana. La decisión la realiza un veterinario independiente tal como
solicita el protocolo de
animales.
animales.
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Ejemplo
7
Se sabe que el corte transversal del nervio
facial en el ratón adulto provoca una degeneración tardía
fácilmente visible del 20% al 35% de las neuronas motoras
axotomizadas. Por tanto, la axotomía del nervio facial proporciona
un modelo para la ELA, que es una enfermedad que se caracteriza por
la pérdida progresiva de motoneuronas. El efecto de la inmunización
sobre la supervivencia y función de las neuronas en el modelo de
axotomía del nervio facial es indicativo del potencial del
tratamiento para atenuar la pérdida neuronal en pacientes con
ELA.
Treinta y cuatro ratones hembra adultos (12
semanas de edad, 20-25 g) de la cepa C57BL/6J01aHsd
(Harlan Winkelmann, Borchen, Alemania) participaron en este
experimento. Se sometieron los animales control a axotomía del
nervio facial unilateral y o bien no se trataron o bien se les
inyectó PBS emulsionado en CFA. Se inmunizaron los ratones en el
grupo experimental (n = 10) con Cop 1 (total de 100 \mug) o se les
inyectó PBS (n = 9), en ambos casos emulsionados en CFA, y 7 días
más tarde se sometieron a axotomía del nervio facial. Se
axotomizaron los ratones en un tercer grupo (n = 8) sin
inmunización anterior, y se dejaron intactos los ratones en un
cuarto grupo
(n = 7).
(n = 7).
Siete días más tarde se creó una anastomosis
facial-facial (FFA) en ratones anestesiados (100 mg
de Ketanest® más 5 mg de Rompun® por kg de peso corporal) mediante
reconexión microquirúrgica del muñón proximal al muñón distal con
dos suturas epineurales 11-0 (Ethicon EH 7438G,
Norderstedt, Alemania). Se cerró la herida con tres suturas
cutáneas 4-0. Para la valoración de la
recuperación, se marcaron de manera retrógrada las neuronas motoras
faciales que inervan a los músculos de la almohadilla del bigote
mediante inyección de 30 \mul de la disolución acuosa al 1% del
trazador retrógrado fluorescente FluoroGold más el 2% de
dimetilsulfóxido (DMSO) inyectada en los músculos de cada
almohadilla del bigote. Siete días más tarde, se volvieron a
anestesiar los ratones y se perfundieron de manera transcardíaca
con NaCl al 0,9% seguido por fijación con paraformaldehído al 4% en
tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 20 min. Se extrajeron los
cerebros y se cortaron secciones coronales de 50 \mum de espesor a
través de los troncos encefálicos con un vibratomo. Se observaron
las secciones con un microscopio de epifluorescencia Axioskop 50 de
Zeiss a través de un conjunto de filtros
HQ-Schmalband hechos a medida para FluoroGold (AHF
Analysentechnik, Tubingen, Alemania).
Ocho semanas tras la axotomía, tal como se
muestra en las figuras 9A-D y la tabla 5, el número
medio de neuronas motoras marcadas con FluoroGold en los ratones
vacunados con Cop-1 era significativamente mayor
que el número obtenido en el grupo al que se inyectó PBS en CFA o
en el grupo control no tratado (P < 0,05). El tratamiento con
Cop 1 no tuvo efecto sobre el número de neuronas motoras en el
núcleo facial no lesionado. La inmunización control con PBS en CFA
no tuvo efecto protector.
El marcaje neuronal retrógrado tras la inyección
de FluoroGold en la almohadilla del bigote no mostró diferencias en
la localización o la cantidad de neuronas motoras en el núcleo
facial intacto entre ratones inmunizados con Cop-1
en CFA (figura 9A) y ratones a los que se inyectó PBS en CFA
(figura 9C). En cambio, el núcleo facial lesionado, tras el
pretratamiento de ratones con Cop 1 en CFA (figura 9B), contenía
significativamente más neuronas motoras marcadas que las del núcleo
facial lesionado en animales control pretratados con PBS en CFA
(figura 9D). Los datos se presentan como medias \pm desviación
estándar (DE). Se detectaron diferencias entre los diferentes
grupos experimentales aplicando un análisis de la varianza (ANOVA)
de una vía y una prueba de t post-hoc para
los datos no apareados con la corrección de
Bonferroni-Holm. Los valores de P inferiores
a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
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Ejemplo
8
Para determinar si el mayor número de neuronas
motoras encontradas en los ratones axotomizados tratados con
Cop-1 que en los controles estaba asociado a la
mejora funcional, se analizó biométricamente el comportamiento de
sacudida. Se documentaron los parámetros de referencia del
comportamiento de sacudida en ratones control intactos. En
condiciones fisiológicas normales, las vibrisas mistaciales están
erectas con orientación anterior. Sus barridos simultáneos,
conocidos como "sacudidas" u "olfateos", se producen
5-11 veces por segundo. Los movimientos claves de
esta actividad motora son la protracción y retracción de los pelos
de las vibrisas mediante los músculos piloerectores, que están
inervados mediante la rama bucal del nervio facial. Cuando se
secciona transversalmente el nervio facial, las vibrisas adquieren
una orientación caudal y permanecen inmóviles.
Usando este modelo, se evaluaron los siguientes
parámetros: (i) protracción (movimiento hacia delante de las
vibrisas), medida mediante el ángulo abierto por el rostro entre el
plano sagital medio y el eje del pelo (se representan protracciones
grandes mediante valores de ángulo pequeños); (ii) frecuencia de
sacudidas, representada por ciclos de protracción y retracción
(movimiento hacia atrás pasivo) por segundo; (iii) amplitud, la
diferencia en grados entre la retracción máxima y la protracción
máxima; (iv) velocidad angular durante la protracción, en grados
por segundo; y (v) aceleración angular durante la protracción, en
grados por segundo.
Los ratones sometidos a axotomía del nervio
facial y a vacunación con Cop-1 demostraron una
actividad de sacudida significativamente mejor que los otros grupos
de ratones. Esto se demostró de la mejor manera mediante la
amplitud, la velocidad angular durante la protracción y la
aceleración angular durante la protracción (tabla 6).
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Los valores numéricos de los resultados se
muestran en la figura 9. Números (medias \pm DE) de pericariones
faciales marcados de manera retrógrada mediante inyección de
FluoroGold al 1% (30 \mul) en ratones intactos (grupo A) y en
ratones que se sometieron a FFA sólo (grupo B), FFA tras inyección
de PBS en CFA (grupo C) y FFA tras vacunación con Cop 1 en CFA
(grupo D). Las letras en superíndice indican los grupos con valores
significativamente diferentes (*P < 0,05). Para el
análisis de imágenes, se usó un sistema de cámara de vídeo CCD
(Optronics Engineering Model DEI-470, Goleta, CA)
combinado con el software de análisis de imágenes Optimas 6.5
(Optimas, Bothell, WA) para contar manualmente las neuronas motoras
faciales marcadas de manera retrógrada en la pantalla del ordenador
(42). Empleando el principio fraccionador (43), se contaron
todas las neuronas motoras marcadas de manera retrógrada con
núcleos celulares visibles en cada sección de segundo de las
secciones de 50 \mum de espesor a través del núcleo facial en el
lado tanto operado como no operado. Dos observadores realizaron el
recuento, los cuales eran ciegos con respecto al tratamiento que
recibieron las ratas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Biometría del comportamiento de sacudida normal
y de recuperación en ratones intactos (grupo A) y en ratones
sometidos a FFA sólo (grupo B), ratones sometidos a FFA tras
inyección de PBS en CFA (grupo C) y ratones sometidos a FFA tras
inyección de Cop-1 en CFA (grupo D). Los valores son
las medias \pm DE. Las letras en superíndice indican grupos con
valores significativamente diferentes (* P < 0,05). Se
usaron para el análisis biométrico los dos pelos largos de la fila
C en cada lado de la cara. Con los ratones en narcosis ligera por
éter, se cortaron las otras vibrisas con unas tijeras finas
pequeñas. Se usó una cámara portátil digital (Panasonic NV
DX-110 EG) para grabar a los ratones en exploración
activa durante 3-5 min. Tras la calibración, se
tomaron muestras de imágenes de vídeo del comportamiento de
sacudida a 50 Hz (50 campos por s), con el obturador de la cámara
de vídeo abierto durante 4 ms. Se registraron las imágenes en
mini-casetes AY-DVM 60 EK. Se
revisaron lentamente las secuencias de vídeo y se seleccionaron
fragmentos de secuencia de 1,5 s de cada ratón para el análisis de
la biometría de sacudida. Los criterios de selección usados eran
posición estable de la cabeza, frecuencia de sacudida y grado de
protracción de las vibrisas. Se capturaron las secuencias
seleccionadas mediante un sistema de vídeo avanzado manual 2D
(2D/Manual Advanced Video System) PEAK Motus 2000 (PEAK
Performance Technologies, Englewood, CO). El modelo espacial
consistía en tres puntos de referencia (punta de la nariz y los
ángulos internos de ambos ojos). Cada vibrisa está representada en
el modelo espacial por dos puntos: su base y un punto en el eje 0,5
cm desde la base.
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Claims (9)
1. Uso de Cop 1 para la preparación de una
vacuna para tratar pacientes con esclerosis lateral amiotrófica
(ELA) mediante la reducción de la evolución de la enfermedad, y/o
la protección frente a la degeneración de nervios motores, y/o la
protección frente a la toxicidad del glutamato.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicha vacuna comprende Cop 1 sin adyuvante.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicha vacuna comprende Cop 1 emulsionado en un adyuvante adecuado
para uso clínico en seres humanos.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que
dicho adyuvante se selecciona del grupo que consiste en hidróxido
de aluminio, gel de hidróxido de aluminio e hidroxifosfato de
aluminio.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que
dicho adyuvante es hidroxifosfato de aluminio amorfo que tiene un
punto isoeléctrico ácido y una razón Al:P de 1:1.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha vacuna es para la
administración al menos una vez al mes.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha vacuna es para la
administración al menos una vez cada 2-3 meses.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha vacuna es para la
administración con otro fármaco para el tratamiento de ENM tal como
riluzol.
9. Vacuna que comprende Cop 1 para tratar
pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) mediante la
reducción de la evolución de la enfermedad, y/o la protección
frente a la degeneración de nervios motores, y/o la protección
frente a la toxicidad del glutamato.
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