NO336231B1 - Anvendelse av Cop-1 for fremstilling av en vaksine for behandling av amyotrofisk lateral sklerose (ALS). - Google Patents

Description

Anvendelse av Cop-1 for fremstilling av en vaksine for behandling av amyotrofisk lateral sklerose (ALS)

OMRÅDE OG BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av Cop-1 for fremstilling av en vaksine til behandling av amyotrofisk lateral sklerose (ALS).

Motorneuronsykdom (MND) er det navn som er gitt en gruppe relaterte sykdommer som påvirker motorneuroner i hjernen (øvre motorneuroner) og ryggraden (nedre motorneuroner). Motorneuroner (eller motonneuroner) er nerveceller langs hvilke hjernen sender instruksjoner, i form av elektriske impulser, til musklene. Degenerering av motorneuroner fører til svekkelse og nedbygging av muskler. Dette skjer generelt til å begynne med i armer og ben, enkelte grupper av muskler påvirkes mer enn andre.

Det finnes forskjellige klassifiseringer av MND. I de fleste tilfeller av MND, inntrer degenerering av både de øvre og nedre motorneuroner. Denne tilstand kalles amyotrofisk lateral sklerose (ALS), også kjent som Lou Gehrigs sykdom, og karakteriseres ved muskelsvekkelse, stivhet og fasikulering (muskelrykninger). Det er også mindre vanlige former der en selektiv degenerering av enten de øvre motorneuroner (som primær lateral sklerose, PLS) eller nedre motorneuroner (som progressiv muskulær atrofi, PMA), observeres. Progressiv Bulbar Palsy (PBP eller Bulbar Onset) er en versjon av ALS som starter med vanskeligheter ved svelging, tygging og snakking og som treffer ca. 25% av ALS pasientene.

Det er en betydelig overlapping mellom disse former av MND. Personer med PMA utvikler med tiden en øvre motorneuroninvo Iver ing og både ved PMA og ALS, kan enkelte personer til slutt erfare tale- og svelgevanskeligheter i varierende grad (bulbar onset ALS eller PMA).

ALS er en kronisk, progressiv neurodegenerativ sykdom som karakteriseres ved gradvis degenerering av nervecellene i sentralnervesystemet (CNS) som kontrollerer frivillig muskelbevegelse. Det progressive tap av motorneuroner fører til gradvis skjellettmuskelatrofi og til uunngåelig død, vanligvis innen 2 - 3 til 10 år etter sykdommens begynnelse. Muskelsvekkelse og atrofi og tegn på anterior horncelledysfunksjon bemerkes til å begynne med oftest i hendene og mindre ofte i føttene. Startsetet er tilfeldig og progresjonen er asymmetrisk. I USA alene har 30.000 mennesker i dag ALS og ca. 8.000 nye tilfeller diagnostiseres hvert år.

ALS opptrer i sporadiske (SALS) og arvelige (FALS) former (Mulder et al., 1986; Munsat, 1989). De primære risikofaktorer er for det meste ukjente, dog er 5 til 10% av alle ALS pasienter arvelighetstilfeller (FALS). Ca. 20% av alle arvelige former ble funnet å ha mutasjoner i genet som koder Cu/Zn superoksideringsmutase type 1 på kromosom 21 (Rosen et al., 1993; Brown, 1995). SOD er et enzym som katalyserer konverteringen av superoksydanioner til hydrogenperoksid og således kan SOD beskytte celler mot de skadelige virkninger av disse toksiske radikaler. Det synes som om toksisiteten for forskjellige SOD mutanter ikke skyldes reduserte friradikal-oppfangingsaktivitet fordi ingen korrelasjon ble funnet mellom enzymatisk aktivitet, polypeptidhalveringstid og resistens mot proteolyse, med startalder eller hurtighet for human sykdomsprogresjon (for en oversikt henvises til Julien, 2001). Transgeniske mus som uttrykker forskjellige SODI mutanter utviklet motorneuronsykdom og utgjør således en akseptert dyremodell for å teste ALS og andre motorneuronterapier.

I den senere tid er et nytt ALS gen identifisert av to uavhengige grupper av forskere (Hadano et al., 2001; Yang et al., 2001). Dette nye gen, kalt ALS2, er lokalisert på kromosom 2 og koder for et protein kalt alsin. Det nye ALS2 gen er mutert både hos personer med juvenil amyotrofisk lateral sklerose (JALS), også kjent som ALS2, og personer med juvenil primærlateralsk sklerose (JPLS). Mutasjoner i forskjellige områder av kromosomet er assosiert med forskjellige motorneuronsykdommer. Spesifikt blir en mutasjon i et område funnet hos personer med ALS, mens mutasjon i to andre områder finnes hos personer med JPLS. I fremtiden vil transgeniske mus som bærer disse mutasjoner, ganske visst utgjøre en ytterligere modell for testing av ALS terapier.

Uttallige studier i det siste tiår er viet forståelsen av etiologien, prognosen og progresjonen av sykdommen. Det har ikke nådd noen konsensus, bortsett fra innrømmelsen at det er en multifaktoriell sykdom uttrykt ved omstendigheter som fører til dens progresjon, mens etiologien forblir uklar.

Det er i dag klart at mange av de faktorer som bidrar til progresjon av ALS finnes i mange andre kronisk og akutte, neurodegenerative lidelser. Disse faktorer inkluderer oksidativt stress, eksitotoksisitet, deprivasjon av trofisk støtte, og ionisk ubalanse. Med årene har det vært gjort forsøk på å stanse progresjonen av ALS som ved andre kroniske og akutte, neuroregenerative lidelser, ved å blokkere forskjellige mediatorer for cytotoksisitet. De fleste av disse kliniske prøver har hatt negative resultater (Turner et al., 2001).

Oksidativt stress karakteriseres ved akkumulering av fri radikaler som kan føre til motorneurondød. Frie radikaler skader komponenter i cellers membraner, proteiner eller genetisk materialer ved at de "oksideres". Disse fri radikaler kan genereres når enzymet SOD ikke virker riktig, enten på grunn av en genetisk mutasjon slik det inntrer ved enkelte arvelige ALS pasienter eller på grunn av den kjemiske omgivelse for nervecellene, eller de kan genereres som et resultat av glutamat eksitotoksisitet, eller av en eller annen grunn. Mange ALS pasienter tar Coenzyme Z Q10 og Vitamin E i et forsøk på å nøytralisere fri radikaler.

Glutamat er en av de vanligste mediatorer for toksisitet ved akutte og kroniske, degenerative lidelser (Pitt et al., 2000) som status epilepticus, cerebral iskemi, traumatisk hjerneskade, ALS, Huntingtons korea, latyrismer og Alzheimers sykdom. Glutamat er en primær eksitatorisk neurotransmitter i human CNS. L-glutamat er tilstede som en majoritet av synapser og er i stand til å vise dualaktivitet: den spiller en nøkkelrolle ved normal funksjon som en essensiell neurotransmitter, men blir toksisk når de fysiologiske nivåer overskrides.

For spinal motorneuroner oppnås hurtig glutamatfjerning etter synaptisk aktivitet ved glutamattransportøren EAAT2 som er tilstede i astrocytter. Reduksjon av EAAT2 aktiviteten og proteinnivået ble funnet i hjernevev hos ALS pasienter (Rothstein et al., 1992). Dette kunne føre til øket ekstracellulær konsentrasjon av glutamat og død for motorneuroner. Klinisk førte den fordelaktige virkning av Riluzole, en glutamat frigivningsinhibitor, på forløpet av lidelsen både hos mennesker og transgeniske mus, til godkjennelse av medikamentbehandling av ALS. Ved imidlertid å nøytralisere den toksiske effekt vil man sannsynligvis interferere med den fysiologiske funksjon for glutamat som en ubikitøs CNS neurotransmitter.

Rollen hos immunfaktorer, cellulære og molekylære, ved ALS, er debattert og diskutert i mange år. Det er argumentert med, som ved mange andre neurodegenerative sykdommer, at inflammasjon er assosierte med sykdomspropageringen, og bruken av immunosuppressive medikamenter mot ALS, er foreslått. Hos mange ALS pasienter ble videre korrelasjonen observert med nærværet av anti-gangliosid antistoffer, noe som brakte noen forskere til å antyde at ALS er en autoimmunsykdom. Imidlertid er ingen avgjørende bevis så langt tilveiebrakt for å understøtte denne hypotese.

I foreliggende søkeres laboratorier er det i den senere tid observert at under neurodegenerative tilstander forårsaket av mekaniske (aksotomi) eller biokjemiske (glutamat, oksidativt stress) insulter, spiller immunsystemet en vesentlig rolle. Således er det funnet at aktiverte T-celler som gjenkjenner et antigen av nervesystemet (NS) promoterer nerveregenerering eller gir neurobeskyttelse, det skal henvises til WO 99/60021, som skal anses som en del av beskrivelsen. Mer spesielt ble T-celler som er reaktive mot MBP, påvist å være neurobeskyttende i rottemodeller av partielt knust optisk nerve (Moalem et al, 1999) og ryggmargsskade (Hauben et al, 2000). Inntil nylig er det antatt at immunsystemet utelukker immunceller fra å delta i nervesystemreparasjon. Det var således overraskende å oppdage at NS-spesifikke, aktiverte T-celler kunne benyttes for å fremme nerveregenerering eller beskytte nervesystemvev mot sekundær degenerering som kunne følge skade forårsaket av skade eller sykdom på CNS eller det perifere nervesystem (PNS).

Foreliggende oppfinnere har videre observert at stressbetingelser i CNS bringer det addative immunsystem til å takle stress og at denne respons er genetisk kontrollert. Således ble overlevelsesgraden for retinale ganglionceller i voksne mus eller rotter etter knuseskade av den optiske nerve eller intravitreal injeksjon av en toksisk dose av glutamat, påvist å være opp til to ganger høyere i belastningen som er resistente mot CNS autoimmunsykdommer enn i susceptible stammer. Forskjellen ble funnet å skyldes en fordelaktig autoimmun T-cellerespons som spontant ble vekket etter CNS insult i den resistente, men ikke i mottakelige stammer. Således er overlevelsesgraden av neuroner som et resultat av en slik insult høyere når T-cellerespons rettet mot ego vekkes, forutsatt at den er selvregulert. Med andre ord ble det påvist at en beskyttende autoimmun respons ble vekket for å virke mot stressbetingede tilstander for å beskytte dyret mot insultkonsekvensene. Det ble videre observert at to dyr med forringet evne til å regulere slik respons, eller hos dyr som ikke hadde mature T-celler (som et resultat av tidligere tymektomi under fødsel), var evnen til å takle stressbetingelser redusert. Som en konsekvens er overlevelsesgraden for neuroner etter CNS insult i disse dyr signifikant lavere enn hos dyr som har en effektiv mekanisme for å reise en beskyttende, autoimmun T-celle-mediert respons (Kipnis et al., 2001).

Det ble så videre funnet av foreliggende oppfinnere at vaksinering med ikke-patogeniske, syntetiske kopolymerer som ligner selvproteiner som kopolymer 1 (Cop-1 eller Glatiramer), en vilkårlig kopolymer bestående av de fire aminosyrer: tyrosin-glutamat-alanin-lysin (heretter "Cop-1") og poly-Glu, Tyr (heretter "PolyYE"), og med T-celler, som derved er aktivert etter traumatisk CSN insult, kan benyttes for å booste den protektive autoimmunitet og derved redusere ytterligere skadeinduserte ulemper, og videre kan beskytte CNS-celler mot glutamattoksisitet. I denne forbindelse henvises det til foreliggende søkeres USSN 09/756,301 og 09/765,644, begge av 22. januar 2001, som anses i sin helhet som en del av foreliggende beskrivelse, tilsvarende WO 01/93893, som beskriver at Cop-1, Cop-1-relaterte peptider og polypeptider og T-celler som er aktivert med disse, beskytte CNS-celler mot glutamattoksisitet (USSN 09/756,301) og forhindre eller inhibere neuronal degenerering eller fremme nerveregenerering i CNS eller PNS (USSN 09/765,644). Det skal videre henvises til foreliggende søkers tidligere USSN 09/893,344 av 28. juni 2001, som også anses som en del av foreliggende beskrivelse, og som beskriver at kopolymeren poly-Glu<50>Tyr<50>, tidligere kalt polyGT også angis som Poly YE og T-celler som er aktivert med denne, beskytte CNS-celler mot glutamattoksisitet og forhindrer eller inhiberer også neuronal degenerering eller fremmer nerveregenerering i CNS eller PNS. Spesifikt ble det i nevnte søknader vist at i optiske nervefibre var antallet overlevende retinalganglionceller signifikant høyere i Cop-1-immuniserte eller poly-Glu, Tyr-immuniserte mus enn i mus som var injisert med PBS.

WO 01/52878 beskriver anvendelse av kopolymer 1 og relaterte peptider og T-celler behandlet dermed for nevrobeskyttende terapi. Anvendelsen av Cop-1 er fokusert på en skadet optisk nerve, glaukom og glutamattoksisiet i motorneuronsykdom.

WO 97/14427 vedrører anvendelse av protein S-100b i medisinske preparater for stimulering av vekst og overlevelse av neuroner som har blitt skadet av sykdommer slik som amyotrofisk lateral sklerose og multippel sklerose.

Det eneste anerkjente og i dag tilgjengelige medikament for behandling av ALS er Riluzole (2-amino-6-(trifluormetoksy)benzotiazol), en putativ

glutamatfrigivningsblokker, som synes å ha en viss spasmereduserende virkning ved denne tilstand, muligens på grunn av inhibering av glutamatergisk transmisjon i CNS. Medikamentet administreres oralt i form av tabletter. Riluzole helbreder ikke sykdommen og forbedrer heller ikke symptomene. Den utøver en moderat til signifikant effekt hos ALS-pasienter ved å forlenge levetiden med opp til 3 måneder, men forbedrer ikke muskelstyrke eller neurologisk funksjon.

Det ville være meget ønskelig å kunne tilveiebringe ytterligere medikamenter for behandling av motorneurosykdommer, inkludert ALS.

Angivelse eller identifisering av referanser i denne del eller annensteds i foreliggende søknad skal ikke erkjennes som innrømmelse om at disse er tilgjengelige som kjent teknikk vis-a-vis foreliggende søknad.

SUMMERING AV OPPFINNELSEN

Der er nå, i henhold til foreliggende oppfinnelse, funnet at immunisering med Cop-1 kan beskytte transgeniske mus som overuttrykker human SODI og mus etter facialnerveaksotomi, begge ALS modeller, mot motorneurondegenerering. Dette og det faktum at Cop-1 er effektiv når det gjelder å beskytte retinalganglionceller mot glutamattoksisitet, antyder egnetheten for disse kopolymerer for behandling av ALS.

Foreliggende oppfinnelse angår således i et aspekt anvendelse av Cop-1 for fremstilling av en vaksine til behandling av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) pasienter ved å redusere sykdomsprogresjon og/eller beskytte mot motornervedegenerering og/eller beskytte mot glutamattoksisitet

I en utførelsesform beskrives behandling også med Riluzole eller et hvilket som helst annet medikament som er egnet for behandling av ALS.

Det beskives også en vaksine omfattende Cop-1 for å behandle amyotrofisk lateral sklerose (ALS) pasienter ved å redusere sykdomsprogresjon, og/eller beskytte mot motornervedegenerering og/eller beskytte mot glutamattoksisitet.

Cop-1 kan administreres ved eller uten adjuvant eller kan emulgeres i en adjuvant egnet for human klinisk bruk. Adjuvanten som er egnet for human klinisk bruk er valgt blant aluminiumhydroksid, aluminiumhydroksidgel og aluminiumhydroksyfosfat. I en foretrukket utførelsesform er vaksineadjuvanten amorf aluminiumhydroksyfosfat med et surt isoelektrisk punkt og et Al :P forhold på 1:1 (heretter angitt som Alum-phos).

I tillegg kan vaksinen administreres innen et regime som inkluderer administrering av Riluzole eller et annet medikament egnet for behandling av ALS.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser at immunisering med Cop-1 eller PolyYE uten adjuvant, beskytter museretinal ganglionceller (RGC'er) mot glutamattoksisitet. Figur 2A-B viser at immunisering med Cop-1 (2A) eller PolyYE (2B) i adjuvant (CFA) beskytter muse RGC'er mot glutamattoksisitet. Figur 3A-B viser virkningen av immunisering med PolyYE (Figur 3A) eller Cop-1 (Figur 3B) på RGC overlevelse i glaukom intraokuler trykk (IOP) modell. Figur 4A-4B viser resultatene av muskelstyrketesten gjennomført med transgeniske mus som overuttrykker human mutant SODI (heretter "ALS mus"). Figur 4A viser den midlere hengetid (sekunder) på en roterende vertikal stav pr. uke for ALS mus som er immunisert med Cop-1 emulgert i Alum-phos (mus 1, 2 og 4) og ikke immunisert, transgenisk mus (mus 3, 5 og 6). Figur 4B angir den midlere hengetid (% av bunnlinjen) av 3 ALS mus immunisert med Cop-1 i Alum-phos (sorte kolonner) sammenlignet med den til 3 transgeniske, ikke-immuniserte mus (kontroll, grå kolonner). For å sammenligne graden av sykdomsprogresjon, ble alle dyr synkronisert til tiden for start av muskelsvekkelse (tid 0), ved normalisering av hver dyrehengetid til sin egen bunnlinjetid før sykdomsstart (bunnlinjetid - 100%). Figuren viser gjennomsnitt ± SEM-hengetiden for hver gruppe for de følgende uker av sykdomsprogresjonen. Figur 5 viser preserveringen av kroppsvekt hos ALS mus som er immunisert med Cop-1 i Alum-phos (sorte kvadrater) sammenlignet med ikke-immuniserte mus (grå ruter). Figur 6 er en graf som viser livsforventningen ved ALS mus som er immunisert med Cop-1 i CF A. Paralyse forårsakes av det progressive tap av motorneuroner fra ryggmargen. Ikke-vaksinerte kontroller (n = 15) ble paralysert i ett eller flere lemmer og døde ved en alder av 211 ± 7 dager (gjennomsnitt ± SA). Cop-1 -behandlede mus overlevde i 263 ± 8 dager. Figur 7 viser livsforventningene for ALS mus immunisert med Cop-1 i CF A og ALS mus behandlet med Riluzole. Riluzole-behandlede og Cop-1-immuniserte ALS mus viste en økning på 9% henholdsvis 25% i forhold til ikke-vaksinerte kontrollmus. Figur 8 viser gjennomsnittlig rotatoriske aktiviteter målt ved det angitte tidspunktet i Cop-1-behandlede og ikke-behandlede ALS mus. Musene ble tillatt å gripe og holde

seg fast i en vertikal tråd (2 mm diameter) med en liten løkke i den nedre ende. Aktiviteten ble notert individuelt ved et datamaskinsystem og bedømt daglig. For statistisk evaluering ble rotarodaktiviteten normalisert til den midlere aktivitet for hver mus fra dag 40 til dag 60. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnitt (SEM). Signifikante differanser mellom behandlete og ikke-behandlete mus ble observert ved de følgende tidspunkter: mellom dag 12 og 20 (P < .058), mellom dag 21 og 24 (P < .0079) og mellom dag 25 og 28 (P < .0017).

Figur 9 A - D viser virkningen på motorneuroner av Cop-1 administrert til mus etter facial nerveaksotomi. 8 uker etter aksotomi var antallet FluoroGold-merkede motorneuroner i hjernestammen hos mus vaksinert med Cop-1 (Figur 9D) signifikant større enn antallet oppnådd i gruppen injisert med PBS i CFA (Figur 9B). Behandling med Cop-1 hadde ingen innvirkning på antallet motorneuroner i den ikke-lesjonerte facialnukleus (Figur 9A, 9C). Kontrollimmunisering med PBS i CFA hadde ingen beskyttende effekt.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Det er beskrevet en anvendelse og en vaksine for å redusere sykdomsprogresjon, for beskyttelse av motornervedegenerering, for å forlenge levetid og forbedre livskvalitet, og/eller for beskyttelse mot glutamattoksisitet hos pasienter som lider av MND, særlig ALS. Det er beskrevet en vaksine omfattende et Cop-1, enten uten adjuvant eller emulgert i en adjuvant egnet for humanklinisk bruk.

Som benyttet her, benyttes uttrykkene "motorneuroner" og motonneuroner", uttrykkene "PolyYE" og "poly-Glu,Tyr", samt uttrykkene "Cop-1" og "Copolymer 1", om hverandre.

For oppfinnelsens formål er "Cop-1 eller et Cop-1-relatert peptid eller polypeptid" ment å inkludere et hvilket som helst peptid eller polypeptid inkludert en vilkårlig kopolymer, som kryssreagerer funksjonelt med myelin basisprotein (MBP) og er i stand til å konkurrere med MBP på MHC klasse U i antigenpresentasjonen.

Vaksinen kan omfatte som aktivt middel, en vilkårlig kopolymer omfattende en egnet mengde av en positivt ladet aminosyre som lysin eller arginin, i kombinasjon med en negativt ladet aminosyre (fortrinnsvis i en mindre mengde) som glutaminsyre eller aspartinsyre, eventuelt i kombinasjon med en ikke-ladet, nøytral aminosyre som alanin eller glysin, som tjener som fyllstoff, og eventuelt med en aminosyre tilpasset tilpasning til de kopolymer immunogeniske egenskaper, for eksempel en aromatisk aminosyre som tyrosin eller tryptofan. Slike vaksiner kan inkludere en hvilken som helst av de kopolymerer som ble beskrevet i WO 00/05250, hvis innhold anses som en del av foreliggende beskrivelse.

Mer spesifikt omfatter vaksinen for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse minst en kopolymer valgt fra gruppen bestående av vilkårlige kopolymerer omfattende en aminosyre valgt blant hver av minst tre av de følgende grupper: (a) lysin og arginin; (b) glutaminsyre og asparginsyre; (c) alanin og glysin; og (d) tyrosin og tryptofan.

Kopolymerene for anvendelse kan bestå av L- eller D-amino syrer eller blandinger derav. Som velkjent for fagmannen opptrer L-aminosyrer i de fleste naturlige proteiner. Imidlertid er D-aminosyrer kommersielt tilgjengelige og kan benyttes i stedet for alle eller noen av aminosyrene som benyttes for å fremstille terpolymerene og andre kopolymerer som benyttes. Foreliggende oppfinnelse tar sikte på bruk av kopolymerer inneholdende både D- og L-aminosyrer så vel som kopolymerer inneholdende i det vesentlige en av L- eller D-aminosyrene.

I en utførelsesform inneholder kopolymeren fire forskjellige aminosyrer, hver fra en annen gruppe av gruppene (a) til (d). En foretrukket kopolymer ifølge denne utførelsesform omfatter i kombinasjon alanin, glutaminsyre, lysin og tyrosin, med netto totalt positiv elektrisk ladning, og en molekylvekt på rundt 2.000 - 40.000 Da og særlig rundt 2.000 - 13.000 Da, helt spesielt Copolymer 1 med midlere molekylvekt 4.700 - 13.000 Da. De foretrukne molekylvektområder og prosesser for fremstilling av en slik form av Cop-1 er beskrevet i US 5.800.808 hvis innhold gjøres til en del av foreliggende beskrivelse. Det skal være klart at dette er et eksempel og at vaksinen kan varieres både med henblikk på bestanddeler og relative andeler av bestanddelene hvis man holder seg til de ovenfor angitte generelle kriterier. Således kan kopolymeren være et polypeptid med en lengde rundt 15 til rundt 100 og fortrinnsvis rundt 40 til rundt 80 aminosyrer og er fortrinnsvis kopolymeren med det generiske navn glatirameracetat.

I en annen utførelsesform inneholder kopolymeren tre forskjellige aminosyrer, hver fra en forskjellig gruppe blant gruppene (a) til (d). Disse kopolymerer angis her som terpolymerer.

I en utførelsesform inneholder terpolymerene for anvendelse tyrosin, alanin og lysin, heretter angitt som YAK. Den midlere molekylandel for aminosyrene i denne terpolymeren kan variere. For eksempel kan tyrosin være tilstede i en molandel på rundt 0,005 - 0,250; alanin kan være tilstede i en molarandel på rundt 0,3 - 0,6; og lysin kan være tilstede i en molandel på rundt 0,1 - 0,5. Den midlere molekylvekt er mellom 2.000 - 40.000 Da og fortrinnsvis mellom rundt 3.000-35.000 Da. I en mer foretrukket utførelsesform er den midlere molekylvekt rundt 5.000 - 25.000 Da. Det er mulig å benytte arginin i stedet for lysin, glysin i stedet for alanin og/eller tryptofan i stedet for tyrosin.

I en annen utførelsesform inneholder terpolymerene for bruk tyrosin, glutaminsyre og lysin, heretter angitt som YEK. Den midlere molandel for aminosyrene i terpolymerene kan variere: glutaminsyre kan være tilstede i en molandel på rundt 0.005 - 0.300, tyrosin kan være tilstede i en molandel på rundt 0.005 - 0.250 og lysin kan være tilstede i en molandel rundt 0,3 - 0,7. Den midlere molekylvekt er mellom 2.000 - 40.000 Da og fortrinnsvis mellom 3.000 - 35.000 Da. I en mer foretrukket utførelsesform er den midlere molekylvekt rundt 5.000 - 25.000 Da. Det er mulig å benytte aspartinsyre i stedet for glutaminsyre, arginin i stedet for lysin og/eller tryptofan i stedet for tyrosin.

I en annen utførelsesform kan terpolymerene for anvendelse inneholde lysin, glutaminsyre og alanin, heretter angitt som KEA. Den midlere molandel for aminosyrene i disse polypeptider kan variere. For eksempel kan glutaminsyre være tilstede i en molandel på rundt 0.005 - 0.300, alanin kan være tilstede i en molandel på rundt 0.005 - 0.600 og lysin kan være tilstede i en molandel på rundt 0.2 - 0.7. Den midlere molekylvekt ligger mellom 2.000 - 40.000 Da og fortrinnsvis mellom rundt 3.000 - 35.000 Da. I en mer foretrukket utførelsesform er molekylvekten rundt 5.000 - 25.000 Da. Det er mulig å benytte aspartinsyre i stedet for glutaminsyre, glysin i stedet for alanin og/eller arginin i stedet for lysin.

I en annen utførelsesform inneholder terpolymerene for anvendelse tyrosin, glutaminsyre og alanin, heretter angitt som YEA. Den midlere molekylandel av aminosyrene i disse polypeptider kan variere. For eksempel kan tyrosin være tilstede i en molandel på rundt 0.005 - 0.250, glutaminsyre kan være tilstede i en molandel på rundt 0.005 - 0.300 og alanin kan være tilstede i en molandel på rundt 0,005 - 0.800. Den midlere molekylvekt er mellom 2.000 og 40.000 Da og helst mellom 3.000 og 35.000 Da. I en mer foretrukket utførelsesform er den midlere molekylvekt rundt 5.000 - 25.000 Da. Det er mulig å benytte tryptofan i stedet for tyrosin, aspartinsyre i stedet for glutaminsyre og/eller glysin i stedet for alanin.

I en mer foretrukket utførelsesform er molandelen av aminosyrer i terpolymerene rundt det som er foretrukket for Copolymer 1. Molandelen av aminosyrer i Copolymer 1 er glutaminsyre rundt 0,14, alanin rundt 0,43, tyrosin rundt 0,10 og lysin rundt 0,34. Den mest foretrukne midlere molekylvekt for Copolymer 1 er mellom rundt 5.000 og 9.000 Da. Aktiviteten for Copolymer 1 for vaksine som beskrevet her, er forventet å forbli hvis en eller flere av de følgende substitusjoner foretas: asparginsyre i stedet for glutaminsyre, glysin i stedet for alanin, arginin i stedet for lysin eller tryptofan i stedet for tyrosin.

Molforholdene for monomerene av de mer foretrukne terpolymerer av glutaminsyre, alanin og tyrosin, eller YEA, er rundt 0,21:0,65:0,14.

Molforholdene for monomerene av den mer foretrukne terpolymer av glutaminsyre, alanin og lysin, eller KEA, er rundt 0,15:0,48:0,36.

Molforholdene for monomerene av den mer foretrukne terpolymer av glutaminsyre, tyrosin og lysin, eller YEK, er rundt 0,26:0,16:0,58.

Molforholdene for monomerene av den mer foretrukne terpolymer av tyrosin, alanin og lysin, eller YAK, er rundt 0,10:0,54:0,35.

Terpolymerene kan fremstilles ved en hvilken som helst prosedyre som er tilgjengelig for fagmannen. For eksempel kan terpolymerene lages under kondensasjonsbetingelser ved bruk av det ønskede monoforhold mellom aminosyrene i oppløsningen, eller ved fastfasesynteseprosedyre. Kondenseringsbetingelsene inkluderer egnet temperatur, pH-verdi og oppløsningsmiddelbetingelser for kondensering av karboksylgruppen av en aminosyre til aminogruppen i en annen aminosyre for å danne en peptidbinding. Kondenseringsmidler, for eksempel dicykloheksylkarbodiimid, kan benyttes for å lette dannelsen av peptidbindingen. Blokkerende grupper kan benyttes for å beskytte funksjonelle grupper som sidekjededelene og noen av amino- eller karboksylgruppene mot uønskede bireaksjoner.

For eksempel kan den prosess som er beskrevet i US patent 3.849.650 benyttes der N-karboksyanhydridene av tyrosin, alanin, y-benzylglutamat og n s-trifluoracetyllysin polymeriseres ved omgivelsestemperatur i vannfri dioksan med dietylamin som initiator. y-karboksylgruppen av glutaminsyren kan deblokkeres med hydrogenbromid i iseddik. Trifluoracetylgruppene fjernes fra lysin med 1 molar piperidin. Fagmannen på området vil lett forstå at prosessen lett kan justeres for å fremstille peptider og polypeptider inneholdende de ønskede aminosyrer, dvs. tre av de fire aminosyrer i Copolymer 1, ved selektivt å eliminere reaksjoner som relaterer til en hvilken som helst av glutaminsyre, alaninsyre, tyrosin eller lysin. For søknadens formål betyr uttrykkene "omgivelsestemperatur" og "romtemperatur" en temperatur i området rundt 20 til rundt 26°C.

Molekylvekten for terpolymeren kan justeres under polypeptidsyntesen eller etter at tverrpolymerene er fremstilt. For å justere molekylvekten under polypeptidsyntesen blir de syntetiske betingelser eller mengdene av aminosyrer justert slik at syntesen stanser når polypeptidet når omtrent den lengde som er ønsket. Etter syntese kan polypeptider med den ønskede molekylvekt oppnås ved en hvilken som helst tilgjengelig størrelsesseleksjonsprosedyre som kromatografi av polypeptidet på en molekylvektstørrelseskolonne eller -gel, og samling av de ønskede molekylvektsområder. De foreliggende polypeptider kan også hydrolyseres partielt for å fjerne høymolekylvektsspesier, for eksempel ved sur eller enzymatisk hydrolyse, og så renses for å fjerne syren eller enzymene.

I en utførelsesform kan terpolymerene med en ønsket molekylvekt fremstilles i en prosess som inkluderer omsetning av et beskyttet polypeptid med hydrobromsyre for å gi et trifluoracetylpolypeptid med den ønskede molekylvektsprofil. Reaksjonen gjennomføres i et tidsrom og ved en temperatur som er bestemt på forhånd ved en eller flere testreaksjoner. Under testreaksjoner blir tid og temperatur variert og molekylvektsområdet for en gitt sats av testpolypeptider bestemmes. Testbetingelsene som gir det optimale molekylvektsområdet for denne sats av polypeptider, benyttes for satsen. Således kan et trifluoracetylpolypeptid med den ønskede molekylvektsprofil fremstilles ved en prosess som inkluderer omsetning av det beskyttede polypeptid med hydrobromsyre i et tidsrom og ved en temperatur som er bestemt på forhånd ved testreaksjoner. Trifluoracetylpolypeptidet med den ønskede molekylvektsprofil blir så behandlet videre med en vandig piperidinoppløsning for å danne et lavtoksisitetspolypeptid med den ønskede molekylvekt.

I en foretrukket utførelsesform blir en testprøve av beskyttet polypeptid fra en gitt sats omsatt med hydrobromsyre i rundt 10 til 50 timer ved en temperatur på rundt 20 - 28°C. De beste betingelser for denne sats bestemmes ved å kjøre flere testreaksjoner. For eksempel i en utførelsesform blir for eksempel det beskyttede polypeptid omsatt med hydrobromsyre i rundt 17 timer ved en temperatur rundt 26 °C.

Som binding er det kjent deler av Cop-1 til MS-assosierte HLA-DR molekyler (Fridkis-Hareli et al., 1999), polypeptider med fiksert sekvens kan lett fremstilles og testes for binding til peptidbindingssporet av HLA-DR molekylene som beskrevet av Fridkis-Hareli et al., (1999). Eksempler på slike peptider er de som beskrevet i WO 005249, hvis innhold gjøres til del av foreliggende beskrivelse. 32 av peptidene som spesifikt er beskrevet i denne søknaden, er reprodusert i Tabell 1 nedenfor. Slike peptider og andre tilsvarende peptider skulle forventes å ha en aktivitet tilsvarende Cop-1. Slike peptider, og andre tilsvarende peptider, anses også å ligge innenfor definisjonen av Cop-1 - relaterte peptider eller polypeptider og deres anvendelse anses å være en del av foreliggende oppfinnelse.

Definisjonen av "Cop-1-relatert polypeptid" er ment å omfatte andre syntetiske aminosyrekopolymerer som de vilkårlige fire aminosyrekopolymerer som er beskrevet av Fridkis-Hareli et al., 2002, som kandidater for behandling av multippel sklerose, nemlig kopolymerer (14-, 35- og 50-merer) inneholdende aminosyrene fenylalanin, glutaminsyre, alanin og lysin (poly FEAK), eller tyrosin, fenylalanin, alanin og lysin (poly YFAK) og en hvilken som helst annen tilsvarende kopolymer som kan anses som et universelt antigen tilsvarende Cop-1 og polyYE. I henhold til foreliggende oppfinnelse er den foretrukne kopolymeren for anvendelse i vaksinen ifølge oppfinnelsen Copolymer 1, her angitt også som Cop-1, helst i for av sitt acetatsalt, kjent under det generiske navn Glatiramer acetat. Glatiramer acetat er anerkjent i flere land for behandling av multippel sklerose (MS) under handelsbetegnelsen COPAXONE ® (et varemerke registrert av Teva Pharmaceuticals Ltd. Petah Tikva, Israel). Flere kliniske prøver har demonstrert at Cop-1 tolereres godt med kun mindre bivirkninger som for de fleste milde reaksjoner på injeksjonssete (Johnson et al, 1995).

Som nevnt ovenfor er mutasjoner i SODI-genet en genetisk årsak for arvelig ALS (Rosen et al., 1993; Brown, 1995). Flere musemodeller som uttrykker de muterte SODI-gener utvikler motorneurondegenerering tilsvarende den hos mennesker (Gurney et al., 1994; Ripps et al, 1995; Kong and Xu, 1998). Initialkarakteriseringen av disse muselinjer har vist at en dominant økning av en ugunstig egenskap ved de muterte enzymer forårsaker motorneurondegenerering (for en oversikt henvises til Bruijn and Cleveland, 1996). I tillegg bekreftet disse analyser tallrike patologiske trekk som er observert hos mennesker (Hirano, 1991; Chou, 1992). Forståelsen av denne mutasjon, kalt SODI-endring, ga en akseptert dyremodell (ALS mus) for å teste terapien på arvelig ALS. Fordi SODI-relatert arvelig ALS og sporadisk ALS (som utgjør 90% av alle ALS-tilfeller) har tilsvarende symptomer og patologiske trekk, er den transgeniske mus som bærer et mutert SODI-gen en akseptert dyremodell for testeterapier både for arvelige og sporadiske ALS-former, og er den modell som benyttes av ALS Therapy Development Foundation (ALS-TDF). ALS-mus utvikler en motorsykdom som minner sterkt om ALS. Motordysfunksjonen forårsaker til slutt deres død.

I henhold til oppfinnelsen ble ALS-mus som var immunisert med en vaksine av Cop-1, emulgert i CFA eller i en adjuvant egnet for human bruk, påvist å være beskyttet mot motornervedegenerering, på tross av de oksidative stressbetingelser som skapes av overekspresjonen av SOD. Således forlenget vaksinasjon med det "universelle" svake selvreaktive antigen Cop-1 i CFA levetidsrommet med 52 dager for ALS-mus (gjennomsnitt ± SA, 263 ± 8 dager, n=14) sammenlignet med ikke-behandlede, tilpassede kontroller (211 ± 7 dager; n=15; P<.0001). Vaksinasjonen forbedret signifikant motoraktiviteten under de kliniske og prekliniske trinn. I tillegg forhindret vaksinasjon Cop-1 også akutt motorneurondegenerering etter facial nerveaksotomi: så å si 200% mer motorneuroner overlevde i vaksinerte mus enn i aksotomiserte kontroller (P<.05). Disse resultatene antyder at konseptet med autoimmunitet som beskyttelse kan utvikles til å inkludere motorneuronsykdommer. De har også potensielt dramatiske kliniske implikasjoner.

Adjuvantene som benyttes for immunisering i henhold til oppfinnelsen er aluminiumbaserte adjuvanter. Ellers mer benyttet i vaksiner inneholdende virusavledede antigener som hepatitt B overfalteantigen eller Haemophilus influensa type b kapsulær polysakkarid, benyttes disse adjuvanter for første gang sammen med syntetiske kopolymerer og særlig med Cop-1.

Doseringen av Cop-1 eller PolyYE for administrering vil bestemmes av legen i henhold til pasientens alder og sykdomstilstanden og kan velges innen området 10 til 80 mg, selv om andre egnede doseringsområder ligger innenfor oppfinnelsens ramme. Administreringen kan foretas minst en gang pr. måned eller minst en gang pr. hver 2. eller 3. måned, eller mindre hyppig, men ethvert annet egnet intervall mellom immuniseringen ligger innenfor oppfinnelsens ramme, alt etter pasientens tilstand.

Vaksinen kan administreres ved en hvilken som helst egnet administreringsmodus, inkludert oralt, intramuskulært, subkutant og intradermalt, med eller uten adjuvant.

Administrert sammen med Riluzole eller et annet medikament som er egnet for behandling av MND og særlig ALS, administreres det ytterligere medikament på samme dag som vaksineringen, og dagen deretter, alt etter produsentens instruksjoner, uten noen assosiasjon til vaksineregimet. For eksempel er den daglige Riluzole-dose 100 mg pr. dag.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen uten å begrense dens ramme.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

Dyr.

Mus av stammen C57BL/6J, alder 8-13 uker, ble levert av "Animal Breeding Center of The Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israel). Før deres anvendelse i forsøket ble dyrene anestetisert ved intraperiotoneal administrering av 80 mg/kg ketamin og 16 mg/kg xylazin. Transgeniske mus som overuttrykker den defektive humanmutant SODI allele inneholdende Gly93 ->Ala (G93A) gen (B6SJL-TgN (SODl-G93A)lGur (heretter "ALS mus") ble levert fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Alle dyrene ble håndtert i henhold til de reguleringer som er formulert av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Materialer.

Cop-1 (median MW: 7.200 dalton) ble levert fra Teva Pharmaceuticals Ltd. (Petah Tikva, Israel). Aluminiumhydroksyfosfatgel (REHYDRAPHOS ™ Vaccine Adjuvant, her Alum-phos) ble ervervet fra Reheis (NJ, USA). Fullstendig Freunds adjuvant inneholdende 0,5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (CFA) ble ervervet fra Difco (Detroit, Michigan, USA), hvis ikke annet er sagt.

Immunisering.

Musene ble immunisert med Cop-1 emulgert i CFA eller i Cop-1 -Alumphos (100 ug i et totalvolum på 100 ul). Alum-phos ble blandet heftig med Cop-1 i et forhold på 1:4. Hver vaksine ble injisert subkutant (SC) ved et sete i flanken av musene. Kontrollmus ble injisert med mannitol i enten CFA eller i Alum-phos.

Glutamatinjeksjon.

Det høyre øyet av en anestetisert C57B BL/6J mus ble punktert med en nål nr. 27 i den øvre del av sclera og en 10 ul Hamilton-sprøyte med en nål nr. 30 ble innført helt inn til det vitrealet legemet. Musene ble injisert med et totalvolum på 1 ul (200 nmol) L-glutamat oppløst i saltoppløsning.

Merking av retinal ganglionceller ( RGC) i mus.

RGC'er ble merket 72 timer før slutten av forsøket. Musene ble anestetisert og plassert i en stereotaktisk innretning. Skallen ble eksponert og holdt tørr og ren. Bregma ble identifisert og markert. Det designerte injeksjonspunkt befant seg ved en dybde på 2 mm fra hjerneoverflaten, 2,92 mm bak bregma i den anteroposteriøre akse og 0,5 mm lateralt til midtlinjen. Et vindu ble boret i skallen over de designerte koordinater i de høyre og venstre hemisfærer. Neurotracerfargestoffet FluoroGold (5% oppløsning i saltoppløsning; Fluorochrome, Denver, CO) ble så tilført (1 ul, i en hastighet av 0,5 ul/min. i hver hemisfære) ved bruk av en Hamilton-sprøyte, og huden over såret ble suturert. Retrogradopptak av fargestoffet ga en markør av de levende celler.

Bedømmelse av RGC overlevelse i mus.

Musene ble gitt en letal dose av pentobarbiton (170 mg/kg). Øynene ble enukleatert og retina løsgjort og preparert som utflatede hele elementer i paraformaldehyd (4% i PBS). Merkede celler fra 4 - 6 valgte områder med identisk størrelse (0,7 mm2) ble talt. De valgte områder ble lokalisert ved omtrent samme avstand fra den optiske skive (0,3 mm) for å overvinne RGC-densitetsvariasjonen som en funksjon av avstanden fra den optiske skive. Feltene ble talt under et fluorescensmikroskop (forstørrelse 800 x) av observatører som var skjermet fra behandling av musene. Det midlere antall RGC'er pr. felt i hver retina ble beregnet.

Amyotrofisk lateral sklkerosemodelL

3 ALS-mus med alder 75 dager ble vaksinert med Cop-1 emulgert i Alum-phos (100 ug Cop-1 i et totalvolum på 100 ul, en subkutan injeksjon i flanken). Musene ble gitt en boosterinjeksjon 1 uke senere og injeksjoner hver måned deretter. 3 ytterligere transgeniske mus ble ikke immunisert og tjente som kontroll for den spontane progresjon av sykdommen. Muskelstyrken ble bedømt ved blindtest av den tid hver mus kunne henge i en roterende, vertikal stav. Fordi den maksimale tid for de fleste dyr når det gjelder å henge i den roterende stav var 5 minutter, ble hvert forsøk fortsatt opp til 5 minutter.

Muskelstyrketest.

Testen ble gjennomført som beskrevet tidligere (Kong and Xu, 1998). Musene ble tillatt å gripe og å holde en vertikal tråd (diameter 2 mm) med en liten løkke i den nedre ende. En vertikal tråd tillot musene å benytte både for- og baklemmene for å gripe tråden. Tråden ble holdt i en vertikalt orientert sirkulær bevegelse (sirkelradius var 10 cm) i en hastighet av 24 omdreininger pr. minutt. Den tid musene var i stand til å henge på tråden ble notert. Fordi de fleste mus falt ned i løpet av 5 minutter, ble testingen avbrutt etter 5 minutter. Musene ble vanligvis testet 1 gang pr. uke og testingen fortsatte inntil de ikke lenger kunne henge på tråden.

Dataanalyse.

OverlevelsesAata ble analysert ved Mantel-Cox testen eller Cox' proporsjonale risikoregresjonsanalyse. Statistisk signifikans ble testet ved enveis ANOVA, fulgt av en post-hoc Student-Neuman-Keuls prosedyre med SPSS-PC program (SPSS, Chicago,

IL).

Eksempel 1. Neuronalbeskyttelse mot glutamattoksisitet ved aktiv vaksinering

med Cop-1 emulgert i Alum-phos.

Det ble først undersøkt hvorvidt glutamatindusert toksisitet kan blokkeres ved aktiv vaksinering med Cop-1 emulgert i CFA eller i Alum-phos. CFA er en adjuvant som ikke er godkjent for human bruk og benyttes hyppig kun i laboratoriedyreforsøk. Alum-phos og andre aluminiumhydroksydbaserte adjuvanter har mottatt FD A- og andre godkjennelser og er i utstrakt bruk i veterinær- og humanvaksiner.

Cop-1 emulgerte enten i CFA eller i Alum-phos (100 jig Cop-1 i et totalvolum på 100 ul) ble injisert subkutant ved et sete i flanken av C57BL/6J mus og 7 dager senere ble glutamat (200 nmol) injisert i det vitreale legemet hos musene. Etter 7 dager ble de overlevende RGC'er tellet. Overlevelsen av RGC'er etter glutamattoksisitet uten tidligere immunisering, ble satt til 100%.

Som vist i Tabell 2, ga pre-immunisering med Cop-1, enten i CFA eller i Alum-phos, 7 dager før glutamatinjeksjon, en signifikant beskyttelse av retinalganglionceller mot glutamattoksisitet, men beskyttelsen med Cop-1 emulgert i Alum-phos var signifikant høyere enn i CFA.

Eksempel 2. Neuronalbeskyttelse mot glutamattoksisitet ved vaksinering med

Cop-1 eller PolyYE uten eller med adjuvant.

Glutamattoksisiteten er en av risikofaktorene ved ALS neurodegenerering. For å undersøke effektiviteten av immunisering med Cop-1 og PolyYE uten adjuvant for å beskytte neuronene mot glutamattoksisitet, ble retina av C57BL mus eksponert til overdrevne mengder av glutamat. C57BL musene ble delt i 4 forsøksgrupper:

1. Dyr ikke-immunisert - negativ kontroll, n = 9

2. Dyr som var immunisert med 25 jig PolyYE pr. mus, n = 10

3. Dyr som var immunisert med 225 ug PolyYE pr. mus, n = 10

4. Dyr som var immunisert med 75 ug Cop-1 pr. mus, n = 7

De behandlede grupper ble immunisert med PolyYE eller Cop-1 oppløst i 100 jxl PBS 7 dager før intraokuler glutamat injeksjon. Antallet RGC'er som overlevde 7 dager etter eksponering til de forhøyede nivåer av glutamat ble talt og beregnet som en prosentandel av normale øyne. Resultatene er vist i Figur 1. RGC overlevelsen i alle behandlede grupper (gruppene 2 -4 ) var signifikant (p < 0,001 t-test) høyere enn den negative kontrollgruppe.

I ytterligere forsøk ble C57B1 mus testet med Cop-1 (100 jig) emulgert i Alum-phos (n=8) eller med Alum-phos alene (n=8) eller PolyYE (100 ug) emulgert i CFA (n=24) eller med adjuvant alene (negativ kontroll) (n=27) (100 ul), 7 dager før intraokuler glutamatinjeksjon. Antallet RGC'er som overlevde 7 dager etter eksponeringen til de forhøyede nivåer av glutamat ble talt. Beskyttelsen ble beregnet som prosentandel RGC som overlevde beregnet på det totale RGC tap i den ikke-behandlede gruppe. Resultatene er vist i Figurene 2A-B. RGC overlevelsen i den Cop-1-behandlede gruppe (Fig. 2A) og den PolyYE-behandlede gruppe (Fig. 2B) var signifikant høyere enn de negative kontrollgrupper som mottok kun adjuvant.

Cop-1 med høye molekylvektstørrelser (midlere MW: 12.600, 15.500 og 22.000 dalton) testes i glutamattoksisitetsmodellen. Effektiviteten ved å fremkalle spesifikk neuroprotektiv respons bestemmes i modellen for akutt glutamattoksisitet i RGC'er som beskrevet ovenfor. C57BL/6 mus (til sammen 5 grupper pr. forsøk, 10 dyr pr. gruppe) immuniseres 14 dager før intraokuler injeksjon av glutamat (200 nmol) og RGC overlevelsen undersøkes 7 dager etter glutamatinjeksjon. Tre doser av Cop-1 av hver molekylvekt testes og sammenlignes med negativ kontroll (kun glutamat) og positiv kontroll (75 ug Cop-1 av MW 7,200 d, 7 dager før glutamattoksisitet).

Eksempel 3. Neuroprotektiv effekt av vaksinasjon med Cop-1 og poly-YE i

glaukommodellen.

Glaukom er en kronisk neurodegenerativ sykdom med progressivt tap av visuelle neuroner som tilslutt fører til blindhet. Øket intraokulert trykk (IOP) anses som hovedrisikofaktor og antas å være primærgrunn til neuronaldød. I henhold til dette er biokjemiske midler eller kirurgi, designet for å redusere IOP, den vanlige standardterapi. Ikke desto mindre er en reduksjon av IOP ikke alltid tilstrekkelig til å stanse neuronalt tap. Videre opptrer optisk nervedegenerering enkelte ganger i fravær av forhøyet IOP, en tilstand som kalles normalspenningsglaukom (som opptrer i omtrent en tredjedel av glaukopasientene). Således anses neuroprotektiv terapi som egnet. Det ble benyttet en modell med kronisk forhøyelse i IOP i rotter for å undersøke evnen hos Cop-1- eller PolyEY vaksinering til å redusere døden for neuroner som befinner seg under kontinuerlige stressbetingelser slik det kan skje hos ALS pasienter. Fordi glaukom er en kronisk neurodegenerativ sykdom på samme måte som ALS, kan neurobeskyttelse som oppnås i glaukommodellen være en indikasjon for en tilsvarende neuroproteksjon i ALS.

Induksjon av høy IOP ble gjennomført som følger: Ved bruk av en Haag-Streit slisslampe som avga blågrønn argon laserstråling ble det høyre øyet av anestetiserte voksne hann Lewis-rotter behandlet ved 80 - 120 applikasjoner rettet mot tre av de fire episklerale vener og mot 270 grader av den limbale pleksus. Laserstrålen ble lagt på med en energi på 1 watt i 0,2 sekunder og ga en punktstørrelse på 100 mm ved de episklerale vener og 50 mm ved den limbale pleksus. Ved en andre lasersesjon en uke senere, ble de samme parametere benyttet, bortsett fra at punktstørrelsen var 100 mm for alle applikasjoner. Bestråling ble rettet mot alle fire episklerale vener og 360 grader av den limbale pleksus 24.

For å måle elevasjonen av IOP ble rottene injisert intraperitonealt med 10 mg/ml acepromazin, et sedativt medikament som ikke reduserer IOP, og 5 minutter senere ble trykket i begge øyne målt ved bruk av Tono-Pen XL tonometer (Automated Ophthalmics, Ellicott City, MD, USA) etter applikering av localin på kornea. Gjennomsnitt av 10 målinger tatt fra hvert øye, ble beregnet. En uke etter den første laserbehandling nådde IOP nivået rundt 30 mmHg uten noen signifikant endring inntil slutten av forsøk (3 uker etter den første laserbehandling) som vist i Tabell 3 nedenfor.

For å bestemme RGC overlevelsen ble det hydrofile neurotracer fargestoffet dekstran tetrameylrhodamin (Rhodamine Dextran) (Molecular Probes, Oregon, USA) applikert e uker etter den første laserbehandling direkte i den intraorbitale del av den optiske nerve. Kun aksoner som overlever det høye IOP og forblir funksjonelt, og hvis cellelegemer fremdeles er i live, kan ta opp fargestoff og derved påvise merkede RGC'er. Rottene ble avlivet 24 timer senere og retina ble skåret ut, montert hele og merket RGC'er tellet under en forstørrelse på 800 i et Zeiss fluorescens mikroskop. Fra hver retina ble fire felt talt, alle med samme diameter (0,076 mm<2>) og i samme avstand fra den optiske skive. RGC'ene ble talt av en observatør som var skjermet mot retinaenes identitet.

Sa. Effekt av PolyEY vaksinering på RGC overlevelse i glaukom IOP modellen.

SPD rotter ble immunisert med PolyEY (500 ug) emulgert med CFA en time etter den første laserbehandling (n=9). En kontrollgruppe ble immunisert med CFA uten antigenet (n=7) og den andre kontrollgruppe ble injisert med kun PBS (n=5). Som vist i figur 3A og selv om IOP forble forhøyet under forsøksperioden viste PolyEY-, men ikke PBS-immuniserte rotter, en signifikant øket overlevelse av deres RGC'er sammenlignet med ikke-immuniserte rotter. Beskyttelse av RGC ble beregnet som prosentandel av celler som overlevde i de behandlede grupper beregnet på det totale celletap i de ikke-immuniserte grupper.

Sb. Effekt av Cop- 1 vaksinasjon på RGC overlevelse i glaukom IOP modellen

Ved bruken av rottemodellen med IOP-forhøyelse ble Cop-1 påvist å redusere neuronalt tap ved administrering (500 (ag i CFA) ved starten av IOP-forhøyelsen eller en uke senere (Se figur 3B) på tross av det faktum at IOP forble høy og nervedegenereringen allerede hadde startet. I tillegg resulterte Cop-1 vaksinering, sammen med det IOP-reduserende medikament brimonodin, i en større RGC-beskyttelse enn bruk av kun brimonodin (se figur 3B, innskutt).

Eksempel 4. Cop-1 immunisering beskytter mot nervedegenerering i transgeniske

mutante SODI mus (ALS mus)

For å teste hvorvidt Cop-1 immunisering kan beskytte mot progresjonen av motorneurondegenerering, ble ALS mus SODI (n=3) immunisert med Cop-1 i Alum-phos når de var 75 dager gamle og en boost ble administrert en uke senere. Deretter ble de immunisert hver 30 dag. En kontrollgruppe (n=3) av ALS mus ble ikke immunisert med Cop-1. Musene ble så testet flere ganger pr. uke på muskelstyrke ved blindtesting av hengetiden på en roterende, vertikal stav. Hvert forsøk varte 5 minutter.

Utviklingen av muskelsvekkelsen i musene er angitt i figurene 4A-B. Fig. 4A viser den midlere hengetid for hvert dyr pr. uke (resultatene er i gjennomsnitt ± SEM). Som vist, oppviste to av de Cop-1-immuniserte dyr (musene 1 og 4) lengre hengetider enn den andre ikke-immuniserte mus.

Starten av reduksjonen av muskelstyrken varierer blant de individuelle mus. For å bedømme effekten av vaksinasjonen og graden av reduksjon hos hver mus, ble muskelstyrken på ethvert gitt tidspunkt sammenlignet med det som ble funnet 1 uke før reduksjonen begynte.

Figur 4B viser det synkroniserte plott for muskelstyrkereduksjon i individuelle, transgeniske mus. Det er klart at mus som er immunisert med Cop-1 (sorte søyler) viste en signifikant lavere grad av muskelstyrkereduksjon, uansett deres styrke på immuniseringSAagen. Således bibeholdt de motorkraft i et lengre tidsrom sammenlignet med ikke-immuniserte dyr.

Den fordelaktige effekt for Cop-1 immunisering er også reflektert i musekroppsvekten. Som vist i fig. 5, viste Cop-1 immuniserte dyr, etter hvert som sykdommen skred frem, og som et langsommere kroppsvekttap. Mellom en alder av 86 og 111 dager mistet alle ikke-immuniserte, transgeniske mus 2 gram krommsvekt. I motsetning til dette hadde en mus i den Cop-1 immuniserte gruppe ingen endring og to mus la 2 gram til sin kroppsvekt.

Immunisering med Cop-1 påvirket også mortalitetsgraden til de transgeniske mus. Etter hvert som sykdommen skred frem, ble musene paralysert og døde. Immunisering med Cop-1 forlenget signifikant levetiden for de transgeniske mus mens de ikke-behandlede mus døde 2, 3 og 4 uker etter starten av sykdommen, en Cop-1 immunisert mus overlevde i 4 uker og de andre to i 7 uker etter sykdommens start (Tabell 4). På dødstidspunktet var de Cop-1 immuniserte, transgeniske mus 3 uker eldre i gjennomsnitt enn de ikke-immuniserte dyr.

Eksempel 5. Cop-1 behandling øker levetidsforventningene for ALS-mus

14 ALS-mus med alder 60 dager ble vaksinert med Cop-1 (75 ug) emulgert i CFA (Difco Laboratories, Heidelberg, Tyskland) inneholdende 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis. Emulsjonen (totalvolum 200 ul) ble injisert inn i bakfotputen og musene ble deretter behandlet daglig med oral Cop-1 (12,5 mg/kg/dag) gitt i drikkevann. Mus som ble immunisert i en alder av 60 dager med Cop-1 og ikke-behandlede kontrollmus ble observert daglig og veid ukentlig. Deres motoraktivitet og mortalitet ble overvåket. Alderen ved symptomstart ble bestemt som alderen (i dager) på tidspunktet for den første opptreden av skjelven og/eller rysting av lemmene, eller henging (heller enn sprelling) av baklemmene når musene ble holdt hengende i halen. Tapet av refleksene ble tatt som en indikasjon på sluttrinnet av sykdommen. Paralyse forårsakes av det progressive tap av motorneuroner fra ryggmargen. Som vist i figur 6, ble ikke-vaksinerte kontroller (n = 14) paralysert i en eller flere lemmer og døde ved en alder av 211 ± 7 dager (gjennomsnitt ± SA). Cop-1 behandlede mus overlevde i 263 ± 8 dager. Således økte vaksinasjonen med Cop-1 livsforventningene for ALS-mus dramatisk (figur 6).

Som en positiv kontroll ble 15 ALS-mus gitt en daglig dose (30 mg/kg) på Riluzole, det eneste medikament som i dag gis til ALS-pasienter. Som vist i fig. 7, viste de Riluzole-behandlede mus en økning på 9% i overlevelse i forhold til kontrollen, mens de Cop-1 behandlede mus viste en økning på 25% i forhold til kontrollen.

I tillegg til økningen på rundt 25% i levetid, ble sykdomsstart (fastslått ved motorytelse) forsinket, noe som antyder at fordelene også ble uttrykt i livskvalitet, både ved de prekliniske og kliniske trinn (fig. 8). Musene ble tillatt å gripe og å holde en vertikal tråd med diameter 2 mm med en liten løkke i den nedre ende. Normale verdier for hver mus ble oppnådd ved å bedømme den nattlige motoraktivitet (fra 20:00 til 08:00) i aldersperioden 40 og 60 dager, ved bruk av rotarod-apparaturen (LMTB, Berlin). Aktiviteten ble notert individuelt ved et datamaskinsystem og bedømt daglig. For statistisk bedømmelse blir rotarodaktiviteten normalisert til den midlere aktivitet for hver mus fra dag 40 til dag 60. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnitt (SEM). Rotarod-testingen og vekten ble sammenlignet ved variansanalyse (ANOVA). Statistisk signifikans ble testet ved enveis ANOVA etter en post-hoc Student-Neuman-Keuls prosedyre med SPSS-PC programmet (SPSS, Chicago, IL). Signifikante differanser mellom Cop-1-behandlede og ikke-behandlede mus ble observert ved de følgende tidsrom: mellom dag 12 og 20 (P <.058), mellom dag 21 og 24 (P < .0079) og mellom dag 25 og 28 (P <.0017).

Eksempel 6. Behandling av ALS-mus med Cop-1 uten adjuvant

ALS-mus (15 dyr pr. gruppe) ble delt i 11 forsøksgrupper:

1. Ikke-behandlede mus - negativ kontrollgruppe.

2. Riluzole-behandlede mus - 30 mg/kg/dag

3. Mus immunisert med Cop-l/CFA - 75 ug primærvaksinasjon fulgt av daglig oral administrering av Cop-1 (12,5 mg/kg - positiv kontrollgruppe. 4. Mus immunisert med to injeksjoner av 75 ug Cop-1: den første på dag 45 og den andre på dag 59. 5. Mus immunisert som i gruppe 4 fulgt av en enkel injeksjon av 100 ug Cop-1 på dag 87. 6. Mus immunisert med to injeksjoner av 150 ug Cop-1: de første på dag 45 og den andre på dag 59. 7. Mus immunisert med to injeksjoner av 75 ug Cop-1: de første på dag 83 og den andre på dag 97.

8. Den samme som gruppe 4 med Riluzole 30 mg/kg/dag.

9. Den samme som gruppe 5, med Riluzole 30 mg/kg/dag.

10. Den samme som gruppe 6, med Riluzole 30 mg/kg/dag.

11. Den samme som gruppe 7, med Riluzole 30 mg/kg/dag.

Motoraktiviteten og kroppsvekten for musene overvåkes en gang i uken med start to uker før påbegynnelsen av behandlingen. Sluttrinnskriteriet for avlivning av dyrene defineres ved deres manglende evne til å rette seg opp selv innen 30 sekunder når de anbringes på siden på en flate overflate. Avgjørelsen tas av en uavhengig veterinær slik det kreves i dyreprotokollen.

Eksempel 7. Cop-1 administrering beskytter mot motorneurondegenerering etter

facialnerveaksotomi

Transeksjon av facialnerven hos voksne mus er kjent for å forårsake en lett synlig sen degenerering av 20 til 35% av de aksotomiserte motorneuroner. Derfor gir aksotomi av facialnerven en modell for ALS som er en sykdom som karakteriseres ved progressivt motoneurontap. Effekten av immuniseringen på overlevelsen og funksjonen hos neuronene i facialnerveaksotomimodellen er indikerende for potensiale av behandlingen ved å redusere neuronaltapet hos ALS-pasienter. 34 voksne hunmus (12 uker gamle, 20 - 25 g) av stammen C57BL/6J01aHsd stammen (Harlan Winkelmann, Borchen, Tyskland) deltok i dette forsøket. Kontrolldyrene ble underkastet unilateral facialnerveaksotomi og forble enten ubehandlet eller ble injisert med PBS emulgert i CFA. Mus i forsøksgruppen (n = 10) ble immunisert med Cop-1 (til sammen 100 jig) eller gitt PBS (n = 9), begge emulgert i CFA , og ble 7 dager senere underkastet den faciale nerveoksotomi. Mus i en tredje gruppe (n = 8) ble aksotomisert uten forutgående immunisering og mus i en fjerde gruppe (n = 7) ble latt intakt. 7 dager senere ble en facial-facial anastamose (FFA) opprettet i anestetiserte mus (100 mg Ketanest<®>pluss 5 mg Rompun<®>pr. kg kroppsvekt) ved mikrokirurgisk rekonneksjon av den proksimale stump til den distale stump med to 11-0 epineurale suturer (Ethicon EH 7438 G, Norderstedt, Tyskland). Såret ble lukket med tre 4 -0 hudsuturer. For å bedømme helbredelse ble facial motorneuronene som matet whiskerputemusklene, merket retrogradert ved injeksjon av 30 ul av 1% vandig oppløsning av fluorescent retrograd tracer FluoroGold pluss 2% dimetylsulfoksid (DMSO), injisert i musklene av hver whiskerpute. 7 dager senere ble musene re-anestetisert og perfusert transkardialt med 0,9% NaCl fulgt av fiksering med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer pH 7,4 i 20 min. Hjernen ble fjernet og 50 um tykke koronalavsnitt ble skåret gjennom hjernestammen med en vibratom. Snittene ble observert med et Zeiss Axioskop 50 epifluorescens mikroskop gjennom et skreddersydd HQ-smalbåndfilter satt for FluoroGold (AHF Analysetechnik, Tiibingen, Tyskland). 8 uker etter aksotomi, som vist i Fig. 9A-D og Tabell 5, var det gjennomsnittlige antall av FluoroGold-merkede motorneuroner i musene som var vaksinert med Cop-1 signifikant større enn antallet oppnådd i gruppen injisert med PBS i CFA eller den ikke-behandlede kontrollgruppen (P < .05). Behandling med Cop-1 hadde ingen effekt på antall motorneuroner i den ikke-lesjonerte facialnukleus. Kontrollimmunisering med PBS i CFA hadde ingen beskyttende effekt.

Retrograd neuronalmerking etter injeksjon av FlouroGold inn i whiskerputen viste ingen differanser i lokaliseringen eller mengden av motorneuroner i den intakte facialnukleus mellom mus immunisert med Cop-1 i CFA (fig. 9A) og mus som var injisert med PBS i CFA (Fig. 9C). Tvert imot inneholdt den lesjonerte faciale nukleus, etter forbehandling av mus med Cop-1 i CFA (Fig. 9B), signifikant flere merkede mononeuroner enn antallet i den lesjonerte facialnukleus i kontrolldyr som var for-behandlet med PBS i CFA (Fig. 9D). Data er vist som gjennomsnitt ± standard avvik (SA). Forskjellene mellom de forskjellige forsøksgrupper ble detektert ved å anvende en enveis analyse av varians (ANOVA) og en post-hoc t test for ikke-parrede data med Bonferroni-Holm korreksjon. P-verdier på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Eksempel 8. Cop-1 administrering bevarer motorneuronaktivitet etter akutt

aksotomi

For å bestemme hvorvidt det større antall av motorneuroner som finnes i Cop-1 behandlede, aksotomiserte mus enn i kontrollene, var assosiert med funksjonell forbedring, ble "whisking" oppførselen analysert biometrisk. Basislinjeparametere for whisking-oppførselen ble dokumentert i intakte kontrollmus. Under normale, fysiologiske betingelser, er den mystatiske vibrissaen opprettet med anteriørørientering. Deres samtidige sveip, kjent som "whisking" eller "sniffing" inntrer 5 til 11 ganger pr. sekund. Nøkkelbevegelsen for denne motoraktivitet er protraksjonen og retraksjonen av de vibrissale hår ved hjelp av piloerektormusklene som er innervert av buccalgrenen av facialnerven. Når facialnerven transekteres, krever birissae en kaudal orientering og forblir bevegelsesløs.

Ved bruk av denne modell ble de følgende parametere bedømt: (i) protraksjon (fremover bevegelse av vibrissae), målt ved den rostralt åpne vinkel mellom midtsagittalplanet og hårskaftet (store protraksjoner representeres ved småvinkelverdier); (ii) whiskingfrekvens, representert ved sykler av protraksjon og retraksjon (passiv tilbakebevegelse) pr. sekund; (iii) amplitude, differansen i grader mellom maksimal retraksjon og maksimal protraksjon; (iv) angulær hastighet under protraksjonen i grader pr. sekund; og (v) angulær akselerasjon under protraksjon, i grader pr. sekund.

Mus underkastet facialnerveaksotomi og Cop-1 vaksinasjon viste signifikant bedre whiskingaktivitet enn de andre grupper av mus. Dette ble best påvist ved amplituden, vinkelhastigheten under protraksjon og vinkelakselerasjonen under protraksjon (Tabell 6).

Numeriske verdier av resultatene som vist i Fig. 9. Antall (gjennomsnitt ± SA) av facial perikarya merket retrogradert ved injeksjon av 1% FluoroGold (30 ul) i intakte mus (gruppe A) og i mus som fikk kun FFA (gruppe B), FFA etter injeksjon av PBS i CFA (gruppe C) og FFA etter vaksinasjon med Cop-1 i CFA (gruppe D). Superskriptbokstavene antyder gruppen med signifikant forskjellige verdier (<*>P < .05). For billedanalyse ble et CCD videokamerasystem (Optronics Engineering Modell DEI-470, Goleta, CA) kombinert med billedanalyseprogrammet Optimas 6.5 (Optimas, Bothell, WA) benyttet for manuelt å telle de retrogrademerkede facialmotorneuroner på skjermen (42). Ved å benytte fraksjonatorprinsippet (43), ble alle retrogradmerkede motorneuroner med synlige cellekjerner talt i hvert sekundsnitt av det 50 um tykke snitt gjennom facialnukleus både på den opererte og den ikke-opererte side. Tellingen ble foretatt av to observatører som var skjermet mot den behandling rottene fikk.

REFERANSER

Brown R.H. (1995) "Amyotrophic lateral sclerosis: recent insights from genetics and transgenic mice" Cell 80: 687-692.

Bruijn L.I., Cleveland D.W. (1996) "Mechanisms of selective motor neuron death in ALS: insights from transgenic mouse models of motor neuron disease" Neuropathol Appl Neurobiol 22: 373-387

Chou S.M. (1992) "Pathology-light microscopy of amyotropic lateral sclerosis". In: Handbook of Amyotrophic Lateral Sclerosis (Smith R.A., ed.), s. 133-181. New York: Marcel Dekker

Fridkis-Hareli et al. (1999) "Binding motifs of copolymer 1 to multiple sclerosis- and rheumatoid arthritis-associated HLA-DR molecules" JImmunol. 162(8): 4697-4704

Fridkis-Hareli et al. (2002) "Novel synthetic amino acid copolymers that inhibit autoantigen-specific T cell responses and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis" J Clin Invest 109(12): 1635-1643

Gurney M.E. et al. (1994) "Motor neuron degeneration in mice that express a human CuiZn superoxide dismutase" Science 264: 1772-1775

Hadano et al. (2001) "A gene encoding a putative GTPase regulator is mutated in familial amyotrophic lateral sclerosis 2" Nature Genetics 29: 166-73

Hauben et al. (2000) "Autoimmune T cells as potential neuroprotective therapy for spinal cord injury" Lancet 355: 286-287

Hirano A. (1991) "Cytopathology of amyotrophic lateral sclerosis" Adv Neurol 56:91-101

Johnson et al. (1995) "Copolymer 1 reduces relapse rate and improves disability in relapsing-remitting multiple sclerosis: results of a phase in multicenter, double-blind placebo-controlled trial. The Copolymer 1 Multiple Sclerosis Study Group", Neurology 1:65

Julien J.P. (2001) "Amyotrophic lateral sclerosis: unfolding the toxicity of the misfolded", Cell 104: 581-591

Kipnis et al. (2001) "Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response". JNeurosci. 21(13): 4564-71

Kong, J. and Xu, Z. (1998) "Massive mitochondrial degeneration in motor neurons triggers the onset of amyotrophic lateral sclerosis in mice expressing a mutant SODI" J.

Neuroscience 18: 3241-3250

Moalem G. et al. (1999) "Autoimmune T Cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy", Nature Medicine 5: 49-55

Mulder D.W. et al. (1986) "Familial adult motor neuron disease: amyotrophic lateral sclerosis" Neurology 36: 511-517

Munsat T.L. et al. (1989) "Adult motor neuron disease". In: Merritt's Textbook of Neurology (Rowland L.P., ed.), pp 682-687. Philadelphia: Lea & Febiger

Pitt et al. (2000) "Glutamate excitotoxicity in a modell for multiple sclerosis" Nature Medicine 6: 67-70

Ripps M.E. et al. (1995) "Transgenic mice experssing an altered murine superoxide dismutase gene provide an animal modell of amyotrophic lateral sclerosis" Proe Nati Acad Sei, USA 92: 689-693

Rosen D.R. et al. (1993) "Mutations in CuiZn superoxide dismutaso gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis" Nature 362: 59-62

Rothstein J.D., et al. (1992) "Decreased glutamate transporter by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis". N.Eng. J. Med; 326: 1464-68

Turner et al. (2001) "Clinical trials in ALS: An overview. Seminars in Neurology" 21: 167-175

Yang et al. (2001) "The gene encoding alsin, a protein with three guanine-nucleotide exchange factor domains, is mutated in a form of recessive amyotrophic lateral sclerosis", Nature Genetics 29: 160-165.

Claims (8)

1. Anvendelse av Cop-1 for fremstilling av en vaksine til behandling av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) pasienter ved å redusere sykdomsprogresjon og/eller beskyttemot motornervedegenerering og/eller beskytte mot glutamattoksisitet.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der vaksinen omfatter det aktive middel uten noen adjuvant.

3. Anvendelse ifølge krav 1, der vaksinen omfatter det aktive middel emulgert i en adjuvant egnet for humanklinisk bruk.

4. Anvendelse ifølge krav 3, der adjuvanten er valgt fra gruppen bestående av aluminiumhydroksid, aluminiumhydroksidgel og aluminiumhydroksyfosfat.

5. Anvendelse ifølge krav 4, der adjuvanten er amorft aluminiumhydroksyfosfat med et surt isoelektrisk punkt og et A1:P forhold på 1:1.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, der vaksinen er for administrering minst en gang pr. måned.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, der vaksinen er for administrering minst hver annen til tredje måned.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, der vaksinen er for administrering sammen med et annet medikament for behandling av MND, for eksempel Riluzole.