PL205469B1

PL205469B1 - Zastosowanie Cop 1

Info

Publication number: PL205469B1
Application number: PL370070A
Authority: PL
Inventors: Michal Eisenbach-Schwartz; Esther Yoles
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2002-12-05
Publication date: 2010-04-30
Also published as: IS2670B; SI1429800T1; WO2003047500A2; MXPA04005537A; DK1429800T3; US20050220802A1; ES2322566T3; EP1429800A2; AU2002353486B2; CN1617736A; NO20042833L; ATE422362T1; NO336231B1; CA2469092C; IS7296A; RU2303996C2; HU228207B1; NZ533356A; CN102151330B; RU2004120536A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie Cop 1 do wytwarzania szczepionki do leczenia stwardnienia zanikowego bocznego (ALS).

Zakres i tło wynalazku

Nazwa choroba neuronów motorycznych (MND) odnosi się do grupy pokrewnych chorób obejmujących neurony motoryczne w mózgu (wyższe neurony motoryczne) oraz w rdzeniu kręgowym (niższe neurony motoryczne). Neurony motoryczne (lub neurony ruchowe lub motoneurony) są komórkami nerwowymi, wzdłuż których mózg wysyła instrukcje do mięśni, w formie impulsów elektrycznych. Degeneracja neuronów motorycznych prowadzi do osłabienia i utraty mięśni. Dotyczy to głównie nóg i rąk, a niektóre grupy mięśni są dotknięte bardziej niż inne.

Istnieje szereg klasyfikacji MND. W większości przypadków MND dochodzi do degeneracji wyższych i niższych neuronów motorycznych. Schorzenie to zwane jest stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS), jak również chorobą Lou Gehriga i objawia się słabością mięśni, sztywnieniem oraz drganiami pęczkowymi mięśni (drżenia mięśni). Istnieją również mniej znane formy, w których zachodzi bardziej selektywna degeneracja wyższych neuronów motorycznych (pierwotne stwardnienie boczne, PLS) lub niższych neuronów motorycznych (postępujący zanik mięśni, PMA). Postępujące porażenie opuszkowe (PBP lub postać opuszkowa) jest postacią ALS rozpoczynającą się od trudności w przełykaniu, przeżuwaniu oraz mówieniu i dotyka około 25% pacjentów z ALS.

Istnieje znaczące podobieństwo postaci MND. U osób z PMA z czasem rozwijają się postaci obejmujące wyższe neurony motoryczne, zaś u niektórych z PMA i ALS występują trudności w mówieniu i przełykaniu o zróżnicowanym stopniu (postać opuszkowa ALS lub PMA).

ALS jest przewlekłą, postępującą chorobą neurodegeneracyjną objawiającą się stopniową degeneracją komórek nerwowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN) kontrolujących dowolne ruchy mięśni. Postępująca utrata neuronów motorycznych prowadzi do stopniowej atrofii mięśni szkieletowych i nieuniknionej śmierci, zazwyczaj w przeciągu 2-3 do 10 lat od wystąpienia choroby. Słabość mięśni, atrofia i objawy dysfunkcji rogów przednich rdzenia kręgowego są zazwyczaj zauważane w rękach i znacznie rzadziej w stopach. Miejsce początkowe jest przypadkowe, zaś progresja jest asymetryczna. Tylko w USA 30000 ludzi obecnie ma ALS, zaś około 8000 nowych przypadków jest diagnozowanych co roku. ALS pojawia się w postaci sporadycznej (SALS) i postaci rodzinnej (FALS) (Mulder i wsp., 1986; Munsat, 1989). Pierwotne czynniki ryzyka są w większości nieznane, jednak 5 do 10% wszystkich pacjentów z ALS to postaci rodzinne (FALS). W oko ł o 20% wszystkich postaci rodzinnych stwierdzono występowanie mutacji w genie kodującym dysmutazę ponadtlenkową Cu/Zn typu 1 na chromosomie 21 (Rosen i wsp., 1993; Brown, 1995). SOD stanowi enzym katalizujący konwersję anionów nadtlenkowych do nadtlenku wodoru, dzięki czemu SOD może chronić komórki przed szkodliwym działaniem tych toksycznych rodników. Wydaje się, że toksyczność różnych mutantów SOD nie wynika ze zmniejszonej aktywności wychwytywania wolnych rodników, ponieważ nie stwierdzono korelacji pomiędzy aktywnością enzymatyczną, okresem półtrwania polipeptydu i odpornością na proteolizę a wiekiem lub szybkością progresji choroby u ludzi (patrz praca przeglądowa Julien, 2001). U myszy transgenicznych z ekspresją różnych mutantów SOD1 dochodziło do rozwoju choroby neuronów motorycznych, przez co stały się one akceptowalnym zwierzęcym modelem badania ALS i innych terapii neuronów motorycznych.

Ostatnio, dwie niezależne grupy naukowców zidentyfikowały nowy gen ALS (Hadano i wsp., 2001; Yang i wsp., 2001). Nowy gen, zwany ALS2, jest zlokalizowany na chromosomie 2 i koduje białko zwane alsyną. Nowy gen ALS2 jest zmutowany zarówno u ludzi z młodzieńczym zanikowym stwardnieniem bocznym (JALS), zwanym również ALS2, jak i u ludzi z pierwotnym stwardnieniem bocznym (JPLS). Mutacje w różnych regionach chromosomu są związane z różnymi chorobami neuronów motorycznych. W sposób specyficzny, mutacja w jednym regionie jest stwierdzana u ludzi z ALS, podczas gdy mutacje w dwóch innych regionach są stwierdzane u ludzi z JPLS. W przyszłości, myszy transgeniczne niosące te mutacje będą na pewno stanowić kolejny model do testowania terapii ALS.

Przez ostatnie dziesięć lat przeprowadzono szereg badań poświęconych zrozumieniu etiologii, prognostyki i progresji choroby. Nie osiągnięto zgodności z wyjątkiem uznania, że stanowi ona chorobę wieloczynnikową pod względem warunków prowadzących do progresji choroby, podczas gdy etiologia pozostaje niejasna.

PL 205 469 B1

W chwili obecnej wiadomo, ż e wiele czynników sprzyjają cych progresji choroby ALS jest stwierdzanych w wielu innych przewlekłych i ostrych chorobach neurodegeneracyjnych. Czynniki te obejmują stres oksydacyjny, ekscytotoksyczność, pozbawienie wsparcia troficznego oraz zaburzenia równowagi jonowej. Przez lata prowadzono próby powstrzymania progresji ALS, podobnie jak w innych przewlekłych i ostrych chorobach neurodegeneracyjnych, poprzez zablokowanie różnych mediatorów cytotoksyczności. Większość z tych prób klinicznych zakończyło się wynikami negatywnymi (Turner i wsp., 2001).

Cechą charakterystyczną stresu oksydacyjnego jest akumulacja wolnych rodników, co może prowadzić do śmierci neuronów motorycznych. Wolne rodniki uszkadzają składniki błon komórkowych, białka lub materiał genetyczny poprzez ich „utlenianie. Wolne rodniki mogą powstawać przy zaburzonym funkcjonowaniu SOD, zarówno z powodu mutacji genetycznych występujących u niektórych pacjentów z rodzinną postacią ALS, jak i z powodu środowiska chemicznego komórek nerwowych, bądź mogą być wytworzone w wyniku ekscytotoksyczności glutaminianu, bądź z innych powodów. Wielu pacjentów z ALS przyjmuje koenzym Q10 i witaminę E w celu neutralizacji wolnych rodników.

Glutaminian jest jednym z najbardziej znanych mediatorów toksyczności w ostrych i przewlekłych chorobach neurodegeneracyjnych (Pitt i wsp., 2000), takich jak stan padaczkowy, niedokrwienie mózgu, urazowe uszkodzenie mózgu, ALS, choroba Huntingtona, spastyczna parapereza (lathyrism) oraz choroba Alzheimera. Glutaminian jest pierwszorzędowym neuroprzekaźnikiem pobudzającym w ludzkim OUN. L-glutaminian jest obecny w większości synaps i jest zdolny do przejawiania dwojakiej aktywności: odgrywa znaczącą rolę w normalnym funkcjonowaniu jako podstawowy neuroprzekaźnik, jednak staje się toksyczny przy przekroczeniu poziomów fizjologicznych.

W przypadku rdzeniowych neuronów motorycznych, szybkie usunięcie glutaminianu po aktywności synaptycznej jest osiągane dzięki transporterowi glutaminianu EAAT2 obecnemu w astrocytach. Spadek aktywności EAAT2 oraz poziomu białka został stwierdzony w tkance mózgowej pacjentów z ALS (Rothstein i wsp., 1992). Mogło to prowadzić do zwiększonego zewnątrzkomórkowego stężenia glutaminianu i śmierci neuronów motorycznych. Klinicznie, korzystny wpływ Riluzolu, inhibitora uwalniania glutaminianu, w przebiegu choroby u ludzi i myszy transgenicznych, doprowadził do dopuszczenia tego leku do terapii ALS. Jednak neutralizowanie wpływu toksycznego wpływa prawdopodobnie na funkcje fizjologiczne glutaminianu jako powszechnego neuroprzekaźnika OUN.

Przez wiele lat rozważano również rolę czynników immunologicznych, komórkowych i molekularnych w ALS. Zastanawiano się nad rolą zapalenia w progresji choroby, podobnie jak w innych chorobach neurodegeneracyjnych oraz sugerowano zastosowanie w ALS leków immunosupresyjnych. U wielu pacjentów zaobserwowano również korelację obecności przeciwciał przeciwko gangliozydom, co doprowadziło niektórych badaczy do sugerowania, że ALS jest chorobą autoimmunologiczną. Nie dostarczono jednak żadnych dowodów potwierdzających tę hipotezę.

W laboratorium twórców niniejszego wynalazku zaobserwowano ostatnio, że w warunkach neurodegeneracyjnych spowodowanych uszkodzeniami mechanicznymi (aksotomia) lub biochemicznymi (glutaminian, stres oksydacyjny) układ immunologiczny odgrywa rolę krytyczną. Stwierdzono, że aktywowane komórki T rozpoznające antygen układu nerwowego (UN) sprzyjają regeneracji nerwów lub sprzyjają neuroprotekcji - odesłanie do publikacji PCT nr WO 99/60021, którego całość jest niniejszym włączona poprzez odniesienie. Dokładniej, wykazano, że komórki T reaktywne w stosunku do MBP są neuroprotekcyjne w szczurzych modelach częściowo zniszczonego nerwu wzrokowego (Moalem i wsp., 1999) oraz uszkodzenia rdzenia kręgowego (Hauben i wsp., 2000). Do niedawna uważ ano, ż e układ immunologiczny eliminuje komórki układu immunologicznego z uczestniczenia w naprawie neuronów. Zaskakującym było stwierdzenie, że specyficznie UN-aktywowane komórki T mogą być stosowane do sprzyjania regeneracji nerwów lub do ochrony tkanki układu nerwowego przed wtórną degeneracją, która może wystąpić po uszkodzeniu spowodowanym urazem lub chorobą OUN lub obwodowego układu nerwowego (PUN).

Twórcy niniejszego wynalazku zaobserwowali ponadto, że warunki stresowe w OUN sprzyjają adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej celem walki ze stresem oraz że odpowiedź ta jest genetycznie kontrolowana. Tym samym, wykazano, że stopień przeżycia komórek zwojów siatkówki u dorosłych myszy lub szczurów po uszkodzeniu nerwu wzrokowego lub wstrzyknięciu do ciała szklistego toksycznej dawki glutaminianu, jest dwukrotnie większy w szczepach odpornych na choroby autoimmunologiczne OUN niż w szczepach podatnych. Stwierdzono, że różnicę tę można przypisać korzystnej odpowiedzi immunologicznej komórek T spontanicznie indukowanej urazem OUN u odpornych, lecz nie u podatnych szczepów. Tym samym, stopień przeżycia neuronów w wyniku tego rodzaju

PL 205 469 B1 uszkodzenia jest wyższy, jeśli wzbudzona zostanie auto-reaktywna odpowiedź komórek T, pod warunkiem że jest dobrze regulowana. Innymi słowy wykazano, że ochronna odpowiedź autoimmunologiczna jest wzbudzana celem ochrony zwierzęcia przed konsekwencjami uszkodzenia. W dalszej kolejności zaobserwowano, że u zwierząt z zaburzoną zdolnością do regulowania tego rodzaju odpowiedzi, lub u zwierząt pozbawionych dojrzałych komórek T (w wyniku tymektomii przy urodzeniu), zdolność do znoszenia warunków stresowych jest zredukowana. W konsekwencji, stopień przeżycia neuronów po uszkodzeniu OUN u tych zwierząt jest znacząco niższy niż u zwierząt obdarzonych skutecznymi mechanizmami wzbudzenia ochronnej odpowiedzi autoimmunologicznej zależnej od limfocytów T (Kipnis i wsp., 2001).

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że szczepienie nie-patogennymi syntetycznymi kopolimerami przypominającymi własne białka, takimi jak Kopolimer 1 (Cop 1 lub Glatiramer), losowy kopolimer złożony z czterech aminokwasów: tyrozyny-glutaminianu-alaniny-lizyny (nazywany Cop 1) oraz poli-Glu,Tyr (nazywany PolyYE) oraz aktywacja przez nie komórek T po urazowym uszkodzeniu OUN może być zastosowana do wzbudzenia ochronnej odpowiedzi autoimmunologicznej i dalszej redukcji uszkodzenia wywołanego urazem a ponadto ochrony komórek OUN przed toksycznością glutaminianu. Odesłanie można tu uczynić do wcześniejszych zgłoszeń patentowych Stanów Zjednoczonych niniejszego Zgłaszającego o num 1, peptydy pokrewne Cop 1 oraz polipeptydy i limfocyty T aktywowane przez nie podczas ochrony OUN przed toksycznością glutaminianu (USSN 09/756,301) oraz do ochrony i hamowania degeneracji neuronów lub sprzyjania regeneracji nerwów w OUN lub PUN (USSN 09/765,644). Dokładniej, we wspomnianych zgłoszeniach pokazano, że w nerwach wzrokowych liczba przeżywających komórek zwojów siatkówki była znacząco wyższa u myszy immunizowanych Cop 1 niż u myszy, którym podawano PBS.

Jedynym lekiem obecnie dopuszczonym i stosowanym w leczeniu ALS jest Riluzol (2-amino-6-(trifluorometoksy)benzotiazol), powszechny bloker uwalniania glutaminianu, który jak się wydaje w przypadku tego stanu wywiera pewne działanie redukujące skurcze, prawdopodobnie poprzez hamowanie glutamatergicznej transmisji w OUN. Jest on podawany doustnie w postaci tabletek. Riluzol nie leczy choroby i nie likwiduje objawów. Wywiera on na pacjentów z ALS wpływ umiarkowany do znaczącego, wydłużając ich życie o około 3 miesiące, ale nie poprawia siły mięśni lub funkcji neurologicznych.

Wysoce pożądanym jest dostarczenie dalszych środków do leczenia chorób neuronów motorycznych, w tym ALS.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie Cop 1 do wytwarzania szczepionki do leczenia stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) u pacjentów poprzez zmniejszanie progresji choroby i/lub ochronę przed degeneracją nerwów ruchowych, i/lub ochronę przed toksycznością glutaminianu.

Korzystnie szczepionka zawiera Cop 1 bez adiuwanta.

Korzystnie szczepionka zawiera Cop 1 w postaci emulsji w adiuwancie odpowiednim do stosowania klinicznego u ludzi.

Korzystniej adiuwant wybrany jest z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, żelu wodorotlenku glinu i hydroksyfosforanu glinu.

Jeszcze korzystniej adiuwant stanowi amorficzny hydroksyfosforan glinu o kwasowym punkcie izoelektrycznym i stosunku A1:P wynoszącym 1:1.

Korzystnie szczepionka przeznaczona jest do podawania co najmniej raz na miesiąc.

Korzystnie szczepionka przeznaczona jest do podawania co najmniej raz na 2-3 miesiące.

Korzystnie szczepionka przeznaczona jest do podawania z innym lekiem do leczenia choroby neuronów ruchowych (MND), takim jak Riluzol.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem immunizacja za pomocą Cop 1 może chronić myszy transgeniczne z nadekspresją ludzkiej SOD 1 oraz myszy po aksotomii nerwu twarzowego, oba stanowiące modele ALS, przed degeneracją neuronów motorycznych. To oraz fakt, że Cop 1 wykazuje skuteczność w ochronie komórek zwojów siatkówki przed toksycznością glutaminianu, wskazuje na użyteczność tych kopolimerów w leczeniu chorób neuronów motorycznych, w tym ALS.

Niniejszy wynalazek odnosi się do zastosowania Cop 1 do wytwarzania szczepionki do leczenia pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) poprzez redukcję postępu choroby, ochronę przed degeneracją neuronów motorycznych i/lub ochronę przed toksycznością glutaminianu.

Czynnik aktywny może być podawany z dodatkiem adiuwanta lub bez niego, lub może być emulgowany w adiuwancie odpowiednim do klinicznego zastosowania u ludzi. Adiuwant odpowiedni do klinicznego zastosowania u ludzi jest wybrany spośród wodorotlenku glinu, żelu wodorotlenku glinu

PL 205 469 B1 lub hydroksyfosforanu glinu. W korzystnym wykonaniu, adiuwant szczepionkowy jest amorficznym hydroksyfosforanem glinu o kwasowym punkcie izoelektrycznym oraz stosunku A1:P wynoszącym 1:1 (tutaj nazywanym Alum-phos).

Ponadto szczepionka może być podawana w schemacie obejmującym podawanie Rizulolu lub innego leku odpowiedniego do leczenia ALS.

Krótki opis figur

Fig. 1 pokazuje, że immunizacja za pomocą Cop 1 lub PolyYE bez adiuwanta chroni komórki zwojów siatkówki myszy (RGC) przed toksycznością glutaminianu.

Fig. 2A-B pokazują, że immunizacja za pomocą Cop 1 (2A) lub PolyYE (2B) w adiuwancie (CFA) chroni komórki zwojów siatkówki myszy (RGC) przed toksycznością glutaminianu.

Fig. 3 A-B pokazują wpływ immunizacji za pomocą PolyYE (Fig.3A) lub Cop 1 (Fig.3B) na przeżycie RGC w modelu jaskry z ciśnieniem wewnątrzgałkowym (IOP).

Fig. 4A-4B pokazują wyniki testów siły mięśni przeprowadzonych z myszami transgenicznymi z nadekspresją ludzkiego mutanta SOD1 (nazywanymi tu dalej myszami ALS). Fig. 4A przedstawia średni czas zwisania (sekundy) na obracającym się pionowym pręcie na tydzień myszy ALS immunizowanych za pomocą Cop 1 emulgowanego w Alum-phos (mysz 1, 2 i 4) oraz nie-immunizowanych myszy transgenicznych (mysz 3, 5 i 6) . Fig. 4B 4A przedstawia średni czas zwisania (% podstawowego) 3 myszy ALS immunizowanych za pomocą Cop 1 w Alum-phos (czarne kolumny) w porównaniu do 3 myszy transgenicznych nieimmunizowanych (kontrola, szare kolumny). W celu porównania szybkości progresji choroby, wszystkie zwierzęta synchronizowano do czasu początku wystąpienia osłabienia mięśni (czas 0), normalizując czas zwisania każdego zwierzęcia do jego linii podstawowej przed rozpoczęciem choroby (linia podstawowa -100%). Figura przedstawia średnią ±SEM czasu zwisania dla każdej grupy w kolejnych tygodniach progresji choroby.

Fig. 5 pokazuje zachowanie masy ciała u myszy ALS immunizowanych za pomocą Cop 1 w Alum-phos (czarne kwadraty) w porównaniu do myszy nieimmunizowanych (szare romby).

Fig. 6 stanowi wykres przedstawiający przewidywany czas życia myszy ALS immunizowanych za pomocą Cop 1 w CFA. Paraliż jest spowodowany postępującą utratą neuronów motorycznych rdzenia kręgowego. Nieimmunizowane kontrole (n = 15) wykazywały paraliż jednej lub więcej kończyn i umierały do wieku 211 ±7 dni (średnia ± SD). Myszy leczone Cop 1 przeżywały przez 263 ± 8 dni.

Fig. 7 przedstawia spodziewany czas życia myszy ALS immunizowanych Cop 1 w CFA oraz myszy ALS podawanych działaniu Riluzolu. Myszy poddawane działaniu Riluzolu i immunizowane za pomocą Cop 1 wykazywały wzrost odpowiednio o 9% i 25% w stosunku do nieszczepionych myszy kontrolnych.

Fig. 8 pokazuje średnią aktywność obracania się mierzoną we wskazanych punktach czasowych u myszy ALS poddawanych i niepoddawanych leczeniu Cop 1. Myszom pozwalano na chwytanie i trzymanie się pionowego pręta (2 mm średnicy) z niewielką pętelką przy dolnym końcu. Aktywność myszy rejestrowano indywidualnie za pomocą systemu komputerowego i poddawano codziennej ocenie. Dla celów oceny statystycznej, aktywność na aparacie Rotarod normalizowano do średniej aktywności każdej myszy od dnia 40 do 60. Dane są przedstawione jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Zaobserwowano znaczące różnice pomiędzy myszami leczonymi i nieleczonymi w nastę pują cych okresach czasowych: pomię dzy dniami 12 i 20 (P < ,058), pomię dzy dniami 21 a 24 (P < ,0079), oraz pomiędzy dniami 25 i 28 (P < ,0017).

Fig. 9A-D pokazują przeżycie neuronów motorycznych dzięki Cop -1 podawanemu myszom po aksotomii nerwu twarzowego. Osiem tygodni po aksotomii liczba neuronów motorycznych znakowanych FluoroGold w pniach mózgów myszy szczepionych za pomocą Cop 1 (Fig. 9D) była znacząco wyższa niż liczba otrzymana w grupie, której wstrzykiwano PBS w CFA (Fig. 9B). Leczenie za pomocą Cop 1 nie miało wpływu na liczbę neuronów motorycznych w nieuszkodzonym jądrze twarzowym (Fig. 9A, 9C). Kontrolne immunizacje za pomocą PBS w CFA nie wywierały wpływu ochronnego.

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza zastosowania Cop 1 do wytwarzania szczepionki do leczenia pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) poprzez redukcję progresji choroby i/lub ochronę przed degeneracją nerwów motorycznych.

W stosowanym tu znaczeniu terminy „neurony motoryczne i „neurony ruchowe, terminy Cop 1 i „Kopolimer I są stosowane zamiennie.

Dla celów niniejszego wynalazku, Cop 1 lub peptyd pokrewny CopK1 lub polipeptyd pokrewny Cop 1 ma obejmować wszelkie peptydy lub polipeptydy, w tym kopolimer losowy, które funkcjonalnie

PL 205 469 B1 reagują krzyżowo z zasadowym białkiem mieliny (MBP) i są zdolne do współzawodniczenia z MBP przy prezentacji antygenów przez białka MHC klasy II.

Kopolimer do zastosowania według niniejszego wynalazku zawiera kombinację alaniny, kwasu glutaminowego, lizyny i tyrozyny, o dodatnim całkowitym ładunku elektrycznym netto oraz masie cząsteczkowej około 2,000 - 40,000 Da, zwłaszcza około 2,000 -13,000 Da, a w szczególności stanowi Kopolimer 1 o średniej masie cząsteczkowej około 4,700 - 13,000 Da. Zalecane zakresy mas cząsteczkowych oraz sposoby wytwarzania zalecanych postaci Cop 1 są opisane w zgłoszeniu patentowym U.S. nr 5,800,808.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zalecanym kopolimerem do zastosowania według wynalazku jest kopolimer 1, niniejszym nazywany Cop 1, zwłaszcza w postaci soli octanowej znanej pod nazwą rodzajową octan glatirameru. Octan glatirameru jest dopuszczony do stosowania w wielu krajach w leczeniu stwardnienia rozsianego (MS) pod nazwą handlową COPAXONE® (znak towarowy Teva Pharmaceuticals Ltd., Petah Tikva, Izrael). Szereg badań klinicznych wykazało, że Cop 1 jest dobrze tolerowany przy jedynie niewielkich skutkach ubocznych, w większości stanowiących umiarkowane reakcje w miejscu iniekcji (Johnson i wsp, 1995).

Jak wcześniej wspomniano, mutacje w genie SOD1 są genetyczną przyczyną rodzinnej postaci ALS (Rosen i wsp., 1993; Brown, 1995). W kilku modelach mysich z ekspresją zmutowanych genów SOD1 dochodzi do degeneracji neuronów motorycznych podobnej do tej występującej u ludzi (Gumey i wsp., 1994; Ripps i wsp., 1995; Kong and Xu, 1998). Początkowa ocena cech charakterystycznych tych linii mysich dowiodła, że nabycie niekorzystnych właściwości przez zmutowane enzymy powodowało degenerację neuronów motorycznych (patrz praca przeglądowa Bruijn i Cleveland, 1996). Dodatkowo, analizy te potwierdziły szereg cech patologicznych obserwowanych u ludzi (Hirano, 1991; Chou, 1992). Zrozumienie tej mutacji, znanej zmianą SOD1 doprowadziło do otrzymania akceptowalnego zwierzęcego modelu (myszy ALS) służącego do testowania rodzinnej postaci ALS. Ponieważ rodzinna postać ALS związana z S0D1 oraz sporadyczna postać ALS (stanowiące 90% wszystkich przypadków ALS) mają podobne objawy i cechy patologiczne, myszy transgeniczne niosące zmutowany gen SOD1 są akceptowalnym modelem zwierzęcym do testowania terapii dla zarówno postaci rodzinnej, jak i sporadycznej ALS oraz modelem stosowanym przez ALS Therapy Development Foundation (ALS-TDF). U myszy ALS rozwija się choroba motoryczna przypominająca ALS. Ta dysfunkcja motoryczna ostatecznie prowadzi do ich śmierci.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykazano, że myszy ALS immunizowane za pomocą szczepionki z Cop 1 emulgowanym w CFA lub adiuwancie odpowiednim do zastosowania u ludzi, są chronione przed degeneracją nerwów motorycznych, pomimo warunków stresu oksydacyjnego stworzonego przez nadekspresję SOD. Tym samym, szczepienie za pomocą „uniwersalnego słabo autoreaktywnego antygenu Cop 1 w CFA przedłużyło życie myszy ALS o 52 dni (średnia ± SD, 263±8 dni, n=14), w porównaniu do nieszczepionych dopasowanych kontroli (211 ±7 dni n=15; P<,0001). Szczepienie znacząco poprawiało aktywność ruchową na etapach klinicznych i przedklinicznych. Dodatkowo, szczepienie za pomocą Cop 1 zapobiegało również ostrej degeneracji neuronów motorycznych po aksotomii nerwu twarzowego: prawie 200% więcej neuronów motorycznych przeżyło u szczepionych myszy niż w u myszy kontrolnych poddanych aksotomii (P<,05). Wyniki te wskazują, że koncepcja ochronnej autoimmunizacji może również objąć choroby neuronów motorycznych, co ma potencjalnie dramatyczne konsekwencje kliniczne.

Adiuwanty stosowane do immunizacji zgodnie z wynalazkiem obejmują adiuwanty oparte na glinie. Częściej stosowane w szczepionkach zawierających antygeny otrzymane z wirusów, takie jak antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B lub polisacharyd otoczkowy Haemophilus influenza typu 10, są po raz pierwszy stosowane razem z syntetycznymi kopolimerami, w szczególności z Cop 1.

Odpowiednie do podawania dawkowanie Cop 1 będzie wyznaczane przez lekarza zgodnie z wiekiem pacjenta oraz etapem choroby i może być wybrane z zakresu 10-80 mg, choć inne odpowiednie dawkowania również mogą być zastosowane. Podawanie może mieć miejsce raz w miesiącu lub co najmniej raz na 2-3 miesiące, lub rzadziej lub ale można zastosować inny odpowiedni odstęp pomiędzy immunizacjami w zależności od stanu pacjenta.

Szczepionka tu opisana może być podawana jakimkolwiek odpowiednim sposobem podawania, w tym doustnie, domięśniowo, podskórnie lub ś ródskórnie, z dodatkiem adiuwanta lub bez niego.

Przy jednoczesnym podawaniu Riluzolu lub jakiegokolwiek innego leku do leczenia MND, w szczególności ALS, dodatkowy lek podaje się w tym samym dniu co szczepienie lub dzień po,

PL 205 469 B1 zgodnie z instrukcjami producenta, bez związku ze schematem szczepień. Przykładowo, dzienna dawka Riluzolu wynosi 100 mg.

Następujące przykłady ilustrują niektóre cechy niniejszego wynalazku, lecz nie ograniczają jego zakresu.

P r z y k ł a d y

Materiały i metody

Zwierzęta. Myszy szczepu C57BL/6J w wieku 8-13 tygodni, pochodziły z Animal Breeding Center of The Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israel). Przed ich zastosowaniem w doświadczeniach, myszy znieczulano za pomocą dootrzewnowego podania 80 mg/kg ketaminy i 16 mg/kg ksylazyny. Myszy transgeniczne z nadekspresją defektywnego allelu ludzkiego genu SOD1 z Gly93 >Ala (G93A) (B6SJL-TgN (SOD1-G93A)1Gur (myszy ALS) zakupiono w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Wszystkie zwierzęta traktowano zgodnie z regulacjami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Materiały. Cop 1 (średnia MW: 7,200 daltonów) pochodził z Teva Pharmaceuticals Ltd. (Petah Tikva, Israel). Żel hydroksyfosforanu glinu (adiuwant REHYDRAPHOS™, zwany Alum-phos) zakupiono w Reheis (NJ, USA). Kompletny adiuwant Freunda zawierający 0,5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (CFA) zakupiono w Difco (Detroit, Michigan, USA), jeśli nie zaznaczono inaczej.

Immunizacja. Myszy immunizowano za pomocą Cop 1 zemulgowanego w CFA lub Cop 1 w Alum-phos (100 μg w całkowitej objętości 100 gl). Alum-phos mieszano intensywnie z Cop 1 w stosunku 1:4. Każdą szczepionkę wstrzykiwano podskórnie (SC) w jednym miejscu na boku myszy. Myszom kontrolnym wstrzykiwano mannitol z CFA albo z Alum-phos.

Iniekcja glutaminianu. Prawe oko znieczulanej myszy C57B BL/6J nakłuwano igłą o rozmiarze 27 w górnej części twardówki, a następnie 10 μl strzykawkę Hamiltona z igłą o rozmiarze wkładano do wysokości ciałka szklistego. Myszom wstrzykiwano całkowitą objętość 1 μl (200 nmoli) L-glutaminianu rozpuszczonego w soli fizjologicznej.

Znakowanie komórek zwojów siatkówki myszy (RCG). RCG znakowano 72 godziny przed końcem doświadczenia. Myszy znieczulano i umieszczano w aparacie stereotaktycznym. Czaszkę eksponowano i utrzymywano czystą oraz suchą. Identyfikowano punkt środkowy i zaznaczano. Zaznaczony punkt iniekcji był na głębokości 2 mm od powierzchni mózgu; 2,92 mm poza punktem środkowym osi przednio-tylnej i 0,5 mm od linii środkowej. W czaszce wywiercano otwór powyżej wyznaczonych współrzędnych w prawej i lewej półkuli. Neuronalny barwnik FluoroGold (5% roztwór w soli fizjologicznej; Fluorochrome, Denver, CO) nanoszono następnie (1 μl z prędkością 0,5 gl/min do każdej półkuli) przy użyciu strzykawki Hamiltona, a skórę na ranie zszywano. Wsteczny pobór barwnika jest markerem żyjących komórek.

Ocena przeżycia RGC u myszy. Myszom podawano śmiertelną dawkę pentobarbitonu (170 mg/kg). Wyjmowano oczy, usuwano siatkówkę i umieszczano w paraformaldehydzie (4% w PBS).

Zliczano wyznakowane komórki z 4-6 wybranych pól o identycznym rozmiarze (0,7 mm²). Wybrane zostały pola zlokalizowane w tej samej odległości od plamki ślepej (0,3 mm) w celu uniknięcia różnic w gęstości RGC jako funkcji odległości od plamki ślepej. Pola zliczono w mikroskopie fluorescencyjnym (powiększenie x 800) w próbie ślepej bez znajomości trybu leczenia. Wyliczano średnią liczbę RGC na pole dla każdej siatkówki.

Model stwardnienia zanikowego bocznego. Trzy myszy ALS, w wieku 75 dni szczepiono za pomocą Cop 1 zemulgowanego w Alum-phos (100 μg Cop 1 w całkowitej objętości 100 gl, jedna iniekcja podskórna w bok). Myszom podawano iniekcje przypominające tydzień później i miesiąc później. Trzech dodatkowych myszy transgenicznych nie poddawano immunizacji i służyły one jako kontrola spontanicznej progresji choroby. Siłę mięśni testowano za pomocą czasu zwisania każdej myszy na obrotowym pręcie. Ponieważ maksymalny czas zwisania dla większości zwierząt wynosił 5 minut, każde doświadczenie kontynuowano do 5 minut.

Test siły mięśni. Test przeprowadzano jak opisano uprzednio (Kong i Xu, 1998). Myszom pozwalano chwytać i trzymać się pionowego pręta (2 mm średnicy) z małą pętlą na dolnym końcu. Pręt pionowy pozwala myszom na użycie do chwytania zarówno przednich, jak i tylnych kończyn. Pręt utrzymywano w pozycji pionowej z ciągłym ruchem obrotowym (średnica ruchu 10 cm) przy 24 rpm. Zapisywano czas, w którym mysz była w stanie trzymać się na pręcie. Ponieważ większość myszy spadała w przeciągu 5 minut, test przerywano w 5 minucie. Myszy zazwyczaj badano raz w tygodniu a testowanie kontynuowano aż do całkowitego zaprzestania zwisania na pręcie.

PL 205 469 B1

Analiza danych. Dane przeżycia analizowano za pomocą testu Mantela-Coxa lub analizy regresji proporcjonalnego ryzyka Coxa. Istotność statystyczną testowano za pomocą jednostronnego testu ANOVA, a następnie procedury Student-Neuman-Keuls przy użyciu programu SPSS-PC (SPSS, Chicago, IL).

P r z y k ł a d 1. Ochrona neuronów przed toksycznością glutaminianu za pomocą Cop 1 zemulgowanego w Alum-phos.

W pierwszej kolejności sprawdzono czy toksyczność indukowana glutaminianem moż e być zablokowana przez aktywne szczepienie za pomocą Cop 1 zemulgowanego w CFA lub w Alum-phos. CFA jest adiuwantem nie dopuszczonym do stosowania u ludzi, choć często stosowanym w doświadczeniach na zwierzętach laboratoryjnych. Alum-phos i inne adiuwanty oparte na wodorotlenku glinu są dopuszczone do stosowania przez FDA oraz inne organizacje i są często wykorzystywane w szczepionkach ludzkich i weterynaryjnych.

Cop 1 zemulgowany w CFA lub Alum-phos (100 μg Cop 1 w całkowitej objętości 100 ul) wstrzykiwano podskórnie w jednym miejscu na boku myszy C57BL/6J, zaś siedem dni później wstrzykiwano glutaminian (200 nmoli) do ciałka szklistego myszy. Po siedmiu dniach zliczano przeżywające RGC. Przeżycie RGC po toksyczności glutaminianu bez wcześniejszej immunizacji uznawano za 100%. Jak pokazano w tabeli 1, pre-immunizacja za pomocą Cop 1 w CFA lub Alum-phos siedem dni przed wstrzyknięciem glutaminianu znacząco chroniła komórki zwojów siatkówki przed toksycznością glutaminianu, jednak ochrona za pomocą Cop 1 zemulgowanego w Alum-phos była znacząco większa.

T a b e l a 1: Ochrona neuronów przed toksycznością glutaminianu poprzez aktywne szczepienie za pomocą Cop 1 w CFA lub w Alum-phos

	Przeżycie RGC (% nieimmunizowanych)
	Kontrolna immunizacja	Cop 1
CFA	98 ± 3%; n = 11	118 ± 8,2%*; n = 9
Alum-phos	108 ± 11%*; n = 8	135 ± 7%; n = 8

* p< 6,05; 2-stronny test t Studenta.

P r z y k ł a d 2. Ochrona neuronów przed toksycznością glutaminianu za pomocą Cop 1 lub PolyYE z dodatkiem adiuwanta lub bez niego

Toksyczność glutaminianu jest jednym z czynników ryzyka w neurodegeneracji ALS. W celu zbadania skuteczności immunizacji za pomocą Cop 1 i PolyYE bez adiuwanta do ochrony neuronów przed toksycznością glutaminianu, siatkówkę myszy C57BL eksponowano na nadmierną ilość glutaminianu. Myszy C57BL podzielono na 4 grupy doświadczalne:

1. Zwierzęta nieimmunizowane - kontrola negatywna, n=9

2. Zwierzęta immunizowane za pomocą 25 μg PolyYE na mysz, n=10

3. Zwierzęta immunizowane za pomocą 225 μg PolyYE na mysz, n=10

4. Zwierzęta immunizowane za pomocą 75 μg Cop 1 na mysz, n=7.

Grupy immunizowano PolyYE lub Cop 1 rozpuszczonym w 100 μl PBS 7 dni przed dooczną iniekcją glutaminianu. Liczbę RGC, które przeżyły 7 dni po ekspozycji na zwiększony poziom glutaminianu zliczano i obliczano jako procent dla zdrowych oczu. Wyniki pokazano na Fig. 1. Przeżycie RGC we wszystkich grupach immunizowanych (grupy 2-4) było znacząco wyższe (p<0,001 t-test) niż w grupie kontroli negatywnej.

W dodatkowych doświadczeniach, myszy C57B1 poddawano działaniu Cop 1 (100 μg) zemulgowanego w Alum-phos (n=8) lub samego Alum-phos (n=8) lub PolyYE (100 μg) zemulgowanego w CFA (n=24) lub samego adiuwanta (kontrola negatywna) (n=27) (100 μΓ), 7 dni przed dooczną iniekcją glutaminianu. Zliczano liczbę RGC, które przeżyły 7 dni po ekspozycji na zwiększony poziom glutaminianu. Ochronę wyliczano jako procent RGC, które przeżyły z całkowitej utraty RGC w grupie nieimmunizowanej. Wyniki pokazano na Fig. 2A-B. Przeżycie RGC w grupie poddawanej działaniu Cop 1 (Fig. 2A) oraz w grupie poddawanej działaniu PolyYE (Fig. 2B) było znacząco wyższe niż w grupach kontrolni negatywnej, które otrzymywały sam adiuwant.

W modelu toksyczności glutaminianu badano Cop 1 o wysokich masach cząsteczkowych (średnia MW: 12,600; 15,500; i 22,000 daltonów). Wydajność wzbudzania specyficznej odpowiedzi neuroprotekcyjnej jest określana w modelu ostrej toksyczności glutaminianu, jak opisano powyżej. Myszy

PL 205 469 B1

C57BL/6 (5 grup na doświadczenie, 10 zwierząt na grupę) immunizowano 14 dni przed doocznymi iniekcjami glutaminianu (200 nmoli), a przeżycie RGC oceniano 7 dni po iniekcji glutaminianu. Badano trzy dawki Cop 1 dla każdej MW i porównywano z kontrolą negatywną (tylko glutaminian) i kontrolą pozytywną (75 μg Cop 1 o MW 7,200 d, 7 dni przed toksycznością glutaminianu).

P r z y k ł a d 3. Neuroprotekcyjne działanie szczepienia za pomocą Cop 1 i poly-YE w modelu jaskry

Jaskra jest przewlekłą chorobą neurodegeneracyjną ze stałą utratą neuronów czuciowych, ostatecznie prowadzącą do ślepoty. Za główny czynnik ryzyka i pierwotną przyczynę śmierci neuronów uważa się podniesione ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP). Zgodnie z tym czynniki biochemiczne lub zabiegi chirurgiczne obniżające IOP są obecnie standardową terapią. Jednak obniżenie IOP nie zawsze wystarcza do zatrzymania utraty neuronów. Co więcej, degeneracja nerwu wzrokowego często zachodzi przy braku podniesionego IOP, schorzenie zwane jaskrą z normalnym ciśnieniem (występują u około 1/3 pacjentów z jaskrą). Tym samym, terapia neuroprotekcyjna jest uznawana za odpowiednią. Zastosowano model przewlekle podniesionego IOP u szczurów celem zbadania zdolności szczepienia za pomocą Cop 1 lub PolyEY do zatrzymania śmierci neuronów znajdujących się w warunkach stresowych, jakie mogą wystąpić u pacjentów z ALS. Ponieważ jaskra jest przewlekłą chorobą neurodegeneracyjną jak ALS, neuroprotekcja osiągnięta w modelu jaskry może wskazywać na podobną neuroprotekcję w ALS.

Indukcję wysokiego IOP przeprowadzano w sposób następujący: używając lampy szczelinowej Haag-Streit emitującej promieniowanie niebiesko-zielonego lasera argonowego, prawe oko uśpionego samca szczura Lewis poddawano 80-120 ekspozycjom skierowanym wobec trzech z czterech żył nadtwardówkowych 270 stopni od splotu żylnego. Promień lasera miał moc 1 wata na 0,2 sekundy, prowadząc do powstania plamki o rozmiarze 100 mm przy żyłach nadtwardówkowych i 50 mm przy splocie naczyniowym. W trakcie drugiej sesji z laserem tydzień później zastosowano te same parametry z wyjątkiem tego, że rozmiar plamki wynosił 100 mm dla wszystkich ekspozycji. Napromieniowanie kierowano na wszystkie cztery żyły nadtwardówkowe i 360 stopni od splotu naczyniowego 24.

W celu pomiaru podniesienia się IOP, szczurom wstrzykiwano dootrzewnowo 10 mg/ml acepromazyny, środka uspakajającego nie obniżającego IOP, a 5 minut później mierzono ciśnienie w obu oczach używając tonometru Tono-Pen XL (Automated Ophthalmics, Ellicott City, MD, USA), po nałożeniu na rogówkę Lokaliny. Obliczano średnią 10 pomiarów dla każdego oka. Po tygodniu od pierwszej sesji lasera, IOP osiągało poziom około 30 mm Hg bez znaczącej zmiany do końca doświadczenia (3 tygodnie po pierwszej sesji lasera), jak pokazano w tabeli 2 poniżej.

W celu określenia przeżycia RGC, 3 tygodnie po pierwszej sesji lasera bezpośrednio do wewnątrzgałkowej części nerwu wzrokowego nakładano hydrofilowy barwnik nerwowy dekstran tetrametylorodaminy (Rhodamine Dextran) (Molecular Probes, Oregon, USA). Jedynie aksony, które przeżyły oraz których ciała były ciągle żywe, mogły pobierać barwnik i wykazywać wyznakowanie RGC. Szczury uśmiercano 24 godziny później, zaś ich siatkówki wycinano, nakładano na szkiełka w całości, a wyznakowane RGC liczono pod powiększeniem x 800 w mikroskopie fluorescencyjnym Zeiss. Z każdej siatkówki liczono cztery pola, wszystkie o tej samej średnicy (0,076 mm²) oraz w tej samej odległości od plamki ślepej. RCG zliczane były przez obserwatorów nie poinformowanych o pochodzeniu siatkówek.

T a b e l a 2 podsumowuje przeżycie RGC u szczurów z normalnym IOP oraz u szczurów ze wzrostem IOP indukowanym przez laser trzy tygodnie później.

Zdrowe	3 tygodnie po laserze
średnia RGC ± SD (na mm²)	średnia IOP ± SD	średnia RGCs ± SD (na mm²)	% przeżycia
2525 ± 372 (n = 5)	29,92 ± 2,38 (n = 10)	1420±272	53.9

3a. Wpływ szczepienia za pomocą PolyEY na przeżycie RGC w modelu jaskry IOP

Szczury SPD immunizowano za pomocą PolyEY (500 ^g) zemulgowanego w CFA godzinę po działaniu lasera (n=9). Jedną grupę kontrolną immunizowano za pomocą CFA bez antygenu (n=7), zaś drugiej grupie kontrolnej wstrzykiwano sam PBS (n=5). Jak pokazano na Fig. 3A, choć IOP pozostawało podniesione przez cały okres doświadczenia, szczury immunizowane za pomocą PolyEY-, ale nie PBS, wykazywały znacząco zwiększone przeżycie RGC w porównaniu ze szczurami nieimmuni10

PL 205 469 B1 zowanymi. Ochrona RGC była obliczona jako procent komórek, które przeżyły w grupach poddawanych immunizacji w stosunku do całkowitej utraty komórek grup nie poddawanych immunizacji.

3b. Wpływ szczepienia za pomocą Cop 1 na przeżycie RGC w modelu jaskry IOP

Wykorzystując szczurzy model podniesionego IOP wykazano, że Cop 1 atenuuje utratę neuronów w przypadku podawania (500 μg w CFA) na początku wzrostu IOP lub tydzień później (patrz Fig. 3B), pomimo faktu, że IOP pozostawał wysoki a degeneracja nerwów już się rozpoczęła. Dodatkowo, szczepienie Cop 1 wraz z bromidyną obniżającą IOP prowadziło do większej ochrony RGC niż sama bromidyna (patrz Fig. 3B wstawka).

P r z y k ł a d 4. Immunizacja za pomocą Cop 1 chroni przed degeneracją nerwów motorycznych u transgenicznych myszy z mutacją SOD1 (myszy ALS)

W celu zbadania czy immunizacja Cop 1 chroni przed rozwojem degeneracji neuronów motorycznych myszy ALS SOD1 (n=3) immunizowano za pomocą Cop 1 w Alum-phos w wieku 75-dni, a dodatkowe szczepienie przypominające podawano tydzień później. Następnie, immunizowano je co 30 dni. Grupy kontrolnej (n=3) myszy ALS nie immunizowano za pomocą Cop 1. Myszy były następnie testowane kilka razy w tygodniu, w sposób ślepy - bez znajomości schematu leczenia, pod kątem siły mięśni za pomocą badania czasu utrzymywania się na obracającym się pionowym pręcie. Każde doświadczenie trwało 5 minut.

Rozwój osłabienia mięśni przedstawiono na Fig. 4A-B. Fig. 4A przedstawia średni czas zwisania dla każdego zwierzęcia na tydzień (wyniki stanowią średnią ± SEM). Jak pokazano, dwa z immunizowanych Cop 1-zwierząt (mysz 1 i 4) wykazywały dłuższe czasy zwisania niż myszy nieimmunizowane.

Początek wystąpienia spadku siły mięśni był indywidualny. W celu zmierzenia wpływu szczepienia na rząd spadku siły u każdej myszy, siłę mięśni w każdym danym czasie porównywano do siły tydzień wcześniej przed wystąpieniem osłabienia.

Fig. 4B pokazuje zsynchronizowany wykres spadku siły mięśni u poszczególnych osobników myszy transgenicznych. Jest oczywistym, że myszy immunizowane za pomocą Cop 1 (czarne kolumny) wykazywały znacząco niższy spadek siły mięśni, bez względu na siłę mięśni w dniu immunizacji. Co oznacza, że zachowywały siłę motoryczną przez dłuższy okres czasu w porównaniu do myszy nieimmunizowanych.

Korzystny wpływ immunizacji Cop 1 jest odzwierciedlony w masie ciała myszy. Jak pokazano na Fig. 5, w miarę jak choroba postępowała, myszy immunizowane za pomocą Cop 1 wykazywały mniejszą utratę masy ciała. Pomiędzy 86 a 111 dniem wszystkie nieimmunizowane myszy traciły 2 gramy masy ciała. Przeciwnie, w grupie immunizowanej za pomocą Cop 1, jedna mysz nie wykazała zmian masy ciała, a dwie zyskały 2 gramy masy ciała. Immunizacja za pomocą Cop 1 wpływała również na rząd śmiertelności myszy transgenicznych. W miarę postępu choroby, myszy ulegały paraliżowi i umierały. Immunizacja za pomocą Cop 1 znacząco wydłużała życie myszy transgenicznych, podczas gdy myszy nieimmunizowane umierały 2, 3 i 4 tygodnie po rozpoczęciu choroby, jedna mysz immunizowana Cop 1 przeżyła 4 tygodnie, zaś druga 7 tygodni po rozpoczęciu choroby (tabela 3). W chwili śmierci, myszy immunizowane Cop 1 były średnio 3 tygodnie starsze niż myszy nieimmunizowane.

T a b e l a 3. Immunizacja za pomocą Cop 1 przedłuża życie myszy z nadekspresją ludzkiej zmutowanej SOD-1.

	Wiek w chwili śmierci (tygodnie)	Śmierć po rozpoczęciu choroby (tygodnie)
kontrola	16,3 ± 0,3 (n=3)	3 ± 0,6 (n=3)
Cop 1	20 ± 0 (n=3)	6 ± 1 (n=3)

P r z y k ł a d 5. Leczenie Cop 1 wydłuża oczekiwany czas życia myszy ALS

Czternaście myszy ALS w wieku 60 dni szczepiono za pomocą Cop 1 (75 ^g) zemulgowanego w CFA (Difco Laboratories, Heidelberg, Germany) zawierającym 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis. Emulsję (całkowita objętość 200 μθ wstrzykiwano do poduszki tylnej łapy, i podawano myszom codziennie doustnie Cop 1 (12,5 mg/kg/dzień) w wodzie do picia. Myszy immunizowane w wieku 60 dni za pomocą Cop 1 i myszy kontrolne obserwowano codziennie i ważono raz w tygodniu. Monitorowano ich aktywność motoryczną i śmiertelność. Wiek, w którym wystąpiły objawy określano jako wiek (w dniach) pojawienia się pierwszych drżeń i/lub chwiejności kończyn albo zwisania (zamiast wymachiwania) kończyn tylnych w sytuacji gdy mysz trzymano za ogon w powietrzu. Utrata odruchu postaPL 205 469 B1 wy i ułożenia była traktowana jako wskaźnik schyłkowego etapu choroby. Paraliż jest spowodowany postępującą utratą neuronów motorycznych w rdzeniu kręgowym. Jak pokazano na Fig. 6, nieszczepione kontrole (n = 14) ulegały paraliżowi jednej lub więcej niż jednej kończyny i umierały do wieku 211 ±7 dni (średnia ± SD). Myszy poddawane działaniu Cop 1 przeżywały do 263 ± 8 dni. Tym samym, szczepienie za pomocą Cop 1 dramatycznie zwiększało oczekiwany czas życia myszy ALS (Fig. 6).

Jako kontrolę pozytywną, 15 myszom ALS podawano dzienną dawkę (30 mg/kg) Riluzolu, jedynego leku obecnie podawanego pacjentom z ALS. Jak pokazano na Fig. 7, myszy poddane działaniu Riluzolu wykazywały 9% wzrost przeżycia w stosunku do kontroli, podczas gdy myszy poddawane działaniu Cop 1 wykazywały 25% wzrost w porównaniu z kontrolami.

Oprócz prawie 25% wzrostu przeżycia w stosunku do kontroli, początek choroby (objawiający się sprawnością motoryczną) był opóźniony, wskazując również na korzyści przejawiające się w postaci jakości życia na etapie przedklinicznym i klinicznym (Fig. 8). Myszom pozwalano na chwytanie i utrzymywanie się na pionowym pręcie (2 mm średnica) z małą pętlą na dolnym końcu. Prawidłowe wartości dla każdej myszy otrzymywano oceniając nocną aktywność motoryczną (od 8 wieczorem do 8 rano) w wieku pomiędzy 40 a 60 dni przy użyciu aparatu Rotarod (LMTB, Berlin). Aktywność myszy oceniano indywidualnie za pomocą skomputeryzowanego systemu i oceniano codziennie. W celu analizy statystycznej, aktywność na aparacie Rotarod normalizowano do średniej aktywności każdej myszy od dnia 40 do dnia 60. Dane przedstawiano jako średnią ± standardowy błąd średniej (SEM). Testowanie na aparacie Rotarod i masę porównywano poprzez analizę wariancji (ANOVA). Istotność statystyczną oceniano jednostronnym testem ANOVA oraz testem Student-Neuman-Keuls za pomocą programu SPSS-PC (SPSS, Chicago, IL). Znaczące różnice pomiędzy myszami poddawanymi leczeniu Cop 1 i nie poddawanymi takiemu leczeniu, obserwowano w następujących okresach czasowych: pomiędzy 12 a 20 dniem (P < ,058), pomiędzy 21 dniem a 24 (P < ,0079) oraz pomiędzy 25 dniem a 28 (P < .,0017).

P r z y k ł a d 6. Poddawanie myszy ALS leczeniu Cop 1 bez adiuwanta

Myszy ALS (15 zwierząt na grupę) podzielono na 11 grup doświadczalnych:

1. myszy nieleczone - grupa kontroli negatywnej

2. myszy leczone za pomocą Riluzolu - 30 mg/kg/dzień

3. myszy immunizowane za pomocą Cop 1/CFA - 75 μg pierwotne szczepienie oraz codzienne podawanie doustne Cop 1 (12,5 mg/kg) - grupa kontroli pozytywnej.

4. myszy immunizowane dwiema iniekcjami 75 μg Cop 1: pierwsza w 45 a druga 59 dniu.

5. myszy immunizowane jak w grupie 4, a następnie jedną iniekcją 100 μg Cop 1 w dniu 87.

6. myszy immunizowane dwiema iniekcjami 150 μg Cop 1: pierwsza w 45 a druga w 59 dniu.

7. myszy immunizowane dwiema iniekcjami 75 μg Cop 1: pierwsza w 83 a druga w 97 dniu.

tak samo jak grupa 4, z Riluzolem 30 mg/kg/dzień.

9. tak samo jak grupa 5, z Riluzolem 30 mg/kg/dzień.

10. tak samo jak grupa 6, z Riluzolem 30 mg/kg/dzień.

11. tak samo jak grupa 7, z Riluzolem 30 mg/kg/dzień.

Aktywność motoryczną i masę ciała myszy monitorowano raz w tygodniu, począwszy od dwóch tygodni po rozpoczęciu leczenia. Kryterium dla etapu schyłkowego i eutanazji stanowiła niezdolność myszy do wyprostowania się w 30 sekund po umieszczeniu na boku na płaskiej powierzchni. Decyzję podejmował niezależny weterynarz, zgodnie z protokołem dla zwierząt.

P r z y k ł a d 7. Podawanie Cop 1 chroni przed degeneracją neuronów motorycznych po aksotomii nerwu twarzowego.

Przecięcie nerwu twarzowego u dorosłych myszy powoduje łatwo obserwowaną degenerację 20% do 35% poddanych aksotomii neuronów motorycznych. Aksotomia nerwu twarzowego stanowi zatem model ALS, które jest chorobą, której cechą charakterystyczną jest postępująca utrata motoneuronów. Wpływ immunizacji na przeżycie i funkcjonowanie neuronów w modelu aksotomii nerwu twarzowego wskazuje na potencjalną terapię hamującą utratę neuronów u pacjentów z ALS.

W doświadczeniu wykorzystano 34 dorosłe samice myszy (12-tygodniowe, 20-25 g) szczepu C57BL/6J01aHsd (Harlan Winkelmann, Borchen, Germany). Zwierzęta kontrolne poddano jednostronnej aksotomii nerwu twarzowego i pozostawiano bez leczenia lub wstrzykiwano im PBS zemulgowany w CFA. Myszy w grupie doświadczalnej (n = 10) immunizowano za pomocą Cop 1 (100 μg) lub wstrzykiwano im PBS (n = 9), zemulgowane w CFA, zaś 7 dni później poddawano aksotomii nerwu twarzowego. Myszy w trzeciej grupie (n=8) poddano aksotomii bez wcześniejszej immunizacji, zaś myszy w czwartej grupie pozostawiono bez traktowania (n = 7).

PL 205 469 B1

Siedem dni później u uśpionych myszy (100 mg Ketanest® plus 5 mg Rompun® na kg masy ciała) wytwarzano twarzowo-twarzową anastamozę (FFA) za pomocą mikrochirurgicznego połączenia przedniego kikuta z tylnym kikutem za pomocą szwów epineuralnych 11-0 (Ethicon EH 743 8G, Norderstedt, Germany). Ranę zamykano trzema szwami skórnymi 4-0. W celu oceny gojenia, neurony motoryczne unerwiające mięśnie wąsów były wstecznie znakowane iniekcją 30 μl 1% wodnego roztworu fluorescencyjnego znacznika FluoroGold plus 2% dimetylosulfotlenku (DMSO) wstrzykiwanego do mięśni każdej części wibrys. Siedem dni później, myszy ponownie usypiano i poddawano perfuzji przez serce za pomocą 0,9% NaCl oraz utrwalano 4% paraformaldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym pH 7,4 przez 20 min. Mózgi usuwano i wykonywano 50 μιίτι skrawki używając wibratomu. Skrawki analizowano w mikroskopie epifluorescencyjnym Zeiss Axioskop 50 z użyciem filtra HQ-Schmalband-filter ustawionego na FluoroGold (AHF Analysentechnik, Tubingen, Germany).

Osiem tygodni po aksotomii, jak pokazano na Fig. 9A-D i w tabeli 4, średnia liczba neuronów motorycznych znacząco wyższa niż liczba otrzymana w grupie, której wstrzykiwano PBS w CFA, bądź grupie kontrolnej nieleczonej (P < ,05). Leczenie za pomocą Cop 1 nie miało wpływu na liczbę neuronów motorycznych w nieuszkodzonym jądrze twarzowym. Kontrolna immunizacja za pomocą PBS w CFA nie miała działania ochronnego.

Wsteczne znakowanie neuronów po wstrzyknięciu FluoroGold do wibrys nie wykazało różnic w lokalizacji lub ilości neuronów motorycznych w nieuszkodzonym jądrze twarzowym pomiędzy myszami immunizowanymi Cop 1 w CFA (Fig. 9A) a myszami którym wstrzykiwano PBS w CFA (Fig. 9C). Przeciwnie, uszkodzone jądro twarzowe, po wcześniejszym leczeniu Cop 1 w CFA (Fig. 9B), zawierało znacząco więcej wyznakowanych neuronów motorycznych niż uszkodzone jądro twarzowe myszy kontrolnych poddanych działaniu PBS w CFA (Fig. 9D). Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe (SD). Różnice pomiędzy różnymi grupami doświadczalnymi były wykrywane poprzez zastosowanie jednostronnej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu t dla danych niesparowanych za pomocą poprawki Bonferroni-Holm.

Wartości P mniejsze niż ,05 były uznawane jako statystycznie istotne.

P r z y k ł a d 8. Podawanie Cop 1 zachowuje aktywność neuronów motorycznych po ostrej aksotomii.

W celu określenia czy większe ilości neuronów motorycznych u myszy leczonych Cop 1 i poddanych aksotomii niż u myszy kontrolnych są związane z poprawą funkcjonalną, biometrycznie analizowano ruchy węszenia. W normalnych warunkach fizjologicznych, wibrysy nosowe są uniesione i skierowane do przodu. Ich stałe ruchy, zwane węszeniem występują 5-11 razy na minutę. Kluczowymi ruchami tej aktywności motorycznej jest przesuwanie do przodu i do tyłu wibrys przez mięśnie piloerekcyjne, unerwiane przez policzkową gałąź nerwu twarzowego. Jeśli nerw twarzowy jest przecięty, wibrysy przyjmują położenie do tyłu i pozostają bez ruchu.

Przy użyciu tego modelu, oceniane są następujące parametry: (i) przesuwanie wibrysy do przodu, mierzone za pomocą dogłowowo otwartego kąta pomiędzy płaszczyzną śródstrzałkową a trzonem włosa (duże ruchy wiążą się z małymi wartościami kąta); (ii) częstotliwość węszenia, stanowiącą cykle wysuwania do przodu i do tyłu (pasywny ruch do tyłu) na sekundę; (iii) amplitudę - różnice w stopniach pomiędzy maksymalnym ruchem do przodu a maksymalnym ruchem do tyłu; (iv) szybkość kątową podczas ruchów do przodu w stopniach na sekundę oraz (v) kątowe przyspieszenie podczas ruchów do przodu w stopniach na sekundę.

Myszy poddane aksotomii nerwu twarzowego i szczepieniu za pomocą Cop 1 wykazywały znacząco lepszą aktywność węszenia niż inne grupy myszy. Najlepiej demonstrowane to było przez amplitudę, szybkość kątową podczas ruchów do przodu oraz kątowego przyspieszenia podczas ruchów do przodu (tabela 4).

T a b e l a 4. Wpływ szczepienia Cop 1 na przeżycie neuronów motorycznych

Grupa	Nieuszkodzone jądro twarzowe	Uszkodzone jądro twarzowe
A: Myszy bez zabiegów (n = 7)	1559 ± 135	_{1707 ± 90} ^{* B,C,D}
B: FFA tylko (n = 8)	1434 ± 106	670 ± 178^{* A,D}
C: FFA po iniekcji PBS/CFA (n = 9)	1605 ± 142	766 ± 104^{* A,D}
D: FFA po szczepieniu Cop1 w CFA (n=10)	1640 ± 186	1172 ± 152^{* A,B,C}

PL 205 469 B1

Wartości liczbowe wyników pokazane są na Fig. 9. Liczby (średnia ± SD) twarzowych perikarionów wstecznie wyznakowanych poprzez iniekcję 1% FluoroGold (30 μΐ) w grupie bez traktowania (grupa A) oraz myszy poddanych działaniu tylko FFA (grupa B), FFA po iniekcji PBS w CFA (grupa C) oraz FFA po szczepieniu Cop 1 w CFA (grupa D). Litery indeksu górnego oznaczają grupy ze znacząco różnymi wartościami (*P < 0,05). W celu analizy obrazu, zastosowano system kamery CCD (Optronics Engineering Model DEI-470, Goleta, CA) połączonej z programem analizującym obraz Optimas 6.5 (Optimas, Bothell, WA) celem ręcznego policzenia wstecznie wyznakowanych twarzowych neuronów motorycznych na ekranie komputera (42). Wykorzystując zasadę frakcjonatora (43), wszystkie wstecznie wyznakowane neurony motoryczne były zliczane w co drugim skrawku o 50 μm grubości jądra twarzowego po stronie operowanej i nieoperowanej. Zliczenie wykonywało dwóch obserwatorów nieświadomych protokołu leczenia jakiemu zostały poddane szczury.

T a b e l a 5. Wpływ szczepienia za pomocą Cop 1 na odzyskiwanie ruchów węszenia po aksotomii nerwu twarzowego

Grupa	Częstotliwość	Kąt Przy maksymalnym ruchu do przodu	Amplituda	Szybkość kątowa podczas ruchu do przodu	Przyspieszenie kątowe podczas ruchu do przodu
	(Hz)	(stopnie)	(stopnie)	(stopnie/s)	(stopnie/s²)
Myszy nie traktowane	6,0 ± 1,0	65,1° ± 22	40° ± 14*^B,C	627° ± 346* ^B,C,D	20084° ± 1508* ^B,C,D
(n = 7)
B: tylko FFA (n = 8)	5,0 ± 2,0	81,2° ± 2,7	11,0° ± 6,0* ^A,D	75° ± 43* ^A	1655° ± 1146* ^A
C: FFA po iniekcji PBS w CFA	5,3 ± 1,2	64,4° ± 6,3	22,1° ± 9,9* ^A,D	214° ± 70* ^A	3874° ± 889* ^A
(n = 9)
D: FFA leczeniu Cop-1 w CFA	5,5 ± 0,9	68,2° ± 23,05	38,9° ± 10,6* ^B,C	347,8° ± 87,3* ^A	6713° ± 2071* ^A
(n-10)

Biometryka normalnego węszenia i odzyskiwania węszenia u myszy bez traktowania (grupa A) oraz u myszy poddanych tylko FFA (grupa B) , myszy poddanych FFA po iniekcji PBS w CFA (grupa C), i myszy poddanych FFA po iniekcji Cop 1 w CFA (grupa D). Wartości to średnie ± SD. Litery w indeksie górnym wskazują grupy ze statystycznie istotnymi różnicami (* P < ,05). Do analizy biometrycznej wykorzystano dwa duże włosy z rzędu C na każdej stronie pyska. Gdy myszy były lekko znieczulone eterem za pomocą nożyczek wycięto im pozostałe wibrysy. Do nagrania na taśmę myszy w stanie aktywnej eksploracji w czasie 3-5 min wykorzystano kamerę camcorder (Panasonic NV DX-110 EG). Po kalibracji zbierano obrazy wideo węszenia u myszy z częstotliwością 50 Hz (50 okienek na sekundę), przy czym okno migawki kamery było otwarte przez 4 msec. Obrazy zapisywano na minikasetach AY-DVM 60 EK. Sekwencje obrazów wideo powoli przeglądano i wybierano 1,5-sekundowe fragmenty dla każdej myszy do analizy biometrycznej węszenia. Zastosowane kryteria wyboru to stabilna pozycja głowy, częstotliwość węszenia i stopień wysunięcia wibrys do przodu. Wybrane sekwencje selekcjonowano za pomocą systemu 2D/ Manual Advanced Video System PEAK Motus 2000 (PEAK Performance Technologies, Englewood, CO). Model przestrzenny składał się z trzech punktów odniesienia (czubek nosa i kąty wewnętrzne obu oczu). Każda wibrysa przedstawiona jest w modelu przestrzennym za pomocą dwóch punktów: swej podstawy i punktu na niej położonego 0,5 cm od podstawy.

PL 205 469 B1

Literatura

Brown R.H. (1995) Amyotrophic lateral sclerosis: recent insights from genetics and transgenic mice Cell 80: 687-692

Bruijn L.I., Cleveland D. W. (1996) Mechanisms of selective motor neuron death in ALS: insights from transgenic mouse models of motor neuron disease Neuropathol Appl Neurobiol 22:373-387

Chou S.M. (1992) Pathology-light microscopy of amyotropic lateral sclerosis. In: Handbook of Amyotrophic Lateral Sclerosis (Smith R.A., ed.), pp. 133-181. New York: Marcel Dekker

Fridkis-Hareli i wsp. (1999) Binding motifs of copolymer 1 to multiple sclerosis- and rheumatoid arthritis-associated HLA-DR molecules J Immunol. 162(8):4697-4704

Fridkis-Hareli i wsp. (2002) Novel synthetic amino acid copolymers that inhibit autoantigenspecific T cell responses and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis J Clin Invest 109(12):1635-1643

Gurney M.E.i wsp. (1994) Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu1Zn superoxide dismutase Science 264: 1772-1775

Hadano i wsp. (2001) A gene encoding a putative GTPase regulator is mutated in familial amyotrophic lateral sclerosis 2 Nature Genetics 29: 166-73

Hauben i wsp. (2000) Autoimmune T cells as potential neuroprotective therapy for spinal cord injury Lancet 355:286-287

Hirano A. (1991) Cytopathology of amyotrophic lateral sclerosis Adv Neurol 56:91-101

Johnson i wsp. (1995) Copolymer 1 reduces relapse rate and improves disability in relapsing-remitting multiple sclerosis: results of a phase III multicenter, double-blind placebo-controlled trial. The Copolymer 1 Multiple Sclerosis Study Group, Neurology 1:65

Julien J.P. (2001) Amyotrophic lateral sclerosis: unfolding the toxicity of the misfolded. Cell 104:581-591

Kipnis i wsp. (2001) Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. J.Neurosci. 21 (13):4564-71

Kong, J. and Xu, Z. (1998) Massive mitochondrial degeneration in motor neurons triggers the onset of amyotrophic lateral sclerosis in mice expressing a mutant SOD1 J. Neuroscience 18: 3241-3250

Moalem G. i wsp. (1999) Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy, Nature Medicine 5:49-55

Mulder D.W. i wsp. (1986) Familial adult motor neuron disease: amyotrophic lateral sclerosis Neurology 36:511-517

Munsat T.L. i wsp. (1989) Adult motor neuron disease. In: Merrit's Textbook of Neurology (Rowland L.P., ed.), pp 682-687. Philadelphia: Lea & Febiger

Pitt i wsp. (2000) Glutamate excitotoxicity in a model of multiple sclerosis Nature Medicine

6:67-70

Ripps M.E. i wsp. (1995) Transgenic mice expressing an altered murine superoxide dismutase gene provide an animal model of amyotrophic lateral sclerosis Proc Natl Acad Sci, USA 92: 689-693

Rosen D.R. i wsp. (1993) Mutations in Cu1Zn superoxide dismutaso gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis Nature 362:59-62

Rothstein J.D., i wsp. (1992) Decreased glutamate transporter by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. N. Eng. J. Med; 326: 1464-68

Turner i wsp. (2001) Clinical trials in ALS: An overview. Seminars in Neurology 21:167-175

Yang i wsp. (2001) The gene encoding alsin, a protein with three guanine-nucleotide exchange factor domains, is mutated in a form of recessive amyotrophic lateral sclerosis, Nature Genetics 29: 160-165.

PL 205 469 B1

Wykaz sekwencji <110> YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

<120> Zastosowanie Cop 1 <130> PRON-018 PL <150> PCT/IL02Z00979 <151> 2002-12-05 <150> US 60/336,139 <151> 2001-12-06 <160> 32 <170> Patentln version 3,1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 1

Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 ' <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 2

Ala Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

PL 205 469 B1 <223> Peptyd syntetyczny <400> 3

Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 4

Ala Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 5

Ala Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 6

Lys Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 7 <211> 15

PL 205 469 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 7

Ala Glu Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 8

Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 9

Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 10

Ala Ala Lys Tyr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15

PL 205 469 B1 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <4Q0> 11

Ala Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 1 '5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 12

Glu Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 13

Glu Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213 > Sekwencj a sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 14

PL 205 469 B1

Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 15

Ala Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 16

Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 17

Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

PL 205 469 B1 <223> Peptyd syntetyczny <400> 18

Ala Lys Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 19

Ala Glu Ala Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 20

Lys Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 21

Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <21O> 22 <211> 15

PL 205 469 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 22

Ala Ala Glu Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 23

Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 24

Ala Ala Lys Tyr Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 25

Ala Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15

PL 205 469 B1 <210> 26 <21l> 15 <212> PRT <213> Sekwencj a sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 26

Glu Lys Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 27

Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 28

Ala Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny

PL 205 469 B1 <400> 29

Ala Glu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 30

Glu Lys Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 31

Ala Tyr Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencj a sztuczna <220>

<223> Peptyd syntetyczny <400> 32

Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15

PL 205 469 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie Cop 1 do wytwarzania szczepionki do leczenia stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) u pacjentów poprzez zmniejszanie progresji choroby i/lub ochronę przed degeneracją nerwów ruchowych, i/lub ochronę przed toksycznością glutaminianu.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że szczepionka zawiera Cop 1 bez adiuwanta.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że szczepionka zawiera Cop 1 w postaci emulsji w adiuwancie odpowiednim do stosowania klinicznego u ludzi.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że adiuwant wybrany jest z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, żelu wodorotlenku glinu i hydroksyfosforanu glinu.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że adiuwant stanowi amorficzny hydroksyfosforan glinu o kwasowym punkcie izoelektrycznym i stosunku A1: P wynoszącym 1:1.
6. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że szczepionka przeznaczona jest do podawania co najmniej raz na miesiąc.
7. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że szczepionka przeznaczona jest do podawania co najmniej raz na 2-3 miesiące.
8. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienne tym, że szczepionka przeznaczona jest do podawania z innym lekiem do leczenia choroby neuronów ruchowych (MND), takim jak Riluzol.