SE505316C2 - Användning av proteinet S-100b för framställning av läkemedel för nervceller - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 505 316 2 fagocytera dött material och spelar en nyckelroll i immun- systemet i hjärnan.

Organisationen av de oerifera nerverna och rvagmäroen.

De perifera nerverna innefattar axoner till muskler (motoriska axoner) som åstadkommer kontraktion.av'musklerna och axoner från musklerna som ger information från mus- kelspolar, senor, ledkapslar och huden (känselaxoner) som mottager känselinformation. De motoriska axonerna utgår från stora perikarya som är lokaliserade i det främre hornet i ryggmärgen. Känselsaxonerna har sina cellkroppar i de dorsala rotganglierna där de omges av satellit glia- celler. Känselsnervceller i ryggmärgen ger informationen vidare till hjärnan. fitukturen av ryggmärgen.

Nervcellskropparna i ryggmärgen är organiserade som en grå substans som i snitt har formen av ett H. Den omges av vitt material innefattande uppåtstigande och.nedåtgående>axoner.

Strukturen av rombenceghalon och kranialnerverna.

Tio av tolv hjärnnerver (kranialnerver) har sina perikarya lokaliserade i klasar (nuclei) på olika ställen i romben- cephalon. Hjärnnerverna är antingen motoriska eller känselmottagliga till sin funktion.

REAKTION PÅ sKADA= Inflammation och cellulärt svar på skada.

Skada på nervvävnad leder till inflammation som känneteck- nas av ett vaskulärt eller cellulärt svar avsedda att försvara kroppen mot främmande substanser och för att ta hand om död och döende vävnad. Inflammationen som sådan bereder också väg för denna reparationsprocess. Om axonerna skadas undergâr den perifera delen degeneration. Dessutom BNSDOCID: 10 15 20 25 30 35 BNSDOCID: 505 316 3 degenererar de proximala delarna av vissa axoner samt deras perikarya och dör.

Graden av inflammation- och reparationsprocesserna beror på graden av skada, tillståndet hos nervvävnaden samt på förmågan hos kroppen som sådan att svara. Det huvudsakliga kännetecknet hos reparationsprocessen är att axonen börjar växa ut från överlevande perikarya och från de proximala axonen, och växer ut genom skadan, och in i den distala döende perifera.nervstumpen eller ryggmärgen. Denna process är långsam (några millimeter per dag) och resultatet är i allmänhet osäkert på grund av att målorganen (muskler, kärl, hud, senor, leder och brosk, ben) som förlorar sina impulser från nerverna, degenererar innan de har kommit i kontakt med de växande axonerna. Detta leder till minskad muskulär kontraktionskraft eller paralys samt minskad känselinput. Detta ger svåra handikapp för individen. För samhället har denna typ skador en stark socio-ekonomisk betydelse.

Cellulära faser vid reparationen.

Två övervägande typer av skador kan uppkomma. Den ena är då nervvävnaden komprimeras medan myelinskidan (basala membraner, endo-, peri- och epineurium) som omger de döende axonen förblir intakt. Den andra typen är då en del av nervvävnaden förloras och ett gap bildas mellan de pro- ximala och perifera stumparna. Denna typ skada kräver överbryggandekonstruktioner(silikonkamrar,transplantera- de nerver eller nervvävnad eller andra transplantat) så att en reparationsprocess kan åstadkommas. Det cellulära svaret är liknande i de två typerna av skador. Den degenererande vävnaden invaderas först av makrofager som i första hand är avsedda att avlägsna dött material eller skadade vävnad- skomponenter. Efter några dagar invaderar fibroblaster och små kärl det skadade området. Schwanns celler växer till och invaderar det skadade området från den proximala 505 516 10 15 20 25 30 35 BNSDOCID; 4 stumpen varefter axoner från överlevande perikarya växer i nära anslutning till Schwanns celler.

En betydande kunskap har samlats under det senaste decenni- et beträffande de mekanismer som reglerar cellerna vid reparationsprocessen. Chemotaktiska peptider har isolerats och prostaglandiner och relaterade substansers roll har delvis klarlagts. Detaljer av stegen i. processerna som leder till förbättrad reparation och regeneration är emellertid till stor del okända.

FÖR NÄRVARANDE ANVÄNDA METODER FÖR REPARATION Av sKAnoR ocH DERAS BEGRÄNSNINGAR: Perifera nerver Olika tekniker används för reparation av skador på perifera nerver eller hjärnnerver som går genom strukturen. I sådana fall, allmänhet igen. bekymmersamt. förhindrar i allmänhet en funktionell repareringsprocess. då en enkel skärskada har uppkommit, Då en del av nerven fattas är det mera sys denna i Granulationsväv och överskott av kollagen En huvudsaklig grund till detta är bristen på axoner, som kan växa över till den perifera stumpen av nerven som leder till målorganen.

Då en del av nerven fattas måste ett transplantat sys in mellan de proximala och distala nervstumparna. En silikon- tuta eller' ett nervtransplantat används för det, mesta.

Muskeltransplantat som har gjorts acellulära gencmxupprepad frysning och upptining (flytande kväve - rumstemperatur) testas för närvarande. Resultatet är emellertid fortfarande i allmänhet dåligt.

Graden av tillväxt hos axonerna och Schwanns celler kan stimuleras genom tillsatsen av tillväxtfaktorer. 10 15 20 25 30 35 BNSDOCID: 505 316 KONKLUSION: Då en skada på de perifera nerverna och hjärnnerverna eller ryggmärgen är stor, är regenerationen dålig eller uppkommer ej och en inskränkt reparationsprocessen leder till en försämrad funktion. Små skador leder emellertid i allmänhet till negligerbara defekter. Ett stort behov för förbättring av läkningsprocessen vid svårare skador föreligger således.

Sådan förbättring kan också hjälpa till med reparation av små skador.

Ett antal faktorer som promoverar och/eller begränsar tillväxt av reparationsvävnad har beskrivits under det senaste decenniet. Många av dessa är faktorer som hänför sig till tumörer eller är associerade med tumörer (onkogena produkter). Vissa av dessa produkter befrämjar starkt tillväxten antingen allmänt eller för en speciell vävnad eller organ. Ett stort problem med dessa ämnen är att några av dem kan inducera transformationer och annars ha bieffek- ter.

Kriteria för en neurotrofisk faktor.

En neurotrofisk faktor är en faktor som stimulerar nerv- tillväxt. Ett antal kriterier måste uppfyllas substans för att kunna kalla den en neurotrofisk faktor (NTF). aV EI! 1. Den nervcell som skall utnyttja den neurotrofiska faktor bör innehålla 2. Nervcellen NTF samt ha receptorer för den. bör överleva i närvaro av faktor och dö i dess frånvaro. 3. Mekanismen för syntes av NTF bör finnas i målcellerna eller i andra celler i kontakt med nervcellen. 4. NTF bör befrämja förlängningen av de processer som äger rwm i de särskilda grupper av nervceller som uppfyller kriterium 1. '505 316 10 15 20 25 30 35 6 S-1QQb som neurotrofisk faktor S-100 familjen d.v.s. S-l00a, S-l00b, S-IOOL, S-100G, calpactin LC, calcylin och calbindin¶¿är små sura kalcium- bindande proteiner som sannolikt är involverade i cell- cykelprogessionen, celldifferentiering och interaktionerna mellan cytoskelettet och membranen. Den ursprungliga S-100 molekylen upptäcktes för 30 år sedan och fick sitt namn p.g.a. lösligheten i 100% ammonium sulfat. Den har tre dimera isoformer, S-100a0, S-100a och S-l00b som bildas genom aa, aß och ßß underenheter. S-l00b är dominerande i däggdjurshjärnor och är den enda komponenten i râtthjärnan.

Neuronalt S-100 är en kontroversiell fråga sedan 20 år tillbaka. En orsak till detta är att aldehydfixering maskerar neuronalt S-l00b:s antigen egenskaperna. Jag har nyligen lokaliserat S-l00b i nervpopulationer hos råttans rombencephalon genom en metod för framtagning av antigener.

(Yang, Q. Hamberger, A., Hyden, H., Wang, S., Stigbrand, T. and Haglid, K.G., S-l00ß has a neuronal localisation in the rat hindbrain revealed by an antigen retrieval method, Brain Res., (accepted) (1995).) Tidigare studier av försöksdjur under utveckling av S-100 i däggdjurs hjärna förbisåg imunoreaktiviteten av S-100 i nervceller, huvudsakligen p.g.a. val av hjärnregioner och utvecklingsstadier.

Endast en del av nervcellerna har S100-b eller har recepto- rer för detta protein. En metod för att fastställa vilka nervceller som har detta protein eller receptorn för denna har angivits ovan. Det visar sig att förekomsten av S-l00b ökar med tiden efter födelsen (försök utförda med råttor) i vissa hjärnceller och ett stort antal sådana celler har S-l00b i sig eller receptorer på ytan. De celler hos vuxna råttor som har detta protein finnes i omrâdet mesencephalon i nervcellerna red nu och oculomotor nu, mæsencephalic BNSDOCID: 10 15 20 25 30 35 BNSDOCID: 505 316 7 trigeminal nu, i området Pons i nervcellerna pontine reticular nu, -oral, -caudal, -ventral, motor trigeminal i området Medulla oblongata, nervcellerna facial nu, nu, vestibular superior, vestibular lateral, -spinal, i området Cerebellum, cerebellar nu, i Spinal cord nervcellerna motor neurons samt i området Dorsal root ganglia nervcellerna sensory neurons. Detta är endast exempel på nervceller som kan påverkas av läkemedlet enligt föreliggande uppfinning.

Flera nervceller som är pâverkbara finns.

PROBLEMET: Det har beräknats att endast i Sverige tusentals skador på de perifera nerverna och hjärnnerverna eller ryggmärgen läks ofullständigt med det förtvinar eller undergår fibrotiska förändringar. Sådana komplikationer ofta betydande funktionell oförmåga samt störningar i det sociala livet och arbets- oförmåga. En förbättrad och snabbare läkning efter skador resultatet att målvävnad åstadkommer på nervsystemet har därför varit ett.mycket starkt önskemål inom den biomedicinska forskningen under ett stort antal år.

Lö SNINGEN = Enligt föreliggande uppfinning har man kunnat lösa eller avsevärt ndnska ovannämnda problem genom användning av proteinet S-100b för framställning av ett läkemedel för stimulering av tillväxten och för överlevnad av skadade nervceller, som har receptorer för S-l00b och/eller inne- håller S-lO0b.

Uppfinningen innefattar även användning av proteinet S-100b för nervceller som skadats genom sjukdom såsom amyotrofiskt lateral skleros eller multipel skleros. 10 15 20 25 30 505 316 8 Enligt uppfinningen kan det framställda läkemedlet inne- hålla S-l00b i en koncentration av 0,1 till 1000 pg/ml i en vattenlösning som även kan innehålla ytterligare biokompa- tibla ämnen.

Det är enligt uppfinningen lämpligt att läkemedlet admini- streras genom infusion eller injektion till det skadade området med exempelvis en miniosmotisk pump.

Inga indikationer visar att S-l00b har någon onkogen eller onkogen relaterad egenskap. Det är en endogen peptid som kan framställas med i och för sig kända bioteknologiska metoder. S-l00b verkar strikt lokalt och har knappast nâgra bieffekter efter en lokal administrering.

S-l00b är som ovan nämnt en peptid med följande amino-syra sekvens, monomera subenhet (ß): Met Ser Glu Leu Glu Lys Ala Met Val Ala Leu.Ile Asp Val Phe His Gln Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Leu Glu Glu Ile Lys Glu Gln Glu Val Val Asp Lys Val Met Glu Thr Leu Asp Glu Asp Gly AspGly Glu Cys Asp Phe Gln Glu Phe Met Ala Phe Val Ser Met Val Thr Thr Ala Cys His Glu Phe Phe Glu His Glu S-l00b minskar således den tid som är nödvändig för regeneration av nerven. Detta minskar den funktionella och sociala oförmågan hos patienten eftersom tiden för rehabi- litering efter en större skada förkortas. Därav följer att förtvining p.g.a. inaktivitet av musklerna samt inak- tivitetsrelaterade förändringar i bensubstansen och andra strukturer kan minskas. Den dos av S-100ß som. krävs varierar inom ett vitt område som bestäms av typen, graden BNSDOCI D: 10 15 20 25 30 35 BNSDOCID. 505 516 9 och lokaliseringen av den skadade vävnaden. Behandlingen kan behöva utföras under dagar eller veckor.

Nedan följer några exempel på användningen av S-100ß och läkemedel innehållande detta för lokal administrering på skador hos råttor där ischias nerven hade skadats och varav ett stycke hade borttagits.

Exempel 1. S-100b användes i första exemplet i en koncentration av 0,5-1000 pg/ml i en saltlösning som var buffrad med 100mM fosfat och hade ett pH av 7,2 samt en tillsats av 2,5mM CaCl2. 2. Det andra försöket utfördes med en koncentration av S-100b av 0,5-1000 pg/ml i 1% bovin serum albumin (BSA) i en buffrad saltlösning med tillsats av 2,5 mM CaClr 3. S-100b i en koncentration av 0,1 pg-1000 pg/ml i saltlösning och en tillsats av 2,5 mM CaCl, användes. 4. It detta exempel användes S-100b :L en hydroximethyl- cellulosagel i en koncentration av 25 pg/ml (framställd av Apoteksbolaget AB, Umeå, Sverige). 5. I detta exempel användes S-100b löst i en hydroximethyl- cellulosagel i en koncentration av 10 pg/ml. 6. I detta exempel löstes S-100b i en 3% hydroximethyl- cellulosagel till en koncentration av 2,5 pg/ml. 7. I detta exempel tillfördes S-100b i en koncentration av 0,5-10 pg/pl,t) till området för en skadad ischias nerv hos råttor med hjälp av en Alzets miniosmotisk pump. Ischias- nerven hos råttan avlägsnades (10mm) och ersattes av ett acellulärt (fruset-upptinat) muskeltransplantat som över- 10 15 20 25 30 35 505 316 10 bryggade den proximala och distala nervstumpen. 12 råttor (kontroller) administrerades med lösningen utan S-l00b medan 11 råttor administrerades med S-100b (0,57 pg/t) under 6 dagar med hjälp av en Alzets miniosmotisk pump. Vid den sjätte dagen bestämdes längden av regenerationen in i det acellulära muskeltransplantatet av axoner som växte in i transplantatet med hjälp av en pinch test. Resultatet av försöket visas nedan. “surr-Whitney U for pínch Groupíng Variable: U . U Prime Z-Vaiue P-Value Ted z-vaxue “Fed P-Value ßïies 2 -33 Mann-Whitney Rank Info for plnch Gmupiug Variable: grupp Count SumRanks MeanRank ha 1 1 187.000 , 17.000 »kontroll 12 _~ 89.000 7.41? Nederst till höger i ovanstående tabell visas under Mean Rank att ha, d.v.s. för de råttor som hade fått läkemedlet innehållande S-100b hade ett värde av 17,000 medan kon- trollrâttorna hade ett värde av 7,417. Förhållandet mellan dessa siffror anger längden av tillväxten av axonen och i detta fall visar det sig att de axoner som hade stimulerats av läkemedlet enligt uppfinningen hade växt ut 2,3 gånger längre än de axoner som inte hade stimulerats av läkemed- let. Utväxtens storlek var signifikant större än den hos kontrollrâttors med P < 0,0007.

BNSDOCID: 505 316 ll Det visar sig således att ett läkemedel innehållande S-l00b förbättrar regenerationen och reparationen samt över- levnaden av skadad nervvävnad av olika typer. Således påverkas inte enbart tillväxten av axonerna utan själva 5 nervcellerna som är skadade får också genom denna be- handling en ökad överlevnadsförmåga.

Uppfinningen är inte begränsad till de ovan visade exemplen utan den kan varieras på olika sätt inom patentkravens ram. 10 BNSDOCID:

Claims (2)

505 316 12 5 PATENTKRAV

1. Användning av proteinet S-l0Ob för framställning av ett läkemedel för stimulering av tillväxten och för överlevnad av skadade nervceller, som har receptorer för S-l0Ob 10 och/eller innehåller S-l0Ob.

2. Användning enligt kravet 1 för nervceller som har skadats genom sjukdom som amyotrofisk lateralskleros eller multipel skleros. 15 BNSDOCID: