CZ116698A3 - Použití proteinu S-100 v medicíně a léčivo obsahující protein S100-b - Google Patents

Description

Oblast techniky ^:

Vynález se zabývá použitím proteinu SlOO-b v medicíně se zaměřením na stimulaci růstu jak přežívajících tak i již zničených neuronů. Zabývá se zejména podáváním léků obsahujících tento protein v infúzi nebo injekční cestou přímo k testruovanému ložisku.

Dosavadní stav techniky

Struktura periferních a kraniálních nervů, spinální míchy a rhombencefala.

Periferní a kraniální nervy stejně tak spinální mícha jsou funkční jednotkou, která je odpovědná za pohyb těla. Tato jednotka vysílá vzruchy také do mozečku a velkého mozku. Funkčnost této jednotky je nezbytnou součástí našeho života.

• · · · • · • ·

Každý neuron se skládá z buněčného těla (perykaryon či sóma) a dvou typu výběžků. Jedny, které vzruchy přijímají, se nazývají dendrity a druhé, které vzruchy vedou směrem od těla neuronu, jsou axony. Axony některých periferních a kraniálních nervů mají myelinovou pochvu, tvořenou Swanovými buňkami. Myelinová pochva je nevodivá na lipidy bohatá. Její funkcí je urychlení přenosu vzruchu. V rhombencealu a spinální míše myelinovou pochvu tvoří oligodendroglie. Ve tkáni centrální nervové soustavy jsou přítomné i další buněčné typy jako například mikroglie a astrocyty.

Astrocyty tvoří více než 50-70 % množsví glií v NS. Udržují stálé prostředí okolo nervových buněk. Množství makroglií je mnohem menší. Jsou aktivovány během poškození nervové tkáně a fagocytují odumřelou tkáň. Tyto buňky hrají klíčovou roli v imunitním systému nervové tkáně.

Organizace periferních nervů a spinální míchy.

Periferní nervy jsou tvořeny axony, které vedou vzruchy ke svalům a mají motorickou funkci. Nazýváme je motoneurony. Jiné neurony vedou vzruchy ze svalům, Šlachám, kloubním pochevám a kůži (senzorické neurony). Motorická vlákna jsou výběžky velkých neuronů uložených v předních rozích míchy. Senzorické axony mají svá • · · · • * • · • · těla ve spinálních gangliích, kde jsou obklopeny satelitními gliovými buňkami. Senzorické neurony ve spinální míše přenášejí infomaci k mozečku a k velkému mozku.

Struktura spinální míchy

Těla neuronů jsou ve spinální míše uložena v centrální šedé hmotě, která má tvar písmene H a je obklopena bílou hmotou obsahující axony, které směřují nahoru nebo dolů.

Struktura rhomencefala a kraniálních nervů z 12 kraniálních nervů má svá těla uložena ve skupinách tzv. jádrech (nukleích) v rhombencefalu. Kraniální nervy mohou mít motorickou i senzorickou funkci.

Reakce na poškození

Zánět a celulární buněčná reakce poškození

Poškození mozkové tkáně vede k zánětlivé reakci, která je charakterizována vaskulární a také celulární reakcí. Obě jsou zaměřené na obranu těla proti cizím látkám a zbavují organismus nekrotické tkáně. Zánět také připravuje tkáň na proces obnovení. Jestliže jsou axony porušeny jejich periferní části degenerují.

• · • · · · • · • ·

Proximální části a těla postupně většinou také degenerují a umírají.

Velikost zánětlivé reakce a degenerativního procesu závisí na velikosti poškození, dále podmínkách v tkáni a na imunoreaktivitě organismu. Primárním znakem reparačního procesu je růst a elongace proximálních axonů z přeživších těl neuronů. Tyto axoný rostou skrz poškozenou tkáň do pochev degenerovaných distálních částí nervu nebo do spinální míchy. Tento proces je pomalý (několik mm za den) a výsledek je nejistý. Než rostoucí axony dorazí do cílových orgánů (svaly, šlachy, kosti, kůže, cévy, chrupavka), které postrádají odstředivá vlákna, může trvat poměrně dlouhou dobu.

Tyto orgány mají tendenci degenerovat ještě předtím než k nim dorazí rostoucí axony. To vede k redukci svalové síly až k paralýze nebo snížení senzorické funkce, což pro daného jedince znamená velký handicap. Tento typ poškození znamená také velkou socioekonomickou zátěž pro celou společnost.

Buněčná fáze reparace nervové tkáně

Existují dva základní typy poškození. První je způsoben kompresí nervu (axonu), zatímco myelinová pochva (endo-, epi-, perineurium), které ohraničuje umírající axon zůstává intaktní. Druhý typ je způsoben • · • · · · • · destrukcí nervové tkáně. V tomto případě je mezera mezi proximální a distální částí axonu. Reparace tohoto typu poškození vyžaduje přemostující zákrok ( silikonová vlákna, transplantace nervu nebo jiné tkáně). Buněčná odpověď je podobná v obou případech poškození. Zpočátku je degenerující tkáň invadována makrofágy, které fagocytují poškozenou a nekrotickou tkáň. Během několika dní do poškozené oblasti invadují fibroblasty s malými cévami. Schwanovy buňky rostou a obalují destruovanou proximální část neuronu. Axony a Schwanovy buňky pak rostou v těsné souvisloti.

Během poslední doby bylo získáno mnoho informací o mechanismu indukce reparace neuronů. Byly izolovány chemotaktické peptidy a role prostaglandinů a dalších zúčastněných složek byla částečně vysvětlena. Jsou známi detaily jednotlivých kroků v procesu, které vede ke zlepšení reparace a regenerace.

Hodnocení metod zaměřených na reparací poěkozené tkáně a jejich limitace

Existuje mnoho metod zaměřených na reparaci a regeneraci periferních a kraniálních nervů. V případě poškození nervu čistým řezem jsou nervové pahýly spojeny suturou. Problémem je ztráta jednoho konce nervu. Přítomnost granulační tkáně a kolagenu mezi • · · · pahýly většinou zamezí funkční tkáňové reparaci. Je to způsobeno deficitem části axonu, který by defekt mohl přemostit. Tento defekt může být nahrazen transplantátem, který spojuje pomocí sutury proximální a distální konec. Silikonová vlákna nebo transplantace nervu je nejčastějším způsobem reparace. Nyní jsou zveřejňvány výsledky testů se svalovými transplantáty¹, které byly prováděny acelulárně opakovaným zmražováním a tavením (tekutým dusíkem při pokojové teplotě) . Výsledky jsou však zatím neuspokojivé.

Růst axonů a Schwanových buněk může být stimulován podáváním růstových faktorů.

Zhodnocení

V případě rozsáhlého poškození periferních nervů či kraniálních nervů nebo spinální míchy je regenerační kapacita malá nebo žádná a výsledek reparačního procesu je značně omezen funkční kapacitou. Naopak malé poškození nervů znamená obvykle zanedbatelný deficit. Závěrem lze tedy říci, že je nutno zlepšit reparaci velkých defektů, ale i u menších lézí by bylo žádoucí zlepšení.

Množství faktorů, které urychlují reparaci tkáně bylo v minulosti již popsáno. Mnoho z nich je odvozeno od nádorových buněk nebo je s touto tkání úzce spjata ( onkogeny). Některé tyto faktory stimulují růst • · ···· · · · · • · · · · · · • · · · · · · « • ··« ·· ·· 7· · · · · · * ··«· · · ·♦ · · nespecifickým způsobem nebo naopak specificky urychlují růst určité tkáně nebo orgánu. Porblémem je schopnost některých těchto faktorů indukovat transformaci cílové tkáně a nebo mají vedlejší nežádoucí účinky.

Kritéria pro neurotropní faktory

Neurotropní faktor stimuluje růst nervové tkáně. ^: Pokud má být látka podána jako neurotropní faktor (NTF) podle platné klasifikace musí být splněny podmínky uvedené níže:

1. Neuron, na, který působí NTF , by měl být schopen použít NTF a měl by mít pro NTF receptor.

2. Neuron by měl být vitální v přítomnosti NTF a v jeho nepřítomnosti by měl zahynout.

3. Mechanizmus syntézy NTF je přítomen v cílové buňce nebo v jiných buňkách, které jsou s neuronem v kontaktu.

4. NTF má podporovat běh těchto procesů, které probíhají ve specifických skupinách buněk, které splňují 1. kritérium.

• · • ·

Podstata vynálezu

S-lOOb jako neurotropní faktor

Rodina S-100 , to je S-lOOa, S-lOOb, S-100L, S100G, calpacin LC, calcyn a calbidin 9K jsou malé molekuly kyseliny, vápníku vázajícího proteiny , které se účastní regulace buněčného cyklu, buněčně diferenciace a interakcí cytoskeletu s buněčnou membránou. Originální S-100 molekula byla objevena apřed 30-ti lety a byla pojmenována podle své rozpustnosti v síranu amonném. S-100 má tři generické formy: S-lOOaO, S-lOOa a S-lOOab, které jsou tvořeny podjednotkami alfa-alfa, alfa-beta a beta-beta. S-lOOb domény převládají v lidském mozku a jsou jediným zástupcem S-100 proteinu v mozku krysy. Přítomnost či nepřítomnost S-100 v neuronech jsou kontroverzní otázkou již 20 let. Jedna teorie předpokládá, že během fixace pomocí aldehydu dojde k zamaskování antigenních determinant pro S-lOOb. Nyní byla zjištěna přítomnost S-lOOb pozitivních neuronů v rhombencefalu krysy. Byla použita nová metoda pro expresi S-lOOb antigenu (Yang, Q Hamberger, A. Hyden, H. Wang, S. Stigbrand, T. a Haglid, K.G., S-lOOb má nueronální lokalizaci v zadním mozku krysy prokázaný pomocí specifického antigenu, Brain Res., 696 (1995) 49 61.)

S-100 imunoreaktivita neuronů ve vyvíjejícím se mozku hlodavců byla již popsána v předchozí práci, kde byl kladen důraz na hledání určitých oblastí mozku a/nebo stádia vývoje zvířat. Jen část neuronální populace obsahuje S-lOOb nebo má receptory pro S-lOOb.

Ve vynálezu je popsáno několik metod, které umožňují určit neuron obsahující určitý protein nebo jeho receptor. Je dokázáno, že u krysy je koncentrace S-lOOb v určitých neuronech rostoucí s věkem. Těchto neuronů je podle zjištění poměrně velké množství. U dospělých krys S-lOOb obsahující neurony se nacházejí v mesencefalu, konkrétně v nucleus ruber, nucleus oculomotorius, v mesencefalickém jádru trigeminu a v pons zj . v pontýnních jádrech retikulární formace: orálním, kaudální, ventrální, a v motorickém jádru trigeminu, v medulle oblongatě, zj. v nucleus nn. facialis, vestibularis a v laterálním vestibulárním jádru. V cerebelu je obsažen v cerebrálních jádrech, ve spinální míše, potom v motorických neuronech a konečně v senzorických neuronech spinálních ganglií. Tyto skupiny neuronů reprezentují příklady neuronů, které mohou být ovlivněny léčebně S-lOOb proteinem. Je možné, že i další neurony mohou být touto látkou ovlivněny.

• ·

Neurologické expertizy ukázaly, že velké množství poškození periferních nervů, kraniálních nervů a spinální míchy se hojí neúplně atd. Cílové orgány degenerují nebo následně podléhají fibrotickým změnám. Takovéto komplikace jsou častým handicapem, jako například sociální neschopnost nebo pracovní neschopnost. Nejdůležitítějším problémem biomedicínského výzkumu je již po mnoho let způsob zlepšení regenerace poškození nervového systému.

Podle tohoto vynálezu je zmíněný problém částečně redukován od doby, kdy je používán S-lOOb protein k indukci reparace NS. Podle patentu je S-lOOb protein užíván pro terapii poškozených neuronu, které mají receptor pro S-lOOb protein nebo přímo tento protein obsahuj í.

Vynález se také zabývá použitím S-lOOb proteinu, které byly poškozeny některými chorobami, jako například amyotrofickou laterální sklerosou nebo sklerosou multiplex.

Vynález popisuje také látku, která obsahuje

S-lOOb protein pro stimulaci nervového růstu a pro podporu přežití poškozených neuronů.

Patent obsahuje také látku, která obsahuje S-lOOb protein o 0.1 až 1000 ug/ml v roztoku vody, který může obsahovat i j iné látky.

·· ···· · · ·· · · · ♦ • · ··· ··· • · · · · · · ♦ * · · ··· ···· ··· • · · · ·· ·· · · · · ··

Podle vynálezu by látka měla být podávána infúzně nebo injekčně pomocí miniosmotické pumpy do poškozené oblasti. Neexistují žádné informace, že by S-lOOb měl onkogenní či s onkogeny spojené vlastnosti. S-lOOb je endogenní peptid, který může být produkován známými biotechnologickými metodami. S-lOOb má přesný lokální efekt a je nepravděpodobné, že by měl jiné místb účinku, než kam ho lokálně aplikujeme.

S-lOOb který je uveden výše jako peptid s následujícími aminokyselinovými sekvencemi monomerové podjednotky (beta):

Met Ser Glu Leu Glu Lys Ala Met Val Ala Leu. Ile Asp Val Phe His Gin Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Leu Glu Glu I le Lys Glu Gin Glu Val Val Asp Lys Val Met Glu Thr Leu Asp Glu Asp Gly AspGly Glu Cys Asp Fhe Gin Glu Phe Met Ala Phe Val Ser Met Val Thr Thr Ala Cys His Glu Phe Phe Glu His Glu

S-lOOb redukuje čas potřebný pro nervovou regeneraci. To redukuje funkční a sociální neschopnost pacienta. Doba od nervového poškození do rehabilitace je zkrácena. Tento problém vznilý z muskulární inaktivity a změn ve struktuře kostí a dalších orgánů je minimalizován. Dávka S-lOOb vhodná k podání je uzpůsobena typu, stupni a lokalizaci poškození. Léčba trvá několik dní až týdnů.

Příklady provedení vynálezu

Příklady použití S-lOOb a léčivo obsahující S-lOOb pro lokální podávání krysám, kterým byly dříve poškozeny nervy. Jejich části byly přemístěny (transplantace) a suturou spojeny.

Příklad 1

S-lOOb byl použit o koncentraci 0.5-1000 ug/ml roztoku soli, který byl pufrován 100 mmol fosfátu a měl pH=7.2 . Obsahoval teké 2.5 mmol CaC12.

Příklad 2

S-lOOb byl použit o koncentraci 0.1-1000 ug/ml roztoku hovězího sérového albuminu (BSA) v pufrovaném solném roztoku s 2.5 mmol CaC12.

Příklad 3

S-lOOb byl použit o koncentraci 0.5-1000 ug/ml v solném roztoku, který obsahoval také CaC12·

Příklad 4

S-lOOb byl podán v gelu zhotoveného • · • · · · • · • ·

z hydroxy-methyl-celulózy při koncentraci 25 ug/ml (vyroben v Apoteksbolaget AB, Umea, Sweden).

Příklad 5

S-lOOb byl rozpuštěn v gelu vyrobeném z hydroxy-methylcelulózy o koncentraci 10 ug/ml.

Příklad 6

S-lOOb byl rozpuštěn na koncentraci 2.5 ug/ml v gelu z 3 % hydroxy-methyl-celulózy.

Příklad 7

S-lOOb byl podán osmotřekou minipumpou v koncentraci 0.5-10 ug/ml do oblasti poškozených senzitivních nervů krysy. 10 mm část senzitivního nervu byla transplantována pomocí acelulární, mražené formy tak, aby přemostila proximální a distální pahýly. 12 krys bylo použito jako kontroly a byl jim podán roztok bez S-lOOb. 11 krys dostávalo protein S-lOOb (0.57 ug/h) po 6 dní pomocí Alzetovy osmotické minipumpy. Délka nervové regenerace v acelulárním transplantátu byla detekovéna pomocí tlakového testu. Výsledky jsou uvedeny níže.

Mann-Whitney U pro tlak

Skupiny

U 11.000

U Prime 121.000

Z-hodnota -3.385

P-hodnota 0.0007

Vázaná Z-hodnota -3.391

Vázaná P-hodnota 0.007 # Vázané hodnoty 4

Mann-Whitney Rank Info pro tlak Skupiny

	počet	rank	Mann rank
ha	11	187 .000	17 . 000
kontrola	12	69.000	7 .417

MeanRank hodnoty 17.000 byly získány u krys, které byly léčeny proteinem S-lOOb (nižší tabulka). Příslušné kontroly měly naopak hodnotu 7.417. Poměr těchto dvou čísel ukazuje, že axony, které byly ošetřeny pomocí léku podle prezentovaného vynálezu, rostly 2.3x více než nestimulavané kontroly. Pravděpodobnost testu a jhednoznačnost výsledku je dána p-hodnotou, která je menší než 0.0007.

Léčivo obsahující S-lOOb protein zlepšuje regeneraci a reparaci, ale i přežívání různých typů neuronů. Podle výsledků je stimulován nejenom růst axonů, ale i množství přežívající neuronů je vyšší.

Vynález není omezen uvedenými příklady, ale může být různě uzpůsoben podle pacientových nároků.

Claims (2)

1. Patentové nároky

   1. Použití S-lOOb proteinu pro přípravu léčiva, pro stimulaci růstu a přežívání poškozených neuronu, které obsahuje receptory pro S-lOOb a/nebo obsahuje samotný S-lOOb.
2. 2. Použití S-lOOb podle nároku 1 pro neurony, které byly postiženy chorobou jako je například amyotrofická laterální skleróza nebo skleróza multiplex.