KR20090012327A

KR20090012327A - 중추 신경계 뉴런의 재생을 자극하는 펩타이드 물질, 이를 기저로 하는 약제학적 조성물 및 이의 적용 방법

Info

Publication number: KR20090012327A
Application number: KR1020087028151A
Authority: KR
Inventors: 블라디미르 캬트스케레비취 캬빈손; 이브거니 이오시포비취 그리고리에브; 블라디미르 빅토로비취 말리닌; 가리나 아나토리에브나 리쟈크
Original assignee: 오브체스트보 에스 오그라니체노이 오트베트스트베노스티유 “시아 펩타이즈”
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2009-02-03
Also published as: US8524674B2; WO2007139431A1; DK2024388T3; EA200601580A1; US20090105157A1; EP2024388B1; IL194346A0; KR101289220B1; IL194346A; EP2024388A1; ATE445633T1; RU2301678C1; US20120309688A1; DE602006009848D1; UA91136C2; EA010157B1

Abstract

본 발명은 중추 신경계의 외상의 후유증 뿐만 아니라, 질병, 외상의 치료의 의료적 방법에 관한 것이고, 뉴런 재생을 자극하는 방법으로 사용될 수 있다. 뉴런의 재생을 자극 할 수 있는 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO: I]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌이 제안되었다. 이것의 활성 기저 및 약제학적으로 허용가능한 담체로서 일반식 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO: I]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량을 포함한 모세관 저항성을 증진시키는 약제학적 조성물 또한 제안되었다. 기관 및 조직에서 미세순환 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법이 제안되었고, 이것의 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO: I]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 효과를 달성하기 위한 필요 기간동안 적어도 하루에 한번씩 0.01-100 μg/체중kg 투여량으로 환자에게 비경구적 투여하여 이루어진다.

펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌, 약제학적 조성물, 외상

Description

중추 신경계 뉴런의 재생을 자극하는 펩타이드 물질, 이를 기저로 하는 약제학적 조성물 및 이의 적용 방법{Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application}

본 발명은 중추신경계의 질병, 외상 및 외상 후유증의 치료의 의학적 수단에 관한 것이고, 또한 뉴런 재생을 자극하는 수단으로도 사용될 수 있다.

뇌의 대사 작용과 통합 기능에 효과적인 제제들이 알려져있다: 세레브로리신(Cerebrolysine), 피라제탐(Pirazetam), 엔세파로리세이드(Encephalolysade). 또한 뇌 및 혈액 순환계를 정상화시키는 제제들도 있다: 수투게론(Stugeron), 캐비톤(Cavinton); 정신병리적 증상을 막는 제제들: 메리딘(Meridyne), 아미트리프티린(Amitriptyline); 뇌의 생체전기 활성에 효과적인 제제들: 페노발비탈(Phenobarbital), 콘부렉스(Convulex); 리큐오로다이나믹(liquorodynamic) 장애를 억제하는 제제들: 베로시피론(Veroshpiron), 푸로세미드(Furosemide)(The Comprehensive Russian Encyclopaedia of Medicinal Means, 모스크바, Remedium 출판사, V.2, 2002 (rus.)).

뉴런의 기능적인 활동을 자극하는 합성 펩타이드 제제들도 알려져 있다(러시 아 특허 제 2155063, 1999).

상기 알려진 약제들은 신경계 구조에서 대사 과정의 개선 및 발병 작용에 대한 이것의 저항성 향상으로 이루어진 기능적인 효과 만을 발휘한다.

뉴런 재생의 과정에 효과적인 약제가 종래의 기술에서 발견되지 않았음을 명시할 필요가 있다.

현재, 여러 뇌질환, 외상, 뿐만 아니라 중추 신경계 외상의 후유증이 있는 환자의 수가 계속 증가하고 있어, 이로 인해 뉴런 재생 능력을 지닌 생물학적 활성 펩타이드 물질을 포함한, 새로운 제제군을 생성하는 것이 현재 상당히 중요하다.

본 발명에 따른 펩타이드는 종래의 기술 수준에서는 구조적 유사체를 갖지 않는다.

본 발명은 생물학적 활성을 가지는 새로운 펩타이드를 얻는 작업을 정립하고 해결해왔고, 이것은 뉴런 재생의 자극에서 명백하다.

본 발명의 기술적인 결과는 뉴런 재생을 자극하는 새로운 펩타이드 뿐만 아니라 활성 기저로서 새로운 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 생산으로 이루어져 있고, 이것은 조직 특이 단백질의 합성을 복구에 의해서 뿐만 아니라, 이것의 항산화 효과와 대사작용 및 뉴런의 생체 전기 활동의 정상화에 의해 뉴런 재생을 자극하는데 사용된다.

본 발명은 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌에 관한 것이다.

일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]의 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌은 뉴런의 재생을 자극하는 능력을 보유하고 있다.

본 발명의 다른 면은 뉴런의 재생을 자극하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 이는 이것의 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.

약제학적 조성물은 비경구적 투여를 위한 형태이다.

본 발명의 다른 면은 뉴런의 재생을 자극하는 방법에 관한 것이고, 이는 이것의 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 0.01 - 100 μg/체중kg의 투여량으로, 치료 효과를 얻기 위해 필요한 기간 내내 적어도 하루에 한번 이상 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다.

이 방법에서 약제학적 조성물은 비경구적으로 투여된다.

일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH의 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌을 용액 중에서 펩타이드 합성의 통상적인 방법에 의해 얻어진다.

본 발명을 사용하여 기술적 결과를 달성하려는 목적의 가능성은, 이 분야에 전통적인 방법에 의해 수행된 연구로 얻어진 실험 데이타를 포함하는 실시예에 나타낸 신뢰성 있는 데이타에 의해 확인되었다.

뉴런의 재생 및 통합 기능에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 자극 효과가 펩타이드의 실험 연구에서 밝혀졌다. 펩타이드의 생물학적 활성의 연구는 뇌 및 척수의 외상성 손상과 저산소증 실험 모델에서, 그리고 뇌 손상의 후유증이 있는 환자에서, 대뇌 피질 외식편 편에서 수행되었다.

"약제학적 조성물" 이라는 개념은 상기 새로운 펩타이드를 포함한 여러 의약 형태를 의미하고, 이는 뉴런 재생 자극의 수단으로 의약에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물을 얻기 위해, 활성 기저(활성 물질)로서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 유효량은 약학에서 일반적으로 허용되는 혼합의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어야 한다.

"유효량"이라는 개념은 유능한 전문가의 지식 뿐만 아니라 활성 및 독성의 양적 지표들에 따라 주어진 약제의 형태에서 유효하여야만 하는 활성 염기의 그러한 양의 사용을 의미한다.

담체는 상기 물질의 약제의 형태에 따라, 유기체에 투여하기에 바람직한 여러 형태를 가질 수 있다.

비경구적 투여를 위해, 안정성을 향상시키고 또는 살균성을 유지하는 다른 성분들 또한 첨가될 수 있지만, 담체는 보통 생리 식염수 또는 살균수에 주입된다.

본 발명의 주제가 도면 및 표에 의하여 설명된다.

표 1은 독성 연구에서 기니피그 말초 혈액의 형태학상 및 생화학상의 지표에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다.

표 2는 허혈성이 있는 랫트 대뇌 피질에 단백질의 지방질 과산화물 산화 및 과산화 과정에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다.

표 3은 분리된 하천 가재의 뉴런의 수명에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다.

표 4는 환자의 교정 테스트 성능의 지표에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다.

표 5는 환자의 EGG 알파 지표의 동태에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다.

도면은 대뇌 피질 이식의 진행에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다.

본 발명은 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH의 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 합성의 실시예(실시예 1), 펩타이드의 독성 및 생화학적 활성 연구의 실시예(실시예 2, 3, 4, 5, 6, 7), 및 그 약제학적 특성을 증명하고 치료 효과를 얻을 가능성을 확인하는 펩타이드의 임상적 투여의 결과의 실시예에 의해 설명된다(실시예 8).

실시예 1. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 합성

1. 생산물 명칭: 글루타밀-아스파틸-아르기닌.

2. 구조식:

3. 이온쌍을 제외한 분자식: C₁₅H₂₆N₆O₈.

4. 이온쌍을 제외한 분자량: 418.40.

5. 이온쌍: 아세테이트.

6. 외관: 냄새가 없는 백색의 무정형 분말.

7. 합성 방법: 펩타이드는 다음의 도해에 따라 용액에서 통상적인 합성 방법에 의해 얻어진다:

BOC - tert-부틸옥시카르보닐기,

OSu - N-옥시숙신이미드 에스테르,

DCC - N,N'-디시클로헥실카르보디이미드,

OBzl - 벤질 에스테르,

TFA - 트리플루오르아세트산,

HOBt - N-옥시벤조트리아졸,

Z - 벤질옥시카르보닐기.

최종 생산물의 특성:

· 기본 물질 함량: 98.01 % (HPLC로, 220 nm),

· TLC- 각각, R_f=O.65 (아세토니트릴-물 1:3),

· 수분 함량: 6%,

· 0.01 % 용액의 pH: 4.88,

· 비회전력: [α]_D ²²: -33°(c=l, H₂O), "폴라메트 A", Carl Zeiss Jena.

합성의 실시예:

1) BOC-GIu(OBzl)-OSu, N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타민산 (I)의 N-옥시숙신이미드 에스테르.

N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타민산 BOC-Glu(OBzl)-OH(33.7 r, 0.1 몰)를 N,N'-디메틸포름아미드 50 ml에 용해시키고, -10℃로 냉각시켜; N,N'-디메틸포름아미드 30ml 중의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(23.0 g, 0.11 몰) 및 N,N'-디메틸포름아미드 20 ml 중의 N-하이드록시숙신이미드(13.0 g, 0.11 몰)의 냉각된(4-6℃) 용액의 혼합 과정. 반응물은 얼음으로 냉각된 상태에서, 12시간 동안 교반하였고, 그 다음 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 잔여물 N,N'-디시클로헥실우레아를 여과시키고, 활성 에테르의 얻어진 용액은 다음 단계에서 추출없이 사용된다.

2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타밀-(β-벤질)아스파르테이트 (II).

(β-벤질)아스파라긴산 H-Asp(OBzl)-OH (28.0 g, 0.12 몰) 및 트리에틸아민 36 ml (0.12 몰)을 N,N'-디메틸포름아미드 50 ml에 현탁시키고 한 시간동안 교반시킨다. 그다음 여기서 이전단계에서 얻은, 활성 에스테르 BOC-Glu(OBzl)-OSu (I)의 용액을 비율로 첨가한다. 반응물을 48시간 동안 실온에서 교반시킨다. 그 다음 pH2-3이 될 때까지 0.5N 황산으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 4x50 ml로 추출시킨다. 이어서 추출물을 0.5N H₂SO₄ 3x50 ml, 물 2x50 ml, 5 % NaHCO₃ 용액 2x50 ml, 물 2x50 ml, 포화 NaCl 용액 2x50 ml에 세척시킨다. 유기층은 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매는 진공 하에서 제거되고, 잔여물은 헥산에서 결정화된다. 생산물의 50 g이 얻어진다(92%). R_f= 0.34(벤젠-아세톤 2:1).

3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타밀-(β-벤질)아스파틸 아르기닌 (III).

아르기닌 하이드로클로라이드 HCl H-Arg-OH 2.4 g(10 mmole)를 디메틸포름아미드 10 ml에 현탁시키고 24시간 동안 교반시킨다. 보호된 펩타이드(II) 2.4 g(4.4 mmole) 및 옥시벤조트리아졸 0.8 g(6 mmole)은 디메틸포름아미드 10 ml에 개별적으로 녹이고 -10℃까지 냉각시킨다. 그 다음 같은 온도로 냉각된 디시클로헥실카르보디이미드 1.25g(6 mmole)의 용액을 디메틸포름아미드 5ml에 첨가시킨다. 활성 에스테르가 20분 동안 얻어지고, 그 다음 아르기닌 침전물을 얻은 제제에 첨가시켜 실온에서 48시간동안 교반시킨다. 부산물 디시클로헥실우레아는 여과시켜버리고, 여과액은 pH 3이 될때까지 0.5 N 황산으로 산성화시킨다. 추출물은 물로 포화된 n-부틸 스피릿 3x20ml을 사용하여 수행된다. 추출물들을 함께 붓고 물로 세척시키고, 유기 용매는 진공에서 제거시킨다. 잔여물은 에스테르 내에서 결정화된다. 재-결정화는 이소프로필 스피릿에서부터 수행되고, 후에 혼합물은 KOH로 건조시킨다.

생산물 800mg이 얻어진다(26%). R_f=0.87 (n-부탄올-물-아세트산, 4:1:1).

4) H-Glu-Asp-Arg-OH (IV), 글루타밀-아스파틸-아르기닌.

보호된 트리펩타이드 BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg-OH(III) (0.80 g)를 메틸 스피릿-물(4:1)의 혼합물에 용해시키고 4시간 동안 촉매 Pd/C (5%)로 수화시킨다. 촉매는 여과되고, 용매는 진공 하에서 제거시키고, 잔여물은 KOH 및 P₂O₅로 진공에서 건조시킨다. 그다음 생산물은 아염소 메틸렌-트리플루오르아세트산(5:1) 혼합물 2ml에 용해되고 2시간 동안 실온에서 유지시킨다. 탈봉쇄 반응의 완료도는 아세토니트릴-물 시스템(1:3)에서 TLC에 의해 조절된다. 용매는 진공 하에서 제거되고, 잔여물은 진공에서 KOH로 건조시킨다.

제제 300 mg을 정제하기 위해 0.01% 트리플루오르아세트산 4 ml에 용해시키고 역상 칼럼 50x250 mm Diasorb-130-C16T, 7 μm상의 고생산성의 액상 크로마토크래피를 거친다. 크로마토그래피 Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. 크로마토그래피의 조건: A: 0.1% TFA; B: MeCN/0.1% TFA, 100분동안 구배 B 0 → 50%. 샘플양 5 ml, 215 nm에서 검출, 스캐닝 190-600 nm, 유량 10 ml/min. 분획은 37.0-42.0 분 동안 선택된다. 용매를 40℃ 이하 온도의 진공 하에서 제거되고, 제거는 10% 아세트산 용액 10 ml로 여러 번(5번) 반복된다. 최종적으로 잔여물을 탈이온수 20 ml에 용해시키고, 동결건조 시킨다.

냄새가 없는 무정형 백색 분말 형태의 정제된 물질 120 mg을 얻는다.

5) 준비된 물질의 분석

· 기본 물질 함량은 칼럼 Phenomenex C 18 LUNA 4.6x150 mm에서 HPLC에 의 해 확인된다. A: TFA 0.1 %; B: MeCN; 10분에 구배.B 0-100%. 유속은 1 ml/min이다. 220 nm에서 검출, 190-600 nm에서 스캐닝, 샘플 양은 20 μl이다. 기저 물질 함량 - 98.15 %.

· TLC: 개별, R_f=O.65 (아세토니트릴/물 1:3, 소르브필(sorbfil) 플레이트, 실리카겔 8-12 μm, 염소/벤지딘에서 전개).

· 수분 함량: 6 % (중량변화에 의해, l00°C에서 20 mg, 건조에 의한 질량 손실에 따라 판단).

· 0.01 % 용액의 pH: 4.88 (전위차적으로)

실시예 2. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH 독성의 연구

펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 일반적인 독성은 "새로운 약제학적 물질의 실험적(전임상)연구를 위한 방법(Manual for experimental(pre-clinical) study of new pharmacological substances)"(2000)에서 명시한 요건에 따라 연구되었다: 물질의 단일 투여 경우의 급성 독성 및 펩타이드의 장기 투여 경우의 아급성 및 만성 독성.

급성 독성의 연구는 체중 20-22 g의 백색 잡종 수컷 마우스 72마리에 수행되었다. 동물들은 6 개의 동등한 그룹으로 무작위로 나뉘었다. 물질은 살균한 0.9% NaCl 용액 0.25 ml 중 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg의 투여량으로 동물에 한번씩, 근육 내에 투여되었다. 대조 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같 은 양으로 투여받았다.

아급성 독성의 연구는 체중 160-210 g의 백색 잡종 수컷 마우스 65마리에 수행되었다. 실험 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액 0.5 ml 중 1 μg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg의 투여량을 90일 동안 매일 근육내에 투여받았다. 대조 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같은 양으로 투여받았다. 동물들의 말초 혈액의 형태 및 특성은 물질의 투여시작 전, 그리고 투여 시작 후 30 일, 60 일, 90 일에 연구되었다. 또한 실험이 완료될 때, 혈액의 생화학 및 응고 지표도 측정되었다.

만성 독성의 연구는 체중 270-310 g인 84마리의 수컷 기니피그에서, 물질의 권고된 임상 투여를 기반으로 6개월 동안 수행되었다. 실험 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액 0.5 ml 중 펩타이드를 1 μg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg의 투여량으로 6개월 동안 하루에 한번씩 매일 근육내에 투여받았다. 대조 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같은 양 및 같은 일정으로 투여받았다. 동물들의 말초혈액에 대한 다음의 지표에 대한 평가에 전통적인 방법들이 사용되었다: 적혈구 수, 헤모글로빈 수, 망상 적혈구 수, 혈소판 수, 백혈구 수, 백혈구 형태, 적혈구 침강속도(ESR), 적혈구 내성의 양. 그것과 함께, 혈청 내 전체 단백질의 함량은 플라즈마 분광법을 이용한 칼륨 및 나트륨 함량 뿐 아니라, Lowry 방법을 이용하여 확인되었다. 실험이 완료되자마자 동물의 뇌, 척수, 척수 신경절, 갑상선, 부갑상선, 부신, 고환, 뇌하수체, 심장, 위, 동맥, 간, 신장, 방광, 췌장, 위, 소장, 대장, 가슴샘, 비장, 림프절 및 골수의 병리형태학적 연구가 수행되었다.

급성 독성의 연구는 임상 투여에 권장되는 치료 투여량을 5000배 이상으로 초과하는 양으로 동물들에게 연구된 펩타이드를 단일 투여하는 것이 독성 반응을 나타내지 않는다는 것을 나타냈고, 이는 물질의 가능한 치료 투여량의 전범위를 가리킨다.

펩타이드의 아급성 및 만성 독성의 연구는 치료 투여량을 100-1000배 초과하는 양으로 물질을 장기 투여하는 경우 부작용이 없음을 나타내었다. 물질 투여 시작 후 3 및 6 개월에 기니피그 혈액 형태 및 생화학적 지표에 대한 펩타이드 효과의 연구는 연구된 지표에서 통계학적으로 유의적인 변화가 없음을 보여주었다(표 1).

동물들의 일반적인 상태의 평가, 말초 혈액의 형태학적 및 생화학적 지표의 평가, 기간의 형태학적 상태의 평가, 심혈관계 및 호흡계의 상태의 평가, 또한 간과 신장의 기능의 평가는 유기체에서 병리학적 변화를 나타내지 않았다.

통상적 독성의 부재는 임상 연구에, 활성 기저로서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 권장한다.

실시예 3. 대뇌 피질 이식의 발달에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과

체중 150-200 g의 Wistar 랫트의 대뇌피질의 32개 단편으로 연구가 시행되었다. 외식편 배양을 위한 영양 배지는 글루코즈 (0.6%), 인슐린 (0.5 units/ml), 페니실린 (100 units/ml), 글루타민 (2 mM)의 첨가와 함께, 35% Eagle 용액, 25% 송아지 태아 혈청, 35% Hanx 용액, 5% 병아리 배아 추출물로 이루어졌다. 대뇌 피질 파편을 배지에 두고 48시간동안 36.7℃의 온도에서 항온기 내의 페트리 디쉬에서 배양시켰다. 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH는 1, 10, 및 100 ng/ml의 최종 농도로 배 지에 첨가시켰다.

면적 지표(AI), 즉 성장 지역과 함께 전체 외식편 면적 대 대뇌피질 단편의 초기 면적의 비가 생물학적 활동의 척도로 제공되었다. 대조된 평균 AI 값 사이의 차이의 통계적인 중요성은 스튜던츠 티-기준(Student's t-criterion)법을 사용하여 평가되었다. AI 값은, 대조 AI 값을, 100%로 간주하여 백분율로 나타내었다.

조절 피질 외식편 성장 면적은 짧은 신경돌기와 외부 신경교 세포 및 섬유아세포들로 이루어졌다.

도면은 대뇌 피질 이식의 발달에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타낸다.

배양 24시간 후 외식편이 콜라겐 물질 상에 펴졌고, 증식 및 이동 세포는 외식편 면적 주위에 퍼지기 시작하는 것이 발견되었다. 10 ng/ml을 만드는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 경우 배양 제3일 경 대조 AI 지표와 비교하여 통계적으로 유의적인 37%의 AI 성장이 관찰되었다. 배양 7일 후 대뇌 피질의 연구는 동일한 농도의 경우 신경돌기 자극 효과가 같음을 나타내었다. 때때로 이식의 AI에서 통계적으로 무의미한 감소가 발견되었고, 이는 아마도 장기 배양 기간의 경우 신경 섬유의 수축 때문이다.

얻어진 결과들은 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 신경돌기를 자극하는 활성을 확인하였다.

실시예 4. 두개골 외상 후 랫트의 대뇌 피질에서 회복 과정에 대한 펩타이드 H-Glu-Arg-OH의 효과

뇌의 회복 과정에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과는 급성 중중의 머리 외상의 패턴에서 측정되었다. 중추 신경계의 직접적인 회복 기능은 동물들의 협응 운동 및 근육 긴장도, 그리고 조건 반사 습관을 학습하고 재현하는 능력에 의해 확인되었다.

24마리의 백색 잡종 랫트는 떨어진 납 분동에 의한 강한 압박의 두개골 외상(cranial trauma)을 입었다. 1, 12, 48 및 96시간에 15마리의 실험용 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액의 0.5 ml에 10 μg/kg의 투여량의 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 매일 근육내에 투여받았다. 대조 동물들은 같은 용량 및 같은 일정으로 살균한 생리적 식염수를 투여받았다.

학습하고 습관을 재현하는 랫트의 능력을 조건 활성 회피 반사(CAAR)의 테스트를 사용하여 측정하였다. 근육 긴장과 협응 운동은 속도를 증가시키면서 랫트를 막대기에서 회전시키고 그들이 막대기를 잡는 시간을 측정하여 테스트되었다.

외상 후 48시간에서, 생존한 모든 동물들은 학습할 수 없었다. 외상 후 96시간에서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH로 치료받은 랫트의 그룹에서 학습할 수 있는 동물의 수는 대조군보다 2배 이상 컸다. 30일에서, 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH로 치료받은 랫트의 학습 능력의 지표 또한 대조군보다 더 높았다.

중증 두개골 외상은 무능력-신경증 증후군 및 협응과 근육 긴장을 현저히 감소시켰다. "회전하는 막대기" 테스트는 외상 후 48시간에서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 협응 운동 및 근육 긴장을 얻는 것에 기여함을 나타냈다(막대기를 잡는 시간이 대조군 보다 2배 이상 더 길었다).

따라서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 투여는 동물들의 조건 반사 습관을 학습하고 재현하는 능력 뿐만 아니라 근육 긴장 및 협응 운동 정상화의 상당한 향상을 가능하게 한다.

뉴런 재생을 자극하는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 능력은 외상 후 다섯 번째 날에 이미 밝혀졌고, 동물들의 학습 능력의 열네번째 날 지표는 정상 값에 가까웠다.

급성 중증 두개골 외상은 뇌 회백질 뉴런 개체군의 손상과 사멸을 일으킨다. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과 하에서 초기 외상 후의 중추 신경계 기능의 급속한 회복은 뇌에서 회복과정을 자극하는 펩타이드의 능력을 확증한다.

실시예 5. 척수 외상의 경우 랫트의 중추신경계에서 형태학적 변화에 끼치는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과

연구는 체중 180-200 g의 성숙한 Wistar 수컷 및 암컷 랫트로 수행되었다. 27마리 랫트의 실험 그룹은 척수 외상을 겪었다.

동물들은 다음의 방법에 따라 척수의 요수분절(lumbar segment)에 손상을 입었다. 마취된 랫트의 마지막 갈비뼈의 척추의 측표면을 작업 표면에 무수 핀셋(dressing forceps)을 사용하여 15kg의 힘으로 피부를 통해 압축시켰다. 외상 후 24시간에 살아남은 동물들은 두개의 그룹으로 다시 나뉘었다.

첫번째 그룹의 동물들은 10일 동안 살균한 0.9% NaCl 용액 0.5 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 10 μg/kg의 투여량으로 매일 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. 두번째 그룹의 랫트(대조군)들은 살균한 생리 식염수를 같은 양으로 투여 받았다.

신경조직 연구는 실험 제30일에 두 그룹의 동물들에게 수행되었다. 이를 위해 척수 신경절을 손상 지점 및 상기 손상된 지점 뿐만 아니라 척수의 요추 및 경부와 뇌의 운동 피질 파편 및 추체로(pyramide tract)로 부터 취하였다. 신경조직 연구는 전자 및 광학(luminous) 현미경을 사용하여 수행되었다.

광학 현미경 용 샘플을 96% 스피릿과 10% 포르말린에 고정시키고, 셀로이딘에 채우고 이어서 헤마톡실린-에오신으로 뿐만 아니라 니슬(Nissle), 반 기손(Van Gison), 웨걸트(Weigert), 스피엘메얼(Spielmeyer)로 염색하였다. 샘플들을 샘플의 조직학적 가용 및 염색의 통상적인 방법에 따라 고정하고 절단하였다.

전자현미경 용 샘플을 카코딜레이트 완충액과 2% 오스뮴산으로 고정시키고, 그 다음 Epon 812에 채우고 Reynolds에 의해 질산납에서 대조시켰다. 샘플의 예비 평가는 준미세 조각을 사용하여 수행되었다. 초미세 조각은 전자 현미경 UEM-IOOSKh를 사용하여 연구되었다.

척수 외상이 있는 모든 랫트들은 손상 지점의 뉴런에서 병리병태학적 변화를 나타냈다. 이러한 변화는 범위가 다양했다. 뉴런의 부분이 축삭반응을 보였다. 이런 경우에서 세포들은 부풀었고, 이들의 선은 매끄러워졌다. 니슬 종기는 주요색에 의해 창백하게 얼룩지면서 마치 분진같은 파편으로 감소되는 것처럼 보였다. 핵질은 만개되었고, 핵은 말초쪽으로 탈구되었다. 뉴런의 상당한 부분이 오그라들었다. 이런 경우 세포는 좁아지고 모난 선 모양으로 융기된다. 염색체의 덩어리들은 진하게 착색되었고, 핵 또한 그러했다. 핵은 거의 눈에 보이지 않았다. 신경 세포의 일 부는 허혈 변화를 나타내었다. 이들의 세포질에서 갑상선 물질은 상당히 방출되었고, 이러한 세포에서 핵은 과염색성에, 크기가 약간 감소하였고, 몇몇 경우에서 핵은 분리 덩어리로 붕괴되었다. 때때로 강렬한 색상의 작은 낟알의 형태에서 입자들이 덩어리 및 부가물 근처(골지 망의 세포주위 외피) 뉴런의 말초에서 발견되었다. 대부분의 경우에서 뉴런은 부종성 변화가 있었다. 이러한 뉴런의 니슬의 물질은 세포질의 말초에서 좁은 코일처럼 보였다. 세포체의 선은 분해된 것으로 보인다. 빛나는 코일의 형태의 세포질이 녹은지점이 핵 주위에서 확인되었다. 몇몇 뉴런은 심하게 변하였다. 세포체는 균일하지 않는 염색질 융해를 가지고 부푼 것으로 보였다. 뉴론 부속물의 긴 조각은 착색되었다. 몇몇 세포들은 마치 "먹히는" 것처럼 보였다. 이들은 여러 크기 및 불규칙적인 모양의 액포의 형태의 착색되지 않는 지점을 나타냈다. 덜 빈번히, 뉴론은 신경포식현상(neuronophagia)의 징후를 나타내는, 비대성 신경교 요소를 나타냈다. 핵 병변은 핵의 크기가 줄어들고, 현저한 하이퍼크로마토시스를 갖는 핵소체를 거의 식별할 수 없는 이런 유형의 변형을 특징으로 한다. 몇몇 뉴런은 심하게 부풀은 형태로 변했다. 이런 경우 세포체는 부푼 것처럼 보였다. 핵들은 확대되고 발산적으로 착색되었다. 세포질은 밝은 푸른 빛으로 균일하게 착색된 작은 낟알의 물체를 나타냈다. 병변 지점의 몇몇 지역에서 강한 파괴 과정이 신경 세포 사이의 틈에, 특히 작은 틈이 오히려 일반적인 척수의 전방 "각"에 존재하였다. 뉴런이 사라지는 몇몇 지점에서, 신경교 세포 증식이 관찰되었다. 척수의 전방 "각"의 신경세포가 더 잘 유지되었다. 신경 섬유의 분산된 탈수초의 신호가 후방 척수 대동맥의 복부 부분 및 전방-측면 척수 대동맥에서 관찰되었다. 백색 물질 부종의 형태의 해면화 초점들 또한 존재하였다.

상기 형태학적 상황은 두 실험 그룹의 랫트에서 관찰되었다. 그러나, 대조군 랫트는 그들의 척수에서 주요하게 "주로 자극되는" 세포를 가지는 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH를 처리한 랫트와 비교하여, 훨씬 더 "심한" 경우 및 뇌허혈성 뉴런의 변화를 나타냈다.

모든 동물들은 성상세포 신경교, 특히 섬유증 성상 세포의 활성 증식을 나타내었다. 세포는 피크노형상의 핵과 부산물이 없는 균질한 세포질의 기형이었다. 실험 동물들은 좀더 활성인 올리고덴드로글리아 과형성을 나타내었다. 복합적인 외상 형태가 그것의 세포 사이에서 발견되었다. 소교세포 요소는 신경교 부산물 분열의 징후와 함께 적당하게 증식되었다.

액손 변성의 형태의 세포 변이가 척수의 위쪽 부분에서 및 대조 동물의 뇌에서 발견되었다.

전자 현미경은 척수 외상이 있는 랫트에서 뉴런, 그들의 부산물, 신경교 요소 및 혈관에서 라디칼 변이를 드러냈다. 뉴런의 세포질은 소포 망 통로, 부푼 골지체 저장소, 다수의 술 모양의 공동과 크고 작은 리소좀(lysosome)의 감소된 양을 나타냈다. 가시적 크리스타 없이 조밀한 매트릭스를 갖는 어두운 마이토콘드리아가 그 상황의 특징이다. 말초 신경 세포는 바람직하기는 리보솜에서 유도된 부푼 과립의 소포 망 통로에 의해, 줄무늬가 있는 크고 어두운 지질, 또한 큰 액포, 즉 다소포체(multivesicular corpuscles) 형성을 나타냈다. 조밀한 핵막 근처의 강하게 만들어진 응집이 형성된, 염색질의 분해는 몇몇 뉴런의 핵에서 확인되었다. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH로 처리한 랫트는 뉴론 세포 세포질에서 회복되는 징후를 나타내었다. 다량의 유리 리보솜 및 폴리리보솜과, 또한 과립 소포 세포의 짧은 프로파일 저장소가 발견되었다. 팽창의 징후없이 다수의 작은 골지 저장소의 수가 증가하였다. 세포 말초는 오직 투명한 단일의 액포와 어두운 소체들(corpuscles)을 나타내었다.

모든 동물들은 마엘린 분열, 회복, 내부 중추 실린더의 압축 형태의 상당히 변한 마엘린 섬유를 나타냈고, 결과적으로 크고 밝은 공간의 존재를 보였다. 실험 랫트는 특정 마엘린 섬유의 회복된 동종을 나타내었다.

시냅스의 변이는 후-시냅스 형성의 실모양의 퇴화로 나타났다. 실험 랫트는 정상 (덴드로-덴드라틱) 시냅스의 상당히 큰 영역을 나타내었다.

실험 동물의 상위 척수 부분은 신경 세포 및 그들의 부산물에서 비슷한 변이를 나타내었다. 뉴런은 기능적 긴장의 증상을 나타내었다. 세포 세포질은 많은 수의 리소좀을 가졌지만, 몇몇 마이토콘드리아에서는 크리스타가 보이지 않았다. 골지체는 적당하게 부풀어 보였다. 핵질은 세포 핵에서 염색질의 극도로 조밀한 위치때문에 응축되었다. 신경 섬유는 적당한 마엘린 박리작용과 중추의 실린더 압축을 나타냈다.

상기 변이는 H-Glu-Asp-Arg-OH 펩타이드를 처리한 랫트에서 덜 심하였다. 핵질은 정상으로 보였고 더 균일한 골지 저장소를 가졌다. 소포 망 통로는 그들의 이용을 위한 폐기 기관(waste organoid)의 잔여물을 포함하는 큰 액포를 형성하였다. 그러나, 세포 세포질은 여전히 과도한 리소좀 뿐만 아니라 무작위로 위치한 크리스 타와 함께 부푼 마이토콘드리아를 나타냈다. 마엘린 섬유는 매우 많은 경우에서 정상적 외관을 가졌다.

이와 같이, 척수 외상이 있는 동물에게 H-GIu-Asp-Arg-OH 펩타이드의 투여는 척수 뉴론 재생을 자극하는 효과를 나타내었다.

실시예 6. 저산소의 경우에 랫트 대뇌 피질에서 자유 라디칼 산화 반응의 강도에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과

18마리의 백색 잡종 랫트에서 연구가 수행되었다. 살균한 0.9% NaCl 용액 1.0 ml 중 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH를 1 μg의 투여량으로 10일 동안 하루에 한번씩 동물들의 근육내에 투여되었다. 동물에 펩타이드의 투여가 끝난 후 24시간에 저산소성 저산소증(hypoxic hypoxia)에 걸렸다. 저산소증은 상기 해발 9000m의 고도에 일치하는 0.029MPa인 흐름-배출기 유형의 감압기(altitude chamber)에서 만들어졌다. 압축과 감압률은 분당 0.005 MPa로 만들었다. 이산화탄소 및 수분 흡수제가 감압기에 존재하였다. 동물들은 자유 수행 및 지속적인 관찰 하의 조건에서 3시간 동안 챔버에서 유지되었다.

과산화 지질 산화(POL)의 강도는 뉴론 손상에서 중요한 역할을 하고 있는, 초기 POL 생산물, 즉 디엔 접합체, 및 최종 생산물, 즉 쉬프 염기 수준을 판단함으로써 평가되었다. 단백질 과산화물의 수준은 2,4-디니트로페닐히드라신과 상호작용 후 단백질에서 카르보닐 유도체 아미노산의 수준에 의해 평가되었다.

H-GIu-Asp-Arg-OH 펩타이드가 대뇌 피질에서 POL 생산물 생성을 억제하는 것이 발견되었다. 펩타이드는 디엔 접합체의 수준의 통계적으로 상당한 감소와 쉬프 스 염기 함량의 감소를 야기했다. 펩타이드는 또한 POL(표 2)과 함께 단백질 과산화물을 억제했다.

데이타는, 저산소의 영향을 받은 동물에게 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 투여가 POL 생산물의 생산 및 대뇌 피질에서 단백질 과산화를 억제한다고 나타냈다.

실시예 7. 가재(crayfish Astacus) 렙토닥틸루스의 분리된 뉴런의 수명에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과

가재의 수명에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 인비트로 연구를 위해 가재 렙토닥틸루스의 분리된 뉴론을 아폽토시스에 의한 세포사멸의 모델로 여겨지는 절단(axotimia)으로 추출하였다.

가재의 펴진 수용체 뉴론은 그들의 전기생리학, 생물학 및 구조적 특성에 의해 척수의 중앙 뉴론과 근접하게 닮았다. 이들은 10-15시간 동안 거의 변함없는 속도와 함께 스파이크를 만든다. 복절에서 추출한 두개의 대칭적인 뉴론(대조 및 실험)은 Harreveld 용액 2 ml로 채운 챔버에 두었다. 뉴론 전위(Neuronal potentials)는 고정된 유리 파이펫 전극봉으로 신경돌기에서 세포 밖으로 기록되었고, 그 다음 H-338 기록계를 사용하여 증폭되고 기록되었다. 동시에 활동 전위의 주파수를 두개-채널의 아날로그 주파수 측정기 및 H-339 데이타 기록계를 이용하여 기록되었다. 실험 초기에는 실험과 대조 뉴런의 자극 주파수를 근육 이완에 의해 10-15 Hz의 수준에 맞춰졌다. 일정한 속도의 안정한 스파이크 생성 1시간 후 10 μg/ml의 농도에서 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH를 실험 챔버에 첨가시켰다. 뉴론의 활성은 스파이크 생성의 자연스런 종결 전에 지속적으로 기록되었다. 뉴런의 수명은 각각의 쌍에 대해 비교하였다. 뉴런의 10쌍 모두가 사용되었다.

정해진 주파수에 의해 비교적 안정한 작업 8-10시간 후 분리된 뉴런 자극의 자연스런 종결이 가는 수초길이의 주파수 변동의 형태로 일어났고, 그 후 수분의 더 느린 리듬이 나타났다. 활동 전위의 평균 주파수는 감소되었고, 그리고 나서 특정 자극이 떨어지기 시작했고, 맥동이 무질서해지고 곧 사라졌다.

본 연구는 H-GIu-Asp-Arg-OH 펩타이드가 분리된 뉴런의 수명을 15%까지, 평균 11.9 내지 13.7 시간으로 연장시키는 것을 밝혀내었다(표 3).

펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과 하에서 뉴런의 지체된 사멸은 전기생리학적인 막 과정 및 내부세포 대사과정에 그것의 영향과 관련있는 펩타이드의 신경세포 보호효과를 확인한다.

실시예 8. 두개골 외상이 있는 환자에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효능

본 연구는 무작위하게 두개의 그룹으로 다시 나뉜, 두개골 외상의 후유증이 있는 31-60세의 25명 환자에게 수행되었다. 이러한 환자들은 1 내지 10년 전에 두개골 외상을 겪었다. 주요 그룹의 환자들은 두개골 외상의 심각성에 따라 3개의 그룹으로 다시 나뉘었다. 두개골 외상이 가장 심각한 후유증이 있는 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액 1 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 포함된 약제학적 조성물을 5.0 mg의 투여량으로 10일 동안 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. 중간정도 심각성의 두개골 외상 후유증이 있는 주요 그룹 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액 1 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 포함된 약제학적 조성물을 10.0 μg의 투여량 으로 10일 동안 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. 가벼운 심각성의 두개골 외상 후유증이 있는 주요 그룹 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액 1 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 포함된 약제학적 조성물을 1.0 μg의 투여량으로 10일 동안 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다.

대조 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같은 양 및 같은 일정으로 투여 받았다.

펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 투여는 전체 환자 수의 59.4%에서 좋은 임상적 결과를, 31.9%에서 만족한 결과를, 8.7%에서 긍정적이지 않은 효과를 야기했다. 어느 환자의 상태에서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 부정적인 효과는 기록되지 않았다. 환자들은 기억력 증진, 두통의 강도 및 지속시간의 감소, 더 나은 기분적 안정성, 뿐만 아니라 야간 수면 후 휴식을 취한 느낌을 보고했다.

H-Glu-Asp-Arg-OH 펩타이드를 포함한 약제학적 조성물의 효능은 뇌의 통합 기능에서 효과, 즉 주의력, 및 정확한 테스트 및 뇌파도를 사용한 뇌의 생체전기 활성에 의해 판단하여 측정되었다.

여러 투여량의 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물로 처리된 주요 그룹의 환자들은 등록된 특징의 수가 통계적으로 상당히 증가했고, 뿐만 아니라 보정 테스트에서 오류의 수도 감소됨을 나타내었다(표 4).

여러 투여량의 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물로 처리된 환자들은 대조군와 비교하여 처리 전 및 후 보정 테스트 수행 역학의 분석에서 더 나은 결과를 나타내었다. 이것은 같은 기간동안 기록된 징후의 수에서 급격한 변동이 없고, 테스트의 마지막 곡선의 점진적인 감퇴와 테스트 중간까지의 "적응"기간이 있는 것으로 명백한데, 이것은 주요 그룹 환자의 주의력의 더 나은 안정성을 지적한다.

뇌의 생체전기 활성에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 효과의 평가는 치료 전 후 알파 지표의 산출에 의해 수행되었다. 뇌의 생체전기 활성의 가장 현저한 변화는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물로 처리한 후 주요 그룹의 환자들에게서 발견되었다-알파 지표의 상당한 증가가 처리의 결과로 발생했다(표 5).

이와같이, 데이타는 뉴론 재생 자극에 의한 두개골 외상의 후유증이 있는 환자에게서 뇌 세포의 통합 기능에 대해 이것의 활성 기저로서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 효능을 확인한다.

* 대조군과 비교하여 -P<0.05

* 대조군와 비교하여 -P<0.01

* 대조군와 비교하여 -P<0.05

* 치료 전 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.05

# 일반적으로 사용되는 약제로 치료한 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.05

* 치료 전 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.01

# 일반적으로 사용되는 약제 치료한 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.05

SEQUENCE LISTING <110> Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostyu "SIA PEPTIDES" <120> Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application <130> 24-00359RU <150> 2006118494 <151> 2006-05-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide compound H-Glu-Asp-Arg-OH stimulating central nervous system neurons regeneration by means of restoring the synthesis of tissue specific proteins, antioxidant effect, normalization of metabolism and bioelectric activity of neurons. <400> 1 Glu Asp Arg 1

Claims

일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌.
뉴런의 재생을 자극할 수 있는, 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌.
활성 기저 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 뉴런의 재생을 자극하는 약제학적 조성물로 상기 조성물은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 비경구적 투여를 위한 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
중추 신경 시스템 뉴런 재생의 자극 방법으로, 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌을 포함하는 조성물을 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 기간동안 하루에 한번 이상 0.01-100 μg/체중kg의 투여량으로 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제5항에 있어서, 상기 투여가 비경구적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.