EA010157B1 - Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний, травм, а также последствий травм центральной нервной системы и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию нейронов. Предлагается фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию нейронов, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель. При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения. Предлагается пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы H-Glu-Asp-Arg-ОН последовательности 1 [SEQ ID NO:1], обладающий способностью стимулировать регенерацию нейронов, а также применение этого пептида для приготовления лекарственного средства, обладающего способностью стимулировать регенерацию нейронов. Предлагается способ стимулирования регенерации нейронов, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. При этом введение осуществляют парентерально.

Description

Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний, травм, а также последствий травм центральной нервной системы и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию нейронов.

Известны препараты, оказывающие влияние на метаболизм и интегративные функции мозга: церебролизин, пирацетам, энцефалолизад; обеспечивающие нормализацию мозгового и системного кровообращения: стугерон, кавинтон; направленные на купирование психопатологических проявлений: меридин, амитриптилин; обладающие способностью изменять биоэлектрическую активность головного мозга: фенобарбитал, конвулекс; воздействующие на ликвородинамические нарушения: верошпирон, фуросемид (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002).

Известен синтетический пептидный препарат, стимулирующий функциональную активность нейронов (патент РФ № 2155063, 1999 г.).

Известные средства обладают только функциональным воздействием, а именно улучшают метаболические процессы в структурах нервной системы и повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям.

Необходимо отметить, что средства, обладающие свойством воздействовать на процесс регенерации нейронов, в уровне техники не обнаружены.

В настоящее время продолжает увеличиваться число пациентов с различными заболеваниями головного мозга, травмами, а также последствиями травм центральной нервной системы, поэтому актуальна разработка новых групп препаратов, в том числе биологически активных пептидных соединений, обладающих свойством регенерировать нейроны.

Структурных аналогов, представленных в уровне техники, предлагаемый пептид не имеет.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения пептида, который обладает биологической активностью, проявляющейся в стимулировании регенерации нейронов и фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, а также способа ее применения.

Технический результат изобретения заключается в создании пептида, стимулирующего регенерацию нейронов, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует регенерацию нейронов за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков, антиоксидантного действия, нормализации метаболизма и биоэлектрической активности нейронов.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Одним из объектов предложенной группы изобретений является фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию нейронов, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН последовательности 1 |8ЕО ГО N0:1] и фармацевтически приемлемый носитель.

При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.

Другой аспект настоящего изобретения касается пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН последовательности 1 |8Е0 ГО N0:1], обладающего способностью стимулировать регенерацию нейронов.

Предлагается применение пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН последовательности 1 |8Е0 ГО N0:1] для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию нейронов.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа стимулирования регенерации нейронов, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН последовательности 1 |8Е0 ГО NО:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

При этом введение осуществляют парентерально.

Пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Стимулирующее действие пептида Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН на регенерацию и интегративные функции нейронов выявлено при его экспериментальном изучении. Изучение биологической активности пептида проводили на эксплантатах коры головного мозга, в экспериментальных моделях травматического повреждения головного и спинного мозга, гипоксии и у больных с отдаленными последствиями черепномозговой травмы.

Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве

- 1 010157 средства, стимулирующего регенерацию нейронов.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН, как активное начало, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие эффективное количество подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.

Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

Сущность изобретения поясняется фигурой и таблицами.

В табл. 1 представлено влияние пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

На фигуре показано влияние пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН на развитие эксплантатов коры головного мозга.

В табл. 2 представлено влияние пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН на процессы перекисного окисления липидов и пероксидации белков в коре головного мозга крыс при гипоксии.

В табл. 3 представлено влияние пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака.

В табл. 4 представлено влияние пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН на показатели выполнения больными корректурной пробы.

В табл. 5 представлено влияние пептида Н-О1и-Л8р-Лгд-ОН на изменение у больных альфа-индекса ЭЭГ.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН (пример 1), примерами изучения токсичности и испытания биологической активности пептида (примеры 2, 3, 4, 5, 6), а также примером результатов клинического применения пептида, демонстрирующим его фармакологические свойства и подтверждающим возможность достижения лечебного эффекта (пример 7).

Пример 1. Синтез пептида Н-61и-Л8р-Лгд-ОН.

1. Название соединения: глутамил-аспартил-аргинин.

2. Структурная формула: Н-61и-Л8р-Лгд-ОН

3. Брутто-формула без противоиона: С₁₅Н₂₆М-,О₈.

4. Молекулярный вес без противоиона: 418,40.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме

ВОС-<Зи(СВг1)-ОН ноби

ВО&аи(ОВг1)-С6и

Н-Авр(СВЙ)-ОН

I

В0С-<Эи(С8г1)-Авр(СВг1)-0Н

1)НСВ1,КЕ ,, 2)Н-Агд-0Н

ВОСаи(СВг1)-/^(СВг1)-/1гд-СН

1)Нг/Р1 , 2) ТРА

Н-Ои-Азр-Агд-ОН

ВОС - трет-бутилоксикарбонильная группа,

- 2 010157

О8и - Ν-оксисукцинимидный эфир,

ОСС - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид,

ΟΒζΙ - бензиловый эфир,

ΤΡΑ - трифторуксусная кислота,

ΗΟΒ1 - Ν-оксибензотриазол,

Ζ - бензилоксикарбонильная группа.

8. Характеристики готового препарата:

содержание основного вещества: 98,01% (по ВЭЖХ, 220 нм),

ТСХ - индивидуален, К.£=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3), содержание влаги: 6%, рН 0,01% раствора: 4,88.

Удельное оптическое вращение: [а]_с ²²: -33° (с=1, Н₂О), Ро1ата! А, Саг1 Ζβίκκ 1еиа.

Пример синтеза.

1) ΒΟί.'-61ιι(ΟΒζ1)-Ο8ιι. Ν-оксисукцинимидный эфир №трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовой кислоты (I).

№трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовую кислоту ΒΟί.'-Ο1ιι(ΟΒζ1)-ΟΗ (33,7 г, 0,1 моль) растворяли в 50 мл Ν,Ν'-диметилформамида, охлаждали до температуры -10°С, добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл Ν,Ν'-диметилформамида и Ν-гидроксисукцинимида (13,0 г, 0,11 моль) в 20 мл Ν,Ν'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую Ν,Ν'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.

2) ΒΟ^Ο1υ(ΟΒζ1)-Ακρ(ΟΒζ1)-ΟΗ, №трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-ф-бензил)- аспартат (II).

(в-Бензил)аспарагиновую кислоту Η-Ακρ(ΟΒζ1)-ΟΗ (28,0 г, 0,12 моль) и 36 мл (0,12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл Ν,Ν'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавили порциями раствор активированного эфира ΒΟί’-Ο1ιι(ΟΒζ1)-Ο8ιι (I), полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0,5 н. серной кислотой до ρΗ 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4x50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0,5 н. Η₂δΟ₄ 3x50 мл, водой 2x50 мл, 5% раствором NаΗСΟз 2x50 мл, водой 2x50 мл, насыщенным раствором №1С1 2x50 мл. Органический слой сушили над ^^Ο^ упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Получено 50 г продукта (92%). К.£ = 0,34 (бензол-ацетон 2:1).

3) ΒΟί’-Ο1ιι(ΟΒζ1)-Α8ρ(ΟΒζ1)-ΑΓ8-ΟΗ (III), №трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-фбензил)аспартиларгинин (III).

2,4 г (10 ммоль) гидрохлорида аргинина Ηί,Ί Η-Αγ§-ΟΗ суспендировали в 10 мл диметилформамида и перемешивали в течение 24 ч. Отдельно 2,4 г (4,4 ммоль) защищенного пептида (II) и 0,8 г (6 ммоль) оксибензотриазола растворяли в 10 мл диметилформамида и охлаждали до температуры -10°С. Затем добавляли охлажденный до этой же температуры раствор 1,25 г (6 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Активированный эфир получали в течение 20 мин, далее к полученному реагенту прибавляли суспензию аргинина и перемешивали в течение 2 суток при комнатной температуре. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывали, фильтрат подкисляли 0,5 н. серной кислотой до ρΗ 3. Экстрагировали 3x20 мл н-бутиловым спиртом, насыщенным водой. Объединенные вытяжки промывали водой и органический растворитель упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали под эфиром. Перекристаллизация из изопропилового спирта, сушили в вакууме над ΚΟΗ. Получено 800 мг продукта (26%). К._£ = 0,87 (н-бутанол-вода-уксусная кислота 4:1:1).

4) Η-ΟΡι-Ακρ-Αι^-ΟΗ (IV), глутамил-аспартил-аргинин.

Защищенный трипептид ΒΟ^Ο1υ(ΟΒζ1)-Ακρ(ΟΒζ1)-ΑΓ§-ΟΗ (III) (0,80 г) растворяли в смеси метиловый спирт - вода (4:1) и гидрировали над катализатором Рб/С (5%) в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над ΚΟΗ и Ρ₂Ο₅. Далее продукт растворяли в 2 мл смеси хлористый метилен-трифторуксусная кислота (5:1) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту прохождения реакции деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над ΚΟΗ.

Для очистки 300 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50x250 мм О1акогЬ-130С16Т, 7ткт. Хроматограф Βесктаη 8ук1ет Оо1б, 126 8о1уеи1 Моби1е, 168 Эюбе Αϊτήν Эе1ес1ог Моби1е. Условия хроматографирования: А: 0,1% ΤΡΑ; Β: МеС№0,1% ΤΡΑ, градиент В 0^50% за 100 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 37,0-42,0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в

- 3 010157 мл деионизованной воды и лиофилизовывали.

Получено 120 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

5) Анализ готового препарата.

Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Рйеиотеиех С 18 ЬИХА 4,6x150 мм. А: 0,1% ТРА, В: МеСЫ; градиент В 0-100% за 10 мин. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества 98,01%.

ТСХ: индивидуален, В(=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ 8огЬй1, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С). рН 0,01% раствора: 4,88 (потенциометрически).

Удельное оптическое вращение: [а]_с ²²: -33° (с=1, Н₂О), Ро1ата1 А, Саг1 2ещ8 1еиа.

Пример 2. Изучение токсичности пептида Н-С1и-А8р-Атд-ОН.

Общетоксическое действие пептида Н-С1и-А8р-Атд-ОН исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1, 2, 3, 4, 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора ЫаС1. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор ЫаС1.

Исследование по изучению подострой токсичности проведено на 65 белых беспородных крысахсамцах с массой тела 160-210 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ЫаС1. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор ЫаС1. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 84 морских свинках-самцах массой 270-310 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно пептид в течение 6 месяцев в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ЫаС1. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор ЫаС1 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании влияния пептида на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (табл. 1).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-С1и-А8р-Атд-ОН, для проведения клинических испытаний.

Пример 2. Влияние пептида Н-С1и-А8р-Атд-ОН на развитие эксплантатов коры головного мозга.

Эксперименты проведены на 32 фрагментах коры головного мозга крыс линии «У181ат», массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты коры головного мозга помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при темпе

- 4 010157 ратуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид Н-С1и-Азр-Агд-ОН до конечных концентраций 1, 10 и 100 нг/мл.

Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента коры головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью ΐ-критерия Стъюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

Зону роста контрольных эксплантатов коры составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки.

На фигуре показано влияние пептида Н-С1и-Азр-Агд-ОН на развитие эксплантатов коры головного мозга.

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации пептида Н-С1и-Азр-Агд-ОН 10 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 37%, по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов коры на более длительных сроках культивирования - 7 дней выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия, в тех же концентрациях. Иногда наблюдалось статистически не достоверное уменьшение ИП эксплантатов, видимо, за счет ретракции нервных волокон при увеличении сроков культивирования.

Полученные результаты свидетельствуют о нейритстимулирующем действии пептида Н-С1и-АзрЛгд-ОН.

Пример 3. Влияние пептида Н-С1и-Азр-Агд-ОН на репаративные процессы в головном мозге крыс после черепно-мозговой травмы.

Влияние пептида Н-С1и-Азр-Агд-ОН на репаративные процессы в головном мозге оценивали в модели острой тяжелой черепно-мозговой травмы. Динамику восстановления функций центральной нервной системы определяли путем тестирования координации движений и мышечного тонуса животных, а также их способности к обучению и воспроизведения условно-рефлекторного навыка.

У 24 белых беспородных крыс вызывали тяжелую компрессионную черепно-мозговую травму падающим свинцовым грузом. Через 1, 12, 48 и 96 ч 15 животным подопытной группы вводили внутримышечно пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН в дозе 10 мкг/кг в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №С1. Животным контрольной группы по аналогичной схеме вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.

Оценку способности крыс к обучению и воспроизведению навыков проводили с помощью теста условного рефлекса активного избегания (УРАИ). Для оценки мышечного тонуса и координации движений крыс вращали на стержне с возрастающей скоростью и измеряли время удерживания.

Через 48 ч после травмы все выжившие животные не были способны к обучению. Через 96 ч после травмы в группе крыс, получавших пептид Н-С1и-А8р-Агд-ОН, способных к обучению животных было в 2 раза больше, чем в контрольной группе. Через 30 суток показатели обучаемости у крыс, которым вводили пептид Н-С1и-А8р-Агд-ОН, были также выше, чем в контроле.

Тяжелая черепно-мозговая травма вызывала у животных выраженный астеноневротический синдром, снижение координации и мышечного тонуса. Исследование по методу вращающегося стержня показало, что пептид Н-С1и-Азр-Агд-ОН способствовал восстановлению координации движений и мышечного тонуса через 48 ч после травмы (время удерживания на стержне было более чем в 2 раза выше, чем в контрольной группе).

Таким образом, применение исследуемого пептида Н-С1и-Азр-Агд-ОН приводило к значительному улучшению способности животных к обучению и воспроизведению условно-рефлекторного навыка, а также к нормализации мышечного тонуса и координации движений.

Свойство пептида Н-С1и-А8р-Агд-ОН, проявляющееся в стимулировании регенерации нейронов, отмечалось уже на 5 сутки после травмы, а к 14 суткам показатели обучаемости животных были близки к нормальным величинам.

При острой тяжелой черепно-мозговой травме происходит повреждение и гибель популяций нейронов серого вещества головного мозга. Ускоренное восстановление функций центральной нервной системы в раннем посттравматическом периоде под действием пептида Н-С1и-Азр-Агд-ОН свидетельствует о том, что пептид вызывает стимуляцию репаративных процессов в головном мозге.

Пример 4. Влияние Н-С1и-А8р-Агд-ОН на морфологические изменения в центральной нервной системе крыс при травме спинного мозга.

Исследование проведено на взрослых крысах обоего пола, с массой тела 180-200 г. У животных подопытной группы, состоящей из 27 крыс, была воспроизведена модель травмы спинного мозга.

Животным наносилась травма в поясничном отделе спинного мозга по следующей методике. Анестезированной крысе на уровне последнего ребра через кожные покровы проводилось кратковременное сжатие боковых поверхностей позвонков корнцангом с силой на рабочих браншах 15 кг. Через 24 ч после нанесения травмы среди выживших крыс выделялось 2 группы.

Животным первой группы вводили внутримышечно ежедневно однократно пептид Н-С1и-Азр-Агд

- 5 010157

ОН в дозе 10 мкг/кг в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора Ναί,Ί в течение 10 дней, крысам второй (контрольной) группы по такой же схеме вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.

Животным обеих групп на 30 сутки проводились нейрогистологические исследования. Для исследования были взяты спинно-мозговые ганглии на уровне и выше уровня поражения, поясничные и шейные сегменты спинного мозга, участки моторной коры и пирамидных путей головного мозга. Нейрогистологическое исследование проводилось методами электронной и световой микроскопии.

Материал, взятый для изучения с помощью световой микроскопии, фиксировали в 96% спирте и 10% формалине, затем заливали в целлоидин с последующей окраской гематоксилин-эозином, а также методами Ниссля, Ван-Гизон, Вейгерта, Шпильмейера. Фиксацию и резку производили в соответствии с условиями применявшихся методов гистологической обработки и окраски материала.

Материал для электронно-микроскопических исследований фиксировали 2% осмиевой кислотой с какодилатным буфером, заливали в эпон-812 и контрастировали в азотно-кислом свинце по Рейнольдсу. Предварительную оценку материала проводили на полутонких срезах. Ультратонкие срезы изучали на электронном микроскопе УЕМ-100СХ.

У всех крыс с травмой спинного мозга обнаруживались патоморфологические изменения нейронов в очаге поражения. Степень выраженности этих изменений была различной. У части нейронов определялась картина аксональной реакции. При этом клетки набухали, контуры их сглаживались. Нисслевские глыбки выглядели измельченными вплоть до пылевидных, с бледным прокрашиванием основными красителями. Определялось просветление кариоплазмы, ядро было сдвинуто к периферии. Значительная часть нейронов находилась в состоянии сморщивания. При этом клетки приобретали удлиненносуженную форму с резкими угловатыми очертаниями. Глыбки хроматина, как и ядро интенсивно прокрашивались. Были едва заметны ядрышки. Часть нервных клеток находилась в состоянии ишемических изменений. В них определялось значительное обеднение цитоплазмы тигроидным веществом, гиперхромагическое, слегка уменьшенное ядро, распавшееся в некоторых клетках на отдельные глыбки. Иногда по периферии нейрона, возле тела и отростков обнаруживались частицы в виде интенсивно окрашенных мелких зерен (перицеллюлярная инкрустация сетей Гольджи). В большинстве случаев обнаруживались нейроны в состоянии отечных изменений. Нисслевское вещество в них просматривалось в виде узкого ободка по периферии цитоплазмы. Контуры тел клеток выглядели размытыми. Вокруг ядра определялись участки расплавления цитоплазмы в виде светлых ободков. Отдельные нейроны находились в состоянии тяжелых изменений. Тела клеток выглядели набухшими с неравномерным хроматолизом. Отростки нейронов прокрашивались на большом протяжении. Некоторые клетки были как бы «изъедены». В них выявлялись неокрашенные участки в виде вакуолей неравномерной величины и неправильной формы. Реже в нейронах обнаруживались гипертрофированные глиальные элементы, что свидетельствовало о явлениях нейронофагии. Для данного типа изменений было характерно поражение ядра, которое уменьшалось в размерах, с резким гиперхроматозом, из-за которого практически не удавалось различить ядрышки. Обнаруживались изменения нейронов по типу острого набухания. При этом тела клеток выглядели набухшими. Определялось увеличение ядер с диффузным их прокрашиванием. В цитоплазме отмечалась мелкая зернистость, гомогенно окрашенная в светло-синий цвет. В отдельных зонах очага поражения определялась картина тяжелого деструктивного процесса, что выражалось в разреженности клеточных элементов, наличии очажков выпадения нервных клеток, особенно в передних рогах спинного мозга, где достаточно часто обнаруживались мелкие полости. В некоторых местах исчезновения нейронов отмечалось разрастание глиальной ткани. В большей степени сохранялись нервные клетки задних рогов спинного мозга. В вентральной части задних и в переднебоковых столбах спинного мозга наблюдались признаки диффузной демиелинизации нервных волокон, встречались очаги спонгиозности в виде отека белого вещества.

Описанная морфологическая картина наблюдалась у крыс обеих экспериментальных групп. Однако у животных контрольной группы значительно чаще встречались «тяжелые» и ишемические изменения нейронов, в отличие от крыс, получавших инъекции пептида Н-С1и-Лкр-Лгд-ОН. в спинном мозге которых в основном обнаруживались клетки в состоянии «первичного раздражения».

У всех животных наблюдалась активная пролиферативная реакция астроцитарной глии, особенно фиброзных астроцитов. Клетки были деформированы, с пикноморфными ядрами и гомогенизированной цитоплазмой, лишенной отростков. У животных подопытной группы отмечалась более активная гиперплазия олигодендроглии. Среди ее клеток имелось множество отечных форм. Элементы микроглии находились в стадии умеренной пролиферации с явлениями фрагментации глиальных отростков.

В вышележащих отделах спинного мозга, в головном мозге животных контрольной группы выявлялись клеточные изменения по типу аксональной дегенерации.

При электронно-микроскопическом исследовании у крыс с травмой спинного мозга наблюдались выраженные изменения нейронов, их отростков, глиальных элементов и сосудов. В цитоплазме нейронов определялось уменьшение числа канальцев эндоплазматической сети, набухание цистерн аппарата Гольджи, большое количество окаймленных пузырьков, мелких и крупных лизосом. Характерным было наличие темных митохондрий с плотным матриксом, в котором не различались кристы. По периферии тел

- 6 010157 нервных клеток наблюдались крупные темные липиды с полосатой исчерченностью и значительных размеров вакуоли, представляющие собой мультивезикулярные тельца, образованные, вероятно, из набухших, потерявших рибосомы канальцев гранулярной эндоплазматической сети. В ядрах некоторых нейронов определялась дезинтеграция хроматина, который образовывал скопления причудливой формы, расположенные у плотной ядерной мембраны. У крыс, получавших пептид Н-С1и-Акр-Атд-ОН, в цитоплазме нейрональных клеток отмечались признаки восстановления. Наблюдалось появление большого количества свободных рибосом и полирибосом, коротких профилей цистерн гранулярной эндоплазматической сети. Определялось увеличение числа мелких цистерн аппарата Гольджи с отсутствием в нем признаков набухания. По периферии клеток встречались лишь единичные прозрачные вакуоли и темные тельца.

У всех животных обнаруживались значительные изменения миелиновых волокон. Так, выявлялось расщепление миелина, его искривление, сжатие внутренних осевых цилиндров и появление, вследствие этого, светлых пространств большого размера. У крыс опытной группы структура миелина части волокон восстанавливала свою гомогенность.

Обнаруживаемые изменения в синапсах проявлялись в филаментозной дегенерации постсинаптических образований. У крыс подопытной группы значительно чаще наблюдались синапсы обычной структуры (дендро-дендритические).

В вышележащих отделах у животных экспериментальных групп обнаруживались сходные изменения нервных клеток и их отростков. В нейронах определялись признаки функционального напряжения. В цитоплазме клеток отмечалось значительное количество лизосом, у части митохондрий не обнаруживались кристы. Наблюдалось умеренное набухание аппарата Гольджи. Выявлялось уплотнение кариоплазмы вследствие слишком компактного расположения хроматина в ядрах клеток. В нервных волокнах обнаруживалось умеренно выраженное расслоение миелина, сжатие осевых цилиндров.

У крыс после применения пептида Н-С1и-Акр-Атд-ОН описанные изменения проявлялись в меньшей степени. Кариоплазма имела обычный вид, более упорядочены были цистерны аппарата Гольджи. Канальцы эндоплазматической сети образовывали крупные вакуоли, содержащие остатки отработанных органоидов, для их утилизации. Однако в цитоплазме клеток по-прежнему обнаруживалось избыточное количество лизосом, определялись набухшие митохондрии с беспорядочно расположенными кристами. Миелиновые волокна гораздо чаще имели нормальный вид.

Таким образом, применение пептида Н-С1и-Акр-Атд-ОН животным с травмой спинного мозга оказывало стимулирующее действие на регенерацию нейронов спинного мозга.

Пример 5. Влияние пептида Н-С1и-Акр-Атд-ОН на интенсивность реакций свободнорадикального окисления в коре головного мозга крыс при гипоксии.

Исследование проведено на 18 белых беспородных крысах. Пептид Н-С1и-Акр-Атд-ОН вводили животным внутрибрюшинно в дозе 1 мкг в 1,0 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №1С1 однократно ежедневно в течение 10 дней. Через 24 ча после окончания введения пептида животные подвергались воздействию гипоксической гипоксии. Гипоксию вызывали в барокамере проточно-вытяжного типа при атмосферном давлении в барокамере 0,029 МПа, что соответствует подъему на высоту 9000 м над уровнем моря. Скорость компрессии и декомпрессии составляла 0,005 МПа/мин. В барокамеру помещали поглотитель углекислоты и влаги. Животные находились в барокамере в условиях свободного поведения под постоянным наблюдением в течение 3 ч.

Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню содержания начальных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и конечных продуктов - оснований Шиффа, играющих существенную роль в повреждении нейронов. Уровень пероксидации белков оценивали по содержанию карбонилпроизводных аминокислот в белках после взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином.

Установлено, что пептид Н-С1и-Акр-Атд-ОН подавлял образование продуктов ПОЛ в коре головного мозга. Под влиянием пептида статистически достоверно снижалось содержание диеновых конъюгатов и наблюдалась тенденция к снижению оснований Шиффа. Применение пептида также ингибировало, наряду с ПОЛ, и пероксидацию белков (табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение пептида Н-С1и-Акр-Атд-ОН у животных при воздействии гипоксии подавляет образование продуктов перекисного окисления липидов и пероксидации белков в коре головного мозга.

Пример 6. Влияние пептида Н-С1и-Акр-Атд-ОН на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака Ак1аеик 1ер1обаеШик.

Для изучения ίη νίίτο влияния пептида Н-С1и-Акр-Атд-ОН на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака АЧаенк 1ер1обае111ик последние выделяли путем аксотомии, поскольку принято считать, что такое выделение является моделью гибели клеток путем апоптоза.

Нейроны рецептора растяжения речного рака по своим электрофизиологическим, биологическим и структурным свойствам очень близки к центральным нейронам позвоночных. Они генерируют спайки с почти постоянной скоростью в течение 10-15 ч. Два симметричных нейрона (контроль и опыт), изолированных из абдоминального сегмента, помещали в камеры объемом 2 мл, наполненные раствором Нагге\^ге1б'к. Потенциалы действия нейронов регистрировались экстраклеточно с аксонов присасывающимися

- 7 010157 стеклянными пипеточными электродами, усиливались и записывались с помощью самописца Н-338. Одновременно с помощью двухканального аналогового частотомера и самописцев Н-339 регистрировалась частота потенциалов действия. В начале эксперимента частота импульсации экспериментальных и контрольных нейронов была установлена на отметке 10-15 Гц путём натяжения мышцы. После 1 ч стабильной генерации спайков с постоянной скоростью в экспериментальную ёмкость добавляли пептид Н-С1цЛкр-Лгд-ОН в концентрации 10 мкг/мл. Активность нейронов непрерывно записывалась до спонтанного прекращения генерации спайков. Время жизни нейронов сравнивалось в каждой паре. Всего использовали 10 пар нейронов.

При спонтанном прекращении импульсации изолированного нейрона после 8-10 ч сравнительно стабильной работы с заданной частотой появлялись сначала небольшие флуктуации частоты длительностью несколько секунд, потом появлялись более медленные ритмы с периодом в несколько минут. Средняя частота потенциалов действия снижалась, затем начиналось выпадение отдельных импульсов, импульсация приобретала хаотический характер и быстро затухала.

Установлено, что пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН удлинял продолжительность жизни изолированных нейронов на 15%, в среднем с 11,9 до 13,7 ч (табл. 3).

Замедление гибели нейронов под воздействием пептида Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН свидетельствует о нейропротекторном эффекте пептида, связанном с его влиянием на электрофизиологические мембранные процессы и внутриклеточный метаболизм в нейронах.

Пример 7. Эффективность применения пептида Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН у больных с отдаленными последствиями черепно-мозговой травмы.

Исследование проведено на 25 больных в возрасте 31-60 лет с отдаленными последствиями черепно-мозговой травмы, разделенных на 2 группы методом рандомизации. Давность перенесенных больными черепно-мозговых травм составляла от 2 до 10 лет. Больным основной группы вводили фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 10 мкг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №1С1 в течение 10 дней. Больным контрольной группы по аналогичной схеме вводили в том же объеме стерильный физиологический 0,9% раствор №С1.

После применения фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, у больных хороший клинический результат наблюдался в 59,4% случаев, удовлетворительный - в 31,9%, отсутствие положительного эффекта - 8,7%. Отрицательного влияния фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, на состояние больных не отмечено. Больные отмечали улучшение памяти, уменьшение интенсивности и длительности головных болей, появление эмоциональной уравновешенности, чувства отдыха после ночного сна.

Оценка влияния фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, на интегральную функцию головного мозга - внимание и на биоэлектрическую активность головного мозга исследовались с помощью корректурной пробы и электроэнцефалографии.

У больных основной группы после лечения с применением фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, достоверно возросло количество просмотренных знаков и уменьшилось количество ошибок при выполнении корректурной пробы (табл. 4).

В группе больных, получавших лечение с применением фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, получены лучшие результаты при анализе динамики выполнения корректурной пробы до и после лечения. Это выражалось в отсутствии резких колебаний в количестве просмотренных знаков за равные отрезки времени, наличии периода врабатываемости к середине выполнения задания и постепенном снижении кривой к концу задания, что свидетельствует о большей устойчивости внимания у больных основной группы.

Для оценки влияния фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН, на биоэлектрическую активность головного мозга проводился расчет альфа-индекса до и после лечения. Наиболее выраженные изменения биоэлектрической активности головного мозга наблюдались у больных основной группы после лечения с применением фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-С1и-Л8р-Лгд-ОН: у них под влиянием лечения произошло достоверное увеличение альфа-индекса (табл. 5).

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о воздействии фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида Н-С1цЛкр-Лгд-ОН, на интегративную функцию клеток головного мозга у больных после перенесенной черепно-мозговой травмы за счет стимуляции регенерации нейронов.

- 8 010157

Таблица 1

Показатель	Введение пептида П-СИи-Авр-Λίβ-ΟΗ (1 мкг/кг)
3 месяца	6 месяцев
Контроль (п=24)	Пептид (п=24)	Контроль (п=24)	Пептид (п=24)
Эритроциты, х10|2/л	5,3+0,6	5,4±0,4	5,4±0,3	5,3±О,6
Гемоглобин, г/л	14,2+1,4	14,3±1,6	14,5±1,3	14,5±1,7
Ретикулоциты, %	1,3±0,07	1,3±0,1	1,1 ±0,05	1,2±0,04
Тромбоциты, х109/л	143,7+7,9	145,1±7,8	144,5±8,6	145,2±8,3
Лейкоциты, х109/л	9,4±0,5	10,0±0,5	9,6±0,5	9,4±0,8
Нейтрофилы палочкоядерные, %	0,31 ±0,04	0,32±0,05	0,33±0,04	0,34±0,07
Нейтрофилы сегментоядерные, %	45,8±2,1	46,4±2,1	46,2±3,5	44,7±2,7
Эозинофилы, %	0,69+0,05	0,71 ±0,06	0,72±0,04	0,68±0,05
Базофилы, %	0,61 ±0,04	0,65±0,07	0,72+0,03	0,67±0,08
Моноциты, %	2,5±0,02	2,4±0,07	2,6±0,06	2,4±0,03
Лимфоциты, %	48,9±2,5	51,4±2,1	51,3±2,7	50,5±1,9
СОЭ, мм/ч	1,69±0,05	2,07±0,04	2,01 ±0,05	1,88±О,ОЗ
Резистентность эритроцитов, % №С1 -максимальная -минимальная	0,41 ±0,02 0,32±0,05	0,43±0,06 0,30±0,01	0,42±0,04 0,34±0,04	0,42±0,03 О,31±О,О5
Общий белок в сыворотке крови, г/л	72,9±3,1	71,4±2,6	73,1 ±3,4	72,6±3,2
Натрий в сыворотке крови, ммоль/л	153,9+5,7	155,2±5,9	155,5±6,2	153,2±7,4
Калий в сыворотке крови, ммоль/л	5,1±2,3	5,1 ±2,4	5,2±2,1	5,3±1,8

Таблица 2

Показатель	Группа животных
Контроль (гипоксия)	Пептид Н-61и-Азр-Аг£-ОН + гипоксия
Диеновые конъюгаты (нмоль/г ткани)	42,15±2,35	28,57+1,84*
Основания Шиффа (у.ед./г ткани)	317,0+24,7	255,4±26,8
Уровень пероксидации белков (мкмоль/мг белка)	9,69±0,32	4,68±0,07*

* - Р < 0,01 по сравнению с контролем.

- 9 010157

Таблица 3

Продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака (ч)
Контроль	Пептид Н-О1и-Азр-Аг§-ОН
11,9+0,3	13,7+0,2*

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 4

Группа больных	Количество просмотренных знаков	Количество ошибок
Здоровые	2874,6+93,4	2,7+0,3
Больные до лечения	1519,1+141,7	12,6+1,3
Больные после лечения с применением пептида Н-О1и-Азр-Агд-ОН	2429,6+105,3*	6,4+1,1*

* - Р < 0,05 по сравнению с показателями у больных до лечения.

Таблица 5

Группа больных	Альфа-индекс
Здоровые	52,9+3,2
Больные до лечения	35,7+4,6
Больные после лечения с применением пептида Н-С1и-Азр-Аг§-ОН	47,9±3,1*

* - Р < 0,01 по сравнению с показателями у больных до лечения.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Общество с ограниченной ответственностью СИА Пептайдс <120> Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения <130> 5ΙΑ/03/2006 <160> 1 <170> расепггп νβΓίίοη 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> РКТ <213> Аг11^-Нс1а1 <22О>

<223> Пептидное соединение Н-С1и-А5р-Агд-0Н, стимулирующее регенерацию нейронов цнс за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков, антиоксидантного действия, нормализации метаболизма и биоэлектрической активности нейронов.

<400> 1 и А5р Агд

- 10 010157

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию нейронов, характеризующаяся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-А8р-Агд-ОН последовательности 1 [8Εζ) ГО N0:1] и фармацевтически приемлемый носитель.
2. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения.
3. 3. Пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-СИи-Акр-Агд-ОН последовательности 1 |8Е0 ГО N0:1], обладающий способностью стимулировать регенерацию нейронов.
4. 4. Применение пептида по п.З для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию нейронов.
5. 5. Способ стимулирования регенерации нейронов центральной нервной системы, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы Н-С1и-А8р-Агд-0Н последовательности 1 |8Εζ) ГО N0:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.
6. 6. Способ по и.5, отличающийся тем, что введение осуществляют парентерально.