ES2315371T3

ES2315371T3 - Uso de poli-glu,tyr para terapia neuroprotectora del snc o snp.

Info

Publication number: ES2315371T3
Application number: ES02743592T
Authority: ES
Inventors: Michal Eisenbach-Schwartz; Ester Yoles; Ehud Hauben
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2022-06-27
Also published as: CA2451521A1; US6835711B2; DE60229639D1; ATE412419T1; HK1064951A1; CA2451521C; US20030003082A1; KR20040032825A; CN1326560C; JP2005502616A; EP1406650B1; MXPA03011926A; AU2002345323B2; IL159535A0; CN1547482A; NZ530261A; EP1406650A1; JP4434729B2; WO2003002140A1; DK1406650T3

Abstract

Uso de poli-Glu 50 ,Tyr 50 para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o inhibir degeneración neuronal en el sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP), para promover regeneración nerviosa en el SNC o SNP, para tratar una lesión en el SNC o SNP o un trastorno o enfermedad en el SNC o SNP producido o agravado por toxicidad del glutamato seleccionado de una demencia senil que incluye enfermedad de Alzheimer, síndrome parkinsoniano que incluye enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), corea de Huntington, una enfermedad de la neurona motora que incluye esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad priónica que incluye enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alper, enfermedad de Batten, síndrome de Cockayne, enfermedad de cuerpos de Lewy, estado epiléptico, síndrome del túnel carpiano, hernia de disco intervertebral, hipovitaminosis, epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, estrés oxidativo, tolerancia a y dependencia de opiáceos, una enfermedad autoinmunitaria o una neuropatía periférica asociada con una enfermedad tal como polineuropatía amiloide, neuropatía diabética, neuropatía urémica, polineuropatía porfírica, hipoglucemia, síndrome de Sjogren-Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de malabsorción, policitemia verdadera, gammapatías IgA y IgG, complicaciones de diversos fármacos tales como nitrofurantoína, metronidazol, isoniazida y toxinas tales como el alcohol u organofosfatos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia-telangiectasia, ataxia de Friedreich, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry o lipoproteinemia, o dicho trastorno o enfermedad está asociado con el ojo e incluye neuropatía óptica no arterítica, degeneración macular senil, un trastorno retiniano tal como degeneración retiniana o una enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada.

Description

Uso de poli-Glu,Tyr para terapia neuroprotectora del SNC o SNP.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para la promoción de regeneración nerviosa o la prevención o inhibición de degeneración neuronal para mejorar los efectos de lesión, trastorno o enfermedad del sistema nervioso (SN). En particular, la invención se refiere a composiciones que comprenden poli-Glu,Tyr para proteger las células del sistema nervioso central (SNC) de toxicidad del glutamato, para promover regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir degeneración neuronal producida por lesión o enfermedad de nervios dentro del SNC o sistema nervioso periférico (SNP) de un sujeto humano. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse solas u opcionalmente pueden administrarse en cualquier combinación deseada.

Abreviaturas

ACF: adyuvante completo de Freund; SNC: sistema nervioso central; PBM: proteína básica de la mielina; CMH: complejo mayor de histocompatibilidad; SN: sistema nervioso; SSTF: solución salina tamponada con fosfato; pEY: poli-Glu,Tyr; SNP: sistema nervioso periférico; Poli-Glu,Tyr: copolímero poli-Glu^{50}Tyr^{50}, un heterocopolímero aleatorio de ácido L-glutámico y L-tirosina; CGR: células ganglionares de la retina.

Antecedentes de la invención

El sistema nervioso comprende el sistema nervioso central (SNC) y el periférico (SNP). El SNC está compuesto por el cerebro, la médula espinal y el sistema visual; el SNP está constituido por todos los otros elementos neuronales, concretamente los nervios y los ganglios fuera del cerebro y la médula espinal.

La lesión al sistema nervioso puede resultar de una lesión traumática, tal como traumatismo penetrante o traumatismo cerrado, o una enfermedad o trastorno que incluye, pero no se limita a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), neuropatía diabética, demencia senil, accidente cerebrovascular e isquemia.

El mantenimiento de la integridad del SNC es un complejo "acto de equilibrio" en el que se adoptan compromisos con el sistema inmunitario. En la mayoría de los tejidos, el sistema inmunitario desempeña una parte esencial en la protección, reparación y curación. En el SNC, debido a su único privilegio inmunitario, las reacciones inmunológicas están relativamente limitadas. Un conjunto creciente de datos indica que el fallo del SNC de mamíferos para lograr la recuperación funcional después de la lesión refleja un diálogo ineficaz entre el tejido lesionado y el sistema inmunitario. Por ejemplo, la comunicación restringida entre el SNC y los macrófagos transmitidos por la sangre afecta la capacidad de axones axotomizados para recrecer aunque los trasplantes de macrófagos activados puedan promover el recrecimiento del SNC.

Se ha mostrado que las células T activadas entran en el parénquima del SNC, independientemente de su especificidad por antígenos, pero parece que aquí sólo persisten las células T que pueden reaccionar con un antígeno del SNC (Hickey y col., 1991). Las células T reactivas a antígenos de la sustancia blanca del SNC, tales como proteína básica de la mielina (PBM), pueden inducir la enfermedad paralítica encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un plazo de varios días desde su inoculación en ratas receptoras sin tratamiento previo (Ben-Nun, 1981). Las células T anti-PBM también pueden estar implicadas en la enfermedad humana esclerosis múltiple (Ota y col., 1990). Sin embargo, debido a su potencial patógeno, los clones de células T anti-PBM están presentes en los sistemas inmunitarios de sujetos sanos (Pette y col., 1990). Las células T activadas, que normalmente patrullan el SNC intacto, se acumulan transitoriamente en sitios de lesiones de sustancia blanca del SNC (Hirschberg y col., 1998).

Una consecuencia catastrófica de la lesión del SNC es que la lesión primaria está frecuentemente compuesta por la pérdida secundaria gradual de neuronas adyacentes que aparentemente no estaban lesionadas, o sólo marginalmente lesionadas, por la lesión inicial (McIntosh, 1993). La lesión primaria produce cambios en las concentraciones de iones extracelulares, elevación de las cantidades de radicales libres, liberación de neurotransmisores, agotamiento de factores de crecimiento e inflamación local. Estos cambios desencadenan una cascada de acontecimientos destructivos en las neuronas adyacentes que inicialmente escaparon de la lesión primaria (Lynch y col., 1994). Esta lesión secundaria está mediada por la activación de canales dependientes del voltaje o dependientes de agonistas, falta de iones, activación de enzimas dependientes de calcio tales como proteasas, lipasas y nucleasas, disfunción mitocondrial y agotamiento de energía, culminando en muerte celular neuronal. La pérdida generalizada de neuronas más allá de la pérdida producida directamente por la lesión primaria se ha llamado "degeneración secundaria".

Uno de los mediadores más comunes que producen la autopropagación de las enfermedades incluso cuando se elimina o atenúa el factor de riesgo primario es el glutamato, un aminoácido excitador que puede mostrar actividad dual: desempeña una función fundamental en el funcionamiento normal del SNC como un neurotransmisor esencial, pero se vuelve tóxico cuando se superan sus niveles fisiológicos. La elevación del glutamato se ha notificado en muchos trastornos del SNC. En su función como compuesto excitotóxico, el glutamato es uno de los mediadores más comunes de toxicidad en trastornos degenerativos agudos y crónicos (incluyendo degeneración del nervio óptico en glaucoma) (Pitt y col., 2000). El glutamato endógeno se ha atribuido a la lesión cerebral que se produce gravemente después de estado epiléptico, isquemia cerebral o lesión cerebral traumática. El glutamato endógeno también puede contribuir a neurodegeneración crónica en tales trastornos como esclerosis lateral amiotrófica y corea de Huntington.

Se ha dedicado una intensa investigación a atenuar el efecto citotóxico del glutamato mediante el uso de fármacos de acción local, tales como antagonistas del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). En seres humanos, tales compuestos tienen efectos psicotrópicos y otros efectos secundarios que los hacen inadecuados como agentes terapéuticos. Además, la terapia convencional de este tipo es frecuentemente poco satisfactoria ya que es probable que la neutralización del efecto tóxico del glutamato interfiera con su funcionamiento fisiológico como un neurotransmisor ubicuo del SNC. Debido a que la actividad del glutamato es esencial para el funcionamiento fisiológico normal, que todavía es potencialmente devastadora después de lesión aguda o en trastornos crónicos del SNC, debe evitarse cualquier intento por neutralizar su efecto perjudicial eliminando su actividad esencial en otros sitios en el cuerpo.

Otra consecuencia trágica de la lesión del SNC es que las neuronas en el SNC de mamíferos no experimentan una regeneración espontánea tras una lesión. Por tanto, una lesión del SNC produce un deterioro permanente de las funciones motoras y sensoriales.

Las lesiones de la médula espinal, independientemente de la gravedad de la lesión, dan inicialmente como resultado una parálisis funcional completa conocida como sección medular. Puede observarse una recuperación espontánea de la sección medular que empieza algunos días después de la lesión y disminuye progresivamente en el plazo de tres a cuatro semanas. Cuando menos grave sea la lesión, mejor será el resultado funcional. El grado de recuperación es una función de la cantidad de tejido inicialmente sin lesión menos la pérdida debido a la degeneración secundaria. La recuperación de la lesión mejoraría mediante tratamiento neuroprotector que podría reducir la degeneración secundaria. Por ejemplo, el alivio del efecto del glutamato es una diana frecuente del desarrollo de fármacos neuroprotectores. Entre los fármacos que están desarrollándose para este fin están los antagonistas del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) o del receptor ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA). Estos fármacos tendrán inevitablemente efectos secundarios graves ya que interfieren con el funcionamiento de los receptores NMDA y AMPA, que son cruciales para la actividad normal del SNC. Uno de los antagonistas del receptor NMDA más intensamente estudiados es MK801, que proporciona neuroprotección eficaz pero con graves efectos secundarios. En modelos animales de isquemia cerebral y lesión cerebral traumática, los antagonistas del receptor NMDA y AMPA protegen de lesión cerebral aguda y retrasan el déficit del comportamiento. Tales compuestos están sometiéndose a pruebas en seres humanos, pero todavía no se ha establecido la eficacia terapéutica. Otros estados clínicos que pueden responder a fármacos que actúan en la transmisión glutamatérgica incluyen epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia y psicosis (Meldrum, 2000).

En el laboratorio de los presentes inventores se ha descubierto recientemente que células T activadas que reconocen un antígeno del SN del paciente confieren neuroprotección. Se hace referencia a la publicación PCT WO 99/60021. Más específicamente se mostró que las células T reactivas a PBM eran neuroprotectoras en modelos de rata de nervio óptico parcialmente aplastado (véase también Moalem y col., 1999) y de lesión de la médula espinal (véase también Hauben y col., 2000). Hasta hace poco se había pensado que las células inmunitarias no participaban en la reparación del SN. Además, cualquier actividad inmunitaria en el contexto de lesión del SNC se consideró tradicionalmente perjudicial para la recuperación. Fue bastante sorprendente descubrir que las células T activadas específicas para el SN podían usarse para proteger tejido del sistema nervioso de la degeneración secundaria que puede seguir a la lesión producida por lesión o enfermedad del SNC o SNP. Todavía no se ha descubierto el mecanismo de acción de tales células T específicas para el SN, pero la acumulación masiva de células T administradas exógenamente en el sitio de la lesión del SNC sugiere que la presencia de células T en el sitio de la lesión desempeña una función importante en la neuroprotección. Sin embargo, parece que la acumulación, aunque es una condición necesaria, no es suficiente para el fin, ya que las células T específicas para el antígeno no propio ovoalbúmina también se acumulan en el sitio, pero no tienen efecto neuroprotector (Hirschberg y col., 1998).

Además de las células T activadas específicas para el SN, las solicitudes de EE.UU. anteriormente aludidas y la publicación PCT WO 99/60021 desvelan que la terapia para la mejora de los efectos de lesión o enfermedad del SN también puede llevarse a cabo con un antígeno específico para el SN natural o sintético tal como MAG, S-100, \beta-amiloide, Thy-1, P0, P2, un receptor de neurotransmisores, y preferentemente PBM humana, proteína del proteolípido humano (PLP) y glucoproteína del oligodendrocito humano (MOG), o con un péptido derivado de un antígeno específico para el SN tal como un péptido que comprende los aminoácidos 51-70 de PBM o los aminoácidos 35-55 de MOG.

Más recientemente se ha descubierto en el laboratorio de los presentes inventores que un copolímero aleatorio básico sintético de alto peso molecular constituido por los residuos de L-Ala, L-Glu, L-Lys y L-Tyr con una fracción molar promedio de 0,141, 0,427, 0,095 y 0,338, designado copolímero 1 o Cop 1 y siendo el principio activo de COPAXONE® (Teva Pharmaceuticals Ltd., Israel), un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, puede prevenir o inhibir degeneración neuronal o promover regeneración nerviosa en el SNC o SNP, además de proteger células del SNC de la toxicidad del glutamato. Se hace referencia a las publicaciones PCT WO 01/52878 y WO 01/93893. Más específicamente, se mostró que las células T activadas específicas para Cop 1 se acumulaban tanto en tejidos neuronales lesionados como no lesionados y eran protectoras en el nervio óptico lesionado del efecto destructor de la degeneración secundaria, y se mostró que la inmunización con Cop 1 protegía de la toxicidad del glutamato.

Se ha desvelado la administración por vía oral de autoantígeno con el fin de obtener "tolerancia oral" para el tratamiento de diversos enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, el documento EP359783 desvela la administración por vía oral de PBM para el tratamiento de esclerosis múltiple, y las publicaciones internacionales PCT WO 91/12816, WO 91/08760 y WO 92/06704 desvelan el tratamiento de otras enfermedades autoinmunitarias usando el método de tolerancia oral con una variedad de autoantígenos. El tratamiento de la esclerosis múltiple mediante ingestión o inhalación del copolímero 1 para lograr la supresión de la respuesta de células T autoinmutarias a antígenos de mielina se ha desvelado en la publicación PCT WO 98/30227.

El copolímero poli-Glu^{50}Tyr^{50}, anteriormente llamado frecuentemente poliGT y también denominado en lo sucesivo pEY, es un heterocopolímero aleatorio de ácido L-glutámico y L-tirosina con una longitud promedio de 100 aminoácidos y una capacidad para provocar una fuerte respuesta inmunitaria en ciertas cepas de ratón (Vidovic y col., 1985; Vidovic y Matzinger, 1988). Hace más de 20 años se mostró que varias cepas de ratones resistentes endogámicas, además de congénicas, que fallaron en responder a pEY, desarrollaron respuestas de células formadoras de plaquetas (PFC) específicas cuando se estimularon por pEY complejado a un vehículo inmunogénico tal como albúmina metilada de suero bovino (MBSA); la preinmunización con pEY tuvo un efecto tolerogénico en la respuesta a pEY-MBSA en algunas cepas de ratón y esta tolerancia pudo transferirse a receptores singeneicos normales mediante células del bazo o timocitos de animales cebados con pEY (Debre y col. 1975). Más recientemente se mostró que pEY activaba líneas de células T V gamma 5/V delta 1 TCR (+) epidérmicas murinas (Seo y col., 2001). Ninguna de estas publicaciones describe o sugiere una actividad biológica útil de pEY y, particularmente, no el uso de pEY para la neuroprotección.

La mención o identificación de cualquier referencia en esta sección o cualquier otra parte de esta solicitud no debe interpretarse como una admisión de que tal referencia está disponible como técnica anterior a la invención.

Resumen de la invención

Ahora se ha encontrado según la presente invención que poli-Glu,Tyr puede proteger células nerviosas de la toxicidad del glutamato y de experimentar degeneración secundaria tras contusión de la médula espinal. La aparición espontánea de células T específicas para PBM y células T específicas para poli-Glu,Tyr se examinó en ratas después de contusión de la médula espinal. Además, la inmunización activa con poli-Glu,Tyr se usó para atenuar la degeneración neuronal inducida por toxicidad del glutamato o mediante lesión mecánica a la médula espinal.

Por tanto, la presente invención se refiere, en un aspecto, al uso de poli-Glu,Tyr para la preparación de una composición farmacéutica que es útil para neuroprotección, concretamente para prevenir o inhibir degeneración neuronal, o para promover regeneración nerviosa, en el SNC o SNP, particularmente para tratar una lesión, trastorno o enfermedad del SNC o SNP que da como resultado, o va acompañada de, lesión axónica.

En otra realización de la invención, las composiciones farmacéuticas son útiles para proteger las células del SNC o SNP de toxicidad del glutamato, particularmente para el tratamiento de una lesión, trastorno o enfermedad del SNC o SNP que se produce o agrava por toxicidad del glutamato.

En una realización, la lesión, trastorno o enfermedad comprende lesión de la médula espinal, traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, golpe o contragolpe cerebral, infarto cerebrovascular hemorrágico o infarto cerebrovascular isquémico. En una realización preferida, la lesión es lesión de la médula espinal.

En otra realización, la lesión, trastorno o enfermedad comprende neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), hipovitaminosis, epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, estrés oxidativo o tolerancia a y dependencia de opiáceos y otros trastornos y enfermedades como se describen en lo sucesivo.

En otra realización, la lesión, trastorno o enfermedad está asociado con el ojo e incluye neuropatía óptica, degeneración macular senil, un trastorno retiniano tal como degeneración retiniana o enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada tal como glaucoma. En una realización preferida, el trastorno o enfermedad es glaucoma.

En todavía otra realización, la lesión, trastorno o enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria.

Una "cantidad eficaz" se define en este documento como una cantidad que es eficaz para mejorar los efectos de una lesión, trastorno o enfermedad del SNC o SNP.

Como se usa en este documento, el término "neuroprotección" se refiere a la prevención o inhibición de efectos degenerativos de una lesión, trastorno o enfermedad en el SNC o SNP, que incluye protección de los efectos neurodegenerativos secundarios que persisten incluso cuando se ha eliminado o atenuado el factor de riesgo primario. Esto incluye la protección de tanto la sustancia blanca como la sustancia gris.

Además, como el poli-Glu,Tyr protege de la toxicidad del glutamato, también debe tener una actividad reguladora, tal como mediante la creación de células reguladoras o sustancias reguladoras. En vista de esta actividad reguladora se espera que la vacunación con poli-Glu,Tyr también proteja la sustancia blanca y la sustancia gris de la lesión producida por estrés oxidativo y otras fuentes de lesión a células neuronales. Además, debido a esta actividad reguladora, la presente invención también puede usarse para proteger células neuronales de enfermedades autoinmunitarias.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de poli-Glu,Tyr para inhibir o mejorar los efectos de una lesión, trastorno o enfermedad del SNC o SNP.

Adicionalmente, la administración por vía oral de poli-Glu,Tyr puede ser eficaz para la neuroprotección después del cebado con poli-Glu,Tyr administrado en adyuvante. Por tanto, el poli-Glu,Tyr oral puede usarse para reforzar la actividad de las células T, posterior a la activación primaria de tal poli-Glu,Tyr, preferentemente en adyuvante, para formar una respuesta de células T crítica inmediatamente después de la lesión.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es una gráfica que muestra los resultados del ensayo de proliferación de esplenocitos en respuesta a diferentes antígenos: ovoalbúmina (Ova), copolímero l (Cop 1), proteína básica de la mielina (PBM), el péptido de PBM p87-99, poli-Glu,Tyr (pEY) y concanavalina A (Con A). El ensayo se llevó a cabo en esplenocitos aislados de ratas SPD 8-10 días después de que las ratas se sometieran a contusión de la médula espinal. El índice se determinó en comparación con la proliferación de esplenocitos en medio que no contenía ningún antígeno (IE = 1).

La fig. 2 es una gráfica que muestra cómo la inmunización con pEY atenúa significativamente la muerte de células ganglionares de la retina (CGR) inducida por glutamato. El número de CGR/mm^{2} marcadas (supervivientes) en retinas extirpadas de ratones C57BL/6J que habían sido inmunizados con una emulsión de pEY en adyuvante completo de Freund (ACF-pEY) o con SSTF en ACF (ACF-SSTF) se contó 7 días antes de la inyección intravítrea de glutamato y 7 días después. Las barras representan la media \pm eem del porcentaje de muerte de CGR en comparación con la retina sin tratamiento previo.

La fig. 3 representa los efectos de la inmunización con pEY/ACF en la recuperación de ratas a partir de contusión de la médula espinal. La gráfica presenta la media \pm de de los marcadores de actividad motora de las extremidades posteriores en campo abierto (prueba BBB como se describe en el ejemplo 3.1 en lo sucesivo) con el tiempo después de la lesión de la médula espinal en dos grupos de ratas SPD inmunizadas con pEY/ACF (cuadrados) o ACF-SSTF (control; triángulos) inmediatamente después de la lesión de la médula espinal.

La fig. 4 representa los efectos de la transferencia adoptiva de esplenocitos activados con pEY en la recuperación de la lesión de la médula espinal. La gráfica presenta la media \pm de de los marcadores de actividad motora de las extremidades posteriores en campo abierto con el tiempo después de la lesión de la médula espinal en dos grupos de ratas SPD inyectadas intraperitonealmente con células T activadas con ACF-pEY (SPc+pEY; cuadrados) o células T tratadas con ACF-SSTF (control; triángulos) inmediatamente después de la lesión de la médula espinal.

Descripción detallada de la invención

Las composiciones de la invención que comprenden poli-Glu,Tyr pueden usarse para promover regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir degeneración secundaria que de otro modo sigue a la lesión primaria del SN, por ejemplo, lesión de la médula espinal, traumatismo cerrado tal como aquel producido por la participación en deportes peligrosos, traumatismo penetrante tal como heridas por arma de fuego, golpe o contragolpe cerebral, infarto cerebrovascular hemorrágico, infarto cerebrovascular isquémico, isquemia cerebral o lesiones producidas por cirugía tales como extirpación de tumores.

Además, tales composiciones pueden usarse para mejorar los efectos de enfermedad que dan como resultado un proceso degenerativo, por ejemplo, degeneración que se produce en o la sustancia gris o blanca (o ambas) como resultado de diversas enfermedades o trastornos que incluyen, sin limitación, una lesión, trastorno o enfermedad seleccionados de una demencia senil que incluye enfermedad de Alzheimer, síndrome parkinsoniano que incluye enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), corea de Huntington, una enfermedad de la neurona motora que incluye esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad priónica que incluye enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alper, enfermedad de Batten, síndrome de Cockayne, enfermedad de cuerpos de Lewy, estado epiléptico, síndrome del túnel carpiano, hernia de disco intervertebral, hipovitaminosis, epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, estrés oxidativo, tolerancia a y dependencia de opiáceos, una enfermedad autoinmunitaria o una neuropatía periférica asociada con una enfermedad tal como polineuropatía amiloide, neuropatía diabética, neuropatía urémica, polineuropatía porfírica, hipoglucemia, síndrome de Sjogren-Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de malabsorción, policitemia verdadera, gammapatías IgA y IgG, complicaciones de diversos fármacos tales como nitrofurantoína, metronidazol, isoniazida y toxinas tales como el alcohol u organofosfatos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia-telangiectasia, ataxia de Friedreich, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry o lipoproteinemia.

Además, en vista de los hallazgos con respecto al aspecto protector del glutamato de la presente invención, otros estados clínicos que pueden tratarse según la presente invención incluyen epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, presión intraocular anormalmente elevada, por ejemplo glaucoma, estrés oxidativo y tolerancia a y dependencia de opiáceos. Además, el aspecto protector del glutamato de la presente invención, es decir, tratar la lesión o enfermedad producida o agravada por toxicidad del glutamato, puede incluir tratamientos posoperatorios tales como la extirpación de tumores del SNC y otras formas de cirugía en el SNC.

En vista del hecho de que la inmunización con poli-Glu,Tyr se ha encontrado sorprendentemente útil en la protección contra la toxicidad del glutamato, se espera que el tratamiento de poli-Glu,Tyr según la presente invención sea eficaz en el tratamiento de las afecciones anteriormente enumeradas no sólo en una fase tardía cuando la mielina está siendo afectada, sino también en las fases tempranas en las que las neuronas están siendo atacadas por factores que producen una elevación en los niveles de glutamato hasta niveles tóxicos. Por tanto, la presente invención es útil para cualquier indicación, es decir, neurodegeneración crónica o aguda, que se produce o se agrava mediante una elevación en los niveles de glutamato, incluyendo las fases tempranas de infarto cerebrovascular isquémico, enfermedad de Alzheimer, etc.

En una realización preferida, la composición de inmunización que comprende poli-Glu,Tyr de la presente invención se usa para tratar enfermedades o trastornos en los que se indica promoción de regeneración nerviosa o prevención o inhibición de degeneración neuronal secundaria.

En una realización preferida, la presente invención contempla el uso de poli-Glu,Tyr administrado en adyuvantes. La administración por vía oral de poli-Glu,Tyr para la neuroprotección, si es posible, siempre se contempla posterior a la activación primaria con poli-Glu,Tyr, preferentemente en adyuvante.

Poli-Glu,Tyr también pueden usarse para mejorar el proceso degenerativo producido por neoplasias, sin usar procesos de inmunoterapia.

Las composiciones farmacéuticas para uso según la presente invención pueden formularse de modo convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. El (Los) vehículo(s) deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de la composición y no perjudiciales para el receptor de la misma.

El siguiente ejemplo de vehículos, modos de administración, formas farmacéuticas, etc. se enumeran como posibilidades conocidas a partir de las que pueden seleccionarse los vehículos, modos de administración, formas farmacéuticas, etc. para uso con la presente invención. Sin embargo, aquellos expertos en la materia entenderán que cualquier formulación dada y modo de administración seleccionado debe probarse primero para determinar que logre los resultados deseados.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el terapéutico. Los vehículos en la composición farmacéutica pueden comprender un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona o povidona), goma tragacanto, gelatina, almidón, lactosa o lactosa monohidratada; un agente disgregante, tal como ácido algínico, almidón de maíz y similares; un lubricante o tensioactivo, tal como estearato de magnesio o laurilsulfato de sodio; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; y/o un aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Procedimientos de administración incluyen, pero no se limitan a, vía parenteral, por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucosa (por ejemplo, oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, intraocular), intratecal, tópica e intradérmica. La administración puede ser sistémica o local.

Para administración por vía oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o puede presentarse como un producto terminado para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. Las preparaciones para administración por vía oral pueden formularse adecuadamente para dar la liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de modo convencional. Si se administra poli-Glu,Tyr por vía oral, puede mezclarse con otras formas de alimento y consumirse en forma sólida, semisólida, de suspensión o emulsión; y puede mezclarse con vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen agua, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, potenciadores del aroma y similares. En una realización, la composición oral está recubierta entéricamente. El uso de recubrimientos entéricos es muy conocido en la técnica.

Las composiciones pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógeno, antes de uso.

Las composiciones también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Para la administración por inhalación, las composiciones para uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverizador de aerosol de envases presurizados o un nebulizador, usando un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. El poli-Glu,Tyr también puede administrarse nasalmente en ciertas de las formas anteriormente mencionadas mediante inhalación o gotas nasales. Además, la inhalación oral puede emplearse para administrar poli-Glu,Tyr a los revestimientos de la mucosa de la traquea y las vías bronquiales.

En una realización preferida, las composiciones que comprenden poli-Glu,Tyr se formulan según procedimientos rutinarios como composiciones farmacéuticas adaptadas para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Si es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Generalmente, los componentes se suministran o por separado o se mezclan juntos. Si la composición va a administrarse mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica o solución salina. Si la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril o solución salina para inyección de manera que los componentes puedan mezclarse antes de la administración.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden poli-Glu,Tyr pueden administrarse opcionalmente con un adyuvante en el modo usual para la inmunización. Ejemplos no limitantes de tales adyuvantes incluyen alumbre y adyuvante incompleto de Freund. También puede usarse emulsiones de lípidos metabolizables, tales como Intralipid o Lipofundin, como vehículos para la terapia de poli-Glu,Tyr en el modo desvelado en el documento WO 97/02016, cuyo contenido completo se incorpora en este documento como referencia. Aunque se sabe que estos materiales producen un desplazamiento de citocina TH1 a TH2, no hay razón para creer que las citocinas TH2 no serán operables, y quizás incluso preferibles, para el fin de la presente invención.

La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a un mamífero, preferentemente a un ser humano, poco después de la lesión o la detección de una lesión degenerativa en el SN.

En una realización, las composiciones de la invención se administran en combinación con uno o más de los siguientes: (a) fagocitos mononucleares, preferentemente monocitos cultivados (como se describen en los documentos WO 97/09985, WO 98/41220, US 5.800.812, US 6.117.424 y US 6.267.955), que han sido estimulados para potenciar su capacidad para promover regeneración neuronal; y (b) un factor neurotrófico tal como el factor de crecimiento de fibroblastos ácido.

En otra realización, las células de fagocitos mononucleares según los documentos WO 97/09985, WO 98/41220, US 5.800.812, US 6.117.424 y US 6.267.955 se inyectan en el sitio de la herida o lesión dentro del SNC, bien simultáneamente, antes de o tras la administración parenteral de poli-Glu,Tyr.

En otra realización, el poli-Glu,Tyr puede administrarse como una dosis única o puede repetirse, preferentemente a intervalos de 2 semanas, y luego a intervalos sucesivamente más largos una vez al mes, una vez al cuatrimestre, una vez cada seis meses, etc. El desarrollo del tratamiento puede durar varios meses, varios años u ocasionalmente también durante toda la vida del individuo, dependiendo de la afección o enfermedad que está tratándose. En el caso de una lesión del SNC, el tratamiento puede oscilar entre varios días a meses o incluso años hasta que la afección se haya estabilizado y no haya riesgo o sólo un riesgo limitado de desarrollo de degeneración secundaria. En enfermedad humana crónica o enfermedad de Parkinson, el tratamiento terapéutico según la invención puede ser para toda la vida.

Como será evidente para aquellos expertos en la materia, el efecto terapéutico depende a veces de la afección o enfermedad que va a tratarse, de la edad del individuo y el estado de salud, de otros parámetros físicos (por ejemplo, sexo, peso, etc.) del individuo, además de diversos otros factores, por ejemplo, si el individuo está tomando otros fármacos, etc.

Los siguientes ejemplos ilustran ciertas características de la presente invención, pero no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos Materiales y procedimientos

Animales. Todos los animales se trataron según las normas formuladas por el Comité Institucional para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio (IACUC). Se suministraron ratones de la cepa C57BL/6J de edad 8-13 semanas, y ratas SPD macho adultas de edad 8-12 semanas por el Centro de cría de animales ("Animal Breeding Center") del Instituto de Ciencias Weizmann ("Weizmann Institute of Science") (Rehovot, Israel) y se alojaron en habitaciones de luz y temperatura controlada. Las ratas se compararon por edad y tamaño en cada experimento. Antes de los experimentos, los animales se anestesiaron mediante administración intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina y 16 mg/kg de xilazina.

Antígenos. Se compraron PBM de las médulas espinales de cobayas y ovoalbúmina (OVA), poli Glu,Tyr y Con-A de Sigma (St. Louis, MO). Cop 1 se compró de Teva Pharmaceuticals (Petah Tikva, Israel). El péptido p87-99 de PBM se sintetizó en Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israel).

Inmunización. Los ratones o ratas se inmunizaron con 100 \mug de poli-Glu,Tyr emulsionado con un volumen igual de ACF que contenía 0,5 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis. La emulsión (volumen total de 0,1 ml) se inyectó subcutáneamente en un sitio en la ijada en los ratones y en el lomo superior en las ratas. Los ratones y las ratas de control se inyectaron con SSTF en ACF (Difco, Detroit, Michigan, EE.UU.).

Inyección de glutamato. Se pinchó el ojo derecho del ratón o rata anestesiado con una aguja de calibre 27 en la parte superior de la esclerótica y se introdujo una jeringa Hamilton de 10 \mul con una aguja de calibre 30 hasta el cuerpo vítreo. Los ratones se inyectaron con un volumen total de 1 \mul (200 nmol) de L-glutamato disuelto en solución salina.

Líneas de células T. Se generaron líneas de células T a partir de células de los ganglios linfáticos drenantes obtenidas de ratas Lewis inmunizadas con los antígenos anteriores (Ben-Nun y col., 1981). El antígeno se disolvió en SSTF (1 mg/ml) y se emulsionó con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund (AIF) (Difco Laboratories, Detroit, MI) complementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco). Diez días después de inyectarse el antígeno en las almohadillas de las patas traseras de las ratas en 0,1 ml de la emulsión, las ratas se sacrificaron y sus ganglios linfáticos drenantes se extirparon quirúrgicamente y se disociaron. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 \mug/ml) en medio de estimulación que contenía medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con L-glutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5} M), piruvato de sodio (1 mM), penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), aminoácidos no esenciales (1 ml/100 ml) y 1% de suero autólogo (volumen/volumen). Después de la incubación durante 72 horas a 37ºC, 98% de humedad relativa y 10% de CO_{2}, las células se transfirieron a medio de propagación constituido por DMEM, L-glutamina, 2-mercaptoetanol, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y antibióticos en las mismas concentraciones que antes, con la adición de suero bovino fetal al 10% (SBF) (volumen/volumen) y factor de crecimiento de células T al 10% derivado del sobrenadante de células del bazo estimuladas con concanavalina A (ConA). Las células se cultivaron en medio de propagación durante 4-10 días antes de reestimularse con su antígeno (10 \mug/ml) en presencia de células del timo irradiadas (2000 rad) (10^{7} células/ml) en medio de estimulación. Las líneas de células T se expandieron mediante estimulación y propagación repetida (Ben-Nun y col., 1982).

Lesión por aplastamiento del nervio óptico: (a) El nervio óptico se sometió a lesión por aplastamiento. Brevemente, las ratas se anestesiaron profundamente mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de Rompun (xilazina, 10 mg/kg; Vitamed, Israel) y Vetalar (ketamina, 50 mg/kg; Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA). Usando un microscopio quirúrgico binocular se realizó una cantotomía lateral en el ojo derecho y se practicó lateralmente una incisión en la conjuntiva hasta la córnea. Después de la separación de los músculos del bulbo retractor, el nervio óptico se expuso intraorbitalmente mediante disección cerrada. Usando pinzas de acción cruzada calibradas, el nervio óptico se sometió a una lesión por aplastamiento de 1-2 mm del ojo. Para los ensayos a corto plazo (dos semanas) se causaron lesiones por aplastamiento leves y graves ya que se mostró que este periodo de tiempo era óptimo para demostrar la degeneración secundaria y su respuesta al tratamiento (Yoles, 1998). El nervio contralateral sin lesionar se dejó tal y como estaba; (b) se anestesiaron ratones o ratas y se sometieron a lesión por aplastamiento escalonada en las porción intraorbital del nervio óptico, 1-2 mm del globo ocular. Con la ayuda de un microscopio quirúrgico binocular se practicó una incisión en la conjuntiva y se expuso el nervio óptico. Usando pinzas de acción cruzada calibradas y teniendo cuidado especial para no interferir con el riego sanguíneo, el nervio se aplastó durante 2 s (ratones) o 30 s (ratas).

Medición de la degeneración secundaria en la rata tras aplastamiento del nervio óptico mediante marcado retrógrado de CGR. La degeneración secundaria de los axones del nervio óptico y sus CGR unidas se midió mediante aplicación posterior a la lesión del colorante lipófilo fluorescente yoduro de 4-(4-(didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, los Países Bajos) distalmente al sitio de la lesión, dos semanas después de la lesión por aplastamiento. Debido a que sólo los axones que están intactos pueden transportar de nuevo el colorante hacia sus somas, la aplicación del colorante distalmente al sitio de la lesión después de dos semanas garantiza que sólo se contarán los axones que sobrevivieron tanto a la lesión primaria como a la degeneración secundaria. Esta solución permitió la diferenciación entre neuronas que todavía están funcionalmente intactas y neuronas en las que los axones están lesionados, pero los somas todavía son viables, debido a que sólo aquellas neuronas cuyas fibras están morfológicamente intactas pueden absorber el colorante aplicado distalmente al sitio de la lesión y transportarlo a sus somas. Usando este procedimiento, el número de CGR marcadas refleja de forma fidedigna el número de neuronas que todavía están funcionando. El marcado y la medición se llevaron a cabo del siguiente modo: el nervio óptico derecho se expuso una segunda vez, de nuevo sin dañar el riego sanguíneo retiniano. Se realizó una axotomía completa de 1-2 mm del extremo distal del sitio de la lesión y se depositaron cristales sólidos (0,2-0,4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sitio de la axotomía recientemente formada. Las ratas se sacrificaron cinco días después de la aplicación del colorante. La retina se separó del ojo, se preparó como una preparación microscópica completa aplastada en disolución de paraformaldehído al 4% y se examinó para CGR marcadas mediante microscopía de fluorescencia.

Marcado de células ganglionares de la retina (CGR) en ratones. Las CGR se marcaron 72 horas antes del final del experimento. Los ratones se anestesiaron y se colocaron en un dispositivo estereotáctico. El cráneo se expuso y se mantuvo seco y limpio. El bregma se identificó y se marcó. El punto de inyección designado estaba a una profundidad de 2 mm de la superficie del cerebro, 2,92 mm detrás del bregma en el eje anteroposterior y 0,5 mm lateral a la línea central. Se perforó una ventana en el cuero cabelludo por encima de las coordenadas designadas en los hemisferios derecho e izquierdo. Entonces se aplicó el colorante neurotrazador FluoroGold (disolución al 5% en solución salina; Fluorochrome, Denver, CO) (1 \mul a una tasa de 0,5 \mul/min en cada hemisferio) usando una jeringa Hamilton, y se suturó la piel sobre la herida.

Evaluación de la supervivencia de CGR en ratones. A los ratones se les administró una dosis letal de pentobarbital (170 mg/kg). Sus ojos se enuclearon y las retinas se separaron y se prepararon como preparaciones microscópicas completas aplastadas en paraformaldehído (4% en SSTF). Se contaron las células marcadas de 4-6 campos seleccionados de tamaño idéntico (0,7 mm^{2}). Los campos seleccionados se localizaron a aproximadamente la misma distancia desde el disco óptico (0,3 mm) para superar la variación en densidad de CGR como una función de la distancia desde el disco óptico. Los campos se contaron con el microscopio de fluorescencia (aumento de 800x) por observadores ciegos al tratamiento recibido por el ratón. Se calculó el número promedio de CGR por campo en cada retina.

Evaluación de la supervivencia de CGR en ratas. La supervivencia de CGR en ratas se midió después de la aplicación posterior a la lesión del colorante lipófilo fluorescente yoduro de 4-(4-(didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, los Países Bajos) distalmente a la papila óptica. El marcado y la medición se llevaron a cabo del siguiente modo: el nervio óptico se expuso sin lesión al riego sanguíneo retiniano. Se realizó una axotomía completa a 1-2 mm de la papila óptica y se depositaron cristales sólidos (0,2-0,4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sitio de la axotomía formada. Las ratas se sacrificaron cinco días después de la aplicación del colorante. La retina se separó del ojo, se preparó como una preparación microscópica completa aplastada en disolución de paraformaldehído al 4% y se examinó para CGR marcadas mediante microscopía de fluorescencia. En los animales experimentales con PIO, las células ganglionares se marcaron mediante transporte retrógrado de dextrano-tetrametilrodamina (DTMR) (Molecular Probes, OR). Se aplicaron cristales de DTMR de Pm 3000 al extremo de corte del nervio óptico a aproximadamente de 2 a 3 mm del globo. Veinticuatro horas después, las retinas se prepararon como una preparación microscópica completa y las células ganglionares marcadas en 8 regiones, 2 en cada cuadrante, (0,66 a 1,103 mm del borde del disco óptico) se contaron con un aumento de 400x.

Análisis histológico. Siete días después de la inyección de glutamato o solución salina, los ratones se sacrificaron mediante inyección de una dosis letal de pentobarbital (170 mg/kg) y sus ojos se extrajeron y se fijaron en formaldehído (4% en SSTF) durante 48 h a 4ºC. Las secciones (10 \mum de espesor) se incluyeron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E).

Generación de hipertensión ocular en ratas/elevación de la presión intraocular en ratas. Se anestesiaron ratas Lewis macho con una mezcla de ketamina (15 mg/kg), acepromazina (1,5 mg/kg) y xilazina (0,3 mg/kg). Se logró un aumento en la presión intraocular (PIO) mediante fotocoagulación láser de las venas limbal y epiescleral. Las ratas recibieron 2 tratamientos láser, separados 1 semana, con un láser de argón verde azulado (1 vatio durante 0,2 s, liberando un total de 130-150 puntos de 50 \mum en los 2 tratamientos; Coherent, Palo Alto, CA). La PIO se midió una vez a la semana usando TONO-PEN (Mentor, Norwell, MA) después de inyectar a las ratas intramuscularmente con el tranquilizante veterinario acepromazina 3,0 mg/kg y aplicar 0,5% de procaína tópicamente en los ojos para anestesiar la córnea.

Ejemplo 1 Repertorio fisiológico de células T en animales contusionados

Las ratas SPD se anestesiaron y sus médulas espinales se expusieron mediante laminectomía al nivel de T8. Una hora después de la inducción de anestesia, una barra de 10 g se dejó caer sobre la médula laminectomizada desde una altura de 50 mm usando el impactador NYU (Basso y col., 1995 y 1996).

Las ratas se sacrificaron 8-10 días después de la contusión de la médula espinal y sus bazos se extirparon y se prensaron a través de una fina malla de alambre. Las células lavadas (2 x 10^{6}/ml) se cultivaron por triplicado en pocillos de microtitulación de fondo redondo en 0,2 ml de medio de proliferación que contenía DMEM complementado con L-glutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5} M), piruvato de sodio (1 mM), penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), aminoácidos no esenciales y 1% de suero autólogo de rata (vol/vol) con el antígeno (15 \mug/ml) o Con A (1,25 \mug/ml) y timocitos irradiados (2000 rad, 2 x 10^{6} células/ml). La respuesta proliferativa a diferentes antígenos, concretamente Ova, Cop 1, PBM, 87-99, poli-Glu,Tyr y Con A, se determinó midiendo la incorporación de [^{3}H]timidina (1 \muCi/pocillo), que se añadió durante las últimas 16 h de un cultivo de 72 h. El índice de proliferación de esplenocitos (IE) se determinó con respecto a la proliferación de los esplenocitos en medio sin antígeno (IE = 1 indica sin respuesta de la proliferación al antígeno anterior a la proliferación sin ningún antígeno). Este parámetro es indicativo del repertorio fisiológico de células T en animales contusionados. Con-A es el control positivo. Los resultados en la fig. 1 indican que en las ratas espinalmente contusionadas hay una alta incidencia de células T reactivas a poli-Glu,Tyr, más que a Cop-1 o a PBM.

Ejemplo 2 Protección de las fibras del nervio óptico de la toxicidad del glutamato

El siguiente experimento se realizó con el fin de descubrir si el poli-Glu,Tyr puede conferir una neuroprotección más general a partir de condiciones medioambientales hostiles producidas por toxicidad inducida por glutamato.

La inyección del neurotransmisor excitador glutamato en el cuerpo vítreo del ojo de ratones C57B1/6J produce muerte dependiente de la dosis de los somas de neuronas del nervio óptico. Un estudio previo mostró que se retrasa la aparición de muerte de CGR (más de 24 horas después de la inyección de glutamato) y es similar a apoptótica.

En el presente experimento, ratones C57B1/6J macho de 8 semanas de edad se inmunizaron subcutáneamente con 100 \mug de poli-Glu,Tyr emulsionado en ACF 7 días antes de la inyección de glutamato. Como controles sirvieron un grupo de ratones inmunizados al mismo tiempo con SSTF emulsionado en ACF para descartar un efecto no específico de la inmunización y un grupo de ratones no inmunizados. Los ratones en los tres grupos recibieron una inyección de glutamato (400 nmol) en el vítreo del ojo derecho. El ojo izquierdo no recibió inyección y se usó como control intacto. Siete días después de la inyección de glutamato, los ojos se extirparon y se determinó la supervivencia de CGR.

El número promedio de CGR por mm^{2} contado en las retinas intactas de los ratones inmunizados con poli-Glu,Tyr, los inmunizados con SSTF y los no inmunizados fueron 2796\pm165, 2874\pm197 y 2807\pm42, respectivamente, que indica que la inmunización no tuvo efecto en la supervivencia de CGR en el ojo intacto contralateral. Por tanto, estos valores promedio de CGR por mm^{2} en la retina intacta en los 3 grupos experimentales se combinaron y se tomaron como el 100% de la supervivencia de CGR (toxicidad del 0%).

Los resultados representados en la fig. 2 muestran que la inmunización de los ratones con poli Glu,Tyr en ACF (ACF-EY) atenuó significativamente la muerte de CGR inducida por glutamato en comparación con la inmunización con SSTF (prueba de la t, p = 0,007) o con la no inmunización (prueba de la t, p = 0,01). No hubo diferencia en la supervivencia de CGR entre los 2 últimos grupos (prueba de la t, p = 0,71).

Ejemplo 3 Neuroprotección en la lesión de la médula espinal

La lesión de la médula espinal incompleta aguda a los bajos niveles torácicos produce una pérdida inmediata de la actividad motora de las extremidades posteriores que se recupera espontáneamente dentro de los 12 primeros días posteriores a la lesión y se estabiliza en capacidades de movimiento deficiente. La cantidad de restitución de la función motora es la suma del efecto de la recuperación positiva de la sección medular y el efecto negativo de la propagación longitudinal y ventral de la lesión. Una solución terapéutica que apunta a reducir la propagación de lesión mediante la neuroprotección dará como resultado una mejor recuperación en términos de actividad motora de las extremidades posteriores.

En los siguientes experimentos se probó el efecto de la inmunización activa o pasiva con poli-Glu,Tyr en la actividad motora de la extremidad posterior después de la contusión de la médula espinal.

3.1 Inmunización activa con poli-Glu,Tyr: el efecto de la inmunización con poli-Glu,Tyr/ACF en la recuperación de ratas a partir de contusión de la médula espinal

Se causó una lesión contundente de la médula espinal en 12 ratas macho SPD anestesiadas usando el dispositivo impactador NYU para dejar caer una barra de 10 g desde una altura de 50 mm sobre la médula espinal laminectomizada expuesta al nivel T8. El dispositivo impactador NYU usado permitió, para cada animal, la medición de la trayectoria de la barra y su contacto con la médula espinal expuesta para permitir una lesión uniforme.

Debido a la sección medular desaparecieron inicialmente las habilidades motoras de las extremidades posteriores de las ratas, pero se recuperaron con el tiempo para conseguir un estado estacionario de actividad motora deficiente. La cantidad de esta deficiencia producida por la lesión puede reducirse con tratamiento neuroprotector adecuado.

Las ratas se dividieron en 2 grupos (6 cada uno) según sus errores de impacto para conseguir grupos similares. En un grupo, las ratas se inmunizaron SC en su lomo superior con SSTF/ACF (triángulos). En el otro grupo, las ratas se inmunizaron SC con pEY/ACF (100 \mug/rata, cuadrados). Ambos grupos se inmunizaron inmediatamente después de la lesión y 7 días después ambos grupos recibieron una segunda inmunización idéntica a la primera. Las habilidades motoras de las extremidades posteriores de los animales se puntuaron usando un procedimiento de puntuación desarrollado por Basso y col., 1995 (se puntúa la actividad locomotora (intervalo de 0-21) según la escala de valoración locomotora de Basso, Beattie, Bresnahan (BBB)) siguiendo la cinética y la cantidad de actividad motora de las extremidades posteriores en los dos grupos experimentales. Aproximadamente dos veces a la semana, la actividad locomotora del tronco, la cola y las extremidades posteriores en un campo abierto se evaluó colocando la rata durante 4 min en el centro de un recinto circular hecho de plástico moldeado con un suelo antideslizante liso (90 cm de diámetro, 7 cm de altura de pared). Los resultados representados en la fig. 3 muestran que las ratas tratadas con pEY (cuadrados) mostraron una tendencia a la recuperación mejor que las ratas tratadas con SSTF.

3.2 Inmunización pasiva con poli-Glu,Tyr

El siguiente experimento se realizó con el fin de examinar si las células T específicas para poli-Glu,Tyr también proporcionan neuroprotección después de la lesión de la médula espinal.

Para la preparación de las células T, cuatro ratas SPD se inmunizaron SC en su lomo inferior con pEY/ACF (125 \mug/rata). Siete días después se recogieron sus esplenocitos y se preparó una única suspensión celular prensando los bazos contra una malla de metal usando el émbolo de una jeringa. Los esplenocitos se activaron en cultivo durante 3 días con pEY (10 \mug/ml). Las células se recogieron, se lavaron en SSTF y se contaron.

Otro grupo de 12 ratas SPD macho se sometió a cirugía y su médula espinal se contusionó al nivel T7 usando 10 g de peso caído desde una altura de 50 mm como se describe en el ejemplo 3.1 anterior. Inmediatamente después de la contusión, las ratas se dividieron en 2 grupos iguales según sus errores de impacto. Un grupo recibió intravenosamente 0,5 ml de SSTF y el otro grupo recibió esplenocitos activados con pEY (30 x 10^{6}/0,5 ml de SSTF/rata). Las ratas se siguieron para la recuperación de su función usando la puntuación de BBB de campo abierto.

Los resultados representados en la fig. 4 muestran que las ratas tratadas con esplenocitos activados con pEY (cuadrados) se recuperaron mejor que el grupo de control (triángulos).

Referencias

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Claims

1. Uso de poli-Glu^{50},Tyr^{50} para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o inhibir degeneración neuronal en el sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP), para promover regeneración nerviosa en el SNC o SNP, para tratar una lesión en el SNC o SNP o un trastorno o enfermedad en el SNC o SNP producido o agravado por toxicidad del glutamato seleccionado de una demencia senil que incluye enfermedad de Alzheimer, síndrome parkinsoniano que incluye enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), corea de Huntington, una enfermedad de la neurona motora que incluye esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad priónica que incluye enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alper, enfermedad de Batten, síndrome de
Cockayne, enfermedad de cuerpos de Lewy, estado epiléptico, síndrome del túnel carpiano, hernia de disco intervertebral, hipovitaminosis, epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, estrés oxidativo, tolerancia a y dependencia de opiáceos, una enfermedad autoinmunitaria o una neuropatía periférica asociada con una enfermedad tal como polineuropatía amiloide, neuropatía diabética, neuropatía urémica, polineuropatía porfírica, hipoglucemia, síndrome de Sjogren-Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de malabsorción, policitemia verdadera, gammapatías IgA y IgG, complicaciones de diversos fármacos tales como nitrofurantoína, metronidazol, isoniazida y toxinas tales como el alcohol u organofosfatos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia-telangiectasia, ataxia de Friedreich, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry o lipoproteinemia, o dicho trastorno o enfermedad está asociado con el ojo e incluye neuropatía óptica no arterítica, degeneración macular senil, un trastorno retiniano tal como degeneración retiniana o una enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica es para tratar una lesión en el SNC o SNP con el fin de prevenir o inhibir degeneración neuronal o para promover regeneración nerviosa.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que dicha lesión es lesión de la médula espinal, traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, golpe o contragolpe cerebral, infarto cerebrovascular hemorrágico o infarto cerebrovascular isquémico.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicha lesión es lesión de la médula espinal.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada es glaucoma.

6. Poli-Glu^{50},Tyr^{50} para uso en la prevención o inhibición de degeneración neuronal en el sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP), para promover regeneración nerviosa en el SNC o SNP, para tratar una lesión en el SNC o SNP o un trastorno o enfermedad en el SNC o SNP producido o agravado por toxicidad del glutamato seleccionado de una demencia senil que incluye enfermedad de Alzheimer, síndrome parkinsoniano que incluye enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (de Bell), corea de Huntington, una enfermedad de la neurona motora que incluye esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad priónica que incluye enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alper, enfermedad de Batten, síndrome de Cockayne, enfermedad de cuerpos de Lewy, estado epiléptico, síndrome del túnel carpiano, hernia de disco intervertebral, hipovitaminosis, epilepsia, amnesia, ansiedad, hiperalgesia, psicosis, convulsiones, estrés oxidativo, tolerancia a y dependencia de opiáceos, una enfermedad autoinmunitaria o una neuropatía periférica asociada con una enfermedad tal como polineuropatía amiloide, neuropatía diabética, neuropatía urémica, polineuropatía porfírica, hipoglucemia, síndrome de Sjogren-Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de malabsorción, policitemia verdadera, gammapatías IgA y IgG, complicaciones de diversos fármacos tales como nitrofurantoína, metronidazol, isoniazida y toxinas tales como el alcohol u organofosfatos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia-telangiectasia, ataxia de Friedreich, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry o lipoproteinemia, o dicho trastorno o enfermedad está asociado con el ojo e incluye neuropatía óptica no arterítica, degeneración macular senil, un trastorno retiniano tal como degeneración retiniana o una enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada.

7. Poli-Glu^{50},Tyr^{50} según la reivindicación 6 para uso en el tratamiento de una lesión en el SNC o SNP con el fin de prevenir o inhibir degeneración neuronal o para promover regeneración nerviosa.

8. Poli-Glu^{50},Tyr^{50} según la reivindicación 7, en el que dicha lesión es lesión de la médula espinal, traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, golpe o contragolpe cerebral, infarto cerebrovascular hemorrágico o infarto cerebrovascular isquémico.

9. Poli-Glu^{50},Tyr^{50} según la reivindicación 8, en el que dicha lesión es lesión de la médula espinal.

10. Poli-Glu^{50},Tyr^{50} según la reivindicación 6, en el que dicha enfermedad asociada con presión intraocular anormalmente elevada es glaucoma.